JP2010505394A - 分子スイッチおよびそれらの使用のための方法 - Google Patents

分子スイッチおよびそれらの使用のための方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、多成分核酸複合体の触媒活性の操作を可能にする組成物および方法に関する。さらに、本発明は、これらの組成物を使用する方法、ならびに分子センサー、分子スイッチ、および/または自己触媒性自己複製カスケードおよび他の反復プロセスのモジュレーターもしくはプロパゲーターを作製する方法を提供する。より詳細には、本発明は、活性および不活性な多成分核酸複合体の自己組織化を可能にする組成物、そのような組成物を製造する方法、ならびに使用のための方法に関する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、2006年10月6日に提出された米国仮特許出願第60/828,451号の恩典を主張し、これはその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
技術分野
本発明は、多成分核酸（MNA）複合体の触媒活性の操作を可能にする組成物および方法に関する。さらに、本発明は、これらの組成物を用いる方法、ならびに分子センサー、分子スイッチ、および/または自己触媒性自己複製カスケードもしくは他の反復プロセスのモジュレーター（modulator）もしくはプロパゲーター（propagator）を作り出すための方法を提供する。より詳細には、本発明は、活性および不活性な多成分核酸複合体の自己組織化（self-assembly）を可能にする組成物、そのような組成物を製造するための方法、および使用のための方法に関する。
発明の背景
その進化上で最適化された機能に加えて、核酸の尋常でない物理的および機能的な特性は、非常に数多くの新たな生体分子性のデバイスおよび方法に対する機会を提供する。人工的に設計された（designer）核酸は、治療用物質（therapeutic entity）、バイオセンサー、ナノスケールデバイス、および分子計算のためのツールとして検討されている。これらの方法は、DNAの自己組織化、電導性、情報素子、増幅、スイッチング、分子検出および触媒活性という特徴を利用している。さらに、DNAは頑強で安定でかつ耐熱性であるため、それは機械的または計算用デバイスの分子エンジニアリングのための理想的な材料を提供する。
DNAおよびRNAなどの一本鎖核酸は、高度に特異的な受容体（アプタマー）および触媒（リボザイムおよびDNAzyme）として機能しうる複雑な三次元構造へとフォールディングしうる能力を有する。さらに、ハイブリダイゼーションのための核酸鎖間の相補性に対する要件が、標的検出（例えば、マイクロアレイ分析、ノーザンブロット法またはサザンブロット法）および/または標的増幅（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応）を可能にする広範囲にわたる手法の基盤をなす。さらに、ハイブリダイゼーションは、核酸のナノスケール構築のため、およびDNAに基づく計算戦略のための基盤も提供する。
自己複製は、個物（individual）がそれ自体の写しを作る（コピーする）ことのできる過程である。そのような過程において、各反応の産物は、構成部分からの個物の新たなコピー（レプリコン）の形成を導く。非常にさまざまな手法が、核酸配列の自己複製のために開発されている。
標的核酸配列のインビトロ複製（標的増幅）のための方法は、当技術分野で周知である。これらの方法の多くは、標的DNAまたはRNAとの特異的ハイブリダイゼーションが可能なオリゴヌクレオチドプライマーを必要とし、それをDNAポリメラーゼまたはRNAポリメラーゼによって伸長させ、標的を合成を導くためのテンプレートとして用いることで、標的（アンプリコン）の新たなコピーを作り出すことができる。そのような手法（Schweitzer and Kingsmore, 2001に総説されている）には、ポリメラーゼ連鎖反応、鎖置換増幅、ローリングサークル増幅およびループ媒介等温増幅、転写媒介増幅、自己持続配列複製および核酸配列複製に基づく増幅が含まれる。リガーゼ連鎖反応（「LCR」）として知られる一つの代替的なアプローチは、核酸標的を増幅するためにプロテインリガーゼを用いる。この反応は、各回の連結産物が、標的の新たなコピーの連結を導くテンプレートとしての役を果たす能力に依存する（Barany, 1991）。
上記のもののような標的増幅技術は、研究および/または臨床診断において広く用いられてきた。しかし、その能力にもかかわらず、それぞれには固有の短所がある。それらはすべて、タンパク質酵素（例えば、DNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼ、逆転写酵素および/またはリガーゼ）の使用を必要とする。タンパク質酵素を含めることにより、複雑さおよび試薬製造の費用が増加し、試薬を含むキットの貯蔵寿命が短くなる。関連のあるその他の技術的課題には、偽陽性シグナルを招く以前の反応物からのレプリコン（標的アンプリコン）の混入、および/またはプライマー配列の複製（プライマー-二量体）によって引き起こされる、もしくは標的非依存的な連結によって引き起こされるバックグラウンドシグナルが含まれる。
酵素活性または触媒活性を有する、非常にさまざまな核酸分子がこの20年間で発見されている。RNA酵素（「リボザイム」）は自然界に存在するが、標的RNA基質を特異的に認識して修飾するように人工的に操作することができる（Haseloff and Gerlach, 1988）。インビトロ進化の手法により、「DNA酵素」または「DNAzyme」としばしば称されるデオキシリボ核酸を含む、より多くの触媒性核酸の発見および開発が促された（Emilsson and Breaker, 2002に総説されている）。インビトロで進化したDNAzymeおよび/またはリボザイムが発見されており、これは核酸の切断（Carmi et al., 1996; Raillard and Joyce, .1996; Breaker, 1997; Santoro and Joyce, 1998）、核酸のライゲーション（Cuenoud and Szostak, 1995, Prior et al., 2004）、ポルフィリンメタル化（Li and Sen, 1996）、および炭素-炭素結合（Tarasow et al., 1997）、エステル結合（Illangasekare et al., 1995）またはアミド結合（Lohse and Szostak, 1996）の形成を含む広範な反応を触媒する能力を有していた。
詳細には、ワトソン・クリック塩基対合によるハイブリダイゼーション後に異なる核酸配列を特異的に切断するDNAzymeおよびリボザイムが、特性付けされている。DNAzymeは、RNA（Breaker and Joyce, 1994; Santoro and Joyce, 1997）またはDNA（Carmi et a.l, 1996）分子のいずれかを切断することができる。リボザイムも、RNA（Haseloff and Gerlach, 1988）標的配列とDNA (Raillard and Joyce, 1996）標的配列の両方を切断することができる。多くの核酸酵素の触媒的切断の速度は、二価金属イオン、例えば、Ba2+、Sr2+、Mg2+、Ca2+、Ni2+、Co2+、Mn2+、Zn2+、およびPb2+の存在および濃度に依存する（Santoro and Joyce, 1998; Brown et al., 2003）。
「10：23」および「8：17」DNAzymeは、特定のRNAホスホジエステル結合の箇所で核酸基質を切断して、2',3'-環状リン酸基および5'-ヒドロキシル基を有する反応産物を作り出す（Santoro and Joyce, 1997；Emilsson and Breaker, 2002に総説されている)。2',3'-環状リン酸産物および5'-ヒドロキシル産物を連結しうるデオキシリボザイム（DNAzyme）の例には、「7Z81」および「7Z48」リガーゼが含まれる（Prior, 2004）。
ハンマーヘッド型リボザイム、10：23および8：17 DNAzyme、ならびに「7Z81」および「7Z48」リガーゼを含む、いくつかの触媒性核酸は、複数のドメインを有する類似の基本構造を有する。これらの核酸酵素は、基質を特異的に認識してそれとハイブリダイズする二つの非保存的な基質結合ドメイン（「アーム」）に挟まれた保存的な触媒ドメイン（触媒コア）を有する。これらの核酸酵素は真のマルチターンオーバー（multiple turnover）酵素として機能しうるが、各酵素は1つの分子、すなわちそれが続いて触媒的に修飾することのできる基質を認識する能力しか有していない。
触媒性核酸は、触媒コアを形成する区域内では、ある特定の修飾にしか許容性がないことが示されている（Perreault et al., 1990；Perreault et al., 1991；Zaborowska et al., 2002；Cruz et al., 2004；Silverman, 2004)）。反応条件のストリンジェンシーによっては、基質アーム内部ではある程度のミスマッチが許容される。しかし、ワトソン-クリック型塩基対合のための要件は、類縁性の高い配列の識別を容易にするために触媒性核酸を用いるプロトコールの開発を可能とした程度に十分に厳格である（Cairns et al., 2000）（WO 99/50452号）。
「アプタマー」とは、その高次構造、例えば3-D結合ドメインまたはポケットのために、一つまたは複数のリガンドを高い親和性および特異性で認識する能力を有する、DNA、RNAまたはペプチドの配列のことである。多くのアプタマーが、例えば、核酸、タンパク質、プリオン、低分子有機化合物および/または生物体全体を含むリガンドと結合する能力に関してインビトロで進化させられている。「アプタザイム（aptazyme）」は、アプタマーおよび触媒性核酸配列（リボザイムまたはDNAzyme）の両方で構成される配列を有する。リガンドとアプタマーとの結合はアプタザイムにおけるコンフォメーション変化を誘導し、その結果、リボザイムまたはDNAzymeが活性化される。
Sandoら（2003）は、標的センシング配列、DNAzymeドメインおよび隣接するDNAzymeに対する二重標識DNA/RNAキメラ基質を構成する複数のドメインを含むセンシング分子（標的補助自己切断（target-assisted self cleavage）（TASC）プローブ）を用いるシグナル増幅戦略を開発した。この方法はタンパク質酵素の使用を回避しているものの、TASCプローブは新たな標的毎に特別仕様で製造しなければならない複雑かつ高価な分子である。
いくつかのグループが、比色測定読み取り値による核酸標的および他の分析物の検出を報告している（Elghanian et al., 1997, Mirkin et al, 1996、およびLiu and Lu, 2004）。この戦略はオリゴヌクレオチドをタグ付加したナノスケール金粒子を用いる。続いて「架橋性オリゴヌクレオチド」の添加によって金粒子を凝集させて、色調を赤から青に変化させることができる（Mirkin et al, 1996）。Liu and Lu（2004）は、DNAzymeの活性化が金粒子の切断、分散および色調の青から赤への変化を引き起こすように、架橋性オリゴヌクレオチドにDNAzyme基質を組み入れることにより、この戦略を拡張した。このグループはこのアプローチを、鉛感受性DNAzymeを用いて鉛を検出するため、およびアプタザイムを用いてアデノシンを検出するために用いている。
触媒性核酸を用いる増幅カスケードのいくつかの例が、当技術分野で公知である。チモーゲン/DzyNAアプローチは、標的増幅（例えば、PCR）をDNAzyme複製と組み合わせている。標的とともに同時増幅されたDNAzymeが一つまたは複数の汎用レポーター基質を切断することで、一つまたは複数の標的の包括的検出が可能になる（US 6,140,055号；US 6,201,113号；US 6365724号；WO 99/45146号、Todd et al., 2000）。増幅を媒介するためにタンパク質酵素の代わりに触媒性核酸を用いる、増幅カスケードのための戦略が考案されている。もう一つのアプローチにおいて、シグナル増幅カスケードは、交差切断によって互いに活性化して線状化を結果的にもたらしうる二つの不活性環状化10：23 DNAzymeを用いている。Paul and Joyce（2004）は、リガーゼ活性を有するリボザイムによって媒介される複製カスケードを記載している。この反応において、第一のリボザイムは、オリゴヌクレオチドを含む二つのRNAを連結して、第二のリボザイムを形成する。続いて、第二のリボザイムがオリゴヌクレオチドを含む他の二つの他のRNAを連結して、新たな第一のリボザイムを形成し、それ故に複製カスケードが誘発されて、第一および第二のリボザイムの両方の新たなコピーを生成する。
核酸カスケードは、広範囲のバイオテクノロジー用途、特に診断に関して検討されてきた。それらは、シグナル増幅を容易にすることにより、疾患診断のためのタンパク質および核酸の検出を可能にしうると考えられる。触媒性核酸および/またはカスケード反応は、診断以外の用途のためにも、例えば、治療に用いうる可能性のあるナノスケールデバイスおよびスイッチの計算機分析および生体分子エンジニアリングの分野で用いることができる。
情報を有限の手順に従って一つの形態から別のものに変換することのできるデバイスは、オートマトンと呼ばれる。計算問題を解くことのできるプログラム可能な有限オートマトンが、タンパク質酵素（制限エンドヌクレアーゼおよびリガーゼ）ならびに二本鎖DNAを用いて開発されている（Benenson et al, 2001）。酵素は「ハードウエア」としての役を果たし、DNAは「ソフトウエア」をコードする。入力（input）およびオートマトンは、適切なDNAソフトウエアの選択によってプログラムされる。オートマトンは切断、ハイブリダイゼーションおよび連結サイクルのカスケードを介して進行し、オートマトンの最終的な状態およびそれ故に計算結果をコードする、検出可能な出力（output）分子を生成する。
生体分子を入力データとして、生物活性分子を出力として用いる単純な分子スケールのプログラム可能なコンピュータを用いて、生物過程の論理的制御のためのシステムを作り出すことが可能であった（Benenson et al, 2004）。インビトロでの概念実証として、Benensonらは、（i）特定のメッセンジャーRNA種の存在量を測定すること、および（ii）遺伝子発現に影響を及ぼしうる一本鎖DNAアンチセンス分子を放出することによって応答すること、ができる生体分子コンピュータを開発した。分子スケールの論理ゲートを作り出すためにDNAzymeのネットワークを用いたもう一つの分子オートマトンは、「三目並べ（tic-tac-toe）」を実行するようにプログラムされた（Stojanovic and Stefanovic, 2003）。最近、一つの配列を認識してそれとハイブリダイズし（「読み」）、かつ別個の異なる配列を連結させ（「書く」）、それを次にPCRによって増幅することが可能な、リガーゼ活性を有する二値（binary）DNAzymeが人工的に作られている（Tabor et al, 2006）。
DNA計算を生物学と連携させる方法には幅広い用途がある。例えば、単純なDNA論理ゲートは、例えば高血糖および低グルカゴンといった生理的シグナルの組み合わせに基づいて、インスリンの放出を調節することができている（Cox and Ellington 2001）。以上を総合すると、核酸の新たな機能性の探索における進展は、アプタマーおよび触媒性核酸といった一連のツール、ならびに新たなナノスケール分子「機械」の成分を開発を可能にする新たな構造成分をもたらしている。
ナノデバイスおよびオートマトンを動作させるために、（i）分枝鎖移動、二次構造形成、例えばヘアピン形成による相補鎖間のハイブリダイゼーションの阻害を含むハイブリダイゼーション過程、（ii）制限エンドヌクレアーゼを用いた切断、ならびに（iii）DNA中心軸周りの回転、収縮伸展および直進運動といったコンフォメーション変化の誘導を含む、いくつかの過程が用いられてきた。アプタマーによるタンパク質の制御放出のための、あるモジュール式DNAシグナル翻訳装置（modular DNA signal translator）は、任意のDNA配列を「入力」として用いている（Beyer and Simmel, 2006）。
したがって、安定な核酸成分を用いて実施しうる、標的の検出のため、およびプログラム可能なデバイスを含むナノスケールデバイスの組織化のための、簡単で、迅速で、かつ費用対効果の大きい方法に対しては、当技術分野において継続的な需要がある。
