MX2008004039A

MX2008004039A - Enzimas de acido nucleico multicomponentes y metodos para su uso

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Publication number: MX2008004039A
Application number: MX/A/2008/004039A
Authority: MX
Inventors: Velyian Todd Alison; Mokany Elisa; John Birkett Donald; Bich Doan Tram
Original assignee: John Birkett Donald; Bich Doan Tram; Johnson & Johnson Research Pty Limited; Mokany Elisa; Velyian Todd Alison
Priority date: 2005-10-07
Filing date: 2008-03-26
Publication date: 2008-09-02

Abstract

La presente invención se refiere a Enzimas deÁcido Nucleico Multicomponentes (MNAzimas) y métodos para su uso. Las MNAzimas comprenden dos o más componentes oliqonucleótidos los cuales se auto-ensamblan en la presencia de una o más moléculas que facilitan el montaje de MNAzima para formar una estructura catalíticamente activa. Se proporcionan composiciones para elaborar MNAzimas y colecciones de MNAzimas. También se proporcionan métodos para usar MNAzimas para la detección, identificación y/o cuantificación de uno o más objetivos. Los métodos pueden ser practicados en ensayos a base de solución o en ensayos en donde uno o más componentes de reacción están unidos a una estructura de soporte. Los métodos permiten multiplexar la detección de MNAzimas para detectar objetivos múltiples en una reacciónúnica. También se proporcionan kits para elaborar las composiciones, y para practicar los métodos proporcionados en este documento.

Description

ENZIMAS DE ACIDO NUCLEICO MULTICOMPONENTES Y MÉTODOS PARA SU USO CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con ácidos nucleicos catalíticos multicomponente y métodos para su uso. Más particularmente, la invención se relaciona con composiciones que comprenden enzimas de ácidos nucleicos multicomponente auto ensamblables, métodos para preparar tales composiciones, y métodos para usar tales composiciones, incluyendo para detectar, identificar y/o cuantificar objetivos tales como facilitadores de ensamble y otras entidades detectando la modificación catalítica de los sustratos por dichas enzimas de ácidos nucleicos multicomponente.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Varias publicaciones, que pueden incluir patentes, solicitudes publicadas, artículos especializados y artículos escolares, se citan a todo lo largo de la especificación entre paréntesis, y pueden encontrarse citas completas de cada una al final de la especificación. Cada una de estas publicaciones citadas se incorpora por referencia aquí, en su totalidad. Las moléculas de ácido nucleico pueden adoptar configuraciones estructurales secundarias que pueden conferir actividad enzimática o catalítica. La tecnología de evolución in vi tro ha facilitado el descubrimiento y desarrollo de tales ácidos nucleicos catalíticos, a menudo referidos como "ADNzimas" o "ribozimas", que son capaces de catalizar un amplio rango de reacciones incluyendo la escisión de ácidos nucleicos (Carmi et al , 1996; Raillard and Joyce, .1996; Breaker, 1997; Santoro and Joyce, 1998), la ligación de ácidos nucleicos (Cuenoud and Szostak, 1995) , metalación de porfirina (Li and Sen, 1996) , y la formación de enlaces carbono-carbono (Tarasow et al , 1997), enlaces éster (Illangasekare et al , 1995) o enlaces amida (Lohse and Szostak, 1996) . En particular, se han caracterizado las ADNzimas y las ribozimas, las cuales específicamente escinden distintas secuencias de ácidos nucleicos después de la hibridación vía el apareamiento de bases de Watson Crick. Las ADNzimas son capaces de escindir ya sea moléculas de ARN (Breaker and Joyce, 1994; Santoro and Joyce, 1997) o moléculas de ADN (Carmi et al , 1996) . Las moléculas (ribozimas) de ARN catalítico también pueden escindir ambas secuencias; de ARN (Haseloff and Gerlach, 1988) y de ADN (Raillard and Joyce, 1996) . La velocidad de escisión catalítica de la mayoría de las enzimas de ácidos nucleicos es dependiente de la presencia y concentración de los iones metálicos divalentes tales como Ba2+, Sr2+, Mg2+, Ca2+, Ni2+, Co2+, Mn2+, Zn2+, y Pb2+ (Santoro and Joyce, 1998; Brown et al , 2003) . Los ácidos nucleicos catalíticos, tales como la ribozima de cabeza de martillo y las ADNzimas 10:23 y 8:17, tienen múltiples dominios. Tienen un dominio catalítico conservado (núcleo catalítico) flanqueado por dos dominios que enlazan el sustrato, no conservados ("brazos de hibridación"), los cuales son regiones de la secuencia que específicamente se enlazan al sustrato. Haseloff and Gerlach diseñaron la ribozima de cabeza de martillo, la cual se denominó así por la estructura de vástago-lazo que junta los dos dominios conservados formando el núcleo catalítico (Haseloff and Gerlach, 1988). Las ADNzimas "10:23" y "8:17" son capaces de escindir los sustratos de ácidos nucleicos en enlaces específicos de fosfodiéster de ARN (Santoro and Joyce, 1997). La ADNzima 10:23 tiene un dominio catalítico de 15 deoxinucleótidos flanqueado por dos brazos de reconocimiento de sustrato. La ADNzima 8:17 tiene un dominio catalítico de 14 deoxinucleótidos que también está flanqueado por dos brazos de reconocimiento de sustrato . Un ácido nucleico catalítico puede escindir un sustrato de ácido nucleico con una secuencia objetivo que cumple los requerimientos mínimos. La secuencia del sustrato debe ser sustancialmente complementaria para los brazos de hibridación del ácido nucleico catalítico, y el sustrato debe contener una secuencia específica en el sitio de escisión. Los requerimientos específicos de la secuencia en el sitio de escisión incluyen, por ejemplo, una secuencia de ribonucleótidos purina ¡pirimidina para la escisión por la ADNzima 10:23 (Santoro and Joyce, 1997), y la secuencia uridina :X para las ribozimas de cabeza de martillo (Perriman et al , 1992), en donde X puede corresponder a A, C, o U, pero no G. Los ácidos nucleicos catalíticos han sido mostrados por tolerar solo ciertas modificaciones en el área que forma el núcleo catalítico (Perreault et al , 1990; Perreault et al , 1991; Zaborowska et al , 2002; Cruz et al , 2004; Silverman, 2004)). Los ejemplos de secuencias responsables de la actividad catalítica de las ADNzimas se listan en la Tabla 1.

Tabla 1 : Secuencias ejemplares para algunas ADNzimas activas y sus sustratos La sustitución de ciertos desoxiribonucleótidos por ciertos ribonucleótidos en las ribozimas conocidas se ha intentado bajo ciertas condiciones (McCall et al . , 1992). Las ribozimas que se han convertido completamente en ADN no tienen actividad debido a las diferencias de conformación del ARN y ADN (Perreault et al . , 1990). Estos estudios demuestran que las enzimas de ARN no pueden modificarse en enzimas de ADN en funcionamiento mediante meramente reemplazando los ribonucleótidos con desoxiribonucleótidos . Ha habido algunos estudios que intentaron desarrollar ciertas ribozimas homodiméricas o heterodiméricas para aplicaciones terapéuticas (Kuwabara et al . , 1999; Kuwabara et al . , 2000; Oshima et al . , 2003). En esos estudios, el núcleo catalítico de la ribozima comprendió solamente de ribonucleótidos. Además, no se ha considerado la capacidad de las ADNzimas para funcionar en formatos diméricos o multiméricos, ni se ha proporcionado información alguna acerca de cómo extrapolar de una ribozima dimérica a una ADNzima dimérica en términos de una estructura posible de una ADNzima dimérica y la actividad resultante . Se han usado los ácidos nucleicos catalíticos en combinación con los protocolos de amplificación in vi tro como una manera de generar una señal detectable, permitiendo así el monitoreo en tiempo real de las secuencias objetivo de ácidos nucleicos, amplificadas (Todd et al . , 2000) (US 6,140,055; US 6,201,113; WO 99/45146; PCT/IB99/00848; WO 99/50452). La detección de zimógeno (US 6,140,055; US 6,201,113; WO 99/45146; PCT/IB99/00848 ; WO 99/50452), también conocida en el arte como detección DzyNA (Todd et al . , 2000), resulta en el objetivo concurrente y la amplificación de señal. Esto ocurre debido a que las ADNzimas o ribozimas catalíticas se co-amplifican junto con las secuencias objetivo para producir amplicones que funcionan como enzimas verdaderas capaces de renovación múltiple. Como tal, cada amplicón de ácido nucleico catalítico escinde múltiples sustratos reporteros. Las ADNzimas y ribozimas se introducen en los amplicones usando cebadores con etiquetas 5' que son inactivas, secuencias antisentido de ácidos nucleicos catalíticos. Cuando estas secuencias se copian durante la amplificación in vi tro las secuencias sentido catalíticamente activas se co-amplifican junto con la secuencia objetivo. El acercamiento zimógeno/DzyNA es muy flexible debido a que la amplificación de la señal catalítica puede asociarse a los métodos de amplificación de objetivo incluyendo PCR (reacción de cadena de polimerasa) , amplificación de desplazamiento de hebra ("SDA"), o amplificación del círculo de enrollamiento ("RCA"), produciendo amplicones de ADNzima; y la amplificación basada en secuencias de ácidos nucleicos ("NASBA"), replicación de secuencia auto-sostenida ("3SR"), o los métodos de amplificación mediados por la transcripción ("TMA") produciendo amplicones de ribozima. Además, debido a que se han descubierto o a que han evolucionado numerosas moléculas de ácidos nucleicos catalíticos con un amplio rango de actividades catalíticas, el enfoque del zimógeno puede usar un sustrato reportero diferente de un ácido nucleico donde la lectura del ensayo es dependiente de una modificación química diferente de la escisión de un sustrato de ácido nucleico. El enfoque zimógeno/DzyNA (Todd et al . , 2000) o NASBA/ribozima (WO 00/58505) puede considerarse sensitivo y útil, pero hay potencial de ruido debido a la amplificación de las secuencias del cebador. NASBA se ha usado para producir amplicones de ARN que contienen el ácido nucleico objetivo y una sección del núcleo catalítico de la ribozima de cabeza de martillo (GAArA) , introducida como la secuencia antisentido etiquetada a un cebador y posteriormente copiada (WO 00/58505) . La secuencia adicional requerida para la actividad catalítica (CUrGANrGrA) fue introducida como una secuencia sentido en una segunda molécula, la cual se etiquetó con un fluoróforo e hibridizador por apagado, y que también sirvió como el sustrato reportero. Ciertas de las bases del ribonucleótido (rN anterior) deben permanecer como ribonucleótidos, o se pierde la actividad catalítica de la ribozima. Se consideró que dos moléculas que consisten enteramente de ADN son incapaces de formar enzimas heterodímeras catalíticamente activas (WO 00/58505) . Los ácidos nucleicos catalíticos también se han usado para la detección de polimorfismos sencillos del nucleótido ("SNPs"). El estricto requerimiento para el apareamiento de bases de Watson Crick entre los brazos que enlazan el ácido nucleico catalítico y el sustrato ha permitido el desarrollo de métodos que permiten la discriminación de secuencias cortas estrechamente relacionadas. Se ha mostrado que las ADNzimas y las ribozimas discriminan entre dos secuencias que difieren por tan poco como una sola base (Cairns et al . , 2000) (WO 99/50452) . Las ADNzimas tienen propiedades que proporcionan ventajas sobre las ribozimas para ciertas aplicaciones in vitro. El ADN es esencialmente más estable que el ARN y por lo tanto es más robusto con una vida en anaquel más larga. El ADN puede almacenarse durante largos periodos a temperatura ambiente ya sea en solución o en una forma liofilizada. Las ADNzimas también son preferibles sobre la mayoría de las enzimas de proteínas en ciertas aplicaciones debido a que, por ejemplo, no se desnaturalizan de forma irreversible por la exposición a altas temperaturas durante la amplificación. Por consiguiente, hay una necesidad en curso en el arte por métodos simples, rápidos, y efectivos en costo para detectar, identificar y cuantificar secuencias de ácidos nucleicos y otras entidades, que preferentemente proporcionen ácidos nucleicos catalíticos basados en ADNzimas y/o ribozimas.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN De acuerdo a un primer aspecto de la presente invención, se proporciona una composición que comprende al menos dos o más componentes oligonucleótidos en donde al menos un primer componente oligonucleótido y un segundo componente oligonucleótido se auto-ensamblan en la presencia de un facilitador de ensamble de MNAzima para formar una enzima de ácidos nucleicos multicomponente (MNAzima) , catalíticamente activa, en donde cada uno de dichos al menos primer y segundo componentes oligonucleótido comprenden una porción del brazo del sustrato, una porción del núcleo catalítico, y una porción del brazo detector; en donde luego del auto-ensamble, la porción del brazo detector de dicho primer y segundo componentes oligonucleótido actúan como brazos detectores de la MNAzima, la porción del brazo del sustrato del primer y segundo componentes oligonucleótido actúa como los brazos del sustrato de la MNAzima, y la porción del núcleo catalítico del primer y segundo componentes oligonucleótido actúa como un núcleo catalítico de la MNAzima; y en donde los brazos detectores de la MNAzima interactúan con dicho facilitador de ensamble de MNAzima para mantener el primero y segundo componentes de oligonucleótidos en proximidad para la asociación de sus porciones del núcleo catalítico respectivas para formar el núcleo catalítico de la MNAzima, dicho núcleo catalítico capaz de modificar al menos un sustrato, y en donde dichos brazos del sustrato de dicha MNAzima enlazan un sustrato a fin de que dicho núcleo catalítico de dicha MNAzima pueda modificar dicho sustrato. Al menos uno de dichos componentes oligonucleótido, facilitador de ensamble o sustrato puede comprender ADN o un análogo del mismo. El facilitador de ensamble puede ser un objetivo a ser identificado, detectado o cuantificado. El objetivo puede comprender un ácido nucleico. El ácido nucleico puede seleccionarse del grupo que comprende de ADN, ADN metilado, ADN alquilado, ARN, ARN metilado, microARN, ARNsi, ARNsh, ARNt, ARNm, ARNsno, ARNst, ARNsm, pre- y pri-microARN, otros ARNs de no codificación, ARN ribosomal, derivados de los mismos, amplicones, o cualquier combinación de los mismos. El ARN ribosomal puede ser ARN ribosomal 16S. La fuente del ácido nucleico puede seleccionarse del grupo que comprende de sintético, mamífero, humano, animal, planta, fúngico, bacteriano, viral, bacterias archaelicas o cualquier combinación de los mismos. Puede amplificarse el ácido nucleico. La amplificación puede comprender uno o más de: reacción de cadena de polimerasa (PCR) , amplificación de desplazamiento de la hebra (SDA) , amplificación de isoterma mediada por lazo (LAMP) , amplificación del círculo de enrollamiento ("RCA"), amplificación mediada por la transcripción (TMA), replicación de secuencia auto-sostenida (3SR) , amplificación basada en la secuencia de ácidos nucleicos (NASBA) , o reacción de cadena de la polimerasa de transcripción inversa (RT-PCR) . La composición puede comprender además al menos un tercer componente oligonucleótido que actúa para estabilizar al menos una de dichas porciones del brazo del sustrato o porciones del brazo detector. Al menos uno de dicho facilitador de ensamble, dichos componentes oligonucleótido o sustrato o una combinación de los mismos pueden estar comprendido más que una molécula. Las porciones del núcleo catalítico del primer componente oligonucleótido pueden seleccionarse del grupo que comprende de SEC ID NOs 149 - 153, 155 - 157, 159 y 161, y las porciones del núcleo catalítico del segundo componente oligonucleótido pueden seleccionarse del grupo que comprende de SEC ID NOs 166 - 170, y 172. La composición puede comprender además al menos un inhibidor de dicho auto-ensamble de dicha MNAzima. Al menos uno de dichos componentes oligonucleótido o facilitador de ensamble o sustrato o una combinación de los mismos puede comprender además al menos un aptámero o porción del mismo. El aptámero o la porción del mismo pueden estar comprendidos de al menos uno de ácido nucleico, péptido, polipéptido o proteína o un derivado o combinación de los mismos. La composición puede comprender además al menos un inhibidor de dicho auto-ensamble de dicha MNAzima. Al menos uno de dicho primer o dicho segundo componentes oligonucleótido o dicho facilitador de ensamble o dicho sustrato puede comprender además al menos una porción de la secuencia auto-complementaria capaz de formar una estructura de horquilla. La estructura de horquilla puede inhibir el auto-ensamble de dicha MNAzima. La inhibición del auto-ensamble puede removerse sobre el contacto de un aptámero con un objetivo. El aptámero, o porción del mismo, puede enlazar un objetivo seleccionado del grupo que comprende de ácidos nucleicos, proteínas, glicoproteínas, lípidos, lipoproteínas, células, virus, bacterias, archaea, hongos, anticuerpos, metabolitos, patógenos, toxinas, contaminantes, venenos, moléculas pequeñas, polímeros, iones metálicos, sales metálicas, priones o cualquier derivado, porción o combinación de los mismos. El sustrato puede comprender un ácido nucleico o una proteína. El ácido nucleico puede comprender al menos uno de un ácido nucleico etiquetado, ARN, ADN, análogos de ácido nucleico, ácido nucleico peptídico, ácido nucleico unido, quimera péptido-ácido nucleico, o cualquier combinación de los mismos. La proteína puede comprender al menos uno de un anticuerpo, polipéptido, glicoproteína, lipoproteína, o cualquier combinación de los mismos. El sustrato puede comprender además al menos una nanopartícula o micropartícula, o combinación de las mismas. El sustrato puede unirse a un soporte insoluble o puede estar libre en la solución. El sustrato puede comprender una porción detectable y una porción del hibridizador por apagado, en donde sobre la modificación de dicho sustrato por dicha MNAzima, aumenta o disminuye un efecto detectable proporcionado por dicha porción detectable. Los brazos del sustrato pueden enlazar dicho sustrato a través del apareamiento de bases complementario. La modificación de dicho sustrato por dicha MNAzima puede proporcionar un efecto detectable. La modificación de dicho sustrato puede seleccionarse del grupo que comprende de escisión, ligación, metalación de porfirina, formación de enlaces carbono-carbono, enlaces éster o enlaces amida, o cualquier combinación de los mismos. El efecto detectable puede detectarse por espectroscopia de fluorescencia, resonancia de plasmón superficial, espectroscopia de masa, NMR, resonancia de giro del electrón, espectroscopia de fluorescencia de polarización, dicroísmo circular, inmunoensayo, cromatografía, radiometría, fotometría, graficado por centelleo, métodos electrónicos, UV, luz visible o espectroscopia infra roja, métodos enzimáticos o cualquier combinación de los mismos. El efecto detectable puede medirse, en donde la magnitud de dicha medición es indicativa de la cantidad de un objetivo. Al menos uno de dichos componentes oligonucleótido, dicho facilitador de ensamble o dicho sustrato puede seleccionarse del grupo que comprende de ADN, ARN, análogos de ácido nucleico, ácidos nucleicos peptídicos, ácidos nucleicos unidos, quimeras péptido-ácido nucleico, o una combinación de los mismos. El facilitador de ensamble y dicho sustrato pueden comprender ácidos nucleicos que son completamente o parcialmente complementarios para al menos parte de dicho primer o segundo componentes oligonucleótido. Al menos uno de dichos componentes oligonucleótido, dicho facilitador de ensamble o dicho sustrato puede comprender al menos una sustitución o adición de nucleótido seleccionada del grupo que comprende de 4-acetilcitidina, 5- (carboxihidroxilmetil) uridina, 2 ' -O-metilcitidina, 5-carboximetilaminometil tiouridina, dihidrouridina, 2 ' -0-metilpseudouridina, beta D-galactosilqueosina, 2 ' -0-metilguanosina, inosina, N6-isopenteniladenosina, 1-metiladenosina, 1-metilpseudouridina, 1-metilguanosina, 1-metilinosina, 2, 2-dimetilguanosina, 2-metiladenosina, 2-metilguanosina, 3-metilcitidina, 5-metilcitidina, N6-metiladenosina, 7-metilguanosina, 5-metilaminometiluridina, 5-metoxiaminometil-2-tiouridina, beta D-manosilmetiluridina, 5-metoxicarbonilmetiluridina, 5-metoxiuridina, 2-metiltio-N6-isopenteniladenosina, N-((9-beta-ribofuranosil-2-metiltiopurina-6-il) carbamoil) treonina, N- ( ( 9-beta-ribofuranosilpurina-6-il) N-metil-carbamoil) treonina, metiléster del ácido uridina-5-oxiacético, ácido (v) uridina-5-oxiacético, wibutoxosina, pseudouridina, queosina, 2-tiocitidina, 5-metil-2-tiouridina, 2-tiouridina, 4-tiouridina, 5-metiluridina, N- ( (9-beta-D-ribofuranosilpurina-6-il) carbamoil) treonina, 2 ' -O-metil-5-metiluridina, 2 ' -0-metiluridina, wibutosina, 3- (3-amino-3-carboxipropil) uridina, beta D-arabinosil uridina, beta D-arabinosil timidina La composición puede comprender además al menos un tercer componente oligonucleótido y un cuarto componente oligonucleótido que se auto-ensamblan en la presencia de al menos un facilitador de ensamble adicional para formar al menos una MNAzima catalíticamente activa adicional, en donde cada uno de dicho al menos tercer y cuarto componentes oligonucleótido comprende una porción del brazo del sustrato, una porción del núcleo catalítico, y una porción del brazo detector; en donde sobre el auto-ensamble de al menos un tercer componente oligonucleótido y un cuarto componente oligonucleótido, la porción del brazo detector de dicho al menos tercer y dicho al menos cuarto componentes oligonucleótido forma los brazos detectores de dicha al menos una MNAzima catalíticamente activa adicional, la porción del brazo del sustrato de dicho al menos tercer y dicho al menos cuarto componentes oligonucleótido forma los brazos del sustrato de dicha al menos una MNAzima catalíticamente activa adicional, y la porción del núcleo catalítico de dicho al menos tercer y dicho al menos cuarto componentes oligonucleótido forma un núcleo catalítico dicha al menos una MNAzima catalíticamente activa adicional; y en donde los brazos detectores de dicha al menos una MNAzima adicional interactúan con dicho al menos un facilitador de ensamble adicional para mantener dicho al menos tercer y dicho al menos cuarto componentes oligonucleótido en proximidad para la asociación de sus porciones del núcleo catalítico respectivas para formar el núcleo catalítico de dicha al menos una MNAzima adicional, dicho núcleo catalítico capaz de actuar sobre al menos un sustrato adicional, y en donde los brazos del sustrato de dicha al menos una MNAzima adicional enlazan al menos un sustrato adicional a fin de que el núcleo catalítico de dicha al menos una MNAzima adicional pueda actuar sobre dicho al menos un sustrato adicional. Cada uno de los sustratos adicionales puede ser el mismo, diferente o una combinación de los mismos. De acuerdo a un segundo aspecto de la presente invención, se proporciona un método para detectar la presencia de al menos un facilitador de ensamble que comprende (a) proporcionar dos o más componentes oligonucleótido, en donde al menos un primer componente oligonucleótido y un segundo componente oligonucleótido se auto-ensamblan en la presencia de un facilitador de ensamble para formar al menos una enzima de ácidos nucleicos multicomponente catalíticamente activa (MNAzima) ; (b) poner en contacto los dos o más componentes oligonucleótido con una muestra que contiene de manera putativa el facilitador de ensamble bajo condiciones que permiten: (1) el auto-ensamble de dicha al menos una MNAzima catalíticamente activa, y (2) la actividad catalítica de dicha MNAzima; y (c) determinar la presencia de la actividad catalítica de dicha al menos una MNAzima, en donde la presencia de la actividad catalítica es indicativa de la presencia de dicho al menos un facilitador de ensamble.

Al menos uno de dichos componentes oligonucleótido o facilitador de ensamble puede estar comprendido de ADN o un análogo del mismo. El facilitador de ensamble puede ser un objetivo a ser identificado, detectado o cuantificado. El objetivo puede comprender un ácido nucleico. El ácido nucleico puede seleccionarse del grupo que comprende de ADN, ADN metilado, ADN alquilado, ARN, ARN metilado, microARN, ARNsi, ARNsh, ARNm, ARNt, ARNsno, ARNst, ARNsm, pre- y pri-microARN, otros ARNs de no codificación, ARN ribosomal, derivados de los mismos, amplicones, o cualquier combinación de los mismos. El ARN ribosomal puede ser ARN ribosomal 16S. La fuente del ácido nucleico puede seleccionarse del grupo que comprende de sintético, mamífero, humano, animal, planta, fúngico, bacteriano, viral, bacterias archaélicas o cualquier combinación de los mismos. El método puede comprender además una etapa de amplificar el facilitador de ensamble. La etapa de amplificación puede comprender uno o más de: reacción de cadena de polimerasa (PCR), amplificación de desplazamiento de la hebra (SDA) , amplificación de isoterma mediada por lazo (LAMP) , amplificación del círculo de enrollamiento (RCA) , amplificación mediada por la transcripción (TMA) , replicación de secuencia auto-sostenida (3SR), amplificación basada en la secuencia de ácidos nucleicos (NASBA) , o reacción de cadena de la polimerasa de transcripción inversa (RT-PCR) . Al menos uno de dicho facilitador de ensamble, dichos componentes oligonucleótido o sustrato o una combinación de los mismos puede estar comprendido de más que una molécula. El método puede comprender además la determinación de la presencia de dicha actividad catalítica durante o después de dicha amplificación. El auto-ensamble de la MNAzima puede requerir el contacto del facilitador de ensamble con uno o ambos de dichos primero y segundo componentes oligonucleótido. El método puede comprender además al menos un tercer componente oligonucleótido que contacta al menos una porción de cualquiera o ambos de primer y segundo componentes oligonucleótido para auto-ensamblar la MNAzima. El tercer componente oligonucleótido puede estar comprendido de más que una molécula. De acuerdo a un tercer aspecto de la presente invención, se proporciona un método para detectar la presencia de al menos un facilitador de ensamble que comprende (a) proporcionar dos o más componentes oligonucleótido, en donde al menos un primer componente oligonucleótido y un segundo componente oligonucleótido se auto-ensamblan en la presencia de al menos un primer facilitador de ensamble para formar al menos una primera enzima de ácidos nucleicos multicomponente catalíticamente activa (MNAzima) ; (b) proporcionar al menos un primer sustrato, dicho primer sustrato capaz de ser modificado por dicha primera MNAzima, en donde dicha modificación de dicho sustrato por dicha MNAzima proporciona un efecto detectable; (c) contactar dichos dos o más componentes oligonucleótido con una muestra que contiene de manera putativa dicho al menos primer facilitador de ensamble bajo condiciones que permiten: (1) el auto-ensamble de dicha al menos primera MNAzima, y (2) la actividad catalítica de dicha al menos primera MNAzima; y (d) detectar dicho efecto detectable. Al menos uno de dichos componentes oligonucleótido, facilitador de ensamble o sustrato pueden estar comprendidos de ADN o un análogo del mismo. El facilitador de ensamble puede ser un objetivo a ser identificado, detectado o cuantificado. El objetivo puede comprender un ácido nucleico. El ácido nucleico puede seleccionarse del grupo que comprende de ADN, ADN metilado, ADN alquilado, ARN, ARN metilado, microARN, ARNsi, ARNsh, ARNt, ARNm, ARNsno, ARNst, ARNsm, pre- y pri-microARN, otros ARNs de no codificación, ARN ribosomal, derivados de los mismos, amplicones, o cualquier combinación de los mismos. El ARN ribosomal puede ser ARN ribosomal 16S. La fuente del ácido nucleico puede seleccionarse del grupo que comprende de sintético, mamífero, humano, animal, planta, fúngico, bacteriano, viral, bacterias archaélicas o cualquier combinación de los mismos. El método puede comprender además la etapa de amplificación el ácido nucleico. La etapa de amplificación puede comprender uno o más de: reacción de cadena de polimerasa (PCR), amplificación de desplazamiento de la hebra (SDA) , amplificación de isoterma mediada por lazo (LAMP) , amplificación del círculo de enrollamiento (RCA) , amplificación mediada por la transcripción (TMA) , replicación de secuencia auto-sostenida (3SR) , amplificación basada en la secuencia de ácidos nucleicos (NASBA) , o reacción de cadena de la polimerasa de transcripción inversa (RT-PCR) . Al menos uno de dicho facilitador de ensamble o dicho primer o dicho segundo componentes oligonucleótido o sustrato o combinación de los mismos, puede estar comprendido de más que una molécula. El método puede comprender además detectar dicho efecto detectable durante o después de dicha amplificación. El efecto detectable puede ser indicativo de la presencia de dicho facilitador de ensamble. El efecto detectable puede medirse cuantitativamente o cualitativamente. El sustrato puede ser un ácido nucleico o una proteína. El ácido nucleico puede comprender al menos uno de un ácido nucleico etiquetado, ARN, ADN, análogos de ácido nucleico, ácido nucleico peptídico, ácido nucleico unido, quimera péptido-ácido nucleico, o cualquier combinación de los mismos. La proteína comprende al menos uno de un anticuerpo, polipéptido, glicoproteína, lipoproteína, o cualquier combinación de los mismos. El sustrato puede comprender además al menos una de una nanopartícula o micropartícula o combinación de las mismas. El sustrato puede unirse a un soporte insoluble o puede estar libre en la solución. El sustrato puede comprender un ácido nucleico y dichos brazos del sustrato pueden enlazar dicho sustrato a través del apareamiento de bases complementario. El sustrato puede comprender una porción detectable y una porción del hibridizador por apagado, en donde sobre la modificación del sustrato por la MNAzima, se incrementa o disminuye un efecto detectable proporcionado por la porción detectable. El efecto detectable puede detectarse por espectroscopia de fluorescencia, resonancia de plasmón superficial, espectroscopia de masa, NMR, resonancia de giro del electrón, espectroscopia de fluorescencia de polarización, dicroísmo circular, inmunoensayo, cromatografía, radiometría, fotometría, graficado por centelleo, métodos electrónicos, UV, luz visible o espectroscopia infra roja, métodos enzimáticos o cualquier combinación de los mismos. El método puede comprender además amplificar el efecto detectable por el uso de una cascada de amplificación del efecto detectable. La cascada de amplificación del efecto detectable puede comprender una o más de una cascada de ribozima/ligasa, una cascada de la enzima de ácido nucleico circular, una cascada de enzima de proteína, o una o más enzimas unidas a un soporte, o cualquier combinación de las mismas. La modificación de dicho sustrato puede seleccionarse del grupo que comprende de escisión, ligación, metalación de porfirina, formación de enlaces carbono-carbono, enlaces éster o enlaces amida. El método puede comprender además proporcionar al menos un tercer y cuarto componentes oligonucleótido, dicho al menos tercer y al menos cuarto componentes oligonucleótido son capaces de auto-ensamblarse en la presencia de al menos un facilitador de ensamble adicional para formar al menos una MNAzima catalíticamente activa adicional, y en donde al menos un sustrato adicional está presente en la muestra, dicho sustrato adicional es capaz de ser modificado por la MNAzima adicional, en donde dicha modificación proporciona dicho efecto detectable adicional. El al menos un efecto detectable adicional puede ser detectable independientemente. Al menos uno de cada sustrato adicional puede unirse a un soporte insoluble de modo que solo una de una porción detectable y una porción del hibridizador por apagado del sustrato adicional permanece unida al soporte cuando dicho sustrato adicional se modifica por dicha MNAzima adicional. Un sustrato adicional puede unirse a al menos un soporte insoluble a fin de que se produzca un efecto detectable cuando ese sustrato se modifique por su MNAzima respectiva. De acuerdo a un cuarto aspecto de la presente invención, se proporciona un método para detectar la presencia de al menos un objetivo que comprende (a) proporcionar dos o más componentes oligonucleótido en donde al menos un primer componente oligonucleótido y al menos un segundo componente oligonucleótido son capaces de auto-ensamblarse en la presencia de dicho objetivo para formar una enzima de ácidos nucleicos multicomponente catalíticamente activa (MNAzima) ; y en donde al menos uno de dicho primer y dicho segundo componentes oligonucleótido comprende además al menos una porción del aptámero; (b) contactar dichos componentes oligonucleótido con una muestra que contiene de manera putativa dicho al menos un objetivo bajo condiciones que permiten: (1) el enlace de dicho objetivo a dichas porciones del aptámero y (2) la actividad catalítica de la MNAzima; y (c) determinar la presencia de la actividad catalítica de la MNAzima, en donde la presencia de la actividad catalítica es indicativa de la presencia de dicho objetivo . Al menos uno de dichos componentes oligonucleótido puede unirse a un soporte sólido. Al menos uno de dichos componentes oligonucleótido puede estar comprendido de ADN o un análogo del mismo. El objetivo puede identificarse, detectarse o cuantificarse . El método puede comprender además proporcionar al menos un tercer y cuarto componentes oligonucleótido, dicho al menos tercer y al menos cuarto componentes oligonucleótido son capaces de auto-ensamblarse en la presencia de al menos un objetivo adicional para formar al menos una MNAzima catalíticamente activa adicional y en donde al menos uno de dicho tercer o cuarto componentes oligonucleótido comprende al menos una porción del aptámero adicional que enlaza dicho al menos un objetivo adicional. De acuerdo a un quinto aspecto de la presente invención, se proporciona un método para detectar la presencia de al menos un objetivo que comprende (a) proporcionar dos o más componentes oligonucleótido en donde al menos un primer componente oligonucleótido y un segundo componente oligonucleótido son capaces de auto-ensamblarse en la presencia de al menos un facilitador de ensamble y dicho al menos un objetivo para formar al menos una enzima de ácidos nucleicos multicomponente catalíticamente activa (MNAzima) ; y en donde al menos uno de dicho primer o dicho segundo componentes oligonucleótido o dicho al menos un facilitador de ensamble comprende además al menos un aptámero o porción del mismo y en donde dicho objetivo es capaz de enlazar dicho al menos un aptámero o porción del mismo; (b) proporcionar al menos un inhibidor de dicho auto-ensamble de dicha MNAzima (c) contactar dichos componentes oligonucleótido, facilitador de ensamble y dicho inhibidor con una muestra que contiene de manera putativa dicho al menos un objetivo bajo condiciones que permiten: (1) el enlace de dicho objetivo a dicho al menos un aptámero o porción del mismo y (2) la actividad catalítica de dicha al menos una MNAzima; y (3) la remoción de dicha inhibición de dicho auto-ensamble de dicha MNAzima catalíticamente activa; y (d) determinar la presencia de la actividad catalítica de dicha MNAzima, en donde la presencia de dicha actividad catalítica es indicativa de la presencia de dicho objetivo. El al menos un objetivo puede seleccionarse del grupo que comprende de proteínas, glicoproteínas, lípidos, lipoproteínas, células, virus, bacterias, archaea, hongos, anticuerpos, metabolitos, patógenos, toxinas, contaminantes, venenos, moléculas pequeñas, polímeros, iones metálicos, sales metálicas, priones, ácidos nucleicos o cualquier derivado, porción o combinación de los mismos. Al menos uno de dichos componentes oligonucleótido, facilitador de ensamble o inhibidor puede unirse a un soporte insoluble. Al menos uno de dichos componentes oligonucleótido, facilitador de ensamble, aptámero o porción del aptámero puede comprender además dicho inhibidor. Al menos uno de dicho primer o dicho segundo componentes oligonucleótido o facilitador de ensamble puede comprender además una porción de la secuencia auto-complementaria capaz de formar una estructura de horquilla. La estructura de horquilla puede inhibir el auto-ensamble de dicha MNAzima catalíticamente activa. El aptámero o porción del mismo puede estar comprendido de al menos uno de ácido nucleico, péptido, polipéptido o proteína o un derivado o combinación de los mismos . La inhibición del auto-ensamble de dicha MNAzima catalíticamente activa puede removerse sobre el contacto de dicho aptámero o porción del aptámero con el objetivo. El inhibidor puede ser capaz de enlazar al menos uno del grupo que comprende de dicho aptámero o porción del mismo. El inhibidor puede seleccionarse del grupo que comprende de ARN, ADN, análogos de ácido nucleico, ácidos nucleicos peptídicos, ácidos nucleicos unidos, quimeras péptido-ácido nucleico, o una combinación de los mismos. El método puede comprender además proporcionar un sustrato que pueda modificarse por dicha MNAzima para proporcionar un efecto detectable. La modificación puede seleccionarse del grupo que comprende de escisión, ligación, metalación de porfirina, formación de enlaces carbono-carbono, enlaces éster o enlaces amida. El sustrato no puede modificarse por dicho primer o segundo componentes oligonucleótido individualmente o por ambos dicho primer y segundo componentes oligonucleótido en la ausencia de dicho facilitador de ensamble y dicho objetivo. El sustrato puede comprender un ácido nucleico o una proteína. El ácido nucleico comprende al menos uno de un ácido nucleico etiquetado, ARN, ADN, análogos de ácido nucleico, ácido nucleico peptídico, ácido nucleico unido, quimera péptido-ácido nucleico, o cualquier combinación de los mismos. La proteína puede comprender al menos uno de un anticuerpo, polipéptido, glicoproteína, lipoproteína, o cualquier combinación de los mismos. El sustrato puede comprender además al menos una nanopartícula o micropartícula o combinación de las mismas. La detección del efecto detectable puede ser indicativa de dicha actividad catalítica de dicha MNAzima catalíticamente activa y en donde dicha actividad catalítica es indicativa de dicho objetivo. El efecto detectable puede medirse cuantitativamente o cualitativamente. El efecto detectable puede detectarse por espectroscopia de fluorescencia, resonancia de plasmón superficial, espectroscopia de masa, NMR, resonancia de giro del electrón, espectroscopia de fluorescencia de polarización, dicroísmo circular, inmunoensayo, cromatografía, radiometría, fotometría, graficado por centelleo, métodos electrónicos, UV, luz visible o espectroscopia infra roja, métodos enzimáticos o cualquier combinación de los mismos. El sustrato puede comprender una porción detectable y una porción del hibridizador por apagado, en donde sobre la modificación de dicho sustrato por dicha MNAzima, aumenta o disminuye un efecto detectable proporcionado por dicha porción detectable. De acuerdo a un sexto aspecto de la presente invención, se proporciona un método para detectar la presencia de al menos un objetivo que comprende: (a) proporcionar dos o más componentes oligonucleótido en donde al menos un primer componente oligonucleótido y un segundo componente oligonucleótido son capaces de auto-ensamblarse en la presencia al menos un primer facilitador de ensamble y dicho al menos un primer objetivo para formar al menos una primera enzima de ácidos nucleicos multicomponente catalíticamente activa (MNAzima) ; (b) proporcionar al menos un primer sustrato, dicho primer sustrato capaz de ser modificado por dicha al menos primera MNAzima, en donde dicha modificación de dicho sustrato por dicha MNAzima proporciona un efecto detectable; (c) en donde al menos uno de dicho primer o dicho segundo componentes oligonucleótido o dicho al menos un primer facilitador de ensamble o dicho al menos un primer sustrato comprende además un aptámero y en donde dicho objetivo es capaz de enlazar al menos una porción de dicho aptámero, proporcionando al menos un primer inhibidor que es capaz de inhibir dicho auto-ensamble de dicha MNAzima catalíticamente activa en la ausencia de dicho objetivo; (d) contactar dichos componentes oligonucleótido, dicho facilitador de ensamble, dicho sustrato, y dicho inhibidor con una muestra que contiene de manera putativa dicho objetivo bajo condiciones que permiten: (1) el enlace de dicho objetivo a dicho aptámero y (2) la remoción de dicha inhibición de dicho auto-ensamble de dicha MNAzima catalíticamente activa (3) la actividad catalítica de la MNAzima; y (e) determinar la presencia de dicho efecto detectable detectando así la presencia de dicho objetivo. Al menos uno de dichos componentes oligonucleótido o facilitador de ensamble puede estar comprendido de ADN o un análogo del mismo. El aptámero, o porción del mismo, puede enlazar un objetivo seleccionado del grupo que comprende de ácidos nucleicos, proteínas, glicoproteínas, lípidos, lipoproteínas, células, virus, bacterias, archaea, hongos, anticuerpos, metabolitos, patógenos, toxinas, contaminantes, venenos, moléculas pequeñas, polímeros, iones metálicos, sales metálicas, priones o cualquier derivado, porción o combinación de los mismos. Al menos uno de dichos componentes oligonucleótido, facilitador de ensamble, sustrato, o inhibidor puede unirse a un soporte insoluble. Al menos uno de dichos componentes oligonucleótido, facilitador de ensamble, aptámero o porción del aptámero puede comprender además dicho inhibidor. El aptámero o la porción del mismo pueden estar comprendidos de al menos uno de ácido nucleico, péptido, polipéptido o proteína o un derivado o combinación de los mismos . Al menos uno de dicho primer o dicho segundo componentes oligonucleótido, facilitador de ensamble o sustrato puede comprender además una porción de la secuencia auto-complementaria capaz de formar una estructura de horquilla. La estructura de horquilla puede inhibir el auto-ensamble de dicha MNAzima catalíticamente activa. La inhibición del auto-ensamble de dicha MNAzima catalíticamente activa puede removerse sobre el contacto de dicho aptámero o porción del aptámero con el objetivo.

El inhibidor puede ser capaz de enlazar al menos uno del grupo que comprende de dicho aptámero o porción del mismo. El inhibidor puede seleccionarse del grupo que comprende de ARN, ADN, análogos de ácido nucleico, ácidos nucleicos peptídicos, ácidos nucleicos unidos, quimeras péptido-ácido nucleico, o una combinación de los mismos. El sustrato puede comprender un ácido nucleico o una proteína. El ácido nucleico puede comprender al menos uno de un ácido nucleico etiquetado, ARN, ADN, análogos de ácido nucleico, ácido nucleico peptídico, ácido nucleico unido, quimera péptido-ácido nucleico, o cualquier combinación de los mismos. La proteína puede comprender al menos uno de un anticuerpo, polipéptido, glicoproteína, lipoproteína, o cualquier combinación de los mismos. El sustrato puede comprender además al menos una nanopartícula o micropartícula o combinación de las mismas. La detección de dicho efecto detectable puede detectar la presencia de dicho objetivo. El efecto detectable puede medirse cuantitativamente o cualitativamente. El efecto detectable puede detectarse por espectroscopia de fluorescencia, resonancia de plasmón superficial, espectroscopia de masa, NMR, resonancia de giro del electrón, espectroscopia de fluorescencia de polarización, dicroísmo circular, inmunoensayo, cromatografía, radiometría, fotometría, graficado por centelleo, métodos electrónicos, UV, luz visible o espectroscopia infra roja, métodos enzimáticos o cualquier combinación de los mismos. El sustrato puede comprender una porción detectable y una porción del hibridizador por apagado, en donde sobre la modificación de dicho sustrato por dicha MNAzima, aumenta o disminuye un efecto detectable proporcionado por dicha porción detectable. La modificación puede seleccionarse del grupo que comprende de escisión, ligación, metalación de porfirina, formación de enlaces carbono-carbono, enlaces éster o enlaces amida. El método puede comprender además proporcionar al menos un tercer y cuarto componentes oligonucleótido, en donde dicho al menos tercer y al menos cuarto componentes oligonucleótido son capaces de auto-ensamblarse en la presencia de al menos un facilitador de ensamble adicional y al menos un objetivo adicional para formar al menos una MNAzima catalíticamente activa adicional, y en donde al menos un sustrato adicional está presente en la muestra, dicho sustrato adicional es capaz de ser modificado por la MNAzima adicional, en donde dicha modificación proporciona un efecto detectable adicional; y en donde al menos uno de dicho tercer o cuarto componentes oligonucleótido o dicho facilitador de ensamble adicional o dicho sustrato adicional comprende además al menos un aptámero adicional que enlaza dicho al menos un objetivo adicional; en donde al menos una molécula del inhibidor adicional contacta una porción de dicho aptámero adicional, inhibiendo así dicho auto-ensamble de dicha MNAzima catalíticamente activa adicional en la ausencia de dicho objetivo adicional; y en donde dicho al menos un facilitador de ensamble adicional entra en contacto con al menos una porción de dichos componentes oligonucleótido adicionales. El al menos un efecto detectable adicional puede ser detectable independientemente. Cada uno de los sustratos adicionales puede ser el mismo, diferente o una combinación de los mismos. Al menos uno de cada sustrato adicional puede unirse a un soporte insoluble de modo que solo una de una porción detectable y una porción del hibridizador por apagado del sustrato adicional permanece unida al soporte cuando dicho sustrato adicional se modifica por dicha MNAzima adicional. De acuerdo a un séptimo aspecto de la presente invención, se proporciona un método para detectar la presencia de al menos una variante de la secuencia de ácidos nucleicos que comprende: (a) proporcionar dos o más componentes oligonucleótido, en donde al menos un primer componente oligonucleótido y un segundo componente oligonucleótido se auto-ensamblan en la presencia de una variante de la secuencia de un ácido nucleico para formar una enzima de ácidos nucleicos multicomponente catalíticamente activa (MNAzima) ; (b) proporcionar al menos un sustrato, dicho sustrato capaz de ser modificado por dicha primera MNAzima, en donde dicha modificación de dicho sustrato por dicha MNAzima proporciona un efecto detectable; (c) contactar los dos o más componentes oligonucleótido con una muestra que contiene de manera putativa dicha variante de la secuencia bajo condiciones que permiten: (1) el auto-ensamble de dicha MNAzima catalíticamente activa, y (2) la actividad catalítica de dicha MNAzima; y (d) determinar la presencia de dicho efecto detectable detectando así la presencia de dicha al menos una variante de la secuencia. La variante de la secuencia puede seleccionarse del grupo que comprende de polimorfismos sencillos del nucleótido, polimorfismos del nucleótido múltiples, inserciones, eliminaciones, duplicaciones, desplazamientos, variantes de secuencia de desplazamiento de sección invariante, variantes de secuencia no sentido, o cualquier combinación de los mismos. La variante de la secuencia puede estar presente en el ADN o en el ARN. Cualquiera o ambos de dicho primer componente oligonucleótido y dicho segundo componente oligonucleótido pueden estar comprendidos de más que una molécula. La muestra que contienen dicha variante de la secuencia puede seleccionarse del grupo que comprende de ADN metilado o no metilado modificado por bisulfito, ARN metilado o no metilado modificado por bisulfito, al menos un amplicón de ADN metilado o no metilado modificado por bisulfito, al menos un amplicón de ARN metilado o no metilado modificado por bisulfito o una combinación de los mismos. El auto-ensamble de la enzima de ácidos nucleicos multicomponente puede requerir el contacto de al menos una porción de cualquiera o ambos del primer y segundo componentes oligonucleótido con el ácido nucleico que comprende dicha variante de la secuencia. El método puede comprender además una etapa de amplificar el ácido nucleico que contienen dicha variante de la secuencia. La etapa de amplificación puede comprender uno o más de: reacción de cadena de polimerasa (PCR), amplificación de desplazamiento de la hebra (SDA) , amplificación de isoterma mediada por lazo (LAMP) , amplificación del círculo de enrollamiento (RCA) , amplificación mediada por la transcripción (TMA) , replicación de secuencia auto-sostenida (3SR), amplificación basada en la secuencia de ácidos nucleicos (NASBA) , o reacción de cadena de la polimerasa de transcripción inversa (RT-PCR) . El método puede comprender además la determinación de la presencia de dicha variante de la secuencia de ácidos nucleicos durante o después de dicha amplificación. El efecto detectable puede detectarse por espectroscopia de fluorescencia, resonancia de plasmón superficial, espectroscopia de masa, NMR, resonancia de giro del electrón, espectroscopia de fluorescencia de polarización, dicroísmo circular, inmunoensayo, cromatografía, radiometría, fotometría, graficado/analizado por centelleo, métodos electrónicos, UV, luz visible o espectroscopia infra roja, métodos enzimáticos o cualquier combinación de los mismos. El sustrato puede comprender una porción detectable y una porción del hibridizador por apagado, en donde sobre la modificación de dicho sustrato por dicha MNAzima, aumenta o disminuye un efecto detectable proporcionado por dicha porción detectable. El sustrato puede unirse a un soporte insoluble o puede estar libre en la solución. La modificación puede seleccionarse del grupo que comprende de escisión, ligación, metalación de porfirina, formación de enlaces carbono-carbono, enlaces éster o enlaces amida. El método puede comprender además (a) proporcionar al menos un tercer componente oligonucleótido y al menos un cuarto componente oligonucleótido que se auto-ensamblan en la presencia de al menos una variante de la secuencia de ácidos nucleicos adicional para formar al menos una enzima de ácidos nucleicos multicomponente catalíticamente activa (MNAzima) adicional; (b) contactar dicho al menos tercer y al menos cuarto componentes oligonucleótido con una muestra que contiene de manera putativa al menos una variante de la secuencia de ácidos nucleicos adicional en la presencia de al menos un sustrato adicional capaz de ser modificado por dicha al menos una MNAzima adicional, en donde dicha modificación de dicho al menos un sustrato adicional proporciona al menos un efecto detectable adicional bajo condiciones que permiten: (1) el auto-ensamble de al menos una MNAzima, y (2) la actividad catalítica de al menos una MNAzima; y (c) detectar dicho al menos un efecto detectable adicional, detectando así la presencia de dicha al menos una variante de la secuencia adicional. El al menos un efecto detectable adicional puede ser detectable independientemente. Cada uno de los sustratos adicionales puede ser el mismo, diferente o una combinación de los mismos. El método puede comprender además proporcionar un soporte insoluble que tiene dicho sustrato unido al mismo. Al menos uno de cada sustrato adicional puede unirse a un soporte insoluble de modo que solo una de una porción detectable y una porción del hibridizador por apagado del sustrato adicional permanece unida al soporte cuando dicho sustrato adicional se modifica por dicha MNAzima adicional. De acuerdo a un octavo aspecto de la presente invención, se proporciona un método para detectar la presencia de una variante de la secuencia de un ácido nucleico que comprende: (a) proporcionar dos o más componentes oligonucleótido que comprenden al menos un primer componente oligonucleótido y un segundo componente oligonucleótido capaces de auto-ensamblarse en la presencia de un ácido nucleico para formar al menos una primera enzima de ácidos nucleicos multicomponente catalíticamente activa (MNAzima) ; (b) contactar los dos o más componentes oligonucleótido con una muestra que contiene de manera putativa el ácido nucleico, en la presencia de al menos un primer sustrato modificable por dicha al menos una primera MNAzima, en donde el sustrato comprende una porción detectable capaz de proporcionar al menos un primer efecto detectable sobre la modificación del sustrato por dicha al menos una primera MNAzima bajo condiciones que permiten: (1) el auto-ensamble de la MNAzima, y (2) la actividad catalítica de la MNAzima; y (c) en donde la ausencia de la actividad catalítica es indicativa de la presencia de una variante de la secuencia en dicho ácido nucleico. De acuerdo a un noveno aspecto de la presente invención, se proporciona un método para detectar la presencia de al menos un ácido nucleico metilado que comprende (a) proporcionar dos o más componentes oligonucleótido, en donde al menos un primer componente oligonucleótido y un segundo componente oligonucleótido se auto-ensamblan en la presencia del ácido nucleico metilado para formar al menos una enzima de ácidos nucleicos multicomponente catalíticamente activa (MNAzima) ; (b) proporcionar al menos un primer sustrato, dicho primer sustrato capaz de ser modificado por dicha primera MNAzima, en donde dicha modificación de dicho sustrato por dicha MNAzima proporciona al menos un primer efecto detectable; (c) contactar los dos o más componentes oligonucleótido con una muestra que contiene de manera putativa el ácido nucleico metilado bajo condiciones que permiten: (1) el auto-ensamble de la MNAzima catalíticamente activa, y (2) la actividad catalítica de la MNAzima; y (d) determinar la presencia de dicho al menos un efecto detectable detectando así la presencia de dicho al menos un ácido nucleico metilado. Las condiciones pueden comprender además una temperatura que facilita la hibridación de dicha MNAzima con dicho ácido nucleico metilado pero no con un ácido nucleico no metilado. El método puede comprender además amplificar el efecto detectable por el uso de una cascada de amplificación del efecto detectable. La cascada de amplificación del efecto detectable puede comprender una o más de una cascada de ribozima/ligasa, una cascada de la enzima de ácido nucleico circular, una cascada de enzima de proteína, o una o más enzimas unidas a un soporte, o cualquier combinación de las mismas. La fuente de dicho ácido nucleico metilado puede seleccionarse del grupo que comprende de sintético, mamífero, humano, ácido animal, planta, fúngico, bacteriano, viral, bacterias archaélicas o cualquier combinación de los mismos. El ácido nucleico metilado puede seleccionarse del grupo que comprende de ADN metilado o ARN metílado. El auto-ensamble de la enzima de ácidos nucleicos multicomponente puede requerir el contacto del ácido nucleico metilado con uno o ambos del primer y segundo componentes oligonucleótido. El método puede comprender además proporcionar un soporte insoluble que tiene al menos uno de dicho sustrato o dichos primer o segundo componentes oligonucleótido, o una combinación de los mismos unida al mismo. El efecto detectable puede detectarse por espectroscopia de fluorescencia, resonancia de plasmón superficial, espectroscopia de masa, NMR, resonancia de giro del electrón, espectroscopia de fluorescencia de polarización, dicroísmo circular, inmunoensayo, cromatografía, radiometría, fotometría, graficado/analizado por centelleo, métodos electrónicos, UV, luz visible o espectroscopia infra roja, métodos enzimáticos o cualquier combinación de los mismos. El sustrato puede comprender una porción detectable y una porción del hibridizador por apagado, en donde sobre la modificación de dicho sustrato por dicha MNAzima, aumenta o disminuye un efecto detectable proporcionado por dicha porción detectable. La modificación puede seleccionarse del grupo que comprende de escisión, ligación, metalación de porfirina, formación de enlaces carbono-carbono, enlaces éster o enlaces amida. El método puede comprender además proporcionar al menos un tercer y cuarto componentes oligonucleótido, en donde dicho al menos tercer y al menos cuarto componentes oligonucleótido son capaces de auto-ensamblarse en la presencia de al menos un ácido nucleico metilado adicional para formar al menos una MNAzima catalíticamente activa adicional, y en donde al menos un sustrato adicional está presente en la muestra, dicho sustrato adicional es capaz de ser modificado por dicha MNAzima adicional, en donde dicha modificación proporciona dicho efecto detectable adicional . El al menos un efecto detectable adicional puede ser detectable independientemente. Cada uno de los sustratos adicionales puede ser el mismo, diferente o una combinación de los mismos. Al menos uno de dicho sustrato adicional puede unirse a un soporte insoluble de modo que solo una de una porción detectable adicional y una porción del hibridizador por apagado adicional del sustrato adicional permanece unida al soporte cuando dicho sustrato adicional se modifica por dicha MNAzima adicional. De acuerdo a un décimo aspecto de la presente invención, se proporciona un método para detectar al menos un facilitador de ensamble usando una cascada de amplificación que comprende: (a) proporcionar dos o más componentes oligonucleótido que comprenden al menos un primer componente oligonucleótido y al menos un segundo componente oligonucleótido que se auto-ensamblan en la presencia de al menos un primer facilitador de ensamble para formar al menos una primera enzima de ácidos nucleicos multicomponente catalíticamente activa (MNAzima) ; (b) proporcionar un soporte insoluble que tiene al menos un primer sustrato unido al mismo, dicho primer sustrato es capaz de ser modificado por dicha MNAzima, en donde dicho primer sustrato comprende al menos una tercera molécula que comprende al menos una primera enzima catalíticamente activa que se libera sobre la modificación de dicho primer sustrato por dicha primera MNAzima; (c) contactar dichos dos o más componentes oligonucleótido con una muestra que contiene de manera putativa dicho facilitador de ensamble, en la presencia de dicho soporte insoluble que tiene dicho primer sustrato unido al mismo bajo condiciones que permiten: (1) el auto-ensamble de dicha MNAzima, y (2) la actividad catalítica de dicha MNAzima; y (d) proporcionar un soporte insoluble que tiene al menos un segundo sustrato unido al mismo, dicho segundo sustrato que se puede escindir por dicha primera enzima catalíticamente activa en donde dicho segundo sustrato comprende al menos una cuarta molécula que comprende al menos un radical detectable que se libera sobre la modificación de dicho segundo sustrato por dicha primera enzima; y (e) en donde dicha primera enzima catalíticamente activa modifica una pluralidad de dicho segundo sustrato liberando así una pluralidad de radicales detectables; (f) en donde dichos radicales detectables son detectables después de la modificación de dicho segundo sustrato por dicha primera enzima catalíticamente activa; y (g) en donde la detección de dichos radicales detectables es indicativa de la presencia de dicho facilitador de ensamble.

