CN111801429A - 用于检测微生物的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

本文提供用于检测微生物的组合物、系统和方法。具体而言，本文提供用于快速、多重检测未经纯化的生物样品中的微生物的组合物、系统和方法。

Description

用于检测微生物的组合物和方法

相关申请的交叉参考

本申请要求2017年11月6日提交的美国临时申请第62/581950号的优先权和权益，所述申请特此通过参考以其全部结合。

公开领域

本文提供用于检测微生物的组合物、系统和方法。具体而言，本文提供用于快速、多重检测未经纯化或复杂的生物样品中的微生物的组合物、系统和方法。

背景

生物工程在电子学和材料方面的进步已经产生了一系列惊人的直接植入血流中的医疗装置，包括人工心脏瓣膜、起搏器、除颤器、心室辅助装置、透析导管、静脉过滤器和支架。这些创新已延长了数百万患者的生命并改善了其质量。不幸的是，血流内异物的存在为细菌定殖和感染提供了生态位。超过120万与医疗保健相关的感染可归因于留置的医疗装置(Bryers, J. D. Biotechnology and Bioengineering 100, 1-18, doi:10.1002/bit.21838 (2008); Darouiche, R. O. TN Engl J Med 350, 1422-1429, doi:10.1056/NEJMra035415350/14/1422 [pii] (2004))。

血管内装置正在成为美国血流感染的主要原因之一。这可通过以下事实举例证明：心脏电子植入装置的感染率的增加超过了植入率的增加(Nielsen, J. C.,等人,European heart journal, doi:10.1093/eurheartj/ehv060 (2015); Greenspon, A. J.等人 Journal of the American College of Cardiology 58, 1001-1006, doi:10.1016/j.jacc.2011.04.033 (2011))。随着技术比如经导管主动脉瓣置换和扩大适应症允许具有增加中并存病的患者接受血管内植入物，这种趋势在短期内将持续或恶化。尽管新的抗微生物技术不断涌现，但其开发和批准的时间跨度却很长。

与血管内装置相关感染相关的主要障碍是建立诊断。尚未建立用于检测细菌定殖或菌血症的生物标志物。目前，血液培养用于检测和鉴定病原体。这种方法由于以下原因而不是最佳的：培养灵敏度低；多达30%的人工瓣膜心内膜炎为培养阴性(Habib, G.等人2015 European heart journal 36, 3075-3128, doi:10.1093/eurheartj/ehv319(2015))。获得血液培养结果的时间在24-72小时范围内。仍然更糟糕的是，培养缺乏特异性并且通常受到正常皮肤菌群的污染(Hall, K. K. & Lyman, J. A. ClinicalMicrobiology Reviews 19, 788-802, doi:10.1128/cmr.00062-05 (2006))。认识到早期的抗微生物治疗可降低血流感染的死亡率，在等待该差诊断结果期间给予患者经验性广谱抗生素。结果是一刀切地使用抗菌药物，这导致抗生素抗性、机会性感染(例如难辨梭菌(clostridium dificile))、严重的副作用(例如肾或肝衰竭)或危重患者治疗不足。

需要有助于早期诊断血管内植入物感染的技术，以降低使用这种装置的患者的发病率和死亡率。

概述

本文提供用于检测微生物的组合物、系统和方法。具体而言，本文提供用于快速、多重检测未经纯化或生物样品比如血液中的微生物的组合物、系统和方法。

例如，在一些实施方案中，本文提供一种检测生物样品中的多种微生物的方法，其包括：a) 对生物样品进行核酸扩增(例如PCR) (例如用多种正向和反向引物，其中引物附着于纳米颗粒)以产生多种不同长度的包含纳米颗粒的扩增产物；b) 在掺入扩增产物中的纳米颗粒上沉积金属壳以产生包含金属包覆的纳米颗粒的扩增产物；和c) 使用圆二色性(CD)检测包含金属包覆的纳米颗粒的扩增产物。在一些实施方案中，纳米颗粒为金纳米颗粒。在一些实施方案中，所述正向和所述反向引物包含不同大小的纳米颗粒。在一些实施方案中，纳米颗粒为纳米棒。在一些实施方案中，包含金属纳米颗粒的扩增产物组装成并排的梯，所述梯在纳米颗粒之间包含间隙距离。在一些实施方案中，不同长度的扩增产物呈现出不同波长的CD峰。在一些实施方案中，金属壳为金、铜或银。在一些实施方案中，微生物为细菌。在一些实施方案中，细菌为病原细菌(例如抗生素抗性细菌)。在一些实施方案中，引物扩增多个生物体特异性和/或抗生素抗性基因。在一些实施方案中，所述生物样品为全血。在一些实施方案中，在进行该方法之前不对样品进行培养或纯化。在一些实施方案中，所述方法在3小时或更短(例如2.9、2.8、2.7、2.6、2.5或更短)的时间内进行。在一些实施方案中，所述方法进一步包括在进行该方法之前使样品与抗生素接触的步骤。

进一步的实施方案提供一种检测生物样品中的多种微生物的方法，其包括：a) 使包含病原细菌的生物样品与抗生素接触；b) 对生物样品进行扩增(例如PCR) (例如用多种正向和反向引物，其中引物附着于纳米颗粒)以产生多种不同长度的包含纳米颗粒的扩增产物；c) 在掺入所述扩增产物中的纳米颗粒上沉积金属壳以产生包含金属包覆的纳米颗粒的扩增产物；和d) 使用圆二色性(CD)检测包含金属包覆的纳米颗粒的扩增产物。