本発明の一つの局面においては、少なくとも一つのオリゴヌクレオチドパートザイムを含む分子スイッチが提供され、ここで前記パートザイムは、触媒コア部分、センサーアーム部分および基質アーム部分のうち少なくとも一つ、ならびに組織化助長因子（assembly facilitator）オリゴヌクレオチド、基質オリゴヌクレオチド、活性阻害因子および組織化阻害因子、またはそれらの任意の組み合わせを含む群から選択される少なくとも一つのさらなるオリゴヌクレオチド成分を含み、前記分子スイッチは多成分核酸（MNA）複合体を形成することができる。
一つの態様において、スイッチには、分解された複合体、部分的に組織化した複合体、完全に組織化したMNAzyme、または完全に組織化した触媒的に不活性なMNA複合体が含まれうる。さらに、スイッチにはMNAiも含まれうる。
もう一つの態様において、活性阻害因子は、前記オリゴヌクレオチドのうち少なくとも一つに対して実質的に非相補的なヌクレオチド配列を含みうる。
もう一つの態様において、パートザイムセンサーアーム、パートザイム基質アーム、組織化助長因子オリゴヌクレオチドおよび基質オリゴヌクレオチドのうち一つまたは複数は、少なくとも二つの分子を含む。さらに、パートザイムセンサーアーム、パートザイム基質アーム、組織化助長因子オリゴヌクレオチド、基質オリゴヌクレオチド、活性阻害因子または組織化阻害因子のうち一つまたは複数は、少なくとも一つの自己相補性領域を含みうる。
もう一つの態様において、パートザイムセンサーアーム、パートザイム基質アーム、組織化助長因子オリゴヌクレオチドおよび基質オリゴヌクレオチドのうち一つまたは複数は、少なくとも一つのアプタマーおよび少なくとも一つの組織化阻害因子をさらに含みうる。
もう一つの態様において、前記スイッチの少なくとも一つの成分は、入力事象に対する複合体の感度が増大もしくは低下するように、および/または出力シグナルの強度が変化するように適合させることができる。
一つのさらなる態様において、活性阻害因子は、組織化助長因子ドメイン、活性阻害因子ドメイン、レポータードメイン、基質ドメインまたはそれらの任意の組み合わせのうち少なくとも一つを含みうる。
もう一つの態様において、スイッチは、少なくとも一つの安定化アームをさらに含みうる。
もう一つの態様において、前記スイッチの少なくとも一つの成分は核酸を含みうる。
一つのさらなる態様において、前記スイッチの少なくとも一つの成分は、少なくとも一つのナノ粒子、マイクロ粒子またはそれらの組み合わせをさらに含みうる。
本発明のもう一つの局面においては、分子スイッチとしてのMNA複合体の使用法であって、前記複合体が入力事象に応答して不活性MNA複合体から活性MNA複合体に遷移する、使用法が提供される。
一つの態様において、不活性複合体には、分解された複合体、部分的に組織化した複合体、または完全に組織化した触媒的に不活性な複合体が含まれうる。さらに、触媒的に不活性なMNA複合体は組織化阻害因子も含みうる。さらになお、触媒的に不活性なMNA複合体はMNAiであってもよい。
もう一つの態様において、MNAiは、活性阻害因子ドメイン、活性化因子組織化助長因子ドメイン、レポータードメイン、基質ドメイン、またはそれらの任意の組み合わせのうち少なくとも一つを含む活性阻害因子を含みうる。
もう一つの態様において、活性MNAzymeへの遷移は、前記MNAiからの少なくとも前記活性阻害因子または活性阻害因子ドメインの置き換え（displacement）を含みうる。さらに、置き換えは、前記活性阻害因子ドメインと前記活性化因子組織化助長因子ドメインとを連結している切断可能な基質の切断を伴いうる。
もう一つの態様において、入力事象は、阻害因子の除去またはその阻害機能の不活性化を含みうる。さらに、入力事象は、触媒的に活性なMNAzymeの組織化を結果としてもたらしうる。さらになお、入力事象は、（i）外因性の供給（provision）によってもたらされるか、または（ii）MNA複合体の環境内での反応の産物である、活性化因子の供給を含みうる。
本発明のもう一つの局面においては、分子スイッチとしてのMNA複合体の使用法であって、前記複合体が入力事象に応答して活性MNA複合体から不活性MNA複合体に遷移する、使用法が提供される。
一つの態様において、活性複合体はMNAzymeでありうる。
もう一つの態様において、不活性MNA複合体への遷移は、活性MNA複合体の分解（disassembly）に伴うものでありうる。さらに、不活性MNA複合体への遷移が、不活性MNA複合体の組織化に伴うものであってもよい。
もう一つの態様において、入力事象は、阻害因子の添加またはその阻害機能の活性化でありうる。さらに、入力事象が、阻害因子の結合であってもよい。さらになお、阻害因子が組織化阻害因子であってもよい。その上さらになお、阻害因子が活性阻害因子または活性阻害因子ドメインであってもよい。
もう一つの態様において、不活性MNA複合体はMNAiでありうる。
もう一つの態様において、活性阻害因子または組織化阻害因子は、（i）外因性の供給によってもたらされうる、または（ii）MNA複合体の環境内での反応の産物でありうる。
前の二つの局面のうちいずれかのもう一つの態様において、遷移は出力シグナルの変化を結果的にもたらしうる。
前の二つの局面のうちいずれかのもう一つの態様において、入力事象は、温度、塩濃度、イオン強度、pH、二価陽イオンの有無、種類もしくは濃度、電荷、磁荷の変化、物理的操作、およびMNAもしくはモジュレーター成分もしくは微小環境の成分の濃度の変化、またはそれらの任意の組み合わせを含む群から選択されうる。
前の二つの局面のうちいずれかのもう一つの態様において、出力シグナルの変化には、以前には存在していなかったシグナルの出現、以前に存在していたシグナルの消失、または出力シグナルの増加もしくは減少が含まれうる。
前の二つの局面のうちいずれかのもう一つの態様において、出力シグナルは基質の修飾の程度に依存してよく、ここで修飾は、切断、連結、ポルフィリンメタル化（porphyrin metallation）、炭素-炭素結合、エステル結合もしくはアミド結合の形成、またはそれらの任意の組み合わせを含む群から選択される。
前の二つの局面のうちいずれかのもう一つの態様において、出力シグナルは、蛍光分光法、表面プラズモン共鳴、質量分析法、NMR、電子スピン共鳴、偏光蛍光分光法、円二色性、イムノアッセイ、クロマトグラフィー、放射分析、光度計測法、シンチグラフィー、電子工学的方法、UV、可視光もしくは赤外分光法、酵素的方法、またはそれらの任意の組み合わせによって決定されうる。さらに、決定は、出力シグナルを定量化することが可能な様式で行うことができる。さらになお、入力事象の大きさは、定量化された出力シグナルから決定されうる。その上さらになお、入力事象または出力シグナルの一方または両方を増幅してもよい。さらにまた、出力シグナル増幅をシグナルカスケードによって生じさせてもよい。
本発明のもう一つの局面においては、二つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチド成分、および少なくとも一つの活性阻害因子分子を含むMNAiが提供される。
一つの態様において、MNAiはさらに、少なくとも一つの組織化助長因子を含みうる。
もう一つの態様において、活性阻害因子は、活性化因子組織化助長因子ドメイン、活性阻害因子ドメイン、レポータードメイン、基質ドメイン、またはそれらの任意の組み合わせのうち少なくとも一つを含みうる。さらに、活性阻害因子ドメイン、活性化因子組織化助長因子ドメインおよびレポータードメインのうち少なくとも二つは、活性阻害因子の別個のドメイン上に位置しうる。さらになお、活性阻害因子ドメイン、活性化因子組織化助長因子ドメインおよびレポータードメインのうち少なくとも二つは、不安定なリンカーまたは切断可能な基質によって連結されてもよい。その上さらになお、基質は、活性化因子組織化助長因子ドメイン、活性阻害因子ドメイン、レポータードメイン、またはそれらの任意の組み合わせのうち少なくとも一つを含みうる。
もう一つの態様において、活性阻害因子は、前記二つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチド成分のうち少なくとも一つに対して実質的に非相補的なヌクレオチド配列を含みうる。
もう一つの態様において、組織化助長因子が標的であってもよい。さらに、核酸は、DNA、メチル化DNA、アルキル化DNA、RNA、メチル化RNA、マイクロRNA、siRNA、shRNA、tRNA、mRNA、snoRNA、stRNA、smRNA、プレ-マイクロRNAおよびプリ-マイクロRNA、他の非コーディングRNA、リボソームRNA、それらの誘導体、アンプリコン、またはそれらの任意の組み合わせからなる群より選択されうる。
もう一つの態様において、MNAiの少なくとも一つの成分が、アプタマーをさらに含んでもよい。
本発明のもう一つの局面においては、少なくとも二つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチド成分を含むMNAi組成物であって、少なくとも第一のオリゴヌクレオチド成分および第二のオリゴヌクレオチド成分が少なくとも一つのMNA複合体活性阻害因子の存在下で自己組織化することができ、前記少なくとも第一および前記第二のオリゴヌクレオチド成分のそれぞれが基質アーム部分、触媒コア部分およびセンサーアーム部分を含み；自己組織化が起こると、前記第一および第二のオリゴヌクレオチド成分のセンサーアーム部分がセンサーアームとして作用し、第一および第二のオリゴヌクレオチド成分の基質アーム部分が基質アームとして作用し、かつ第一および第二のオリゴヌクレオチド成分の触媒コア部分が非機能性触媒コアを形成し；かつ
自己組織化が起こると、少なくとも一つのセンサーアームが前記活性阻害因子と相互作用し、前記第一および第二のオリゴヌクレオチド成分がその各々の触媒コア部分の会合のために近傍に維持されて、非機能性触媒コアを形成する、MNAi組成物が提供される。
一つの態様において、MNAi組成物は少なくとも一つの組織化助長因子をさらに含みうる。
もう一つの態様において、活性阻害因子は、活性化因子組織化助長因子ドメイン、活性阻害因子ドメイン、レポータードメイン、基質ドメイン、またはそれらの任意の組み合わせのうち少なくとも一つを含みうる。
もう一つの態様において、活性阻害因子ドメイン、活性化因子組織化助長因子ドメインおよびレポータードメインのうち少なくとも二つは、活性阻害因子上の別個のドメインに位置しうる。さらに、活性阻害因子ドメイン、活性化因子組織化助長因子ドメインおよびレポータードメインのうち少なくとも二つは、不安定なリンカーまたは切断可能な基質によって連結されてもよい。
もう一つの態様において、活性阻害因子が基質であってもよい。
もう一つの態様において、活性阻害因子は、前記二つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチド成分のうち少なくとも一つに対して実質的に非相補的なヌクレオチド配列を含みうる。
もう一つの態様において、複合体の少なくとも一つの成分が少なくとも一つのアプタマーまたはその部分を含んでもよく、ここで前記アプタマーまたはその部分は、核酸、タンパク質、糖タンパク質、脂質、リポタンパク質、細胞、ウイルス、細菌、古細菌、真菌、抗体、代謝産物、病原体、毒素、汚染物質、毒物、小分子、ポリマー、金属イオン、金属塩、プリオン、またはそれらの任意の誘導体、部分もしくは組み合わせを含む群から選択されるリガンドと結合する。
本発明のもう一つの局面においては、第一のMNAzyme、実質的に触媒的に不活性な形態で最初は存在するMNA複合体（MNAi）、前記第一のMNAzymeによって修飾されて検出可能な影響をもたらしうる活性阻害因子を含むシグナルカスケードを用いる、組織化助長因子の検出のための方法であって、前記活性阻害因子が活性阻害因子および潜在的基質の両方であり；かつ
前記第一のMNAzyme触媒活性が可能な条件下での、前記組織化助長因子と該第一のMNAzymeに対するパートザイムとの会合が、該第一のMNAzymeの触媒活性を助長し、それによって前記活性阻害因子の修飾をもたらして、活性化因子組織化助長因子ドメインおよび該活性阻害因子の活性阻害因子ドメインを放出させ、該放出が前記検出可能な影響をもたらし；かつ
前記放出された活性化因子組織化助長因子ドメインが、前記MNA複合体の成分からの第二のMNAzymeの組織化を助長し；かつ
前記第二のMNAzymeの触媒活性が前記活性阻害因子を修飾して、さらなる活性阻害因子ドメインおよびさらなる活性化因子組織化助長因子ドメインを放出させ、該放出がさらなる検出可能な影響をもたらし、かつ；
前記のさらなる活性化因子組織化助長因子ドメインが追加の第二のMNAzymeの組織化を助長し、それによってさらなる前記触媒的に活性な第二のMNAzymeをもたらし、それによって前記組織化助長因子の存在を示すさらなる検出可能な影響をもたらす、
検出方法が提供される。
一つの態様において、活性阻害因子はレポーター-阻害因子-助長因子であってよい。
もう一つの態様において、前記活性阻害因子、前記第一のMNAzymeまたは前記第二のMNA複合体成分のうち一つまたは複数を、不溶性支持体に結び付けてもよい。
もう一つの態様において、前記活性阻害因子、前記第一のMNAzymeまたは前記第二のMNA複合体成分のうち一つまたは複数を、溶液中に遊離させてもよい。
もう一つの態様において、活性阻害因子は、組織化助長因子ドメイン、活性阻害因子ドメイン、レポータードメイン、基質ドメイン、またはそれらの任意の組み合わせのうち少なくとも一つを含みうる。さらに、活性阻害因子は検出可能な部分およびクエンチャーを含んでもよく、前記第一のまたは前記第二のMNAzymeによる前記活性阻害因子の修飾が起こると、前記検出可能な部分によってもたらされる検出可能な影響が増加または減少する。さらになお、検出可能な影響は、蛍光分光法、表面プラズモン共鳴、質量分析法、NMR、電子スピン共鳴、偏光蛍光分光法、円二色性、イムノアッセイ、クロマトグラフィー、放射分析、光度計測法、シンチグラフィー、電子工学的方法、UV、可視光もしくは赤外分光法、酵素的方法、またはそれらの任意の組み合わせによって検出されうる。その上さらになお、検出可能な影響を測定することもでき、ここで前記測定の大きさは組織化助長因子の量を示す。
もう一つの態様において、組織化助長因子が標的であってもよい。さらに、標的は、DNA、メチル化DNA、アルキル化DNA、RNA、メチル化RNA、マイクロRNA、siRNA、shRNA、tRNA、mRNA、snoRNA、stRNA、smRNA、プレ-マイクロRNAおよびプリ-マイクロRNA、他の非コーディングRNA、リボソームRNA、それらの誘導体、アンプリコン、またはそれらの任意の組み合わせを含む群から選択されうる。
もう一つの態様において、第一のMNAzymeおよび/または第二のMNA複合体の成分のうち少なくとも一つはアプタマーをさらに含んでよく、ここで前記方法は、該アプタマーと結合するリガンドの検出をもたらす。さらに、リガンドは、タンパク質、ポリペプチド、ペプチドまたは核酸、糖タンパク質、脂質、リポタンパク質、細胞、ウイルス、細菌、古細菌、真菌、抗体、代謝産物、病原体、毒素、汚染物質、毒物、生物体全体、小分子、ポリマー、金属イオン、金属塩、プリオン、またはそれらの任意の誘導体、部分もしくは組み合わせを含みうる。
もう一つの態様において、組織化助長因子は、入力事象として作用する合成オリゴヌクレオチドであってもよい。
もう一つの態様において、触媒的に活性なMNAzymeの組織化は、温度、塩濃度、イオン強度、pH、二価陽イオンの有無、種類もしくは濃度、電荷、磁荷の変化、物理的操作、およびMNAもしくはモジュレーター成分もしくは微小環境の成分の濃度の変化、またはそれらの任意の組み合わせを含む群から選択される入力事象によって調節されうる。
本発明のもう一つの局面においては、カスケードを用いて標的を検出する方法であって、前記カスケードが、該標的の存在下で形成される開始MNAzyme；該開始MNAzymeの産物の存在下で形成される第一のMNAzyme；該第一のMNAzymeの産物の存在下で形成される追加のMNAzymeを含み、以下の段階：
（i）第一の基質を前記開始MNAzymeにより修飾して第一の組織化助長因子を生成させる段階；
（ii）前記第一のMNAzymeを前記第一の組織化助長因子により組織化させる段階；
（iii）追加の基質を前記第一のMNAzymeにより修飾して追加の組織化助長因子を生成させる段階；
（iv）前記追加のMNAzymeを前記追加の組織化助長因子により組織化させる段階；
（v）前記第一の基質を前記追加のMNAzymeにより修飾して前記第一の組織化助長因子を生成させる段階；
（vi）前記第一のMNAzymeを（v）から放出された前記第一の組織化助長因子により組織化させ、それによって増幅カスケードを形成させる段階を含み；かつ
前記第一のまたは前記追加の基質のうち少なくとも一つの前記修飾が、前記標的の存在を示す検出可能な影響を生じさせる、方法が提供される。
一つの態様において、前記第一のまたは前記追加の組織化助長因子の一方または両方は、活性化因子組織化助長因子であってよい。
もう一つの態様において、第一の基質は前記第一のMNAzymeの活性阻害因子であってよい。
もう一つの態様において、増幅カスケードはフィードバック増幅カスケードであってよい。
もう一つの態様において、追加の基質は、前記追加のMNAzymeに対する活性阻害因子であってよい。