Los radicales detectables pueden comprender además una segunda enzima catalíticamente activa adicional capaz de modificar dicho primer sustrato liberando así la enzima catalíticamente activa adicional. Al menos una de dicha primera o dicha segunda enzima catalíticamente activa puede seleccionarse del grupo que comprende de MNAzimas, ADNzimas, ribozimas, enzimas hidrolíticas, endonucleasas de restricción, exonucleasas, proteasas, proteinasas, hidrolasas, liticasas, peptidasas, dipeptidasas, esterasas, caspasas, catepsisnas, desulfhidrasas, amidasas, glicosidasas . El facilitador de ensamble puede comprender un objetivo a ser identificado, detectado o cuantificado. El objetivo puede seleccionarse del grupo que comprende de ácidos nucleicos, proteínas, glicoproteínas, lípidos, lipoproteínas, células, virus, bacterias, archaea, hongos, anticuerpos, metabolitos, patógenos, toxinas, contaminantes, venenos, moléculas pequeñas, polímeros, iones metálicos, sales metálicas, priones, ácidos nucleicos o cualquier derivado, porción o combinación de los mismos. El ácido nucleico puede seleccionarse del grupo que comprende de ADN, ADN metilado, ADN alquilado, ARN, ARN metilado, microARN, ARNsi, ARNsh, ARNm, ARNt, ARNsno, ARNst, ARNsm, pre- y pri-microARN, otros ARNs de no codificación, ARN ribosomal, derivados de los mismos, amplicones de los mismos, o cualquier combinación de los mismos . De acuerdo a un decimoprimero aspecto de la presente invención, se proporciona un método para detectar un objetivo usando una cascada de amplificación de señal mediada por MNAzima que comprende: (a) proporcionar un primer componente de oligonucleótido y un segundo componente de oligonucleótido que se auto-ensamblan en la presencia de dicho objetivo para formar una primera enzima de ácidos nucleicos multicomponente catalíticamente activa (MNAzima) ; (b) proporcionar un soporte insoluble que tiene un primer y un segundo sustrato unidos al mismo, dichos primer y segundo sustratos son capaces de modificarse por dicha primera MNAzima, en donde dichos primer y segundo sustratos comprenden al menos un tercer y un cuarto componentes oligonucleótido respectivamente, capaces de formar una segunda MNAzima catalíticamente activa, en donde dicho tercer y cuarto componentes oligonucleótido se liberan sobre la modificación de dicho primer y segundo sustratos por dicha primera MNAzima; (c) proporcionar dicho soporte insoluble que tiene un tercer y un cuarto sustrato unidos al mismo, dicho tercer y cuarto sustratos son capaces de ser modificados por dicha segunda MNAzima, en donde dichos tercer y cuarto sustratos comprenden al menos un quinto y un sexto componente oligonucleótido respectivamente, capaces de formar una tercera MNAzima catalíticamente activa, en donde dicho quinto y dicho sexto componentes oligonucleótido se liberan sobre la modificación de dichos tercer y cuarto sustratos por dicha segunda MNAzima, y; (d) proporcionar un facilitador de ensamble capaz de facilitar el ensamble de dicha segunda y dicha tercera MNAzima, y; (e) proporcionar un quinto sustrato que es capaz de ser modificado por dicha segunda MNAzima para proporcionar un efecto detectable; (f) poner en contacto dichos primer y segundo componentes de oligonucleótido con una muestra que contiene de manera putativa dicho objetivo, en la presencia de dicho facilitador de ensamble, y en la presencia de dicho soporte insoluble que tiene dicho primero, segundo, tercero y cuarto sustratos unidos al mismo bajo condiciones que permiten: (1) el auto-ensamble de dicha primera, segunda y tercera MNAzimas, y (2) la actividad catalítica de dicha primera, segunda y tercera MNAzimas; y (g) en donde dicha tercera MNAzima modifica dichos primer y segundo sustratos proporcionando adicionalmente así dicha segunda MNAzima en donde dicha segunda MNAzima modifica adicionalmente al menos uno de dicho tercer, cuarto y quinto sustratos proporcionando adicionalmente así dicha tercera MNAzima proporcionando adicionalmente así dicho efecto detectable, y; (h) en donde la detección de dicho efecto detectable es indicativa de la presencia de dicho objetivo. El objetivo puede identificarse, detectarse o cuantificarse . El objetivo puede seleccionarse del grupo que comprende ácidos nucleicos, proteínas, glicoproteínas, lípidos, lipoproteínas, células, virus, bacterias, archaea, hongos, anticuerpos, metabolitos, patógenos, toxinas, contaminantes, venenos, moléculas pequeñas, polímeros, iones metálicos, sales metálicas, priones, ácidos nucleicos o cualquier derivado, porción o combinación de los mismos. El ácido nucleico puede seleccionarse del grupo que comprende de ADN, ADN metilado, ADN alquilado, ARN, ARN metilado, microARN, ARNsi, ARNsh, ARNm, ARNt, ARNsno, ARNst, ARNsm, pre- y pri-microARN, otros ARNs de no codificación, ARN ribosomal, derivados de los mismos, amplicones de los mismos, o cualquier combinación de los mismos . El quinto sustrato puede ser el mismo o diferente a cualesquiera de dichos primero, segundo, tercero o cuarto sustratos.

Cada uno de dichos primero, segundo, tercero o cuarto sustratos puede estar presente en el mismo soporte sólido o en soportes sólidos diferentes o en cualquier combinación de los mismos. La modificación de al menos uno de dichos primero, segundo, tercero o cuarto sustratos puede proporcionar además un efecto detectable. De acuerdo con un decimosegundo aspecto de la presente invención, se proporciona un método para preparar una pluralidad de enzimas de ácidos nucleicos multicomponente (MNAzimas) que cada una reconoce al menos un facilitador de ensamble y modifica a un sustrato, el método que comprende: (a) proporcionar una pluralidad de facilitadores de ensamble a ser identificados, detectados o cuantificados (b) diseñar dos o más componentes oligonucleótido en donde al menos un primer componente oligonucleótido y un segundo componente oligonucleótido se auto-ensamblan en la presencia de un facilitador de ensamble para formar una enzima de ácidos nucleicos multicomponente catalíticamente activa (MNAzima) , en donde cada uno de los al menos primer y segundo componentes oligonucleótido comprende una porción del brazo del sustrato, una porción del núcleo catalítico, y una porción del brazo detector, en donde luego del auto-ensamble, la porción del brazo detector del primer y segundo componentes de oligonucleótido forman los brazos detectores de la MNAzima, la porción del brazo del sustrato del primer y segundo componentes de oligonucleótido forman los brazos del sustrato de la MNAzima, y la porción del núcleo catalítico del primer y segundo componentes de oligonucleótido forman un núcleo catalítico de la MNAzima; y en donde los brazos detectores de la MNAzima interactúan con un facilitador de ensamble para mantener los primer y segundo componentes de oligonucleótido en proximidad para la asociación de sus porciones del núcleo catalítico respectivas para formar el núcleo catalítico de la MNAzima, dicho núcleo catalítico capaz de actuar sobre al menos un sustrato, y en donde los brazos del sustrato de la MNAzima enlazan un sustrato de modo que el núcleo catalítico de la MNAzima puede modificar dicho sustrato; (c) alterar dichos dos o más componentes de oligonucleótido tal que la porción del brazo del sustrato y la porción del núcleo catalítico del primer y segundo componentes de oligonucleótido sean constantes, y la porción del brazo detector de al menos uno del primer y segundo componentes de oligonucleótido se adapta para reconocer otro de la pluralidad de facilitadores de ensamble, y (d) repetir la etapa de alteración para cada uno de la pluralidad de facilitadores de ensamble. De acuerdo con un decimotercero aspecto de la presente invención, se proporciona un equipo o kit para detectar la presencia de una pluralidad de objetivos que comprenden una pluralidad de componentes oligonucleótido diseñados para ensamblar una pluralidad de MNAzimas cada una correspondiente a al menos uno de una pluralidad de objetivos, y al menos un sustrato. De acuerdo a un decimocuarto aspecto de la presente invención, se proporciona un equipo para ensamblar una pluralidad de MNAzimas que comprende una pluralidad de facilitadores de ensamble, una pluralidad de componentes oligonucleótido diseñados para ensamblar una pluralidad de MNAzimas cada una correspondiente a cada uno de la pluralidad de facilitadores de ensamble, y al menos un sustrato. De acuerdo a un decimoquinto aspecto de la presente invención, se proporciona un equipo para detectar un objetivo que comprende una pluralidad de componentes oligonucleótido diseñados para ensamblar una MNAzima correspondiente al objetivo, y un sustrato.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Se describirá ahora una modalidad preferida de la presente invención, solo a manera de un ejemplo, con referencia a los dibujos acompañantes en donde: Figura 1: Diseño para una MNAzima: se muestra una representación de un diseño ejemplar para una MNAzima, en donde las porciones (A) del brazo del sustrato de las partzimas A y B enlazan a un sustrato Reportero, al cual se une una etiqueta fluorescente (izquierda) y un hibridizador por apagado (derecha) . Las porciones (C) del núcleo catalítico se localizan entre las porciones (A) del brazo del sustrato y las porciones (B) del brazo detector. Sobre el enlace de las porciones (B) del brazo detector a un Objetivo, el sustrato Reportero se escinde en el Sitio de Escisión de la MNAzima, incrementando así la fluorescencia. Figura 2 : Estrategias para la detección del objetivo mediada por la MNAzima: se muestra un diagrama de flujo que muestra las aplicaciones ejemplares de los métodos para la detección del objetivo usando las MNAzimas.

Las MNAzimas pueden usarse para (1) la detección directa; (2) detectar amplicones generados, por ejemplo, por PCR, SDA, LAMP, RCA, TMA, 3SR o NASBA ya sea durante, o después de, la amplificación; y (3) iniciar una cascada de amplificación de señal. Figura 3: Método para la detección de objetivos usando una MNAzima y sustratos genéricos anclados: se muestra una representación de las MNAzimas ejemplares y un método para la detección del objetivo usando las MNAzimas que escinden sustratos atados a un soporte. En esta modalidad, la MNAzima se forma solo en la presencia de un facilitador de ensamble (objetivo) . Cuando la MNAzima escinde el sustrato atado entre un fluoróforo y el hibridizador por apagado, se genera una señal. Como se muestra aquí, sobre la escisión entre el fluoróforo F y el hibridizador por apagado Q, hay un incremento resultante en la fluorescencia. En general, el método puede diseñarse tal que ya sea el fluoróforo F o el hibridizador por apagado Q puede permanecer unido al soporte una vez que ocurre la escisión. Panel (i): El soporte mostrado tiene solo un sustrato atado a él. Panel (ii) : Pueden haber múltiples sustratos atados en posiciones diferentes. Cada sustrato puede escindirse solo por una MNAzima formada en la presencia de una molécula específica del facilitador de ensamble de MNAzima - aquí, los Objetivos 1 y 2 facilitan el auto-ensamble de las MNAzimas 1 y 2 respectivamente. Así, en este ejemplo la MNAzima 1 solo se auto-ensambla en la presencia del Objetivo 1 y solo escinde al Sustrato 1. De modo semejante, la MNAzima 2 solo se auto-ensambla en la presencia del Objetivo 2 y solo escinde al Sustrato 2. La señal puede localizarse mediante el posicionamiento del sustrato sobre la superficie, permitiendo así la detección específica de diferentes facilitadores de ensamble. Figura 4: Métodos ejemplares para la detección del objetivo: se muestran ejemplos de los métodos que usan una MNAzima para detectar un analito (An) objetivo, por ejemplo, incluyendo pero no limitado a una proteína o una molécula pequeña. Este ejemplo muestra la generación de una señal por la escisión de la MNAzima de un sustrato etiquetado con un fluoróforo (F) y un hibridizador por apagado (Q) . Los diseños generales podrían usarse en otros formatos, por lo cual la señal se genera por una modificación diferente de la escisión y/o donde la lectura no es fluorescente, pero, por ejemplo, es colorimétrica, radiactiva, etc. Se ilustran tres estrategias generales en esta figura, (i) Un aptámero para enlazar un analito objetivo se enlaza a una partzima (una apta-partzima) . Esta molécula tiene auto-complementariedad, y no puede contribuir al ensamble de la MNAzima activa en la ausencia del analito objetivo. También se proporcionan una segunda partzima, un sustrato y un facilitador de ensamble. Cuando un analito objetivo específico se enlaza al dominio del aptámero, las bases complementarias dentro de la apta-partzima se separan, habilitando a la apta-partzima a adoptar una conformación por lo cual puede contribuir al ensamble de la MNAzima activa. La MNAzima activa puede escindir el sustrato y generar fluorescencia. (ii) Un aptámero para enlazar un analito objetivo se enlaza a un facilitador de ensamble. Esta molécula tiene auto-complementariedad, y no puede dirigir las partzimas para alinear y ensamblar una MNAzima activa en la ausencia del analito objetivo. También se proporcionan dos partzimas y un sustrato. Cuando un analito objetivo específico se enlaza al dominio del aptámero, las bases complementarias dentro del facilitador de ensamble se separan, habilitando al facilitador de ensamble a adoptar una conformación por lo cual puede dirigir el ensamble de la MNAzimas activa. La MNAzima activa puede escindir al sustrato y generar fluorescencia, (iii) Dos apta-partzimas, cada una de las cuales contiene una porción de un aptámero, se incuban en la presencia de un sustrato. En la ausencia del analito objetivo, las dos apta-partzimas no pueden ensamblarse para formar una MNAzima activa. Cuando está presente un analito objetivo específico, y se enlaza a ambos de los dominios que contienen una porción del aptámero, las dos apta-partzimas se ponen en proximidad cercana y pueden ensamblarse en una MNAzima activa. La MNAzima activa puede escindir al sustrato y generar fluorescencia. Figura 5: Amplificación PCR de microARNs y detección usando las MNAzimas: se muestra una representación de una estrategia de la MNAzima para la amplificación y detección de secuencias cortas tales como las especies micro-ARN (miR) . El método usa un cebador 3' que se enlaza al miR en el extremo 3' y que tiene una secuencia de extensión no relacionada (mostrada en cuadros con líneas punteadas) que puede (partes (i) y (ii) , Cebador de bucle o lazo, izquierdo) , o no puede (partes (iii) y (iv) , cebador etiquetado, derecho) , formar una estructura de vástago-lazo en el extremo 5 A El cebador miR 3' se extiende en la presencia de la transcriptasa inversa (partes (i) y (iii) , seguido por la amplificación vía PCR usando los cebadores 5' y 3' con la secuencia específica miR en los extremos 3' y la secuencia de extensión no relacionada en los extremos 5' (partes (ii) y (iv) ) . Los amplicones pueden detectarse por las MNAzimas, las cuales hibridan al amplicón, incluyendo la región entre los cebadores 5' y 3' . Un requerimiento para la complementariedad estricta de los brazos detectores de la MNAzima y el ácido nucleico objetivo permite la discriminación de secuencias estrechamente relacionadas. F: fluoróforo; Q: hibridizador por apagado. Figura 6 : Detección de la MNAzima acoplada a la amplificación de señal mediada por la enzima: se muestra una representación de una MNAzima para iniciar una cascada de amplificación de señal. En esta modalidad las MNAzimas disparan una cascada de generación de señal corriente abajo, en donde (de izquierda a derecha, panel superior) una MNAzima se forma solo en la presencia de un objetivo y luego libera una enzima de una posición atada sobre un soporte. Como se muestra en el panel del fondo, la enzima liberada posteriormente escinde una molécula del sustrato fluorescente. El sustrato fluorescente se detecta fácilmente. F: fluoróforo; Q: hibridizador por apagado. Figura 7 : Detección de analitos usando las MNAzimas y la amplificación de señal: Una MNAzima puede disparar una cascada generada usando ADNzimas separadas espacialmente. Como se muestra en las etapas secuencialmente numeradas, un evento inicial de escisión de la MNAzima, el cual ocurre solo en la presencia del objetivo, puede escindir al sustrato inmovilizado, liberando así una primera ADNzima A atada ("A") (etapas 1-3) . La ADNzima A, una vez liberada, escinde entonces y libera la segunda ADNzima B atada ("B") (etiquetada con fluoróforo) (etapas 4-6) que, a su vez, escinde y libera la ADNzima A adicional (etapas 7-8), resultando en la iniciación de una cascada. La amplificación de señal exponencial hace la medición demasiado fácil mientras la ADNzima B con fluoróforo se libera en la cascada resultante. F: fluoróforo; Q: hibridizador por apagado. Figura 8: Diseño de la MNAzima para el objetivo RPLPO: Panel (i): Secuencias ejemplares para los diseños 1 (panel superior) y 2 (panel inferior) para las MNAzimas; Panel (ii) : Resultados de la escisión dependiente del objetivo de un sustrato reportero por los diseños 1 (panel superior) y 2 (panel inferior) de la MNAzima. N=A, G, C, T o cualquier análogo; N' = cualquier nucleótido complementario para N; (N o N')x = cualquier número de nucleótidos o análogos; K= A, G o AA; W=A o T; rN = cualquier ribonucleótido y/o cualquier número de ribonucleótidos; *= base wobble. Figura 9: Diseño de la MNAzima para el objetivo RPLPO: Panel (i) : Secuencia ejemplar para el diseño 3 para una MNAzima; Panel (ii) : Resultados para la escisión dependiente del objetivo de un sustrato reportero. Las reacciones de control mostradas incluyen control de hibridación sin objetivo, dos controles fuera de objetivo y reacciones que contienen ya sea los oligonucleótidos de la partzima A o partzima B, pero no ambos. N=A, G, C, T o cualquier análogo; N' = cualquier nucleótido complementario para N; (N o N')x = cualquier número de nucleótidos o análogos; K= A, G o AA; W=A o T; rN = cualquier ribonucleótido y/o cualquier número de ribonucleótidos; *= base wobble. Figura 10: Diseño de la MNAzima para el objetivo RPLPO: Panel (i) : Secuencia ejemplar para el diseño 4 para una MNAzima; Panel (ii) : La eficiencia de la escisión dependiente del objetivo para los diseños 3 y 4. Los resultados se muestran para reacciones que contienen los oligonucleótidos RPLPO objetivo, y para los controles que carecen del objetivo. N=A, G, C, T o cualquier análogo; N' = cualquier nucleótido complementario para N; (N o N')x = cualquier número de nucleótidos o análogos; K= A, G o AA; W=A o T; rN = cualquier ribonucleótido y/o cualquier número de ribonucleótidos; *= base wobble. Figura 11 : Uso de las MNAzimas para discriminar entre secuencias estrechamente relacionadas: Panel (i): Se ilustran secuencias de ADN, homologas a la hsa-miR-20 y secuencias miR relacionadas, usadas como la secuencia objetivo en los experimentos en las Figuras 11 y 12. Las diferencias en la secuencia entre D-20 y D-miRs relacionadas están subrayadas. La línea vertical a rayas, en negritas, separa las regiones de los oligonucleótidos reconocidas por los dos brazos detectores. Panel (ii) : Representa las secuencias ejemplares para una MNAzima de diseño 4 para la detección de miR-20. Panel (iii): Los resultados para la escisión dependiente del objetivo de la MNAzima D-20 de un sustrato reportero. Reacciones de control mostradas: oligonucleótidos "fuera de objetivo" (D-17-5p, D-106a, D-106b, D-93), y reacciones de control (dH20) "sin objetivo". Figura 12 : Optimización de MgCl2 del sistema MNAzima MiR-20: Resultados obtenidos usando un sistema MNAzima de diseño 4 ejemplar para la detección de miR-20. Escisión dependiente del objetivo (D-20) de un sustrato reportero. Las reacciones de control que contienen secuencias "fuera de objetivo" (D-17-5p, D-106a, D-106b, D-93) o "no objetivo" (dH20) , se muestran para reacciones que contienen (i) 5 mM, (ii) 25 mM o (iii) 100 mM de MgCl2, respectivamente. Figura 13: Diseño de la MNAzima para el objetivo RPLPO: Panel (i) : Secuencias ejemplares para los diseños 5 y 6 para las MNAzimas. Panel (ii) : Resultados para la escisión dependiente del objetivo de un sustrato reportero usando los diseños 5 y 6, y sus controles "no objetivo". N=A, G, C, T o cualquier análogo; N' = cualquier nucleótido complementario para N; (N o N')x = cualquier número de nucleótidos o análogos; R = A o G; Y=C o U; rN = base del ribonucleótido . Figura 14: Detección de RPLPO amplificada con PCR: Resultados para la escisión dependiente del objetivo de un sustrato reportero y varias reacciones de control por el sistema MNAzima diseño 4 que tiene como objetivo el ge RPLPO humano. La reacción de la MNAzima RPLPO contuvo ya sea (i) oligonucleótidos RPLPO de control, (ii) amplicones PCR RPLPO (5 µl) producidos por amplificación de ADN genómico humano (100 ng) usando cebadores complementarios para el gen RPLPO, (iii) reacciones PCR RPLPO "no objetivo" que carecen de ADN genómico o (iv) ADN genómico humano no amplificado (500 ng) .

Figura 15: Detección de secuencias cortas (22mer) amplificadas: Panel (i): Resultados para la escisión dependiente del objetivo de un sustrato reportero por un sistema MNAzima diseño 4 que tiene como objetivo la secuencia miR-20 humana. Las reacciones de la MNAzima MiR-20 se realizaron con ya sea (i) 1012 (1 E+12) copias del oligonucleótido Objetivo D-20 de control (no amplificado) ; (ii) amplicones PCR (5 µl) producidos por amplificación de 2 x 107 (2 E+7) copias del oligonucleótido objetivo D-20 usando cebadores complementarios para las secuencias miR-20; (iii) reacciones PCR "no objetivo" que carecen del oligonucleótido Objetivo D-20; (iv) 108 (1 E+8) copias del oligonucleótido Objetivo D-20 (no amplificado) ; y (v) un Objetivo D-17-5p de control "fuera de objetivo" (2 x 107 (2 E+7) copias amplificadas por PCR). Panel (ii) : Comparación de la secuencia Objetivo D-20 y la secuencia fuera de objetivo, D-17-5p. El oligonucleótido D-17-5p tiene un desapareamiento dentro de la región de enlace del cebador PCR relativo a la secuencia Objetivo D-20, y un desapareamiento dentro de la región (localizado entre los cebadores) que es interrogada por los brazos detectores de las MNAzimas. Figura 16: Detección de amplicones miR-20 amplificados: Ejemplo de detección del punto final de los amplicones usando las MNAzimas siguiendo la amplificación PCR. La PCR se usó para amplificar el microARN miR-20 presente en el ARN total de las células humanas del timo, y se detectó usando la metodología de la MNAzima. Las muestras amplificadas y los controles son como se muestra. Figura 17 : Análisis PCR en tiempo real cuantitativo del exón 5 de RPLPO por el diseño 6 de MNAzima: Ejemplo de detección y cuantificación en tiempo real usando la metodología de la MNAzima, en donde el gen RPLPO se detectó usando MNAzimas para monitorear la acumulación del exón 5 de RPLPO. Panel (i) : Diseño 6 de la MNAzima; Panel (ii) : señal de fluorescencia que indica la PCR en tiempo real para diferentes cantidades del molde macromolecular como se muestra; Panel (iii) : curva estándar y cuantificación del material amplificado. Los resultados muestran el incremento dependiente del tiempo en la fluorescencia para la detección de la MNAzima del ADN genómico humano amplificado vía PCR. R=0.995; pendiente = - 3.698 Figura 18: Representación esquemática de un análisis múltiple ejemplar de múltiples objetivos: Dos o más objetivos pueden detectarse simultáneamente usando dos o más sustratos, cada uno específico para una MNAzima. Los sustratos preferentemente se etiquetan con diferentes fluoróforos. En este ejemplo, el Objetivo 1 puede detectarse monitoreando el incremento en la fluorescencia FAM y el Objetivo 2 puede detectarse monitoreando el incremento en la fluorescencia JOE. Q: hibridizador por apagado; FAM, JOE: fluoróforos. Figura 19: Detección simple y múltiple de secuencias RPLPO y D-20: La detección de RPLPO se monitoreó usando un sustrato etiquetado con JOE y la detección de la secuencia Objetivo D-20 se monitoreó usando un sustrato etiquetado con FAM. Panel (i) : El diseño 6 de la MNAzima comprende partzimas para solo un sistema de MNAzima, ya sea para RPLPO (panel superior) o D-20 (panel inferior) ; Panel (ii) : El diseño 6 de la MNAzima contiene partzimas para las MNAzimas que tienen como objetivo ambos RPLPO y D-20. Figura 20: Detección de la MNAzima de los objetivos usando un aptámero: Se representa una estrategia ejemplar para la detección de un objetivo. En esta estrategia, una secuencia del aptámero se incorpora al final de una partzima (apta-partzima) en una configuración por la cual una MNAzima activa se forma solo en la presencia del objetivo. Los componentes oligonucleótido requeridos para la estrategia de detección de la MNAzima ilustrada incluyen: (a) una partzima estándar; (b) una apta-partzima que es una partzima con un aptámero incorporado en uno de sus extremos; (c) un facilitador de ensamble que enlaza a ambas; la apta-partzima y la partzima habilitando el ensamble de una MNAzima activa (en la presencia del objetivo) ; (d) un sustrato de sonda reportera; y (e) un inhibidor de ensamble que híbrida a la apta-partzima en una región que abarca al menos parte de la secuencia del aptámero y parte del brazo que enlaza al sustrato de la secuencia de partzima. En la ausencia de un analito objetivo (panel (i)), el inhibidor de ensamble se enlaza a la apta-partzima bloqueando así el enlace (y la escisión) del sustrato de sonda reportera. En la presencia de un analito objetivo (panel (ii) ) , el objetivo se enlaza a la secuencia del aptámero de la apta-partzima, previniendo el enlace del inhibidor de ensamble y permitiendo el enlace y la escisión del sustrato de sonda reportera. Como tal, las MNAzimas solo pueden formar y causar la generación de la señal fluorescente en la presencia del objetivo. Figura 21 : Detección de la MNAzima de moléculas pequeñas usando un aptámero: Se representa un ejemplo de uso de las MNAzimas para la detección de objetivos, específicamente ATP. La estrategia ilustrada en la Figura 20 se demostró usando el ejemplo de detección de una molécula pequeña, ATP. Panel (i) ilustra las secuencias de los componentes oligonucleótido que se usaron para la detección del ATP. Estos comprenden una partzima, una aptapartzima (que incorpora un aptámero para enlazar al ATP) , un inhibidor de ensamble aptámero/MNAzima, un sustrato reportero y un facilitador de ensamble. Panel (ii) El análisis de escisión SubBi-1-FB muestra los resultados obtenidos después de la incubación de los componentes oligonucleótido en la presencia, o ausencia, del ATP y otros nucleótidos. Se observó un incremento en la fluorescencia con el tiempo en la presencia del ATP, y dATP, pero no en la presencia de GTP o CTP. Además, no se observó incremento alguno en la fluorescencia en la ausencia de cualquier objetivo (agua el único control). Figura 22: Detección de desapareamientos de bases sencillas usando las MNAzimas: Se representa un ejemplo de uso de las MNAzimas para la detección de desapareamientos de bases sencillas. Panel (i) ilustra las secuencias de los componentes oligonucleótido que se usaron para la detección de desapareamientos de bases sencillas en una secuencia objetivo del exón 5 de RPLPO. El oligonucleótido ilustrado consistió de dos partzimas (A5 y B6) , que se basan en el diseño 7 de la MNAzima (por ejemplo, Ejemplo 20), y un sustrato reportero. La tercera base (X) en el brazo detector de la partzima B está ya sea apareada o desapareada con la secuencia objetivo. Cuando X=G la partzima y el objetivo están completamente apareados. Cuando X=C existe un desapareamiento entre el brazo detector y el objetivo RPLPO. Panel (ii) muestra los resultados obtenidos después de la amplificación PCR y la detección en tiempo real en reacciones que contienen una partzima B que está ya sea completamente apareada, o que está desapareada, con respecto al objetivo RPLPO. Figura 23: Estrategia de la MNAzima y resultados para la detección de SNP: El método usa un brazo detector de la partzima B truncado que está completamente apareado a una versión del SNP, y el oligonucleótido estabilizador que facilita el ensamble de la MNAzima en la presencia del objetivo completamente apareado. El requerimiento para la complementariedad estricta del brazo detector de la partzima B y el ácido nucleico objetivo permite la discriminación de secuencias estrechamente relacionadas. Panel (i) : Brazo detector de 5 bases completamente apareadas más oligonucleótido estabilizador; Panel (ii) : Brazo detector de 5 bases desapareadas más oligonucleótido estabilizador; Panel (iii) : Ningún control estabilizador; Panel (iv) : Ningún control objetivo; Panel (v) : Resultados de la detección de SNP de MNAzima con objetivo completamente apareado, objetivo desapareado, ningún control estabilizador y ningún control objetivo. Figura 24: Adaptación de la detección de la MNAzima para producir una reacción de cambio de color: El método usa partículas de oro de nano-escala con oligonucleótidos unidos, los cuales, cuando se enlazan por puentes de oligonucleótidos, forman un agregado azul (panel i) . Los puentes de oligonucleótidos incorporan una secuencia del sustrato. En la presencia del objetivo (panel ii), la MNAzima ensambla y escinde la secuencia del sustrato, liberando partículas individuales de oro, y dando como resultado un cambio de color azul a rojo que es visible a simple vista. Figura 25: Ejemplo de una cascada de MNAzima usando partzimas atadas: Las MNAzimas pueden usarse para iniciar cascadas de amplificación de señal como se ilustra en este diagrama. La reacción contiene los siguientes elementos: (i) partzimas para la MNAzima 1 que están libres en la solución; (ii) un facilitador de ensamble para las MNAzimas 2 y 3 (que tienen los mismos brazos detectores) que está ya sea libre en la solución (como se ilustra) o atado a un soporte insoluble por el sustrato, Sub 1; (iii) partzimas para la MNAzima 2 que están atadas a un soporte insoluble por el sustrato, Sub 1. Sub 1 puede escindirse por ya sea la MNAzima 1 (en la presencia de un objetivo) o por la MNAzima 3 (en la presencia de un facilitador de ensamble) , y la escisión resulta en la liberación de las partzimas para la MNAzima 2 en la solución; (iv) partzimas para la MNAzima 3 que están atadas a un soporte insoluble por el sustrato, Sub 2. Sub 2 puede escindirse por la MNAzima 2 (en la presencia del facilitador de ensamble) y la escisión resulta en la liberación de las partzimas para la MNAzima 3 en la solución; (v) Sub 2-FQ, que tiene la misma secuencia que Sub 2, pero está libre en la solución y está doblemente etiquetado con un fluoróforo (F) y un hibridizador por apagado (Q) . Sub 2-FQ puede escindirse por la MNAzima 2 para generar una señal fluorescente. En la presencia del objetivo, la MNAzima 1 activa se forma a partir de partzimas que están libres en la solución. La MNAzima 1 escinde su Sub 1 liberando así partzimas para la MNAzima 2. Una vez libres, estas partzimas se hibridan con el facilitador de ensamble y forman la MNAzima 2, la cual escinde al Sub 2-FQ libre (generando una señal fluorescente), o al Sub 2 atado (soltando partzimas para la MNAzima 3) . Debido a que la MNAzima 3 comparte los mismos brazos del sustrato que la MNAzima 1, también puede escindir al Sub 1 atado, liberando así más partzimas para la MNAzima 2. Esto resulta en una cascada de generación enzimática de los componentes (partzimas) para más enzimas (MNAzimas) y una cascada concomitante de amplificación de señal .

DEFINICIONES Ciertos términos que se usan aquí tendrán los significados expuestos como sigue. El término "que comprende" significa "que incluye principalmente, pero no necesariamente solamente". Además, las variaciones de la palabra "que comprende", tales como "comprenden" y "comprende", tienen significados correspondientemente variados. Los términos "polinucleótido", "ácido nucleico" y "oligonucleótido" pueden usarse de forma intercambiable y se refieren a un polímero de una o doble hebra de bases de deoxiribonucleótido o ribonucleótido, o análogos, derivados, variantes, fragmentos o combinaciones de los mismos, incluyendo pero no limitado a ADN, ADN metilado, ADN alquilado, ARN, ARN metilado, microARN, ARNsi, ARNsh, ARNm, ARNt, ARNsno, ARNst, ARNsm, pre- y pri-microARN, otros ARNs de no codificación, ARN ribosomal, derivados de los mismos, amplicones de los mismos, o cualquier combinación de los mismos. A manera de ejemplo no limitante, la fuente de un ácido nucleico puede seleccionarse del grupo que comprende de sintético, mamífero, humano, animal, planta, fúngico, bacteriano, viral, bacterias archaélicas o cualquier combinación de los mismos . Los términos "oligonucleótido" y "cebador" típicamente denotan un segmento de ADN o una molécula de ácidos nucleicos que contiene ADN, o ARN o molécula que contiene ARN, o una combinación de las mismas. Ejemplos de oligonucleótidos incluyen objetivos ácido nucleico; sustratos, por ejemplo, aquellos que pueden modificarse por una MNAzima; cebadores tales como aquellos usados para la amplificación del objetivo in vi tro por métodos tales como PCR; y componentes de las MNAzimas. Los facilitadores de ensamble de MNAzima, en ciertas modalidades, pueden comprender oligonucleótidos como se define aquí. Las partzimas como se usa aquí también pueden comprender oligonucleótidos . Los términos "polinucleótido", "ácido nucleico" y "oligonucleótido" incluyen la referencia a cualquier secuencia especificada así como también a la secuencia complementaria de los mismos, a menos que se indique lo contrario. Los oligonucleótidos pueden comprender al menos una adición o sustitución, incluyendo pero no limitado al grupo que comprende 4-acetilcitidina, 5- (carboxihidroxilmetil) uridina, 2 ' -O-metilcitidina, 5-carboximetilaminometil tiouridina, dihidrouridina, 2 ' -0-metilpseudouridina, beta D-galactosilqueosina, 2 ' -0-metilguanosina, inosina, N6-isopenteniladenosina, 1-metiladenosina, 1-metilpseudouridina, 1-metilguanosina, 1-nietilinosina, 2, 2-dimetilguanosina, 2- metiladenosina, 2-metilguanosina, 3-metilcitidina, 5-metilcitidina, N6-metiladenosina, 7-metilguanosina, 5-metilaminometiluridina, 5-metoxiaminometil-2-tiouridina, beta D-manosilmetiluridina, 5-metoxicarbonilmetiluridina, 5-metoxiuridina, 2-metiltio-N6-isopenteniladenosina, N-((9-beta-ribofuranosil-2-metiltiopurina-6-il) carbamoil) treonina, N- ( ( 9-beta-ribofuranosilpurina-6-il) N-metil-carbamoil) treonina, metil éster del ácido uridina-5-oxiacético, ácido (v) uridina-5-oxiacético, wibutoxosina, pseudouridina, queosina, 2-tiocitidina, 5-metil-2-tiouridina, 2-tiouridina, 4-tiouridina, 5-metiluridina, N- ( (9-beta-D-ribofuranosilpurina-6-il) carbamoil) treonina, 2 ' -0-metil-5-metiluridina, 2 ' -0-metiluridina, wibutosina, 3- (3-amino-3-carboxipropil) uridina, beta D-arabinosil uridina, beta D-arabinosil timidina. Los términos "molécula de ácidos nucleicos catalítica", "ácidos nucleicos catalíticos", "enzimas de ácidos nucleicos" y "secuencia de ácidos nucleicos catalítica" se usan aquí de forma intercambiable y significarán una molécula de ADN o una molécula que contiene ADN (también conocida en el arte como una "enzima de ADN", "deoxiribozima" o "ADNzima") o un ARN o una molécula que contiene ARN (también conocida en el arte como una "enzima de ARN" o "ribozima") o una combinación de las mismas, siendo una molécula híbrida ADN-ARN, la cual puede reconocer un sustrato y catalizar una modificación del sustrato. Los residuos del nucleótido en los ácidos nucleicos catalíticos pueden incluir las bases A, C, G, T, y U, así como también derivados y análogos de las mismas.

El término "derivado" cuando se usa en relación a un ácido nucleico o nucleótido de la presente invención incluye cualquier nucleótido o ácido nucleico funcionalmente equivalente, incluyendo cualquier molécula de fusión producida integralmente (por ejemplo, por medios recombinantes) o agregada después de la síntesis (por ejemplo, por medios químicos) . Tales fusiones pueden comprender oligonucleótidos de la invención con ARN o ADN añadidos a los mismos o conjugados a un polipéptido (por ejemplo, puromicina u otro polipéptido), una molécula pequeña (por ejemplo, psoralen) o un anticuerpo. El término "análogo" cuando se usa en relación a un ácido nucleico o nucleótido incluye un compuesto que tiene una estructura física que está relacionada a un residuo o molécula de ADN o ARN, y que puede ser capaz de formar un enlace hidrógeno con un residuo de ADN o ARN o un análogo del mismo (es decir, es capaz de hibridarse por calentamiento y enfriamiento con un residuo de ADN o ARN o un análogo de los mismos para formar un par de base) , pero tal enlace no es tan requerido para que dicho compuesto esté comprendido dentro del término "análogo". Tales análogos pueden poseer diferentes propiedades químicas y biológicas para el residuo de deoxiribonucleótido o ribonucleótido al cual se relacionan estructuralmente. Residuos metilados, yodados, bromados o biotinilados son ejemplos de análogos. Las ADNzimas activas se han descrito que contienen análogos de nucleótido, incluyendo desoxiinosina, C-5-imidazol desoxiuridina, 3-(aminopropinil) -7-deaza-dATP, 2'-0-metil ARN, 2' O-metil cap (Warashina et al., 1999; Cairns et al., 2003; Schubert et al., 2004; Sidorov et al., 2004). Otros análogos son compatibles con la actividad catalítica de las ADNzimas. La alteración de una secuencia de ácidos nucleicos catalítica, por ejemplo por sustitución de una base por otra, por sustitución de un análogo por una base, o alteración del componente de azúcar o de la estructura principal del fosfodiéster, puede dirigirse por el artesano experto. Por ejemplo, las alteraciones pueden realizarse durante la síntesis, o por la modificación de bases específicas después de la síntesis. La prueba empírica de los ácidos nucleicos catalíticos que incorpora alteraciones tales como cambios de base o análogos de la base permite la valoración del impacto de las secuencias alteradas, o análogos específicos, en la actividad catalítica. Los análogos de las bases A, C, G, T y U son conocidos en el arte, y un subconjunto se lista en la Tabla 2.