仍然其他的实施方案提供组合物或试剂盒，其包含至少一对扩增引物，所述扩增引物包含多种正向和反向引物，其中引物附着于纳米颗粒。在一些实施方案中，组合物或试剂盒进一步包含一种或多种所选择的组分，例如金属、抗生素、对照核酸、一种或多种缓冲剂和一种或多种酶。

仍然其他的实施方案提供一种反应混合物，其包含：多种正向和反向引物，其中引物附着于结合于靶核酸或其扩增产物的纳米颗粒。在一些实施方案中，反应混合物包覆有金属。

本文描述另外的实施方案。

附图描述

图1显示(A) PCR复制程序，其中使用引物、模板DNA、taq plus聚合酶和4种不同的DNA碱基扩增DNA链。(B) 基于PCR的金纳米棒(NR)端对端(ETE)组件。(C) 基于PCR的金NR并排(SBS)组件，NR间间隙为d；为了清楚起见，在图的底部去除DNA链。在不同的PCR循环数之后获得的ETE (D-F)和SBS (G-I)组件的代表性电子显微图像，n=2 (D & G)，n=10 (E &H)，n=15 (F & I)。SBS组件的冷冻电子断层成像(J)和CD光谱。

图2显示(A) PCR组装纳米颗粒复合物及Ag和Au壳的组装后沉积的图示。(B) 壳介导的手性等离子体谱带的光谱调制。(C) 分析校正曲线，其将带有Au壳的CD谱带的强度与DNA的浓度关联起来。

图3显示掺有0-10⁴ CFU/ml血液范围内的活MRSA的系列稀释液的全血的mecA PCR的凝胶电泳。

图4显示(A) 全血的UV-vis光谱。(B) 含有和不含细菌DNA血液的全血的CD光谱，所述细菌DNA血液掺有0-10⁴ CFU/ml血液范围内的活MRSA的系列稀释液。

图5显示间隙为2、5、10、20、30和40 nm的NR复合物的计算CD光谱。

图6显示来自NR-PCR的AST的假设读出。

定义

为了促进对本技术的理解，下面定义许多术语和短语。在整个详述中阐述了另外的定义。

本文使用的术语“核酸分子”是指任何含有核酸的分子，包括(但不限于)DNA或RNA。该术语涵盖的序列包括DNA和RNA的任何已知碱基类似物，包括(但不限于) 4-乙酰胞嘧啶、8-羟基-N6-甲基腺苷、吖丙啶基胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶，5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、肌苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基腺嘌呤、1-甲基假尿嘧啶、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-甲基腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基辫苷(beta D mannosylqueosine)、5'-甲氧基羰基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸、氧基丁氧基胸苷(oxybutoxosine)、假尿嘧啶、辫苷(queosine)、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、N-尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸、假尿嘧啶、辫苷、2-硫胞嘧啶和2,6-二氨基嘌呤。

术语“基因”是指包含产生多肽、前体或RNA (例如rRNA、tRNA)所必需的编码序列的核酸(例如DNA)序列。多肽可由全长编码序列或编码序列的任何部分编码，只要保留全长或片段的期望活性或功能特性(例如酶活性、配体结合、信号转导、免疫原性等)即可。该术语还涵盖结构基因的编码区和位于5'和3'两个末端上与编码区相邻(在任一末端相距约1kb或更长)的序列，使得该基因对应于全长mRNA的长度。位于编码区5'且存在于mRNA上的序列称为5'非翻译序列。位于编码区3'或下游并存在于mRNA上的序列称为3'非翻译序列。术语“基因”涵盖基因的cDNA和基因组形式两者。

术语“引物”是指以下寡核苷酸(无论是天然存在(如在纯化的限制性酶切消化中)还是合成产生的)，其当置于其中诱导与核酸链互补的引物延伸产物的合成的条件下(即在存在核苷酸和诱导剂比如DNA聚合酶的情况下和在合适的温度和pH下)时能够充当合成的起始点。为了获得最大扩增效率，引物优选地为单链的，但是可备选地为双链的。如果为双链的，则在用于制备延伸产物之前，首先对引物进行处理以分离其链。优选地，引物为寡脱氧核糖核苷酸。引物必须足够长以在存在诱导剂的情况下引发延伸产物的合成。引物的确切长度将取决于许多因素，包括温度、引物来源和方法的使用。

当关于聚合酶链反应使用时，术语“靶标”是指被用于聚合酶链反应的引物结合的核酸区域。因此，寻求从其他核酸序列中选出“靶标”。“区段”定义为靶序列内的核酸区域。

本文使用的术语“扩增子”是指经扩增反应产生的核酸。扩增子一般地为双链DNA；然而，其可为RNA和/或DNA:RNA。扩增子包含与样品核酸互补的DNA。在一些实施方案中，引物对经配置以从样品核酸产生扩增子。因此，任何给定扩增子的碱基组成可包括引物对、引物对的互补序列以及被扩增以产生扩增子的样品核酸区域。本领域的技术人员理解的是，将设计的引物对序列掺入到扩增子中可替代引物结合位点处的天然序列及其互补序列。在某些实施方案中，在使用引物扩增靶区域之后，将具有引物序列的所得扩增子用于随后的分析。在一些实施方案中，扩增子进一步包含与后续分析相容的长度。

在核酸的上下文中，术语“扩增”("amplifying"或"amplification)"是指多核苷酸或多核苷酸的一部分的多个拷贝的产生，一般地从少量多核苷酸(例如少至单个多核苷酸分子)开始，其中通常可检测到扩增产物或扩增子。多核苷酸的扩增涵盖多种化学和酶促过程。在聚合酶链反应(PCR)或连接酶链反应(LCR)期间，从靶标或模板DNA分子的一个或几个拷贝产生多个DNA拷贝为扩增的形式。扩增不限于起始分子的严格复制。例如，使用逆转录(RT)-PCR从样品中有限量的RNA产生多个cDNA分子为一种扩增形式。此外，在转录过程期间从单个DNA分子产生多个RNA分子也为一种扩增形式。