もう一つの態様において、第一および/または前記追加のMNAzymeは、少なくとも一つの組織化助長因子の存在下で触媒的に活性となる二つのパートザイムを含みうる。
もう一つの態様において、第一および/または前記追加のMNAzymeは、少なくとも二つの組織化助長因子成分の存在下で触媒的に活性となる二つのパートザイムを含みうる。
もう一つの態様において、第一および/または前記追加のMNAzymeは、三つまたはそれ以上の組織化助長因子成分の存在下で触媒的に活性となる二つのパートザイムを含みうる。
もう一つの態様において、標的が、検出、同定または定量化しようとする組織化助長因子分子であってもよい。さらに、標的には核酸が含まれうる。さらになお、核酸は、DNA、メチル化DNA、アルキル化DNA、RNA、メチル化RNA、マイクロRNA、siRNA、shRNA、tRNA、mRNA、snoRNA、stRNA、smRNA、プレ-マイクロRNAおよびプリ-マイクロRNA、他の非コーディングRNA、リボソームRNA、それらの誘導体、アンプリコン、またはそれらの任意の組み合わせを含む群から選択されうる。その上さらになお、前記核酸の供給源は、合成、哺乳動物、ヒト、動物、植物、真菌、細菌、ウイルス、古細菌、またはそれらの任意の組み合わせを含む群から選択されうる。
もう一つの態様において、前記MNAzymeの少なくとも一つは、少なくとも一つのアプタマーをさらに含みうる。さらに、アプタマーは少なくとも一つのリガンドと結合しうる。さらになお、リガンドは、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、核酸、糖タンパク質、脂質、リポタンパク質、細胞、ウイルス、細菌、古細菌、真菌、抗体、代謝産物、病原体、毒素、汚染物質、毒物、生物体全体、小分子、ポリマー、金属イオン、金属塩、プリオン、またはそれらの任意の誘導体、部分もしくは組み合わせを含む群から選択されうる。
もう一つの態様において、前記MNAzymeまたは前記基質の少なくとも一つの成分を、不溶性支持体に結び付けてもよく、または溶液中に遊離させてもよい。
もう一つの態様において、一つまたは複数の基質は検出可能な部分およびクエンチャー部分を含んでもよく、前記MNAzymeの少なくとも一つによる前記基質の修飾が起こると、前記検出可能な部分によって検出可能な影響がもたらされる。
もう一つの態様において、検出可能な影響は、蛍光分光法、表面プラズモン共鳴、質量分析法、NMR、電子スピン共鳴、偏光蛍光分光法、円二色性、イムノアッセイ、クロマトグラフィー、放射分析、光度計測法、シンチグラフィー、電子工学的方法、UV、可視光もしくは赤外分光法、酵素的方法、またはそれらの任意の組み合わせのうち少なくとも一つによって検出されうる。さらに、検出可能な影響を測定することもでき、ここで前記測定の大きさは標的の量を示す。
本発明のもう一つの局面においては、第一のMNAzymeに対するパートザイム、第一の基質、第二のMNAzymeに対するパートザイム、DNAzymeリガーゼ、第二の基質、追加のMNAzymeに対する追加のパートザイムおよび組織化助長因子、ならびに追加の基質を含むシグナル増幅カスケードを用いて標的を検出するための方法であって、以下の段階を含む方法が提供される：
（i）検出しようとする標的分子の存在下で、前記第一のMNAzymeに対するパートザイムから前記第一のMNAzymeを形成させる段階；
（ii）前記第一の基質を前記第一のMNAzymeで切断して、複数の切断産物を生成させる段階；
（iii）前記切断産物の少なくとも一つを前記DNAzymeリガーゼによって前記第二の基質と連結させて、前記追加のMNAzymeに対する連結されたパートザイムを作り出す段階；
（iv）前記切断産物の少なくとも一つによる組織化によって、前記第二のMNAzymeに対するパートザイムから前記第二のMNAzymeを形成させる段階；
（v）前記第一の基質を前記第二のMNAzymeで切断して、さらなる前記複数の切断産物を生成させる段階；
（vi）さらなる前記複数の切断産物の少なくとも一つによる組織化によってさらなる前記第二のMNAzymeを形成させる段階であって、それによるさらなる該第二のMNAzymeの組織化が、さらなる該複数の切断産物の蓄積を結果的に引き起こす増幅カスケードを形成し、さらなる該複数の切断産物の少なくとも一つが前記DNAzymeリガーゼに対する基質として作用する段階；
（vii）前記組織化助長因子と一緒に、前記追加のパートザイムを用いて、および前記連結されたパートザイムを用いて、前記追加のMNAzymeを形成させる段階；
（viii）前記追加の基質を前記追加のMNAzymeにより修飾して、前記標的の存在を示す検出可能な影響を結果的に引き起こす段階。
一つの態様において、増幅カスケードはフィードバック増幅カスケードであってよい。
もう一つの態様において、第二の基質と連結された切断産物は、その3'末端に2',3'-環状リン酸を有してよい。
もう一つの態様において、前記切断産物の少なくとも一つは、活性化因子組織化助長因子であってよい。
もう一つの態様において、標的が、検出、同定または定量化しようとする組織化助長因子分子であってもよい。さらに、標的には核酸が含まれうる。さらになお、核酸は、DNA、メチル化DNA、アルキル化DNA、RNA、メチル化RNA、マイクロRNA、siRNA、shRNA、tRNA、mRNA、snoRNA、stRNA、smRNA、プレ-マイクロRNAおよびプリ-マイクロRNA、他の非コーディングRNA、リボソームRNA、それらの誘導体、アンプリコン、またはそれらの任意の組み合わせを含む群から選択されうる。さらになお、前記核酸の供給源は、合成、哺乳動物、ヒト、動物、植物、真菌、細菌、ウイルス、古細菌、またはそれらの任意の組み合わせを含む群から選択されうる。
もう一つの態様において、前記第一のMNAzymeに対するパートザイム、前記第一の基質、前記第二のMNAzymeに対するパートザイム、前記DNAzymeリガーゼ、前記第二の基質、前記追加のパートザイム、追加のMNAzymeに対する前記組織化助長因子、および前記追加の基質のうち少なくとも一つは、少なくとも一つのアプタマーをさらに含みうる。さらになお、アプタマーは、少なくとも一つのリガンドと結合しうる。その上さらになお、リガンドは、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、核酸、糖タンパク質、脂質、リポタンパク質、細胞、ウイルス、細菌、古細菌、真菌、抗体、代謝産物、病原体、毒素、汚染物質、毒物、生物体全体、小分子、ポリマー、金属イオン、金属塩、プリオン、またはそれらの任意の誘導体、部分もしくは組み合わせを含む群から選択されうる。
もう一つの態様において、前記第一のMNAzymeに対するパートザイム、前記第一の基質、前記第二のMNAzymeに対するパートザイム、前記DNAzymeリガーゼ、前記第二の基質、前記追加のパートザイム、追加のMNAzymeに対する前記組織化助長因子、および前記追加の基質のうち少なくとも一つは、少なくとも一つのナノ粒子、ミクロ粒子、またはそれらの組み合わせをさらに含みうる。
もう一つの態様において、前記第一のMNAzymeに対するパートザイム、前記第一の基質、第二のMNAzymeに対する前記パートザイム、前記DNAzymeリガーゼ、前記第二の基質、前記追加のパートザイム、追加のMNAzymeに対する前記組織化助長因子および前記追加の基質のうち少なくとも一つは、不溶性支持体に結び付けてもよく、または溶液中に遊離させてもよい。
もう一つの態様において、前記基質の少なくとも一つは検出可能な部分およびクエンチャー部分を含んでもよく、ここで前記MNAzymeによる前記基質の修飾が起こると、前記検出可能な部分によって検出可能な影響がもたらされる。
もう一つの態様において、検出可能な影響は、蛍光分光法、表面プラズモン共鳴、質量分析法、NMR、電子スピン共鳴、偏光蛍光分光法、円二色性、イムノアッセイ、クロマトグラフィー、放射分析、光度計測法、シンチグラフィー、電子工学的方法、UV、可視光または赤外分光法、酵素的方法、またはそれらの任意の組み合わせのうち少なくとも一つによって検出されうる。さらに、検出可能な影響を測定することもでき、ここで前記測定の大きさは標的の量を示す。
前出のいずれかの局面の一つの態様において、前記標的は、検出、同定または定量化しようとする分子である。標的には核酸が含まれうる。核酸は、DNA、メチル化DNA、アルキル化DNA、RNA、メチル化RNA、マイクロRNA、siRNA、shRNA、tRNA、mRNA、snoRNA、stRNA、smRNA、プレ-マイクロRNAおよびプリ-マイクロRNA、他の非コーディングRNA、リボソームRNA、それらの誘導体、アンプリコン、またはそれらの任意の組み合わせを含む群から選択されうる。
核酸の供給源は、合成、哺乳動物、ヒト、動物、植物、真菌、細菌、ウイルス、古細菌、またはそれらの任意の組み合わせを含む群から選択されうる。
前出のいずれかの局面の一つの態様において、方法または組成物はアプタマーを組み込んでいてもよく、タンパク質、ポリペプチド、ペプチドまたは核酸、糖タンパク質、脂質、リポタンパク質、細胞、ウイルス、細菌、古細菌、真菌、抗体、代謝産物、病原体、毒素、汚染物質、毒物、生物体全体、小分子、ポリマー、金属イオン、金属塩、プリオン、またはそれらの任意の誘導体、部分もしくは組み合わせ、または他の任意の実体を非限定的に含む、アプタマーと結合するリガンドを検出することができる。
前出のいずれかの局面の一つの態様において、MNA複合体の少なくとも一つの成分は、核酸またはタンパク質を含みうる。核酸は、標識された核酸、RNA、DNA、核酸類似体、ペプチド核酸、ロックド（locked）核酸、ペプチド-核酸キメラ、またはそれらの任意の組み合わせのうち少なくとも一つを含みうる。タンパク質は、抗体、ポリペプチド、糖タンパク質、リポタンパク質、またはそれらの任意の組み合わせのうち少なくとも一つを含みうる。
MNA複合体の少なくとも一つの成分は、少なくとも一つのナノ粒子またはミクロ粒子、またはそれらの組み合わせをさらに含みうる。成分は不溶性支持体に結び付けてもよく、または溶液中に遊離させてもよい。基質成分は検出可能な部分およびクエンチャー部分を含んでもよく、ここで前記MNAzymeによる前記基質の修飾が起こると、前記検出可能な部分によってもたらされる検出可能な影響が増加または減少する。
前出のいずれかの局面の一つの態様において、検出可能な影響は、蛍光分光法、表面プラズモン共鳴、質量分析法、NMR、電子スピン共鳴、偏光蛍光分光法、円二色性、イムノアッセイ、クロマトグラフィー、放射分析、光度計測法、シンチグラフィー、電子工学的方法、UV、可視光もしくは赤外分光法、酵素的方法、またはそれらの任意の組み合わせによって検出されうる。検出可能な影響を測定することもでき、ここで前記測定の大きさは標的の量を示す。
本発明のもう一つの局面においては、複数のMNA複合体を含む全加算器が提供され、ここで該全加算器は、二つの出力の四通りの可能な組み合わせを生成する三つの入力の八通りの可能な組み合わせを含んでよく、四通りの可能な組み合わせとは、出力無し（no output）、第一の出力、第二の出力、または第一および第二の両方の出力である。
一つの態様において、入力無し（no input）の存在は、出力無しを生じさせる。
もう一つの態様において、任意の厳密に一つの入力に応答して、全加算器は第一の出力を生成することができる。
もう一つの態様において、任意の厳密に二つの入力に応答して、全加算器は第二の出力を生成することができる。
もう一つの態様において、三つの入力に応答して、全加算器は第一および第二の出力を生成することができる。
もう一つの態様において、入力の少なくとも一つは、検出可能な事象であってよい。
もう一つの態様において、出力の少なくとも一つは、蛍光分光法、表面プラズモン共鳴、質量分析法、NMR、電子スピン共鳴、偏光蛍光分光法、円二色性、イムノアッセイ、クロマトグラフィー、放射分析、光度計測法、シンチグラフィー、電子工学的方法、UV、可視光もしくは赤外分光法、酵素的方法、またはそれらの任意の組み合わせのうち少なくとも一つによって決定される、検出可能な事象または検出可能な影響であってよい。
もう一つの態様において、第一または第二の出力は、もう一つの全加算器に対する入力として作用する。
ここで、添付の図面を参照しながら、単なる一例として、本発明の一つの好ましい態様を説明する。
多成分核酸（MNAzyme）の一つの例示的デザインの描写を示す。例示的な開示として、MNAzymeは、組織化助長因子の存在下で自己組織化する二つのパートザイム（AおよびB）から構成される。二つのパートザイムが組織化助長因子の存在下で組織化すると、基質を修飾すること、例えば切断することのできる、触媒的に活性なMNAzymeが形成される。二つの成分パートザイムは、（i）組織化助長因子と結合するセンサーアーム、（ii）基質と結合する基質アーム、および（iii）部分的触媒コア配列を有する。 活性MNAzymeの別の例示的デザインを示す。パネル（i）：MNAzyme形成のために複数の組織化助長因子成分が必要とされる、MNAzymeの例示的デザインの描写。このデザインでは、組織化助長因子の一つの成分（F1）はパートザイムAおよびBの両方のセンサーアームの領域に対して相補的であり、一方、第二の組織化助長因子成分（F2）はパートザイムBのみ（この説明図のように）またはパートザイムAのみのいずれかに対して相補的である。この二つの組織化助長因子成分は相伴うことで、基質を修飾（例えば、切断）することのできる活性MNAzymeの組織化を導く。パネル（ii）：パートザイムA成分および二部構成のパートザイムB成分が組織化助長因子の存在下で組織化して、基質を修飾（例えば、切断）することのできる活性MNAzymeを生成する、例示的デザインの描写を示す。この略図において、パートザイムBは、安定化アーム成分（S）と呼ばれる第二の成分の非存在下では安定なMNAzyme組織化を可能にするのに不十分な、短縮型（truncated）センサーアーム（T）を有する。パートザイムの短縮型センサーアームに隣接した位置での、安定化アームと組織化助長因子とのハイブリダイゼーションにより、活性MNAzymeの組織化が可能となる。 活性および不活性な多成分核酸複合体の存在下における、経時的な出力シグナル（蛍光）の変化を示す。この例では、第一のパートザイム（A）は標準的なデザインのものである。第二のパートザイム（B）は、基質アーム、部分的触媒コアおよび短縮型センサーアーム（T）を含む一つの成分、ならびに安定化アーム（S）としての役を果たす第二の成分を有する。パートザイムAおよびBならびに組織化助長因子のすべての成分を含む反応（i）において、蛍光の増加が観察された。これは、この反応における活性MNAzymeの組織化および基質の切断と一致する。パートザイムBの安定化アーム部分の脱落（反応（ii)）は経時的なシグナルの増加の欠如を引き起こし、このことはこの成分がこの系における活性MNAzymeの組織化のために必須であることを示している。組織化助長因子を欠く対照反応（反応（iii)）も、経時的な蛍光の増加を全く示さなかった。 MNAi（左側）および活性MNAzyme（右側）の例示的デザインの描写を示す：パートザイムAおよびBが組織化助長因子成分および活性阻害因子と複合体化するとMNAiが形成される（左側）。MNAiは基質と相互作用することはできるが、それを触媒的に修飾することはできない。いくつかの態様において、活性阻害因子は、活性阻害因子内部の二つまたはそれ以上のドメインを分離させうる、不安定なまたは切断可能なリンカー（点線矢印によって表示）をさらに含みうる。そのようなドメインには、例えば、（i）パートザイム成分に対して実質的に非相補的であって、触媒的に活性なMNAzymeの形成のために必要な二次構造を破壊することによって阻害作用を発揮する、活性阻害因子ドメイン、および（ii）活性阻害因子ドメインから分離された場合に、組織化助長因子成分として機能して、活性MNAzymeの組織化を導くことのできる、活性化因子組織化助長因子ドメインが含まれうる。 さまざまな多成分核酸複合体からの触媒活性の実証を示す。いずれの反応物にも、パートザイムA、パートザイムB、および蛍光団クエンチャー色素ペアで標識された基質を含めた。加えて、反応物には、（i）組織化助長因子F1/2、（ii）成分F1およびF2（その配列は相伴うことで組織化助長因子F1/2のそれと対応する）を含む組織化助長因子、（iii）組織化助長因子部分F1、ならびに活性阻害因子ドメインおよびF2と同じ配列を有するドメインに対応する二つの接続されたドメインを含む活性阻害因子のいずれかを含めるか、または（iv）組織化助長因子も活性阻害因子も含めなかった。蛍光の変化を、活性MNAzyme複合体による基質の触媒切断の指標として経時的にモニターした（図5）。蛍光は組織化助長因子F1/2または組織化助長因子F1およびF2のいずれかを含む反応物で急速に増加し、このことはそれぞれ活性MNAzyme 1および2が形成され、両方とも基質を切断しうることを示している。これに対して、F1および活性阻害因子を含む反応物は経時的な蛍光の増加を示さず、このことはMNAi複合体の形成を示している。