Tabla 2: Ejemplos de análogos de nucleótidos útiles aquí ( ( El término "fragmento" cuando se usa en relación a un ácido nucleico se refiere a un constituyente de ese ácido nucleico. Típicamente el fragmento posee actividad biológica cualitativa en común con el ácido nucleico, 5 aunque este no necesariamente tiene que ser el caso. Los fragmentos de un ácido nucleico no necesariamente necesitan codificar los polipéptidos que retienen la actividad biológica. Más bien, un fragmento de ácido nucleico puede, por ejemplo, ser útil como una sonda de hibridación u oligonucleótido PCR. El fragmento puede derivarse de un ácido nucleico de la invención o alternativamente puede sintetizarse por algunos otros medios, por ejemplo síntesis química . El término "variante" como se usa aquí se refiere a secuencias de polipéptidos o de ácidos nucleicos sustancialmente similares. Generalmente, las variantes de la secuencia poseen actividad biológica cualitativa en común. Además, tales variantes de la secuencia pueden compartir al menos 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia. Los homólogos también se incluyen dentro del significado del término "variante", los cuales son típicamente un polipéptido o un ácido nucleico de una especie diferente pero que comparten sustancialmente la misma actividad o función biológica como el polipéptido o ácido nucleico correspondiente descrito aquí. El término "alta severidad" como se usa aquí se refiere a las condiciones bajo las cuales dos ácidos nucleicos pueden hibridarse, y puede incluir, por ejemplo, la concentración de sales y/o detergentes en una solución, la temperatura de una solución que se usa durante la hibridación de los dos ácidos nucleicos y el periodo de tiempo de la hibridación. Consecuentemente, el término "alta severidad" como se usa aquí se refiere a las condiciones en una solución que son conducentes para la hibridación de dos ácidos nucleicos solo donde tales ácidos nucleicos comparten un alto grado de complementariedad. El grado de complementariedad puede incluir, pero no estar limitado a, un rango de aproximadamente 50 % a 99 %. Así, las condiciones de "alta severidad" pueden involucrar, pero no están limitadas a, el uso de una temperatura variante y un amortiguador que comprende varias concentraciones de detergentes, sales, y cationes divalentes. Los términos "molécula facilitadora de ensamble", "facilitador de ensamble", "molécula facilitadora de ensamble de MNAzima", "facilitador" y "facilitador de ensamble de MNAzima" como se usa aquí se refieren a las entidades que pueden facilitar el auto-ensamble de las partzimas componentes para forma una MNAzima catalíticamente activa. En las modalidades preferidas se requiere un facilitador de ensamble para el auto-ensamble de una MNAzima. Un facilitador de ensamble en algunas modalidades comprende un objetivo tal como un ácido nucleico o analito no ácido nucleico. Las moléculas facilitadoras de ensamble pueden comprender una o más regiones o moléculas que pueden parearse con, o enlazarse a, una o más "partzimas" de oligonucleótido, que constituyen los componentes o las porciones de una "MNAzima". No se requiere que el facilitador de ensamble interactúe con, se aparee con, o se enlace a cada partzima u oligonucleótido componente con tal que interactúe con, se paree con, o se enlace a, al menos una de las partzimas componentes de una MNAzima. Como se usa aquí, las moléculas facilitadoras de ensamble de MNAzima pretenden abarcar el rango más amplio de constituyentes que pueden facilitar el auto-ensamble de una MNAzima. En algunas modalidades, un facilitador de ensamble puede comprender un ácido nucleico. En otras modalidades, un facilitador de ensamble puede comprender cualquier célula o cualquier porción de la misma, por ejemplo, cualquier célula eucariótica o procariótica, un virus, prión, levadura o fungosidad, o cualquier otra molécula, por ejemplo, incluyendo pero no limitado a una proteína, polipéptido, péptido o ácido nucleico. En otras modalidades, un facilitador de ensamble puede comprender un virus, prión, levadura o fungosidad, o cualquier otra molécula, por ejemplo, incluyendo pero no limitado a glicoproteínas, lípidos, lipoproteínas, organismos enteros, células, virus, bacterias, archaea, hongos, anticuerpos, metabolitos, patógenos, toxinas, contaminantes, venenos, moléculas pequeñas, polímeros, iones metálicos, sales metálicas, priones o cualquier derivado, porción o combinación de los mismos. El término "objetivo" como se usa aquí incluye cualquier entidad natural o sintética, constituyente o analito que se busca para ser detectado, identificado o cuantificado por una(s) MNAzima (s) particular (es) . Los objetivos por consiguiente abarcan el rango más amplio de entidades, constituyentes o analitos detectables para los cuales son deseables los métodos de detección sensitiva, identificación y/o cuantificación. En algunas modalidades, un objetivo comprende un facilitador de ensamble. Algunos objetivos ejemplares incluyen, pero no se limitan a, proteína, polipéptido, péptido o ácido nucleico, glicoproteínas, lípidos, lipoproteínas, organismos enteros, células, virus, bacterias, archaea, levadura, hongos, anticuerpos, metabolitos, patógenos, toxinas, contaminantes, venenos, moléculas pequeñas, polímeros, iones metálicos, sales metálicas, priones o cualquier derivado, porción o combinación de los mismos. También se contemplan otros objetivos para el uso aquí. Los términos "sustrato", "molécula del sustrato" y "sustrato químico" como se usa aquí incluyen cualquier molécula que es capaz de ser reconocida, y que actúa sobre, o modificada químicamente por una molécula catalítica. En las modalidades particulares, un sustrato puede ser reconocido y modificado por una enzima. En otras modalidades, un sustrato puede ser reconocido y modificado por una molécula de ácidos nucleicos catalítica. La modificación química de un sustrato puede medirse por la aparición de, o incremento en, un producto de la reacción de modificación, o por la desaparición de, o disminución en, un sustrato de la(s) reacción (es) de modificación. Una molécula catalítica particular puede reconocer una o más moléculas del sustrato diferentes a condición de que cada molécula del sustrato tenga al menos una estructura mínima que sea reconocible para la actividad catalítica mediante la molécula catalítica. Un "sustrato reportero", "sonda reportera" o "sustrato de sonda reportera" como se usa aquí es un sustrato que se adapta particularmente para facilitar la medición de cualquiera de la desaparición de un sustrato o la aparición de un producto en conexión con a una reacción catalizada. Los sustratos reporteros pueden estar libres en la solución o enlazados (o "atados"), por ejemplo, a una superficie, o a otra molécula. Un sustrato reportero puede etiquetarse por cualquiera de una gran variedad de maneras incluyendo, por ejemplo, fluoróforos (con o sin uno o más componentes adicionales, tales como hibridizadores por apagado), etiquetas radiactivas, etiquetado con biotina (por ejemplo biotinilación) o etiquetas quimioluminiscentes . Los sustratos reporteros para los ácidos nucleicos catalíticos también pueden incluir enzimas de ácidos nucleicos o proteínas, por ejemplo, unidas de manera covalente a sus terminales. Como se usa aquí, sustratos "genéricos" o "universales" son sustratos, por ejemplo sustratos reporteros, que son reconocidos por y actuados catalíticamente por una pluralidad de MNAzimas, cada una de las cuales puede reconocer un objetivo diferente. El uso de tales sustratos facilita el desarrollo de ensayos separados para la detección, identificación o cuantificación de una amplia variedad de objetivos usando MNAzimas relacionadas estructuralmente, todas de las cuales reconocen un sustrato universal. Estos sustratos universales pueden cada uno etiquetarse independientemente con una o más etiquetas. En las modalidades preferidas, las etiquetas detectables independientemente se usan para etiquetar uno o más sustratos genéricos para permitir la creación de un sistema conveniente para detectar independientemente o simultáneamente una variedad de objetivos usando las MNAzimas Como se usa aquí, los términos "partzima", "partzima componente" y "oligonucleótido componente" se refieren a un oligonucleótido que contiene ADN o que contiene ARN o que contiene ADN-ARN, dos o más de los cuales, solo en la presencia de una molécula facilitadora de ensamble de MNAzima, pueden conjuntamente formar una "MNAzima". En ciertas modalidades preferidas, una o más partzimas componentes, y preferentemente al menos dos, pueden comprender tres regiones o dominios: un dominio "catalítico", que forma parte del núcleo catalítico de la MNAzima que cataliza una modificación química; un dominio del "brazo detector", que puede asociarse con y/o enlazarse a un facilitador de ensamble (por ejemplo un objetivo) ; y un dominio del "brazo del sustrato", que puede asociarse con y/o enlazarse a un sustrato. Una representación de estas regiones o dominios puede verse, por ejemplo, en la Figura 1. Una partzima puede comprender una o más moléculas. Las partzimas pueden comprender al menos un componente adicional incluyendo pero no limitado a un aptámero, referida aquí como una "apta-partzima". Una partzima también puede incluir un sustrato, como se puede ver, por ejemplo, en la Figura 25. El término "MNAzima" como se usa aquí, se refiere a dos o más secuencias de oligonucleótidos (por ejemplo partzimas) las cuales, solo en la presencia de la molécula facilitadora de ensamble de MNAzima (por ejemplo, un objetivo), forman una enzima de ácidos nucleicos activa que es capaz de modificar catalíticamente un sustrato. Una MNAzima ejemplar que comprende partzima A y partzima B se representa en la Figura 1. Con referencia a la Figura 1, las partzimas A y B de ADN cada una se enlaza a un objetivo (por ejemplo, a través del apareamiento de bases de Watson-Crick con un objetivo de ácido nucleico) . La MNAzima solo se forma cuando los brazos detectores de las partzimas A y B hibridan de manera adyacente entre sí en el objetivo. Los brazos del sustrato de la MNAzima enlazan al sustrato reportero, la escisión del cual se cataliza por el núcleo catalítico de la MNAzima, formado por la interacción de los dominios catalíticos de las partzimas A y B. La MNAzima escinde el sustrato entre un par de un fluoróforo y un tinte con hibridizador por apagado, generando así la señal. La escisión de una quimera de ADN/ARN (sustrato reportero) se ejemplifica en el dibujo. Los términos "enzima de ácidos nucleicos multicomponente" y "MNAzima" se usan aquí de forma intercambiable y comprenden estructuras bipartidas, compuestas de dos moléculas, o estructuras tripartidas, compuestas de tres moléculas de ácidos nucleicos, u otras estructuras multipartes, por ejemplo aquellas formadas por cuatro o más moléculas de ácidos nucleicos. Una MNAzima también puede comprender un oligonucleótido de estabilización que proporciona estabilidad de la MNAzima interactuando con un facilitador de ensamble o sustrato. Es aparente que la formación de una MNAzima requiere el ensamble de al menos los componentes partzima con el facilitador de ensamble, así como también el enlace de un sustrato, para la actividad catalítica a ser detectable, y que la ausencia de cualquiera de estos componentes resultará en una falta de actividad catalítica. Como se usa aquí un "aptámero" puede comprender una estructura que tiene la habilidad para reconocer uno o más ligandos. Por ejemplo, el reconocimiento puede tener un alto grado de especificidad debido a la estructura de nivel superior del aptámero, tal como, un dominio o receptáculo en enlace tridimensional. Los aptámeros pueden por consiguiente enlazar la proteína, polipéptido, péptido o ácido nucleico, glicoproteínas, lípidos, lipoproteínas, células, virus, bacterias, archaea, hongos, anticuerpos, metabolitos, patógenos, toxinas, contaminantes, venenos, organismos enteros, moléculas pequeñas, polímeros, iones metálicos, sales metálicas, priones o cualquier derivado, porción o combinación de los mismos, o cualquier otra entidad. Los aptámeros preferidos aquí pueden comprender oligómeros de ADN o ARN de una sola hebra, cortos, que pueden aislarse de genotecas complejas de ácidos nucleicos sintéticos por un proceso iterativo de adsorción, recuperación, y re-amplificación. Los aptámeros por consiguiente pueden generarse contra casi cualquier objetivo, variando en el rango de moléculas pequeñas tales como los aminoácidos, o antibióticos a las estructuras de ácidos nucleicos y proteínas. Como se usa aquí, el término "cascada" se refiere a cualquier sucesión de procesos u operaciones que ocurren en etapas sucesivas, en donde la ocurrencia de cada etapa es típicamente dependiente de la ocurrencia de una etapa precedente. Una cascada por consiguiente puede incluir, pero no está limitada a, una cascada enzimática o cualquier otra cascada de transducción de señal. En algunas modalidades, una cascada puede comprender la amplificación de una señal que resulta de la actividad catalítica de una MNAzima. En las modalidades preferidas, tal una cascada de amplificación pueden involucrar la amplificación repetida y por consiguiente cíclica de una señal, en donde la actividad catalítica de una primera MNAzima hace disponible una molécula requerida para la actividad catalítica de una segunda MNAzima, que a su vez hace disponible una molécula requerida para la actividad catalítica de la primera MNAzima. En algunas modalidades, la molécula requerida puede comprender una partzima, una enzima, un facilitador de ensamble, un sustrato, un objetivo, una porción o fragmento de los mismos o una combinación de los mismos. En algunas modalidades, una cascada por consiguiente puede involucrar la producción de un efecto acumulativo, y detectar así un objetivo de baja abundancia generando una señal a un nivel en el cual puede detectarse. En otras modalidades, pueden emplearse más que dos etapas catalíticas. La cascada puede ser lineal. En una modalidad preferida, la cascada puede ser exponencial. Como se usa aquí, los términos "inhibidor" o "inhibidor de ensamble" incluyen, pero no se limitan a, cualquier proteína, polipéptido, péptido o ácido nucleico, ARN, ADN, análogos de ácido nucleico, ácido nucleico peptídico, ácido nucleico unido, quimeras péptido-ácido nucleico, glicoproteínas, lípidos, lipoproteínas, células, virus, bacterias, archaea, hongos, anticuerpos, metabolitos, patógenos, toxinas, contaminantes, venenos, organismos enteros, moléculas pequeñas, polímeros, iones metálicos, sales metálicas, priones o cualquier derivado, porción o combinación de los mismos, o cualquier otra entidad o molécula que interactúe con uno o más componentes de una MNAzima como se define aquí, o que interactúe con un sustrato o facilitador de ensamble, para prevenir el ensamble de una MNAzima. Un "inhibidor" o "inhibidor de ensamble" no necesita estar en proximidad física a una MNAzima, pero, a manera de ejemplo no limitativo, puede enlazar competitivamente una parte componente de una MNAzima, sustrato o facilitador de ensamble, previniendo por consiguiente a tal parte componente de estar disponible para el ensamble de la MNAzima. Tal enlace puede incluir, por ejemplo, un ácido nucleico inhibitorio que es complementario para un oligonucleótido que comprende una parte componente de una MNAzima. Las siguientes abreviaturas se usan aquí y a todo lo largo de la especificación: MNAzima : enzima de ácidos nucleicos mul ticomponente , o enzima de ácidos nucleicos mul tipartes; ADNzima: enzima de ácido desoxirribonucleico; ARNzima: enzima de ácido ribonucleico, o ribozima; PCR: reacción de cadena de la polimerasa; SDA: amplificación de desplazamiento de la hebra; LAMP: amplificación de isoterma mediada por lazo; RCA: amplificación del círculo de enrollamiento; TMA: amplificación mediada por la transcripción; 3SR: replicación de secuencia auto-sostenida; NASBA: amplificación basada en la secuencia de ácidos nucleicos; dH20: agua destilada des-ionizada; LNA: ácido nucleico unido; PNA: ácido nucleico peptídico bADN : muestra de ADN ramificado; FCS: espectroscopia de correlación de fluorescencia; TSA: amplificación de señal de tiramida; An: analito u objetivo; F: fluoróforo; Q: hibridizador por apagado; miR: microARN; N=A, C, T, G, o cualquier análogo de los mismos; N' = cualquier nucleótido complementario para N, o capaz de formar un par de base con N; (N)x: cualquier numero de N; (N')x: cualquier numero de N' ; W: A o T; K: A, G, o AA; rN: cualquier base del ribonucleótido; (rN)x: cualquier numero de rN; rR: A o G; rY: C o U; M: A o C; H: A, C, o T; D: G, A, o T; JOE o 6-JOE: 6-carboxi-4 ' , 5' -dicloro-2' , 7'-dimetoxifluoresceina; FAM o 6-FAM: 6-Carboxifluoresceina . BHQl: Hibridizador 1 por apagado de agujero negro BHQ2 : Hibridizador 2 por apagado de agujero negro M-MLV RT (H-) : Transcriptasa Inversa del Virus de Leucemia Murina de Moloney RNasa H menos ARNsh: ARN de horquilla corta ARNsi: ARN corto de interferencia ARNm: ARN mensajero ARNt: ARN de transferencia ARNsno: ARN nucleolar pequeño ARNst: ARN temporal pequeño ARNsm: ARN modular pequeño pre-microARN: microARN precursor pri-microARN: microARN primario DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Debe entenderse al comienzo, que las figuras y los ejemplos proporcionados aquí son para ilustrar, y no para limitar la invención y sus varias modalidades. De acuerdo con la presente invención, las composiciones, los métodos y los equipos se proporcionan para la detección, identificación y/o cuantificación de un objetivo. Los métodos generalmente comprenden el uso de composiciones que comprenden enzimas de componentes múltiples o de ácidos nucleicos multipartes que se forman preferentemente por múltiples componentes de ácidos nucleicos que se auto-ensamblan para formar una enzima de ácidos nucleicos activa en la presencia de un facilitador de ensamble. En las modalidades preferidas, el facilitador de ensamble es el objetivo y por consiguiente las enzimas de ácidos nucleicos multicomponente se forman solo en la presencia del objetivo. 1. Composiciones - MNAzimas Las enzimas de Ácidos Nucleicos Multicomponente (también referidas aquí igualmente como enzimas de ácidos nucleicos multipartes o "MNAzimas") son capaces de auto-ensamblarse a partir de dos o más componentes de oligonucleótido, también referidos aquí como partzimas. Los oligonucleótidos partzima se auto-ensamblan en la presencia de un facilitador de auto-ensamble de MNAzima para formar una MNAzima. Las MNAzimas son por consiguiente enzimas de ácidos nucleicos catalíticamente activas. En algunas modalidades, puede detectarse la presencia de una MNAzima, y es indicativa de la presencia de un objetivo, debido a que la MNAzima se forma solo en la presencia del objetivo, en donde el objetivo comprende el facilitador de ensamble. Se proporciona aquí una amplia variedad de ensayos basados en los principios básicos esbozados anteriormente. También se proporcionan aquí composiciones que comprenden oligonucleótidos capaces de formar MNAzimas, y MNAzimas de varias secuencias. En algunas modalidades al menos uno de los componentes oligonucleótido, facilitador de ensamble o sustrato también puede incluir/comprender un aptámero que es capaz de enlazar a un objetivo. En las modalidades preferidas, las estructuras de la MNAzima se basan en una o más ADNzimas y/o ribozimas. Las estructuras más preferidas son aquellas estructuras de MNAzima que se basan en una estructura de ADNzima particular. Las estructuras actualmente preferidas se basan en ADNzimas que incluyen las ADNzimas 10:23 y 8:17. En varias modalidades las MNAzimas comprenden cualquiera o ambas bases del ribonucleótido y bases del desoxiribonucleótido. En las modalidades más preferidas, una estructura de la MNAzima se basa al menos en parte en la estructura de una ADNzima. En otras modalidades preferidas, las MNAzimas comprenden al menos algunas bases del desoxiribonucleótido o análogos de las mismas. En las modalidades más preferidas, el núcleo catalítico de una MNAzima comprende una o más bases del desoxiribonucleótido o análogos de las mismas. En modalidades aún más preferidas, una o más bases del desoxiribonucleótido o análogos de las mismas están involucradas en la catálisis de un sustrato. En otras modalidades, al menos una base del desoxiribonucleótido, o su análogo, en el núcleo catalítico mejora la actividad catalítica. En aún otras modalidades, hay un requerimiento estricto para al menos una base del desoxiribonucleótido, o su análogo, en el núcleo catalítico de la MNAzima para que ocurra la catálisis en una velocidad medible, relativa a aquella de una MNAzima comparable sin la presente base del desoxiribonucleótido.

Como se proporciona aquí, las MNAzimas pueden contener una o más sustituciones tales como análogos, derivados, bases modificadas o alteradas, ribonucleótidos, alteraciones del azúcar o de la estructura principal del fosfato, varias eliminaciones, inserciones, sustituciones, duplicaciones u otras modificaciones, o cualquier combinación de estos, bien conocidas por aquellos expertos en el arte. Tales modificaciones, sustituciones, eliminaciones, inserciones, etc. pueden realizarse en los brazos detectores y/o los brazos del sustrato y/o en las porciones del núcleo catalítico, como se demuestra aquí, tal que la molécula retiene actividad catalítica. Las sustituciones y modificaciones a los brazos que enlazan el sustrato o el facilitador de ensamble pueden ser adecuadamente toleradas y de hecho son la base para permitir el ajuste de las moléculas a diferentes facilitadores de ensamble/sustratos. Por ejemplo, la modificación de los brazos detectores permitirá el ajuste a diferentes facilitadores de ensamble, mientras que la modificación de los brazos del sustrato permitirá el ajuste a diferentes sustratos. Por consiguiente, en ciertas modalidades preferidas, la invención prevé MNAzimas con actividad catalítica que comprenden de desoxiribonucleótidos o que se derivan de tales moléculas por ciertas modificaciones/sustituciones etc. Como una regla general, el remplazo de la molécula entera con, por ejemplo, ribonucleótidos, dará la molécula inactiva debido a que confía para su actividad en ciertos desoxiribonucleótidos clave. En una manera correspondiente, algunos ribonucleótidos en una ribozima pueden sustituirse con desoxiribonucleótidos pero el remplazo de la molécula entera con, por ejemplo, desoxiribonucleótidos, dará la molécula inactiva. El artesano experto apreciará que las MNAzimas comprenden ya sea desoxiribonucleótidos o ribonucleótidos, o incluso ambos. Aquellas MNAzimas que comprende al menos uno y más preferentemente, todos los oligonucleótidos de componentes desoxiribonucleótidos son actualmente preferidos. También se prefieren aquellas MNAzimas que comprenden al menos una base del desoxiribonucleótido, o su análogo, dentro del núcleo catalítico de la MNAzima. Son aún más preferidas aquellas modalidades donde tal una base se requiere para la actividad catalítica. El artesano experto también apreciará que las ADNzimas multipartes tienen ventajas sobre las ribozimas multipartes, por ejemplo con respecto a la estabilidad y facilidad de uso. Así, las MNAzimas multicomponente proporcionadas aquí pueden proporcionar una alternativa actualmente preferida para las ribozimas multicomponente, las cuales también se proporcionan de acuerdo con varias modalidades. También debe apreciarse que en ciertas modalidades, las MNAzimas ofrecen ventajas sobre las enzimas de ácidos nucleicos uni-moleculares, por ejemplo las ADNzimas, que solo pueden reconocer un sustrato, mientras que una sola MNAzima puede reconocer dos moléculas, a saber un facilitador de ensamble (por ejemplo un objetivo) y un sustrato. Por ejemplo, estas propiedades de las MNAzimas las hacen adaptables por ejemplo, para la detección de objetivos, incluyendo la detección in si tu, in vivo o in vi tro. 2. Métodos que usan MNAzimas para detectar, identificar o cuantificar objetivos La presente invención proporciona varios métodos que emplean el uso de una o más MNAzimas para la detección, identificación o cuantificación de al menos un objetivo. En una modalidad, el primer y segundo componentes oligonucleótido se auto-ensamblan solo cuando se contactan con una muestra que contienen un facilitador de ensamble, dicho auto-ensamble de la MNAzima catalíticamente activa indicando así la presencia del facilitador de ensamble, en donde el facilitador de ensamble es el objetivo. En otras modalidades, tales como por ejemplo aquellas que involucran un aptámero, el facilitador de ensamble no puede ser el objetivo, y de esta manera puede comprender solo un elemento requerido para el auto-ensamble de la MNAzima. Algunas de las varias modalidades de la invención puede ser mejor entendidas por medio de representaciones pictóricas. Por consiguiente, con referencia a las figuras, y de acuerdo con las composiciones y métodos aquí, se proporcionan generalmente métodos basados en MNAzimas que permiten la detección de al menos un objetivo usando solo enzimas de ácidos nucleicos (por ejemplo, Figuras 1, 3, 4, 7 - 13, 20, 21, 24, 25) sin cualquier necesidad de enzimas de proteínas tales como las polimerasas. Aunque el uso de las enzimas de proteínas en conjunción con las MNAzimas no se excluye aquí, y en ciertas modalidades aquí la inclusión de enzimas de proteínas es permisible, o incluso preferida, las condiciones de reacción para los métodos que no requieren enzimas de proteínas son generalmente menos restrictivas y más fácilmente optimizadas, por ejemplo para la eficiencia de escisión de la MNAzima. La falta de requerimiento para las enzimas de proteínas también generalmente disminuye el costo de los reactivos. Como se proporciona adicionalmente aquí, algunos métodos de emplear MNAzimas para la detección del objetivo no requieren termociclización y/o desnaturalización de un objetivo. Los métodos isotérmicos son más flexibles que los métodos que requieren la termociclización y también pueden habilitar la diferenciación entre objetivos que comprenden el ácido nucleico de una hebra o de doble hebra. Además, la falta de una necesidad de termociclización puede hacer a tales métodos más fáciles y menos caros. Se proporcionan de acuerdo con los métodos aquí, métodos simples, rápidos, efectivos en costos, isotérmicos, y flexibles en relación al procedimiento, para detectar objetivos de interés en una muestra, la cual puede ser sintética o natural. Ciertos de los ejemplos proporcionados aquí demuestran la detección de un objetivo de ácido nucleico por el ensamble específico al objetivo de una MNAzima conduciendo a la escisión mediada por la MNAzima de, por ejemplo, un sustrato reportero fluorescente. Además, debido a la naturaleza de la molécula de la MNAzima, las reacciones pueden realizarse sobre un amplio rango de temperaturas, sujetas solo a los requerimientos para el ensamble de la MNAzima y a la modificación catalítica (por ejemplo escisión) del sustrato utilizado. Un ejemplo básico de una estructura de la MNAzima se representa en la Figura 1. La estructura mostrada comprende la partzima A y partzima B que se han apareado con bases con una molécula facilitadora de ensamble de MNAzima, mostrada aquí simplemente como Objetivo . Las partzimas A y B interactuando con el Objetivo, han permitido que el núcleo catalítico entre en proximidad cercana y que por consiguiente se forme. Los brazos del sustrato de la MNAzima han interactuado con y se han apareado con bases con un sustrato, aquí Sustrato Reportero. Así la MNAzima se ha auto-ensamblado y este proceso es facilitado a través de la presencia del Objetivo de la molécula facilitadora de ensamble de MNAzima. En la ausencia del Objetivo, no se formará MNAzima alguna. La modificación (en este caso, la escisión) del sustrato se cataliza por el núcleo catalítico de la MNAzima en el Sitio de Escisión de la MNAzima dentro del sustrato denotado por la flecha vertical. El sustrato en esta modalidad particular de la invención comprende una porción detectable que tiene una señal detectable, por ejemplo fluoróforo F, y una porción del hibridizador por apagado que tiene un efecto de hibridación por apagado sobre la señal F detectable a través de la acción del hibridizador por apagado Q. Sobre la escisión en el Sitio de Escisión de la MNAzima, hay un aumento sustancial en la señal detectable, aquí fluorescencia, la cual es fácilmente detectada o cuantificada La Figura 1 puede entenderse además para representar un ejemplo de un método básico de uso de las MNAzimas para detectar un objetivo, que en algunas modalidades comprende un facilitador de ensamble. La estrategia 1 (vea la Figura 2) usa MNAzimas adaptadas para la detección de objetivos que incluyen ADN, ARN y proteínas. El sustrato reportero puede estar ya sea libre en la solución (Figura 1) o enlazado a un soporte (Figura 3). La señal puede generarse por varias maneras tales como la separación del fluoróforo F y pares teñidos con hibridizador por apagado Q (Figuras 1 y 3) . Más específicamente, la partzima A y la partzima B se muestran en la Figura 1, cada una que comprende una porción del brazo del sustrato, una porción del núcleo catalítico, y una porción del brazo detector. En la presencia -de un objetivo, las porciones del brazo detector de la partzima A y partzima B pueden comenzar a hibridar a, y a formar un par de base con porciones complementarias del objetivo, por ejemplo una secuencia de ADN o ARN. Al contactar el objetivo en esta manera, la MNAzima se auto-ensambla formando un núcleo catalítico que puede modificar un sustrato que se enlaza por los brazos del sustrato. Preferentemente la presencia de la MNAzima se detecta a través de la detección o medición de su actividad catalítica. Los brazos del sustrato de la MNAzima así ensamblada pueden enlazar un sustrato, por ejemplo el sustrato reportero mostrado en la Figura 1, a través de la interacción de las secuencias complementarias sobre los brazos del sustrato y el sustrato. Una vez que el sustrato se enlaza de esta manera con los brazos del sustrato, el núcleo catalítico puede promover la modificación (por ejemplo la escisión) del sustrato, el cual a su vez puede medirse o detectarse, directamente o indirectamente. Con más referencia a las figuras, la Figura 2 proporciona una visión general estilizada de varias aplicaciones de ejemplo de un ensayo de MNAzima. La estrategia 1 ejemplifica una aplicación básica del ensayo de MNAzima como se describe anteriormente. Una MNAzima compuesta de dos oligonucleótidos separados con secuencias de reconocimiento para ambos; un objetivo y un sustrato, se forma cuando los oligonucleótidos reconocen y enlazan un objetivo. El sustrato, por ejemplo el sustrato reportero, se modifica por la acción catalítica de la MNAzima y provoca la generación de una señal detectable, ya sea directamente (Estrategia 1), durante o después de la amplificación del objetivo (Estrategia 2) o vía una cascada de señal (Estrategia 3) . En algunas modalidades, ambas amplificaciones; de señal y del objetivo ocurren simultáneamente . Uno experto en el arte reconocería que las MNAzimas pueden usarse en estrategias para la detección, identificación o cuantificación de facilitadores de ensamble que cubren un amplio rango de áreas de aplicación. Estas áreas incluyen, pero no se limitan a, aplicaciones médicas, veterinaria, agrícola, tecnología alimenticia, aplicación de formación de imágenes y bioterrorismo. También será fácilmente aparente para un artesano experto que las MNAzimas pueden usarse para detectar, identificar y/o cuantificar objetivos en la solución. Por ejemplo, las estrategias que involucran detectar, identificar y/o cuantificar objetivos únicos usando un solo sustrato son aplicables para tal detección. En algunas modalidades esto puede implicar el uso de un sustrato genérico. Múltiples objetivos también pueden detectarse en la solución usando múltiples MNAzimas que modifican una serie de sustratos genéricos, la modificación de cada sustrato resultando en una señal detectable de manera distinta por ejemplo diferente fluorescencia. 3. Métodos que usan múltiples MNAzimas El artesano experto reconocerá que los varios ensayos proporcionados aquí generalmente pueden usarse para detectar un solo objetivo por reacción o ensayo, o para detectar múltiples objetivos en una sola reacción o ensayo. Al detectar múltiples objetivos, pueden usarse una o más MNAzimas dependiendo del ensayo y de lo que debe detectarse. Por ejemplo, una sola MNAzima puede ser suficiente donde detectar múltiples estructuras relacionadas, por ejemplo un grupo de secuencias que comparten una secuencia crítica (reconocida por la MNAzima) y variando solo por ejemplo, en longitud, o en secuencia fuera de la secuencia crítica. Cualquier secuencia podría detectarse con la secuencia crítica. Múltiples MNAzimas serían útiles donde detectar secuencias relacionadas que difieren por tan poco como un solo nucleótido o incluso donde objetivos vastamente diferentes están siendo detectados, y es deseable conocer la presencia o ausencia de cada uno. De modo semejante, en algunas modalidades un solo sustrato será suficiente, mientras en otras se requiere un sustrato único para detectar cada uno de varios objetivos. En algunos casos, multiplexar el método requiere el uso de una señal detectable única o distinta para cada sustrato para facilitar el diseño del método. Puede no requerirse una señal detectable única o distinta para cada sustrato cuando los sustratos se fijan a un soporte o soportes y pueden distinguirse por virtud de su localización en el soporte o soportes. Estas características de diseño serán fácilmente comprendidas por uno experto en el arte. En algunas modalidades, los métodos permiten la detección de una variedad de tipos diferentes de objetivos en una reacción, por ejemplo un objetivo de ácido nucleico y una proteína. 4. Métodos que usan la amplificación del objetivo El artesano experto fácilmente apreciará que los métodos descritos aquí pueden implicar la amplificación de un objetivo antes, durante o después de la actividad catalítica de la MNAzima. Tal amplificación del objetivo encuentra aplicación particular en las modalidades de la presente invención donde la cantidad de un objetivo que se pretende sea detectado, identificado o cuantificado es de tal quantum como para proporcionar una señal que de otra manera no puede ser detectable. Tal amplificación puede comprender uno o más de: reacción de cadena de polimerasa (PCR), amplificación de desplazamiento de la hebra (SDA) , amplificación de isoterma mediada por lazo (LAMP) , amplificación del círculo de enrollamiento (RCA) , amplificación mediada por la transcripción (TMA) , replicación de secuencia auto-sostenida (3SR) , amplificación basada en la secuencia de ácidos nucleicos (NASBA) , o reacción de cadena de la polimerasa de transcripción inversa (RT-PCR) . La Estrategia 2 (Figura 2) ejemplifica el uso de una MNAzima adaptada para monitorear la acumulación de amplicones durante, o después de, la amplificación in vitro de los objetivos del ácido nucleico. Las técnicas para la amplificación in vitro de secuencias de ácidos nucleicos son conocidas en el arte. Estas incluyen técnicas mediadas por una polimerasa de ADN, tal como la reacción de cadena de polimerasa ("PCR") (vea, por ejemplo, la Patente Norteamericana Número 4,683,202; Patente Norteamericana Número 4,683,195; Patente Norteamericana Número 4,000,159; Patente Norteamericana Número 4,965,188; Patente Norteamericana Número 5,176,995) (Saiki et al., 1985; Chehab et al., 1987), amplificación de desplazamiento de la hebra ("SDA") (Walker et al., 1992), amplificación del círculo de enrollamiento ("RCA") (Lizardi et al., 1998), reacción de cadena de la polimerasa de transcripción inversa (RT-PCR) y amplificación de isoterma mediada por lazo ("LAMP") (Notomi et al., 2000; Nagamine et al., 2002). Otras técnicas de amplificación del objetivo son mediadas por una polimerasa de ARN, por ejemplo, amplificación mediada por la transcripción ("TMA") (Joñas et al., 1993), replicación de secuencia auto-sostenida ("3SR") (Fahy et al., 1991) y amplificación basada en la replicación de secuencia de ácidos nucleicos ("NASBA") (Compton, 1991). Los productos de la amplificación ("amplicones") producidos por PCR, RT-PCR, SDA, RCA y LAMP están compuestos de ADN, mientras que los amplicones de ARN se producen por TMA, 3SR y NASBA. Con más referencia a la estrategia 2 como se ejemplifica en la Figura 2, en uno de sus varios aspectos, la invención proporciona métodos de usar MNAzimas en conjunción con los métodos de amplificación del objetivo que incluyen, por ejemplo, dichos PCR, RT-PCR, SDA, RCA, LAMP, TMA, 3SR y NASBA. Los Ejemplos 4, 5, 6, y 9 demuestran la detección de amplicones PCR. En los Ejemplos 4, 5, 6, y 9, el análisis del punto final que sigue a PCR facilitó la determinación rápida de la presencia o la ausencia de los ácidos nucleicos objetivo. Los Ejemplos 8, 10, 11, 13, 14, 15, 16, 19, y 20 ejemplifican el monitoreo en tiempo real de la amplificación PCR, permitiendo así la cuantificación del ácido nucleico objetivo. La acumulación de los amplicones producidos por PCR usando ya sea proporciones de cebador asimétricas o simétricas puede monitorearse usando las MNAzimas. Como se puede observar en la Figura 2 (estrategia 2) se amplifica un ácido nucleico objetivo de acuerdo con un procedimiento para amplificar ese ácido nucleico (es decir, ADN O ARN) . Preferentemente, se usan los métodos estándar de amplificación in vitro. Los amplicones generados durante la amplificación sirven como objetivos para una MNAzima, así la actividad de la MNAzima es indicativa de la presencia del objetivo. El artesano experto apreciará que tal monitoreo puede dirigirse en un solo recipiente bajo condiciones que permiten tanto la amplificación y el ensamble de la MNAzima y la actividad catalítica, o el ensayo de MNAzima puede dirigirse subsecuente a, o en puntos de tiempo a todo lo largo de, la amplificación, removiendo muestras al final o durante el curso de las reacciones de amplificación. También debe apreciarse que los métodos o protocolos que combinan la amplificación del objetivo con la actividad catalítica de los ácidos nucleicos pueden requerir condiciones de reacción específicas. Preferentemente, las condiciones de reacción son compatibles con la actividad de la polimerasa (para la amplificación) , y con la modificación de ácidos nucleicos catalíticos de un sustrato (para la detección) . Los protocolos para determinar las condiciones para la actividad catalítica concurrente y la actividad de la polimerasa en alta temperatura, tales como durante PCR, se han descrito para las ADNzimas (Impey et al., 2000). La influencia de factores que incluyen la longitud del brazo de la ADNzima, el amortiguador, la temperatura, la concentración del ion divalente y los efectos de los aditivos se demostró en este escrito. Las enzimas de ADN son adecuadas para el uso en combinación con las estrategias de amplificación in vitro. Por ejemplo, no son desnaturalizadas de forma irreversible por la exposición a altas temperaturas durante la amplificación.

. Métodos que usan soportes sólidos e insolubles También debe entenderse que generalmente los métodos, ya sean multiplexados o no, son aplicables en solución, o se combinan con un soporte insoluble o soporte sólido sobre el cual uno o más de sustrato, enzima o porción de la misma, facilitador de ensamble de MNAzima y/u objetivo están unidos, enlazados o atados. De nuevo las características de tales sistemas de ensayo serán generalmente comprendidas por el artesano experto provisto con los métodos y las variaciones ilustradas aquí y los ejemplos operativos. De este modo, la invención no debe considerarse limitada a las enseñanzas literales aquí, sino que es capaz de ser modificada y variada consistente con los principios y el alcance de las enseñanzas proporcionadas aquí y con el conocimiento en el arte. Con referencia a la Figura 3, Panel (i) , se representa un método ejemplar para detectar objetivos usando una MNAzima y un sustrato anclados a un soporte. En esta modalidad, el sustrato es preferentemente un sustrato como se muestra con una porción detectable que comprende una señal detectable, por ejemplo un fluoróforo, y una porción del hibridizador por apagado que disminuye o elimina la señal detectable mientras la porción detectable y la porción del hibridizador por apagado del sustrato permanecen en proximidad cercana, por ejemplo, hasta que el sustrato se modifica por ejemplo por escisión. El sustrato se une a un soporte. Preferentemente el soporte es un material insoluble, o una matriz que retiene el sustrato y lo excluye de moverse libremente en el volumen de la mezcla de reacción. Tales soportes son conocidos en el arte para inmovilizar o localizar sustratos, incluyendo objetivos del ácido nucleico. El artesano experto apreciará que el soporte puede seleccionarse de una amplia variedad de matrices, polímeros, y similares en una variedad de formas incluyendo cuentas convenientes para el uso en micro-ensayos, así como también otros materiales compatibles con las condiciones de reacción. En ciertas modalidades preferidas, el soporte puede ser un material plástico, tal como obleas o cuentas plásticas, o aquel del pozo o tubo en el cual se conduce un ensayo particular. La unión del sustrato al soporte se diseña tal que sobre la modificación, por ejemplo por escisión, del sustrato por la MNAzima, ya sea la porción detectable o la porción del hibridizador por apagado, pero no ambas, permanece unida al soporte, mientras la otra se libera para moverse en el volumen de la mezcla de reacción, lejos de la porción que permanece unida. Así, en un ejemplo de escisión, la señal detectable vastamente aumenta mientras la porción del hibridizador por apagado y la porción detectable se separan sobre la escisión. En la modalidad mostrada en la Figura 3, Panel (i) , la porción detectable que contiene fluoróforo permanece unida después de la escisión. Esto tiene el beneficio de permitir la localización de la señal sobre el soporte pero en ciertas instancias, el/los fluoróforo/s puede/n liberarse en la solución. En una modalidad adicional donde, por ejemplo, ocurre la ligación, el hibridizador por apagado se puede ligar a un fluoróforo disminuyendo así la señal detectable. Con referencia a la Figura 3, Panel (ii), se muestra un método multiplexado que comprende múltiples componentes de la MNAzima para preparar múltiples MNAzimas (dos mostradas) específicas para diferentes objetivos. Esta modalidad abarca una estructura que comprende un sustrato en una posición particular conocida, por ejemplo un "chip", donde múltiples posiciones están disponibles para enlazar numerosos sustratos, por ejemplo Sustrato 1, Sustrato 2. La porción detectable de cada sustrato puede ser rastreada a su posición y se ata en esa posición. Para cada MNAzima, por ejemplo MNAzima 1, MNAzima 2, si el objetivo, por ejemplo Objetivo 1, Objetivo 2, está presente en, por ejemplo, una solución experimental, la MNAzima correspondiente a y específica para ese objetivo se auto-ensambla y será capaz de catalizar la escisión de su sustrato correspondiente, resultando en la producción de una señal en esa ubicación. La posición de la señal detectable identificará así que MNAzima ha escindido su sustrato, y de este modo que objetivo (s) está(n) presente (s) en la solución experimental. En esta modalidad, la modificación del sustrato resulta en una señal identificable por virtud de su ubicación. El sustrato no necesita un mecanismo de detección independientemente identificable, por ejemplo, un diferente fluoróforo, aunque las personas expertas en el arte reconocerían que tal contemplación está dentro del alcance de la presente invención. Las modalidades de la presente invención comprenden un soporte insoluble en la forma de un "chip", conocido de otra manera como un arreglo o micro-arreglo, típicamente comprende una pluralidad de sustratos acoplados, atados o de otra manera unidos al chip. En las modalidades particulares, los sustratos comprenden un ácido nucleico. Una pluralidad de ácidos nucleicos puede posicionarse sobre el chip por cualquier método adecuado conocido en el arte, por ejemplo, por pipeta, impresión por chorro de tinta, impresión por contacto o fotolitografía. El chip pueden estar comprendido de al menos un elemento, con cada elemento comprendiendo al menos un ácido nucleico. El al menos un elemento puede estar comprendido de una pluralidad de ácidos nucleicos de la misma secuencia. El número de elementos que comprenden un chip puede ser cualquier número, y donde una pluralidad de elementos se posiciona sobre un chip, los elementos se pueden separar en una distancia uniforme o en una distancia variable, o en una combinación de las mismas. En algunas modalidades, los elementos pueden posicionarse aleatoriamente, con la ubicación respectiva de cada elemento posteriormente determinada. El tamaño y la forma de los elementos dependerán de la aplicación particular de la presente invención, y pueden combinarse elementos de diferentes tamaños y formas en un solo chip. La superficie del chip puede ser sustancialmente plana o puede tener características tales como depresiones o protuberancias, y los elementos pueden posicionarse ya sea en las depresiones o sobre las protuberancias. Tales depresiones pueden proporcionar un depósito para las soluciones en las cuales están inmersos los elementos, o tales protuberancias pueden facilitar el secado de los elementos. Por ejemplo, los elementos pueden colocarse en cada pozo de una placa de 96 pozos. En algunas modalidades, el chip puede incluir identificadores únicos tales como indicios, etiquetas de radiofrecuencia, dispositivos integrados tales como microprocesadores, códigos de barras u otras marcas para identificar cada uno de los elementos. Los identificadores únicos adicionalmente o alternativamente pueden comprender las depresiones o protuberancias en la superficie del arreglo. Además, los identificadores únicos pueden proporcionarse para la identificación u orientación correcta del chip. Los identificadores únicos pueden ser leídos directamente por un dispositivo de captura de datos o por un detector o explorador óptico. 6. Sistemas del sustrato reportero usados en los métodos También se proporcionan de acuerdo con la presente invención sistemas del sustrato reportero genérico, los cuales permiten el desarrollo rápido del ensayo permitiendo cambios de diseño fáciles para crear nuevas MNAzimas que reconocen diferentes objetivos. Como se describe aquí, la porción del brazo del sustrato y la porción del núcleo catalítico de las partzimas pueden permanecer sin cambios, solo con cambios para la porción del brazo detector de una o más partzimas requeridas para los nuevos objetivos. Se proporcionan las secuencias del sustrato genérico y por consiguiente puede incorporarse el mismo sustrato en los ensayos para muchos objetivos diferentes. Además, el mismo sustrato puede incorporarse en los métodos en varias modalidades aquí, incluyendo ensayos donde el sustrato está libre en la solución o está atado o unido a un soporte. Puede usarse una serie de sustratos genéricos en una reacción multiplex permitiendo la detección simultánea de múltiples objetivos. Las estrategias de MNAzima que usan sustratos genéricos ofrecen una ventaja principal sobre las tecnologías tales como TaqMan® o Beacons que requieren el diseño y uso de sondas específicas para cada nuevo objetivo. 7. Sustratos usados en los métodos Como se describe en más detalle a continuación, las MNAzimas tienen una propiedad ventajosa en ciertas modalidades de ser capaces de utilizar un sustrato universal o genérico. Tal sustrato se muestra en la Figura 1 en una configuración actualmente preferida en donde el sustrato comprende ambas; una porción detectable y una porción del hibridizador por apagado. La porción del hibridizador por apagado se adapta para disminuir o eliminar una señal detectable de la porción detectable del sustrato hasta que el sustrato se escinde por la MNAzima. Por ejemplo, la porción del hibridizador por apagado puede comprender el "Hibridizador 1 por apagado de agujero negro" (BHQl) o "Hibridizador 2 por apagado de agujero negro" (BHQ2) . De este modo, la MNAzima escinde el sustrato entre la porción detectable y la porción del hibridizador por apagado permitiendo que las dos porciones se separen en la solución, permitiendo por consiguiente que aparezca o que aumente la señal detectable mientras la porción del hibridizador por apagado se separa de, o se remueve efectivamente del ambiente local de la porción detectable.

El uso del sustrato genérico o universal se habilita a través del diseño de las partzimas componentes de la MNAzima. Alterando solo los brazos detectores de las partzimas, pero dejando sin cambios los brazos del sustrato, puede diseñarse una gran variedad de MNAzimas específicas para cada uno de una pluralidad de objetivos, todos de los cuales usan un sustrato universal para la detección. El artesano experto apreciará las ventajas que esto ofrece en términos de eliminar la necesidad para sustratos personalizados o únicos para cada objetivo. Cada nuevo objetivo requiere solo uno o más cambios en una o más de las porciones del brazo detector; la porción del brazo del sustrato y la porción del núcleo catalítico pueden permanecer constantes. Así, puede usarse un solo sustrato reportero para un solo objetivo usando una MNAzima, y múltiples objetivos en una serie de ensayos usando MNAzimas alteradas. Una pluralidad de sustratos reporteros permite la multiplexión para detectar múltiples objetivos en un solo ensayo usando múltiples MNAzimas, una para cada objetivo. Tales métodos multiplexados de usar MNAzimas son fácilmente realizados en solución (Figura 18) o con unión a un sistema de soporte (Figura 3) . Se contempla aquí que los ensayos multiplexados pueden llevarse a cabo así en sistemas que involucran unir uno o más del sustrato, o las partzimas de la MNAzima o el facilitador de ensamble, o las actividades adicionales de la enzima, a un soporte como se describe aquí. Además, los sustratos pueden incorporar entidades adicionales tales como ácidos nucleicos etiquetados, nanopartículas, micropartículas, proteínas, anticuerpos, ARN, ADN, análogos de ácido nucleico, proteínas, glicoproteínas, lipoproteínas, ácidos nucleicos peptídicos, ácidos nucleicos unidos, quimeras péptido-ácido nucleico, o cualquier combinación de los mismos. Por ejemplo, las nanopartículas pueden ser nanopartículas de oro, en donde estas nanopartículas de oro se asocian con una pluralidad de objetivos, tales como los ácidos nucleicos. Los sustratos pueden modificarse por una MNAzima proporcionando por consiguiente un efecto detectable. En el proceso de detección, la modificación del sustrato por una MNAzima puede involucrar, por ejemplo, escisión, ligación, metalación de porfirina, formación de enlaces carbono-carbono, enlaces éster o enlaces amida. Como una consecuencia de la modificación del sustrato por una MNAzima, se genera un efecto detectable y la magnitud del efecto por consiguiente puede ser indicativa de la cantidad del objetivo buscado para ser medido. El efecto detectable puede detectarse por una variedad de métodos, incluyendo espectroscopia de fluorescencia, resonancia de plasmón superficial, espectroscopia de masa, NMR, resonancia de giro del electrón, espectroscopia de fluorescencia de polarización, dicroísmo circular, inmunoensayo, cromatografía, radiometría, fotometría, graficado por centelleo, métodos electrónicos, UV, luz visible o espectroscopia infra roja, métodos enzimáticos o cualquier combinación de los mismos. Varios grupos han reportado detección de objetivos del ácido nucleico, y otros analitos con lecturas colorimétricas (Elghanian et al, 1997, Mirkin et al, 1996, y Liu and Lu, 2004). La estrategia implica la preparación de lotes de nanopartículas de oro, cada uno de los cuales tiene una secuencia de oligonucleótidos de ADN distinta unida a su superficie. Las partículas de oro posteriormente pueden agregarse por la adición de un "puente de oligonucleótidos", el cual tiene complementariedad con las secuencias que están unidas a las partículas de oro. La agregación de partículas resulta en un cambio concomitante en el color de rojo a azul (Mirkin et al, 1996) . El trabajo más reciente ha mostrado que la inclusión de una secuencia del sustrato de ADNzima dentro del puente de oligonucleótidos puede proporcionar un mecanismo para invertir la agregación de las partículas de oro (Liu and Lu, 2004). La activación de las ADNzimas, y la subsiguiente escisión del sustrato/puente de oligonucleótidos, resultó en la disociación de las partículas de oro y en un cambio en color de azul a rojo. Fue diseñado un detector sencillo de plomo basado en el concepto anterior que funcionó sacando provecho de la dependencia de una ADNzima específica por plomo para su actividad catalítica. La ADNzima se diseño para escindir un puente de oligonucleótidos usado para agregar partículas de oro (Liu and Lu, 2004). De modo semejante, una aptazima que contiene un aptámero específico para la adenosina, y una ADNzima capaz de escindir un puente de oligonucleótidos solo en la presencia de adenosina, permitió la detección de la adenosina en un formato colorimétrico. 8. Optimización de los métodos El artesano experto fácilmente entenderá que los métodos descritos aquí pueden optimizarse usando una variedad de parámetros experimentales para optimizar la detección, identificación y/o cuantificación de un objetivo. Los parámetros experimentales particulares que son optimizados, y el nivel de tal optimización, dependerán del método particular que se emplee y el objetivo particular que se pretenda detectar, identificar y/o cuantificar. Tales parámetros incluyen, pero no se limitan a, el tiempo, la temperatura, la concentración de sales, detergentes, cationes y otros reactivos incluyendo pero no limitado a dimetilsulfóxido (DMSO) , y longitud, complementariedad, contenido GC y punto de fusión (Tm) de los ácidos nucleicos. En algunas modalidades, por ejemplo aquellos métodos que involucran la detección de variación de secuencia y/o la detección de ADN metilado, los parámetros experimentales, y preferentemente incluyendo la temperatura a la cual se realiza el método, pueden optimizarse para discriminar entre el enlace de un ácido nucleico componente de la MNAzima a un ácido nucleico objetivo que comprende o no comprende una variación de secuencia o un nucleótido metilado, respectivamente. La temperatura a la cual tales métodos pueden realizarse puede estar en el rango de aproximadamente 20 °C a aproximadamente 96°C, aproximadamente 20 °C a aproximadamente 75°C, 20°C a aproximadamente 60 °C o aproximadamente 20 a aproximadamente 55°C En una modalidad preferida, se proporcionan aquí las reacciones optimizadas para practicar los métodos de usar MNAzimas. En tales reacciones optimizadas, la actividad catalítica se incrementa por hasta 10, 20, o 30 % arriba de las reacciones no optimizadas. Más condiciones de reacción preferidas mejoran la actividad catalítica por al menos 35 %, o 40 %, y preferentemente hasta 50 % o más. En modalidades aún más preferidas, las reacciones optimizadas tienen un incremento de actividad catalítica de más que 50 %, y hasta 66 %, 75 % o incluso 100 %. En modalidades aún más preferidas, un método de reacción completamente optimizado ofrecerá 100, 200 o incluso 300 % o más incremento en la actividad catalítica. Otras condiciones de reacción preferidas pueden mejorar la actividad catalítica por hasta 1000 % o más sobre los métodos practicados con condiciones de reacción no optimizadas. Una condición de reacción altamente preferida para optimizar los métodos proporcionados aquí es la inclusión de ciertos cationes divalentes. La actividad catalítica de la mayoría de las enzimas de ácidos nucleicos puede ser influenciada en una manera dependiente de la concentración por la concentración de los cationes divalentes. Las reacciones optimizadas preferidas son optimizadas por uno o más de Ba2+, Sr2+, Mg2+, Ca2+, Ni2+, Co2+, Mn2+, Zn2+, y Pb2+. 9. Métodos que usan aptámeros Las personas expertas en el arte fácilmente apreciarán que los métodos descritos aquí pueden realizarse con aptámeros, en donde dichos aptámeros pueden facilitar la detección, identificación y/o cuantificación de objetivos incluyendo objetivos diferentes de los ácidos nucleicos . Con referencia a las Figuras 4 y 20, se ejemplifica un método de usar MNAzimas para detectar objetivos, incluyendo entidades no ácidos nucleicos. Este método usa aptámeros que pueden comprender una proteína o ácido nucleico, polipéptido, o péptido o combinación de los mismos que tiene la habilidad de reconocer uno o más ligandos. Los aptámeros pueden enlazar, por ejemplo, proteínas, polipéptidos, péptidos o ácidos nucleicos, glicoproteínas, lípidos, lipoproteínas, células, virus, bacterias, archaea, hongos, anticuerpos, metabolitos, patógenos, toxinas, contaminantes, venenos, organismos enteros, moléculas pequeñas, polímeros, iones metálicos, sales metálicas, priones o cualquier derivado, porción o combinación de los mismos, o cualquier otra entidad (Lee et al., 2004) . Los aptámeros preferidos aquí pueden comprender péptidos u oligómeros de ADN o ARN de una sola hebra, cortos, que pueden aislarse de genotecas complejas de péptidos o ácidos nucleicos sintéticos por un proceso iterativo de adsorción, recuperación, y re-amplificación. Los aptámeros por consiguiente pueden generarse contra casi cualquier objetivo, variando dentro del rango de moléculas pequeñas tales como los aminoácidos o antibióticos, a estructuras de ácidos nucleicos y proteínas. En las modalidades preferidas, los aptámeros incluyen, por ejemplo, moléculas que enlazan los ácidos nucleicos que se generan preferentemente por técnicas de evolución y selección. Preferentemente, los aptámeros pueden comprender moléculas de ADN o ARN, o una combinación de ambas, incluyendo pero no limitado a los análogos de nucleótidos de acuerdo con, por ejemplo, la Tabla 2 anterior. Las estrategias para combinar el uso de los aptámeros con MNAzimas se ilustra en las Figuras 4 y 20. Con referencia a la Figura 4 panel (i), los oligonucleótidos del ácido nucleico requeridos para esta estrategia de detección de MNAzima pueden incluir; (a) una partzima estándar; (b) una apta-partzima que es una partzima que incorpora un aptámero (secuencia en negritas) así como también una secuencia complementaria capaz de formar una horquilla y por consiguiente inhibir el ensamble de la MNAzima; (c) un facilitador de ensamble que puede enlazar a ambas; la apta-partzima y la partzima, habilitando así el ensamble de una MNAzima activa; y (d) un sustrato. En la ausencia de un analito (An) objetivo, la apta-partzima adopta una estructura de horquilla que inhibe el ensamble de una MNAzima activa. En la presencia del analito objetivo, el analito objetivo se enlaza al dominio del aptámero de la apta-partzima, rompiendo así la estructura de horquilla y permitiendo a la apta-partzima participar en el ensamble de una MNAzima activa. La MNAzima activa puede posteriormente modificar un sustrato causando, por ejemplo, la generación de la señal fluorescente.