本文使用的术语“受试者”和“患者”是指任何动物，比如狗、猫、鸟、家畜，并且特别是哺乳动物，和优选地为人。

本文使用的术语“样品”以其最广义使用。从某种意义上说，这意味着包括从任何来源(包括生物和环境来源)获得的代表性部分或培养物。生物样品可从动物(包括人类)获得，并且包括流体、固体、组织和气体。生物样品包括血液和血液制品，比如血浆、血清等。然而，这种实例不应解释为限制适用于本公开的样品类型。

详述

尽管本文的公开是指某些示出的实施方案，但是应当理解，这些实施方案通过实例而非通过限制的方式呈现。

本文提供用于检测微生物的组合物、系统和方法。具体而言，本文提供用于快速、多重检测未经纯化的生物样品中的微生物的组合物、系统和方法。

心血管装置市场，特别是与血流直接接触的那些(例如起搏器、除颤器、人工心脏瓣膜、左心室辅助装置、支架、血管通路装置和静脉过滤器)为增长最快的医疗装置行业之一。这种增长是由于心血管疾病的患病率越来越多(Mozaffarian, D.等人 A Report Fromthe American Heart Association, doi:10.1161/cir.0000000000000350 (2015))、植入的扩大适应症(Praz, F.,等人 JACC: Cardiovascular Interventions 8, 1777-1796,doi:10.1016/j.jcin.2015.08.015 (2015); Zhan, C.,等人 Journal of GeneralInternal Medicine 23, 13-19, doi:10.1007/s11606-007-0392-0 (2008))以及基础生物工程在材料和电子学方面的改进(Khan, W., Muntimadugu, E., Jaffe, M. & Domb,A. J. in Focal Controlled Drug Delivery (Abraham J. Domb & Wahid Khan编) 33-59 (Springer US, 2014))引起的。尽管这些装置提供显著的益处，但置于血流内的任何异物仍会构成显著的感染威胁。尽管在过去的几十年中，植入率增加了多达65% (Zhan等人同上; Isaacs, A. J.,等人 The Journal of thoracic and cardiovascular surgery149, 1262-1269.e1263, doi:10.1016/j.jtcvs.2015.01.052 (2015))，但感染率却不成比例地增加(即> 200%) (Nielsen等人, 同上; Greenspon等人, 同上; Wang, A.等人Jama 297, 1354-1361, doi:10.1001/jama.297.12.1354 (2007))。结果，在美国，植入的医疗装置为血流感染的主要原因。随着植入的适应症持续扩大(Praz等人, 同上; Zhan等人, 同上)，具有增加中并存病的患者接受这些装置。例如，经导管主动脉瓣置换程序允许可能原本不是开放手术的良好候选者的患者接受瓣膜置换(Alsara, O.,等人 Journal ofGeriatric Cardiology: JGC 11, 163-170, doi:10.3969/j.issn.1671-5411.2014.02.004 (2014))。因此，预计其具有更大的并存病和免疫抑制，并因此具有更大的感染风险。尽管正在研究新的抗微生物装置策略，但其开发、监管批准和临床采用的时间跨度却很长。

与装置相关感染相关的主要挑战在于其由生物膜引起。生物膜为包封于细胞外基质中的固着细菌群落。它们开始于非生物材料的定殖，并可能发展成播散性感染16。因此，在许多情况下，最初的表现是惰性的，并且一般地直到感染已经播散才做出诊断。在这一点上，该装置被包覆在成熟的生物膜中，对抗生素或宿主免疫反应具有顽抗性。最终，必须通过手术移除并更换该装置，然后再进行长期的全身性抗生素治疗。因此，早期诊断血管内装置污染将降低发病率和死亡率，并且甚至挽救珍贵的装置。

当前用于诊断血管内装置相关感染的金标准要求经传统的血液培养进行细菌检测、鉴定(ID)和AST。这是一种非常差的诊断，具有深远的临床牵涉。首先，获得血液培养结果的时间一般地在1-5天的范围内(Cleven, B. E. E.等人 Journal of clinicalmicrobiology 44, 2389-2397, doi:10.1128/jcm.02291-05 (2006))。一旦患者表现出全身症状，就在等待培养结果期间开始广谱抗生素治疗。这种经验性使用抗生素会导致机会性感染、药物相关的毒性和抗生素抗性。第二，血液培养的灵敏度低。当血液中的细菌数量低时(比如当将装置定植但在播散之前时)，生长足够缓慢以产生阴性结果(Neut, D.,等人Acta orthopaedica 78, 299-308, doi:10.1080/17453670710013843 (2007); Hall-Stoodley, L.等人 FEMS immunology and medical microbiology 65, 127-145, doi:10.1111/j.1574-695X.2012.00968.x (2012); Lindsay, D. & von Holy, A. TheJournal of hospital infection 64, 313-325, doi:10.1016/j.jhin.2006.06.028(2006))。仍然更糟糕的是，某些细菌在标准培养条件下根本不生长(Peters, R. P. H.,等人 The Lancet Infectious Diseases 4, 751-760, doi:http://dx.doi.org/10.1016/S1473-3099 (04) 01205-8 (2004))。例如，多达30%的人工瓣膜心内膜炎最初为培养阴性(Habib, G.等人 European heart journal 36, 3075-3128, doi:10.1093/eurheartj/ehv319 (2015))。因此，直至生物膜成熟并且对抗生素和宿主反应较不敏感才检测到感染。第三，培养通常受到正常皮肤菌群的污染(Weinstein, M. P. Journal of clinicalmicrobiology 41, 2275-2278, doi:10.1128/jcm.41.6.2275-2278.2003 (2003))，正常皮肤菌群可快速生长并竞争得过培养基中的某些病原菌。重复培养以确认污染与感染进一步延长诊断的时间。