組織化助長因子の非存在下では蛍光の増加は全く認められなかった。 DNAを用いるシグナルカスケード（SCUD）の概略図を示す。図示されたプロトコールは以下の成分を含む：（i）以下の複数のドメインを含む二重標識RIF（レポーター-阻害因子-助長因子）成分：a．第一に活性阻害因子であり（RIFの中に組み込まれている時）、第二にRIFが切断された時には蛍光出力シグナルをもたらすという二重の機能を有する、活性阻害因子/レポータードメインを含むRIドメイン、b．活性MNAzyme 2a複合体の組織化のための必須な成分である、活性化因子組織化助長因子ドメインF2b、c．RIとF2bとの間に位置し、MNAzyme 1aまたはMNAzyme 2aのいずれかによって切断された時にRIドメインとF2bドメインとの分離を引き起こす、基質配列；（ii）組織化助長因子成分F2a；（iii）例えば被験試料中に存在する標的核酸であるとも考えられるもう一つの組織化助長因子（F1）の存在下のみで活性MNAzyme 1a構造を形成させることのできるパートザイム成分；この活性MNAzyme 1aは、RIFを切断し、それ故にRIドメイン（これは続いて蛍光を発して出力シグナルを生成することができる）の除去によってF2bドメインを遊離させて活性化することができる；（iv）パートザイムアームがF2aドメインに隣接する遊離F2bドメインと結合した時にのみ活性MNAzyme 2aを形成することのできるパートザイム。このMNAzyme 2aは続いてさらに別のRIFを切断してさらに別のF2bを遊離させ、それ故にMNAzyme 2aの自己触媒性自己複製のカスケードを作り出す。完全状態のRIFの存在下では、MNAzyme 2aの成分はMNAi 2i複合体へと組織化する。F1の非存在下では、MNAzyme 2aに対するパートザイムは、完全状態のRIFとともにMNAi 2i複合体を形成すると考えられる。F1の存在下では、活性MNAzyme 1aが形成されてRIFを切断し、F2bを放出させ、それが続いて自由に会合して活性MNAzyme 2aの組織化を助長すると考えられる。MNAzyme 2aはさらに、さらに別のRIFを切断することができるため、これはシグナルカスケードを惹起させると考えられる。SCUD（図6）は、SCUD戦略がアプタマー-MNAzyme系と結び付けられている場合には（図7に示されているように）、核酸標的（DNAおよび/またはRNA）または他の標的分析物（タンパク質、小分子その他）によって惹起させうると考えられる。 MNAzymeの活性のモジュレーションのための例示的な戦略を示す。この系における戦略は、（i）リガンドを活性化因子分子として用いてMNAzyme活性を制御するための方法、および/または（ii）アプタ-MNAzymeを用いる非核酸標的の検出の方法のいずれかとして用いることができる。この例示的なアプタ-MNAzyme検出戦略に含められる核酸オリゴヌクレオチドには、以下が含まれる；（a）標準的なパートザイム；（b）その末端の一方にアプタマーが組み込まれているパートザイムである、アプタ-パートザイム；（c）アプタ-パートザイムおよびパートザイムの両方と結合して活性MNAzymeの組織化を可能にするオリゴヌクレオチドである組織化助長因子；（d）レポーター基質；ならびに（e）アプタ-パートザイムと、アプタ-パートザイム配列の少なくともアプタマー配列の一部および基質結合アームの一部にわたる領域でハイブリダイズする、組織化阻害因子オリゴヌクレオチド。活性化因子リガンドの非存在下では（左側のパネル）、組織化阻害因子オリゴヌクレオチドはアプタ-パートザイムと結合し、それ故にレポーター基質の結合と競合してそれを阻止する。活性化因子リガンドが存在する時には（右側のパネル）、それはアプタ-パートザイムのアプタマー配列と結合し、組織化阻害因子オリゴヌクレオチドの結合を阻止して、それ故にレポーター基質の結合および切断を可能にする。このため、MNAzymeが形成されて蛍光シグナル生成を引き起こすことができるのは、アプタマーと結合しうるリガンドの存在下においてのみである。このアプローチは、MNA系の触媒活性をオンおよびオフに切り替えることのできる分子スイッチを開発するために用いることができる。または、それを、核酸性および非核酸性の標的リガンドの両方の検出に応用することもできる。また、一つまたは複数のアプタマーを、パートザイム、組織化助長因子または基質を非限定的に含む、オリゴヌクレオチド成分の任意のものに組み込みうると考えられることも、当業者には理解されるであろう。さらに、アプタマーを、これらのオリゴヌクレオチドの任意の一つのいずれかの末端に組み込むこともできると考えられる。一つの態様において、アプタマーは、パートザイムの少なくとも一つのセンサーアームに結び付けられる。もう一つの態様において、アプタマーはパートザイムの少なくとも一つの基質アームに結び付けられる。 DNAzymeリガーゼおよびMNAzymeによって媒介される切断/連結カスケードの一例を示す：オリゴ1/2などのオリゴヌクレオチドをMNAzymeによって切断産物オリゴ1およびオリゴ2へと切断し、それ故に2',3'-環状リン酸および5'-ヒドロキシル産物を生成させ、それらをその後の連結反応に関与させることができる。DNAzymeリガーゼ、例えば7Z81（Prior et al, 2004）は、第一のオリゴヌクレオチド（オリゴ1）を第二のオリゴヌクレオチド（オリゴ2）と連結させて、オリゴ1/2と同じヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチド連結産物を作り出すことができる。 MNAzymeおよびMNAiのデザインの例示的な構造を示す：活性MNAzyme構造のいくつかの例がパネルA〜Dに示されている（左側の構造）。これらの構造はすべて、基質（S）を切断することのできる触媒的に活性な酵素を形成することができる。MNAi構造の例はパネルA〜Dに示されている（活性MNAzymeの右側にある構造）。これらのMNAi構造は、活性MNAzyme中の組織化助長因子（F）によって占有されると考えられる部位と結合する、活性阻害因子（I）を含む。この説明図は、一つの組織化助長因子F1（パネルA）、二つの組織化助長因子F1およびF2（パネルBおよびD）、または三つの組織化助長因子F1、F2およびF3（パネルC）を含むMNAzymeの模式図を含んでいる。パネルAに示されているMNAの例は、パートザイムセンサーアーム内部に自己相補的領域を有するセンサーアームを含む。MNA構造はまた、パネルDに示されているように、一つまたは複数の安定化アーム（sA）を含んでもよい。a〜hと表記されている具体的なMNAzymeおよびMNAi構造は、実施例7〜10を参照することによってさらによく理解されるであろう。 二つの基質を用いるカスケードのための例示的な戦略を示す。この戦略では、開始MNAzyme（Mt）が標的（T）の存在下で形成される。開始MNAzyme（Mt）は第一の基質（S1）を切断して、第一の活性化因子組織化助長因子成分（S1f）を作り出し、それが第一のMNAzyme（カスケード性MNAzyme Mc1）の形成を導く。この例において、第一のMNAzyme（Mci）は、二つのパートザイム、ならびにF1、F2およびS1fと表記された三つの組織化助長因子成分デザインを含む。Mc1は追加の基質（S2）を切断し、それ故に追加の活性化因子組織化助長因子成分（S2f）を遊離させることができ、それが第二のMNAzyme（カスケード性MNAzyme Mc2）の形成を導く。この例において、第二のMNAzyme（Mc2）は、二つのパートザイム、ならびにF3、F4およびS2fと表記された三つの組織化助長因子成分を含む。続いてMc2はさらに別の第一の基質（S1）を切断して、それ故にさらに別の第一の活性化因子組織化助長因子成分（S1f）を作り出すことができる。これはさらなる第一のMNAzyme（Mc1）の形成を招き、それにより、増幅カスケードを形成する。 開始MNAzyme、SCUDカスケード増幅およびDNAzymeリガーゼを介したMNAzyme切断読み取りを用いるシグナル増幅カスケードを示す。この図に示されている戦略は以下の特徴を有する：（i）標的核酸（F1）は第一の基質（基質A）を切断して第一の切断産物（産物Aa）および第二の切断産物（活性化因子組織化助長因子）（産物Ab）を切断する開始MNAzyme（MNAzyme 1a）の形成を助長し、第一の切断産物（産物Aa）は反応局面（ii）における成分として必要であり、かつ第二の切断産物（産物Ab）は反応局面（iii）における成分として必要である。（ii）第一の切断産物（産物Aa）は2',3'-環状リン酸をその3'末端に有し、リガーゼ活性を有するDNAzyme 2aに対する基質として機能するのに適している。DNAzymeリガーゼ2aは第一の切断産物（産物Aa）を第二の基質（基質B）と連結させて、追加のMNAzyme（MNAzyme 4a）に対する連結されたパートザイムを作り出す。（iii）第二の切断産物（産物Ab）は、第二のMNAzyme（MNAzyme 3a）の形成を導く活性化因子組織化助長因子成分として機能する。第二のMNAzyme（MNAzyme 3a）は、さらなる第一の基質（基質A）を修飾して、さらなる第一の切断産物（産物Aa）および第二の切断産物（産物Ab）を生成する。このさらなる第二の切断産物（産物Ab）は続いて、さらなる第二のMNAzyme（MNAzyme 3a）の形成を導く。これはSCUD自己触媒性自己複製フィードバック増幅カスケードを結果的にもたらす。このSCUDカスケードは、さらに別の第二のMNAzyme（MNAzyme 3a）を組織化するように機能するさらなる第二の切断産物（産物Ab）のさらなる蓄積を結果的にもたらし、それは局面（ii）におけるDNAzyme 2aに対する基質として機能するさらなる第一の切断産物（産物Aa）の蓄積を結果的にもたらす。（iv）第一の切断産物（産物Aa）および第二の基質（基質B）の連結によって局面（ii）において生成された、追加のMNAzymeに対する連結されたパートザイムは、追加のMNAzyme（MNAzyme 4a）に対する新たなパートザイムを形成する。この追加のMNAzyme（MNAzyme 4a）は助長因子F4を伴って形成され、蛍光団およびクエンチャー色素ペアの間の基質Cを修飾して、標的核酸F1の存在を示す蛍光シグナルの増加を結果的にもたらす。 MNAzymeを用いる分子全加算器を示す。三つの入力FAC1、FAC2およびFAC3はグレーで示されており、「緑」および「青」と表記された斜線は異なる蛍光団を有する基質を表しており、Cオリゴヌクレオチドは黒で表示されている。パートザイムも黒で示されており、Cオリゴヌクレオチドおよび基質とあらかじめ複合体化している。
定義
一定の用語を本明細書において使用し、それらは、以下のとおり示す意味を有するものとする。
用語「含む（comprising）」は、「本質的に、しかし必ずしも唯一ではなく含むこと（including）」を意味する。さらに、「含む」という語の変形、例えば「含む（comprise）」および「含む（comprises）」は、相応じて変わる意味を有する。
用語「ポリヌクレオチド」、「核酸」および「オリゴヌクレオチド」は、同義で用いることができ、この用語は、DNA、メチル化DNA、アルキル化DNA、RNA、メチル化RNA、ミクロRNA、siRNA、shRNA、mRNA、tRNA、snoRNA、stRNA、smRNA、プレ-およびプリ-ミクロRNA、他の非コーディングRNA、リボソームRNA、それらの誘導体、それらのアプリコンまたはそれらの任意の組み合わせを含むがこれらに限定されるわけでなない、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチド塩基の一本鎖もしくは二本鎖ポリマー、またはそれらの類似体、誘導体、変異体、フラグメントもしくは組み合わせを指す。非限定的例として、核酸の供給源は、合成のもの、哺乳類のもの、ヒトのもの、動物のもの、植物のもの、真菌のもの、細菌のもの、ウイルスのもの、古細菌のものまたはそれらの任意の組み合わせを含む群から選択することができる。
用語「触媒核酸分子」、「触媒核酸」、「核酸酵素」および「触媒核酸配列」は、本明細書においては同義で用いており、基質を認識することができ、基質の修飾を触媒することができる、DNA分子もしくはDNA含有分子（当技術分野において「DNA酵素」、「デオキシリボザイム」または「DNAzyme」としても知られている）またはRNAもしくはRNA含有分子（当技術分野において「RNA酵素」または「リボザイム」としても知られている）、またはDNA-RNAハイブリッド分子であるこれらの組み合わせを意味するものとする。触媒核酸中のヌクレオチド残基としては、塩基A、C、G、TおよびU、ならびにそれらの誘導体および類似体を含むことができる。
「多成分核酸複合体」、「多成分核酸」、「MNA」または「MNA複合体」という用語は、パートザイム、安定化アーム、組織化助長因子、基質、および活性阻害因子、組織化阻害因子を含むモジュレーター成分、ならびにそれらの成分を非限定的に含む群から選択される、二つまたはそれ以上の成分を含む複合体のことを指す。いくつかの態様において、MNA複合体は活性MNAzymeである。他の態様において、MNA複合体はMNAiなどの不活性複合体であり、本明細書において多成分核酸不活性プロ酵素（MNAi）とも称しうるMNAiを含みうる。さらに他の態様において、MNA複合体は、基質、組織化助長因子、安定化アームおよびパートザイム、またはそれらの成分を非限定的に含む、MNAzymeによる組織化および触媒作用のために必要な成分の一つまたは複数を欠いていてもよい。
「MNAzyme」という用語は、本明細書で用いる場合、基質を触媒的に修飾することのできる活性核酸酵素複合体を、MNAzyme組織化助長因子（例えば、標的）の存在下においてのみ形成する、二つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチド配列（例えば、パートザイム）のことを指す。パートザイムAおよびパートザイムBを含む例示的なMNAzymeが図1に描写されている。図1を参照すると、パートザイムAおよびBはそれぞれ、組織化助長因子と結合する（例えば、ワトソン-クリック型塩基対合を通じて）。MNAzymeは、パートザイムAおよびBのセンサーアームが組織化助長因子上で互いに隣接してハイブリダイズした時にのみ形成される。MNAzymeの基質アームは基質と係合し、その修飾（例えば、切断）は、パートザイムAおよびBの触媒ドメインの相互作用によって形成される、MNAzymeの触媒コアによって触媒される。DNA/RNAキメラレポーター基質の切断は図面中に例示されている。MNAzymeは基質を蛍光団とクエンチャー色素ペアとの間で切断し、そうすることでシグナルを生成させる。「多成分核酸酵素」および「MNAzyme」という用語は、本明細書において互換的に用いられ、これには、二つの分子で構成される二部構成（bipartite）構造、または三つの核酸分子で構成される三部構成（tripartite）構造、または他の多部構成（multipartite）構造、例えば四つもしくはそれ以上の核酸分子によって形成されるものが含まれる。
二つを上回る分子で構成されるMNAzymeの一例は、図2（ii）に図示されている。パートザイムは、短縮型センサーアームと、組織化助長因子（図2（ii)に描写されているように）または基質のいずれかと相互作用することによってMNAzyme構造を安定化する安定化アーム成分とを有するパートザイム成分を非限定的に含む、複数の成分を含みうる。
「MNAi」という用語は、本明細書で用いる場合、触媒的に不活性な状態にあるMNA複合体のことを指し、ここで触媒活性は、本明細書に定義したような「活性阻害因子」によって阻害される。好ましい態様において、MNAiは、例えば、MNAiの例示的デザインを示している図4に描写されているように、活性阻害因子オリゴヌクレオチドの結合が原因で触媒的に不活性となりうる。例えば、MNAiは、パートザイムA、パートザイムB、組織化助長因子および活性阻害因子が会合して不活性複合体を形成した場合に形成されうる。MNAi構造のそのほかの例は図9に図示されている。
「触媒的に不活性なMNA複合体」、「不活性MNA複合体」、「触媒的に不活性なMNA」または「不活性MNA」という用語は、本明細書で用いる場合、触媒的に活性な状態にない多成分核酸複合体のことを指す。一つの態様において、「不活性MNA複合体」は、活性阻害因子オリゴヌクレオチドの結合が原因で触媒的に不活性となりうるMNAiである。もう一つの態様において、「不活性MNA複合体」は、MNAzyme触媒活性のために必要な成分の一つまたは複数がMNA複合体と会合していない、部分的に組織化した、または部分的に分解されたMNA複合体である。一つの態様において、MNAzyme活性のために必要な一つまたは複数の成分の、反応環境（reaction milieu）からの欠如は、「不活性なMNA複合体」の形成を結果的にもたらす。もう一つの態様において、微小環境、例えば温度が、活性MNAzymeのために必要な成分のすべての会合とは適合しないことがありうる。もう一つの態様において、「不活性MNA複合体」は活性MNAzymeの構造形成のために必要なすべての成分を含むが、「不活性MNA複合体」が触媒作用のために必要な一つまたは複数の必須な要素、例えば二価陽イオンの欠如が原因で活性を欠くこともありうる。もう一つの態様において、不活性MNA複合体は、組織化阻害因子の存在という理由で不活性でありうる。