Con referencia a la Figura 4 panel (ii) , los oligonucleótidos del ácido nucleico requeridos para esta estrategia de detección de MNAzima pueden incluir; (a) dos partzimas estándar; (b) un facilitador de ensamble que incorpora un aptámero (secuencia en negritas) así como también una secuencia del inhibidor complementaria capaz de formar una estructura de horquilla; y (c) un sustrato. En la ausencia de un analito objetivo, el facilitador de ensamble adopta una estructura de horquilla que inhibe la habilidad de este componente para dirigir el ensamble de las MNAzimas activas. En la presencia del analito objetivo, el analito objetivo se enlaza al dominio del aptámero del facilitador de ensamble, rompiendo así la estructura de horquilla y permitiendo al componente dirigir el ensamble de una MNAzima activa. La MNAzima activa posteriormente puede modificar un sustrato causando, por ejemplo, la generación de la señal fluorescente. Uno experto en el arte apreciará que el aptámero puede incorporarse en cualquier extremo de la molécula o moléculas facilitadoras de ensamble. Además será apreciado que podrían incorporarse múltiples aptámeros en uno o más de los componentes de oligonucleótido de partzima. El facilitador de ensamble en las estrategias ilustradas en la Figura 4 paneles (i) y (ii) puede comprender ADN, ARN, LNA, PNA o una secuencia que tiene uno o más análogos de la base del nucleótido. En otras modalidades, el objetivo An es un ácido nucleico. En tales modalidades, una secuencia complementaria para el ácido nucleico objetivo reemplaza la secuencia del aptámero en negritas en la Figura 4. Con referencia a la Figura 4 panel (iii), los oligonucleótidos del ácido nucleico requeridos para esta estrategia de detección de MNAzima pueden incluir dos apta-partzimas, cada una de las cuales contiene una porción de un aptámero. En la ausencia de un analito objetivo, las MNAzimas activas no pueden ensamblarse. En la presencia del analito objetivo, el analito objetivo sirve como el facilitador de ensamble poniendo los componentes oligonucleótido juntos, dirigiendo así el ensamble de una MNAzima activa. La MNAzima activa posteriormente puede modificar un sustrato causando, por ejemplo, la generación de la señal fluorescente. Una estrategia relacionada, la cual combina el enlace del aptámero y el ensamble de la MNAzima, se ilustra en la Figura 20. En esta estrategia, se incorpora una secuencia del aptámero al final de una partzima (apta-partzima) en una configuración por lo cual solo se forma una MNAzima activa en la presencia del analito objetivo. Los componentes oligonucleótido requeridos para la estrategia de detección de MNAzima ilustrada incluyen; (a) una partzima estándar; (b) una apta-partzima que es una partzima con un aptámero incorporado en uno de sus extremos; (c) un facilitador de ensamble que enlaza a ambas; la apta-partzima y la partzima que habilita el ensamble de una MNAzima activa (en la presencia del objetivo) ; (d) un sustrato de sonda reportera; y (e) un inhibidor de ensamble que híbrida a la apta-partzima en una región que abarca al menos parte de la secuencia del aptámero y parte del brazo que enlaza al sustrato de la secuencia de partzima. En la ausencia de un objetivo (panel de la izquierda) , el inhibidor de ensamble se enlaza a la apta-partzima bloqueando así el enlace (y la escisión) del sustrato de sonda reportera. En la presencia de un objetivo (panel de la derecha), el objetivo se enlaza a la secuencia del aptámero de la apta-partzima, previniendo el enlace del inhibidor de ensamble y permitiendo el enlace y la escisión del sustrato de sonda reportera. Como tal, una MNAzima activa solo puede formar y causar la generación de la señal fluorescente en la presencia del objetivo. Además, será apreciado por uno experto en el arte que la estrategia como se ilustra en la Figura 20 es similar a aquella ilustrada en la Figura 4 panel (i), con la diferencia siendo que la secuencia del inhibidor complementaria, la cual previene la formación de la MNAzima activa, se incorpora ya sea en un componente de partzima de oligonucleótido (Figura 4 panel (i) ) o en una molécula separada (Figura 20) . Como tal, una secuencia del inhibidor puede ser una molécula separada o puede incorporarse en uno de los componentes que participan en el complejo de MNAzima. También será apreciado por uno experto en el arte que uno o más aptámeros podrían incorporarse en cualquiera de los componentes de oligonucleótido, incluyendo las partzimas, el facilitador de ensamble o el sustrato. Además el aptámero podría incorporarse en cualquier extremo de cualquiera de estos oligonucleótidos. La invención puede comprenderse mejor por la referencia a los ejemplos 18 y 21 donde el aptámero/estrategia de MNAzima se usa para detectar una molécula pequeña (ATP) y una proteína ( Taq polimerasa) respectivamente.

. Métodos para la detección, identificación y cuantificación del microABN El artesano experto entenderá que la detección, identificación y/o cuantificación del microARN representa una modalidad particular de los métodos descritos aquí. Con referencia a la Figura 5, se ejemplifica una estrategia para la amplificación de secuencias cortas de ácidos nucleicos (por ejemplo microARNs (miRs) ) y para la detección de amplicones usando MNAzimas.

La detección de secuencias cortas de ácidos nucleicos tales como microARNs (miRs) requiere estrategias adicionales primordialmente debido al tamaño pequeño de estos objetivos. Las miRs son moléculas de ARN de no codificación de aproximadamente 22 nucleótidos de longitud. Pueden detectarse mediante clonación o análisis de manchado northern, pero estos métodos son laboriosos y requieren grandes cantidades de ARN total que las técnicas tales como RT-PCR. El tamaño pequeño de las miRs proporciona secuencia insuficiente para acomodar dos cebadores PCR de diseño estándar. Además, aun si se realiza la amplificación de miR, es difícil distinguir amplicones genuinos de los dímeros del cebador usando ya sea el tamaño (averiguado por electrofóresis) , o la fluorescencia de la intercalación de tintes no específicos, tales como Verde Sybr o Bromuro de Etidio. Esta limitación podría superarse mediante la formación de sondas de los amplicones de miR con sondas de hibridación internas tales como sondas TaqMan® o Beacon, sin embargo, de nuevo el tamaño pequeño de los amplicones prohibe el uso de sondas de diseños estándar. Un método RT-PCR TaqMan® modificado (Chen et al , 2005) para el análisis de miR inicia la transcripción inversa usando los cebadores 3' que tienen terminales 3' específicas para miR y secuencias no relacionadas adicionales en sus terminales 5' que pueden formar vástagos-lazos . El cADN generado se amplifica usando estos cebadores 3' y los cebadores 5' , que también tienen terminales 3' específicas para miR y secuencias no relacionadas adicionales en sus terminales 5' . La amplificación se monitorea en tiempo real usando sondas TaqMan® que enlazan a ambas; las secuencias miR y las secuencias no relacionadas introducidas por los cebadores. Sin embargo, debido al diseño del cebador, y al tamaño y posicionamiento de la sonda TaqMan® existe aún la probabilidad de que las miRs específicas no puedan distinguirse de las secuencias estrechamente relacionadas. Como se muestra en la Figura 5, el método empleado aquí preferentemente emplea un cebador 3' que se enlaza a una miR en su extremo 3' y que tiene una secuencia de extensión, no relacionada a la miR, que puede, o no, formar un vástago-lazo en el extremo 5' . Como representa la Figura 5, la secuencia no relacionada del cebador puede crear una estructura de lazo (Figura 5, lado izquierdo) o puede meramente crear una estructura de etiqueta (Figura 5, lado derecho) . En cualquier ejemplo, el cebador miR 3' se extiende en la presencia de la transcriptasa inversa, seguida por la amplificación PCR usando los cebadores 5' y 3' con la secuencia específica para miR en el extremo 3' con la secuencia de extensión no relacionada en los extremos 5' . Los amplicones son fácilmente detectados por las MNAzimas, las cuales reconocen e hibridan al amplicón incluyendo la región entre los cebadores 5' y 3' . El requerimiento estricto para la complementariedad entre el brazo detector de la MNAzima y el ácido nucleico objetivo permite la discriminación de secuencias aun estrechamente relacionadas. El Ejemplo 5 y el Ejemplo 10 en los Ejemplos debajo, demuestran los resultados de usar MNAzimas para detectar amplicones generados por la amplificación de secuencias cortas de ácidos nucleicos (vea también la estrategia 2 en la Figura 2, arriba). Además, el ejemplo 5 demuestra la capacidad de los métodos que usan MNAzimas para distinguir entre dos secuencias que tienen solo una sola diferencia del nucleótido. Esto proporciona una ventaja principal en que, aun cuando el proceso de amplificación es incapaz de discriminar entre las secuencias estrechamente relatadas, las MNAzimas permitirán la discriminación entre la menor variación de secuencia en los amplicones resultantes. 11. Métodos que usan las cascadas Las personas expertas en el arte apreciarán que los métodos descritos aquí pueden usarse para realizar una cascada como se define aquí. Las modalidades particulares para realizar tales métodos como se describe aquí incluyen, pero no se limitan a (1) el uso de una MNAzima para escindir un sustrato solo en la presencia de un objetivo, en donde dicho sustrato posteriormente se hace disponible para el envolvimiento en un segundo evento tal como la generación de una señal detectable, como se representa en la Figura 6 en donde la escisión de un sustrato hace disponible una enzima que posteriormente puede escindir una ancla, resultando por consiguiente en la disociación de la etiqueta fluorescente de un hibridizador por apagado; o (2) el uso de una MNAzima para escindir un sustrato solo en la presencia de un objetivo, en donde dicho sustrato posteriormente se hace disponible para el envolvimiento en un segundo evento, en donde el desempeño de dicho segundo evento a su vez hace disponible un sustrato adicional para el envolvimiento en cualquier número de eventos subsiguientes, tal que un evento subsiguiente hace disponible un sustrato para el envolvimiento en el desempeño de un evento anterior, creando por consiguiente una cascada cíclica, tal como se representa en las Figuras 7 y 25, en donde tales cascadas cíclicas pueden emplearse para amplificar una señal, por ejemplo, en aplicaciones donde la baja abundancia de un objetivo no puede proporcionar de otra manera una señal que sea detectable. Una cascada de amplificación del efecto detectable puede comprender una o más de una cascada de ribozima/ligasa, una cascada de la enzima de ácido nucleico circular, una cascada de enzima de proteína, o una o más enzimas unidas a un soporte, o cualquier combinación de las mismas . Con referencia a la Figura 2, la estrategia 3 muestra una visión general de un método de usar una MNAzima para amplificar una señal a través del uso de una cascada de señal. Esto se discute en más detalle con referencia a las Figuras 6, 7 y 25. La Figura 6 representa un método ejemplar de detección de la MNAzima del objetivo acoplado con la amplificación de señal mediada por la enzima. Como se describe anteriormente, la invención proporciona métodos de usar la detección de MNAzima en donde se amplifica un objetivo así como también métodos en donde se amplifica una señal generada. En algunas modalidades, combinar la tecnología de MNAzima con las estrategias de amplificación de señal proporciona una alternativa para los ensayos de MNAzima combinados con la amplificación del objetivo, aunque en algunas instancias la amplificación del objetivo y la amplificación de señal pueden usarse conjuntamente. Los métodos preferidos de amplificar las señales implican mecanismos de cascada, los cuales como apreciará el artesano experto a menudo están involucrados al amplificar las señales en los sistemas biológicos. Varios ejemplos de cascadas de amplificación, que usan ácidos nucleicos catalíticos, son conocidos en el arte y se contemplan para el uso aquí. Las cascadas de ligación (Paul and Joyce, 2004) usan una primera ribozima (A) que liga dos oligonucleótidos que contienen ARN para formar una segunda ribozima (B) . La ribozima (B) posteriormente liga otros dos oligonucleótidos que contienen ARN para formar una nueva primera ribozima (A) , disparando así una reacción en cascada. Una segunda cascada de amplificación adecuada para el uso aquí usa moléculas de ADNzima/sustrato propagadas (Levy and Ellington, 2003) . Una ADNzima (A) está inactiva cuando está circular, pero se activa por la linearización por una segunda ADNzima (B) , la cual escinde la ADNzima (A) circular. La ADNzima (A) lineal activa posteriormente escinde las moléculas de ADNzima (B) circular de esta manera linearizandolas y activándolas. Las dos ADNzimas capaces de escindir/linearizar entre sí, resultan en una cascada de actividad del ácido nucleico catalítico. Las personas de habilidad en el arte entenderán que otros acercamientos están disponibles por ejemplo combinando el uso de ADNzimas con la versatilidad de los aptámeros y/o con el poder catalítico de las enzimas de proteínas tradicionales (vea por ejemplo Zhang et al . , 2005) . El método de Zhang resulta en la liberación de una enzima de proteína que puede, a su vez, catalizar la formación de moléculas detectables, generando ' y amplificando la señal en consecuencia. El acercamiento de Zhang permite la detección sensitiva, pero es caro ya que requiere moléculas altamente personalizadas para cada ensayo. Los métodos para el acoplamiento de péptidos a los ácidos nucleicos son conocidos en el arte (vea por ejemplo Cheng et al . , 1993), como son métodos para unir ADN a estructuras de soporte. Por ejemplo, Asher (PCT/US96/02380) describe atar una enzima (ribozima) a un soporte insoluble, el cual sobre la liberación, escinde un sustrato iniciando por consiguiente la amplificación de una señal usando dos ribozimas espacialmente separadas. Otros ejemplos de amplificación de señal para los métodos in vi tro son conocidos en el arte, y aún otras estrategias para amplificar las señales pueden crearse usando técnicas similares a aquellas que han resultado ser exitosas. Por ejemplo, el ensayo de ADN ramificado (bADN) (Urdea, 1993) amplifica una señal empleando una molécula reportera secundaria (por ejemplo fosfatasa alcalina) unida a sondas etiquetadas que median la reacción. La espectroscopia de correlación de fluorescencia (FCS) emplea la amplificación electrónica de la señal (Eigen and Rigler, 1994). La amplificación de señal de tiramida (TSA) (Bobrow et al . , 1989; Adams, 1992; Raap et al . , 1995; van Gijlswijk et al . , 1997), usa peroxidasa de rábano para convertir la tiramisida a su forma activa, la cual se enlaza a los residuos de tirosina en las proteínas. La TSA se usa para varias aplicaciones de inmunoquímica celular. El ensayo Invader (Hall et al . , 2000) emplea dos oligonucleótidos que se enlazan a una secuencia objetivo en una manera que permite la escisión de la nucleasa, conduciendo a más que 1000 eventos de escisión por molécula objetivo con el paso del tiempo, y la reacción de escisión puede acoplarse a una sonda fluorescente. Sin embargo, hay limitaciones para los métodos conocidos de amplificación de señal. Por ejemplo, el ensayo de bADN no es tan sensitivo como los métodos de amplificación del objetivo. Por consiguiente, con más atención a la Figura 6, se representa un ejemplo de un método que emplea una enzima liberada por las MNAzimas como parte de una estrategia de amplificación de señal. La señal puede generarse, por ejemplo, por escisión de la enzima de un sustrato entre un radical fluoróforo y un radical hibridizador por apagado, permitiendo así que se genere una señal. Las enzimas contempladas para el uso aquí incluyen, pero no se limitan a, ADNzimas, MNAzimas, ribozimas, y enzimas de proteínas con actividad medible, tales como proteasas, endonucleasas de restricción y otras enzimas hidrolíticas . Los objetivos preferidos son secuencias de ácidos nucleicos que incluyen, pero no se limitan a, ADN o ARN humano, animal, planta, viral, o bacteriano. Otros objetivos preferidos pueden incluir, prión, levadura o fungosidad, o cualquier otra molécula, por ejemplo, incluyendo pero no limitado a glicoproteínas, lípidos, lipoproteínas, organismos enteros, células, virus, bacterias, archaea, hongos, anticuerpos, metabolitos, patógenos, toxinas, contaminantes, venenos, moléculas pequeñas, polímeros, iones metálicos, sales metálicas, priones o cualquier derivado, porción o combinación de los mismos. Como se puede observar en la Figura 6, una enzima ejemplar, designada aquí "Enzima" se une a un primer soporte insoluble, a través de una molécula que se puede escindir, preferentemente un ácido nucleico. Como se muestra en el ejemplo en la Figura 6, la molécula que se puede escindir que actúa como la unión para la enzima "Enzima" es un sustrato de MNAzima genérico o universal. También está unido a un soporte insoluble no en contacto con el primer soporte insoluble un sustrato de "ancla escindible" para la enzima "Enzima". La "Enzima" es cualquier enzima con una actividad detectable, por ejemplo una MNAzima, ADNzima, ribozima, o enzima de proteína como se describe anteriormente. En las modalidades preferidas, las MNAzimas o ADNzimas son particularmente útiles. En la presencia de los componentes oligonucleótido, o partzimas, que se auto-ensamblan para formar una MNAzima capaz de escindir el sustrato universal o genérico, y en la presencia del objetivo para la MNAzima, la MNAzima forma y escinde catalíticamente la "Enzima" del soporte, liberándola por consiguiente y permitiéndole acceder al sustrato de "ancla escindible" y escindirlo. La escisión de la "ancla escindible" libera el fluoróforo del sustrato unido. El fluoróforo es fácilmente detectado y medido. La separación física de una enzima inmovilizada o unida de su sustrato, el cual también está preferentemente inmovilizado o unido a un soporte, es algunas veces referida aquí como "separación espacial". Una o más enzimas pueden estar "separadas espacialmente" de sus sustratos respectivos, y de entre sí. Una cascada de amplificación de señal puede resultar, particularmente donde la escisión del sustrato para la primera enzima libera la segunda enzima, la cual a su vez libera más la primera enzima cuando el sustrato para la segunda enzima se escinde (vea la Figura 7) . En las modalidades preferidas, el sustrato para la enzima "Enzima" es un sustrato bifuncional como se muestra, que comprende ambas; una porción del hibridizador por apagado y una porción detectable. Son particularmente preferidas las modalidades en donde el sustrato para la enzima "Enzima" es una molécula sin señal detectable mientras en el sustrato no escindido, y cuya señal detectable incrementa por uno a muchos órdenes de magnitud sobre la escisión. Con referencia ahora a la Figura 7, se muestra un ejemplo de un ensayo que usa MNAzimas y una amplificación de señal usando dos enzimas "separadas espacialmente". También puede generarse una cascada de amplificación de señal usando tales ADNzimas "separadas espacialmente" como se describe anteriormente. Un evento de escisión de MNAzima inicial escinde un sustrato atado inmovilizado, liberando así la ADNzima A. La ADNzima A posteriormente emigra a una segunda secuencia donde está atada una segunda ADNzima B. La ADNzima A libera la ADNzima B que, a su vez, libera más de la ADNzima A. Se inicia una cascada que resulta en la amplificación de señal. En varias modalidades, el objetivo puede ser secuencias de ácidos nucleicos incluyendo, pero no limitado a, ADN o ARN humano, viral, bacteriano; o el objetivo puede ser proteínas, virus, priones, anticuerpos, células completas o moléculas pequeñas. En particular, se puede observar del ejemplo en la Figura 7 que la ADNzima A está unida a un soporte a través de un primer sustrato de MNAzima universal o sustrato genérico, que también se escinde por la ADNzima B. La ADNzima B está unida a un soporte insoluble a través de un segundo sustrato genérico que es un sustrato para la ADNzima A. Ambas ADNzimas se retienen tal que sus sustratos respectivos son inaccesibles para ellas. En la presencia de las partzimas que se auto-ensamblan para formar una MNAzima que escinde el sustrato universal, y en la presencia adicional del objetivo, la MNAzima se forma y escinde el sustrato de MNAzima universal que retiene la ADNzima A, liberando por consiguiente la ADNzima A. La ADNzima A ahora puede emigrar al segundo sustrato genérico. Sobre la escisión del segundo sustrato genérico por la ADNzima A, la ADNzima B se libera junto con su señal detectable unida, mostrada aquí como un fluoróforo F. El fluoróforo F ahora es detectable ya que se separa de una porción Q del hibridizador por apagado retenida. La ADNzima B liberada, ahora capaz de acceder a su sustrato lo hace, escindiéndolo (el primer sustrato genérico) y liberando por consiguiente ADNzima A adicional, que a su vez libera más ADNzima B y la señal F detectable. Así, se establece una cascada de amplificación de señal poderosa, con cantidades que incrementan exponencialmente de señal F detectable. Un ejemplo de una cascada de MNAzima usando partzimas atadas puede comprenderse mejor por referencia a la Figura 25. Las MNAzimas pueden usarse para iniciar cascadas de amplificación de señal como se ilustra en este diagrama. La reacción contiene los siguientes elementos; (i) partzimas para la MNAzima 1 que están libres en la solución; (ii) un facilitador de ensamble para las MNAzimas 2 y 3 (que tienen los mismos brazos detectores) que está ya sea libre en la solución (como se ilustra) o atado a un soporte insoluble por el sustrato, Sub 1; (iii) partzimas para la MNAzima 2 que están atadas a un soporte insoluble por el sustrato, Sub 1. Sub 1 puede escindirse por ya sea la MNAzima 1 (en la presencia de un analito objetivo) o por la MNAzima 3 (en la presencia de un facilitador de ensamble) , y la escisión resulta en la liberación de las partzimas para la MNAzima 2 en la solución; (iv) partzimas para la MNAzima 3 que están atadas a un soporte insoluble por el sustrato, Sub 2. Sub 2 puede escindirse por la MNAzima 2 (en la presencia del facilitador de ensamble) y la escisión resulta en la liberación de las partzimas para la MNAzima 3 en la solución; (v) Sub 2-FQ, que tiene la misma secuencia que Sub 2, pero está libre en la solución y está doblemente etiquetado con un fluoróforo (F) y un hibridizador por apagado (Q) . Sub 2-FQ puede escindirse por la MNAzima 2 para generar una señal fluorescente. En la presencia del analito objetivo, la MNAzima 1 activa se forma a partir de partzimas que están libres en la solución. La MNAzima 1 escinde su Sub 1 liberando así las partzimas para la MNAzima 2. Una vez libres, estas partzimas hibridan con el facilitador de ensamble y forman la MNAzima 2, la cual escinde el Sub 2-FQ libre (generando una señal fluorescente) , o el Sub 2 atado (liberando las partzimas para la MNAzima 3) . Debido a que la MNAzima 3 comparte los mismos brazos del sustrato que la MNAzima 1, también puede escindir el Sub 1 atado, liberando así más partzimas para la MNAzima 2. Esto resulta en una cascada de generación enzimática de los componentes (partzimas) para más enzimas (MNAzimas) y una cascada de amplificación de señal concomitante. 12. Métodos para la detección, identificación y cuantificación del ácido nucleico metilado La generación de señal mediada por la MNAzima permite la discriminación entre las secuencias de ácidos nucleicos completamente apareadas y aquellas que contienen desapareamientos. Esta capacidad habilita a las MNAzimas para usarse para la detección, identificación y cuantificación del ácido nucleico metilado. Las alteraciones en el patrón de metilación ocurren frecuentemente en asociación con padecimientos tales como cáncer, diabetes, padecimientos autoinmunes, y desórdenes psiquiátricos. La vasta mayoría de protocolos actualmente usados para el análisis de metilación comienza con la modificación de bisulfito del ADN genómico. La modificación de bisulfito convierte citidinas no metiladas, pero no metiladas, a uridinas. Si se amplifica entonces el ácido nucleico- modificado por bisulfito, por ejemplo por PCR, las uridinas se reemplazan con timidinas y la citidina metilada se reemplaza por la citidina. Los amplicones modificados pueden analizarse por varios métodos que permiten la discriminación de las secuencias que contienen T (en posiciones que contienen originalmente C no metilado) y C (en posiciones que contienen originalmente C metilado) . La capacidad de las MNAzimas para discriminar entre variantes de secuencias estrechamente relacionadas hace esta tecnología muy adecuada para discriminar entre las secuencias modificadas por bisulfito que estaban originalmente ya sea metiladas o no metiladas. El acercamiento puede comprenderse mejor por referencia al ejemplo 11. Además, las MNAzimas pueden proporcionar un nuevo acercamiento que permite el análisis directo del ADN metilado y no metilado sin la necesidad de la modificación de bisulfito. Esto proporciona una ventaja significativa debido a que la modificación de bisulfito es laboriosa, consumidora de tiempo y destructiva para el ácido nucleico a ser analizado. El uso de un brazo estabilizador con una partzima que tiene un brazo detector truncado se ha usado para demostrar la capacidad de las MNAzimas para detectar polimorfismos sencillos del nucleótido presentes en los facilitadores de ensamble (Ejemplo 22). Bajo las condiciones experimentales usadas en ese ejemplo, una partzima con un brazo detector (base cinco) truncado fue funcional en una temperatura muy por encima de su temperatura de fusión esperada. Los sistemas con brazos estabilizadores, y partzimas que tienen brazos detectores truncados, son muy sensitivos a cambios pequeños en el objetivo, y son amenos para usarse en temperaturas altamente severas . Esta estrategia de detección puede adicionalmente extenderse para discriminar directamente entre objetivos, que están ya sea metilados o no metilados en los residuos de citosina específicos, sin la necesidad de la modificación de bisulfito anterior. La presencia de 5-metilcitosina (s) incrementa la temperatura de fusión del ADN por 1.3°C por base metilada, relativa a citosina (s) no metilada (s). Cuando las partzimas, un brazo estabilizador, y un sustrato se incuban en una temperatura, la cual es adecuada para la hibridación y el ensamble de la MNAzima activa en la presencia de un objetivo metilado, pero que es demasiada alta para el ensamble de la MNAzima en la presencia de un objetivo no metilado, se generaría una señal solo en la presencia del objetivo metilado. Esto proporciona una nueva estrategia para el análisis directo de patrones de metilación que pueden proporcionar un método para la detección de bases de metilación como marcadores de cáncer y otros padecimientos. Los artesanos expertos por consiguiente fácilmente apreciarán y entenderán que la optimización de los parámetros experimentales incluyendo la temperatura como se describe aquí, está contemplada como dentro del alcance de los métodos de la presente invención, y que tal optimización encuentra aplicación particular en el desempeño de los métodos referentes a la detección de ADN metilado ya sea directamente o después de la modificación de bisulfito. 13. Métodos para la detección e identificación de variantes de las secuencias de ácidos nucleicos La presente invención proporciona además métodos para la detección e identificación de variantes de la secuencia sobre la base de que la generación de señal mediada por la MNAzima permite la discriminación entre secuencias de ácidos nucleicos completamente apareadas y aquellas que contienen desapareamientos. Las variaciones de la secuencia capaces de detección por los métodos de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, adiciones, eliminaciones, sustituciones, conversiones, duplicaciones, desplazamientos, variantes de secuencia de desplazamiento de sección invariante, variantes de secuencia no sentido, o cualquier combinación de los mismos. Los métodos pueden aplicarse en cualquier situación en la cual es deseable detectar y/o identificar una variación de la secuencia de ácidos nucleicos, incluyendo pero no limitado al diagnóstico de padecimientos o predisposiciones a los mismos, identificación de polimorfismos, o valoración de la fidelidad de replicación de ácidos nucleicos. Además, también pueden detectarse alteraciones mayores tales como desplazamientos asociados con varios tipos de cáncer, lo que resulta en traslados de fusión. Esto ocurre frecuentemente en asociación con la leucemia. Por ejemplo, los traslados de fusión PML/RARa están asociados con la leucemia promielocítica aguda y los traslados de fusión bcr/abl están asociados con la leucemia granulocítica crónica. La detección del objetivo mediada por la MNAzima puede ocurrir vía el reconocimiento de bases de Watson-Crick de los brazos detectores de la partzima y el facilitador de ensamble. El requerimiento para la complementariedad puede explotarse para detectar pequeñas variaciones de la secuencia, incluyendo pero no limitado a, desapareamientos de bases sencillas entre el brazo detector de la partzima y el facilitador de ensamble. La capacidad para la discriminación de variantes de secuencia puede comprenderse mejor por referencia a los ejemplos 5, 19 y 22. Todos esos ejemplos demuestran la capacidad de las MNAzimas para discriminar entre situaciones donde el brazo detector y facilitador de ensamble están completamente apareados, y situaciones donde hay al menos un desapareamiento sencillo de la base o polimorfismo. La capacidad para discriminar desapareamientos de bases sencillas es dependiente de varios factores que incluyen (a) la severidad de las condiciones de reacción, las cuales pueden ser influenciadas por muchos factores incluyendo la temperatura, concentración de sal, concentración del catión, (b) el tipo de desapareamiento, (c) la posición del desapareamiento dentro del brazo de la partzima, y (d) la longitud del brazo de la partzima. Dependiendo de la aplicación, la severidad de la reacción puede adaptarse para ser ya sea intolerante, o tolerante, hasta cierto punto de desapareamiento entre el brazo detector y el facilitador de ensamble. Las condiciones severas permiten la discriminación de variantes de secuencias estrechamente relacionadas, tales como una sola diferencia del nucleótido. Las condiciones de menor severidad no pueden discriminar entre los facilitadores de ensamble con secuencias estrechamente relacionadas. Por consiguiente, esto podría explotarse para detectar simultáneamente un grupo de secuencias estrechamente relacionadas en una sola reacción con una sola MNAzima. La discriminación de polimorfismos sencillos del nucleótido puede extenderse por el uso de partzimas con brazos detectores truncados (Figura 23 y Ejemplo 22). Los brazos detectores truncados pueden estabilizarse por un componente oligonucleótido estabilizador, el cual aunque es una molécula separada, puede considerarse como un segundo componente de la partzima truncada, a la cual se enlaza de manera adyacente. 14. MNAzimas para la detección, identificación y/o cuantificación de bacterias y virus La presente invención comprende métodos para la detección de bacterias, virus o cualquier otro microorganismo, por ejemplo, a través del diseño de brazos detectores de la MNAzima que se adaptan para hibridar a cualquier molécula tal como un ácido nucleico que es único para el microorganismo que se pretende sea detectado, identificado y/o cuantificado. Adicionalmente o alternativamente, puede detectarse una clase de microorganismos, por ejemplo, incluyendo pero no limitado a bacterias Gram positivo o Gram negativo. Más variaciones de los métodos que están dentro del alcance de la contemplación de la persona experta en el arte incluyen, pero no se limitan a, el uso de un aptámero adaptado para enlazar una proteína, molécula pequeña, célula, componente celular o producto celular tal como una toxina que es única para el microorganismo que se pretende sea detectado, identificado y/o cuantificado. Las bacterias y virus contienen ADN y/o ARN que pueden proporcionar un molde macromolecular para su identificación, detección y/o cuantificación rápida y sensitiva usando la tecnología de MNAzima. La variación de secuencia entre las cepas y especies bacterianas y virales puede usarse para permitir la discriminación sensitiva entre las cepas y especies individuales. Los acercamientos de MNAzima multiplex son particularmente preferidos para la detección y/o discriminación simultánea de múltiples especies, cepas o aislados bacterianos o virales. Alternativamente, las regiones de similitud de secuencia a través de las cepas y especies bacterianas o virales pueden usarse para identificar la presencia o la ausencia de cualquiera de un grupo de cepas y especies individuales en un solo ensayo de la MNAzima. Este acercamiento más reciente se ejemplifica en el Ejemplo 15 donde una región conservada encontrada en la secuencia 16S ribosómica bacteriana se usó como la base de un ensayo para reemplazar la prueba bacteriana de una mancha Gram para una prueba rápida de liberación para la esterilidad y/o contaminación de micoplasma.

El Ejemplo 16, que ilustra el uso de las MNAzimas para la detección y cuantificación de ARN viral HIV-1, demuestra el uso de las MNAzimas como una herramienta sensitiva para la detección y cuantificación viral.

. Equipos La presente invención también proporciona equipos para practicar los métodos descritos aquí. Típicamente, los equipos para llevar a cabo los métodos de la presente invención contienen todos los reactivos necesarios para llevar a cabo el método. Por ejemplo, en una modalidad un kit puede comprender un primer recipiente que contiene al menos un primer y segundo componentes de oligonucleótido que comprenden una primera y segunda partzima, y un segundo recipiente que comprende un sustrato, en donde el auto-ensamble de la primera y segunda partzimas, y el sustrato, en una MNAzima requiere la asociación de un facilitador de ensamble presente en la muestra experimental. Consecuentemente, en tal modalidad, la primera y segunda partzimas, y el sustrato, pueden aplicarse a la muestra experimental para determinar la presencia del facilitador de ensamble, en donde el facilitador de ensamble comprende el objetivo. Típicamente, los equipos de la presente invención también comprenderán uno o más otros recipientes, que contienen por ejemplo, reactivos de lavado, y/u otros reactivos según se requiera en el desempeño de los métodos de la invención. En el contexto de la presente invención, un kit compartimentado incluye cualquier kit en el cual están contenidos los reactivos en recipientes separados, y pueden incluir pequeños recipientes de vidrio, recipientes de plástico o tiras de plástico o de papel. Tales recipientes pueden permitir la transferencia eficiente de reactivos de un compartimiento a otro compartimiento evitando la contaminación cruzada de las muestras y los reactivos, y la adición de agentes o soluciones de cada recipiente de un compartimiento a otro en una manera cuantitativa. Tales equipos también pueden incluir un recipiente que aceptará la muestra experimental, un recipiente que contiene los reactivos usados en el ensayo, recipientes que contienen reactivos de lavado y recipientes que contienen un reactivo de detección. Típicamente, un kit de la presente invención también incluirá instrucciones para usar los componentes del kit para dirigir los métodos apropiados. Los equipos y los métodos de la invención pueden usarse en conjunción con equipo y sistemas de análisis automatizado, por ejemplo, incluyendo pero no limitado a, máquinas de PCR en tiempo real . Para la aplicación para la detección, identificación o cuantificación de diferentes objetivos, puede ser aplicable un solo kit de la invención, o alternativamente pueden requerirse diferentes equipos, por ejemplo que contienen reactivos específicos para cada objetivo. Los métodos y los equipos de la presente invención encuentran aplicación en cualquier circunstancia en la cual es deseable detectar, identificar o cuantificar cualquier entidad. La presente invención se describirá ahora adicionalmente en mayor detalle por referencia a los siguientes ejemplos específicos, los cuales no deberían interpretarse como que limitan de alguna manera el alcance de la invención.

EJEMPLOS En los siguientes ejemplos, varios diseños de MNAzima, basados en dividir el núcleo catalítico de ya sea la ADNzima 10:23 o la ADNzima 8:17, se adaptaron para una variedad de sustratos y ácidos nucleicos objetivo (Tabla 3) . Estos sistemas de sustrato objetivo han sido probados bajo una variedad de condiciones de reacción y han resultado ser robustos. Los diseños de MNAzima de ejemplo y las partzimas específicas usadas en los siguientes ejemplos se listan en la Tabla 3. Las partzimas se nombran tal que el nombre (por ejemplo R04A1/1) incorpora la referencia para el dominio objetivo (por ejemplo R04 para exón 4 de RPLPO) , el dominio requerido para la actividad catalítica de la MNAzima (por ejemplo Al) y el dominio del sustrato (por ejemplo 1 para SubBi-1) .

Tabla 3: MNAzimas y sustratos ejemplares . Partzimas específicas usadas en ejemplos operativos Tabla 3 (continuación) : MNAzimas y sustratos ejemplares . Partzimas específicas usadas en ejemplos operativos Diseños de Partzimas Partzimas Específicas Ejemplos MNAzima A y B Objetivos (Figuras) (núcleo Sustratos catalítico) R05A4/3-P:R05B5/3-P 13 exón 5 de RPLPO (R05) SubBi-3-Q6B2 (3) R05A4/3-P:R05B5/3-P 9 exón 5 de RPLPO (R05) :i9) SubBi-3-JB(3) R05A4/4-P:R05B5/4-P 14 exón 5 de RPLPO (R05) SubBi-4-JB(4) R05A4/2-P:R05B5 (16) /2-P 20 exón 5 de RPLPO (R05) SubBi-2-FB(2) R05A4/2-P:R05B5/2-P 24 exón 5 de RPLPO (R05) SubBi-2 (2) miR20A4/2 :miR20B5/2 9 miR-20 (19) SubBi-2-FB(2) PCR7aA4/2-P:PCR7aB5/2-P 10 Let-7a SubBi-2-FB(2) BaA4/2-P:BaB5/2-P 13 B-actina SubBi-2-JB(2) BaA4/7-P:BaB5/7-P 14 B-actina SubBi-7-FB(7) BCRA4/ 6-P:BCRB5/ß-P 13 y 14 BCR SubBi-6-TRB2 (6) HPRTA4/7-P:HPRTB5/7-P 13 HPRT SubBi-7-FB(7) HPRTA4/2-P:HPRTB5/2-P 14 HPRT SubBi-2-A350B(2) R04A4/3-P:R04B5/3-P 14 exón 4 de RPLPO (R04) SubBi-3-Q6B2 (3) R04A4/3-5b:R04B5/3-3b 24 exón 4 de RPLPO (R04) SubBi-3-FB(3) Tabla 3 (continuación) : MNAzimas y sustratos ejemplares . Partzimas específicas usadas en ejemplos operativos Diseños de Partzimas Partzimas Específicas Ejemplos MNAzima A y B Objetivos (Figuras) (núcleo Sustratos catalítico ) NefA4/6-P:NefB5/6P 16 HIV-lNef SubBi-6-TRB2 (6) XdA4/2-P:XdB5/2-P 22 Xd ¡23: SubBi-2-FB(2) 7 A5:B6 pl6A5/3-P:pl6B6/3-P 11 '10:23) pl6 SubBi-3-FB(3) 16SlA5/2-P:16SlB6/2-P 15 16 S Ribosómico Bacteriano SubBi-2-FB (2) R05A5/2 (22)- 19 P:R05B6/2(11G)-P [22) exón 5 de RPLPO (R05) SubBi-2-FB(2) R05A5/2 (22)- 19 P:R05B6/2 (?IC)-P (22) exón 5 de RPLPO R05) SubBi-2-FB(2) R05A5/2 (22)- 20 P:R05B6(16) /2-P exón 5 de RPLPO ;RO5) SubBi-2-FB(2) R04A5 /2:R04B6/2 17 exón 4 de RPLPO IR04: SubBi-2-FB(2) R04A5/2-G14A: R04B6/2 17 exón 4 de RPLPO (R04) SubBi-2-FB(2) R04A5/2-A12T: R04B6/2 17 exón 4 de RPLPO (R04) SubBi-2-FB(2) R04A5/2-A11T: R04B6/2 17 exón 4 de RPLPO (R04) SubBi-2-FB(2) R04A5/2-A9T: R04B6/2 17 exón 4 de RPLPO (R04) SubBi-2-FB(2) Tabla 3 (continuación) : MNAzimas y sustratos ejemplares . Partzimas específicas usadas en ejemplos operativos Tabla 3 (continuación) : MNAzimas y sustratos ejemplares . Partzimas específicas usadas en ejemplos operativos Ejemplo 1 : Aplicación de MNAzimas a la detección directa de un ácido nucleico objetivo (secuencia de KPLPO humano) . 1. 1. Oligonucleótidos de la partzima Se probaron cuatro diseños para las MNAzimas (Figuras 8-10) con base en la ADNzima 8:17. Aquellos expertos en el arte apreciarán que las secuencias del brazo detector (enlace del objetivo) designadas por "N" pueden remplazarse por secuencias específicas al objetivo por cualquier objetivo de ácido nucleico conocido (Figuras 8-10) . Las secuencias del brazo del sustrato, que enlazan al sustrato reportero, pueden ser genéricas y pueden usarse para muchos objetivos. Aquellos expertos en el arte apreciarán que las secuencias del sustrato designadas por "N" en las Figuras 8-10 pueden remplazarse por secuencias quiméricas de ADN, ARN o ADN/ARN y que aquellas designadas por "r" pueden remplazarse por otra y/o un número diferente de secuencias de ribonucleótidos. En los experimentos conducidos para medir la actividad catalítica de las MNAzimas de RPLPO descritos en las Figuras 8-10, las partzimas de oligonucleótido A y B se diseñaron para el exón 4 objetivo del gen RPLPO. Las secuencias de las partzimas A y B se listan debajo de 5' a 3' donde las bases subrayadas forman al menos parte del núcleo catalítico activo de la MNAzima ensamblada, las bases en negritas hibridan con el objetivo, y las bases en letras itálicas hibridan para el sustrato. SEC ID NO:l: Partzima Al R04A1/1: GCTGGTCATCCAGCACGGTCGAA?TAGTG?GT SEC ID NO: 2: Partzima A2 R04A2/1: GCTGGTCATCCAGCAGCGGTCGAA?TAGGGAGT SEC ID NO:3: Partzima Bl R04B1/1: CATCGCGTCTCOGTCGAAGTGTTCGACAATGGC SEC I D NO : 4 : Part zima B2 R04B2 /1 : CATCTCTT'CTCCGGTGTTCGACAATGGC SEC ID NO : 5 : Partzima B3 R04B3 / 1 : CATCTCTTCTCCGAGCGTGTTCGACAATGGC 1.2. Sustrato Reportero La actividad de la MNAzima se monitorea por la escisión de un sustrato reportero del ácido nucleico doblemente etiquetado. La secuencia del sustrato es una secuencia quimérica que contiene ambas bases; ARN y ADN que se ha usado previamente como un sustrato de la ADNzima 8:17 (Li et al . , 2000). En el ejemplo actual, el sustrato reportero se designa SubBi-1-FB y tiene etiquetas internas, a saber 6-carboxifluoresceina ("6-FAM") unida a un nucleótido 5' a la base ARN, y un radical Hibridizador 1 por apagado de agujero negro ("BHQl ") unido a un nucleótido 3' a la base ARN. La escisión del SubBi-1-FB por las MNAzimas se monitoreó a 530nm (longitud de onda de la emisión de FAM) con excitación a 485nm (longitud de onda de la excitación de FAM) . La secuencia etiquetada de SubBi-1-FB es como sigue, 5' a 3', con las bases subrayadas indicando la posición de los radicales 6-FAM y BHQl. Las bases en letras minúsculas representan el ARN y las bases en letras mayúsculas representan el ADN. SEC ID NO: 6: SubBi-1-FB: ACTCACTATaGGAAGAGATG 1. 3. Secuencia de la MNAzima de control El control de hibridación (MNAzima inactiva) se desactivó mutando una sola base en el oligonucleótido Al que es esencial para la formación del núcleo catalítico.

Aunque ambos; el sustrato reportero y las secuencias objetivo aún pueden enlazar a las MNAzimas, el sustrato no puede escindirse debido a la modificación en núcleo catalítico de la MNAzima. El enlace del sustrato reportero a las moléculas de la partzima podría en sí generar una medida de la fluorescencia debido al cambio de conformación del sustrato reportero sobre la hibridación. Un control que usa una molécula de partzima Al mutada (R04Almut) se incluyó y se designó el Control de Hibridación. La secuencia de la MNAzima mutada se ilustra debajo y la posición de la base G que se cambió a T está subrayada. SEC ID NO: 7: Partzima A Mutante RO4Almut/l :GCTGGTCATCCAGCACGGTCTAAATAGTGAGT 1. 4. Objetivo La secuencia objetivo para este ejemplo fue un oligonucleótido, Objetivo R04/1, el cual tiene la misma secuencia como una sección de exón 4 del gen RPLPO humano.

La secuencia del Objetivo R04/1 es como sigue: escrito 5' a 3' . SEC ID NO: 8 Objetivo R04/1: GCCAT G CGAACACC GCTGGATGACCAGC Para asegurar que no pueda detectarse una señal cuando está presente una secuencia objetivo incorrecta, el efecto "fuera de objetivo" se determinó usando 3 µg de ADN lambda (PROMEGA) o un oligonucleótido de control negativo sintético de la secuencia no relacionada (Objetivo R04/lmut) . SEC ID NO: 9 Objetivo R04/lmut: CGACCATTAGGTCGTCCACAAGCTGTTACCG 1.5. Componentes de la reacción La detección de la secuencia objetivo se midió por un incremento en la señal fluorescente causada por la escisión del sustrato reportero por la MNAzima catalíticamente activa. Las reacciones se iniciaron por la adición del sustrato y el volumen total de todas las reacciones fue 25 µL. Todas las reacciones fueron dirigidas a 40°C en un formador de ciclos térmicos (Cepheid) SmartCycler® System. La fluorescencia para cada reacción se leyó cada 7 segundos durante un total de 10 minutos. Todas las reacciones en la Tabla 4 contuvieron la mezcla en volumen de 1 µM de SubBi-1-FB en HCl Tris (pH 9.0 a 25°C) y 25 mM de MgCl2.

Tabla 4 : Componentes de reacción para la detección de un ácido nucleico Cada pozo de reacción en el formador de ciclos térmicos (Cepheid) SmartCycler® System utilizado durante un experimento se probó primero para su nivel del fondo de la fluorescencia, como esto es conocido para variar entre pozos. Esto se midió leyendo la fluorescencia de la mezcla en volumen aisladamente. Este valor posteriormente se sustrajo de todas las otras reacciones realizadas en ese pozo para permitir las comparaciones entre pozos. 1. 6. Resultados : detección de la escisión del sustrato reportero S?bBi-1-FB Las MNAzimas de diseño 1 y 2 mostraron poca evidencia de escisión dependiente del objetivo del sustrato reportero bajo las condiciones de este experimento (Figura 8) . La fluorescencia fue similar para las reacciones con, y sin, el objetivo oligonucleótido RPLPO objetivo. La adición del oligonucleótido RPLPO objetivo resultó en un incremento de la fluorescencia para el diseño 3 (Figura 9 y 10) y para el diseño 4 (Figura 10) . Esto es consistente con la formación de MNAzimas activas en la presencia del ácido nucleico objetivo resultando en la escisión del sustrato reportero entre el fluoróforo y par teñido con hibridizador causando un incremento en la fluorescencia. La fluorescencia de los controles no objetivo fue menor que aquella en las reacciones que contienen el objetivo y ninguna de las reacciones de control mostró un incremento en la fluorescencia con el paso del tiempo (Figuras 8-10) . Esto demuestra que el incremento en la fluorescencia producida en las reacciones que contienen el objetivo se debe al ensamble dependiente del objetivo de una MNAzima catalíticamente activa que posteriormente escindió el sustrato reportero. La eficiencia de la escisión del diseño 4 fue mayor que del diseño 3 para el sistema RPLPO (Figura 10) . Las reacciones de control de objetivo desplazado, de hibridación, solo de Partzima A y sólo de Partzima B se muestran para el diseño 3 (Figura 9) . Los niveles de fluorescencia de estos controles fueron ya sea menores que o similares a aquellos de las reacciones no objetivo. Ninguna de las reacciones de control mostró un incremento en la fluorescencia con el paso del tiempo. Estos resultados demuestran adicionalmente que la escisión del sustrato reportero es dependiente de la presencia de ambos; los oligonucleótidos de la partzima A y los oligonucleótidos de la partzima B que se requieren para el ensamble de una MNAzima activa, así como también la secuencia de ácidos nucleicos objetivo.

Ejemplo 2 : MNAzimas para la detección de miR-20 u homólogos de secuencias cortas de ADN para miR-20. 2. 1. Oligonucleótidos de la partzima También puede usarse la detección usando MNAzimas para el análisis de miRs. En este ejemplo, la MNAzima solo se forma cuando está presente la secuencia miR correcta. Esta MNAzima puede distinguir entre las secuencias miR relacionadas por ejemplo hsa-miR-20 y hsa-miR-93. En los experimentos conducidos para medir la actividad catalítica de la MNAzima descritos en la Figura 11, los oligonucleótidos de la partzima A y B se diseñaron para el objetivo hsa-miR-20. Las secuencias de los oligonucleótidos de las partzimas A y B se listan debajo de 5' a 3A En las siguientes secuencias, las bases subrayadas forman parte del núcleo catalítico de la MNAzima ensamblada, las bases en negritas hibridan con el objetivo, y las bases en letras itálicas hibridan para el sustrato. SEC ID NO: 10: Partzima A2 : miR20A2/1 : T&CCTGCAC &CGGTCGA?A'rAGTGAGT SEC ID NO: 11: Partzima B3: miR20B3 /1 : CATCTCTTCTCCGAGCTAAGCACTTTA 2.2. Sus tr to Reportero La actividad de la MNAzima se monitorea por la escisión de un sustrato reportero del ácido nucleico doblemente etiquetado. El sustrato reportero para este ejemplo es SubBi-1-FB con la secuencia, 5' a 3', como se muestra debajo. Las bases en letras minúsculas representan el ARN y las bases en letras mayúsculas representan el ADN. Las bases subrayadas indican la posición de un radical 6-FAM en el extremo 5' y un radical BHQl en el extremo 3' .

Los cambios en la fluorescencia debidos a la escisión de SubBi-1-FB en el ribonucleótido entre la FAM y BHQl se monitorearon a 530nm (longitud de onda de la emisión de FAM) con excitación a 485nm (longitud de onda de la excitación de FAM) . SEC ID NO: 6: SubBi-1-FB: ACTCAC ATaGGAAGAGATG 2. 3. Objetivo La secuencia objetivo para este ejemplo fue un oligonucleótido de ADN, D-20, que tiene secuencia que es homologa a las especies hsa-miR-20 ARN (Figura 11 (i)). La secuencia del Objetivo D-20 es como sigue, escrito 5' a 3' . SEC ID NO: 12: Objetivo D-20: TAAAGTGCTTATAGTGCAGGTA 2. 4. Secuencias de control Cualquier ensayo desarrollado para detectar microARNs específicamente debe distinguir la secuencia miR deseada por ejemplo hsa-miR-20 de las secuencias relacionadas tales como hsa-miR-17-5p, la cual puede diferir del miR objetivo por uno o más términos (Figura 11 (i) ) . Los oligonucleótidos de miR 17-5p, 93, 106a y 106b "fuera de objetivo" relacionados a hsa-miR-20 también se sintetizaron como ADN y son escritos 5' a 3' debajo.

SEC ID NO: 13: Objetivo D-17-5p: CAAAGTGCTTACAGTGCAGGTAGT SEC ID NO: 14: Objetivo D-93: AAAGTGCTGTTCGTGCAGGTAG SEC ID NO: 15: Objetivo D-106a: AAAAGTGCTTACAGTGCAGGTAGC SEC ID NO: 16: Objetivo D-106b: TAAAGTGCTGACAGTGCAGAT 2. 5. Condiciones de reacción La detección de la secuencia objetivo se midió por un incremento en la señal fluorescente causado por la escisión del sustrato reportero por la MNAzima catalíticamente activa. Las reacciones se iniciaron por la adición del sustrato y el volumen total de todas las reacciones fue 25 µL. Todas las reacciones se dirigieron a 40 °C en un formador de ciclos térmicos (Cepheid) SmartCycler® System. La fluorescencia para cada reacción se leyó cada 7 segundos durante un total de 4 minutos. Todas las reacciones en la Tabla 5 contuvieron la mezcla en volumen que consiste de 1 µM de SubBi-1-FB, HCl Tris (pH 9.0 a 25°C) y 25 mM de MgCl2.

Tabla 5 : Componentes de las reacciones para la detección de un objetivo de ácido nucleico como se muestra en la Figura 11 Cada pozo de reacción en el formador de ciclos térmicos (Cepheid) SmartCycler® System utilizado durante el experimento se probó primero para su nivel del fondo de la fluorescencia, como esto es conocido para variar entre pozos. Esto se midió leyendo la fluorescencia de la mezcla en volumen aisladamente. Este valor posteriormente se sustrajo de todas las otras reacciones realizadas en cada pozo para permitir las comparaciones entre pozos. Las reacciones que contienen el objetivo, "no objetivo" y "fuera de objetivo" también se realizaron en la presencia de concentraciones de 5 mM y 100 mM de MgCl2 y se compararon a 25 mM de MgCl2 (Figura 12) . 2. 6. Resultados : Detección de la escisión del sustrato reportero SúbBi-1-FB Los oligonucleótidos de la partzima A y B de la MNAzima se ensamblan en una MNAzima catalíticamente activa para escindir el sustrato reportero solo en la presencia de la secuencia objetivo. En este ejemplo los controles fuera de objetivo tienen tan poco como dos bases desapareadas con los brazos detectores (la secuencia que enlaza el objetivo miR-20) . El D-17-5p "fuera de objetivo" tiene dos bases desapareadas, solo una de las cuales ocurre en la región más discriminatoria localizada en la mitad de la secuencia miR-20. La reacción de escisión que contiene la secuencia D-20 objetivo dio un incremento de 26 veces en la señal comparado al control no objetivo (Figura 11 (iii)). Esto se compara con los controles D-17-5p y D-106a fuera de objetivo, los cuales dan un incremento de 3.5 veces en la señal comparado al control no objetivo, y D-93 y D-106b que no dan incremento en la señal comparado al control no objetivo (Figura 11 (iii) ) . Así, la diferenciación de D-20 de las secuencias relacionadas demuestra la capacidad del sistema de MNAzima para discriminar secuencias que difieren por solo unos cuantas bases. Estudios previos que usan ADNzimas unimoleculares han demostrado que las ADNzimas tienen la capacidad para distinguir mutaciones de bases sencillas (Impey et al . , 2000). Las MNAzimas también permiten la discriminación de cambios de bases sencillas (vea el ejemplo 5 debajo) . Los controles "solo de Partzima A" y "sólo de Partzima B" tienen una fluorescencia similar a aquella de la fluorescencia antecedente (datos no mostrados). El uso de enzimas de proteínas requiere otros reactivos en la reacción para estar en concentraciones que son óptimas para la actividad de la enzima de proteína. Por ejemplo, la concentración del cofactor del ion metálico que ayuda a una ADNzima en la escisión del sustrato reportero se mantiene en un mínimo en protocolos que usan las enzimas como polimerasas. La detección directa usando MNAzimas no requiere enzima de proteína alguna y por consiguiente las condiciones de reacción pueden optimizarse para la rápida escisión del sustrato. En estas reacciones el cofactor del ion metálico por ejemplo Mg2+ puede incrementarse para optimizar la velocidad catalítica de la MNAzima. La figura 12 muestra cómo puede incrementarse la concentración de MgCl2 a niveles que normalmente no pueden ser tolerados en los protocolos de detección del objetivo. En MgCl2 alto (100 mM) la eficiencia catalítica de la MNAzima es superior. Además, al detectar el Objetivo D-20, un incremento en el MgCl2 no afectó la especificidad de la reacción, debido a que el Objetivo D-20 es todavía claramente distinguible de las secuencias D-17-5p relacionadas, Objetivo D-106a Objetivo, Objetivo D-93 y Objetivo D-106b.