需要一种快速、超灵敏、无培养的用于菌血症检测、ID和AST的诊断法。非培养分子诊断方法正在迅速纳入标准医学微生物学实验室。大多数技术基于核酸检测和/或扩增(例如PCR)。然而，直接检测全血中的细菌核酸仍然是挑战。这与以下事实有关：在人细胞的高背景浓度下，血液中的细菌浓度可能极低(例如<1 CFU/ml) (Valencia-Shelton, F. &Loeffelholz, M. Future microbiology 9, 543-559, doi:10.2217/fmb.14.8 (2014))。迄今为止，尚无批准的诊断法用于直接检测细菌而不进行培养预富集。尽管当前利用初始培养富集的分子技术改善到AST的时间，并证明具有包括住院时间和健康成本在内的临床益处(Sango, A.等人 Journal of clinical microbiology 51, 4008-4011, doi:10.1128/JCM.01951-13 (2013))，但其均遭受了先前提及的血液培养失败。唯一不需要培养富集的可行的全血核酸检测系统为SeptiFast技术(Roche Diagnostics, Mannheim,Germany)。基于制造商的说明书，其可在<6小时内识别出细菌。然而，其没有全面的AST。此外，其仅能检测低至~300 CFU/ml。尽管这在严重感染或用抗生素进行预治疗的患者中可能有用(Yanagihara, K.等人 Critical Care 14, R159-R159, doi:10.1186/cc9234(2010))，但对于许多由医疗装置感染引起的惰性菌血症病例，这并不够灵敏，所述病例可能具有个位数的CFU/ml浓度。

因此，本文提供一种检测方法，其解决了用于检测微生物(例如全血中)未满足的临床需求。在一些实施方案中，通过将标准PCR引物偶联于纳米颗粒(例如金纳米棒(NR-PCR))，本文所述的PCR反应产生复合纳米棒“梯”。这些组件具有独特的手性等离子体特性，其允许使用圆二色性(CD)分光光度法进行介摩尔(zeptomolar) 10^-21检测(Ma, W.等人Nat Commun 4,doi:10.1038/ncomms 3689 (2013); Zhao, Y.等人 Nano Letters, doi:10.1021/nl501166m (2014))。本公开的实施方案的NR-PCR方法的灵敏度是最灵敏的PCR检测系统的至少50x，并且可在不到2.5小时内进行。尽管可使用其他扩增方法，但本文的描述用PCR进行说明。

优选的NR-PCR方法(1) 无需事先培养即可用于全血；(2) 能够足够多重进行以检测大多数病原体；(3) 提供抗生素敏感性概况；和(4) 提供少于3小时的获得结果的时间。

通过将标准PCR引物偶联于金纳米棒(NR-PCR；图1A-C)，PCR反应产生复合纳米棒组件，其长度取决于PCR循环数(图1D-I)。并排(SBS)‘梯’具有独特的手性等离子体特性(图1J)，这允许经圆二色性分光光度法来检测低至阿托摩尔(attomolar) 10^-18范围的DNA (图1K) (Ma等人, 同上)。该方法的灵敏度为最灵敏的PCR检测技术的至少50倍，并且为临床上使用的最传统PCR的至少1000倍。另外，手性等离子体检测对其他PCR检测方法失去灵敏度的大(> 2 nm) DNA链特别灵敏。具有更长的DNA靶标提高测定的特异性。

将这种高度灵敏和特异性的PCR技术与靶向鉴定物种特异性基因的引物结合使用，极大地影响全血中细菌的检测和ID。灵敏度的提高可检测出超低浓度的最难养细菌。其也允许进行DNA检测而无需事先培养生长富集。高特异性增加可以多重系统测定的基因靶标的数量。其还允许检测细菌DNA而无需进行样品处理来去除过量的人DNA。

在一些实施方案中，该技术利用NP组件周围的金属(例如Au、Ag、Cu)沉积——PCR后反应(图2A)。这些壳覆层提供调制CD光谱峰的方法(图2B) (Zhao等人, 同上)。另外，其将检测限提高到低至介摩尔10^-21范围(接近单分子检测；图2C) (Zhao等人, 同上)。

本公开不限于特定微生物。在一些实施方案中，检测细菌(例如病原细菌或抗生素抗性细菌)。病原细菌的实例包括(但不限于)耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(methicillinresistant S. Aureus) (MRSA)、结核分枝杆菌(M. tuberculosis) (抗生素敏感或抗性的)、链球菌属(Streptococcus sp.)、葡萄球菌属(Staphylococcus sp.)、沙门氏菌属(Salmonella sp.)、李斯特菌属(Listeria sp.)、大肠杆菌(E. coli)、志贺氏菌属(Shigella sp.)、弯曲杆菌属(Campylobacter sp.)、假单胞菌属(Pseudomonas sp.)、芽孢杆菌属(Bacillus sp.)、巴通体属(Bartonella sp.)、博德特菌属(Bordetella sp.)、疏螺旋体属(Borrelia sp.)、布鲁氏菌属(Brucella sp.)、衣原体属(Chlamydia sp.)、梭菌属(Clostridium sp.)、棒状杆菌属(Corynebacterium sp.)、肠球菌属(Enterococcus sp.)、弗朗西斯菌属(Francisella sp.)、嗜血杆菌属(Haemophilus sp.)、螺杆菌属(Helicobacter sp.)、军团菌属(Legionella sp.)、钩端螺旋体属(Leptospira sp.)、分枝杆菌属(Mycobacterium sp.)、支原体属(Mycoplasma sp.)、立克次体属(Rickettsia sp.)、密螺旋体属(Treponema sp.)、脲原体属(Ureaplasma sp.)、弧菌属(Vibrio sp.)和耶尔森氏菌属(Yersinia sp.)和奈瑟菌属(Neisseria sp.)。