「分子スイッチ」または「スイッチ」という用語は、本明細書で用いる場合、入力事象に応答して、不活性複合体から活性複合体へと、またはその逆に遷移させることのできる、任意のMNA複合体のことを指す。好ましい態様において、不活性複合体は触媒的に不活性な複合体である。触媒的に不活性な複合体には、分解された複合体、部分的に組織化した複合体、またはMNAiなどの複合体、または会合した組織化助長因子を伴う複合体が含まれうる。触媒的に活性な複合体がMNAzymeであってもよい。
「組織化助長因子分子」、「組織化助長因子」、「MNAzyme組織化助長因子分子」、「助長因子」、「MNAzyme組織化助長因子」および「活性化因子組織化助長因子」という用語は、本明細書で用いる場合、MNAzymeのセンサーアームとの相互作用によって、パートザイム成分の自己組織化を助長して触媒的に活性なMNAzymeを形成させることのできる実体のことを指す。好ましい態様において、組織化助長因子はMNAzymeの自己組織化のために必要である。一つの態様において、組織化助長因子は、一つまたは複数のオリゴヌクレオチド「パートザイム」のセンサーアームと対合または結合しうる、一つ（図1）またはそれ以上の分子または成分（図2（i）、図4〜6および9〜10）で構成されうる。組織化助長因子はまた、MNAi、および部分的に組織化した、または分解されたMNA複合体を非限定的に含む、触媒的に活性でないMNA複合体とも会合しうる。
MNA複合体の成分は、全体としての成分に対して別々の機能を与えるドメインを含みうる。例えば、活性化因子組織化助長因子ドメインが、他の成分の内部、例えば活性阻害因子分子の内部に含まれていて、それらがそこに、例えば切断によって成分から遊離するまでは活性MNAzyme組織化に寄与することのできない状態で存在してもよい。「活性化因子組織化助長因子」または「活性化因子組織化助長因子成分」とは、本明細書で用いる場合、ひとたび別の成分の内部から遊離した場合、または外因性にもたらされた場合に、MNAzymeのセンサーアームとの相互作用によって、パートザイム成分の自己組織化を助長して触媒的に活性なMNAzymeを形成させることのできる実体のことを指す。
活性化因子組織化助長因子などの組織化助長因子は、活性MNAzymeの組織化を制御するため、または不活性多成分核酸複合体から活性MNAzymeへの遷移を助長するために用いることができる。前記多成分核酸複合体は、MNAiにおけるように、例えば、活性阻害因子の存在が原因で触媒的に不活性であってもよい。
「活性化因子」とは、本明細書で用いる場合、MNAzymeの活性化を結果的にもたらす、任意のMNAの構造的もしくはモジュレーター的なオリゴヌクレオチド成分、任意の「分子エフェクター」、「リガンド」、「標的」または「事象」のことを指す。活性化因子オリゴヌクレオチドには、組織化助長因子、パートザイムまたはそれらの成分、例えばセンサーアームもしくは基質アームの短縮を有するもの、およびパートザイム安定化アーム成分として作用するオリゴヌクレオチドが非限定的に含まれる。
他の態様において、活性化因子は、阻害作用を発揮するオリゴヌクレオチドを除去することによってMNAzymeを活性化することができる。そのような機序を通じて活性化を行いうるオリゴヌクレオチドの例には、「活性阻害因子」または「組織化阻害因子」を非限定的に含む、阻害成分を追い出す（除去する）ことのできるモジュレーターオリゴヌクレオチドが含まれる。
他の態様において、「活性化因子」は、MNA複合体成分のアプタマードメインと相互作用するリガンドであってもよく、ここでその相互作用の結果はMNA複合体の活性化である。
本明細書で用いる場合、「安定化アーム」という用語は、パートザイムのセンサーアームに隣接した位置で少なくとも一つの組織化助長因子と相互作用して、活性MNAzymeを非限定的に含むMNA複合体の組織化を可能にすることのできる実体のことを指す。
「標的」という用語は、本明細書において用いる場合、MNAzyme増幅プロとコール、例えば「DNAを用いるシグナルカスケード」すなわち「SCUD」反応を含むがこれに限定されない追加的な増幅段階を用いまたは用いずに、特定のMNAzymeによって検出、同定または定量しようとする、任意の天然または合成の実体、構成要素または分析物を含む。従って、標的は、高感度検出法、同定法および/または定量法が望ましい検出可能な単位、構成要素または分析物の最も広い範囲を包含する。一部の例示的標的としては、タンパク質、ポリペプチド、ペプチドもしくは核酸、糖タンパク質、脂質、リポタンパク質、全生物、細胞、ウイルス、細菌、古細菌、酵母、真菌、抗体、代謝産物、病原体、毒素、汚染物質、毒物、小分子、ポリマー、金属イオン、金属塩、プリオンまたはこれらの任意の誘導体、部分もしくは組み合わせが含まれるがそれらに限定されるわけではない。他の標的も本明細書において使用するために意図される。標的が組織化助長因子または活性化因子でもよいことが理解されるであろう。
本明細書で用いる場合、「検出可能な事象」または「入力」または「入力事象」には、MNAzymeおよび/または不活性MNA複合体を非限定的に含む、MNA複合体の微小環境における変化が含まれる。変化は例えば、温度、塩濃度、イオン強度、pH、二価陽イオンの有無、種類もしくは濃度、電荷、磁荷の変化、物理的操作、およびMNAもしくはモジュレーター成分もしくは微小環境の成分の濃度の変化、またはそれらの任意の組み合わせであってよい。また、「濃度の変化」に対する言及には、濃度の上昇または低下が含まれるほか、MNAzymeおよび/またはMNAiなどの不活性MNA複合体を含むMNA複合体の微小環境内に以前には存在しなかったか検出不能な濃度で存在していた実体の出現も含まれる。
また、微小環境における変化はMNA複合体の触媒活性を操作するために用いることができるため、検出可能な事象に相当する実体を、MNAzymeの触媒活性の「活性化因子」または「阻害因子」として用いることもできる。このため、これらの実体は、不活性MNA複合体から活性MNAzymeへの、またはその逆の遷移を促進することによって、MNAzymeの触媒活性を「オン」または「オフ」に切り替えることを可能にする。いくつかの態様において、実体は、MNAzymeの組織化および活性化を促進する。いくつかの態様において、事象または実体は、MNAzymeの分解および不活性化を促進する。他の態様において、事象または実体は、MNAiまたは他のMNA複合体の組織化または分解を導きうる。好ましい態様において、MNAzyme触媒活性の活性化および不活性化の過程は可逆的である。
「活性阻害因子」という用語は、MNA複合体の一つまたは複数の成分と結合して、触媒的に不活性な「MNAi」の組織化を導くことのできる任意の実体のことを指す（例えば、図4〜6および9〜11）。活性阻害因子による触媒活性の阻害は、パートザイムに対して実質的に非相補的であり、「活性阻害因子成分」、「阻害因子ドメイン」または「活性阻害因子ドメイン」とも呼ばれる、「活性阻害因子ドメイン」によって媒介されうる。好ましい態様において、活性阻害因子は、例えば、活性阻害因子ドメイン、活性化因子組織化助長因子ドメイン、基質ドメイン、および/またはレポータードメインから選択される任意の組み合わせの機能的ドメインを非限定的に含む、いくつかの別個の機能的ドメインを含みうる。そのような別個の機能的ドメインは、活性阻害因子におけるいくつかの別個の構造ドメインと一致しても一致しなくてもよい。したがって、いくつかの態様において、活性阻害因子は、パートザイム成分に対して実質的に非相補的であって、触媒的に活性なMNAzymeの形成のために必要な二次構造を破壊することによって阻害作用を発揮する、活性阻害因子ドメインを含みうる。活性阻害因子の存在は、基質と相互作用することはできるが、それを触媒的に修飾することはできないMNAi複合体の組織化を推進する。いくつかの態様において、活性阻害因子は組織化助長因子ドメインを含みうる。
いくつかの態様において、活性阻害因子は、活性阻害因子内部の二つまたはそれ以上のドメインの間、例えば活性阻害因子ドメインと活性化因子組織化助長因子ドメインとの間に位置しうる、不安定なまたは切断可能なリンカーまたは基質をさらに含みうる。基質またはリンカーの部位での切断は、活性化因子組織化助長因子ドメインからの活性阻害因子ドメインの分離を可能にし、前者は続いて組織化助長因子成分として働いて、活性MNAzymeの組織化を導くことができる。
いくつかの態様において、活性阻害因子を他の実体とコンジュゲートさせることもできる。いくつかの態様において、活性阻害因子は、ハイブリダイゼーションの遠隔的な電子的制御を可能にするように高周波磁場と連動させた金ナノ粒子とコンジュゲートさせることができる。このアプローチにおいて、高周波磁場は、周囲の分子には相対的に影響を及ぼさないままで、特定のオリゴヌクレオチドの可逆的熱変性を可能にする、アンテナとして機能する。いくつかの態様において、活性阻害因子は、活性阻害因子の捕捉および物理的単離を容易にするためにビオチンで標識することができる。
本明細書で用いる場合、「組織化阻害因子」とは、活性MNAzyme複合体の必須な成分に対する相補的結合によって、例えばパートザイム成分または組織化助長因子または基質に対する結合によって、MNAzyme複合体の組織化を阻害する成分のことである。第一のMNAzyme複合体成分に対する組織化阻害因子配列の結合は、第二のMNAzyme複合体成分に対する結合をめぐる組織化阻害因子と前記第一の成分との間の競合を招く。例えば、組織化阻害因子は、（基質と結合する）パートザイム基質アームまたは（組織化助長因子と結合する）パートザイムセンサーアームのいずれかと結合することができる。組織化阻害因子が基質アームに対して相補的である（そしてそれと結合した）場合には、それはパートザイムに対する基質の結合と競合する（そしてそれを阻止する）（図7）。組織化阻害因子がセンサーアームに対して相補的である（そしてそれと結合した）場合には、それはパートザイムに対する組織化助長因子の結合と競合する（そしてそれを阻止する）。このようにして、組織化阻害因子はMNAzyme複合体の組織化を阻止する。組織化阻害因子分子はMNAzymeの組織化を制御するために用いることができ、さらに、非核酸性および核酸性の両方の標的分析物の検出のための戦略の開発も可能にする。
「基質」、「基質分子」および「化学基質」という用語には、本明細書で用いる場合、MNA複合体などの分子によって認識される、作用を受ける、または化学修飾される、任意の分子が含まれる。基質の修飾は、MNA系の活性をモニターするための「出力」シグナルまたは「検出可能な影響」をもたらす。特定の態様において、基質は酵素によって認識および修飾されうる。他の態様において、基質は触媒性核酸分子によって認識および修飾されうる。好ましい態様において、基質はMNAzymeによって認識および修飾されうる。基質の化学修飾は、修飾反応の産物の出現もしくは増加によって、または修飾反応の基質の消失もしくは減少によって測定することができる。
「レポーター基質」、「レポータープローブ」または「レポーターオリゴヌクレオチド」は、本明細書において用いる場合、触媒反応に関連しての基質の消失または産物の出現いずれかの測定を助長することに特に適合する基質である。レポーター基質は、溶液中で遊離している場合もあり、または例えば、表面にもしくは別の分子に、結合（もしくは「係留」）されている場合もある。レポーター基質は、例えば、蛍光体（一つまたは複数の追加の成分、例えばクエンチャーを伴うもしくは伴わない）、放射性標識、ビオチン（例えば、ビオチン化）または化学発光標識を含む多様な手段のいずれによっても標識することができる。
本明細書において用いる場合、「ジェネリック」または「ユニバーサル」基質は、各々が異なる組織化助長因子を認識できる多数のMNAzymeによって認識され、それらによる触媒作用を受ける基質、例えば、レポーター基質である。このような基質の使用は、構造的に関連したMNAzyme（これらのすべてが、ユニバーサル基質を認識する）を使用する多種多様な標的の検出、同定または定量のための独立したアッセイの開発を助長する。これらのユニバーサル基質は、各々、独自に、一つまたは複数の標識で標識することができる。好ましい態様において、独自に検出することができる標識を使用して一つまたは複数のジェネリック基質を標識して、MNAzymeを使用する様々な組織化助長因子の独自または同時検出に適便な系を作ることができる。いくつかの態様においては、MNAzymeによって切断された基質を、DNAzymeリガーゼを用いて再構築し、そうすることで再利用することができる。
「モジュレーター」という用語は、本明細書で用いる場合、MNA系の触媒活性を増大または低下させることのできる実体のことである。モジュレーターは、MNAzymeを活性化する、またはその活性をオンに切り替える「活性化因子」であってもよい。いくつかの態様において、モジュレーターは、「組織化阻害因子」または「活性阻害因子」を非限定的に含む「阻害因子」である。
本明細書において用いる場合、「アプタマー」とは、一つまたは複数のリガンドを認識する能力を有する構造を含むことができる。例えば、この認識は、そのアプタマーのより高レベルの構造、例えば、三次元結合ドメインまたはポケットのため、高い特異度を有する場合がある。従って、アプタマーは、タンパク質、ポリペプチド、ペプチドもしくは核酸、糖タンパク質、脂質、リポタンパク質、細胞、ウイルス、細菌、古細菌、真菌、抗体、代謝産物、病原体、毒素、汚染物質、毒物、全生物、小分子、ポリマー、金属イオン、金属塩、プリオンまたはそれらの任意の誘導体、部分もしくは組み合わせ、あるいは任意の他の単位に結合することができる。本明細書において好ましいアプタマーは、吸収、回収および再増幅の反復プロセスにより合成核酸の複合ライブラリーから単離することができる短い一本鎖DNAまたはRNAオリゴマーを含むことができる。従って、アプタマーは、アミノ酸または抗生物質などの小分子からタンパク質および核酸構造にわたるほぼあらゆる標的に対して生じさせることができる。本発明において、アプタマーは、組織化阻害因子を含むMNA系に分子スイッチを構築するために用いられる。活性化因子リガンドの存在は、MNAzyme活性をオンに切り替えることができ（図7右側）、活性化因子リガンドの除去または欠如は、MNAzymeの活性をオフに切り替えることができる（図7左側）。さらに、本発明において、アプタマーは、核酸性および非核酸性リガンドの検出を容易にするためにも用いられる。リガンドの検出はさらに、SCUD増幅カスケードを非限定的に含む増幅カスケードを作動させるために用いることができる。
本明細書で用いる場合、「パートザイム」、「成分パートザイム」、「パートザイム成分」および「成分オリゴヌクレオチド」という用語は、本明細書に定義したようなMNAzyme組織化助長因子の存在下においてのみ、その二つまたはそれ以上が相伴って「MNAzyme」を形成することのできる、DNA含有性またはRNA含有性またはDNA-RNA含有性のオリゴヌクレオチドのことを指す。ある好ましい態様において、一つまたは複数の、好ましくは少なくとも二つの成分パートザイムは、次の三つの領域またはドメインを含みうる：「触媒」ドメイン、これは化学修飾を触媒する触媒コアの一部を形成する；「センサーアーム」ドメイン、これは組織化助長因子と会合および/または結合することができる；ならびに「基質アーム」ドメイン、これは基質と会合および/または結合することができる。これらの領域またはドメインの描写の一例は図1に示されている。パートザイムは、アプタマーを非限定的に含む少なくとも一つの追加の成分を含むことができ、これは本明細書において「アプタ-パートザイム」と称される。
本明細書で用いる場合、「全加算器」という用語は、三つの二値入力の演算を行って、二つの一意的な二値出力を生成する論理素子のことを指す。全加算器演算は以下の規則に従う：（i）任意の厳密に一つの入力の存在は、第一の出力のみを生成する；（ii）任意の厳密に二つの入力の存在は、第二の出力のみを生成する；（iii）厳密に三つのすべての入力の存在は、第一および第二の両方の出力を生成する、かつ；（iv）三つのすべての入力の欠如は出力無しを生じる。