Ejemplo 3 : MNAzimas (diseños 5 y 6) para la detección directa de un objetivo del ácido nucleico 3. 1. Oligonucleótidos de la partzima Los diseños 5 y 6 para las MNAzimas, basados en la ADNzima 10:23, se probaron para la actividad catalítica (Figura 13) . Aquellos expertos en el arte apreciarán que las secuencias del brazo detector (enlace del objetivo) designadas por "N" pueden remplazarse por secuencias específicas al objetivo por cualquier objetivo de ácido nucleico conocido. Las secuencias del brazo del sustrato, las cuales enlazan al sustrato reportero, pueden ser genéricas y pueden usarse para muchos objetivos. Aquellos expertos en el arte apreciarán que las secuencias del sustrato designadas por "N" en la Figura 13 pueden remplazarse por secuencias quiméricas de ADN, ARN o ADN/ARN. En los experimentos conducidos para medir la actividad catalítica de las MNAzimas de RPLPO descritos en la Figura 13, las partzimas A y B del oligonucleótido se diseñaron para el exón 5 objetivo del gen RPLPO. Las secuencias de las partzimas A y B se listan debajo de 5' a 3' donde las bases subrayadas forman parte del núcleo catalítico de la MNAzima ensamblada, las bases en negritas hibridan con el objetivo, y las bases en letras itálicas hibridan para el sustrato. Las secuencias que no están subrayadas, ni en negritas, ni en letras itálicas en la SEC ID NO: 17 y SEC ID NO: 18 preferentemente forman una estructura de vastago tal como aquella representada en la Figura 13 (vea por ejemplo, Diseño 5) . SEC ID NO: 17 partzima A3 R05A3/2: CAAACGAGTCCTGGCCTTGTCCGCACAACGAGAGGAAACCTT SEC ID NO: 18 partzima B4 R05B4/2: GCCCAGGGAGGCTAGCTGCGGTGGAGACGGATTACACCOTC SEC ID NO: 19 partzima A4 R05A4/2: CAAACGAGTCCTGGCCTTGTCTACAACGAGAGGAAACCry SEC ID NO: 20 partzima B5 R05B5/2: TGCCCAGGGAGGCTAGC GTGGAGACGGATTACACCTTC 3.2. Sustrato reportero El sustrato reportero para este ejemplo es SubBi- 2 con la secuencia, 5' a 3', como se muestra debajo. En el ejemplo actual, SubBi-2 se etiquetó en el extremo con un radical 6-FAM en el extremo 5' y un radical BHQl en el extremo 3' y se designó SubBi-2-FB. La escisión de SubBi-2-FB se monitoreó a 530nm (longitud de onda de la emisión de FAM) con excitación a 485nm (longitud de onda de la excitación de FAM) . Las bases en letras minúsculas representan el ARN y las bases en letras mayúsculas representan el ADN. SEC ID NO: 21 SubBi-2-FB: AAGGTTTCCTCguCCCTGGGCA 3.3. Secuencias objetivo La secuencia objetivo para este ejemplo fue un Objetivo R05/1 de oligonucleótido sintético con la secuencia, 5' a 3', como se muestra debajo. Esta secuencia objetivo tiene la misma secuencia como una sección del gen RPLPO, exón 5. SEC ID NO: 22 Objetivo R05/1: GAAGGTGTAATCCGTCTCCACAGACAAGGCCAGGACTCGTTTG 3. 4. Componentes de la reacción La detección de la secuencia objetivo se midió por un incremento en la señal fluorescente causado por la escisión del sustrato reportero por la MNAzima catalíticamente activa. Las reacciones se iniciaron por la adición del sustrato y el volumen total de todas las reacciones fue 25 µL. Todas las reacciones se dirigieron a 55°C en un formador de ciclos térmicos (Cepheid)_ SmartCycler® System. La fluorescencia para cada reacción se leyó cada 7 segundos durante un total de 5 minutos. Todas las reacciones en la Tabla 6 contuvieron 1 µM de SubBi-2-FB, HCl Tris (pH 9.0 a 25°C) y 25 mM de MgCl2.

Tabla 6 : Componentes de las reacciones para la detección de un objetivo de ácido nucleico como se muestra en la Figura 13 Cada pozo de reacción en el formador de ciclos térmicos (Cepheid) SmartCycler® System usado durante el experimento se probó primero para su nivel del fondo de la fluorescencia, como esto es conocido para variar entre pozos. Esto se midió leyendo la fluorescencia de la mezcla en volumen aisladamente. Este valor posteriormente se sustrajo de todas las otras reacciones realizadas en ese pozo para permitir las comparaciones entre pozos. 3.5. Resultados : Detección y escisión del sustrato Las reacciones que contienen el objetivo, con las MNAzimas de diseños 5 y 6, mostraron un incremento en la fluorescencia con el paso del tiempo, comparado al control no objetivo (Figura 13ii) , paneles superior e inferior, respectivamente. Esto demuestra que los oligonucleótidos de la partzima se ensamblan en una MNAzima catalíticamente activa y escinden el sustrato reportero solo en la presencia de la secuencia objetivo. Los controles no objetivo no mostraron un incremento en la fluorescencia indicando que no estaba ocurriendo escisión alguna. La velocidad de escisión para el diseño 6 fue considerablemente más rápida que para el diseño 5.

Ejemplo 4 : Detección de amplicones a partir de la amplificación PCR in vitro de una secuencia de ácidos nucleicos usando MNAzimas 4. 1 . Oligonucleótidos de la partzima Las MNAzimas también pueden usarse para detectar amplicones de la secuencia de ácidos nucleicos amplificada in vi tro . Para este ejemplo, la detección de amplicones se realiza como un proceso de dos etapas pero también puede realizarse en una sola reacción. En este caso, los oligonucleótidos usados para detectar los amplicones se basaron en el diseño 4 usando los oligonucleótidos R04A2/1 y R04B3/1 (Figura 10), que detecta el gen RPLPO humano. Los oligonucleótidos de la partzima A y B se listan debajo. En las siguientes secuencias, las bases subrayadas forman parte del núcleo catalítico de la MNAzima ensamblada, las bases en negritas hibridan con el objetivo, y las bases en letras itálicas hibridan para el sustrato. SEC ID NO: 2 Partzima A2 R04A2/1: GC GGTCATCCAGCAGCGGTCGAAATAGTGAGT SEC ID NO: 5 Partzima B3 R04B3/1: CATCTCTTCTCCGAGCGTGTTCGACAATGGC 4.2. Sus tra to reportero El sustrato reportero para este ejemplo es SubBi-1-FB con la secuencia, 5' a 3', como se muestra debajo. Las bases en letras minúsculas representan el ARN y las bases en letras mayúsculas representan el ADN. Las bases subrayadas indican la posición de un radical 6-FAM en el extremo 5' y un radical BHQl en el extremo 3' . La escisión de SubBi-1-FB se monitoreó a 530nm (longitud de onda de la emisión de FAM) con excitación a 485nm (longitud de onda de la excitación de FAM) . SEC ID NO: 6 SubBi-1-FB: ACTCACTATaGGAAGAGATG 4. 3. Cebadores para la amplificación del gen RPLPO humano or PCR La secuencia objetivo para este ejemplo se generó por amplificación PCR in vi tro de la secuencia del exón 4 del gen RPLPO del ADN genómico humano extraído de la línea celular K562 (PROMEGA), usando los cebadores PCR listados debajo. SEC ID NO: 23 5R04/3 Cebador: CAAGACTGGAGACAAAGTG SEC ID NO : 24 3R04 /2 Cebador : GCAGAG TTCCTCTGTGATA 4. 4. Oligonucleótido Objetivo de Control Se sintetizó y usó un oligonucleótido como un control positivo para la secuencia RPLPO. El oligonucleótido de control no se amplificó por PCR en estos experimentos . SEC ID NO: 8 Objetivo R04/1: GCCATTGTCGAACACCTGCTGGATGACCAGC 4. 5. Componentes de la reacción : Amplificación PCR del gen RPLPO La amplificación PCR del gen RPLPO se realizó en el volumen total de reacción de 25 µL. Todas las reacciones de amplificación se dirigieron en un formador de ciclos térmicos GeneAmp® PCR System 9700 (Biosistemas aplicados) . Los parámetros de ciclización fueron 95°C durante 7 minutos, 10 ciclos de 95°C durante 5 segundos y 65°C durante 30 segundos (con una disminución de 1°C en la temperatura por ciclo), y finalmente 50 ciclos de 95°C durante 5 segundos y 55°C durante 30 segundos. Todas las reacciones contuvieron 40 nM de 5R04/3 y 200 nM de 3R04/2, 3 mM de MgCl2, 200 µM de cada dNTP, Inmunoamortiguador (Bioline) IX y 1 unidad de Immolasa (Bioline) con o sin 500 ng de ADN genómico humano K562 (PROMEGA) . 4. 6. Componentes de la reacción: Detección de la secuencia objetivo La detección de la secuencia objetivo se midió por un incremento en la señal fluorescente causado por la escisión del sustrato reportero por la MNAzima catalíticamente activa. Las reacciones se iniciaron por la adición del sustrato y el volumen total de todas las reacciones fue 25 µL. Todas las reacciones se dirigieron a 40 °C en un formador de ciclos térmicos (Cepheid) SmartCycler® System. La fluorescencia para cada reacción se leyó cada 7 segundos durante un total de 10 minutos. Todas las reacciones en la Tabla 7 contuvieron la mezcla en volumen de 1 µM de SubBi-1-FB, HCl Tris (pH 9.0 a 25°C) y 25 mM de MgCl2. Las concentraciones de las Partzimas A y B del oligonucleótido son 1 µM.

Tabla 7: Componentes de la reacción para la detección de amplicones de ADN RPLPO siguiendo PCR in vitro . Los sistemas de MNAzima usaron el Diseño 4 (R04A2/1 :R04B3/1) Reacción de la MNAzima Objetivo RPLPO Objetivo-oligo (RPLPO de 1012 copias de Control Positivo) R04/10bjetivo Oligo RPLPO producto Objetivo-PCR 5 µL de producto de PCR de (Prueba) RPLPO (equivalente a lOOng de ADN genómico) No Objetivo (RPLPO de 5 µL H20 Control Negativo) AND genómico no amplificado 5 µL que contienen 500 ng (Control Negativo) de ADN genómico Cada pozo de reacción en el formador de ciclos térmicos (Cepheid) SmartCycler® System utilizado durante el experimento se probó primero para su nivel del fondo de la fluorescencia, como esto es conocido para variar entre pozos. Esto se midió leyendo la fluorescencia de la mezcla en volumen aisladamente. Este valor posteriormente se sustrajo de todas las otras reacciones realizas en ese pozo para permitir las comparaciones entre pozos. 4. 7. Resultados : Detección de la escisión del sustrato reportero SubBi-1-FB El diseño 4 de la MNAzima para la detección de RPLPO, exón 4, mostró un incremento en la fluorescencia con el paso del tiempo cuando la secuencia RPLPO objetivo se amplificó del ADN genómico humano por PCR (Figura 14). El incremento en la fluorescencia visto para los amplicones RPLPO fue similar a aquel visto para 1012 copias de los oligonucleótidos del Objetivo R04/1 de control positivo. La fluorescencia de los controles no objetivo fue menor que aquella en las reacciones que contienen el objetivo y ninguna de las reacciones de control negativo mostró un incremento en la fluorescencia con el paso del tiempo. Esto demuestra que el incremento en la fluorescencia producido en las reacciones que contienen el objetivo se debe al ensamble dependiente del objetivo de una MNAzima catalíticamente activa, que posteriormente escindió el sustrato reportero.

Ejemplo 5: Uso de las MNAzimas para la detección de amplicones producidos por amplificación PCR in vitro de secuencias cortas de ácidos nucleicos . . 1. Oligonucleótidos de la partzima Las MNAzimas pueden usarse para detectar amplicones de la secuencia de ácidos nucleicos amplificada in vi tro . En este ejemplo la amplificación y la detección se realizan en un proceso de tres etapas (Figura 5) pero la transcripción inversa, la amplificación PCR y la detección también podrían realizarse concurrentemente en un solo tubo de reacción. Para este ejemplo los oligonucleótidos usados para detectar los amplicones usaron los oligonucleótidos de la partzima A y B miR, diseño 4 (Figura 11), los cuales se diseñan para detectar hsa-miR-20. Los oligonucleótidos de la partzima de MNAzima se listan debajo tal que las bases subrayadas forman parte del núcleo catalítico de la MNAzima ensamblada, las bases en negritas hibridan con el objetivo, y las bases en letras itálicas hibridan para el sustrato. SEC ID NO: 10 Partzima A2 miR20A2/l: TACCTGCACTACGGTCG AATAGTGAGT SEC ID NO : 11 Part zima B3 miR20B3 / l : CATCTCTTeTCCGAGCtAAGCACTTTA .2. Sustrato Reportero El sustrato reportero para este ejemplo es SubBi-1-FB con la secuencia, 5' a 3', como se muestra debajo. Las bases en letras minúsculas representan el ARN y las bases en letras mayúsculas representan el ADN. Las bases subrayadas indican la posición de un radical 6-FAM en el extremo 5' y un radical BHQl en el extremo 3' . La escisión de SubBi-1-FB se monitoreó a 530nm (longitud de onda de la emisión de FAM) con excitación a 485nm (longitud de onda de la excitación de FAM) . SEC ID NO: 6 SubBi-1-FB: ACTCACTATaGGAAGAGATG .3. Cebadores de PCR para amplificación de secuencias objetivo de 22 mer D-20 oligonucléotidos La secuencia objetivo para este ejemplo se generó por amplificación in vi tro del oligonucleótido D-20 usando los cebadores PCR de oligonucleótidos listados debajo SEC ID NO: 25 5miR20/l Cebador: ACGTGACGCTAAAGTGCT SEC ID NO: 26 3miR20/Ll Cebador: CGTCCGAATGACGTACCTGCAC SEC ID NO: 27 3miR20/Pl Cebador: CGAATGACGTACCTGCAC . 4. Controles y secuencias objetivo La secuencia de ADN (Objetivo D-20) con homología para miR-20 se usó como molde macromolecular para demostrar la amplificación y detección de una secuencia corta usando PCR y MNAzimas. SEC ID NO: 12 Objetivo D-20: TAAAGTGCTTATAGTGCAGGTA Además, para asegurar que cualquier secuencia "fuera de objetivo" estrechamente relacionada, erróneamente amplificada, no pueda detectarse con el sistema miR-20, el Objetivo D-17-5p del oligonucleótido de ADN objetivo de control también se probó con el sistema de oligonucleótido de la partzima A y B miR-20. SEC ID NO: 13 Objetivo D-17-5p: CAAAGTGCTTACAGTGCAGGTAGT . 5 Componentes de la Reacción: Amplificación de la secuencia objetivo La amplificación de la secuencia objetivo se realizó en un volumen de reacción total de 25 µL. Todas las reacciones de amplificación se dirigieron en un formador de ciclos térmicos GeneAmp® PCR System 9700 (Biosistemas Aplicados). Los parámetros de ciclización para las etapas 1 y 2 (transcripción inversa y PCR) fueron 42°C durante 30 minutos, 95°C durante 7 minutos, 10 ciclos de 95°C durante 5 segundos y 30°C durante 30 segundos (más 2°C por ciclo), y finalmente 50 ciclos de 95°C durante 5 segundos y 50°C durante 30 segundos. Las reacciones inicialmente solo contuvieron 10 nM de 3miR20/Ll, después de 42°C durante 30 minutos se pausó la reacción y se agregaron 30 nM de 3miR20/Pl y 200 nM de 5miR20/l. Todos los otros reactivos listados estuvieron en la mezcla de reacción inicial, 3 mM de MgCl2, 200 µM de cada dNTP, Inmunoamortiguador (Bioline) IX y 1 unidad de Immolasa (Bioline) y ya sea a) 108 copias del Objetivo D-20, b) ningún objetivo (dH20) o c) 108 copias de ADN fuera de objetivo (Objetivo D-17-5p) . . 6. Componentes de la reacción: Detección de la secuencia objetivo La detección de la secuencia objetivo se midió por un incremento en la señal fluorescente causado por la escisión del sustrato reportero por la MNAzima catalíticamente activa. Las reacciones se iniciaron por la adición del sustrato y el volumen total de todas las reacciones fue 25 µL. Todas las reacciones se dirigieron a 40 °C en un formador de ciclos térmicos (Cepheid) SmartCycler® System. La fluorescencia para cada reacción se leyó cada 7 segundos durante un total de 10 minutos. Todas las reacciones en la Tabla 8 contuvieron la mezcla en volumen de 1 µM de SubBi-1-FB HCl Tris (pH 9.0 a 25°C) y 25 mM de MgCl2. Las concentraciones de la partzima A y B fueron 1 µM.

Tabla 8: Componentes de la reacción para la detección de secuencias cortas de ácidos nucleicos (20-25 mer) amplificadas in vitro. El sistema de MNAzima usó el Diseño 4 (miR20A2/l :MiR20B3/l) . Reacción de MNAzima Objetivo miR-20 Objetivo- 10 rrir copias de Objetivo D-20 oligonucleótido (miR 20 en 5 µL (No amplificado) de Control Positivo) miR-20 Objetivo-producto Producto PCR D-20 (5 µL de de PCR (Prueba) 25 µL de reacción) (equivalente a 2 x 107 copias de Objetivo D-20 amplificado por PCR) miR-20 Objetivo- 10 copias Objetivo D-20 en oligonucleótido (Control 5 µL (No amplificado) D-20 no amplificado) No objetivo (miR20 de 5 µL H20 Control Negativo) Fuera de Objetivo Producto PCR D-17-5p (Control fuera de (5 µL de 25 µL de objetivo para miR20) reacción) (equivalente a 2 x 107 copias de Objetivo D-17- 5p amplificado por PCR) Cada pazo de reacción en el formador de ciclos térmicos (Cepheid) SmartCycler® System utilizado durante el experimento se probó primero para su nivel del fondo de la fluorescencia. Este valor posteriormente se sustrajo de todas las otras reacciones realizadas en ese pozo para permitir las comparaciones entre pozos. .7. Resultados : Detección de la escisión del sustrato reportero SubBi-1-FB El diseño 4 de la MNAzima para la detección de miR-20, mostró un incremento en la fluorescencia con el paso del tiempo cuando la secuencia objetivo usada fue el Objetivo D-20 amplificada vía PCR (Figura 15 (i)). La fluorescencia del control no objetivo fue menor que aquella en las reacciones que contienen el objetivo, y ninguna de las reacciones de control negativo mostró un incremento en la fluorescencia con el paso del tiempo. Esto demuestra que el incremento en la fluorescencia producido en las reacciones que contienen el objetivo se debe al ensamble dependiente del objetivo de las MNAzimas catalíticamente activas que posteriormente escindieron el sustrato reportero. El control (D-17-5p) fuera de objetivo en este ejemplo también se amplificó con los cebadores miR-20 debido a que solo tiene un desapareamiento en la posición terminal dentro de las regiones que hibridan con los cebadores miR-20. La amplificación de ambos; Objetivo D-20 y Objetivo D-17-5p se confirmó por electrofóresis . Debido a que ambos amplicones incorporan las secuencias del cebador en sus terminales, ellos ahora solo difieren por una sola base en la mitad de los amplicones. La MNAzima exitosamente discriminó entre los amplicones D-20 y D-17-5p. Esta discriminación es un resultado de la única diferencia de los nucleótidos en los amplicones D-20 y D-17-5p en la región que yace entre los cebadores como se ilustra en la Figura 15 (ii) . La MNAzima requiere las cuatro bases entre los cebadores que estarán presentes (permitiendo así la discriminación entre el dímero del cebador y los amplicones genuinos) y esas cuatro bases deben ser exactas sin sustituciones toleradas. Este ejemplo ilustra la capacidad de las MNAzimas para discriminar entre las secuencias estrechamente relacionadas incluyendo aquellas que difieren por solo un solo polimorfismo del nucleótido.

Ejemplo 6: Uso de las MNAzimas para la detección de amplicones de microARN producidos por amplificación PCR in vitro del ARN total 6. 1. Oligonucleótidos de la partzima Las MNAzimas pueden usarse para detectar amplicones de secuencias de ácidos nucleicos amplificadas in vi tro . En este ejemplo la amplificación y la detección se realizan en un proceso de dos etapas (Figura 5) en donde la transcripción inversa y la amplificación PCR ocurren en un primer tubo, seguido por la detección mediada por la MNAzima en un segundo tubo. Para este ejemplo los oligonucleótidos usados para detectar los amplicones fueron los oligonucleótidos de la partzima A y B miR, diseño 4 (Figura 11), los cuales se diseñan para detectar hsa-miR-20. Los oligonucleótidos de la partzima de MNAzima se listan debaj o tal que las bases subrayadas forman parte del núcleo catalítico de la MNAzima ensamblada , las bases en negritas hibridan con el obj etivo , y las bases en letras itálicas hibridan para el sustrato . SEC ID NO : 10 Part zima A2 miR20A2 / l : TACCTGCACTACGGTCGAAATAGTGAGT SEC ID NO : 11 Partzima B3 miR20B3 / l : CATCyCTTCTCCGAGCTAAGCACTTTA 6.2. Sustrato Reportero El sustrato reportero para este ejemplo es SubBi-1-FB con la secuencia, 5' a 3', como se muestra debajo. Las bases en letras minúsculas representan el ARN y las bases en letras mayúsculas representan el ADN. Las bases subrayadas indican la posición de un radical 6-FAM en el extremo 5' y un radical BHQl en el extremo 3' . La escisión de SubBi-1-FB se monitoreó a 530nm (longitud de onda de la emisión de FAM) con excitación a 485nm (longitud de onda de la excitación de FAM) . SEC ID NO: 6 SubBi-1-FB: ACTCACTATaGGAAGAGA G 6. 3. Cebadores PCR para la amplificación de hsa-miR-20 La secuencia obj etivo para este ej emplo se generó por la amplificación in vi tro del ARN total del timo humano (Ambion) usando los cebadores PCR del oligonucleótido listados debajo. SEC ID NO: 25 5miR20/l Cebador: ACGTGACGCTAAAGTGCT SEC ID NO: 26 3miR20/Ll Cebador: CGTCCGAATGACGTACC GCAC 6. 4. Controles y secuencias objetivo El ARN total del timo humano (Ambion) se usó como el molde macromolecular para la amplificación de miR-20 y los amplicones se detectaron subsiguientemente usando las MNAzimas (sección 6.6). La secuencia de ARN (Objetivo R-20) con homología para miR-20 se usó como un control positivo para demostrar la amplificación de secuencias cortas, seguido por la detección de amplicones resultantes usando las MNAzimas. SEC ID NO: 28 Objetivo R-20: ua agugcuuauagugcaggua 6.5. Componentes de la reacción: Amplificación de la secuencia objetivo La transcripción inversa y la amplificación PCR de la secuencia objetivo se realizó en el volumen de reacción total de 25 µL. Todas las reacciones de amplificación se dirigieron en un formador de ciclos térmicos GeneAmp® PCR System 9700 (Biosistemas Aplicados). Los parámetros de ciclización fueron 40°C durante 30 minutos, 95°C durante 7 minutos, 10 ciclos de 95°C durante 5 segundos y 30 °C durante 30 segundos (con un incremento de 2°C en la temperatura por ciclo), y finalmente 50 ciclos de 95°C durante 5 segundos y 50°C durante 30 segundos. Las reacciones contuvieron 40 nM de 3miR20/Ll y 200 nM de 5miR20/l, 3 mM de MgCl2, 200 µM de cada dNTP, 10 unidades de Rnasin (Promega), 30 unidades de Transcriptasa Inversa MMLV(-H) (Promega), Inmunoamortiguador (Bioline) IX y 0.5 unidades de Immolasa (Bioline) y ya sea a) 1 µg de ARN total, b) ningún objetivo (dH20) o c) 1014 copias (5 µM) del Oligonucleótido del Objetivo R-20. 6. 6. Componentes de la reacción : Detección de la secuencia objetivo La detección de la secuencia objetivo se midió por un incremento en la señal fluorescente causado por la escisión del sustrato reportero por la MNAzima catalíticamente activa. Las reacciones se iniciaron por la adición del sustrato y el volumen total de todas las reacciones fue 25 µL. Todas las reacciones se dirigieron a 40°C en un formador de ciclos térmicos (Cepheid) SmartCycler® System. La fluorescencia para cada reacción se leyó cada 30 segundos durante un total de 5 minutos. Todas las reacciones en la Tabla 9 contuvieron la mezcla en volumen de 1 µM de SubBi-1-FB, 1 µM de la partzima A, 1 µM de la partzima B, 50 mM de HCl Tris (pH 9.0 a 25°C), 25 mM de MgCl2 y el objetivo (como se indica en la Tabla 9) .

Tabla 9: Componentes de la reacción para la detección de ARN total amplificado in vitro . El sistema de MNAzima usó el Diseño 4 (miR20A2/l :miR20B3/l) .

El nivel del fondo de la fluorescencia se midió para cada pozo de reacción en el formador de ciclos térmicos (Cepheid) SmartCycler® System. Este valor posteriormente se sustrajo de todas las otras reacciones realizas en ese pozo para permitir la comparación entre pozos . 6. 7. Resultados : Detección de la escisión del sustrato reportero SubBi-1-FB El diseño 4 de la MNAzima para la detección de miR-20, mostró un incremento en la fluorescencia con el paso del tiempo cuando la secuencia objetivo usada fue ARN total amplificada por PCR (Figura 16) . La fluorescencia del control objetivo no ARN fue menor que aquella en las reacciones que contienen el objetivo ARN, y ninguna de las reacciones de control negativo mostró un incremento en la fluorescencia con el paso del tiempo. Esto demuestra que el incremento en la fluorescencia producido en las reacciones que contienen el objetivo se debe al ensamble dependiente del objetivo amplificado por PCR de las MNAzimas catalíticamente activas que posteriormente escindieron el sustrato reportero. Mientras este experimento se realizó en dos etapas (transcripción inversa/PCR posteriormente detección del punto final de la MNAzima) , todas las etapas podrían realizarse concurrentemente en un solo tubo de reacción permitiendo que se monitoree la reacción en tiempo real.

Ejemplo 7: Detección del objetivo por las MNAzimas acopladas a una cascada de señal de ácidos nucleicos . 7. 1. Cascadas de amplificación de señal iniciadas por la MNAzima Es posible aminorar el límite de detección de ácidos nucleicos acoplando la detección de la MNAzima a una reacción de cascada de amplificación de señal, como se ilustra en la Figura 7. Las MNAzimas también permiten un mecanismo de dispara altamente específico para la iniciación de una cascada. 7.2. Cascada de ADNzima espacialmente separada Las ADNzimas pueden atarse a un soporte usando una variedad de métodos incluyendo la unión a obleas plásticas revestidas con estreptavidina que permite la unión de las ADNzimas etiquetadas con biotina. Las secuencias usadas para la unión también pueden servir como sustratos genéricos de MNAzima/ADNzima . Los objetivos (por ejemplo las secuencias de ácidos nucleicos) pueden detectarse después de la hibridación para las secuencias de la partzima permitiendo la formación de MNAzimas activas.

Las MNAzimas posteriormente pueden escindir sustratos genéricos atados liberando así la ADNzima A. La ADNzima A posteriormente puede emigrar a una segunda secuencia genérica sobre una segunda superficie sólida donde se ata la ADNzima B. La ADNzima A puede escindir la segunda secuencia genérica liberando así la ADNzima B. La escisión de este sustrato entre el fluoróforo/par teñido con hibridizador por apagado puede resultar en fluorescencia aumentada. La ADNzima B liberada a su vez puede escindir más del primer sustrato liberando así más de la ADNzima A e iniciando una cascada de señal que resulta en la amplificación de señal (Figura 7). Este ejemplo describe un mecanismo para generar una cascada de señal usando ADNzimas espacialmente separadas, sin embargo, existen otros métodos que también permitirían la amplificación de señal usando ácidos nucleicos catalíticos. El artesano experto apreciará que cualquier método debería ser completamente funcional con esto, con tal que por alguna manera de unión o separación física, un sustrato se mantiene "inaccesibles" para una enzima que actuaría sobre el mismo. Otros ejemplos de amplificación de señal de ácido nucleico que podrían acoplarse a las reacciones iniciadas por la MNAzima incluyen, pero no se limitan a, cascadas de ligación (Paul and Joyce, 2004) y cascadas de ADNzima circular (Levy and Ellington, 2003) , cada una de las cuales implica el principio base de mantener una "separación" de una enzima de su sustrato, después de lo cual cuando la enzima y el sustrato entran en contacto tal que puede resultar la actividad catalítica, resulta directamente o indirectamente una cascada de señal o de señal amplificada.

Ejemplo 8: Uso de las MNAzimas para la cuantificación de un objetivo de ácido nucleico 8. 1. Oligonucleótidos de la partzima Las MNAzimas pueden usarse para monitorear la amplificación de ácidos nucleicos objetivo en tiempo real usando los métodos de amplificación del objetivo in vi tro tales como PCR. Además, el monitoreo en tiempo real permite que se cuantifique la cantidad de objetivo inicialmente presente en la reacción. En este ejemplo la amplificación y la detección se realizan en un proceso de una etapa, en donde la amplificación PCR y la detección mediada por la MNAzima ocurren simultáneamente en un solo tubo. Los oligonucleótidos de la partzima A y B usaron el diseño 6 con brazos detectores complementarios para el exón 5 del gen RPLPO humano (Figura 17 (i) ) . Los oligonucleótidos de la partzima se listan debajo con "-p" indicando la fosforilación 3' del oligonucleótido. SEC ID NO: 29 Partzima A4 R05A4/3-P: C?AACGAGTCCTGGCCTOGTCTAGAACGAGGTGGTGCTG- P SEC ID NO: 30 Partzima B5 R05B5/3-P: CGGGGGGTGAGGCTAGCTGTGGAGACGGATTACACCTTC - p 8.2. Sus tr to Reportero El sustrato reportero para este ejemplo es SubBi- 3 con la secuencia, 5' a 3' , como se muestra debajo. En el ejemplo actual, SubBi-3-FB se etiquetó en el extremo con un radical 6-FAM en el extremo 5' y un radical BHQl en el extremo 3' . La escisión de SubBi-3-FB se monitoreó a 530nm (longitud de onda de la emisión de FAM) con excitación a 485nm (longitud de onda de la excitación de FAM) . Las bases en letras minúsculas representan el ARN y las bases en letras mayúsculas representan el ADN. SEC ID NO: 31 SubBi-3-FB: CAGCACAACCguCACCAACCG 8. 3. Cebadores PCR para la amplificación del exón 5 de RPLPO La secuencia objetivo para este ejemplo se generó por amplificación in vi tro del ADN genómico humano usando los cebadores PCR de oligonucleótido listados debajo. SEC ID NO: 32 5R05/1 Cebador: CATTCTATCATCAACGGGTA SEC ID NO : 33 3R05 / 1 Cebador : CAAAGGCAGATGGATCAG 8. 4. Secuencia objetivo El ADN genómico humano extraído de la línea celular K562 (Promega) se usó como molde macromolecular para la amplificación del gen RPLPO. 8.5. Componentes de la reacción: Amplificación y cuantificación de la secuencia objetivo La amplificación y cuantificación en tiempo real de la secuencia objetivo se realizó en un volumen de reacción total de 25 µL. Todas las reacciones se dirigieron en un formador de ciclos térmicos ABI7700 (Biosistemas Aplicados). Los parámetros de ciclización fueron, 95°C durante 7 minutos, 10 ciclos de 95°C durante 5 segundos y 60°C durante 30 segundos (con una disminución de 1°C en la temperatura por ciclo) , y finalmente 50 ciclos de 95°C durante 5 segundos y 50°C durante 30 segundos. Las reacciones contuvieron 40 nM de 5R05/1 y 200 nM de 3R05/1, 200 nM de R05A4/3-P y 200 nM de R05B5/3-P, 200 nM de SubBi-3-FB, 10 mM de MgCl2, 200 µM de cada dNTP, 10 unidades de Rnasin (Promega), ROX referencia (Invitrogen) lx, Inmunoamortiguador (Bioline) IX, 0.25 unidades de Immolasa (Bioline) y cualquier molde macromolecular de ADN genómico (20,000 pg, 4000 pg, 800 pg, 160 pg, 32 pg, y 6.4 pg) o ningún objetivo (dH20) . 8. 6. Resultados : Amplificación del objetivo y escisión del sustrato reportero SubBi-3-FB El diseño 6 de la MNAzima para la detección y cuantificación en tiempo real del exón 5 de RPLPO, mostró un incremento en la fluorescencia con el paso del tiempo cuando la secuencia objetivo usada fue ADN genómico humano amplificado vía PCR (Figura 17 (ii)). La fluorescencia del control no objetivo no ADN fue menor que aquella en las reacciones que contienen el objetivo ADN y no aumentó durante la reacción. Esto demuestra que el incremento en la fluorescencia producido en las reacciones que contienen el objetivo se debe al ensamble dependiente del objetivo de las MNAzimas catalíticamente activas que posteriormente escindieron el sustrato reportero. Se generó una curva estándar haciendo la gráfica del logaritmo de las concentraciones de ADN contra el ciclo umbral, resultando en una gráfica lineal con un coeficiente de correlación de 0.995. En la reacción que contiene 6.4 pg de ADN genómico, aproximadamente 10 copias del objetivo estarían presentes. Este ejemplo demuestra la alta sensibilidad de este acercamiento. Mientras este experimento usó proporciones asimétricas del cebador, los experimentos subsiguientes usando PCR en tiempo real (datos no mostrados) demostraron que la detección de la MNAzima también fue compatible con PCR usando proporciones simétricas de cebador.

Ejemplo 9: Reacción multiplex usando múltiples MNAzimas que tienen como objetivo múltiples objetivos simultáneamente. 9. 1. Oligonucleótidos de la partzima Pueden detectarse simultáneamente múltiples objetivos en una reacción multiplexada que comprende múltiples MNAzimas únicas. Cada MNAzima tiene brazos detectores específicos para un objetivo y brazos del sustrato específicos para un miembro único de una serie de sustratos genéricos, cada uno de los cuales se etiqueta con un fluoróforo diferente (Figura 18) . En el siguiente ejemplo, las MNAzimas se diseñaron para detectar dos objetivos diferentes, a saber las secuencias D-20 y RPLPO. Será apreciado que puede usarse cualquier número de objetivos de acuerdo con el método. Las secuencias de las partzimas A y B se listan debajo de 5' a 3' . En las siguientes secuencias las bases subrayadas forman parte del núcleo catalítico de la MNAzima ensamblada, las bases en negritas hibridan con el objetivo y las bases en letras itálicas hibridan para el sustrato. SEC ID NO: 29 Partzima A4 R05A4/3-P: CAAACGAGTCCTGGCCTTCTCTACAACGAGGTGGTGCGG-P SEC ID NO: 30 Partzima B5 R05B5/3-P: CGGTTGGGGAGGCTAGCTGTGG?GACGGATTACACCTTC-P SEC I D NO : 34 Part zima A4 miR20A4 /2 : TACCOrGCACTAACAACGAGAGGAAACCrr SEC ID NO : 35 Partzima B5 miR20B5 /2 : TGCCCAGGGAGGCTAGCTTAAGCACTTTA 9.2. Sus tra tos Reporteros Los dos sustratos reporteros usados en este ejemplo fueron SubBi-2 y SubBi-3 con las secuencias, 5' a 3', como se muestra debajo. En el ejemplo actual, SubBi-2 se etiquetó en el extremo con un radical 6-FAM en el extremo 5' y un radical BHQl en el extremo 3' y se designó SubBi-2-FB. SubBi-3 se etiquetó en el extremo con un radical 6-JOE en el extremo 5' y un radical BHQl en el extremo 3' y se designó SubBi-3-JB. La escisión de SubBi-2-FB se monitoreó a 530nm (longitud de onda de la emisión de FAM) con excitación a 485nm (longitud de onda de la excitación de FAM) y la escisión de SubBi-3-JB se monitoreó a 548 nm (longitud de onda de la emisión de JOE) con excitación a 520 nm (longitud de onda de excitación de JOE) . Las bases en letras minúsculas representan el ARN y las bases en letras mayúsculas representan el ADN . SEC ID NO : 21 SubBi-2-FB : AAGGTTTCCTCguCCCTGGGCA SEC ID NO : 36 SubBi-3-JB : CAGCACAACCguCACCAACCG 9. 3. Secuencias Objetivo La secuencia objetivos para este ejemplo fueron el Objetivo D-20 y Objetivo R05/1 de oligonucleótidos sintéticos con las secuencias, 5' a 3' , como se muestra debajo. La secuencia del Objetivo R05/1 tiene la misma secuencia como una sección del gen RPLPO, exón 5 y la secuencia del Objetivo D-20 es un homólogo de ADN de la hsa-miR-20 de ARN. SEC ID NO: 22 Objetivo R05/1: GAAGGTGTAATCCG CTCCACAGACAAGGCCAGGACTCG TTG SEC ID NO: 12 Objetivo D-20: TAAAGTGCT ATAGTGCAGGTA 9. 4. Condiciones de Reacción La detección de las secuencias objetivo se midió monitoreando el incremento en la señal fluorescente causado por la escisión de los sustratos reporteros por las MNAzimas catalíticamente activas. Las reacciones se iniciaron por la adición del sustrato y el volumen total de todas las reacciones fue 25 µL. Todas las reacciones se dirigieron a 55°C en un formador de ciclos térmicos (Cepheid) SmartCycler® System. La fluorescencia para cada reacción se leyó cada 7 segundos durante un total de 5 minutos. Todas las reacciones en la Tabla 10 contuvieron el amortiguador PCRII (Biosistemas Aplicados) y 25 mM de MgCl2.

Tabla 10: Componentes de las reacciones para la detección simultánea de dos objetivos del ácido nucleico diferentes .

Cada pozo de reacción en el formador de ciclos térmicos (Cepheid) SmartCycler® System utilizado durante el experimento se probó primero para su nivel del fondo de la fluorescencia, como esto es conocido para variar entre pozos. Esto se midió leyendo la fluorescencia de la mezcla en volumen aisladamente. Este valor posteriormente se sustrajo de todas las otras reacciones realizas en ese pozo para permitir las comparaciones entre pozos. 9.5. Resultados : Detección y escisión del sustrato Las reacciones singleplex que contienen el objetivo D-20 o RPLPO mostraron un incremento en la fluorescencia con el paso del tiempo comparado al control no objetivo (Figura 19 (i) ) . Esto demuestra que las partzimas se ensamblan en una MNAzima catalíticamente activa y escinden el sustrato reportero solo en la presencia de la secuencia objetivo. Los controles (dH20) "no objetivo" no incrementaron en fluorescencia indicando que no ocurrió escisión alguna en la ausencia del objetivo. La reacción multiplex para la detección simultánea de RPLPO y D-20 (Figura 19 (ii)) produjo resultados similares para cada objetivo como aquellos observados en las reacciones singleplex para cada objetivo. No se observó incremento alguno en la fluorescencia en la reacción de control "no objetivo". Estos resultados demuestran la detección simultánea de múltiples objetivos en una sola reacción sin pérdida de especificidad.

Ejemplo 10 : Uso de MNAzimas para la cuantificación de amplicones producidos por amplificación in vitro de microARN. . 1. Oligonucleótidos de la partzima Las MNAzimas pueden usarse para monitorear la amplificación de ácidos nucleicos objetivo en tiempo real usando los métodos de amplificación del objetivo in vi tro tales como RTPCR. Además, el monitoreo en tiempo real permite que se cuantifique la cantidad de objetivo inicialmente presente en la reacción. En este ejemplo, la amplificación y la detección se realizan en un proceso de dos etapas, en donde la primera etapa implican la producción de cADN vía transcripción inversa, y posteriormente la amplificación PCR y la detección mediada por la MNAzima del cADN ocurren simultáneamente en la segunda etapa. Los oligonucleótidos de la partzima A y B usaron el diseño 6 con brazos detectores complementarios para hsa-let-7a de microARN humano. Los oligonucleótidos de la partzima se listan debajo con "- P" indicando la fosforilación 3' del oligonucleótido. En las siguientes secuencias las bases subrayadas forman parte del núcleo catalítico de la MNAzima ensamblada, las bases en negritas hibridan con el objetivo y las bases en letras itálicas hibridan para el sustrato.

SEC ID NO: 37 Partzima A4 PCR7aA4/2-P: GACCGTGAGGTAGTAACAACGAGAGGAAACCG-G- P SEC ID NO: 38 Partzima B5 PCR7aB5/2-P: GCCCAGGGAGGCTAGC GGT GTATAGTTGTC-P .2. Sus tra to reportero El sustrato reportero para este ejemplo es SubBi-2 con la secuencia, 5' a 3', como se muestra debajo. En el ejemplo actual, SubBi-2 se etiquetó en el extremo con un radical 6-FAM en el extremo 5' y un radical BHQl en el extremo 3' y se designó SubBi-2-FB. La escisión de SubBi-2-FB se monitoreó a 516 nm (longitud de onda de la emisión de FAM) con excitación a 492 nm (longitud de onda de la excitación de FAM) . En la siguiente secuencia las bases en letras minúsculas representan el ARN y las bases en letras mayúsculas representan el ADN. SEC ID NO: 21 SubBi-2-FB: AAGGTTTCCTCg CCCTGGGC .3. Secuencias objetivo La curva estándar para este ejemplo se generó por un RTPCR de dos etapas de un R-let7a de oligonucleótido de ARN sintético, que tiene secuencia homologa a las especies hsa-let-7a de ARN. La secuencia de R-let7a, escrita 5' a 3', es como sigue.

SEC ID NO : 39 R-let7a : gagguaguaggu?g?auaguu Las muestras de ARN total humano de células de colon (Ambion), células leucémicas K562, células de cáncer cervical HeLa (Ambion) y células del bazo (Clontech) se amplificaron y analizaron para la abundancia de hsa-let-7a. . 4. Cebadores PCR para la amplificación de hsa-let- 7a Los siguientes cebadores se usaron para la amplificación de hsa-let-7a. El cebador 31et7a se usó para la transcripción inversa y los cebadores 51et7a y 3PCR7a se usaron para la amplificación PCR. SEC ID NO: 40 Cebador 31et7a: AGCGAAGCTGAGACAACTATACAA SEC ID NO : 41 Cebador 51et7a : CGACGTGACCGTGAGGTAG SEC ID NO: 42 Cebador 3PCR7a: CATGGCACAAGCGAAGCTGA . 5. Componentes de la reacción : Transcripción inversa de la secuencia objetivo La transcripción inversa de la secuencia objetivo se realizó en un volumen de reacción total de 25 µL. Las reacciones se incubaron en un formador de ciclos térmicos 2720 (Biosistemas Aplicados) durante 20 minutos a 20°C, seguido de 20 minutos a 30°C y posteriormente 20 minutos a 40°C. Las reacciones contuvieron 10 nM de 31et7a, 5 mM de MgCl2, 300 µM de cada dNTP, 20 unidades de Rnasin (Promega), Inmunoamortiguador (Bioline) IX, 100 unidades de M-MLV RT (H-) y 5 µL de ya sea R-let7a (6 x 1011 copias)' o ARN total humano de colon normal (0.1 µg) , K562 (0.1 µg) , HeLa (0.2 µg) o bazo (0.2 µg) . Una reacción de control contuvo todos los reactivos como arriba pero careció del objetivo de ARN en lugar de contener solo 5 µL de dH20. . 6. Componentes de la reacción: Amplificación y cuantificación de la secuencia objetivo La amplificación y la cuantificación en tiempo real de la secuencia objetivo se realizó en el volumen de reacción total de 25 µL. Todas las reacciones se dirigieron en un Sistema QPCR Mx3005P™ (Stratagene) . Los parámetros de ciclización fueron, 95°C durante 7 minutos, 10 ciclos de 95°C durante 15 segundos y 40°C durante 30 segundos (con un incremento de 1°C en la temperatura por ciclo) , y finalmente 50 ciclos de 95°C durante 15 segundos y 50°C durante 30 segundos. Las reacciones contuvieron 200 nM de 3PCR7a y 40 nM de 51et7a, 400 nM de PCR7aA4/2-P y 400 nM de PCR7aB5/2-P, 200 nM de SubBi-2-FB, 10 mM de MgCl2, 200 µM de cada dNTP, 20 unidades de Rnasin (Promega), Inmunoamortiguador (Bioline) IX, 1 unidad de Immolasa (Bioline) y 5 µL de ya sea cADN R-let7a (que contiene 5 x 108, 5 x 107, 5 x 106, 5 x 105, 5 x 104 copias) o molde macromolecular de ARN total humano (colon normal, 0.5 µg; K562, 0.5 µg; HeLa, 1 µg; bazo, 1 µg) o ningún objetivo (dH20) . .7. Resultados : Amplificación del objetivo y escisión del sustrato reportero SubBi-2-FB La MNAzima para la detección y la cuantificación en tiempo real de hsa-let-7a mostró un incremento en la fluorescencia con el paso del tiempo cuando la secuencia objetivo usada fue cADN generado a partir del oligonucleótido de ARN sintético o ARN total humano. No se detectó señal alguna para la reacción de control no objetivo (Tabla 11) . Esto demuestra que el incremento en la fluorescencia producido en las reacciones que contienen el objetivo se debió al ensamble dependiente del objetivo de las MNAzimas catalíticamente activas que posteriormente escindieron el sustrato reportero. Se generó una curva estándar haciendo la gráfica del logaritmo de las concentraciones iniciales de ARN contra el ciclo umbral, resultando en una gráfica lineal con un coeficiente de correlación de 0.999. También se amplificaron cuatro muestras de ARN total humano y se estimó la cantidad de hsa-let-7a en cada una mediante la extrapolación de la curva estándar (Tabla 11) .

Tabla 11 : Resultados de las reacciones para la amplificación y la detección de amplicones hsa-let-7a .

Este ejemplo demuestra la habilidad de las MNAzimas para detectar y cuantificar amplicones generados por la amplificación RTPCR de especies de microARN humano. El microARN es difícil de amplificar y detectar debido a su tamaño pequeño de alrededor de 22 bases. Las MNAzimas son adecuadas para esta aplicación.

Ejemplo 11 : Uso de las MNAzimas para detectar la metilación de ADN 11. 1. Oligonucleótidos de la partzima Se muestra en el ejemplo 19 que la PCR en tiempo real y la generación de señal mediada por la MNAzima permiten la discriminación entre secuencias de ácidos nucleicos completamente apareadas y aquellas que contienen desapareamientos con C opuesto a C. Esta capacidad habilita a las MNAzimas para ser usadas para el análisis del estado de metilación de las células. Las alteraciones en el patrón de metilación ocurren frecuentemente en asociación con cáncer. La mayoría de los protocolos para el análisis de metilación comienzan con la modificación de bisulfito del ADN genómico que convierte las citidinas no metiladas, pero no metiladas, a uridinas. La amplificación PCR del ADN modificado posteriormente reemplaza las uridinas con timidinas y pueden usarse varios métodos para distinguir las secuencias que contienen T (C originalmente no metilado) y C (C originalmente metilado) . En el siguiente ejemplo, se usó una MNAzima para determinar el estado de metilación de dobletes CpG específicos en la región promotora del gen pl6 en el ADN modificado por bisulfito.

En este ejemplo, las partzimas se diseñaron para aparear la secuencia producida después de la modificación de bisulfito de un gen plß metilado. Las secuencias de las partzimas se listan debajo (5' a 3' ) . En las siguientes secuencias, las bases subrayadas forman parte del núcleo catalítico de la MNAzima ensamblada, las bases en negritas hibridan con el objetivo modificado por bisulfito y las bases en letras itálicas hibridan para el sustrato. "- P" indica la fosforilación 3' del oligonucleótido. SEC ID NO: 43 Partzima A5 pl6A5/3-P: GCCCCCGCCTCCAACTACAACGAGGTFGTGerG-P SEC ID NO: 44 Partzima B6 pl6B /3-P: CGGTTGGTGAGGCTAGCAACGCQCGC?CC C - p 11 . 2. Sus tra to reportero El sustrato reportero usado en este ejemplo fue SubBi-3. En el ejemplo actual, SubBi-3 se etiquetó en el extremo con un radical 6-FAM en el extremo 5 A un radical BHQl en el extremo 3' y se designó SubBi-3-FB. La escisión de SubBi-3-FB se monitoreó a 530 nm (longitud de onda de la emisión de FAM) con excitación a 485 nm (longitud de onda de la excitación de FAM) . La secuencia de SubBi-3-FB se muestra debajo (5' a 3'); las bases en letras minúsculas representan el ARN y las bases en letras mayúsculas representan el ADN. SEC ID NO: 31 SubBi-3-FB: CAGCACAACCguCACCAACCG 11. 3. Cebadores PCR para la amplificación de p!6 modificado or bisulfito En este ejemplo, los cebadores PCR se diseñaron para aparear el objetivo modificado por bisulfito, el cual estaba originalmente metilado. La secuencia objetivo para este ejemplo se generó por la amplificación in vi tro del ADN genómico humano modificado por bisulfito usando los cebadores PCR de oligonucleótido listados debajo (5' a 3' ) . SEC ID NO: 45 Cebador 5pl6: GTTGGTTACGGTCGCGGTTC SEC ID NO: 46 Cebador 3pl6: CCGACCGTAACTATTCGATACG 11. 4. Controles y secuencias objetivo. El ADN genómico humano extraído de la línea celular K562 se usó como el ADN genómico de control negativo que contiene un promotor del gen pl6 no metilado. El ADN genómico metilado CpG universal (Chemicon) se usó como un control para una promotor del gen pl6 metilado. El ADN genómico se modificó con bisulfito toda la noche usando el equipo MethylEasy (Human Genetic Signatures) , de acuerdo a las instrucciones del fabricante. El ADN metilado y el ADN no metilado posteriormente se diluyeron en serie para dar muestras que contienen proporciones diversas de ADN metilado en el promotor del gen pld a saber; 100 %, 20 %, 4 %, 0.8 %, 0.16 % y 0.032 %. El dH20 libre de nucleasa se usó en lugar del ADN genómico como un control no objetivo. 11.5. Componentes de la reacción: Amplificación y cuantificación de la secuencia objetivo La amplificación y la cuantificación en tiempo real de la secuencia objetivo se realizó en un volumen de reacción total de 25 µl. Todas las reacciones se dirigieron en un sistema Stratagene MX3005p QPCR. Los parámetros de ciclización fueron 95°C durante 7 minutos, 10 ciclos de 95°C durante 15 segundos y 56°C durante 30 segundos, y finalmente 50 ciclos de 95°C durante 15 segundos y 52°C durante 30 segundos. Las reacciones contuvieron 200 nM de 5pl6 y 40 nM de 3pl6, 200 nM de plßA5/3-P y 200 nM de pl6B6/3-P, 200 nM de SubBi-3-FB, 7.5 mM de MgCl2, 200 µM de cada dNTP, 10 unidades de Rnasin (Prómega), Inmunoamortiguador (Bioline) IX, 1 unidad de Immolasa (Bioline) y ya sea 150 ng de ADN genómico modificado por bisulfito (que contiene 100 %, 20 %, 4 %, 0.8 %, 0.16 % o 0.032 % de ADN metilado) o dH20 solo (reacción de control no objetivo) . Todas las reacciones se realizaron por duplicado. 11. 6. Resultados : Detección de la metilación por una MNAzima La MNAzima específica a la metilación mostró un incremento en la fluorescencia con el paso del tiempo cuando la muestra objetivo contuvo 100 % hasta 0.16 % de ADN metilado (Tabla 12) . En contraste, cuando la muestra objetivo contuvo 0.032 % y 0 % de ADN metilado, la reacción mostró un bajo nivel de fluorescencia, similar a aquel visto en el control no objetivo, y la fluorescencia no aumentó con el paso del tiempo. Mientras el porcentaje de objetivo metilado disminuyó, el Ct de la reacción aumentó y se gráfico una curva estándar con un valor de R2 de 0.996. Los resultados experimentales se resumen en la tabla 12 debajo.