在一些实施方案中，来自受试者的全血样品或其他生物样品在有或没有进一步纯化的情况下被用于分析。在一些实施方案中，受试者具有植入的医疗装置(例如包括(但不限于)除颤器、人工骨或关节、心脏起搏器、美容植入物、螺钉、棒、盘等、IUD和冠状动脉支架)。

在一些实施方案中，NR-PCR包括以下步骤。在一些实施方案中，首先用附着于纳米颗粒的多种正向和反向引物对生物样品进行PCR。在一些实施方案中，使用用于1个或多个(例如2、3、4、5或更多个)靶标的引物。在一些实施方案中，每对引物被设计为产生不同长度的PCR产物，使得产生多种不同长度的包含纳米颗粒的PCR产物。

本公开不限于特定的微粒或纳米颗粒。实例包括(但不限于)纳米棒。在一些实施方案中，纳米颗粒或纳米棒为金或其他合适的材料。在一些实施方案中，所述正向和所述反向引物包含不同大小的纳米颗粒。在一些实施方案中，包含金属纳米颗粒的PCR产物组装成并排的梯，所述梯在纳米颗粒之间包含间隙距离。在一些实施方案中，预期间隙大小的差异造成不同长度PCR产物的不同CD谱。

在一些实施方案中，在PCR后，将金属壳沉积在包含纳米颗粒的PCR产物上。在一些实施方案中，金属壳为金、铜或银或另一种金属，并且可与纳米颗粒材料相同或不同。

在一些实施方案中，在沉积后，使用圆二色性(CD)检测包含纳米颗粒的金属包覆的PCR产物。在一些实施方案中，不同长度的PCR产物呈现出不同的峰值CD偏移波长，允许多重进行。圆二色性(CD)为涉及圆偏振光的二色性，即左旋和右旋光的差分吸收。左旋圆(LHC)和右旋圆(RHC)偏振光代表光子的两种可能的自旋角动量状态，并因此圆二色性也称为自旋角动量的二色性。其呈现于光学活性手性分子的吸收谱带中。CD分光光度法在许多不同领域中具有广泛范围的应用。UV CD用于研究蛋白的二级结构。UV/Vis CD用于研究电荷转移跃迁。近红外CD用于通过探测金属d→d跃迁而研究几何和电子结构。使用来自红外能量区的光的振动圆二色性用于有机小分子的结构研究，并且最近用于蛋白和DNA的结构研究。在一些实施方案中，UV/Vis CD用于检测NR-PCR产物。

在一些实施方案中，从样品采集到数据收集和分析(包括CD检测)的NR-PCR方法在3小时或更短(例如3.0、2.75、2.5、2.25、2.0小时或更短)的时间内完成。

在一些实施方案中，NR-PCR方法包括确定样品中细菌(例如病原细菌)的抗生素抗性状态和/或特异性的步骤。例如，在一些实施方案中，在进行NR-PCR检测方法之前，使样品与抗生素接触。在一些实施方案中，多个样品各自与不同的抗生素(例如不同类别或相同类别的)接触。在一些实施方案中，将样品与抗生素一起温育数小时的时间段。在一些实施方案中，在不同时间点进行NR-PCR方法，并确定细菌的生长。通过比较反映细菌生长的检测到的NR-PCR产物的水平，确定样品对每种抗生素的敏感性。在一些实施方案中，确定微生物的遗传概况以揭示抗生素敏感性。

在一些实施方案中，样品的抗生素敏感性用于确定和任选地给予治疗作用过程(例如选择一种或多种抗生素给予受试者)。

在一些实施方案中，基于计算机的分析程序用于将通过检测测定产生的原始数据(例如给定微生物的存在、不存在或量)翻译成对临床医师具有预测价值的数据。临床医师可使用任何合适的方式访问预测数据。因此，在一些优选的实施方案中，本公开提供进一步的益处，即不太可能接受遗传学或分子生物学训练的临床医师不需要理解原始数据。数据以其最有用的形式直接呈现给临床医师。然后，临床医师能够立即利用该信息以优化受试者的护理。

本公开考虑能够向和自进行测定的实验室、信息提供者、医务人员和受试者接收、处理和传输信息的任何方法。例如，在本公开的一些实施方案中，样品(例如血液样品)从受试者获得并提交给概况分析服务(例如医疗设施的临床实验室、基因组概况分析业务等)以产生原始数据。如果样品包含组织或其他生物样品，则受试者可访问医疗中心以获取样品并将其发送到概况分析中心，或者受试者可自己收集样品(例如血液样品)并将其直接发送到概况分析中心。如果样品包含先前确定的生物信息，则该信息可由受试者直接发送到概况分析服务(例如含有信息的信息卡可由计算机扫描，并且使用电子通信系统将数据传输到概况分析中心的计算机)。一旦由概况分析服务接收，就处理样品并产生对于受试者期望的诊断或预后信息特异的概况(例如样品中细菌的存在和/或抗生素抗性状态)。