本明細書において用いる場合、用語「カスケード」は、逐次段階的に発生するプロセスまたは動作のあらゆる継続を指し、各段階の発生は、前の段階の発生に一般に依存する。従って、カスケードとしては、酵素的カスケードまたは任意の他のシグナル伝達カスケードが含まれるがそれらに限定されるわけではない。一部の態様において、カスケードは、MNAzymeの触媒活性の結果として生じるシグナルの増幅を含む場合がある。好ましい態様において、そのような増幅カスケードは、シグナルの反復増幅、従って周期的増幅を必要とし得、第一のMNAzymeの触媒活性は、第二のMNAzymeの触媒活性に必要な分子を利用できるようにし、それが次いで、追加的な第二のMNAzymeの触媒活性のための活性化因子を利用できるようにする。一部の態様において、該必要な活性化因子は、パートザイム、酵素、組織化助長因子、基質、標的、これらの一部分もしくはフラグメント、またはそれらの組み合わせを含むことができる。従って、一部の態様におけるカスケードは、蓄積作用の産出を含む場合があり、従って、検出することができるレベルにシグナルを生じさせることによって低存在度の標的を検出することができる。他の態様では、2つより多くの触媒的段階を利用する場合がある。このカスケードは連続的であり得る。一つの好ましい態様において、カスケードは指数的である。好ましい態様において、カスケードは、活性阻害因子の影響の除去を介したMNAiの活性化を伴いうる。いくつかの態様において、MNA複合体成分を、他のMNA複合体成分の切断によって作り出すこともできる。いくつかの態様において、MNA複合体成分は、例えばDNAzymeリガーゼを用いることによる、他のMNA複合体成分の連結によって作り出すことができる。
「オリゴヌクレオチド」という用語は、典型的には、DNAもしくはDNA含有核酸分子、またはRNAもしくはRNA含有分子、またはそれらの組み合わせのセグメントのことを示す。オリゴヌクレオチドの例には、核酸標的；基質、例えば、MNAzymeまたはDNAzymeによって修飾されうるもの；PCRなどの方法によるインビトロ標的増幅のために用いられるもののようなプライマー；およびMNA複合体の成分が含まれる。組織化助長因子、組織化阻害因子、活性阻害因子、アーム安定化因子および/または基質を非限定的に含むMNA複合体成分は、ある態様において、本明細書に定義したようなオリゴヌクレオチドを含みうる。本明細書で用いるパートザイムも、オリゴヌクレオチドを含みうる。
「ポリヌクレオチド」、「核酸」および「オリゴヌクレオチド」という用語は、別に指示する場合を除き、指定された任意の配列ならびにそれに対して相補的な配列に対する言及を含む。オリゴヌクレオチドは、4-アセチルシチジン、5-(カルボキシヒドロキシルメチル)ウリジン、2'-O-メチルシチジン、5-カルボキシメチルアミノメチルチオウリジン、ジヒドロウリジン、2'-O-メチルプソイドウリジン、β D-ガラクトシルキューオシン、2'-O-メチルグアノシン、イノシン、N6-イソペンテニルアデノシン、1-メチルアデノシン、1-メチルプソイドウリジン、1-メチルグアノシン、1-メチルイノシン、2,2-ジメチルグアノシン、2-メチルアデノシン、2-メチルグアノシン、3-メチルシチジン、5-メチルシチジン、N6-メチルアデノシン、7-メチルグアノシン、5-メチルアミノメチルウリジン、5-メトキシアミノメチル-2-チオウリジン、β D-マンノシルメチルウリジン、5-メトキシカルボニルメチルウリジン、5-メトキシウリジン、2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデノシン、N-((9-β-リボフラノシル-2-メチルチオプリン-6-イル)カルバモイル)トレオニン、N-((9-β-リボフラノシルプリン-6-イル)N-メチルカルバモイル)トレオニン、ウリジン-5-オキシ酢酸メチルエステル、ウリジン-5-オキシ酢酸(v)、ワイブトキソシン、プソイドウリジン、キューオシン、2-チオシチジン、5-メチル-2-チオウリジン、2-チオウリジン、4-チオウリジン、5-メチルウリジン、N-((9-β-D-リボフラノシルプリン-6-イル)カルバモイル)トレオニン、2'-O-メチル-5-メチルウリジン、2'-O-メチルウリジン、ワイブトシン、3-(3-アミノ-3-カルボキシプロピル)ウリジン、β D-アラビノシルウリジン、β D-アラビノシルチミジンを非限定的に含む、少なくとも一つの付加または置換を含みうる。
「誘導体」という用語は、本発明の核酸またはヌクレオチドに関して用いる場合、（例えば組換え手段により）一体生産されるまたは（例えば、キメラ手段により）合成後付加される任意の融合分子を含めて、任意の機能的に等価の核酸またはヌクレオチドを含む。このような融合は、付加されたRNAもしくはDNAを有する、またはポリペプチド（例えば、ピューロマイシンもしくは他のポリペプチド）、小分子（例えば、ソラレン）もしくは抗体にコンジュゲートした、本発明のオリゴヌクレオチドを含むことができる。
核酸またはヌクレオチドに関係して用いる場合の用語「類似体」は、DNAまたはRNA分子または残基に関する物理構造であって、DNAもしくはRNA残基またはそれらの類似体と水素結合を形成することができる（すなわち、DNAもしくはRNA残基またはそれらの類似体をアニールして塩基対を形成することができる）物理構造を有する化合物を包含するが、そのような結合は、この用語「類似体」に包含される該化合物にはあまり必要とされない。このような類似体は、構造的に関係があるリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドと異なる化学的および生物学的特性を有する場合がある。メチル化、ヨウ素化、臭素化またはビオチン化残基が、類似体の例である。デオキシイノシン、C-5-イミダゾールデオキシウリジン、3-（アミノプロピニル）-7-デアザ-dATP、2’-O-メチルRNA、2’O-メチルキャップを含むヌクレオチド類似体を含有する活性DNAzymeが記載されている（Warashina et al., 1999; Cairns et al., 2003; Schubert et al., 2004; Sidorov et al., 2004）。他の類似体は、DNAzymeの触媒活性と適合性である。例えば、ある塩基での別の塩基の置換による、ある塩基の類似体での置換による触媒核酸配列の改変、または糖成分もしくはホスホジエステル骨格の改変は、当業者には簡単であり得る。例えば、改変は、合成中に行うことができ、または合成後に特定の塩基の修飾によって行うことができる。塩基変更または塩基類似体などの改変が組み込まれた触媒核酸の経験的試験により、触媒活性に対する改変配列または特定の類似体の影響を評定することができる。塩基A、C、G、TおよびUの類似体は、当技術分野において公知であり、サブセットを表1に列挙する。
（表１）本明細書において有用なヌクレオチド類似体の例
Figure 2010505394
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「ストリンジェンシー」という用語は、本明細書において用いる場合、二つの核酸をハイブリダイズすることができる条件を指し、例えば、溶液中の塩および/または界面活性剤の濃度、二つの核酸のハイブリダイゼーション中に用いられる溶液の温度、ならびにそのハイブリダイゼーションの期間を含み得る。従って、本明細書において用いる「高ストリンジェンシー」という用語は、二つの核酸のハイブリダイゼーションが、そのような核酸が高い相補性度を共有する場合にのみ導びかれる、溶液中での条件を指す。相補性の度合いには、約50％から100％までの範囲が非限定的に含まれうる。したがって、「高ストリンジェンシー」条件は、さまざまな温度、ならびにさまざまな濃度の界面活性剤、塩および二価陽イオンを含むバッファーの使用を非限定的に含みうる。
以下の略号は、本明細書において、明細書の全体を通じて用いられる：
MNA：多成分核酸または多部構成核酸
MNA複合体：多成分核酸複合体、または多部構成核酸複合体
MNAzyme：多成分核酸酵素、または多部構成核酸酵素
MNAi：多成分核酸不活性プロ酵素複合体、または多部構成核酸不活性プロ酵素複合体
DNAzyme：デオキシリボ核酸酵素
PCR：ポリメラーゼ連鎖反応
LCR：リガーゼ連鎖反応
LNA：ロックド核酸
PNA：ペプチド核酸
An：分析物または標的
F：蛍光団
Q：クエンチャー
FAMまたは6-FAM：6-カルボキシフルオレセイン
BHQ1：Black Holeクエンチャー1
BHQ2：Black Holeクエンチャー2
shRNA：短鎖ヘアピンRNA
siRNA：短鎖干渉性RNA
mRNA：メッセンジャーRNA
tRNA：転移RNA
snoRNA：核小体小分子RNA
stRNA：低分子一過性RNA
smRNA：低分子調節性RNA
プレ-マイクロRNA：マイクロRNA前駆体
プリ-マイクロRNA：初期マイクロRNA（primary microRNA）
SCUD：DNAを用いるシグナルカスケード
TASC：標的補助自己切断
RIF：レポーター-阻害因子-助長因子
RI：レポーター-阻害因子ドメイン
GTP：グアノシン5'-三リン酸
CTP：シトシン5'-三リン酸
dATP：デオキシアデノシン5'-三リン酸
ATP：アデノシン5'-三リン酸
LP：連結産物
CP：切断産物
オリゴ：オリゴヌクレオチド
例示的態様の詳細な説明
本明細書において提供する図および実施例が、本発明およびその様々な態様を例示するためのものであり、限定するためのものではないことを最初に理解しなければならない。
本発明に従って、MNA複合体の修飾のための組成物、方法およびキットを提供する。本方法は、一般に、組織化助長因子が存在する場合に自己組織化して触媒的に活性または不活性な核酸複合体を形成する複数の核酸成分により好ましくは形成される多成分または多部構成核酸複合体を含む組成物の使用を含む。
本発明によれば、MNAzyme検出を標的増幅（例えば、PCR）と結び付けることに代わる選択肢は、それを、好ましくは核酸酵素のみを用いる、シグナル増幅と組み合わせることである。そのようなシグナルカスケード反応は、PCRなどの標的増幅技術に置き換わりうると考えられる。さらに、タンパク質酵素を全く必要とせず、それ故により安価であって貯蔵寿命がより長い、診断プロトコールを開発することもできる。
本発明によれば、DNAzymeを加えるか加えずにMNAzymeを用いる、シグナルカスケードのためのいくつかの戦略が考え出されている。
1．組成物‐MNAzymeおよび不活性MNA複合体
多成分核酸酵素（本明細書において多部構成核酸酵素または「MNAzyme」とも称される）は、2005年10月13日に提出された米国出願第60/726,291号および2005年10月7日に提出された第60/724,567号、ならびに国際出願PCT/AU2006/001473号に詳細に記載されており、それらの内容はすべて、参照により本明細書に組み入れられる。本明細書で定義したように、MNAzymeはMNA複合体の一つのクラスである。MNAzymeは、本明細書においてパートザイムとも称される、二つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチド成分から自己組織化することができる。該パートザイムオリゴヌクレオチドは、組織化助長因子が存在下で自己組織化してMNA複合体を形成する。MNAzymeは、触媒的に活性なMNA複合体である。一部の態様において、MNAzymeの存在は、検出することができ、標的の存在を示す。標的が組織化助長因子を含む場合、その標的が存在する場合にしかMNAzymeは形成しないからである。上で略述した基本原理に基づく多種多様なアッセイを本明細書において提供する。MNAzymeを形成することができるオリゴヌクレオチド、および様々な配列のMNAzymeを含む組成物も、本明細書において提供する。一部の態様において、オリゴヌクレオチド成分、組織化助長因子または基質のうちの少なくとも一つは、活性化因子またた標的に結合することができるアプタマーが含むことができる。
MNAzymeの一つの例示的デザインが図1に示されている。組織化助長因子分子は、モジュレーションを受けやすい高度に特異的な様式でパートザイム成分の組織化を導く「入力」シグナルをもたらす。いくつかの態様において、組織化助長因子は、例えば、被験試料中に存在する標的核酸配列であってよい。他の態様において、組織化助長因子は、例えば、環境内に含まれていて、検出可能な実体または事象の存在下でパートザイム成分の組織化を導く合成オリゴヌクレオチドであってよい。組織化したMNAzymeによる基質の修飾は、検出および/または定量化しうる「出力」シグナルをもたらすことができる。単なる例としては、基質を蛍光団（F）およびクエンチャー（Q）で二重標識した場合、活性MNAzymeによる基質の切断は蛍光団とクエンチャーとを分離させ、それに付随する蛍光の増加を結果的にもたらす。
以前に開示されているようなMNAzymeは、標的分析物の検出、同定および定量を想定していた。本発明は、MNA複合体に関する新たな方法、組成物および用途を記載する。本発明は、分解された、または部分的に組織化した複合体のような、触媒活性を欠く代替的な構造を形成させることによってMNAzymeの活性を操作するために用いうるオリゴヌクレオチド成分を提供する、新たな組成物を記載する。本発明はまた、適切な条件下では活性MNAzymeへと組織化しうると考えられるが、「活性阻害因子」とともに組織化されると触媒的に不活性な複合体の形成を結果的にもたらすオリゴヌクレオチド成分を含む、MNAiなどの不活性MNA複合体も開示する。そのような不活性なMNA複合体は本明細書において「MNAi」と定義されており、そのような不活性は活性阻害因子による阻害的な影響の発揮に起因しうる。MNAiはパートザイム成分の基質アームを介して基質と相互作用することができるが、基質を触媒的に修飾することはできない。
活性阻害因子は、組織化助長因子ドメイン、活性阻害因子ドメイン、レポータードメイン、基質ドメイン、またはそれらの任意の組み合わせのうち少なくとも一つをさらに含みうる。活性阻害因子が活性化因子組織化助長因子ドメインおよび活性阻害因子ドメインを含んでもよい。活性阻害因子が活性化因子組織化助長因子ドメイン、活性阻害因子ドメインおよびレポータードメインを含んでもよい。活性阻害因子ドメイン、活性化因子組織化助長因子ドメイン、基質ドメインおよびレポータードメインのうち少なくとも二つは、活性阻害因子の別個のドメイン上に位置しうる。活性阻害因子の活性阻害因子ドメイン、活性化因子組織化助長因子ドメインおよびレポータードメインのうち少なくとも二つは、不安定なリンカーまたは切断可能な基質によって連結されてもよい。
活性阻害因子ドメインは、パートザイムを含む少なくとも一つのMNA成分に対して実質的に非相補的なヌクレオチド配列を含みうる。
基質は、少なくとも一つの活性化因子組織化助長因子ドメイン、活性阻害因子ドメインおよびレポータードメイン、またはそれらの任意の組み合わせを含みうる。
活性阻害因子は、少なくとも一つの組織化阻害因子をさらに含みうる。
組織化助長因子ドメインが活性化因子組織化助長因子ドメインであってもよい。活性阻害因子はまた、活性化因子組織化助長因子ドメインおよび活性阻害因子ドメインも含みうる。この筋書きは、図4に描かれた活性阻害因子によって図示されている。活性阻害因子は、活性化因子組織化助長因子ドメイン、活性阻害因子ドメインおよびレポータードメイン、例えば、図6に図示されたRIF分子を含みうる。RIF分子の場合には、活性阻害因子ドメイン、活性化因子組織化助長因子ドメインおよびレポータードメインのうち少なくとも二つは、活性阻害因子の別個のドメイン上に位置しうる。
図6に描かれたRIF分子を参照すると、活性阻害因子ドメイン、活性化因子組織化助長因子ドメインおよびレポータードメインのうち少なくとも二つは、不安定なリンカーまたは切断可能な基質によって連結されている。
本発明はまた、触媒活性の阻害が、例えば本明細書で定義したような組織化助長因子などの活性化因子の存在を非限定的に含む特定の事象の発生、または温度、波長、圧、塩、界面活性剤、陽イオンの濃度もしくは任意の他のパラメーターの変化を非限定的に含むパラメーターの変化に即して除去しうることも開示する。さらに、例えば活性阻害因子を含むMNA成分に、結び付けられた核酸、ナノ粒子、マイクロ粒子、タンパク質、抗体、RNA、DNA、核酸類似体、ビオチン基、糖タンパク質、リポタンパク質、ペプチド核酸、ロックド核酸、ペプチド-核酸キメラ、高周波部分、またはそれらの任意の組み合わせを非限定的に含みうる、物理的手段による除去を容易にするための追加の実体を組み込むこともできる。触媒的に不活性なMNA複合体は「オフ」状態に相当し、一方、触媒的に活性なMNAzymeは「オン」状態に相当する。
活性化因子は、活性状態を直接的または間接的に誘導することができる。例えば、活性状態の直接的誘導は、組織化助長因子成分（活性化因子）がパートザイムと相互作用した時に起こりうる。例えば、活性MNAzyme状態の間接的誘導は、阻害因子ドメインおよび組織化助長因子ドメインからなる活性阻害因子の阻害因子ドメインの放出などによって阻害因子に作用して活性阻害因子の除去を引き起こす作用物質を活性化因子が含むかそれからなる場合のように、一つまたは複数の中間体の作用を通じて起こりうる。他の態様において、活性化因子は組織化阻害因子を除去する。