Tabla 12. Uso de las MNAzimas para detectar la metilación de ADN en muestras de ADN genómico modificado por bisulfito .

Los cebadores específicos para pld metilado y la MNAzima pudieron discriminar entre un objetivo metilado y un objetivo no metilado bajo las bases usadas en este ejemplo. Además, el sistema permitió la detección del 0.16 % de objetivo metilado en un antecedente de objetivo no metilado. La eficiencia del 100 % en una reacción PCR implica una duplicación en cada ciclo. La eficiencia observada en este experimento del 133 % indica que hay ambas; la amplificación del objetivo (por PCR) y la detección del amplicón amplificada por la actividad catalítica de la MNAzima.

Ejemplo 12: MNAzimas que se ensamblan a partir de partzimas que tienen brazos detectores que forman estructuras de horquilla . La estructura de las partzimas, las cuales son capaces de ensamblarse en MNAzimas activas, es flexible. Este ejemplo demuestra estructuras adicionales que son compatibles con la actividad de la MNAzima. 12. 1. Oligonucleótidos de la partzima La detección usando MNAzimas también puede realizarse cuando la región del brazo detector de la partzima A, o de la partzima B, o de ambas; la partzima A y B, se sigue por una secuencia arbitraria de horquilla. En los siguientes experimentos, las partzimas A y B se diseñaron para tener como objetivo la secuencia de un microARN humano, hsa-miR-143. Las secuencias de los oligonucleótidos de la partzima A y partzima B se listan debajo 5' a 3' . En las siguientes secuencias, las bases subrayadas forman parte del núcleo catalítico de la MNAzima ensamblada, las bases en negritas hibridan con el objetivo, las bases en letras i táli cas hibridan para el sustrato y las bases que son texto plano forman la horquilla. SEC ID NO: 142 Partzima A2 miR143 A2/1: TGAGCTACAGTCGGTCGAA 'PAGTGAGT SEC ID NO: 143 Partzima B3 miR143 B3/1: CATCTCGTCTCCGAGCGCTTCATCTCA SEC I D NO : 144 Part zima A2 miR143 A2H/1 : GGCACTAACGTGCCTGAGCTACAGTCGGTCGAA?TAGTGAGT SEC ID NO : 145 Part zima B3 miRl43 B3H/ 1 : CA TCTC-GTCÍZCCGAGCGCTTCATC CACGACGATAACGTCG 12.2. Sustrato Reportero La actividad de la MNAzima se monitoreó por la escisión de un sustrato reportero de ácido nucleico doblemente etiquetado. El sustrato reportero para este ejemplo fue SubBi-1-FB con la secuencia, 5' a 3', como se escribe debajo. Las bases en letras minúsculas representan el ARN y las bases en letras mayúsculas representan el ADN. Las bases subrayadas indican la posición de un radical 6-FAM en el extremo 5' y un radical BHQl en el extremo 3' . Los cambios en la fluorescencia debidos a la escisión de SubBi-1-FB en el desoxiribonucleótido entre la FAM y BHQl se monitorearon a 530nm (longitud de onda de la emisión de FAM) con excitación a 485nm (longitud de onda de la excitación de FAM) . SEC ID NO: 6 SubBi-1-FB: ACTCACTATaGGAAGAGA G 12.3. Objetivo La secuencia objetivo para este ejemplo fue un oligonucleótido de ADN, Objetivo D-143, que tiene secuencia homologa al microARN humano, hsa-miR-143. La secuencia del Objetivo D-143 fue como sigue, escrito 5' a 3' . SEC ID NO: 146 Objetivo D-143: GAGATGAAGCACTGTAGCTCA 12. 4 Condiciones de reacción La detección de la secuencia objetivo se midió por un incremento en la señal fluorescente causado por la escisión del sustrato reportero por la MNAzima catalíticamente activa. Las reacciones se iniciaron por la adición del sustrato y el volumen total de todas las reacciones fue 25 µL. Todas las reacciones se dirigieron a 40°C en un formador de ciclos térmicos (Cepheid) SmartCycler® System. La fluorescencia para cada reacción se leyó cada siete segundos durante un total de 10 minutos. Todas las reacciones en la Tabla 13 contuvieron la mezcla en volumen que consiste de 1 µM de SubBi-1-FB, 10 mM de HCl Tris (pH 9.0 a 25°C) y 25 mM de MgCl2.

Tabla 13 : Componentes de las reacciones para la detección de un objetivo de ácido nucleico Cada pozo de reacción en el formador de ciclos térmicos (Cepheid) SmartCycler® System utilizado durante el experimento se probó primero para su nivel del fondo de la fluorescencia, como esto es conocido para variar entre pozos. Esto se midió leyendo la fluorescencia de la mezcla en volumen aisladamente. Este valor posteriormente se sustrajo de todas las otras reacciones realizas en cada pozo para permitir las comparaciones entre pozos. 12.5. Resultados : Detección de la escisión del sustrato reportero S?bBi - 1 -FB Varias combinaciones de diseños de las partzimas A y B fueron todas capaces de ser ensambladas en MNAzimas activas. Estas escindieron el sustrato reportero, como se evidenció por un incremento en la fluorescencia, solo en la presencia de la secuencia objetivo. En este ejemplo, los brazos detectores de las partzimas se han extendido con la secuencia que formó una horquilla. Las reacciones, las cuales contuvieron una partzima con una horquilla (ya sea la partzima A o la partzima B) , o donde ambas partzimas (A y B) contuvieron horquillas, dieron señales fluorescentes similares como aquellas vistas cuando se usaron partzimas que carecían de horquillas. No se observó incremento en la señal alguno en ninguna de las reacciones de control que carece de objetivo. El diseño de las partzimas que contienen horquillas proporciona una estrategia adecuada para la detección de secuencias cortas tales como microARN. El oligonucleótido de ADN detectado en este experimento solo tuvo 22 bases. Esta secuencia se detectó usando partzimas, las cuales ya sea contenían, o no contenían, horquillas. El diseño de horquilla proporciona una estructura más estable y proporciona más flexibilidad en el diseño de las partzimas conocidas para ser compatibles con el ensamble y la actividad catalítica de la MNAzima.

Ejemplo 13: Uso de las MNAzimas para la cuantificación simultánea de cuatro secuencias de ácidos nucleicos vía RTPCR en tiempo real 13. 1. Oligonucleótidos de la partzima para un ensayo RTPCR cuádruple . Múltiples objetivos pueden amplificarse simultáneamente en tiempo real usando los métodos de amplificación del objetivo in vi tro tales como RTPCR. Además, la amplificación de los objetivos puede monitorearse simultáneamente en tiempo real en una reacción multiplexada que comprende múltiples MNAzimas únicas. Cada MNAzima tiene brazos detectores específicos para un objetivo y brazos de sustrato específicos para un miembro único de una serie de sustratos genéricos, cada uno de los cuales se etiqueta con un fluoróforo diferente (Figura 18). En este ejemplo, las MNAzimas se diseñaron para detectar cuatro objetivos diferentes, a saber traslados de BCR, RPLPO, ß-actina y HPRT humanos. Será apreciado que puede usarse cualquier número de objetivos de acuerdo con el método. Las secuencias de las partzimas A y B para cada objetivo se listan debajo 5' a 3' . En las siguientes secuencias las bases subrayadas forman parte del núcleo catalítico de la MNAzima ensamblada, las bases en negritas hibridan con el objetivo y las bases en letras itálicas hibridan para el sustrato. SEC ID NO: 51 Partzima A4 BaA4/2-P: AGATCAAGATCATTGCTCCACAACGAGAGGAAAeCT-r- P SEC ID NO: 52 Partzima B5 BaB5/2-P: TGCCCAGGGAGGC AGC TCC GAGCGCAAGT ACTC - P SEC ID NO: 29 Partzima A4 R05A4/3-P: CAAACGAGTCCTGGCCTTGTCTACAACGAGGTTGGGCGG-P SEC ID NO: 30 Partzima B5 R05B5/3-P: CGGTTGGTGAGGCTAGCTGTGGAGACGGATTACACCTTC-P SEC ID NO: 55 Partzima A4 BCRA4/6-P: AGTTCAAATCTGTACTCCACCACAACGAGAGGGGGGAT- P SEC ID NO: 56 Partzima B5 BCRB5/6-P: C-TGGGAGGAAGGCTAGCTC-TGGAGGTGGATTCCTTTGG-P SEC ID NO: 57 Partzima A4 HPRTA4/7-P: ACTGAATAGAAATAG GATAGATACAACGAGGGCCATGT AA-P SEC ID NO: 58 Partzima B5 HPRTB5/7-P: TAOCACAGCCAAGGC AGC CCA CCTATGACTGTAGATT - P 13.2. Sus tra tos Reporteros Para este ejemplo, se usaron cuatro diferentes sustratos reporteros, cada uno etiquetado con un fluoróforo diferente. Las secuencias de los sustratos están escritas 5' a 3' debajo. En el ejemplo actual, SubBi-2 se etiquetó en el extremo con un radical 6-JOE en el extremo 5' y un radical BHQl en el extremo 3' y se desinó SubBi-2-JB. La escisión de SubBi-2-JB se monitoreó a 555 nm con excitación a 535 nm. SubBi-3 se etiquetó en el extremo con un radical Quasar 670 en el extremo 5' y un radical BHQ2 en el extremo 3' y se designó SubBi-3-Q6B2. La escisión de SubBi-3-Q6B2 se monitoreó a 665 nm con excitación a 635 nm. SubBi-6 se etiquetó en el extremo con el radical Texas Red en el extremo 5' y un radical BHQ2 en el extremo 3' y se designó SubBi-6-TRB2. La escisión de SubBi-6-TRB2 se monitoreó a 610 nm con excitación a 585 nm. El cuarto sustrato, SubBi-7, se etiquetó en el extremo con un radical 6-FAM en el extremo 5' y un radical BHQl en el extremo 3' y se designó SubBi-7-FB. La escisión de SubBi-7-FB se monitoreó a 516 nm con excitación a 492 nm. Las bases en letras minúsculas representan el ARN y las bases en letras mayúsculas representan el ADN. SEC ID NO: 59 SubBi-2-JB: AAGGTTTCCTCguCCCTGGGCA SEC ID NO: 60 SubBi-3-Q6B2 : CAGCACAACCguCACCAACCG SEC ID NO: 61 SubBi-6-TRB2 : ATCACGCCTCguTCCTCCCAG SEC ID NO: 62 SubBi-7-FB: TTAACATGGCACguTGGCTGTGATA 13.3. Secuencia objetivo y cebadores PCR para la amplificación de los cuatro amplicones El ARN total humano extraído de células leucémicas K562 se usó como el molde macromolecular para la amplificación in vi tro de todos los cuatro de los traslados de objetivo. Los amplicones se generaron por RTPCR usando los cebadores PCR de oligonucleótido listados debajo. SEC ID NO: 32 Cebador 5' de 5R05/1: CATTCTATCATCAACGGGTA SEC ID NO: 33 Cebador 3' de 3R05/1: CAAAGGCAGATGGATCAG SEC ID NO: 63 Cebador 5' de 5Bactina: CATTGCCGACAGGATGCAGA SEC ID NO: 64 Cebador 3' de 3Bactina: GAGCCGCCGATCCACACG SEC ID NO: 65 Cebador 5' de 5BCR14: CACTCAGCCACTGGATTTAA SEC ID NO: 66 Cebador 3' de 3BCR15/6: GCGCGTCTTTGCTTTATTC SEC ID NO: 67 Cebador 5' de 5HPRT/5: CTTTGCTGACCTGCTGGATTA SEC ID NO: 68 Cebador 3' de 3HPRT/8: CCTGTTGACTGGTCATTACAA 13. 4. Componentes de la reacción: Amplificación y cuantificación de la secuencia objetivo La amplificación y la cuantificación en tiempo real de las secuencias objetivo se realizó en el volumen de reacción total de 25 µL. Todas las reacciones se dirigieron en un Sistema Mx3005P™ QPCR (Stratagene) . Los parámetros de ciclización fueron, 50°C durante 30 minutos, 95°C durante 7 minutos, 10 ciclos de 95°C durante 15 segundos y 65°C durante 30 segundos (con una disminución de 1°C en la temperatura por ciclo) , y finalmente 40 ciclos de 95°C durante 15 segundos y 54 °C durante 30 segundos. Las reacciones contuvieron 40 nM de cada cebador 5' y 200 nM de cada cebador 3' , 200 nM de cada partzima A y 200 nM de cada partzima B, 200 nM de cada sustrato, 10 mM de MgCl2, 200 µM de cada dNTP, 10 unidades de Rnasin (Promega) , 20 unidades de M-MLV RT (H-) , Inmunoamortiguador (Bioline) IX, 1.5 unidades de Immolasa (Bioline) y ya sea el molde macromolecular de ARN total (100 ng, 20 ng, 4 ng, 800 pg, 160 pg o 32 pg) o no objetivo (dH20) Tabla 14 : Componentes de las reacciones para la detección simultánea de cuatro diferentes objetivos del ácido nucleico . 13.5. Resultados : Amplificación simultánea de cuatro diferentes secuencias objetivo y detección vía la escisión de cuatro diferentes sustratos reporteros Las cuatro MNAzimas usadas para la detección y cuantificación en tiempo real de traslados de ß-actina, RPLPO, BCR, y HPRT mostraron un incremento en la fluorescencia con el paso del tiempo cuando la secuencia objetivo usada fue ARN total humano amplificado vía RTPCR (Tabla 15) . La fluorescencia del control objetivo no ARN para todas las cuatro reacciones fue menor que aquella en las reacciones que contienen el objetivo ARN y no aumentó durante la reacción (Tabla 15) . Esto demuestra que el incremento en la fluorescencia producido en las reacciones que contienen el objetivo se debió al ensamble dependiente del objetivo de las MNAzimas catalíticamente activas que posteriormente escindieron el sustrato reportero. Se generaron curvas estándar para todos los cuatro objetivos representando gráficamente el logaritmo de las concentraciones de ARN contra el ciclo umbral, resultando en una gráfica lineal. El umbral (Ct) de cada estándar se muestra en la Tabla 15. Los valores de Ct mostrados en la tabla son un promedio de los resultados para las reacciones duplicadas. El coeficiente de correlación (R2) , la pendiente y la eficiencia de reacción para cada objetivo también se muestran en la Tabla 15.

Tabla 15: Resultados de las reacciones para la amplificación y detección simultánea de cuatro diferentes objetivos del ácido nucleico La reacción RTPCR de la MNAzima en este ejemplo permitió la detección simultánea y la generación de curvas estándar para la cuantificación de cuatro objetivos en una sola reacción multiplex que incluyó cuatro sustratos genéricos. Estos sustratos genéricos son adecuados para monitorear otras combinaciones de cuatro objetivos en una sola reacción.

Ejemplo 14 : Uso de las MNAzimas para la cuantificación simultánea de cinco secuencias de ácidos nucleicos en un RTPCR multiplex en tiempo real . 14. 1. Oligonucleótidos de la partzima para el ensayo RTPCR güíntupiex Múltiples objetivos pueden amplificarse simultáneamente en tiempo real usando los métodos de amplificación del objetivo in vi tro tales como RTPCR. Además, la amplificación de los objetivos puede monitorearse simultáneamente en tiempo real en una reacción multiplexada que comprende múltiples MNAzimas únicas. Cada MNAzima tiene brazos detectores específicos para un objetivo y brazos de sustrato específicos para un miembro único de una serie de sustratos genéricos, cada uno de los cuales se etiqueta con un fluoróforo diferente (Figura 18). En este ejemplo, las MNAzimas se diseñaron para detectar cinco objetivos diferentes, a saber las secuencias BCR, exón 4 de RPLPO, ß-actina, exón 5 de RPLPO y ARNm de HPRT. Será apreciado que puede usarse cualquier número de objetivos de acuerdo con el método. Las secuencias de las partzimas A y B se listan debajo 5' a 3' . En las siguientes secuencias las bases subrayadas forman parte del núcleo catalítico de la MNAzima ensamblada, las bases en negritas hibridan con el objetivo y las bases en letras itálicas hibridan para el sustrato. SEC ID NO: 69 Partzima A4 BaA4/7-P: AGATCAAGATCA?TGCTCCACAACGAGTGCCAGG- GAA-P SEC ID NO: 70 Partzima B5 BaB5/7-P: TA-TCACAGCCAAGGCTAGCTTCCTGAGCGCAAGTAC C-P SEC ID NO: 71 Partzima A4 R05A4/4-P: CAAACGAGTCCTGGCCTTGTCTACAACGAGTGCGGGATG-P SEC ID NO: 72 Partzima B5 R05B5/4-P: TAGTGCTCCCAAGGCTAGCTG GGAGACGGATTACACCTTC - p SEC ID NO: 55 Partzima A4 BCRA4/6-P: AGTTCAAATCTGTACTGCACCACAACGAGAGGCG GAT-P SEC ID NO: 56 Partzima B5 BCRB5/6-P: CTGGGAGGAAGGCTAGCTCTGGAGGTGGATTCCTTTGG-P SEC ID NO: 75 Partzima A4 HPRTA4/2-P: ACTGAATAGAAATAGTGATAGATACAACGAGAGGAAACCTT-P SEC ID NO: 76 Partzima B5 HPRTB5/2-P: TGCCCAGGGAGGCTAGCTCCATTCCTATGACTGTAGATT-P SEC ID NO: 77 Partzima A4 R04A4/3-P: GCTGGTCATCCAGCAGACAACGAGG TG GCGG- P SEC ID NO: 78 Partzima B5 R04B5/3-P: CGGTTGGTGAGGGTAGCTGTGTTCGACAATGGC-P 14.2. Sustratos Reporteros Para este ejemplo, se usaron cinco sustratos 'reporteros diferentes, cada uno de los cuales se etiquetó con uno de cinco fluoróforos diferentes. Las secuencias del sustrato están escritas 5' a 3' . En el ejemplo actual, SubBi-2 se etiquetó en el extremo con un radical Alexa 350 en el extremo 5' y un radical BHQl en el extremo 3' y se designó SubBi-2-A350B. La escisión de SubBi-2-A350B se monitoreó a 440 nm con excitación a 350 nm. SubBi-3 se etiquetó en el extremo con un radical Quasar 670 en el extremo 5' y un radical BHQ2 en el extremo 3' y se designó SubBi-3-Q6B2. La escisión de SubBi-3-Q6B2 se monitoreó a 665 nm con excitación a 635 nm. SubBi-6 se etiquetó en el extremo con un radical Texas Red en el extremo 5' y un radical BHQ2 en el extremo 3' y se designó SubBi-6-TRB2. La escisión de SubBi-6-TRB2 se monitoreó a 610 nm con excitación a 585 nm. SubBi-7 se etiquetó en el extremo con un radical 6-FAM en el extremo 5' y un radical BHQl en el extremo 3' y se designó SubBi-7-FB. La escisión de SubBi-7-FB se monitoreó a 516 nm con excitación a 492 nm. SubBi-4 se etiquetó en el extremo con un radical 6-JOE en el extremo 5' y un radical BHQl en el extremo 3' y se designó SubBi-4-JB. La escisión de SubBi-4-JB se monitoreó a 555 nm con excitación a 535 nm. Las bases en letras minúsculas representan el ARN y las bases en letras mayúsculas representan el ADN. SEC ID NO: 79 SubBi-2-A350B: AAGGTTTCCTCguCCCTGGGCA SEC ID NO: 60 SubBi-3 - Q6B2 : CAGCACAACCguCACCAACCG SEC ID NO: 61 SubBi-6-TRB2 : ATCACGCCTCguTCCTCCCAG SEC ID NO: 62 SubBi-7-FB: TTAACATGGCACguTGGCTGTGATA SEC ID NO: 83 SubBi-4-JB: CATGGCGCACguTGGGAGAAGTA 14.3. Secuencia objetivo y cebadores PCR para la amplificación de las cinco secuencias objetivo de ARNm. El ARN total humano extraído de las células K562 se usó como el molde macromolecular para la amplificación in vi tro de todos los cinco objetivos. Los amplicones se generaron por amplificación in vi tro usando los cebadores PCR de oligonucleótido listados debajo.

SEC ID NO: 32 Cebador 5' de 5R05/1: CATTCTATCATCAACGGGTA SEC ID NO: 33 Cebador 3' de 3R05/1: CAAAGGCAGATGGATCAG SEC ID NO: 63 Cebador 5' de 5Bactina: CATTGCCGACAGGATGCAGA SEC ID NO: 64 Cebador 3' de 3Bactina: GAGCCGCCGATCCACACG SEC ID NO: 65 Cebador 5' de 5BCR14: CACTCAGCCACTGGATTTAA SEC ID NO: 66 Cebador 3' de 3BCR15/6: GCGCGTCTTTGCTTTATTC SEC ID NO: 67 Cebador 5' de 5HPRT/5: CTTTGCTGACCTGCTGGATTA SEC ID NO: 68 Cebador 3' de 3HPRT/8: CC GTTGACTGG CAT ACAA SEC ID NO: 84 Cebador 5' de 5R04/3: CAAGACTGGAGACAAAGTG SEC ID NO: 85 Cebador 3' de 3R04/2: GCAGAGTTTCCTCTGTGATA 14.4. Componentes de la reacción: Amplificación y cuantificación de la secuencia objetivo La amplificación y la cuantificación en tiempo real de las secuencias objetivo se realizó en un volumen de reacción total de 25 µL. Todas las reacciones se dirigieron en un Sistema Mx3005P™ QPCR (Stratagene) . Los parámetros de ciclización fueron, 50°C durante 30 minutos, 95°C durante 7 minutos, 10 ciclos de 95°C durante 15 segundos y 65°C durante 30 segundos (con una disminución de 1°C en la temperatura por ciclo), y finalmente 40 ciclos de 95°C durante 15 segundos y 54 °C durante 30 segundos. Las reacciones contuvieron 40 nM de 5Bactina, 5BCR14, 5HPRT/5 y 80 nM de 5R04/3, 5R05/1 y 200 nM de 3Bactina, 3BCR15/6, 3HPRT/8 y 400 nM de 3R04/2 y 3R05/1. Hubo 200 nM de cada partzima A y partzima B para la ß-actina, BCR, exón 4 de RPLPO y HPRT y 400 nM de cada partzima A y partzima B para el exón 5 de RPLPO. Hubo 200 nM de SubBi-2-A350B, SubBi-3-Q6B2, SubBi-6-TRB2 y SubBi-7-FB, y 400 nM de SubBi-4-JB. También hubo 10 mM de MgCl2, 200 µM de cada dNTP, 10 unidades de Rnasin (Promega), 20 unidades de M-MLV RT (H-) (Promega) , Inmunoamortiguador (Bioline) IX, 2 unidades de Immolasa (Bioline) y 5 µl de ya sea el molde macromolecular de ARN total (lOOng, 20 ng, 4 ng, 800 pg, o 160 pg) o no objetivo (dH20) .

Tabla 16: Componentes de las reacciones para la detección simultánea de cinco diferentes objetivos del ácido nucleico 14.5. Resultados : Amplificación simultánea de cinco diferentes secuencias objetivo y detección vía la escisión de cinco diferentes sustratos reporteros Las cinco MNAzimas usadas para la detección y cuantificación en tiempo real de secuencias ARN dentro del exón 4 de RPLPO, BCR, ß-actina, exón 5 de RPLPO y HPRT mostraron un incremento en la fluorescencia con el paso del tiempo cuando la secuencia objetivo usada ARN total humano amplificado por RTPCR (Tabla 17). La fluorescencia del control objetivo no ARN para todas las cinco reacciones fue menor que aquella en las reacciones que contienen el objetivo ARN y no aumentó durante la reacción (Tabla 17). Esto demuestra que el incremento en la fluorescencia producido en las reacciones que contienen el objetivo se debió al ensamble dependiente del objetivo de las MNAzimas catalíticamente activas que posteriormente escindieron el sustrato reportero. Se generaron curvas estándar para todos los cinco objetivos representando gráficamente el logaritmo de las concentraciones de ARN contra el ciclo umbral, resultando en una gráfica lineal. El umbral (Ct) de cada estándar se muestra en la Tabla 17. Los valores Ct son el promedio de las reacciones duplicadas. El coeficiente de correlación (R2) , la pendiente y la eficiencia de la reacción para cada objetivo también se muestran en la Tabla 17.

Tabla 17: Resultados de las reacciones para la amplificación y detección simultánea de cinco diferentes objetivos del ácido nucleico La reacción RTPCR de la MNAzima en este ejemplo permitió la detección simultánea y la generación de curvas estándar para la cuantificación de cinco objetivos en una sola reacción multiplex que incluyó cinco sustratos genéricos. Estos sustratos genéricos son adecuados para monitorear otras combinaciones de cinco objetivos en una sola reacción.

Ejemplo 15: Uso de las MNAzimas para la cuantificación de 16S ribosómico en bacterias Para reemplazar la prueba bacteriana de una mancha Gram, las MNAzimas pueden usarse para una prueba rápida de liberación para la esterilidad y/o contaminación de micoplasma con base en secuencias de ácidos nucleicos conservadas encontradas en las especies bacterianas. Las MNAzimas pueden usarse para monitorear la amplificación de ácidos nucleicos bacterianos objetivo en tiempo real usando los métodos de amplificación del objetivo in vi tro tales como RTPCR. En este ejemplo, se usa una región conservada encontrada en la secuencia 16S ríbosómica bacteriana, en donde la transcripción inversa, la amplificación PCR y la detección mediada por la MNAzima ocurren simultáneamente en el único tubo. Se diseño un sistema que tuviera como objetivo una región de la secuencia 16S ribosómica que es común para varias especies bacterianas incluyendo Staphylococcus capitis, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus arneri, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Streptococcus pyogenes, Clostridium sporogenes, Acinetobacter woffii, Propionibacterium acnés, Pseudomonas aeruginosa y Pseudomonas fluorescens. . 1. Oligonucleótidos de la partzima Los oligonucleótidos de la partzima A y B usaron el diseño 7 con brazos detectores complementarios para una región conservada en medio de las especies bacterianas. Los oligonucleótidos de la partzima se listan debajo con "- P" indicando la fosforilación 3' del oligonucleótido. En las siguientes secuencias las bases subrayadas forman parte del núcleo catalítico de la MNAzima ensamblada, las bases en negritas hibridan con el objetivo y las bases en letras itálicas hibridan para el sustrato SEC ID NO: 86 Partzima A5 16S1A5/2-P: GGTTGTC rCAGCTCGTGTACAACG?GAGGAAACCTT- P SEC I D NO : 87 Part zima B6 16S1B6/2-P : TGCCCAGGGAGGCTAGCTCGTGAGATGTTGGGTTAAG- P .2. Sustrato Reportero El sustrato reportero para este ejemplo es SubBi-2 con la secuencia, 5' a 3' , como se muestra debajo. En el ejemplo actual, SubBi-2 se etiquetó en el extremo con un radical 6-FAM en el extremo 5' y un radical BHQl en el extremo 3' y se designó SubBi-2-FB. La escisión de SubBi-2-FB se monitoreó a 516 nm (longitud de onda de la emisión de FAM) con excitación a 492 nm (longitud de onda de la excitación de FAM) . Las bases en letras minúsculas representan el ARN y las bases en letras mayúsculas representan el ADN. SEC ID NO: 21 SubBi-2-FB: AAGGTTTCCTCguCCCTGGGCA .3. Cebadores PCR para la amplificación del 16S ribosómico en bacterias La secuencia objetivo para este ejemplo se generó por la amplificación in vi tro de Ba cill us Subtilis usando los cebadores PCR de oligonucleótido listados debajo. SEC ID NO: 88 Cebador 5' de 516S1-1: TGGTGCATGGTTGTCGTC SEC ID NO: 89 Cebador 3' de 316S1-1: TTGCGCTCGTTGCGGGA . 4. Control y secuencia objetivo El ARN ribosómico bacteriano se extrajo de células Bacill us Subtilis y se usó como el molde macromolecular para la amplificación de la región 16S. El dH0 libre de nucleasa se usó en lugar del ARN como un control no objetivo. .5. Componentes de la reacción: Amplificación y cuantificación de la secuencia objetivo La amplificación y la cuantificación en tiempo real de la secuencia objetivo se realizó en un volumen de reacción total de 25 µL. Todas las reacciones se dirigieron en un sistema Mx3005p QPCR (Stratagene) . Los parámetros de ciclización fueron, 50°C durante 30 minutos, 95°C durante 7 minutos, 10 ciclos de 95°C durante 15 segundos y 65°C durante 30 segundos (con una disminución de 1°C en la temperatura por ciclo), y finalmente 40 ciclos de 95°C durante 5 segundos y 55°C durante 30 segundos. Las reacciones contuvieron 40 nM de 516S1-1 y 200 nM de 316S1-1, 200 nM de 16S1A5/2-P y 200 nM de 16S1B672-P, 200 nM de SubBi-2-FB, 7.5 mM de MgCl2, 200 µM de cada dNTP, 10 unidades de Rnasin (Promega) , Inmunoamortiguador (Bioline) IX, 1 unidad de Immolasa (Bioline) y ya sea el molde macromolecular de ARN (500 ng, 50 ng, 5 ng o 500 pg) o no objetivo (dH20) . . 6. Resultados : Amplificación del objetivo y escisión del sustrato reportero SubBi-2-FB La MNAzima para la detección y la cuantificación en tiempo real del 16S ribosómico bacteriano, mostró un incremento en la fluorescencia con el paso del tiempo cuando la secuencia objetivo usada fue ARN bacteriano amplificado por RTPCR. La fluorescencia del control no molde macromolecular fue menor que aquella en las reacciones que contienen ARN y no aumentó durante la reacción. Esto demuestra que el incremento en la fluorescencia producido en las reacciones que contienen el objetivo se debe al ensamble dependiente del objetivo de las MNAzimas catalíticamente activas que posteriormente escindieron el sustrato reportero. Se generó una curva estándar haciendo la gráfica del logaritmo de las concentraciones de ARN contra el ciclo umbral, resultando en una gráfica lineal con un coeficiente de correlación de 0.992.

Tabla 18: Resultados de las reacciones para la amplificación y detección de los amplicones 16S ribosómicos bacterianos Este ejemplo demuestra la habilidad de las MNAzimas para detectar y cuantificar amplicones generados por la amplificación RTPCR del ARN 16S ribosómico bacteriano. Las MNAzimas usadas en este ejemplo tienen como objetivo una región del 16S bacteriano que está 100 % conservada entre Staphylococcus capi tis , Staphylococcus epidermidis , Staphylococcus warneri , Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis , Streptococcus pyogenes , Clostridium sporogenes , Acinetobacter woffii , Propionibacterium acnés, Pseudomonas aeruginosa y Pseudomonas fluorescens Como tal una sola MNAzima y un sustrato reportero podrían usarse para seleccionar un ensayo para la presencia de cualquiera de las bacterias citadas anteriormente. La detección de una señal (por ejemplo FAM) sería indicativa de la presencia de una o más de estas especies bacterianas en la muestra.

Ejemplo 16: Uso de las MNAzimas para la detección y cuantificación de ARN viral vía RT-PCR de un solo tubo Las MNAzimas pueden usarse para monitorear la amplificación de los ácidos nucleicos objetivo en tiempo real usando los métodos de amplificación del objetivo in vi tro tales como RTPCR. Además, el monitoreo en tiempo real permite que se cuantifique la cantidad de objetivo inicialmente presente en la reacción. Este ejemplo ilustra el uso de la MNAzima para la detección y la cuantificación de ARN viral HIV. La transcripción inversa, la amplificación PCR y la detección de la MNAzima se realizaron en una reacción de un tubo. 16. 1. Oligonucleótidos de la Partzima Las partzimas se diseñaron para tener como objetivo específicamente el gen Nef de HIV-1. En las siguientes secuencias las bases subrayadas forman parte del núcleo catalítico de la MNAzima ensamblada, las bases en negritas hibridan con el objetivo y las bases en letras itálicas hibridan para el sustrato. "- P" indica la fosforilación 3' del oligonucleótido. SEC ID NO: 90 Partzima A4 NefA4/6-P: GAAGAGGCCAATAAAGGAGAGACAACGAG?GGCGTGAG- P SEC ID NO: 91 Partzima B5 NefB5/6-P: CGGGGAGGAAGGCTAGCTAACACCAGCTTGTTACACC-P 16.2. Sustrato Reportero El sustrato reportero para este ejemplo es SubBi-6 con la secuencia, 5' a 3', como se muestra debajo. En el ejemplo actual, SubBi-6 se etiquetó en el extremo con un radical Texas Red en el extremo 5' y un radical BHQ2 en el extremo 3' y se designó SubBi-6-TRB2. La escisión de SubBi-6-TRB2 se monitoreó a 610 nm (longitud de onda de la emisión de Texas Red) con excitación a 585 nm (longitud de onda de la excitación de Texas Red) . En la siguiente secuencia las bases en letras minúsculas representan el ARN y las bases en letras mayúsculas representan el ADN. SEC ID NO: 61 SubBi-6-TRB2 : ATCACGCCTCgu CCTCCCAG 16. 3. Secuencias objetivo La curva estándar en este experimento se generó por la amplificación RTPCR del ARN viral HIV-1. Se usó un equipo QIAGEN Ultrasens para Virus HIV-1 para aislar el ARN viral del medio colectado de las células CEMT4 humanas infectadas con HIV-1. El agua libre de nucleasa (NF) se usó en lugar del ARN viral como un control no objetivo. 16. 4. Cebadores PCR para la amplificación de los traslados de HIV-1 Nef. Los siguientes cebadores se usaron para la amplificación de los traslados de HIV-1 Nef. El cebador 3', Nef/3PCR, se usó para la transcripción inversa y posteriormente este cebador y el cebador 5' Nef/5PCR facilitaron la amplificación PCR. SEC ID NO: 92 Cebador Nef/3PCR: CAGGGTCATCCATTCCATGCAG SEC ID NO: 93 Cebador Nef/5PCR: GCTAGTACCAGTTGAGCCAG 16.5. Componentes de la reacción: Amplificación y cuantificación de la secuencia objetivo La amplificación y la cuantificación en tiempo real de la secuencia objetivo se realizó en un volumen de reacción total de 25 µL. Todas las reacciones se dirigieron en un Sistema Mx3005p QPCR (Stratagene) . Los parámetros de ciclización fueron, 50°C durante 30 minutos, 95°C durante 7 minutos, 10 ciclos de 95°C durante 15 segundos y 65°C durante 30 segundos (con una disminución de 1°C en la temperatura por ciclo), y finalmente 50 ciclos de 95°C durante 15 segundos y 55°C durante 30 segundos. Las reacciones contuvieron 200 nM del cebador 3' Nef/3PCR y 40 nM del cebador 5' Nef/5PCR, 200 nM de la partzima NefA4/6-P y 200 nM de la partzima NefB5/6-P, 200 nM de SubBi-6-TRB2, 10 mM de MgCl2, 200 µM de cada dNTP, 10 unidades de Rnasin (Promega), Inmunoamortiguador (Bioline) IX, 0.5 unidades de Immolasa (Bioline) , 10 unidades de MMLV RT (H-) y 5 µL de ya sea el molde macromolecular de ARN total (que contiene 45,000 pg, 4,500 pg, 450 pg, 45 pg, 4.5 pg, o 0.45 pg) o no objetivo (solo agua) . 16. 6. Resultados : Amplificación del objetivo y escisión del sustrato reportero SubBi-6-TRB2 La MNAzima para la detección y cuantificación en tiempo real de los traslados de HIV-1 Nef mostró un incremento en la fluorescencia con el paso del tiempo cuando la secuencia objetivo usada fue ARN viral HIV-1 amplificado por RTPCR. No hubo incremento en la señal para la reacción de control que carece del objetivo (solo agua) . Esto demuestra que el incremento en la fluorescencia producido en las reacciones que contienen el objetivo se debió al ensamble dependiente del objetivo de las MNAzimas catalíticamente activas que posteriormente escindieron el sustrato reportero. Se generó una curva estándar haciendo la gráfica del logaritmo de la cantidad de molde macromolecular de ARN en cada reacción contra el ciclo umbral (Ct) , resultando en una gráfica lineal. El Ct de cada estándar, conjuntamente con el coeficiente de correlación (R2) , la pendiente y la eficiencia de reacción se muestran en la Tabla 19.

Tabla 19: Resultados de la amplificación y detección de los traslados HIV Nef Este ejemplo demuestra la capacidad de las MNAzimas para ser usadas para la detección y cuantificación de secuencias virales, incluyendo HIV-1.

Ejemplo 17: Requerimientos de secuencia de la actividad catalítica de las MNAzimas . 17. 1. Oligonucleótidos de la partzima El núcleo catalítico de la ADNzima 10:23 como se descubrió originalmente comprende 15 nucleótidos (Santoro & Joyce, 1997). Estudio posteriores de las bases críticas dentro del núcleo catalítico han demostrado que ciertas sustituciones de bases específicas disminuyen significativamente la actividad catalítica, mientras otras son bien toleradas (Zaborowska et al ) . En este ejemplo, una serie de partzimas se diseñaron y probaron para investigar la tolerancia del núcleo catalítico de la MNAzima a la variación de secuencia dentro de los núcleos parciales de las dos partzimas. Las partzimas A y B no modificadas para la MNAzima que detecta el gen RPLPO humano se usaron como el control y se compararon a varias secuencias de la partzima mutadas en donde se había hecho una sola sustitución de las bases en la región del núcleo catalítico parcial. Los oligonucleótidos de la partzima usados para detectar el objetivo se basaron en el diseño 7 (vea el Ejemplo 20) y se listan debajo, 5' a 3' . En las siguientes secuencias las bases subrayadas forman parte del núcleo catalítico de la MNAzima ensamblada, las bases que están subrayadas, en letras i táli cas y en negritas están mutadas en comparación a las secuencias del núcleo parcial de control (no mutadas) , las bases en negritas hibridan con el objetivo y las bases en letras i tálicas hibridan para el sustrato. SEC ID NO: 94 partzima A5 R04A5/2: GGGCTGGTCATCCAGCAG ACAACGAGAGGAAACCTT SEC ID NO: 95 partzima A5 R04A5/2-G14A: GGGCTGG CATCCAGCAGTACAACAAGAGGAAACCGG SEC ID NO: 96 partzima A5 R04A5/2-A9T: GGGCTGGTCATCCAGCAGTTCAACGAGAGGAAACGÍGG SEC I D NO : 97 part zima A5 R04A5 /2-A12T : GGGCTGGTCATCCAGCAGTACATCGAGAGGAA?CG?T SEC ID NO: 98 partzima A5 R04A5/2-A11T : GGGCTGGTCATCCAGCAGTACGACGAGAGGAAACCGT SEC ID NO: 99 partzima B6 R04B6/2: TGGCCAGGGAGGCTAGCGTGTTCGACAATGGCAGCA SEC ID NO: 100 partzima B6 R04B6/2-C7A: TGCCCAGGGAGGCTAGAGTGTTCGACAATGGCAGCA SEC ID NO: 101 partzima B6 R04B6/2-T4C: TGCCCAGGG?GGCCAGCGTGTTCGACAAGGCAGCA 17. 2. Sus tra to Reportero El sustrato reportero para este ejemplo es SubBi-2 con la secuencia, 5' a 3' , como se muestra debajo. En el ejemplo actual, SubBi-2 se etiquetó en el extremo con un radical 6-FAM en el extremo 5' y un radical BHQl en el extremo 3' y se designó SubBi-2-FB. La escisión de SubBi-2-FB se monitoreó a 530 nm (longitud de onda de la emisión de FAM) con excitación a 485 nm (longitud de onda de la excitación de FAM) . En la siguiente secuencia las bases en letras minúsculas representan el ARN y las bases en letras mayúsculas representan el ADN. SEC ID NO: 21 SubBÍ-2-FB: AAGGTTTCCTCguCCCTGGGCA 17 . 3 . Secuencia objetivo Se usó un oligonucleótido de ADN sintético como el molde macromolecular objetivo en este experimento. La secuencia del objetivo se muestra debajo, 5' a 3' . SEC ID NO: 102 Objetivo R04/2: ATGCTGCCATTGTCGAACACCTGCTGGATGACCAGCCCAA 17. 4. Condiciones de reacción El análisis de la actividad catalítica de varios pares de partzimas se realizó usando un formador de ciclos térmicos (Cepheid) SmartCycler System. Las reacciones se iniciaron por la adición del sustrato y el volumen total de todas las reacciones fue 25 µL. Cada reacción contuvo Amortiguador II PCR 1 X (Biosistemas Aplicados) , 10 mM de MgCl2, 0.2 µM de SubBi-2FB, 2 µM de Objetivo R04/2 y un par de partzimas A y B cada una a 2 µM. Los pares de partzimas en cada reacción fueron como en la Tabla 20 debajo.

Tabla 20 : Componentes de las reacciones para la detección de un objetivo de ácido nucleico Las reacciones se incubaron a 54 °C durante 20 minutos y se colectaron datos fluorescentes en intervalos de 12 segundos. Debido a que la fluorescencia inicial puede variar para pozos individuales en el formador de ciclos térmicos SmartCycler System, el valor inicial de la fluorescencia fue sustraído de la fluorescencia en cada punto de tiempo para cada reacción para permitir la comparación entre reacciones en pozos diferentes. Los promedios de las reacciones duplicadas, que contienen ya sea una partzima A mutada o una partzima B mutada, se expresaron entonces como un porcentaje de la fluorescencia para las copias de control. 17.5. Resultados : Detección de la escisión del sustrato reportero S?bBi-2-FB. La escisión del sustrato por los diversos pares de partzimas se midió por el cambio en la fluorescencia con el paso del tiempo. Los valores fluorescentes normalizados para cada reacción se expresaron entonces como un porcentaje de la fluorescencia observada en las reacciones de control en el punto de tiempo equivalente (Tabla 21) .

Tabla 21 : Actividad de la escisión de diversas variantes de la secuencia de partzima (* este ejemplo) y comparación a la actividad de ADNzimas 10:23 variantes (** Zaborowska) .

El experimento muestra que varias sustituciones dentro del núcleo catalítico parcial de ya sea la partzima A o B fueron compatibles con la formación de la MNAzima activa. En contraste otras sustituciones no fueron bien toleradas y produjeron estructuras con poca o ninguna actividad catalítica. Cuando los resultados obtenidos usando las MNAzimas se compararon con aquellos reportados para la sustitución equivalente dentro del núcleo catalítico de la ADNzima 10:23 (Zaborowska et al ) , se observó un patrón similar (Tabla 21) arriba. Por ejemplo, la sustitución de A por G en la posición 14 (G14A) dentro de la partzima A, o dentro del núcleo 10:23, resultó en pérdida de > 90 % de actividad de la escisión. En contraste, la sustitución de T por A en la posición 12 (A12T) dentro de la partzima A, o dentro del núcleo 10:23, resultó en moléculas que retuvieron aproximadamente 80 % de actividad de escisión comparada a las secuencias de control . Como tal, la información en la literatura acerca de otras sustituciones de secuencia, que son compatibles con la actividad de la ADNzima (por ejemplo la ADNzima 10:23 o la ADNzima 8:17), podría predecir la actividad catalítica esperada cuando se introduce la misma variación de secuencia en una de las partzimas. Además, uno experto en el arte podría usar pruebas empíricas para identificar las variantes de núcleo catalítico parcial de partzima adicional, que sean compatibles con la formación de la MNAzima activa.

Ejemplo 18: Aplicación de MNAzimas para detectar objetivos incluyendo moléculas pequeñas tales como 5' -trifosfato de adenosina Los aptámeros son moléculas de ARN o ADN de una sola hebra, desarrolladas in vi tro a partir de grandes depósitos de oligonucleótidos de secuencia aleatoria para que su capacidad para enlazar objetivos con alta especificidad y afinidad. Los aptámeros se han seleccionado por su habilidad para enlazarse específicamente a muchos tipos de objetivos incluyendo proteínas, carbohidratos, lípidos, nucleótidos, virus y células enteras. En este ejemplo, se incorporó una secuencia del aptámero al final de una partzima (apta-partzima) en una configuración por lo cual una MNAzima activa se formó solo en la presencia del objetivo. Hay varias formas de lograr esta meta, incluyendo las estrategias esbozadas en la Figura 4 y la estrategia usada en el siguiente ejemplo que se ilustra en la Figura 20. Los oligonucleótidos del ácido nucleico requeridos para la estrategia de detección de la MNAzima ilustrados en la Figura 20 incluyen; una partzima estándar; a) una apta-partzima que es una partzima con un aptámero incorporado en uno de sus extremos; b) un facilitador de ensamble que es un oligonucleótido que se enlaza a ambas; la apta-partzima y la partzima que habilita el ensamble de una MNAzima activa; c) un sustrato de sonda reportera; y d) un oligonucleótido inhibidor que híbrida a la apta-partzima en una región que abarca al menos parte de la secuencia del aptámero y parte del brazo que enlaza al sustrato de la secuencia de partzima. En la ausencia de un objetivo que se enlaza al aptámero (panel de la izquierda Figura 20) , el oligonucleótido inhibidor se enlaza a la apta-partzima bloqueando así el enlace (y la escisión) del sustrato de sonda reportera. En la presencia de un objetivo que se enlaza al aptámero (panel de la derecha Figura 20), el objetivo se enlaza a la secuencia del aptámero de la apta-partzima, previniendo el enlace del oligonucleótido inhibidor y permitiendo el enlace y la escisión del sustrato de sonda reportera. Como tal, las MNAzimas solo pueden formar y causar la generación de la señal fluorescente en la presencia del objetivo. La estrategia se demostró usando la detección de una molécula pequeña, ATP. La secuencia del aptámero de 27 nucleótidos de longitud usada en este ejemplo se ha reportado previamente como que es altamente específica para el enlace de ATP y dATP (Achenbach, 2005; Huizenga and Szostak, 1995) . 18. 1. Oligonucleótidos de la partzima, ensamble y oligonucleótidos inhibitorios En este ejemplo la secuencia del aptámero de ATP se colocó adyacente al brazo del sustrato de la apta-partzima A (Figura 20). Los brazos detectores de la apta-partzima A y partzima B se diseñaron para enlazar un facilitador de ensamble. Las secuencias de la apta-partzima AtpA2/l y partzima Atp B3/1 (Figura 21) se muestran debajo (5' a 3')- En las siguientes secuencias las bases en negritas hibridan con el facilitador de ensamble, las bases subrayadas forman parte del núcleo catalítico de la MNAzima ensamblada, y las bases en letras i tálicas hibridan para el sustrato. Además, las bases en texto plano en la partzima AtpA2/l indican las secuencias del aptámero de ADN que enlazan al ATP o dATP. SEC ID NO: 103 Apta-Partzima A2 AtpA2/l: AACGTACACTGCACGCGGTCGAAA AsrsAGTACCTGGGGGAGTATTGCGGA GGAAGGT SEC ID NO: 104 Partzima B3 AtpB3/l: CA CTCTTC CCGAGC ?CTGTACCGTGT?C La secuencia del facilitador de ensamble se muestra debajo (5' a 3' ) : SEC ID NO: 105 Facilitador de ensamble AtpC/1: GTACACGGTACAGACCGTGCAGTGTACGTT La secuencia del oligonucleótido inhibidor se muestra debajo (5' a 3' ) • SEC ID NO: 106 Inhibidor AtpR/1: CCAGGTACTCACTATTT 18.2. Sustrato reportero La actividad de la MNAzima se monitoreó por la escisión de un sustrato reportero de ácido nucleico doblemente etiquetado. El sustrato reportero para este ejemplo es SubBi-1-FB con la secuencia, 5' a 3' , como se muestra debajo. Las bases en letras minúsculas representan el ARN y las bases en letras mayúsculas representan el ADN. Las bases subrayadas indican la posición de un radical 6-FAM en el extremo 5' y un radical BHQl en el extremo 3' . Los cambios en la fluorescencia debidos a la escisión de SubBi-1-FB en el ribonucleótido entre la FAM y BHQl fueron monitoreados a 520 nm (longitud de onda de la emisión de FAM) con excitación a 490 nm (longitud de onda de la excitación de FAM) . SEC ID NO: 6 SubBi-1-FB: ACTCACTATaGGAAGAGATG 18. 3. Objetivos Las moléculas objetivo para este ejemplo fueron 5' -trifosfato de adenosina (ATP) y 5' -trifosfato de deoxiadenosina (dATP). El 5' -trifosfato de guanosina (GTP) y el 5' -trifosfato de citosina (CTP) se usaron como controles negativos. Todas las moléculas se compraron de Bioline. El agua libre de nucleasa se usó como un control no objetivo. 18. 4. Condiciones de reacción La detección del objetivo se midió por un incremento en la señal fluorescente causado por la escisión del sustrato reportero por la MNAzima catalíticamente activa. Las reacciones se iniciaron por la adición del sustrato y el volumen total de todas las reacciones fue 50 µL. Antes de la inyección del sustrato, todas las reacciones se pre-incubaron a 60°C durante 5 minutos (para reducir la estructura secundaria) . Las reacciones se dirigieron a 47 °C en un FLUOstar ÓPTIMA (BMG Biotech) . La fluorescencia para cada reacción se leyó cada 3 segundos durante un total de 10 minutos. Cada reacción contuvo una concentración final de 200 nM de AtpA2/l, 200 nM de AtpB3/l, 200 nM de AtpC/1, 200 nM de AtpR/1, 200 nM de SubBi-1-FB, 25 mM de MgCl2, 50 mM de HCl Tris pH 7.5 y 2 mM de ya sea el ATP, dATP, GTP, CTP o no objetivo (agua) . 18. 5. Resultados : Detección y escisión del sustrato reportero SubBi-1-FB En la ausencia de ATP o dATP se observó un bajo nivel de fluorescencia, el cual no aumentó con el paso del tiempo, demostrando que el oligonucleótido inhibidor pudo prevenir el ensamble de una MNAzima activa (Figura 21) . En la presencia de ATP o dATP, la señal fluorescente fue mayor y aumentó con el paso del tiempo. Esto indica que el oligonucleótido inhibidor se desplazó por dATP y ATP y se formó una MNAzima activa. El ensamble de la MNAzima fue dependiente del objetivo ya que la señal fluorescente en la presencia de GTP y CTP fue la misma como en la ausencia de ATP o dATP es decir en el control de agua no analito. Este ejemplo demuestra que las MNAzimas pueden acoplarse a los aptámeros para la detección de objetivos que incluyen ambos objetivos; de ácidos nucleicos y de no ácidos nucleicos, en un acercamiento que es altamente específico para el objetivo. Uno experto en el arte reconocerá que el diseño de esta estrategia puede ser flexible. El aptámero puede incorporarse en cualquier extremo (5' o 3' ) de cualquiera de las dos partzimas que contienen secuencias parciales del núcleo catalítico. Como tal, el oligonucleótido inhibidor puede enlazarse a la región del aptámero y a ya sea el brazo del sustrato (que enlaza el sustrato reportero) o al brazo detector (que enlaza el facilitador de ensamble) . En el diseño anterior (Figura 20; este ejemplo), el inhibidor bloquea el enlace del sustrato reportero. En el último diseño, el inhibidor prevendría el enlace del facilitador de ensamble con las partzimas y por consiguiente prevendría la formación de la MNAzima activa. La literatura contiene secuencias para un gran número de aptámeros capaces de detectar muchos tipos de objetivos. Estos incluyen proteínas, carbohidratos, lípidos, priones, nucleótidos, virus y células enteras. Los aptámeros para todos estos tipos de objetivos podrían enlazarse a las partzimas para detectar un rango muy diverso de moléculas. Las condiciones de reacción (amortiguador, temperatura, concentración de catión divalente, etc.), las cuales son compatibles con ambos; el enlace de los objetivos a los aptámeros (o apta-partzimas) y la escisión de un sustrato reportero por una MNAzima, pueden determinarse mediante pruebas empíricas. Además, debido a que los aptámeros se desarrollan in vi tro bajo condiciones de reacción seleccionadas por el investigador, haría posible adaptar la evolución molecular para permitir el desarrollo de aptámeros para cualquier objetivo deseado que se enlazará bajo las condiciones compatibles con la escisión de la MNAzima. Como las MNAzimas son activas sobre un rango muy amplio de condiciones, uno experto en el arte fácilmente podría determinar las condiciones compatibles con la escisión de la MNAzima.