然后以适合于主治医师解释的格式来准备概况数据。例如，不是提供原始表达数据，而是准备的格式可代表受试者的诊断或风险评价(例如微生物或抗生素抗性微生物的存在或不存在)以及针对特定治疗选择的建议。可通过任何合适的方法将数据显示给临床医师。例如，在一些实施方案中，概况分析服务生成报告，其可为临床医师打印(例如在护理点)或在计算机监视器上显示给临床医师。

在一些实施方案中，首先在护理点或区域设施分析信息。然后将原始数据发送到中央处理设施以进行进一步分析和/或将原始数据转换为对临床医师或患者有用的信息。中央处理设施提供数据分析的隐私(所有数据均用统一的安全协议存储于中央设施中)、速度和一致性的优势。然后，中央处理设施可在对受试者进行治疗后控制数据的命运。例如，使用电子通信系统，中央设施可将数据提供给临床医师、受试者或研究人员。

在一些实施方案中，受试者能够使用电子通信系统直接访问数据。受试者可基于结果选择进一步的干预或咨询。在一些实施方案中，数据用于研究用途。例如，数据可用于进一步优化标志物的包含或消除，以作为疾病的特定状况或阶段的有用指标或者作为伴随诊断以确定治疗作用过程(例如选择抗生素)。

在一些实施方案中，本公开提供用于分离和分析核酸(例如微生物特异性核酸)的试剂盒和系统。在一些实施方案中，试剂盒包含检测核酸所必需、充分或有用的试剂(例如引物、纳米颗粒、金属、酶、缓冲剂、对照、说明书、仪器、处理装置等)。

在一些实施方案中，试剂盒包含一个或多个容器，所述容器包含引物、纳米颗粒、金属、酶、缓冲剂、对照、说明书等。在一些实施方案中，将试剂盒的每种组分包装于单独的容器中。在一些实施方案中，将容器以同一试剂盒或盒子包装和/或运输以便一起使用。在一些实施方案中，将试剂盒的一种或多种组分单独运输和/或包装。

在一些实施方案中，系统包括自动化样品和试剂处理装置(例如机器人)。

实验

提供以下实施例以证明和进一步说明本公开的某些优选实施方案和方面，并且不应解释为限制其范围。

实施例1

经NR-PCR直接检测全血中的细菌

全血的许多组分(例如血红蛋白)产生可干扰CD光谱检测的手性等离子体信号。全血为一种复杂培养基，其含有完整的细胞、蛋白/肽、脂质和许多可能干扰核酸检测的小分子。全血内有几种已知的PCR抑制剂，包括血红蛋白和免疫球蛋白以及蛋白酶(Kermekchiev, M.B.,等人 Nucleic Acids Research, doi:10.1093/nar/gkn1055 (2009))。为解决这个问题，使用为全血设计的特定聚合酶试剂盒。使用该试剂盒，有可能用简单的凝胶电泳检测以低至~300 CFU/ml的浓度掺有活的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的全血中甲氧西林抗性基因(mecA)的存在(图3)。

全血NR-PCR测定

数据显示，PCR后的NR‘梯’可进行壳包覆以调制CD谱带(图2)。具体地讲，Ag壳在峰值CD谱带产生蓝移，而Au壳产生红移。还测试了铜壳，其产生大的红移。这些光谱偏移还取决于壳厚度8。壳厚度由在壳包覆反应中添加的金属量来控制。对CD谱带的这种控制允许将峰移动至全血谱的较小噪声部分。已经发现，经渐增浓度的NH₂OH•HC来另外减少Cu和Au壳，可增加对光谱峰位置及其强度的另外控制。

将全血中NR-PCR反应的峰值CD信号强度作为3种金属(即Au、Ag和Cu)壳厚度的函数进行评估。来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) COL的基因组DNA用作PCR反应的模板。该菌株为原型MRSA菌株。使用溶葡萄球菌酶(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)、Trizol (LifeTechnologies, Carlsbad, CA)和QIAamp DNA迷你试剂盒(Qiagen, Hilden,Germany)从金黄色葡萄球菌的对数中期培养物中分离基因组DNA。通过从Au晶种生长来合成Au NR，并且如先前所述(Ma等人, 同上)修饰用于以SBS构型(图1C)与金黄色葡萄球菌的PCR引物(表1)缀合。使用5x Phusion Blood Direct PCR试剂盒(Thermo FisherScientific, Waltham, MA)与模板基因组DNA和Au-NR缀合引物进行PCR反应。热循环方案以在95℃下进行5分钟预变性步骤开始，然后进行20个循环的95℃变性(5 s)、50-65℃退火(5 s)和72℃延伸(15-30 s)步骤，然后在72℃下进一步延伸10分钟。最后，PCR系统将在4℃下保持10分钟。壳覆层基于先前描述的方案施加(Zhao等人, 同上)。简而言之，将PCR产物以7000 rpm离心5分钟，将沉淀物重新悬浮于PBS-CTAB (20 mM CTAB)中。然后，将AgNO₃ (0.1 mM-10 mM)加0.1 M抗坏血酸；HAuCl₄ (0.3-10 mM)加1 mM NH₂OH•HCl；或CuCl₂ (0.5-5 mM)加1 mM NH₂OH•HCl混合到PCR产物中。反应5分钟之后，将混合物以6000 rpm离心5分钟。然后将沉淀物溶于去离子水中，并经JASCO J-815分光光度计获得UV-vis和CD光谱。