好ましい態様において、MNAzymeおよび不活性MNA複合体を含むMNA複合体は、一つまたは複数のDNAzymeおよび/またはリボザイムを基にしている。MNAzymeおよび不活性MNA複合体のためのより好ましいパートザイム成分は、特定のDNAzyme構造を基にしている。現在のところ好ましい構造は、10：23および8：17 DNAzymeを含むDNAzymeである。さまざまな態様において、MNAzymeおよび不活性MNA複合体は、リボヌクレオチド塩基およびデオキシリボヌクレオチド塩基の一方または両方を含む。より好ましい態様において、MNAzymeおよび不活性MNA複合体を含むMNA複合体は、少なくとも一部には、DNAzymeの構造を基にしている。他の好ましい態様において、MNAzymeおよび不活性MNA複合体を含むMNA複合体は、少なくともいくつかのデオキシリボヌクレオチド塩基またはその類似体を含む。より好ましい態様において、MNAzymeおよび/または不活性MNA複合体へと組織化されたパートザイムの触媒コア部分は、一つまたは複数のデオキシリボヌクレオチド塩基またはその類似体を含む。さらにいっそう好ましい態様において、一つまたは複数のデオキシリボヌクレオチド塩基またはその類似体は、MNAzymeによる基質の触媒作用に関与する。他の態様において、該触媒コア中の少なくとも一つのデオキシリボヌクレオチド塩基またはその類似体は、MNAzymeの触媒活性を向上させる。さらに他の態様において、一旦抑制性の活性阻害因子の作用が取り除かれたならば、デオキシリボヌクレオチド塩基が存在しない比較対象となるMNAzymeと比較して測定可能な割合で触媒作用が発生するために、MNAzymeの触媒コア中の少なくとも一つのデオキシリボヌクレオチド塩基またはその類似体に対する厳格な要件がある。
本明細書において提供するように、MNAzymeを含むMNA複合体および不活性のMNA複合体は、当業者には周知の一つまたは複数の置換、例えば類似体、誘導体、修飾もしくは改変された塩基、リボヌクレオチド、糖もしくはリン酸骨格の改変、様々な欠失、挿入、置換、重複もしくは他の修飾、またはこれらの任意の組み合わせを含有する場合がある。本明細書において証明するように、このような修飾、置換、欠失、挿入などをセンサーおよび/もしくは基質アームにおいて、ならびに/または触媒コア部分において行うことができるので、その分子は触媒活性を保持する。基質または組織化助長因子に結合するアームに対する置換および修飾は、十分に許容され得るものであり、実際、異なる基質/組織化助長因子に合わせてそれらの分子を作ることができる基礎となる。例えば、センサーアームの修飾により、異なる組織化助長因子に合わせて作ることができ、一方、基質アームの修飾により、異なる基質に合わせて作ることができる。複数の一般的な基質の解析により、複数の「出力」シグナルの同時のモニタリングが可能になる。
一定の好ましい態様において、本発明は、デオキシリボヌクレオチドからなる、または一定の修飾/置換などによりそのような分子から誘導される、触媒活性を有するMNAzymeを考えている。原則として、例えばリボヌクレオチドでの分子全体の置換は、その活性が一定の重要なデオキシリボヌクレオチドに依存するため、その分子を不活性にする。相応じて、リボザイムにおける一部のリボヌクレオチドをデオキシリボヌクレオチドで置換することはできるが、例えばデオキシリボヌクレオチドでの分子全体の置換は、その分子を不活性にする。
当業者は、MNAzymeおよび不活性MNA複合体を含むMNA複合体が、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのいずれか、またはさらにはその両方を含むことを理解するであろう。少なくとも一つの、より好ましくはすべてのデオキシリボヌクレオチド成分オリゴヌクレオチドを含む、そのようなMNAzymeおよび不活性MNA複合体が、現在のところ好ましい。同じく好ましいのは、MNAzymeおよび/または不活性MNA複合体を含むパートザイムの部分的触媒コアの少なくとも一つの内部に、少なくとも一つのデオキシリボヌクレオチド塩基またはその類似体を含むような、MNAzymeおよび不活性MNAである。さらにより好ましいのは、そのような塩基がMNAzymeの触媒活性のために必要であるような態様である。
ある好ましい態様において、MNA複合体の少なくとも一つの成分は、何らかの条件下でヘアピン構造を形成しうる自己相補性領域を含みうる。一つの態様において、自己相補性領域はパートザイムセンサーアームの一方または両方に位置しうる。もう一つの態様において、自己相補性領域はパートザイム基質アームの一方または両方に位置しうる。もう一つの態様において、一つまたは複数の自己相補性領域は、組織化助長因子、組織化阻害因子もしくは活性阻害因子成分、またはそれらの任意の組み合わせの中に存在しうる。他の態様において、MNA複合体は、自己相補性領域を含む基質と結合しうる。
例えば安定性および使用の容易さに関して、多部構成DNAzymeが多部構成リボザイムよりも有利であることも、当業者により認識されるであろう。また、特定の態様において、単一のMNAzyme（および/または不活性なMNA複合体）が二つの分子、すなわち組織化助長因子および基質を認識することができるのに対し、一つの基質しか認識できない単一分子核酸酵素、例えばDNAzymeに勝る利点を、MNAzymeが提供することも、認識されるであろう。例えば、MNAzymeのこれらの特性は、それらを、例えば論理ゲートを利用する系において、成分が「入力」シグナルを「読み」、「出力」シグナルを「書く」ことができることを必要とする系に適応させることを可能にする。MNAzymeのこの特性は、情報を伝達する能力、例えば、入力シグナルを受け取って適切な出力応答によって応答する能力をもたらす。
2．MNA複合体の触媒活性を調節するための方法、およびそれらの使用のための用途
MNA複合体の組織化および分解は、微小環境を変化させることによって制御することができる。そのような変化の例には、温度、二価陽イオンの種類および濃度、塩濃度、pH、添加物、ならびに活性MNAzymeの組織化および/または活性のために必須である必須成分の有無が非限定的に含まれる。
組織化したMNAzymeは「オン」状態に相当し、一方、その分解された、または部分的に組織化した成分は「オフ」状態に相当する。組織化および分解は、温度によって制御可能である。「オン」状態は、温度を、MNAzymeの組織化および触媒活性の両方と適合性のある範囲内にあるものに切り替えることによって誘導することができる。その反対に、「オフ」状態は、MNAzymeの組織化および/または触媒活性のいずれかと適合性のある範囲外に温度を切り替えることによって誘導することができる。MNA複合体の成分の融解温度は、限られた温度範囲内のみで組織化を可能にするように調整することができる。本発明のこの局面において特に有用なオリゴヌクレオチドには、安定化アーム成分、短縮型センサーアームを有するパートザイム成分、ならびに組織化助長因子および/またはモジュレーターオリゴヌクレオチドの成分が非限定的に含まれる。高度の柔軟性は、基本デザイン（図1）の成分が、図2に描かれた短縮型センサーアームまたは安定化アーム部分のようにより小さな成分サブユニットまたは部分へとさらに分割されているMNA複合体によって付与され、その配列は、融解温度、配列の組成、および他の成分オリゴヌクレオチドとの相補性またはその欠如に合わせて適合化することができる。図2を参照すると、短縮型のパートザイムアームは以下のいずれでもありうることが当業者には理解されるであろう；パートザイムAセンサーアーム、パートザイムBセンサーアーム（図2に示されているように）、パートザイムA基質アームまたはパートザイムB基質アーム、またはそれらの組み合わせ。
温度に対するMNAzymeの感受性を利用して、熱センサーおよび可変抵抗器を構築することができる。温度が、成分オリゴヌクレオチドの組織化（ハイブリダイゼーション）および/または触媒活性のために高すぎるか低すぎるならば、MNAzyme基質は修飾（例えば、切断）されないと考えられる。温度がMNAzyme活性にとって許容性であるならば、基質が修飾されてシグナルが生成されると考えられる。MNAzyme活性に対して非適合性であるものからMNAzyme活性と適合性のある別のものへの温度の上昇または低下は、MNAzymeによる基質修飾後に生成されるシグナルによって検出されると考えられる。MNAzymeはこのようにして、温度変化を検出しうるデバイスを提供することができる。当業者は、温度センシングのためにMNAzymeを用いる単純なデバイスの発明を、例えば、製薬産業、食品産業および農産業を含む多くの産業に応用しうると考えられることを理解するであろう。
他の態様においては、磁力が陽イオン濃度を調節することができ、それ故にMNAzyme活性をオンおよびオフにモジュレートするためのスイッチを提供することができる。正に荷電した陽イオンが、ある種のMNAzymeの触媒活性のためには必要である。磁力は、負に荷電したパートザイム成分を、正に荷電した陽イオン、例えばMg2+から物理的に分離することにより、MNAzyme活性を二者択一的にオフに切り替えることができると考えられる。続いて、MNAzymeは、パートザイムおよび陽イオンを接触した状態に戻すことにより、元通りに切り替えられると考えられる。
いくつかの態様において、活性「オン」状態（MNAzyme）は、活性と適合性のある範囲内にあるpHを用いて誘導することができる。その反対に、「オフ」状態は、活性と適合性のある範囲外にあるpHを用いて誘導することができる。pHはさらに、不安定な配列の加水分解を誘導して、それ故にMNAzymeおよび/または不活性MNA複合体に対して新たな成分を作り出すか破壊するかのいずれかによって、MNA複合体の活性を制御するために用いることもできる。
MNA複合体のいずれかの成分の有無は、「オン」または「オフ」スイッチのいずれかをもたらしうる。例えば、オリゴヌクレオチド配列、融解温度および/または濃度を変更することで、より微細な調節を達成することができる。MNA複合体として組織化しうる成分の広範囲にわたるデザインにより、例えば二部性（two-part）の組織化助長因子および/または二部性のパートザイム成分（短縮型センサードメインおよび安定化アームを有する）は、系に柔軟性を導入し、それはハイブリダイゼーションおよびそれ故にMNA複合体の組織化と適合性のある条件の適合化（微調整）を可能にする。さらに、MNA複合体内部の特定オリゴヌクレオチドの結合のハイブリダイゼーションの強度およびストリンジェンシーは、塩濃度、陽イオン濃度、温度および添加物（例えば、DMSO）の有無を非限定的に含む、多くの要因によって影響される。このため、ハイブリダイゼーションに影響を及ぼす実体は、活性MNAzymeおよび不活性MNAを含むMNA複合体の組織化および分解を制御するためのツールを提供する。
成分の物理的操作は、例えば、分子「フック」として結び付けられた部分の物理的性質を利用することにより、および/またはオリゴヌクレオチドの固有の特性、例えば負の荷電または配列相補性を利用することにより、達成することができる。もう一つの態様において、結び付けられた部分は、オリゴヌクレオチドを、例えばビオチン基を用いて選択的に捕捉することを可能にする。もう一つの態様において、部分は、ハイブリダイゼーションの遠隔的な電子的制御を容易にする高周波磁場受信器を含む。このアプローチは、MNA複合体内部の特定オリゴヌクレオチドの標的指向的熱変性による成分分子の選択的除去を可能にし、それ故に、成分分子がそれ自体で活性化因子または阻害因子配列であるか否かに応じて酵素活性の活性化または阻害を可能にするようにデザインされる。例えば、MNAi複合体からの活性阻害因子を選択的に変性させ、活性MNAzyme状態への遷移を可能にすることができる。
他の戦略を用いて、活性化因子または阻害因子分子の影響を除去し、それ故に活性MNAzymeおよび不活性MNA複合体の組織化または分解を促進させることができる。例えば、二つのオリゴヌクレオチドの一本鎖末端間でのハイブリダイゼーションは、DNA分枝点移動および二本鎖核酸のアンジッピング（unzipping）を引き起こしうる。一つの態様において、活性阻害因子は、分枝鎖移動によって機能するモジュレーターオリゴヌクレオチドにより、MNAi複合体から除去することができる。
他の態様において、相補的オリゴヌクレオチドは、活性化（MNAzyme）複合体またはMNAiなどの不活性MNA複合体のいずれかに本来含まれうるオリゴヌクレオチド成分に競合で打ち勝ち（outcompete）、それ故にそれを「オフ」に切り替える、または停止させるために用いることができる。このアプローチによって阻害される成分には、MNAzymeまたは不活性MNA複合体のいずれかの活性化因子または阻害因子成分が含まれうる。
活性化因子組織化助長因子ドメインの除去または阻害は、触媒的に活性なMNAzymeの、MNAiなどの不活性MNA複合体への遷移を許容する。活性化因子組織化助長因子ドメインの除去には、活性阻害因子による、MNAzymeからの活性化因子組織化助長因子ドメインの置き換えが含まれうる。
当業者は、本明細書で提供したさまざまな方法を、単一のMNA複合体の、または複数のMNA複合体の組織化または活性を、単一の反応またはアッセイでモジュレートするために一般に用いうることを認識するであろう。
3．組成物の分子スイッチとしての使用
当業者は、本発明を分子または生物「スイッチ」と同等にみなしうることを認識および理解すると考えられ、その用途は本明細書において想定されている。MNAzyme活性をオンおよびオフに切り替えるための機序の例示的な例は、以下の表2に列記されている。
（表２）活性および不活性MNA状態、ならびに二つの状態を切り替えるための機序
Figure 2010505394
この点に関して、多成分核酸複合体のいずれかの成分の有無は、「活性化因子」もしくは「オン」スイッチをもたらすことができ、またはそれは阻害性「オフ」スイッチをもたらしうる。
いくつかの態様において、安定化アームの存在または付加は、「オン」スイッチをもたらすことができる。一つの態様においては、反応の過程で、例えば活性阻害因子または任意の他のMNA成分の切断により、新たな安定化アームを系の中に生成させることができる。他の態様において、安定化アームの欠如、修飾または除去は「オフ」スイッチをもたらしうる。
いくつかの態様において、組織化助長因子またはそれらの成分の存在は、「オン」スイッチをもたらしうる。いくつかの態様においては、MNA複合体成分のMNAzyme切断により、例えば、SCUDの過程での活性阻害因子の切断により、または反応環境内にもたらされた他の成分の修飾により、新たな組織化助長因子を生成させることができる。いくつかの態様において、組織化助長因子は、配列内部にコードされた特定の「入力」シグナル系をもたらしうる。いくつかの態様において、組織化助長因子は認識される、または「読まれる」ことができる。いくつかの態様において、パートザイムセンサーアームは、一つまたは複数の単一塩基に違いのあるものを含め、組織化助長因子配列を「読む」ことができる。他の態様において、組織化助長因子またはそれらの成分の欠如または除去は、「オフ」スイッチをもたらしうる。
いくつかの態様において、MNA複合体の成分は、反応環境内に存在する成分の連結によって生成させることができる。いくつかの態様において、パートザイムは、オリゴヌクレオチドの連結を行い、それにより、会合して例えば活性MNAzymeを形成することのできる新たなパートザイム成分を生成させることによって作り出される。いくつかの態様において、組織化助長因子は、オリゴヌクレオチドの連結を行い、それにより、MNA複合体の組織化を助長しうる新たな組織化助長因子成分を生成させることによって作り出される。
活性化（MNAzyme）状態と不活性化（不活性MNA）状態との間の遷移は、活性コンフォメーションと不活性コンフォメーションとを交替させることによって調節することのできる分子スイッチを作り出すための機序をもたらしうる。そのような分子スイッチは、例えば、核酸複製カスケードの制御のために、または自律的な治療用、診断用および計算用の分子スケールデバイスの調節のために適用することができる。
本発明は、一つまたは複数のMNAzyme組織化助長因子分子の存在下で自己組織化してMNAiを形成する、自己組織化性MNAi複合体のための成分を含む組成物であって、少なくとも一つの組織化助長因子分子が活性阻害因子を含む組成物を提供する。
本発明は、図面を参照することによってより良く理解されるであろう。図1は、組織化助長因子を用いてMNAzymeを組織化させるための基本的な方法の一例を描写している。より具体的に、パートザイムAおよびパートザイムBを図1に示し、各々は、（i）センサーアーム部分、（ii）基質アーム部分、および（iii）触媒コア部分を含む。組織化助長因子の存在下において、パートザイムAおよびパートザイムBのセンサーアーム部分は、組織化助長因子、例えばDNAまたはRNA配列の相補的部分とハイブリダイズ可能であり、塩基対合することができる。この様式で組織化助長因子と接触すると、MNAzymeは自己組織化して触媒コアを形成し、これは、基質アームによって結合される基質を修飾することができる。好ましくは、MNAzymeの存在は、その触媒活性の検出または測定により検出される。このようにして組織化したMNAzymeの基質アームは、それらの基質アーム上の相補的配列と基質の相互作用により、基質、例えば、図1に示されているレポーター基質に係合することができる。基質が、基質アームとそのように係合すると、触媒コアは、基質の修飾（例えば、切断）を促進することができ、そしてまた、その基質を直接または間接的に測定または検出することができる。MNAzymeは、さまざまな方法を用いて、二者択一的に組織化させること（オンに切り替えること）および分解させること（オフに切り替えること）ができる。