Ejemplo 19: Uso de las MNAzimas para la detección de desapareamientos de bases sencillas Las MNAzimas pueden usarse para detectar y cuantificar ácidos nucleicos objetivo en tiempo real usando los métodos de amplificación del objetivo in vi tro tales como PCR. Las MNAzimas también pueden usarse para generar resultados cualitativos, por ejemplo detectando cambios en las secuencias de ácidos nucleicos. La detección del objetivo mediada por la MNAzima puede ocurrir vía el reconocimiento de bases de Watson-Crick de los brazos detectores y la secuencia objetivo. En este ejemplo, las MNAzimas se usan para detectar un solo desapareamiento de bases sacando provecho de este requerimiento para la complementariedad entre el brazo detector de la partzima y la secuencia de ácidos nucleicos objetivo. 19. 1. Oligonucleótidos de la partzima Los oligonucleótidos de la partzima se diseñaron para ser ya sea completamente complementarios para la secuencia objetivo, o para estar desapareados con respecto a la secuencia objetivo (Figura 22 (i)) . Las secuencias de la partzima A completamente apareada (R05A5/2 (22) -P) , la partzima B completamente apareada (R05B6/2 (11G) -P) y la partzima B desapareada (R05B6/2 (11C) -P) se listan debajo (5' a 3')- En las siguientes secuencias las bases subrayadas forman parte del núcleo catalítico de la MNAzima ensamblada, las bases en negritas hibridan con el objetivo y las bases en letras i tálicas hibridan para el sustrato.

La base desapareada en la partzima R05B6/2 (11C) -P está en negritas y subrayada. "- P" indica la fosforilación 3' del oligonucleótido. SEC ID NO: 107 Partzima A5 R05A5/2 (22) -P: CAAACGAGTCCTGGCCTTGTCTTACAACGAGAGGAAACCGG-P SEC ID NO: 108 Partzima B6 R05B6/2 (?IG)-P: TGGGCAGGGAGGC AGCGTGGAGACGGA- P SEC ID NO: 109 Partzima B6 R05B6/2 (?IC)-P: GCCGAGGGAGGCTAGCGTCGAGACGGA- P 19.2. Sus tra to reportero El sustrato reportero usado en este ejemplo fue SubBi-2. En el ejemplo actual, ?ubBi-2 se etiquetó en el extremo con un radical 6-FAM en el extremo 5' , un radical BHQl en el extremo 3' y se designó SubBi-2-FB. La escisión de SubBi-2-FB se monitoreó a 530 nm (longitud de onda de la emisión de FAM) con excitación a 485 nm (longitud de onda de la excitación de FAM) . La secuencia de SubBi-2-FB se lista debajo (5' a 3' ) ; las bases en letras minúsculas representan el ARN y las bases en letras mayúsculas representan el ADN. SEC ID NO: 21 SubBi-2-FB: AAGGTTTCCTCguCCCTGGGCA 19. 3. Cebadores PCR para la amplificación del exón 5 de RPLPO La secuencia objetivo para este ejemplo se generó por la amplificación in vi tro del ADN genómico humano usando los cebadores PCR de oligonucleótido listados debajo (5' a 3' ) SEC ID NO: 32 Cebador 5R05/1: CATTCTATCATCAACGGGTA SEC I D NO : 110 Cebador 3R05 /2 : AGCAGCCACAAAGGCAGA 19. 4. Controles y secuencias objetivo El ADN genómico humano extraído de la línea celular K562 humana se usó como el molde macromolecular para la amplificación del gen RPLPO. El agua libre de nucleasa (NF) se usó en lugar del ADN genómico como un control no objetivo. 19. 5. Componentes de la reacción : Amplificación y detección de la secuencia objetivo La amplificación y la detección en tiempo real de la secuencia objetivo se realizó en un volumen de reacción total de 25 µl . Todas las reacciones se dirigieron en un formador de ciclos térmicos ABI 7700 (Biosistemas Aplicados) . Los parámetros de ciclización fueron 95°C durante 7 minutos, 10 ciclos de 95°C durante 15 segundos y 65°C durante 30 segundos (con una disminución de 1°C en la temperatura por ciclo) , y finalmente 50 ciclos de 95°C durante 15 segundos y 47 °C durante 30 segundos. Las reacciones contuvieron 40 nM de 5R05/1, 200 nM de 3R05/2, 200 nM de R05A5/2 (22 ) -P y 200 nM de R05B6/2 ( 11G) -P o 200 nM de R05B6/2 (?IC)-P, 200 nM de SubBi-2-FB, 10 mM de MgCl2, 200 µM de cada dNTP, 10 unidades de Rnasin (Promega), ROX referencia (Invitrogen) lx, Inmunoamortiguador (Bioline) IX, 1 unidad de Immolasa (Bioline) y ya sea 100 ng del molde macromolecular de ADN genómico o agua-NF. 19. 6. Resultados : Detección del desapareamiento de bases sencillas usando una MNAzima La MNAzima que comprende el brazo B detector completamente apareado mostró un incremento en la fluorescencia con el paso del tiempo cuando la secuencia objetivo usada fue ADN genómico humano amplificado vía PCR (Figura 22 (ii) ) . En contraste, la MNAzima que contiene el brazo B detector desapareado mostró un bajo nivel de fluorescencia con el objetivo genómico, similar a aquel visto en el control no objetivo, y la fluorescencia no aumentó con el paso del tiempo. Así, el desapareamiento sencillo, tres bases de la unión de la partzima A y B fue suficiente para prevenir la formación de la MNAzima activa. Este ejemplo demuestra que las MNAzimas pueden usarse para detectar desapareamientos de bases sencillas entre el objetivo y los brazos detectores. Debido a que las MNAzimas son capaces de detectar alteraciones tan pequeñas como cambios de bases sencillas, sería obvio para uno experto en el arte que las MNAzimas también podrían usarse para discriminar la secuencia que difiere por eliminaciones pequeñas o inserciones pequeñas. Además, también podrían detectarse alteraciones más grandes tales como desplazamientos asociados con varios tipos de cáncer, que resultan en traslados de fusión. Estos ocurren frecuentemente en asociación con la leucemia, por ejemplo los traslados de fusión PML/RARa están asociados con la leucemia promielocítica aguda y los traslados de fusión bcr/abl están asociados con la leucemia granulocítica crónica. Mientras este ejemplo muestra que los desapareamientos sencillos pueden ser suficientes para prevenir el ensamble de la MNAzima activa, experimentos adicionales demostraron que no todos los desapareamientos de bases sencillas rompen completamente el ensamble de la MNAzima bajo todas las condiciones. La capacidad para discriminar desapareamientos de bases sencillas depende de varios factores incluyendo a) la severidad de las condiciones de reacción, que pueden ser influenciadas por muchos factores incluyendo la temperatura, la concentración de sal, la concentración del catión, b) el tipo de desapareamiento, por ejemplo desapareamientos G/T versus C/C, c) la posición del desapareamiento dentro del brazo de la partzima, y d) la longitud del brazo de la partzima. Pueden usarse estrategias adicionales para incrementar la capacidad de la MNAzima para polimorfismos de bases sencillas detectables. Estas incluyen, por ejemplo, el uso de un brazo detector de la partzima truncado como se demuestra en el ejemplo 22.

Ej mplo 20: Actividad de prueba de la MNAzima de una serie de pares de partzimas que contienen secuencias parciales del núcleo catalítico, variantes derivadas del núcleo catalí ticolO : 23. Las enzimas de ácidos nucleicos multi-componente (MNAzimas) pueden hacerse que incorporan secuencias parciales de una variedad de ADNzimas desarrolladas in vi tro . Las MNAzimas activas, basadas en las secuencias parciales de las ADNzimas 8:17 y 10:23, se han demostrado. Además, varios diseños de partzima alternativos basados en las ADNzimas 8:17 y 10:23 han sido mostrados por ya sea tener (Ejemplos 1, 3, Figuras 9, 10 y 13) , o carecer (Ejemplo 1, Figura 8), actividad. Este ejemplo además extiende estos estudios e identifica ambas secuencias de la partzima; activas e inactivas con base en las secuencias parciales del núcleo catalítico de la ADNzima 10:23. Además, el ejemplo proporciona un protocolo general para las etapas necesarias para identificar el (los) lugar (es) óptimo (s) para dividir una secuencia del núcleo catalítico tal que, cuando se incorporan las secuencias parciales del núcleo catalítico en las partzimas, se generan las MNAzimas activas funcionales. . 1. Oligonucleótidos de la partzima El método en este ejemplo se usó para investigar que posiciones dentro de la secuencia del núcleo catalítico 10:23 son adecuadas para la división en secuencias parciales del núcleo catalítico las cuales, sobre la incorporación en las partzimas, resultan en MNAzimas funcionalmente activas. La secuencia 10:23 se dividió en varios puntos y posteriormente las dos secuencias parciales se incorporaron en una serie de pares de partzimas que se diseñaron para escindir un sustrato en la presencia del objetivo (gen RPLPO humano) . Los núcleos catalíticos parciales para cada par de partzimas que fueron probados se muestran en la Tabla 22 con referencia a la secuencia completa del núcleo catalítico de la ADNzima 10:23 (Santoro and Joyce, 1997) .

Tabla 22: Bases y posiciones en la ADNzima 10 :23 y en una serie de pares de partzimas variantes donde las bases en las posiciones 1 a 15 del núcleo se han distribuido de manera diferente entre dos partzimas A y B.

Todas las secuencias están escritas 5' a 3' . El diseño de la MNAzima y la nomenclatura de la partzima se continúan de la serie en la Tabla 3 y se extienden en esta tabla para identificar la posición de la división dentro del núcleo. Por ejemplo, el Diseño 6 es una MNAzima derivada de 10:23 con el diseño de partzima A4 y partzima B5 (A4:B5), donde el núcleo se ha dividido entre T en la posición 8 y A en la posición 9 (T8-A9) .

En este experimento las series de pares de partzimas fueron todas sintetizadas con brazos detectores diseñados para hibridar a exón 5 del gen RPLPO humano, y con brazos del sustrato dirigidos contra el sustrato, SubBi-2. Los pares de partzimas usados en este experimento se sintetizaron por Sigma-Proligo y sus secuencias se listan debajo (5' a 3' ) . Las bases subrayadas forman parte del núcleo catalítico de la MNAzima ensamblada, las bases en negritas hibridan con el objetivo de ácido nucleico y las bases en letras i tálicas hibridan para el sustrato. "-P" indica la fosforilación 3' del oligonucleótido. Par de Partzimas de RPLPO A4 : B5 SEC ID NO: 147 R05A4/2-P CAAACGAGTCCTGGCCTTGTCTACAACGAGAGGAAACCGT -P SEC I D NO : 112 R05B5 ( 16 ) / 2 -P TGCGCAGGGAGGCTAGCTGTGGAGACGGATTACA -P Par de Part zimas de RPLPO A5 : B 6 SEC I D NO : 107 R05A5 /2 ( 22 ) - P CAAACGAGTCCtGGCCTTG CTTACAACGAGAGGAAACCrr -P SEC ID NO: 114 R05B6 (16) /2-P TGCCCAGGGAGGCTAGCGTGGAGACGGATTACA -P Par de Partzimas de RPLPO A6:B7 SEC ID NO: 115 R05A6 (22) /2-P CAAACGAGTCCTGGCCTTGCTACGAGAGGAAACCTT -P SEC ID NO: 116 R05B7 (16) /2-P TGCCCAGGGAGGC GCTACAGTGGAGACGGATTACA -P Par de Partzimas de RPLPO A7 : B8 SEC ID NO: 117 R05A7 (22) /2-P CAAACGAGTCCTGGCCTTGTCTC AACGAGAGGAAACGTT -P SEC ID NO: 118 R05B8 (16) /2-P TGCGCAGGGAGGCTAGCTAGTGGAGACGGATTACA -P Par de Partzimas de RPLPO A8:B9 SEC ID NO: 119 R05A8 (22) /2-P CAAACGAGTCCTGGCCTTG CTCTACAACGAGAGGAAACCGT -P SEC ID NO: 120 R05B9 (16) /2-P GGCCGAGGGAGGCTAGGTGGAGACGGATTACA -P Par de Partzimas de RPLPO A9:B10 SEC ID NO: 121 R05A9 (22) /2-P CAAACGAGTCCTGGCCTTGTCTGCTACAACGAGAGGAAACCiTT - P SEC ID NO : 122 RO5B10 ( 16 ) /2-P TGCCCAGGGAGGC AGTGGAGACGGATTACA -P . 2. Sustrato Reportero El sustrato reportero para este ejemplo es SubBi- 2 con la secuencia, 5' a 3', como se muestra debajo. En el ejemplo actual, SubBi-2 se etiquetó en el extremo con un radical 6-FAM en el extremo 5' y un radical BHQl en el extremo 3' y se designó SubBi-2-FB. La escisión de SubBi-2-FB se monitoreó a 530nm (longitud de onda de la emisión de FAM) con excitación a 485nm (longitud de onda de la excitación de FAM) . Las bases en letras minúsculas representan el ARN y las bases en letras mayúsculas representan el ADN. SEC ID NO: 21 SubBi-2-FB AAGGTTTCCTCguCCCTGGGCA . 3. Cebadores PCR para la amplificación del exón 5 del gen RPLPO humano . Las secuencias de los cebadores se muestran, 5' a 3' , debajo. SEC ID NO : 123 Cebador 5 ' de 5R05 /2 GCTACCCAACTGTTGCATC SEC ID NO : 110 Cebador 3 ' de 3R05 /2 AGCAGCCACAAAGGCAGA 20. 4. Molde macromolecular objetivo El ADN genómico humano extraído de las células K562 se usó como el molde macromolecular en la reacción PCR. .5. Condiciones de reacción La amplificación en tiempo real de la secuencia objetivo y la detección de la actividad catalítica de los pares de partzimas se dirigieron en una reacción de 25 µL que entró en un ciclo en un formador de ciclos térmicos ABI 7700 (Biosistemas Aplicados) . Los parámetros de ciclización fueron 95°C durante 7 minutos, 10 ciclos de 95°C durante 15 segundos y 65°C durante 30 segundos (con una disminución de 1°C en la temperatura por ciclo), y finalmente 50 ciclos de 95°C durante 15 segundos y 50°C durante 30 segundos. Cada reacción contuvo 0.04 µM de 5R05/1 y 0.2 µM de 3R05/2, 10 mM de MgCl2, 50 µM de cada dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) , Inmunoamortiguador (Bioline) IX, 0.2 µM de SubBi-2-FB, tinte Rox de referencia (Invitrogen) lx, 10 unidades de Rnasin (Promega) y 1 unidad de Immolasa Polimerasa (Bioline) y 100 ng de ADN genómico. Además cada reacción contuvo un par de partzimas 0.2 µM de partzima A y 0.2 µM de partzima B (Par de Partzimas de RPLPO A4:B5 o A5 : B6 o A6:B7 o A7 : B8 o A8:B9 o A9:B10). . 6. Resultados Usando un método PCR-MNAzima en tiempo real, se detectó la actividad catalítica de tres de los seis pares de partzimas de RPLPO. El par de partzimas A4:B5 y A5:B6 mostraron altos niveles de actividad catalítica, permitiendo la detección del objetivo en 22 ciclos (Tabla 23). El par de partzimas A7:B8 también fue activo, aunque menos activo que A4 : B5 y A5:B6. No se detectó actividad catalítica alguna de los pares de partzimas A6:B7, A8:B9 o A9:B10 bajo las condiciones de este experimento.

Tabla 23 : Valores del Ciclo Umbral (Ct) obtenidos usando varios pares de partzimas Los valores Ct son promediados de reacciones triplicadas, cuando el nivel umbral de la florescencia se estableció en 0.2 y la fluorescencia del fondo de la línea base se sustrajo entre los ciclos 1 y 14.

Ejemplo 21 : Aplicación de las MNAzimas para detectar objetivos de proteína. Como se demuestra en el ejemplo 18, las MNAzimas pueden usarse para detectar objetivos mediante la incorporación de secuencias del aptámero sobre el extremo de una partzima (apta-partzima). En este ejemplo, se usó la misma estrategia de detección de MNAzima (Figura 20) para detectar la polimerasa Taq de proteína usando una secuencia del aptámero de 46 nucleótidos de longitud que ha sido reportada por enlazar la polimerasa Taq con alta especificidad (Yakimovich, 2003) . El facilitador de ensamble y el oligonucleótido de la partzima B fueron los mismos como aquellos usados en el ejemplo 18 donde se detectó el ATP usando una MNAzima. 21. 1. Oligonucleótidos de la partzima, ensamble y oligonucleótidos inhibitorios En este ejemplo la secuencia del aptámero de polimerasa Taq se colocó adyacente al brazo del sustrato de la apta-partzima A (Figura 20). Los brazos detectores de la apta-partzima A y la partzima B se diseñaron para enlazar un facilitador de ensamble. Las secuencias de la apta-partzima TaqA2/l y partzima AtpB3/l se muestran debajo (5' a 3' ) • En las siguientes secuencias las bases en negritas hibridan con el facilitador de ensamble, las bases subrayadas forman parte del núcleo catalítico de la MNAzima ensamblada, y las bases en letras i tálicas hibridan para el sustrato. Además, las bases en texto plano en la apta-partzima A2 TaqA2/l indican secuencias del aptámero de ADN que se enlazan a la polimerasa Taq. SEC ID NO: 124 Apta-partzima A2 TaqA2/l: AACGTACACTGCACGCGGTCGAAATAGTGAGreCGGTCGGCTCGGGGCATTC TTAGCGTTTTGCCCCGAGCCGACCGC SEC ID NO: 104 Partzima B3 AtpB3/l: GAGCGGCTCTCCGAGCGTCTGTACCGTGTAC La secuencia del facilitador de ensamble se muestra debajo (5' a 3' ) : SEC ID NO: 105 Facilitador de ensamble AtpC/1: GTACACGGTACAGACCGTGCAGTGTACGTT La secuencia del oligonucleótido inhibidor se muestra debajo (5' a 3' ) • SEC ID NO: 125 Inhibidor TaqR/1: GCCCCGAGCCGACCGAACTCACTA T 21. 2. Sustrato reportero La actividad de la MNAzima se monitorea por la escisión de un sustrato reportero del ácido nucleico doblemente etiquetado. El sustrato reportero para este ejemplo es SubBi-1-FB con la secuencia, 5' a 3', como se muestra debajo. Las bases en letras minúsculas representan el ARN y las bases en letras mayúsculas representan el ADN. Las bases subrayadas indican la posición de un radical 6-FAM en el extremo 5' y un radical BHQl en el extremo 3' . Los cambios en la fluorescencia debidos a la escisión de SubBi-1-FB en el ribonucleótido entre la FAM y BHQl se monitorearon a 520 nm (longitud de onda de la emisión de FAM) con excitación a 490 nm (longitud de onda de la excitación de FAM) . SEC ID NO: 6 SubBi-1-FB: ACTCACTATaGGAAGAGATG 21 . 3. Objetivo La molécula objetivo en este ejemplo fue la Polimerasa Taq de ADN (Amersham Biosciences) y la polimerasa Klenow (Amersham Biosciences) se usó como un control negativo. El agua libre de nucleasa se usó como un control "no objetivo". 21. 4. Condiciones de reacción La detección de la secuencia objetivo se midió por un incremento en la señal fluorescente causado por la escisión del sustrato reportero por la MNAzima catalíticamente activa. Las reacciones se iniciaron por la adición del sustrato y el volumen total de todas las reacciones fue 50 µL. Las reacciones se dirigieron a 40°C en un FLUOstar ÓPTIMA (BMG Biotech) . La fluorescencia para cada reacción se leyó cada 6 segundos durante un total de minutos. Cada reacción contuvo una concentración final de 200 nM de TaqA2/l, 200 nM de AtpB3/l, 200 nM de AtpC/1, 200 nM de TaqR/1, 200 nM de SubBi-1-FB, 25 mM de MgCl2, 25 mM de HCl Tris pH 6.8 y ya sea 5 Unidades de polimerasa Taq de ADN o 5 Unidades de polimerasa Klenow o ninguna proteína (solo agua) . 21.5. Resultados : Detección y escisión del sustrato reportero SubBi-1-FB En la ausencia de la polimerasa Taq se observó un bajo nivel de fluorescencia que solo aumentó ligeramente con el paso del tiempo, demostrando que el oligonucleótido inhibidor pudo prevenir el ensamble de una MNAzima activa. En la presencia de la polimerasa Taq, la señal fluorescente fue mayor y aumentó con el paso del tiempo. Esto indica que el oligonucleótido inhibidor se desplazó por la polimerasa Taqr y se formó una MNAzima activa. El ensamble de la MNAzima fue dependiente del objetivo ya que la señal fluorescente en la presencia de la polimerasa Klenow fue similar a la señal en la ausencia de la polimerasa Taq es decir en el control de agua "no objetivo". Esto es consistente con las observaciones de Yakimovich et al (2003) que mostró que la secuencia del aptámero de la polimerasa Taq es específica para la polimerasa Taq y no se enlaza a Klenow. Este ejemplo de MNAzima de arriba demuestra que las MNAzimas pueden acoplarse a los aptámeros para la detección de proteínas específicas.

Ejemplo 22: Detección de un polimorfismo del nucleótido sencillo (SNP) usando una partzima truncada y un oligonucleótido estabilizador La detección del objetivo mediada por la MNAzima puede ocurrir vía el reconocimiento de bases de Watson-Crick de los brazos detectores de la partzima y la secuencia objetivo. En el ejemplo 19, este requerimiento para la complementariedad se usó para detectar un desapareamiento de bases sencillas entre el brazo detector de la partzima y la secuencia de ácidos nucleicos objetivo. En el siguiente ejemplo, el requerimiento para la complementariedad se explotó de nuevo para detectar un polimorfismo del nucleótido sencillo (SNP) usando una estrategia que usó una partzima con un brazo detector truncado, el cual puede estabilizarse por un oligonucleótido estabilizador. La estrategia de detección de la MNAzima usada en este ejemplo se ilustra en la Figura 23 y los oligonucleótidos requeridos se describen debajo: a) la partzima estándar; b) una partzima con un brazo detector truncado (por ejemplo 5 bases) que se diseña para aparear completamente una forma del SNP pero no la otra; c) un oligonucleótido estabilizador (por ejemplo 15 bases), el cual híbrida para el objetivo adyacente al brazo detector truncado de la partzima. El estabilizador se diseña para facilitar el ensamble de la MNAzima cuando el brazo detector de 5 nucleótidos híbrida para el objetivo; y d) un sustrato de sonda reportera. 22. 1. Oligonucleótidos de la partzima y oligonucleótido estabilizador En este ejemplo, el brazo detector de la partzima B se diseño para ser solo de 5 nucleótidos de longitud y para discriminar un SNP que tiene lugar en el oligonucleótido objetivo. El brazo detector de la partzima B se diseño para hibridar a la forma "T" del SNP pero no a la forma "C" del SNP. Las secuencias de las partzimas A y B y el oligonucleótido estabilizador se muestran debajo (5' a 3' ) . En las siguientes secuencias las bases en negritas hibridan con el objetivo, las bases subrayadas forman parte del núcleo catalítico de la MNAzima ensamblada, y las bases en letras itálicas hibridan para el sustrato. "- P" indica la fosforilación 3' del oligonucleótido. SEC ID NO: 126 Partzima A4 XdA4/2-P: ACTGGATGTCCATCTGTCTGACAACGAGAGGAAAGCTT- SEC ID NO: 127 Partzima B5 XdB5/2-P: TGCCGAGGGAGGCTAGCTTATAC-P SEC ID NO: 128 Estabilizador XdF/2-P: CTTCGTGAGGGTGAG-P 22.2. Sustrato reportero El sustrato reportero usado en este ejemplo fue SubBi-2. En el ejemplo actual, SubBi-2 se etiquetó en el extremo con un radical 6-FAM en el extremo 5' , un radical BHQl en el extremo 3' y se designó SubBi-2-FB. La escisión de SubBi-2-FB se monitoreó a 520 nm (longitud de onda de la emisión de FAM) con excitación a 490 nm (longitud de onda de la excitación de FAM) . La secuencia de SubBi-2-FB se lista debajo (5' a 3'); las bases en letras minúsculas representan el ARN y las bases en letras mayúsculas representan el ADN. SEC ID NO: 21 SubBi-2-FB: AAGGTTTCCTCguCCCTGGGCA 22. 3. Objetivo Las moléculas objetivo para este ejemplo fueron oligonucleótidos sintéticos derivados del gen Xd. Uno de los objetivos correspondió a la forma "T" del SNP (XdC/2(52)) y se apareó completamente con el brazo detector de la partzima B. El otro objetivo correspondió a la forma "C" del SNP y se desapareó para el brazo detector de la partzima B. Los oligonucleótidos sintéticos fueron ordenados de Sigma-Proligo y el agua libre de nucleasa se usó en lugar del objetivo como un control "no objetivo". Las secuencias de ambos objetivos se listan debajo (5' a 3') con el SNP subrayado. SEC ID NO: 129 Objetivo XdC/2(52): TGCCCCCTCACCCTCACGAAGGTATACAGACAGATGGACATCCAGTTGGTGA SEC ID NO: 130 Objetivo (desapareamiento) XdC/2 (1M52) : TGCCCCCTCACCCTCACGAAGGCATACAGACAGATGGACATCCAGTTGG GA 22. 4. Condiciones de reacción La detección de la secuencia objetivo se midió por un incremento en la señal fluorescente causado por la escisión del sustrato reportero por la MNAzima catalíticamente activa. Las reacciones se iniciaron por la adición del sustrato y el volumen total de todas las reacciones fue 50 µL. Las reacciones se dirigieron a 55°C en un FLUOstar ÓPTIMA (BMG Biotech) . La fluorescencia para cada reacción se leyó cada 2 segundos durante un total de 5 minutos. Todas las reacciones contuvieron 200 nM de XdA4/2-P, 200 nM de XdB5/2-P, Amortiguador II PCR lx (Biosistemas Aplicados) y 25 mM de MgCl2. Además, la reacción contuvo los oligonucleótidos listados en la Tabla 24.

Tabla 24. Reactivos adicionales en las reacciones de la MNAzima . 22. 5. Resultados : Detección y escisión del sustrato reportero S?bBi-2-FB La MNAzima mostró un incremento en la fluorescencia con el paso del tiempo cuando se usó el molde macromolecular de SNP completamente apareado (Reacción A: Figura 23) . En contraste, cuando el molde macromolecular se desapareó (contenido un SNP) , la señal fluorescente no aumentó con el paso del tiempo (Reacción B: Figura 23) . De modo semejante, no hubo incremento en la fluorescencia en la ausencia del oligonucleótido objetivo (Reacción D: Figura 23) . La presencia del oligonucleótido estabilizador se mostró por ser esencial para estabilizar el complejo de la MNAzima. Una reacción que contiene todos los componentes de la reacción incluyendo el objetivo completamente apareado, pero que careció del oligonucleótido estabilizador, no dio incremento en la fluorescencia con el paso del tiempo (Reacción C: Figura 23). Como tal, 5 bases del brazo detector fueron insuficientes para formar un complejo estable de la MNAzima pero la presencia de un oligonucleótido estabilizador podría compensar la corta longitud del brazo detector de la partzima (5 bases) y permitir la formación de la MNAzima estable bajo condiciones de temperatura severas (55°C en este ejemplo). El oligonucleótido estabilizador puede considerarse una tercera partzima en este sistema, como es requerido para la formación de la MNAzima estable Este ejemplo demuestra que las MNAzimas pueden usarse para discriminar entre dos objetivos que difieren por tan poco como un SNP. Además, demuestra la aplicación de las partzimas con brazos detectores truncados, y su uso en combinación con los oligonucleótidos estabilizadores.

Ejemplo 23 : Actividad catalítica de las MNAzimas con sustituciones del ribonucleótido. A diferencia de las ribozimas, las ADNzimas no se han encontrado en la naturaleza. Las ADNzimas son desarrolladas in vi tro de grandes genotecas de oligonucleótidos. La sustitución de ciertos desoxiribonucleótidos por ciertos ribonucleótidos en ribozimas conocidas se ha intentado bajo ciertas condiciones (McCall et al . , 1992). Las ribozimas que se han convertido completamente en ADN no tienen actividad debido a las diferencias de conformación del ARN y del ADN (Perreault et al . , 1990). Estos estudios demuestran que las enzimas de ARN no pueden modificarse en enzimas de ADN operativas meramente reemplazando los ribonucleótidos con desoxiribonucleótidos. Los experimentos se realizaron para investigar la tolerancia de las MNAzimas a la sustitución de ribonucleótidos por desoxiribonucleótidos. 23. 1. Oligonucleótidos de la partzima En este ejemplo, se sintetizaron varias partzimas donde uno o más desoxiribonucleótidos fueron reemplazados con ribonucleótidos dentro de las regiones que constituyen el núcleo catalítico parcial. Las partzimas se sintetizaron que ya sea tuvieron una sustitución de ribonucleótidos sencilla, o que tuvieron la región completa del núcleo catalítico parcial remplazada con ribonucleótidos. Los oligonucleótidos de la partzima A y B tuvieron brazos detectores complementarios para una región del exón 4 del gen RPLPO humano. Los oligonucleótidos de la partzima se listan debajo, 5' a 3' . En las siguientes secuencias las bases subrayadas forman parte del núcleo catalítico de la MNAzima ensamblada, las bases en negritas hibridan para el objetivo y las bases en letras itálicas hibridan para el sustrato. Las bases en letras minúsculas representan las bases de ARN que han reemplazado las bases de ADN. SEC ID NO: 131 partzima A (Control) R04A5 (18) /2-P GGGCTGGTCATCCAGCAGTACAACGAGAGGAAACCTT-P SEC ID NO: 132 partzima B (Control) R04B6 (19) /2-P 27GCGGAGGGAGGCTAGCGTGTTCGAC AATGGC AGC A- P SEC ID NO: 133 Partzima A (ribo-14g) : R04A5 (18) /2-rG14-P GGGCTGGTCATCCAGCAG ACAACgAGAGGAAACCTT™ P SEC ID NO: 134 Partzima A (ribo-9a) : R04A5 (18) /2-rA9-P GGGCTGGTCATCCAGCAGTaCAACGAGAGGAAACC? -P SEC ID NO: 135 Partzima A (ribo x 8) : R04rA5(18; 12 GGGCTGGTCAtCCAGCAGuacaacgaGAGGAAACCrr SEC ID NO: 136 Partzima B (ribo x 7): R04rB6(19! 12 TGCCCAGGGAggc agcGTGTTCGACAATGGCAGCA 23.2. Sustrato reportero El sustrato reportero para este ejemplo fue SubBi-2 con la secuencia, 5' a 3', como se muestra debajo. En el ejemplo actual, SubBi-2 se etiquetó en el extremo con un radical 6-FAM en el extremo 5' y un radical BHQl en el extremo 3' y se designó SubBi-2-FB. La escisión de SubBi-2-FB se monitoreó a 530 nm (longitud de onda de la emisión de FAM) con excitación a 485 nm (longitud de onda de la excitación de FAM) . En la siguiente secuencia las bases en letras minúsculas representan el ARN y las bases en letras mayúsculas representan el ADN. SEC ID NO: 21 SubBi-2-FB: AAGGTTTCCTCguCCCTGGGCA 23.3. Secuencia objetivo El oligonucleótido de ADN sintético se usó como el molde macromolecular objetivo en este experimento. La secuencia del objetivo se muestra debajo, 5' a 3' . SEC ID NO: 8 Objetivo R04/1 GCCATTGTCGAACACCTGCTGGATGACCAGC 23. 4. Condiciones de reacción El análisis de la actividad catalítica de varios pares de partzimas se realizó usando un formador de ciclos térmicos (Cepheid) SmartCycler System. Los volúmenes totales de reacción fueron 25 µL y cada reacción contuvo Maortiguador II PCR IX (Biosistemas Aplicados) , 10 mM de MgCl2, 0.2 µM de SubBi-2-FB, 2 µM de Objetivo R04/1 y un par de partzimas A y B cada una en 2 µM. Los pares de partzimas en cada reacción fueron como en la Tabla 24.

Tabla 24 : Partzimas en varias reacciones.

Las reacciones se incubaron a 5 °C durante 20 minutos y los datos fluorescentes se colectaron en intervalos de 12 segundos. Debido a que la fluorescencia inicial puede variar para pozos individuales en el formador de ciclos térmicos SmartCycler System, el valor de fluorescencia inicial se sustrajo de la fluorescencia en cada punto de tiempo para cada reacción para permitir la comparación entre reacciones en pozos diferentes. 23.5. Resultados : Actividad catalítica de las MNAzimas con sustituciones del ribonucleótido dentro de las secuencias parciales del núcleo catalítico de la partzima . La escisión catalítica del sustrato por las MNAzimas compuestas de los varios pares de partzimas se monitoreó como un cambio en la fluorescencia con el paso del tiempo (Tabla 25) .

Tabla 25: Resultados obtenidos usando varias combinaciones de partzimas.

El experimento muestra que algunas sustituciones del ribonucleótido dentro del núcleo catalítico parcial de las partzimas son compatibles con la formación de la MNAzima activa. Mientras la sustitución sencilla (partzima A (ribo 14g) ) tuvo actividad similar como todas las partzimas de ADN bajo estas condiciones, una sustitución sencilla alternativa (partzima A (ribo9a)), mientras todavía era compatible con la formación de la MNAzima activa, escindió el sustrato en una velocidad más lenta que el control. La MNAzima no toleró la sustitución de todos los nucleótidos en el dominio del núcleo catalítico parcial de ya sea la partzima A y/o la partzima B.

Ejemplo 24 : Activación de una MNAzima por la liberación de una partzima atada como un mecanismo para iniciar una cascada de amplificación de señal . 24. 1. Cascadas de amplificación de señal mediadas por la MNAzima Las MNAzimas pueden usarse para iniciar cascadas de amplificación de señal. Una estrategia para tal cascada de amplificación de señal se ilustra en la Figura 25. En la presencia del objetivo, la MNAzima 1 activa se forma a partir de las partzimas que están libres en la solución. La MNAzima 1 escinde su sustrato atado, Subí, liberando así los componentes de la partzima para la MNAzima 2. Una vez libre, estas partzimas hibridan con el facilitador de ensamble y forman la MNAzima 2 que escinde el sustrato Sub 2. Sub 2 doblemente etiquetado, el cual está libre en la solución, se escinde por la MNAzima 2 y se genera la señal fluorescente. Además, la MNAzima 2 escinde el Sub 2 atado liberando las partzimas, que tienen los mismos brazos detectores como la MNAzima 2 y cuando hibridan para el facilitador de ensamble, forman la MNAzima 3. (El facilitador de ensamble puede estar ya sea atado o puede estar libre en la solución) . Debido a que la MNAzima 3 comparte los mismos brazos del sustrato como la MNAzima 1, también puede escindir el Subí atado, liberando así más componentes de la partzima para la MNAzima 2. Esto resulta en una cascada de generación enzimática de los componentes (partzimas) para más enzimas (MNAzimas) y la amplificación concomitante de la señal. 24.2. Activación de la MNAzima atada capaz de escindir el sustrato etiquetado de manera fluorescente Este ejemplo demuestra la primera etapa de la cascada de amplificación de señal como se ilustra en la Figura 25. En esta etapa inicial, el objetivo se enlaza a las partzimas, las cuales están libres en la solución, y forma una MNAzima 1 activa. La MNAzima 1 escinde su sustrato atado, Sub 1, liberando así los componentes de la partzima para la MNAzima 2. Una vez libre, estas partzimas hibridan con el facilitador de ensamble y forman la MNAzima 2. Sub 2-FQ doblemente etiquetado (específicamente SubBi-3-FB en este ejemplo), el cual está libre en la solución, se escinde por la MNAzima 2 y se genera la señal fluorescente. 24. 3. Oligonucleótidos de la partzima En las siguientes secuencias las bases subrayadas forman parte del núcleo catalítico de la MNAzima ensamblada, las bases en negritas hibridan con el objetivo y las bases en letras i tálicas hibridan para el sustrato. Las bases que están en letras i tálicas y subrayadas representan las secuencias del sustrato que están acopladas a las partzimas que se van a atar. "- P" indica la fosforilación del oligonucleótido y " (Biotin) " indica biotinilación del oligonucleótido. Las bases en letras minúsculas representan el ARN y las bases en letras mayúsculas representan el ADN. Todas las secuencias listadas debajo están escritas 5' a 3' . Las partzimas de la MNAzima 1 libres en la solución se diseñaron para enlazarse específicamente al exón 5 del gen RPLPO humano y las partzimas de la MNAzima 2 atadas se diseñaron para hibridar para el facilitador de ensamble. SEC ID NO: 147 Partzima A4 R05A4/2-P: CAAACGAGTCCTGGCCTTGTCTACAACGAGAGGAAACGGT -P SEC ID NO: 148 Partzima B5 R05B5/2-P: TGCGCAGGGAGGCTAGC GTGGAGACGGATTACACCTTC -P SEC ID NO: 138 Sustrato 1 atado/Partzima A4 R04A4/3-5b: < Bi ° t in ) AAftAAAAAGGrrrCCT guCCCTGGGCAGCTCGTCATCCAQCAG ACAACGAGGT GTGCTG SEC ID NO : 139 Sustrato 1 atado/Partzima B5 R04B5/3-3b : CGGrTGGrGAGGCTAGCTGTGTTCGACAATGGCAAGGTTTCCTCffuCCCrGG GCAAAAAA (Biotin) 24. 4. Sustrato reportero El sustrato reportero (Sub 2; Figura 25) para este ejemplo es SubBi-3 con la secuencia, 5' a 3' , como se muestra debajo. En el ejemplo actual, SubBi-3 se etiquetó en el extremo con un radical 6-FAM en el extremo 5' y un radical BHQl en el extremo 3' y se designó SubBi-3-FB. La escisión de SubBi-3-FB se monitoreó a 516 nm (longitud de onda de la emisión de FAM) con excitación a 492 nm (longitud de onda de la excitación de FAM) . Las bases en letras minúsculas representan el ARN y las bases en letras mayúsculas representan el ADN. SEC ID NO: 31 SubBi-3-FB: CAGCACAACCguCACCAACCG 24. 5. Objetivo sintético y secuencias del Facilitador En las siguientes secuencias, " (Biotin) " indica la biotinilación del oligonucleótido.

SEC ID NO : 140 Facilitador de ensamble R04 /2-3b : GCC TTGTCGAACACCTGCTGGA GACCAGC- (Biotin) SEC ID NO : 141 obj etivo sintético de RPLPO 5 ( R05 ) : GAAGGTGTAATCCGTCTCCACAGACAAGGCCAGGACTCGTTTG 24. 6. Atadura de partzimas biotiniladas a la placa de microtitulación revestida con estreptavidina La atadura de las partzimas biotiniladas y el facilitador de ensamble, se condujo en a temperatura ambiente en un volumen de reacción total de 100 µl . La mezcla de enlace contuvo 200 nM de partzima R04A4/3-5b, 200 nM de partzima RQ4B5/3-3b y 200 nM del facilitador de ensamble R04/2-3b en solución PBS Amressco (sin Ca+y Mg+) . La mezcla de enlace (100 µl) se colocó en alícuotas en cada pozo de la placa de microtitulación revestida de estreptavidina (Roche Diagnostics) . El tiempo de enlace fue 30 minutos, seguido por 3 lavados usando PBS, cada uno con incubación de 15 minutos antes del lavado. 24. 7. Escisión de la MNAzima atada y detección del sustrato etiquetado de manera fluorescente escindido . La escisión del sustrato etiquetado de manera fluorescente, SubBi-3-FB se monitoreó de isotérmicamente a 55°C durante 4 minutos en el fluorómetro FluoStar Óptima (BMG LabTech) en un volumen de reacción total de 100 µL. Las reacciones contuvieron 200 nM de partzima R05A4/2-P, 200 nM de la partzima R05B5/2-P, 200 nM del sustrato SubBi-3-FB, 25 mM de MgCl2, Amortiguador II PCR lx (Biosistemas Aplicados) y 200 nM del objetivo R05 sintético. El agua libre de nucleasa se usó en lugar del objetivo R05 sintético para los controles "no objetivo". La reacción se inició con la adición del sustrato SubBi-3-FB. 24. 8. Resultados : Cambio en el nivel de fluorescencia en la presencia del objetivo ROS versus el control "no objetivo" Hay un incremento en la fluorescencia en la presencia del objetivo R05 comparado con las reacciones que carecen del objetivo (control de agua) . El cambio en la fluorescencia después de 4 minutos fue aproximadamente de 36,000 unidades en la presencia del objetivo, comparado con < 1,000 unidades para el control no objetivo. Esto demuestra la habilidad de la MNAzima 1 (hecha de partzimas R05A4/2-P y R05B5/2-P) para escindir el sustrato atado y liberar las partzimas que reponen la MNAzima 2. Además, demuestra que una vez liberadas, las partzimas pueden formar un complejo de la MNAzima activa con el facilitador de ensamble que es capaz de la escisión del sustrato que conduce a la generación de la señal.

Ejemplo 25: Discriminación directa entre citosinas metiladas y citosinas en ADN. El uso de un brazo estabilizador con una partzima que tiene brazos detectores truncados se usó para demostrar la capacidad de las MNAzimas para detectar polimorfismos sencillos del nucleótido (SNPs) presentes en los facilitadores de ensamble objetivo (ejemplo 22). Bajo la condición experimental usada en ese ejemplo, un brazo detector de cinco bases se usó como una sonda para SNPs a 55°C, muy por encima de su temperatura de fusión esperada. Los sistemas con brazos estabilizadores, y partzimas que tienen brazos detectores truncados, son muy sensitivos a cambios pequeños en el objetivo. Esta estrategia de detección puede extenderse adicionalmente para discriminar directamente entre los objetivos, los cuales están ya sea metilados o no metilados en residuos específicos de citosina, sin la necesidad para la modificación de bisulfito anterior (vea el ejemplo 11) . La presencia de 5-metilcitosina (s) incrementa la temperatura de fusión del ADN por 1.3°C por base metilada, relativa a la(s) citosina (s) no metilada (s). Así, una partzima con, por ejemplo, un brazo detector de cinco nucleótidos de longitud podría ser capaz de enlazar un objetivo que contiene tres 5-metilcitosinas en una temperatura de casi 4°C mayor que lo que sería capaz para enlazar un objetivo no metilado de la misma secuencia. Cuando las partzimas, un brazo estabilizador, y un sustrato se incuban en una temperatura, la cual es adecuada para la hibridación y formación de la MNAzima en la presencia de un objetivo metilado, pero que es demasiado alta para la formación de la MNAzima en la presencia de un objetivo no metilado, se generaría una señal solo en la presencia del objetivo metilado. Esto proporciona una nueva estrategia para el análisis de los patrones de metilación que pueden proporcionar un método para la detección de bases de metilación como marcadores de cáncer y otros padecimientos.

Ejemplo 26: Uso de las MNAzimas para inducir un cambio de color en respuesta a un objetivo Una estrategia para usar las MNAzimas en un formato colorimétrico se ilustra en la Figura 24. En este acercamiento, un sustrato de la MNAzima sería incorporado en un puente de oligonucleótidos. El puente de oligonucleótidos tiene complementariedad para los oligonucleótidos unidos a las partículas de oro. Si no estuviera presente facilitador de ensamble alguno, el puente de oligonucleótidos permanecería intacto y las partículas de oro agregarían volver la reacción azul. Si un facilitador de ensamble, por ejemplo un ácido nucleico objetivo, estuviera presente, entonces las MNAzimas activa se ensamblarían a partir de las partzimas presentes en la solución, y escindirían el sustrato (y por lo tanto el puente de oligonucleótidos) . Esto conduciría a la dispersión de los agregados de las partículas de oro que a su vez causarían un cambio en el color de azul a rojo. Esta estrategia de la MNAzima proporciona un sistema que incorpora varios componentes genéricos, y como tal, proporciona un método que puede adaptarse rápidamente para cualquier nuevo objetivo. Esto proporciona una ventaja sobre otros sistemas que usan ADNzimas y partículas de oro que requieren moléculas más complejas. En esta estrategia de la MNAzima, el sustrato de la MNAzima y las partículas de oro con oligonucleótidos unidos podrían ser genéricos y usarse para el análisis cualquier objetivo de ácido nucleico. Los nuevos sistemas analíticos meramente requerirían la síntesis de nuevas partzimas con brazos detectores complementarios para el nuevo objetivo. Además, la reacción colorimétrica también puede usarse en conjunción con los sistemas de MNAzima sensitivos para la activación mediante ácidos nucleicos, proteínas u otros objetivos .

REFERENCIAS Patentes y Solicitudes de Patentes : Publicación Internacional de PCT No. WO 99/45146 Publicación Internacional de PCT No. IB99/00848 Publicación Internacional de PCT No. WO 99/50452 Publicación Internacional de PCT No. WO 00/58505 Solicitud de PCT/US96/02380 ("Asher") Patente Estadounidense No. 4,683,202 Patente Estadounidense No. 4,683,195 Patente Estadounidense No. 4,000,159 Patente Estadounidense No. 5,176,995 Patente Estadounidense No. 4,965,188 Patente Estadounidense No. 6,140,055 Patente Estadounidense No. 6,201,113 Otras Referencias : Achenbach, J. , Nutiu, R. and Li, Y. (2005) Structure-switching allosteric deoxyribozymes . Analytica Chimica Acta. 534(1): 41-51. Adams, J. (1992) Biotin amplification of biotin and horseradish peroxidase signáis in histochemical stains. J Histochem Cytochem. Oct;40(10): 1457-63. Bobrow, M., Harris, T., Shaughnessy, K. and Litt, G. (1989) Catalyzed repórter deposition, a novel method of signal amplification . Application to immunoassays . J Immunol Methods. Dec 20(125(1-2)): 279-85. Breaker, R. (1997) DNA enzymes. Nat Biotech. 15: 427-431. Breaker, R.R. and Joyce, G.F. (1994) A DNA enzyme that cleaves RNA. Chem Biol. Dec; 1(4): 223-9. Brown, A., Li, J. , Pavot, C. and Lu, Y. (2003) A lead-dependent DNAzyme with a two- step mechanism. Biochem. Jun 17;42 (23) : 7152-61. Cairns, M., King, A. and Sun, L. (2000) Nucleic acid mutation analysis using catalytic DNA. Nucí Acids Res. 28(3) : e9. Cairns, M. , King, A. and Sun, L. (2003) Optimisation of the 10-23 DNAzyme-substrate pairing interactions enhanced RNA cleavage activity at purine-cytosine target sites. Nucí Acids Res. Jun 1;31(11): 2883-9. Carmi, N., Shultz, L. A. and Breaker, R.R. (1996) In vitro selection of self-cleaving DNAs . Chem Biol. 3(12): 1039-46. Chehab, F.F., Doherty, M., Cai, S.P., Kan, Y. W., Cooper, S. and Rubín, E.M. (1987) Detection of sickle cell anaemia and thalassaemias [letter] [published erratum appears in Nature 1987 Oct 22-28 ; 329 ( 6141) : 678] . Nature. 329(6137) : 293-4. Chen, C, Ridzon, D. , Broomer, A., Zhou, H., Barbisn, M., Lao, K. and Livak, K. (2005) MicroRNA quantitation by looped RT-PCR. AACR. poster. Cheng, S., Merlino, G.T. and Pastan (1993) A versatile method for coupling of proteins to DNA: synthesis of a2-macroglobin-DNA conjugates. Nucleic Acid Research: 11, 659-669. Compton, J. (1991) Nucleic acid sequence-based amplification. Nature. 350(6313): 91-2. Cruz, R.P., Withers, J.B. and Li, Y. (2004) Dinucleotide junction cleavage versatility of 8-17 deoxyribozyme . Chem Biol. Jan;l 1(1): 57-67. Cuenoud, B. and Szostak, J.W. (1995) A DNA metalloenzyme with DNA ligase activity. Nature. 375(6532): 611-4. Eigen, M. and Rigler, R. (1994) Sorting single molecules: application to diagnostics and evolutionary biotechnology. Proc Nati Acad Sci U S A. 91(13): 5740-7. Elghanian, R., Storhoff, J. , Mucic, R. , Letsinger, R. and Mirkin, C. (1997) Selective colorimetric detection of polynucleotides based on the distance-dependent optical properties of gold nanoparticles .