预期的是，向光谱的近红色部分的偏移提供最佳的信噪比和最高的测定灵敏度。

与标准血液培养的比较

通过与当前的临床金标准(即血液培养)进行比较，证实该测定的灵敏度和特异性。

使从健康供体获得的人类全血(市售得自Valley Biomedical, Virginia)掺有确定浓度的甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(MSSA)和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)和野生型大肠杆菌。所有细菌菌株均可作为在-80℃下储存的冷冻甘油储备液获得。将给定物种的单个菌落接种于含有1%葡萄糖的胰蛋白酶大豆肉汤(TSBG)中，并生长至对数中期。然后将细菌以10x的增量连续稀释。每个稀释液的一个等分试样用于掺入全血样品。另一个用于平板接种和菌落计数。已知不含细菌的血液用作阴性对照。同时对样品进行处理用于NR-PCR (引物序列见表1)和标准血液培养。测试样品由与进行平台测定的那些不同的实验室人员制备。CD强度相对于细菌浓度的曲线图用于确定检测限。构建标准的2x2表格来确定灵敏度和特异性。

如果使用未经处理的血液，并且实现单分子检测，则最大理论检测限为50 CFU/ml。在一些情况下，在NR-PCR之前，在98℃下对2 ml全血进行初始变性，然后离心以浓缩大的大分子(包括DNA)。在一些情况下，也对同一样品进行多个(~100)同时NR-PCR反应，类似于数字PCR，但没有产生皮升大小反应的复杂性。

实施例2

CD峰值波长和PCR转录物长度

考虑到不仅需要检测而且还需要ID血液中的特定细菌种类，在一些实施方案中，NR-PCR测定提供一种用于最常见病原体的多重检测的方法。壳覆层可在宽的可见光谱范围内调制CD谱带的位置。另外，个体NR复合物的结构提供窄带调制。基于数值模拟，由DNA转录物桥接的NR之间的间隙或距离，也可改变峰值CD波长(图5)，尽管在窄得多的范围内。

这提供一种用于多重进行的方法。也就是说，在同一试管中进行具有不同转录物长度的多个PCR反应，并在不同波长下检测到每种独特的产物。

mecA基因用作测试案例。表2显示mecA的引物组，其转录物长度在99到402 bp之间变化。使全血掺有从MRSA中分离的基因组DNA。使用以上确定的优化的NR-PCR条件，用这些引物组中的每一个生成个体分析物的CD光谱。将CD光谱叠加，并确定每个引物组的峰值波长。然后，该数据用于生成CD峰相对于转录物长度的曲线图。为了评估进行多重反应的能力，如上所述使全血掺有MSSA或MRSA。各自进行含有两个NR引物组(一个用于mecA-99 bp；和一个用于femA-306 bp)的NR-PCR反应，并获得CD光谱。通过比较具有两种模板反应物(mecA和femA)的MRSA样品的光谱与仅具有一种(femA)的MSSA样品的光谱，确定由同一试管中两种不同NR复合物产生的光谱差异。经主成分分析进行定量比较。

表1：PCR引物

表2：mecA引物

实施例3

抗生素敏感性的测定

NR-PCR的超灵敏度允许检测细菌浓度的细微差异。在存在和不存在抗生素的情况下对于细菌作为时间的函数进行NR-PCR反应，以确定可以可靠地检测到差异的最早的时间。这建立NR-PCR用于抗生素敏感性测试(AST)的能力。

当前的临床实践为针对怀疑菌血症的患者开始使用广谱抗生素，并然后一旦进行了AST即缩窄至靶向治疗。这种一刀切的方法是必需的，因为具有AST的血液培养可能需要72小时或更长时间。AST的一般概念为评估临床样品中检测到的细菌在存在特定抗生素的情况下持续生长或复制的能力。如果细菌对抗生素具有抗性，它将复制并且其浓度在存在该抗生素的情况下会增加。另一方面，敏感细菌在存在抗生素的情况下将无法复制。

鉴于NR-PCR系统的高灵敏度，完成检测细菌浓度的该差异的时间比传统AST显著更短。例如，如果以10 CFU/ml检测细菌，并且在营养丰富的培养基中其倍增时间为30分钟，考虑到指数生长之前的典型延滞期，在2小时内进行2-3个倍增周期，结果细菌浓度增加到高达80 CFU/ml。使用NR-PCR区分10和80 CFU/ml之间CD峰的差异。因此，对抗生素X具有抗性的细菌在培养基加抗生素X中温育2小时之后，具有信号的增加，而敏感的同一物种的不同菌株将具有相同或减小的信号，如图6所示。

为了确证NR-PCR测定的AST能力，评估了两种具有不同抗生素敏感性的细菌菌株。具体地讲，金黄色葡萄球菌SH1000 (对甲氧西林敏感)对阿莫西林和万古霉素敏感，而金黄色葡萄球菌COL (MRSA)对阿莫西林具有抗性和对万古霉素敏感。

肉汤微量稀释法(基于临床和实验室标准协会(Clinical and LaboratoryStandards Institute)的指南)用于确定两种金黄色葡萄球菌菌株的阿莫西林和万古霉素的最低抑菌浓度(MIC)。简而言之，将标准接种物与不同浓度的抗生素在TSBG中于37℃下温育16小时。MIC定义为抑制细菌生长的最低抗生素浓度。该浓度用于通过NR-PCR评估AST。使全血掺有每种细菌菌株的已知接种物，其水平刚好高于以上确定的检测限。立即使用NR-PCR系统测试该样品的等分试样，以确认细菌种类的检测和ID。然后将另外的等分试样接种到装有补充有1xMIC阿莫西林或万古霉素的TSBG的小瓶中。也有没有抗生素控制的培养基以确定基线生长。然后将这些小瓶在37℃有氧条件下进行温育。在0.5、1、1.5、2和3小时从每个小瓶中取出样品，并经NR-PCR处理以生成CD峰对比时间的曲线，如图6所示。可在统计学上区分的那些生长曲线的最早时间定义AST所需的最短时间。

Claims (45)

1.一种检测生物样品中的多种微生物的方法，其包括：

a) 对生物样品进行核酸扩增以产生多种不同长度的包含纳米颗粒的扩增产物；

b) 在掺入所述扩增产物中的所述纳米颗粒上沉积金属壳以产生包含金属包覆的纳米颗粒的扩增产物；和

c) 使用圆二色性(CD)检测所述包含金属包覆的纳米颗粒的扩增产物。

2.权利要求1的方法，其中所述扩增为PCR。

3.权利要求2的方法，其中所述PCR利用多种正向和反向引物，其中所述引物附着于纳米颗粒。

4.权利要求1-3中任何一项的方法，其中所述纳米颗粒为金纳米颗粒。

5.权利要求3或4的方法，其中所述正向和所述反向引物包含不同大小的纳米颗粒。

6.权利要求1-5中任何一项的方法，其中所述纳米颗粒为纳米棒。

7.权利要求1-6中任何一项的方法，其中所述包含金属纳米颗粒的扩增产物组装成并排的梯，所述梯在纳米颗粒之间包含间隙距离。

8.权利要求1-6中任何一项的方法，其中所述不同长度的扩增产物呈现出不同波长的CD峰。

9.权利要求1-7中任何一项的方法，其中所述金属壳为金、铜或银。

10.权利要求1-9中任何一项的方法，其中所述微生物为细菌。

11.权利要求10的方法，其中所述细菌为病原细菌。

12.权利要求10或11的方法，其中所述细菌为抗生素抗性细菌。

13.权利要求3的方法，其中所述引物扩增多个生物体特异性和/或抗生素抗性基因。

14.权利要求1-13中任何一项的方法，其中所述生物样品为全血。

15.权利要求14的方法，其中在进行所述方法之前，不对所述样品进行培养或纯化。

16.权利要求1-15中任何一项的方法，其中所述方法在3小时或更短的时间内进行。

17.权利要求1-16中任何一项的方法，其中所述方法在2.5小时或更短的时间内进行。

18.权利要求1-17中任何一项的方法，其进一步包括在进行所述方法之前使所述样品与抗生素接触的步骤。

19.一种检测生物样品中的多种微生物的方法，其包括：

a) 使包含病原细菌的生物样品与抗生素接触；

b) 对所述生物样品进行扩增产生多种不同长度的包含纳米颗粒的扩增产物；

c) 在掺入所述扩增产物中的所述纳米颗粒上沉积金属壳以产生包含金属包覆的纳米颗粒的扩增产物；和

d) 使用圆二色性(CD)检测所述包含金属包覆的纳米颗粒的扩增产物。

20.权利要求19的方法，其中所述扩增为PCR。

21.权利要求20的方法，其中所述扩增利用多种正向和反向引物，其中所述引物附着于纳米颗粒。

22.权利要求19-21中任何一项的方法，其中所述生物样品与所述抗生素一起培养。

23.权利要求19-22中任何一项的方法，其中所述纳米颗粒为金纳米颗粒。

24.权利要求19-23中任何一项的方法，其中所述正向和所述反向引物包含不同大小的纳米颗粒。

25.权利要求19-24中任何一项的方法，其中所述纳米颗粒为纳米棒。

26.权利要求19-25中任何一项的方法，其中所述包含金属纳米颗粒的扩增产物组装成并排的梯，所述梯在纳米颗粒之间包含间隙距离。

27.权利要求19-26中任何一项的方法，其中所述不同长度的扩增产物呈现出不同波长的CD峰。

28.权利要求19-27中任何一项的方法，其中所述金属壳为金、铜或银。

29.权利要求19-28中任何一项的方法，其中所述细菌为抗生素抗性细菌。

30.权利要求21的方法，其中所述引物扩增多个生物体特异性和/或抗生素抗性基因。

31.权利要求19-30中任何一项的方法，其中所述生物样品为全血。

32.权利要求19-31中任何一项的方法，其中所述方法的步骤b)至d)在3小时或更短的时间内进行。

33.权利要求19-32中任何一项的方法，其中所述方法在2.5小时或更短的时间内进行。

34.一种组合物或试剂盒，其包含至少一对扩增引物，所述扩增引物包含多种正向和反向引物，其中所述引物附着于纳米颗粒。

35.权利要求34的组合物或试剂盒，其中所述纳米颗粒为金纳米颗粒。

36.权利要求34或35的组合物或试剂盒，其中所述正向和所述反向引物包含不同大小的纳米颗粒。

37.权利要求34-36中任何一项的组合物或试剂盒，其中所述纳米颗粒为纳米棒。

38.权利要求34-37中任何一项的组合物或试剂盒，其中所述组合物或试剂盒进一步包含一种或多种选自以下的组分：金属、抗生素、对照核酸、一种或多种缓冲剂和一种或多种酶。

39.权利要求38的组合物或试剂盒，其中所述金属壳为金、铜或银。

40.一种反应混合物，其包含：

多种正向和反向引物，其中所述引物附着于结合于靶核酸或其扩增产物的纳米颗粒。

41.权利要求40的反应混合物，其中所述纳米颗粒为金纳米颗粒。

42.权利要求40或41的反应混合物，其中所述正向和所述反向引物包含不同大小的纳米颗粒。

43.权利要求40-42中任何一项的反应混合物，其中所述纳米颗粒为纳米棒。

44.权利要求40-43中任何一项的反应混合物，其中所述反应混合物包覆有金属。

45.权利要求44 的反应混合物，其中所述金属壳为金、铜或银。

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