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Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN
Habiéndose descrito la presente se considera como novedad, y por lo tanto, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes:
REIVINDICACIONES 1. Una composición que comprende al menos dos o más componentes oligonucleótidos caracterizada porque al menos un primer componente oligonucleótido y un segundo componente oligonucleótido se auto-ensamblan en la presencia de un facilitador de ensamble de MNAzima para formar una enzima de ácidos nucleicos multicomponente catalíticamente activa (MNAzima) , en donde cada uno de dicho al menos primero y dicho segundo componentes oligonucleótidos comprenden una porción del brazo del sustrato, una porción del núcleo catalítico, y una porción del brazo detector; en donde sobre el auto-ensamble, la porción del brazo detector de dicho primer y segundo componentes oligonucleótídos actúa como los brazos detectores de la MNAzima, la porción del brazo del sustrato del primer y segundo componentes oligonucleótidos actúa como los brazos del sustrato de la MNAzima, y la porción del núcleo catalítico del primer y segundo componentes oligonucleótidos actúa como un núcleo catalítico de la MNAzima; y en donde los brazos detectores de la MNAzima interactúan con dicho facilitador de ensamble de MNAzima para mantener el primer y segundo componentes oligonucleótido en proximidad para la asociación de sus porciones del núcleo catalítico respectivas para formar el núcleo catalítico de la MNAzima, dicho núcleo catalítico capaz de modificar al menos un sustrato, y en donde dichos brazos del sustrato de dicha MNAzima enlazan un sustrato a fin de que dicho núcleo catalítico de dicha MNAzima pueda modificar dicho sustrato. 2. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque al menos uno de dichos componentes oligonucleótidos, facilitador de ensamble o sustrato está comprendido de ADN o un análogo del mismo. 3. La composición de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizada porque dicho facilitador de ensamble es un objetivo a ser identificado, detectado o cuantificado.
4. La composición de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque dicho objetivo es un ácido nucleico.
5. La composición de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque dicho ácido nucleico se selecciona del grupo que comprende de ADN, ADN metilado, ADN alquilado, ARN, ARN metilado, microARN, ARNsi, ARNsh, ARNt, ARNm, ARNsno, ARNst, ARNsm, pre- y pri-microARN, otros ARNs de no codificación, ARN ribosómico, derivados de los mismos, amplicones, o cualquier combinación de los mismos .
6. La composición de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque dicho ARN ribosómico es ARN ribosómico 16S.
7. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 4-6, caracterizada porque la fuente del ácido nucleico se selecciona del grupo que comprende de sintético, mamífero, humano, animal, planta, fúngico, bacteriano, viral, bacterias archaelicas o cualquier combinación de los mismos.
8. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 4-6, caracterizada porque dicho ácido nucleico se amplifica.
9. La composición de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque dicha amplificación comprende una o más de: reacción de cadena de polimerasa (PCR), amplificación de desplazamiento de la hebra (SDA), amplificación de isoterma mediada por lazo (LAMP) , amplificación del círculo de enrollamiento (RCA) , amplificación mediada por la transcripción (TMA) , replicación de secuencia auto-sostenida (3SR) , amplificación basada en la secuencia de ácidos nucleicos (NASBA) , o reacción de cadena de la polimerasa de transcripción inversa (RT-PCR) .
10. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-9, caracterizada porque comprende además al menos un tercer componente oligonucleótido que actúa para estabilizar al menos una de dichas porciones del brazo del sustrato o porciones del brazo detector.
11. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-10, caracterizada porque al menos uno de dicho facilitador de ensamble, dichos componentes oligonucleótido o sustrato o una combinación de los mismos está comprendido de más que una molécula.
12. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-11, caracterizada porque las porciones del núcleo catalítico del primer componente oligonucleótido se seleccionan del grupo que comprende de SEC ID NOs 149 - 153, 155 - 157, 159 y 161, y las porciones del núcleo catalítico del segundo componente oligonucleótido se seleccionan del grupo que comprende de SEC ID NOs 166 - 170 y 172.
13. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-12, caracterizada porque comprende además al menos un inhibidor de dicho auto-ensamble de dicha MNAzima.
14. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-13, caracterizada porque al menos uno de dichos componentes oligonucleótido o facilitador de ensamble o sustrato o una combinación de los mismos comprende además al menos un aptámero o porción del mismo.
15. La composición de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque dicho aptámero o porción del mismo está comprendida al menos uno de ácido nucleico, péptido, polipéptido o proteína o un derivado o combinación de los mismos.
16. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-15, caracterizada porque comprende además al menos un inhibidor de dicho auto-ensamble de dicha MNAzima.
17. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-16, caracterizada porque al menos uno de dicho primer o dicho segundo componentes oligonucleótido o dicho facilitador de ensamble o dicho sustrato comprende además al menos una porción de la secuencia auto-complementaria capaz de formar una estructura de horquilla.
18. La composición de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada porque dicha estructura de horquilla inhibe el auto-ensamble de dicha MNAzima.
19. La composición de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada porque dicha inhibición del auto-ensamble se remueve sobre el contacto de un aptámero con un objetivo.
20. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 14-19, caracterizada porque dicho aptámero, o porción del mismo, enlaza un objetivo seleccionado del grupo que comprende de ácidos nucleicos, proteínas, glicoproteínas, lípidos, lipoproteínas, células, virus, bacterias, archaea, hongos, anticuerpos, metabolitos, patógenos, toxinas, contaminantes, venenos, moléculas pequeñas, polímeros, iones metálicos, sales metálicas, priones o cualquier derivado, porción o combinación de los mismos.
21. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-20, caracterizada porque dicho sustrato es un ácido nucleico o una proteína.
22. La composición de conformidad con la reivindicación 21, caracterizada porque dicho ácido nucleico comprende al menos uno de un ácido nucleico etiquetado, ARN, ADN, análogos de ácido nucleico, ácido nucleico peptídico, ácido nucleico unido, quimera péptido-ácido nucleico, o cualquier combinación de los mismos.
23. La composición de conformidad con la reivindicación 21, caracterizada porque dicha proteína comprende al menos uno de un anticuerpo, polipéptido, glicoproteína, lipoproteína, o cualquier combinación de los mismos .
24. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-23, caracterizada porque dicho sustrato comprende además al menos una nanopartícula o micropartícula, o combinación de las mismas.
25. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-24, caracterizada porque dichos brazos del sustrato enlazan dicho sustrato a través del apareamiento de bases complementarias.
26. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-25, caracterizada porque dicho sustrato está unido a un soporte insoluble o está libre en la solución.
27. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-26, caracterizada porque dicho sustrato comprende una porción detectable y una porción del hibridizador por apagado, en donde sobre la modificación de dicho sustrato por dicha MNAzima, aumenta o disminuye un efecto detectable proporcionado por dicha porción detectable.
28. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-27, caracterizada porque dicha modificación de dicho sustrato por dicha MNAzima proporciona un efecto detectable.
29. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-28, caracterizada porque dicha modificación de dicho sustrato se selecciona del grupo que comprende de escisión, ligación, metalación de porfirina, formación de enlaces carbono-carbono, enlaces éster o enlaces amida, o cualquier combinación de los mismos.
30. La composición de conformidad con la reivindicación 27, 28 o 29, caracterizada porque dicho efecto detectable se detecta por espectroscopia de fluorescencia, resonancia de plasmón superficial, espectroscopia de masa, NMR, resonancia de giro del electrón, espectroscopia de fluorescencia de polarización, dicroísmo circular, inmunoensayo, cromatografía, radiometría, fotometría, graficado por centelleo, métodos electrónicos, UV, luz visible o espectroscopia infra roja, métodos enzimáticos o cualquier combinación de los mismos.
31. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 27-30, caracterizada porque se mide dicho efecto detectable y en donde la magnitud de dicha medición es indicativa de la cantidad de un objetivo.
32. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-31, caracterizada porque al menos uno de dichos componentes oligonucleótido, dicho facilitador de ensamble o dicho sustrato se selecciona del grupo que comprende de ADN, ARN, análogos de ácido nucleico, ácidos nucleicos peptídicos, ácidos nucleicos unidos, quimeras péptido-ácido nucleico, o una combinación de los mismos.
33. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-32, caracterizada porque dicho facilitador de ensamble y dicho sustrato son ácidos nucleicos que son completamente o parcialmente complementarios para al menos parte de dicho primer o segundo componentes oligonucleótido.
34. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-34, caracterizada porque al menos uno de dichos componentes oligonucleótido, dicho facilitador de ensamble o dicho sustrato comprende al menos una sustitución o adición del nucleótido seleccionada del grupo que comprende de 4-acetilcitidina, 5- (carboxihidroxilmetil) uridina, 2 ' -O-metilcitidina, 5-carboximetilaminometil tiouridina, díhidrouridina, 2 ' -0-metilpseudouridina, beta D-galactosilqueosina, 2 ' -0-metilguanosina, inosina, N6-isopenteniladenosina, 1-metiladenosina, 1-metilpseudouridina, 1-metilguanosina, 1-nietilinosina, 2 , 2-dimetilguanosina, 2- metiladenosina, 2-metilguanosina, 3-metilcitidina, 5-metilcitidina, N6-metiladenosina, 7-metilguanosina, 5-metilaminometiluridina, 5-metoxiaminometil-2-tiouridina, beta D-manosilmetiluridina, 5-metoxicarbonilmetiluridina, 5-metoxiuridina, 2-metiltio-N6-isopenteniladenosina, N-((9-beta-ribofuranosil-2-metiltiopurina-6-il) carbamoil) treonina, N- ( ( 9-beta-ribofuranosilpurina-6-il) N-metil-carbamoil) treonina, metil éster del ácido uridina-5-oxiacético, ácido (v) uridina-5-oxiacético, wibutoxosina, pseudouridina, queosina, 2-tiocitidina, 5-metil-2-tiouridina, 2-tiouridina, 4-tiouridina, 5-metiluridina, N- ( (9-beta-D-ribofuranosilpurina-6-il) carbamoil) treonina, 2 ' -O-metil-5-metiluridina, 2 ' -0-metiluridina, wibutosina, 3- (3-amino-3-carboxipropil) uridina, beta D-arabinosil uridina, beta D-arabinosil timidina.
35. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-34, caracterizada porque comprende además al menos un tercer componente oligonucleótido y un cuarto componente oligonucleótido que se auto-ensamblan en la presencia de al menos un facilitador de ensamble adicional para formar al menos una MNAzima catalíticamente activa adicional, en donde cada uno de dichos al menos tercer y cuarto componentes oligonucleótido comprenden una porción del brazo del sustrato, una porción del núcleo catalítico, y una porción del brazo detector; en donde sobre el auto-ensamble de al menos un tercer componente oligonucleótido y un cuarto componente oligonucleótido, la porción del brazo detector de dicho al menos tercer y dicho al menos cuarto componentes oligonucleótido forma los brazos detectores de dicha al menos una MNAzima catalíticamente activa adicional, la porción del brazo del sustrato de dicho al menos tercer y dicho al menos cuarto componentes oligonucleótido forma los brazos del sustrato de dicha al menos una MNAzima catalíticamente activa adicional, y la porción del núcleo catalítico de dicho al menos tercer y dicho al menos cuarto componentes oligonucleótido forma un núcleo catalítico de dicha al menos una MNAzima catalíticamente activa adicional; y en donde los brazos detectores de dicha al menos una MNAzima adicional interactúan con dicho al menos un facilitador de ensamble adicional para mantener dicho al menos tercer y dicho al menos cuarto componentes oligonucleótido en proximidad para la asociación de sus porciones del núcleo catalítico respectivas para formar el núcleo catalítico de dicha al menos una MNAzima adicional, dicho núcleo catalítico capaz de actuar sobre al menos un sustrato adicional, y en donde los brazos del sustrato de dicha al menos una MNAzima adicional enlazan al menos un sustrato adicional a fin de que el núcleo catalítico de dicha al menos una MNAzima adicional pueda actuar sobre dicho al menos un sustrato adicional.
36. La composición de conformidad con la reivindicación 35, caracterizada porque cada uno de los sustratos adicionales es el mismo, diferente o una combinación de los mismos.
37. Un método para detectar la presencia de al menos un facilitador de ensamble, caracterizado porque comprende (a) proporcionar dos o más componentes oligonucleótido, en donde al menos un primer componente oligonucleótido y un segundo componente oligonucleótido se auto-ensamblan en la presencia de un facilitador de ensamble para formar al menos una enzima de ácidos nucleicos multicomponente catalíticamente activa (MNAzima) ; (b) contactar los dos o más componentes oligonucleótido con una muestra que contiene de manera putativa el facilitador de ensamble bajo condiciones que permiten: (1) el auto-ensamble de dicha al menos una MNAzima catalíticamente activa, y (2) la actividad catalítica de dicha MNAzima; y (c) determinar la presencia de la actividad catalítica de dicha al menos una MNAzima, en donde la presencia de la actividad catalítica es indicativa de la presencia de dicho al menos un facilitador de ensamble.
38. El método de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado porque el auto-ensamble de la MNAzima requiere el contacto del facilitador de ensamble con uno o ambos de dichos primero y segundo componentes oligonucleótido .
39. El método de conformidad con la reivindicación 37 o 38, caracterizado porque comprende además proporcionar al menos un tercer componente oligonucleótido que contacta al menos una porción de cualquiera o ambos del primer y segundo componentes oligonucleótido para auto-ensamblar la MNAzima.
40. El método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque dicho tercer componente oligonucleótido está comprendido de más que una molécula .
41. Un método para detectar la presencia de al menos un facilitador de ensamble, caracterizado porque comprende (a) proporcionar dos o más componentes oligonucleótido, en donde al menos un primer componente oligonucleótido y un segundo componente oligonucleótido se auto-ensamblan en la presencia de al menos un primer facilitador de ensamble para formar al menos una primera enzima de ácidos nucleicos multicomponente catalíticamente activa (MNAzima) ; (b) proporcionar al menos un primer sustrato, dicho primer sustrato capaz de ser modificado por dicha primera MNAzima, en donde dicha modificación de dicho sustrato por dicha MNAzima proporciona un efecto detectable; (c) contactar dichos dos o más componentes oligonucleótido con una muestra que contiene de manera putativa dicho al menos primer facilitador de ensamble bajo condiciones que permiten: (1) el auto-ensamble de dicha al menos primera MNAzima, y (2) la actividad catalítica de dicha al menos primera MNAzima; y (d) detectar dicho efecto detectable.
42. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 37-41, caracterizado porque al menos uno de dichos componentes oligonucleótido, facilitador de ensamble o sustrato está comprendido de ADN o un análogo del mismo.
43. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 37-41, caracterizado porque dicho facilitador de ensamble es un objetivo a ser identificado, detectado o cuantificado.
44. El método de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado porque dicho objetivo es un ácido nucleico.
45. El método de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque dicho ácido nucleico se selecciona del grupo que comprende de ADN, ADN metilado, ADN alquilado, ARN, ARN metilado, microARN, ARNsi, ARNsh, ARNt, ARNm, ARNsno, ARNst, ARNsm, pre- y pri-microARN, otros ARNs de no codificación, ARN ribosómico, derivados de los mismos, amplicones, o cualquier combinación de los mismos.
46. El método de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado porque dicho ARN ribosómico es ARN ribosómico 16S.
47. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 44 - 46, caracterizado porque la fuente del ácido nucleico se selecciona del grupo que comprende de sintético, mamífero, humano, animal, planta, fúngico, bacteriano, viral, bacterias archaelicas o cualquier combinación de los mismos.
48. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 37-47, caracterizado porque comprende además una etapa de amplificar el ácido nucleico.
49. El método de conformidad con la reivindicación 48, caracterizado porque la etapa de amplificación comprende uno o más: reacción de cadena de polimerasa (PCR), amplificación de desplazamiento de la hebra (SDA) , amplificación de isoterma mediada por lazo (LAMP) , amplificación del círculo de enrollamiento (RCA) , amplificación mediada por la transcripción (TMA) , replicación de secuencia auto-sostenida (3SR) , amplificación basada en la secuencia de ácidos nucleicos (NASBA) , o reacción de cadena de la polimerasa de transcripción inversa (RT-PCR) .
50. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 37-49, caracterizado porque al menos uno de dicho facilitador de ensamble, dicho primer o segundo componentes oligonucleótido o sustrato o combinación de los mismos está comprendido de más que una molécula.
51. El método de conformidad con la reivindicación 48, caracterizado porque comprende además detectar dicho efecto detectable durante o después de dicha amplificación .
52. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 37-51, caracterizado porque dicho efecto detectable es indicativo de la presencia de dicho facilitador de ensamble.
53. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 37-52, caracterizado porque dicho efecto detectable se mide cuantitativamente o cualitativamente .
54. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 37-53, caracterizado porque dicho sustrato es un ácido nucleico o una proteína.
55. El método de conformidad con la reivindicación 54, caracterizado porque dicho ácido nucleico comprende al menos uno de un ácido nucleico etiquetado, ARN, ADN, análogo de ácido nucleico, ácido nucleico peptídico, ácido nucleico unido, quimera péptido-ácido nucleico, o cualquier combinación de los mismos.
56. El método de conformidad con la reivindicación 54, caracterizado porque dicha proteína comprende al menos uno de un anticuerpo, polipéptido, glicoproteína, lipoproteína, o cualquier combinación de los mismos .
57. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 37-56, caracterizado porque dicho sustrato comprende además al menos una de una nanopartícula o micropartícula o combinación de las mismas.
58. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 54-57, caracterizado porque dicho sustrato es un ácido nucleico y en donde dichos brazos del sustrato enlazan dicho sustrato a través del apareamiento de bases complementarias.
59. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 37-58, caracterizado porque el sustrato comprende una porción detectable y una porción del hibridizador por apagado, en donde sobre la modificación del sustrato por la MNAzima, aumenta o disminuye un efecto detectable proporcionado por dicha porción detectable.
60. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 37-59, caracterizado porque dicho sustrato está unido a un soporte insoluble o está libre en la solución.
61. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 37-60, caracterizado porque dicho efecto detectable se detecta por espectroscopia de fluorescencia, resonancia de plasmón superficial, espectroscopia de masa, NMR, resonancia de giro del electrón, espectroscopia de fluorescencia de polarización, dicroísmo circular, inmunoensayo, cromatografía, radiometría, fotometría, graficado por centelleo, métodos electrónicos, UV, luz visible o espectroscopia infra roja, métodos enzimáticos o cualquier combinación de los mismos.
62. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 37-61, caracterizado porque comprende además amplificar el efecto detectable por el uso de una cascada de amplificación del efecto detectable.
63. El método de conformidad con la reivindicación 62, caracterizado porque la cascada de amplificación del efecto detectable comprende una o más de una cascada de ribozima/ligasa, una cascada de enzima de ácido nucleico circular, una cascada de enzima de proteína, o una o más enzimas unidas a un soporte, o cualquier combinación de las mismas.
64. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 37-63, caracterizado porque dicha modificación de dicho sustrato se selecciona del grupo que comprende de escisión, ligación, metalación de porfirina, formación de enlaces carbono-carbono, enlaces éster o enlaces amida.
65. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 37-64, caracterizado porque comprende además proporcionar al menos un tercer y cuarto componentes oligonucleótido, en donde dicho al menos tercer y al menos cuarto componentes oligonucleótido son capaces de auto-ensamblarse en la presencia de al menos un facilitador de ensamble adicional para formar al menos una MNAzima catalíticamente activa adicional, y en donde al menos un sustrato adicional está presente en la muestra, dicho sustrato adicional es capaz de ser modificado solo por la MNAzima adicional, en donde dicha modificación proporciona dicho efecto detectable adicional.
66. El método de conformidad con la reivindicación 76, caracterizado porque dicho al menos un efecto detectable adicional es detectable independientemente .
67. El método de conformidad con la reivindicación 65 o 66, caracterizado porque al menos uno de cada sustrato adicional está unido a un soporte insoluble a fin de que solo una de una porción detectable y una porción del hibridizador por apagado del sustrato adicional permanezca unida al soporte cuando dicho sustrato adicional se modifica por dicha MNAzima adicional.
68. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 65-67, caracterizado porque un sustrato adicional está unido a al menos un soporte insoluble a fin de que se produzca un efecto detectable cuando ese sustrato se modifique por su MNAzima respectiva.
69. Un método para detectar la presencia de al menos un objetivo caracterizado porque comprende (a) proporcionar dos o más componentes oligonucleótido en donde al menos un primer componente oligonucleótido y al menos un segundo componente oligonucleótido son capaces de auto-ensamblarse en la presencia de dicho objetivo para formar una enzima de ácidos nucleicos multicomponente catalíticamente activa (MNAzima) ; y en donde al menos uno de dicho primer y dicho segundo componentes oligonucleótido comprende además al menos una porción del aptámero; (b) contactar dichos componentes oligonucleótido con una muestra que contiene de manera putativa dicho al menos un objetivo bajo condiciones que permiten: (1) el enlace de dicho objetivo a dichas porciones del aptámero y (2) la actividad catalítica de la MNAzima; y (c) determinar la presencia de la actividad catalítica de la MNAzima, en donde la presencia de la actividad catalítica es indicativa de la presencia de dicho objetivo .
70. El método de conformidad con la reivindicación 69, caracterizado porque dicho objetivo debe ser identificado, detectado o cuantificado .
71. Un método para detectar la presencia de al menos un objetivo caracterizado porque comprende (a) proporcionar dos o más componentes oligonucleótido en donde al menos un primer componente oligonucleótido y un segundo componente oligonucleótido son capaces de auto-ensamble en la presencia de al menos un facilitador de ensamble y dicho al menos un objetivo para formar al menos una enzima de ácidos nucleicos multicomponente catalíticamente activa (MNAzima) ; y en donde al menos uno de dicho primer o dicho segundo componentes oligonucleótido o dicho al menos un facilitador de ensamble comprende además al menos un aptámero o porción del mismo y en donde dicho objetivo es capaz de enlazar dicho al menos un aptámero o porción del mismo; (b) proporcionar al menos un inhibidor de dicho auto-ensamble de dicha MNAzima (c) contactar dichos componentes oligonucleótido, facilitador de ensamble y dicho inhibidor con una muestra que contiene de manera putativa dicho al menos un objetivo bajo condiciones que permiten: (1) el enlace de dicho objetivo a dicho al menos un aptámero o porción del mismo y (2) la actividad catalítica de dicha al menos una MNAzima; y (3) la remoción de dicha inhibición de dicho auto-ensamble de dicha MNAzima catalíticamente activa; y (d) determinar la presencia de la actividad catalítica de dicha MNAzima, en donde la presencia de dicha actividad catalítica es indicativa de la presencia de dicho objetivo .
72. El método de conformidad con la reivindicación 71, caracterizado porque dicho aptámero o porción del mismo está comprendida de al menos uno de ácido nucleico, péptido, polipéptido o proteína o un derivado o combinación de los mismos.
73. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 69-72, caracterizado porque comprende además proporcionar un sustrato que pueda modificarse por dicha MNAzima para proporcionar un efecto detectable
74. El método de conformidad con la reivindicación 73, caracterizado porque dicha modificación se selecciona del grupo que comprende de escisión, ligación, metalación de porfirina, formación de enlaces carbono-carbono, enlaces éster o enlaces amida.
75. El método de conformidad con la reivindicación 73, caracterizado porque dicho sustrato no se modifica por dicho primer o segundo componentes oligonucleótido individualmente o por ambos dicho primer y segundo componentes oligonucleótido en la ausencia de dicho facilitador de ensamble y dicho objetivo.
76. Un método para detectar la presencia de al menos un objetivo caracterizado porque comprende (a) proporcionar dos o más componentes oligonucleótido en donde al menos un primer componente oligonucleótido y un segundo componente oligonucleótido son capaces de auto-ensamblarse en la presencia al menos un primer facilitador de ensamble y dicho al menos un primer objetivo para formar al menos una primera enzima de ácidos nucleicos multicomponente catalíticamente activa (MNAzima) ; (b) proporcionar al menos un primer sustrato, dicho primer sustrato capaz de ser modificado por dicha al menos primera MNAzima, en donde dicha modificación de dicho sustrato por dicha MNAzima proporciona un efecto detectable; (c) en donde al menos uno de dicho primer o dicho segundo componentes oligonucleótido o dicho al menos un primer facilitador de ensamble o dicho al menos un primer sustrato comprende además un aptámero y en donde dicho objetivo es capaz de enlazar al menos una porción de dicho aptámero, proporcionando al menos un primer inhibidor que es capaz de inhibir dicho auto-ensamble de dicha MNAzima catalíticamente activa en la ausencia de dicho objetivo; (d) contactar dichos componentes oligonucleótido, dicho facilitador de ensamble, dicho sustrato, y dicho inhibidor con una muestra que contiene de manera putativa dicho objetivo bajo condiciones que permiten: (1) el enlace de dicho objetivo a dicho aptámero y (2) la remoción de dicha inhibición de dicho auto-ensamble de dicha MNAzima catalíticamente activa (3) la actividad catalítica de la MNAzima; y (e) determinar la presencia de dicho efecto detectable detectando así la presencia de dicho objetivo.
77. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 69-76, caracterizado porque al menos uno de dichos componentes oligonucleótido o facilitador de ensamble está comprendido de ADN o un análogo del mismo.
78. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 69-77, caracterizado porque dicho aptámero, o porción del mismo, enlaza un objetivo seleccionado del grupo que comprende de ácidos nucleicos, proteínas, glicoproteínas, lípidos, lipoproteínas, células, virus, bacterias, archaea, hongos, anticuerpos, metabolitos, patógenos, toxinas, contaminantes, venenos, moléculas pequeñas, polímeros, iones metálicos, sales metálicas, priones o cualquier derivado, porción o combinación de los mismos.
79. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 69-78, caracterizado porque al menos uno de dichos componentes oligonucleótido, facilitador de ensamble, sustrato, o inhibidor está unido a un soporte insoluble .
80. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 71-79, caracterizado porque al menos uno de dichos componentes oligonucleótido, facilitador de ensamble, aptámero o porción de aptámero comprende además dicho inhibidor.
81. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 69-80, caracterizado porque dicho aptámero o porción del mismo está comprendida de al menos uno de ácido nucleico, péptido, polipéptido o proteína o un derivado o combinación de los mismos.
82. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 71-81, caracterizado porque al menos uno de dicho primer o dicho segundo componentes oligonucleótido, facilitador de ensamble o sustrato comprende además una porción de la secuencia auto-complementaria capaz de formar una estructura de horquilla.
83. El método de conformidad con la reivindicación 82, caracterizado porque dicha estructura de horquilla inhibe el auto-ensamble de dicha MNAzima catalíticamente activa.
84. El método de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado porque dicha inhibición del auto-ensamble de dicha MNAzima catalíticamente activa se remueve sobre el contacto de dicho aptámero o porción del aptámero con el objetivo.
85. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 71-84, caracterizado porque dicho inhibidor es capaz de enlazar al menos uno del grupo que comprende de dicho aptámero o porción del mismo.
86. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 71-85, caracterizado porque dicho inhibidor se selecciona del grupo que comprende de ARN, ADN, análogos de ácido nucleico, ácidos nucleicos peptídicos, ácidos nucleicos unidos, quimeras péptido-ácido nucleico, o una combinación de los mismos.
87. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 73-86, caracterizado porque dicho sustrato es un ácido nucleico o una proteína.
88. El método de conformidad con la reivindicación 87, caracterizado porque dicho ácido nucleico comprende al menos uno de un ácido nucleico etiquetado, ARN, ADN, análogos de ácido nucleico, ácido nucleico peptídico, ácido nucleico unido, quimera péptido-ácido nucleico, o cualquier combinación de los mismos.
89. El método de conformidad con la reivindicación 87, caracterizado porque dicha proteína comprende al menos uno de un anticuerpo, polipéptido, glicoproteína, lipoproteína, o cualquier combinación de los mismos .
90. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 73-89, caracterizado porque dicho sustrato comprende además al menos una nanopartícula o micropartícula o combinación de las mismas.
91. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 73-90, caracterizado porque dicho efecto detectable se mide cuantitativamente o cualitativamente.
92. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 73-91, caracterizado porque dicho efecto detectable se detecta por espectroscopia de fluorescencia, resonancia de plasmón superficial, espectroscopia de masa, NMR, resonancia de giro del electrón, espectroscopia de fluorescencia de polarización, dicroísmo circular, inmunoensayo, cromatografía, radiometría, fotometría, graficado por centelleo, métodos electrónicos, UV, luz visible o espectroscopia infra roja, métodos enzimáticos o cualquier combinación de los mismos.
93. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 73-92, caracterizado porque dicho sustrato comprende una porción detectable y una porción del hibridizador por apagado, en donde sobre la modificación de dicho sustrato por dicha MNAzima, aumenta o disminuye un efecto detectable proporcionado por dicha porción detectable.
94. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 73-93, caracterizado porque dicha modificación se selecciona del grupo que comprende de escisión, ligación, metalación de porfirina, formación de enlaces carbono-carbono, enlaces éster o enlaces amida.
95. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 71-94, caracterizado porque comprende además proporcionar al menos un tercer y cuarto componentes oligonucleótido, en donde dicho al menos tercer y al menos cuarto componentes oligonucleótido son capaces de auto-ensamblarse en la presencia de al menos un facilitador de ensamble adicional y al menos un objetivo adicional para formar al menos una MNAzima catalíticamente activa adicional, y en donde al menos un sustrato adicional está presente en la muestra, dicho sustrato adicional es capaz de ser modificado por la MNAzima adicional, en donde dicha modificación proporciona un efecto detectable adicional; y en donde al menos uno de dicho tercer o cuarto componentes oligonucleótido o dicho facilitador de ensamble adicional o dicho sustrato adicional comprende además al menos un aptámero adicional que enlaza dicho al menos un objetivo adicional; en donde al menos una molécula del inhibidor adicional contacta una porción de dicho aptámero adicional, inhibiendo así dicho auto-ensamble de dicha MNAzima catalíticamente activa adicional en la ausencia de dicho objetivo adicional; y en donde dicho al menos un facilitador de ensamble adicional contacta al menos una porción de dichos componentes oligonucleótido adicionales.
96. El método de conformidad con la reivindicación 95, caracterizado porque dicho al menos un efecto detectable adicional es detectable independientemente .
97. El método de conformidad con la reivindicación 95 o 96, caracterizado porque cada uno de los sustratos adicionales es el mismo, diferente o una combinación de los mismos.
98. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 95-97, caracterizado porque al menos uno de cada sustrato adicional está unido a un soporte insoluble a fin de que solo una de una porción detectable y una porción del hibridizador por apagado del sustrato adicional permanezca unida al soporte cuando dicho sustrato adicional se modifica por dicha MNAzima adicional.
99. Un método para detectar la presencia de al menos una variante de la secuencia de ácidos nucleicos caracterizado porque comprende (a) proporcionar dos o más componentes oligonucleótido, en donde al menos un primer componente oligonucleótido y un segundo componente oligonucleótido se auto-ensamblan en la presencia de una variante de la secuencia de un ácido nucleico para formar una enzima de ácidos nucleicos multicomponente catalíticamente activa (MNAzima) ; (b) proporcionar al menos un sustrato, dicho sustrato capaz de ser modificado por dicha primera MNAzima, en donde dicha modificación de dicho sustrato por dicha MNAzima proporciona un efecto detectable; (c) contactar los dos o más componentes oligonucleótido con una muestra que contiene de manera putativa dicha variante de la secuencia bajo condiciones que permiten: (1) el auto-ensamble de dicha MNAzima catalíticamente activa, y (2) la actividad catalítica de dicha MNAzima; y (d) determinar la presencia de dicho efecto detectable detectando así la presencia de dicha al menos una variante de la secuencia.
100. El método de conformidad con la reivindicación 99, caracterizado porque la variante de la secuencia se selecciona del grupo que comprende de polimorfismos sencillos del nucleótido, polimorfismos del nucleótido múltiples, inserciones, eliminaciones, duplicaciones, desplazamientos, variantes de secuencia de desplazamiento de sección invariante, variantes de secuencia no sentido, o cualquier combinación de los mismos .
101. El método de conformidad con la reivindicación 99 o 100, caracterizado porque dicha variante de la secuencia está presente en el ADN o en el ARN .
102. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 99-101, caracterizado porque cualquiera o ambos de dicho primer componente oligonucleótido y dicho segundo componente oligonucleótido está comprendido de más que una molécula.
103. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 99-102, caracterizado porque dicha muestra que contiene dicha variante de la secuencia se selecciona del grupo que comprende de ADN metilado o no metilado modificado por bisulfito, ARN metilado o no metilado modificado por bisulfito, al menos un amplicón del ADN metilado o no metilado modificado por bisulfito, al menos un amplicón del ARN metilado o no metilado modificado por bisulfito o una combinación de los mismos.
104. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 99-103, caracterizado porque el auto-ensamble de la enzima de ácidos nucleicos multicomponente requiere el contacto de al menos una porción de cualquiera o ambos del primer y segundo componentes oligonucleótido con el ácido nucleico que comprende dicha variante de la secuencia .
105. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 99-104, caracterizado porque comprende además una etapa de amplificar el ácido nucleico que contiene dicha variante de la secuencia.
106. El método de conformidad con la reivindicación 105, caracterizado porque la etapa de amplificación comprende uno o más: reacción de cadena de polimerasa (PCR) , amplificación de desplazamiento de la hebra (SDA) , amplificación de isoterma mediada por lazo (LAMP) , amplificación del círculo de enrollamiento (RCA) , amplificación mediada por la transcripción (TMA) , replicación de secuencia auto-sostenida (3SR), amplificación basada en la secuencia de ácidos nucleicos (NASBA) , o reacción de cadena de la polimerasa de transcripción inversa (RT-PCR) .
107. El método de conformidad con la reivindicación 105 o 106, caracterizado porque comprende además la determinación de la presencia de dicha variante de la secuencia de ácidos nucleicos durante o después de dicha amplificación.
108. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 99-107, caracterizado porque dicho efecto detectable se detecta por espectroscopia de fluorescencia, resonancia de plasmón superficial, espectroscopia de masa, NMR, resonancia de giro del electrón, espectroscopia de fluorescencia de polarización, dicroísmo circular, inmunoensayo, cromatografía, radiometría, fotometría, graficado por centelleo, métodos electrónicos, UV, luz visible o espectroscopia infra roja, métodos enzimáticos o cualquier combinación de los mismos.
109. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 99-108, caracterizado porque dicho sustrato comprende una porción detectable y una porción del hibridizador por apagado, en donde sobre la modificación de dicho sustrato por dicha MNAzima, aumenta o disminuye un efecto detectable proporcionado por dicha porción detectable .
110. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 99-109, caracterizado porque dicho sustrato está unido a un soporte insoluble o está libre en la solución.
111. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 99-110 en donde dicha modificación se selecciona del grupo que comprende de escisión, ligación, metalación de porfirina, formación de enlaces carbono-carbono, enlaces éster o enlaces amida.
112. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 99-111, caracterizado porque comprende además (a) proporcionar al menos un tercer componente oligonucleótido y al menos un cuarto componente oligonucleótido que se auto-ensamblan en la presencia de al menos una variante de la secuencia de ácidos nucleicos adicional para formar al menos una enzima de ácidos nucleicos multicomponente catalíticamente activa (MNAzima) adicional; (b) contactar dicho al menos tercer y al menos cuarto componentes oligonucleótido con una muestra que contiene de manera putativa al menos una variante de la secuencia de ácidos nucleicos adicional en la presencia de al menos un sustrato adicional capaz de ser modificado por dicha al menos una MNAzima adicional, en donde dicha modificación de dicho al menos un sustrato adicional proporciona al menos un efecto detectable adicional bajo condiciones que permiten: (1) el auto-ensamble de al menos una MNAzima, y (2) la actividad catalítica de al menos una MNAzima; y (c) detectar dicho al menos un efecto detectable adicional, detectando así la presencia de dicha al menos una variante de la secuencia adicional.
113. El método de conformidad con la reivindicación 112, caracterizado porque dicho al menos un efecto detectable adicional es detectable independientemente .
114. El método de conformidad con la reivindicación 112 o 113, caracterizado porque cada uno de los sustratos adicionales es el mismo, diferente o una combinación de los mismos.
115. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 112-114, caracterizado porque al menos uno de cada sustrato adicional está unido a un soporte insoluble a fin de que solo una de una porción detectable y una porción del hibridizador por apagado del sustrato adicional permanezca unida al soporte cuando dicho sustrato adicional se modifica por dicha MNAzima adicional.
116. Un método para detectar la presencia de una variante de la secuencia de un ácido nucleico caracterizado porque comprende (a) proporcionar dos o más componentes oligonucleótido que comprende al menos un primer componente oligonucleótido y un segundo componente oligonucleótido capaces de auto-ensamblarse en la presencia de un ácido nucleico para formar al menos una primera enzima de ácidos nucleicos multicomponente catalíticamente activa (MNAzima) ; (b) contactar los dos o más componentes oligonucleótido con una muestra que contiene de manera putativa el ácido nucleico, en la presencia de al menos un primer sustrato modificable por dicha al menos una primera MNAzima, en donde el sustrato comprende una porción detectable capaz de proporcionar al menos un primer efecto detectable sobre la modificación del sustrato por dicha al menos una primera MNAzima bajo condiciones que permiten: (1) el auto-ensamble de la MNAzima, y (2) la actividad catalítica de la MNAzima; y (c) en donde la ausencia de la actividad catalítica es indicativa de la presencia de una variante de la secuencia en dicho ácido nucleico.
117. Un método para detectar la presencia de al menos un ácido nucleico metilado caracterizado porque comprende (a) proporcionar dos o más componentes oligonucleótido, en donde al menos un primer componente oligonucleótido y un segundo componente oligonucleótido se auto-ensamblan en la presencia del ácido nucleico metilado para formar al menos una enzima de ácidos nucleicos multicomponente catalíticamente activa (MNAzima) ; (b) proporcionar al menos un primer sustrato, dicho primer sustrato capaz de ser modificado por dicha primera MNAzima, en donde dicha modificación de dicho sustrato por dicha MNAzima proporciona al menos un primer efecto detectable; (c) contactar los dos o más componentes oligonucleótido con una muestra que contiene de manera putativa el ácido nucleico metilado bajo condiciones que permiten: (1) el auto-ensamble de la MNAzima catalíticamente activa, y (2) la actividad catalítica de la MNAzima; y (d) determinar la presencia de dicho al menos un efecto detectable detectando así la presencia de dicho al menos un ácido nucleico metilado.
118. El método de conformidad con la reivindicación 117, caracterizado porque dichas condiciones comprenden además una temperatura que facilita la hibridación de dicha MNAzima con dicho ácido nucleico metilado pero no con ácido nucleico no metilado.
119. El método de conformidad con la reivindicación 117 o 118, caracterizado porque comprende además amplificar el efecto detectable por el uso de una cascada de amplificación del efecto detectable.
120. El método de conformidad con la reivindicación 119, caracterizado porque la cascada de amplificación del efecto detectable comprende una o más de una cascada de ribozima/ligasa, una cascada de enzima de ácido nucleico circular, una cascada de enzima de proteína, o una o más enzimas unidas a un soporte, o cualquier combinación de las mismas.
121. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 117-120, caracterizado porque la fuente de dicho ácido nucleico metilado se selecciona del grupo que comprende de sintético, mamífero, humano, ácido animal, planta, fúngico, bacteriano, viral, bacterias archaelicas o cualquier combinación de los mismos.
122. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 117-121, caracterizado porque el ácido nucleico metilado se selecciona del grupo que comprende de ADN metilado o ARN metilado.
123. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 117-122, caracterizado porque el auto-ensamble de la enzima de ácidos nucleicos multicomponente requiere el contacto del ácido nucleico metilado con uno o ambos del primer y segundo componentes oligonucleótido.
124. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 117-123, caracterizado porque comprende además proporcionar un soporte insoluble que tiene al menos uno de dicho sustrato o dicho primer o segundo componentes oligonucleótido, o una combinación de los mismos unida al mismo.
125. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 117-124, caracterizado porque dicho efecto detectable se detecta por espectroscopia de fluorescencia, resonancia de plasmón superficial, espectroscopia de masa, NMR, resonancia de giro del electrón, espectroscopia de fluorescencia de polarización, dicroísmo circular, inmunoensayo, cromatografía, radiometría, fotometría, graficado por centelleo, métodos electrónicos, UV, luz visible o espectroscopia infra roja, métodos enzimáticos o cualquier combinación de los mismos.
126. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 117-125, caracterizado porque dicho sustrato comprende una porción detectable y una porción del hibridizador por apagado, en donde sobre la modificación de dicho sustrato por dicha MNAzima, aumenta o disminuye un efecto detectable proporcionado por dicha porción detectable.
127. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 117-126, caracterizado porque dicha modificación se selecciona del grupo que comprende de escisión, ligación, metalación de porfirina, formación de enlaces carbono-carbono, enlaces éster o enlaces amida.
128. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 117-127, caracterizado porque comprende además proporcionar al menos un tercer y cuarto componentes oligonucleótido, en donde dicho al menos tercer y al menos cuarto componentes oligonucleótido son capaces de auto-ensamblarse en la presencia de al menos un ácido nucleico metilado adicional para formar al menos una MNAzima catalíticamente activa adicional, y en donde al menos un sustrato adicional está presente en la muestra, dicho sustrato adicional es capaz de ser modificado por dicha MNAzima adicional, en donde dicha modificación proporciona dicho efecto detectable adicional .
129. El método de conformidad con la reivindicación 128, caracterizado porque dicho al menos un efecto detectable adicional es detectable independientemente.
130. El método de conformidad con la reivindicación 128 o 129, caracterizado porque cada uno de los sustratos adicionales es el mismo, diferente o una combinación de los mismos.
131. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 128-130, caracterizado porque al menos uno de dicho sustrato adicional está unido a un soporte insoluble de modo que solo una de una porción detectable adicional y una porción del hibridizador por apagado adicional del sustrato adicional permanece unida al soporte cuando dicho sustrato adicional se modifica por dicha MNAzima adicional.
132. Un método para detectar al menos un facilitador de ensamble usando una cascada de amplificación caracterizado porque comprende (a) proporcionar dos o más componentes oligonucleótido que comprende al menos un primer componente oligonucleótido y al menos un segundo componente oligonucleótido que se auto-ensamblan en la presencia de al menos un primer facilitador de ensamble para formar al menos una primera enzima de ácidos nucleicos multicomponente catalíticamente activa (MNAzima) ; (b) proporcionar un soporte insoluble que tiene al menos un primer sustrato unido al mismo, dicho primer sustrato es capaz de ser modificado por dicha MNAzima, en donde dicho primer sustrato comprende al menos una tercera molécula que comprende al menos una primera enzima catalíticamente activa que se libera sobre la modificación de dicho primer sustrato por dicha primera MNAzima; (c) contactar dichos dos o más componentes oligonucleótido con una muestra que contiene de manera putativa dicho facilitador de ensamble, en la presencia de dicho soporte insoluble que tiene dicho primer sustrato unido al mismo bajo condiciones que permiten: (1) el auto-ensamble de dicha MNAzima, y (2) la actividad catalítica de dicha MNAzima; y (d) proporcionar un soporte insoluble que tiene al menos un segundo sustrato unido al mismo, dicho segundo sustrato que se puede escindir por dicha primera enzima catalíticamente activa en donde dicho segundo sustrato comprende al menos una cuarta molécula que comprende al menos un radical detectable que se libera sobre la modificación de dicho segundo sustrato por dicha primera enzima; y (e) en donde dicha primera enzima catalíticamente activa modifica una pluralidad de dicho segundo sustrato liberando así una pluralidad de radicales detectables (f) en donde dichos radicales detectables son detectables después de la modificación de dicho segundo sustrato por dicha primera enzima catalíticamente activa, y; (g) en donde la detección de dichos radicales detectables es indicativa de la presencia de dicho facilitador de ensamble.
133. El método de conformidad con la reivindicación 132, caracterizado porque dichos radicales detectables comprenden además una segunda enzima catalíticamente activa adicional capaz de modificar dicho primer sustrato liberando así la enzima catalíticamente activa adicional.
134. El método de conformidad con la reivindicación 133, caracterizado porque al menos una de dicha primera o dicha segunda enzima catalíticamente activa se selecciona del grupo que comprende de MNAzimas, ADNzimas, ribozimas, enzimas hidrolíticas, endonucleasas de restricción, exonucleasas, proteasas, proteinasas, hidrolasas, liticasas, peptidasas, dipeptidasas, esterasas, caspasas, catepsisnas, desulfhidrasas, amidasas, glicosidasas .
135. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 132 - 134, caracterizado porque dicho facilitador de ensamble es un objetivo a ser identificado, detectado o cuantificado.
136. Un método para detectar un objetivo usando una cascada de amplificación de señal mediada por la MNAzima caracterizado porque comprende (a) proporcionar un primer componente oligonucleótido y un segundo componente oligonucleótido que se auto-ensamblan en la presencia de dicho objetivo para formar una primera enzima de ácidos nucleicos multicomponente catalíticamente activa (MNAzima) ; (b) proporcionar un soporte insoluble que tiene un primer y un segundo sustrato unidos al mismo, dichos primer y segundo sustratos son capaces de ser modificados por dicha primera MNAzima, en donde dichos primer y segundo sustratos comprenden al menos un tercer y un cuarto componentes oligonucleótido respectivamente, capaces de formar una segunda MNAzima catalíticamente activa, en donde dicho tercer y cuarto componentes oligonucleótido se liberan sobre la modificación de dicho primer y segundo sustratos por dicha primera MNAzima; (c) proporcionar dicho soporte insoluble que tiene un tercer y un cuarto sustratos unidos al mismo, dichos tercer y cuarto sustratos son capaces de ser modificados por dicha segunda MNAzima, en donde dichos tercer y cuarto sustratos comprenden al menos un quinto y un sexto componentes oligonucleótido respectivamente, capaces de formar una tercera MNAzima catalíticamente activa, en donde dicho quinto y dicho sexto componentes oligonucleótido se liberan sobre la modificación de dichos tercer y cuarto sustratos por dicha segunda MNAzima, y; (d) proporcionar un facilitador de ensamble capaz de facilitar el ensamble de dicha segunda y dicha tercera MNAzima, y; (e) proporcionar un quinto sustrato que es capaz de ser modificado por dicha segunda MNAzima para proporcionar un efecto detectable; (f) contactar dichos primer y segundo componentes oligonucleótido con una muestra que contiene de manera putativa dicho objetivo, en la presencia de dicho facilitador de ensamble, y en la presencia de dicho soporte insoluble que tiene dicho primero, segundo, tercer y cuarto sustratos unidos al mismo bajo condiciones que permiten: (1) el auto-ensamble de dicha primera, segunda y tercera MNAzimas, y (2) la actividad catalítica de dicha primera, segunda y tercera MNAzimas; y (g) en donde dicha tercera MNAzima modifica dichos primer y segundo sustratos proporcionando adicionalmente así dicha segunda MNAzima en donde dicha segunda MNAzima modifica adicionalmente al menos uno de dicho tercer, cuarto y quinto sustratos proporcionando adicionalmente así dicha tercera MNAzima proporcionando adicionalmente así dicho efecto detectable, y; (h) en donde la detección de dicho efecto detectable es indicativa de la presencia de dicho objetivo.
137. El método de conformidad con la reivindicación 136 en donde dicho objetivo debe ser identificado, detectado o cuantificado.
138. El método de conformidad con la reivindicación 136 o 137, caracterizado porque dicho quinto sustrato es el mismo como o es diferente a cualquiera de dichos primero, segundo, tercer o cuarto sustratos.
139. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 132-138, caracterizado porque dicho objetivo se selecciona del grupo que comprende de ácidos nucleicos, proteínas, glicoproteínas, lípidos, lipoproteínas, células, virus, bacterias, archaea, hongos, anticuerpos, metabolitos, patógenos, toxinas, contaminantes, venenos, moléculas pequeñas, polímeros, iones metálicos, sales metálicas, priones, ácidos nucleicos o cualquier derivado, porción o combinación de los mismos.
140. El método de conformidad con la reivindicación 139, caracterizado porque dicho ácido nucleico se selecciona del grupo que comprende de ADN, ADN metilado, ADN alquilado, ARN, ARN metilado, microARN, ARNsi, ARNsh, ARNm, ARNt, ARNsno, ARNst, ARNsm, pre- y pri-microARN, otros ARNs de no codificación, ARN ribosómico, derivados de los mismos, amplicones de los mismos, o cualquier combinación de los mismos.
141. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 136-140, caracterizado porque cada uno de dicho primer, segundo, tercer o cuarto sustratos está presente en el mismo soporte sólido o diferente soporte sólidos o cualquier combinación de los mismos.
142. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 136-141, caracterizado porque dicha modificación de al menos uno de dicho primer, segundo, tercer o cuarto sustratos proporciona adicionalmente un efecto detectable.
143. Un método para preparar una pluralidad de enzimas de ácidos nucleicos multicomponente (MNAzimas) que cada una reconoce al menos un facilitador de ensamble y modifica un sustrato, el método caracterizado porque comprende: (a) proporcionar una pluralidad de facilitadores de ensamble a ser identificados, detectados o cuantificados (b) diseñar dos o más componentes oligonucleótido en donde al menos un primer componente oligonucleótido y un segundo componente oligonucleótido se auto-ensamblan en la presencia de un facilitador de ensamble para formar una enzima de ácidos nucleicos multicomponente catalíticamente activa (MNAzima) , en donde cada uno del al menos primer y segundo componentes oligonucleótido comprenden una porción del brazo del sustrato, una porción del núcleo catalítico, y una porción del brazo detector, en donde sobre el auto-ensamble, la porción del brazo detector del primer y segundo componentes oligonucleótido forma los brazos detectores de la MNAzima, la porción del brazo del sustrato del primer y segundo componentes oligonucleótido forma los brazos del sustrato de la MNAzima, y la porción del núcleo catalítico del primer y segundo componentes oligonucleótido forma un núcleo catalítico de la MNAzima; y en donde los brazos detectores de la MNAzima interactúan con un facilitador de ensamble para mantener el primer y segundo componentes oligonucleótido en proximidad para la asociación de sus porciones del núcleo catalítico respectivas para formar el núcleo catalítico de la MNAzima, dicho núcleo catalítico capaz de actuar sobre al menos un sustrato, y en donde los brazos del sustrato de la MNAzima enlazan un sustrato de modo que el núcleo catalítico de la MNAzima puede modificar dicho sustrato; (c) alterar dichos dos o más componentes oligonucleótido tal que la porción del brazo del sustrato y la porción del núcleo catalítico del primer y segundo componentes oligonucleótido sean constantes, y la porción del brazo detector de al menos uno del primer y segundo componentes oligonucleótido se adapta para reconocer otro de la pluralidad de facilitadores de ensamble, y (d) repetir la etapa de alteración para cada uno de la pluralidad de facilitadores de ensamble.
144. Un kit para detectar la presencia de una pluralidad de objetivos caracterizado porque comprende una pluralidad de componentes oligonucleótido diseñados para ensamblar una pluralidad de MNAzimas cada una correspondiente a al menos uno de una pluralidad de objetivos, y al menos un sustrato.
145. Un kit para ensamblar una pluralidad de MNAzimas caracterizado porque comprende una pluralidad de facilitadores de ensamble, una pluralidad de componentes oligonucleótido diseñados para ensamblar una pluralidad de MNAzimas cada una correspondiente a cada uno de la pluralidad de facilitadores de ensamble, y al menos un sustrato.
146. Un kit para detectar un objetivo caracterizado porque comprende una pluralidad de componentes oligonucleótido diseñados para ensamblar una MNAzima correspondiente al objetivo, y un sustrato.