図2を参照すると、活性MNAzymeの別の例示的なデザインが示されている。一つのMNAzymeの例示的な構造がパネル（i）に描写されており、この場合には複数の組織化助長因子成分がMNAzymeの形成のために必要である。このデザインでは、一つの組織化助長因子成分（F1）は、パートザイムAおよびBの両方のセンサーアームの領域に対して相補的であり、一方、第二の組織化助長因子成分（F2）はパートザイムBのみ（図2（i)のように）またはパートザイムAのみのいずれかに対して相補性を有する。この二つの組織化助長因子成分は相伴うことで、基質を修飾（例えば、切断）することのできる活性MNAzymeの組織化を導く。図9（左側の構造）は、MNAzymeの組織化のための助長因子の他のデザインを図示している。
図2のパネル（ii）は、組織化助長因子の存在下におけるパートザイムAと二部構成のパートザイムB成分との組織化によって、基質を修飾（例えば、切断）することのできる活性MNAzymeが生じる、例示的デザインを描写している。このデザインでは、パートザイムBは、本明細書において安定化アーム成分（S）と称する第二の成分の非存在下では安定なMNAzyme組織化を可能にするのに不十分な、短縮型センサーアーム（T）を有する。しかし、安定化アーム成分が、パートザイムの短縮型センサーアームが結合する位置に隣接した位置で、組織化助長因子とハイブリダイズすると、これは活性MNAzymeへの組織化を可能にする。
組織化助長因子の存在下において、パートザイムA、短縮型センサーアームを有するパートザイムB成分および安定化アーム成分の組織化によって形成された活性MNAzymeは、「オン」状態に相当する。パートザイム安定化アーム成分または組織化助長因子成分のいずれかの脱落、除去または修飾は、触媒的に活性な「オフ」状態を結果的にもたらす。このため、MNAzyme触媒活性を、さまざまなオリゴヌクレオチドの有無により、および/またはそのようなオリゴヌクレオチド成分が機能的に活性である能力、例えば、他のオリゴヌクレオチド成分とハイブリダイズして安定なMNAzyme複合体を形成する能力により、調節することができる。短縮型アームは、安定化アーム成分を伴わない反応条件下では安定なMNAzyme組織化を可能にするには不十分であるようにデザインされる。安定化アーム成分および組織化助長因子は、それ故に、MNAzyme活性の「オン」スイッチとして機能することができる。
図3に示された反応は、MNA複合体の二つの代替的な状態を表している。活性MNAzyme（反応（i)）は「オン」状態に相当する。パートザイム安定化アーム成分（反応（ii)）または組織化助長因子成分（反応（iii)）のいずれかが脱落した反応物は、「オフ」状態に相当する不活性MNA複合体である。このため、MNAzyme触媒活性を、さまざまなオリゴヌクレオチドの有無により、および/またはそのようなオリゴヌクレオチド成分が機能的に活性である能力、例えば、他のオリゴヌクレオチド成分とハイブリダイズして安定なMNAzyme複合体を形成する能力により、調節することができる。短縮型アームは、安定化アーム成分を伴わない反応条件下では安定なMNAzyme組織化を可能にするには不十分であるようにデザインされる。安定化アーム成分および組織化助長因子は、それ故に、MNAzyme活性の「オン」スイッチとして機能することができる。
短縮型のパートザイムアームは以下のいずれでもありうることが当業者には理解されるであろう；パートザイムAセンサーアーム、パートザイムBセンサーアーム（図示されているように）、パートザイムA基質アームまたはパートザイムB基質アーム。
当業者は、MNAzymeを、分子センサー、分子スイッチ、ならびに/または自己触媒性自己複製カスケードおよび他の反復プロセスのモジュレーターもしくはプロパゲーターを作り出すための戦略に用いうることを認識しているであろう。可能性のある適用範囲には、医学的用途、獣医学的用途、農業用途、食品技術用途、画像化用途および生物テロリズム向け用途が非限定的に含まれる。
図4を参照すると、MNAiは、パートザイムAおよびBが組織化助長因子および活性阻害因子と複合体化すると形成される（左側のパネル）。MNAiは基質と相互作用することはできるが、それを触媒的に修飾することはできない。いくつかの態様において、活性阻害因子は、活性阻害因子内部の二つまたはそれ以上のドメインを分離させうる、不安定なまたは切断可能なリンカーをさらに含みうる。そのようなドメインには、例えば、（i）パートザイム成分に対して実質的に非相補的であって、触媒的に活性なMNAzymeの形成のために必要な二次構造を破壊することによって阻害作用を発揮する、活性阻害因子ドメイン、および（ii）活性阻害因子ドメインから分離された場合に、組織化助長因子成分として働いて、活性MNAzymeの組織化を導くことのできる、活性化因子組織化助長因子ドメインが含まれうる。
活性MNAzyme（図4、右側）は、分子を二分して（i）阻害因子ドメインおよび（ii）活性化因子組織化助長因子ドメインを分離させる等のための活性阻害因子の修飾の後に、MNAiの構成要素から導き出されうる。放出された活性化因子組織化助長因子ドメインは、続いて、第二の組織化助長因子成分として機能することができ、それは第一の組織化助長因子成分と協同して、パートザイム成分AおよびBの、基質を触媒的に修飾することのできる活性MNAzymeへの組織化を導くことができる。
MNAiの他の例示的な構造は図9に示されている。
MNAiおよび触媒的に活性なMNAzymeは、組織化した成分の二つの代替的な状態、すなわち、それぞれ「オフ」状態および「オン」状態に相当する。
4．組成物の論理ゲートとしての使用法
当業者は、本明細書に記載されたようなMNA複合体を論理ゲートとして用いうることを認識するであろう。「オン」状態には、その活性化因子リガンドの存在下におけるMNAzymeまたはアプタ-MNAzymeを非限定的に含む、組織化した触媒的に活性なMNA複合体が含まれる。「オフ」状態には、完全または部分的に分解されたMNA複合体、活性化因子リガンドの非存在下におけるアプタ-MNA複合体、およびMNAiを非限定的に含む、触媒的に不活性なMNA複合体が含まれる。本発明の一つの局面によれば、少なくとも一つの不活性MNA複合体、少なくとも一つの入力および少なくとも一つの出力を含む、MNA複合体論理ゲートであって、前記入力の存在が前記不活性MNA複合体論理ゲートを活性化し、前記活性化が前記出力をもたらす、論理ゲートが提供される。ゲートは少なくとも二つの異なる出力状態が可能であり、ここで前記状態は前記不活性MNA複合体論理ゲートの活性化に依存する。
本発明の一つのさらなる局面において、MNA複合体ゲートは、少なくとも二つの入力、前記MNA複合体が不活性である第一の出力状態、および前記MNA複合体が活性化されている第二の出力状態を有する。MNA複合体が活性化されていない第一の出力状態は論理オフ（logical off）に対応し、前記MNA複合体が活性化されている第二の出力状態は論理オン（logical on）に対応する。または、第一の出力状態が論理オンに対応し、第二の出力状態が論理オフに対応してもよい。
本発明の一つのさらなる好ましい局面において、MNA複合体論理ゲートの出力は、蛍光分光法、表面プラズモン共鳴、質量分析法、NMR、電子スピン共鳴、偏光蛍光分光法、円二色性、イムノアッセイ、クロマトグラフィー、放射分析法、電子工学的方法、UV、可視光もしくは赤外分光法、酵素的方法のいずれか一つまたは任意の組み合わせによって検出することができる。
本発明のさらに別の態様において、MNA複合体論理ゲートは二つの入力を有する論理ANDゲートであってよく、ここでMNA複合体は第一および第二の入力が存在する場合にのみ活性化され、それにより論理オンに対応する出力をもたらす。いずれかの入力のみの存在下、または入力の非存在下では、MNA複合体は、論理オフに対応する活性なままである。
本発明のさらに別の態様において、MNA複合体論理ゲートは一つの入力を有する論理センサーゲートであってよく、ここで前記入力は不活性MNA複合体論理ゲートを活性化して、それにより論理オンに対応する出力をもたらし、前記入力の非存在下では、不活性MNA複合体論理ゲートは論理オフに対応する不活性なままである。
本発明の一つの追加の態様において、MNA複合体論理ゲートは二つの入力を有する論理ORゲートであってよく、ここでは前記入力の一方または両方がMNA複合体論理ゲートを活性化し、それにより論理オンに対応する出力をもたらし、入力が存在しなければ、MNA複合体論理ゲートは、論理オフに対応する不活性なままである。
本発明の一つのさらなる態様において、MNA複合体論理ゲートは二つの入力を有する論理EX-OR（排他的OR）ゲートであってよく、ここでは前記入力の両方ではなく一方がMNA複合体論理ゲートを活性化し、それにより論理オンに対応する出力をもたらし、入力が存在しないか、または両方の入力が存在するならば、MNA複合体論理ゲートは、論理オフに対応する不活性なままである。
さらに、当業者は、MNAzymeの分解および組織化が二つの状態であるオン状態およびオフ状態を等しくもたらしうること、ならびに二つの状態間の遷移を多くの実体および事象によってモジュレートしうることが分かるであろう。これらの状態を、上記のものに類似の様式で論理ゲート系に適用することもできる。
全加算器における論理ゲートの使用の一例が、図12に例示され、実施例12に記載されている。
5．不溶性および固体支持体を用いる方法
また、一般にこれらの方法が、多重化されているか否かにかかわらず、溶液中に適用可能であること、または基質、MNA複合体成分もしくはその部分のうち一つもしくは複数が結び付けられた不溶性支持体または固体支持体と組み合わされることも理解されるべきである。したがって、パートザイム成分、基質、組織化助長因子、組織化阻害因子および/または活性阻害因子のうち少なくとも一つを結合させること、結び付けること、または係留させることができる。重ねて、このようなアッセイ系の特徴は、本明細書において例示する方法および変形ならびに研究例の提供を受けた当業者には、一般に、理解される。従って、本発明を本明細書における文字通りの教示に限定されるとみなすべきではなく、本発明は、本明細書において提供する教示の原理および範囲ならびに当技術分野において知識に矛盾することなく修正および変更することができる。
別様にはアレイまたはマイクロアレイとして知られている「チップ」の形態の不溶性支持体を包含する本発明の態様は、一般に、そのチップに連結された、係留された、または別様に取り付けられた多数の基質を含む。特定の形態において、それらの基質は、核酸を含む。多数の核酸を、当技術分野において公知の任意の適する方法により、例えばピペット、インクジェット印刷、コンタクトプリンティングまたはフォトリソグラフィーにより、そのチップ上に配置することができる。このチップは、少なくとも一つの素子からなることができ、各素子が少なくとも一つの核酸を含む。この少なくとも一つの素子は、同じ配列の多数の核酸からなる場合もある。チップを構成する素子の数は、いずれの数であってもよく、多数の素子が一つのチップ上に配置される場合、それらの素子に、均一な距離もしくは可変的な距離またはそれらの組み合わせで間隔をあけることができる。一部の態様では、それらの素子をランダムに配置し、その後、各素子のそれぞれの位置を決めることができる。それらの素子のサイズおよび形状は、本発明の特定の用途に依存し、異なるサイズおよび形状の素子を組み合わせて一つのチップにすることもできる。このチップの表面は、実質的に平面である場合もあり、または陥没部もしくは突起部などの特徴を有する場合もあり、それらの素子が、それらの陥没部または突起部に配置される場合もある。そのような陥没部は、素子を浸漬させる溶液のレザバーとなることができ、またはそのような突起部は、素子の乾燥を助長することができる。例えば、素子を96ウエルプレートの各ウエルに配置することができる。一部の態様において、チップは、各々の素子を同定するために、固有識別子、例えば表示、無線周波タグ、集積装置、例えばマイクロプロセッサ、バーコードまたは他のマーキングを含む場合がある。これらの固有識別子は、追加でまたは代替として、そのアレイの表面の陥没部または突起部を含む場合がある。さらに、これらの固有識別子は、そのチップの正しい配向または同定のために提供することができる。これらの固有識別子は、データ取り込み装置により、または光学スキャナもしくは光学検出装置により直接読み取ることができる。
6.上記方法において使用されるレポーター基質系
本発明に従って、異なる組織化助長因子を認識する新たなMNAzymeおよび不活性なMNA複合体を作り出すために設計を容易に変更できることで迅速な系の開発を可能にするジェネリックレポーター基質系も提供する。本明細書において論じているように、パートザイムの基質アーム部分および触媒コア部分は、変わらずとどまることができ、新たな組織化助長因子に必要な一つまたは複数のパートザイムのセンサーアーム部分のみが変わる。一般的な基質配列が提供され、従って、同じ基質を様々な異なる用途のための系に組み込むことができる。さらに、同基質は、基質が溶液中で遊離している、または支持体に係留されているもしくは取り付けられている場合のアッセイを含む本明細書において様々な態様における方法に組み込むことができる。一連のジェネリック基質を多重反応において使用して、複数の組織化助長因子の同時検出を可能にすることができる。
切断された基質は再構成することができ、従ってDNAzymeリガーゼを使用して再利用される。
7.上記方法において使用される基質
以下でさらに詳細に説明するように、MNAzymeなどのMNA複合体および不活性なMNA複合体は、ユニバーサルまたはジェネリック基質を利用することができる一定の態様において有利な特性を有する。そのような基質を、基質が検出可能な部分とクエンチャー部分の両方を含む現在好ましい構成で図1に示す。このクエンチャー部分は、基質がMNAzymeによって切断されるまで、その基質の検出可能な部分からの検出可能なシグナルの減少または消去に適応している。例えばこのクエンチャー部分は、「ブラックホールクエンチャー1」（BHQ1）または「ブラックホールクエンチャー2」（BHQ2）を含むことができる。
従ってMNAzymeは、検出可能な部分とクエンチャー部分の間で基質を切断してそれら二つの部分を溶液中で分離させ、その結果クエンチャー部分を検出可能な部分の局所的環境から遠ざけ、または有効に除去するので、検出可能なシグナルを出現または増加させることができる。
一般的または汎用的な基質の使用は、MNAzymeの成分パートザイムのデザインを通じて可能になる。パートザイムのセンサーアームのみを変更し、基質アームは変化させずにおくことにより、そのすべてが汎用的な基質を利用して出力シグナルを生じる、複数の組織化助長因子のそれぞれに対して特異的な多種多様なMNAzymeおよび不活性MNA複合体をデザインすることができる。当業者は、このことがそれぞれの入力事象に応答する、特化したまたは特有の基質の必要性をなくすという利点を理解するであろう。それぞれの新たな組織化助長因子の検出に必要なのは、センサーアーム部分の一つまたは複数における一つまたは複数の変化のみである；基質アーム部分および触媒コア部分は不変なままでありうる。したがって、単一のレポーター基質を、MNAzymeなどのMNA複合体を用いる単一の組織化助長因子または他の入力事象に対して、および改変されたMNAzymeなどのMNA複合体を用いる一連の系において複数の組織化助長因子に対して用いることができる。複数のレポーター基質により、一つの系の内部での複数のMNA複合体およびMNAzymeの多重化モニタリングが可能となる。
さらに、標識された核酸、ナノ粒子、マイクロ粒子、タンパク質、抗体、RNA、DNA、核酸類似体、ビオチン基、糖タンパク質、リポタンパク質、ペプチド核酸、ロックド核酸、ペプチド核酸キメラ、高周波磁場用の部分、またはそれらの任意の組み合わせといった追加の実体を基質に組み込むこともできる。
MNAzymeによって基質を修飾し、それによって「検出可能な影響」または「出力」シグナルをもたらすことができる。この検出プロセスにおけるMNAzymeによる基質の修飾は、例えば切断、ライゲーション、ポルフィリンメタル化、および炭素-炭素結合、エステル結合またはアミド結合の形成を伴う場合がある。MNAzymeによる基質修飾の結果として検出可能な影響が生じ、従ってその作用の大きさは、入力シグナルの量を示す。この検出可能な作用は、蛍光分光法、表面プラズモン共鳴、質量分光法、NMR、電子スピン共鳴、偏光蛍光分光法、円二色性、イムノアッセイ、クロマトグラフィー、放射分析、光度計測法、シンチグラフィー、電子工学的方法、UV、可視光もしくは赤外分光法、酵素的方法、または任意の組み合わせ、UV、可視光もしくは赤外分光法、酵素的方法、またはそれらの任意の組み合わせを含む様々な方法によって検出することができる。
幾つかのグループが、比色読み出しでの核酸標的および他の分析物の検出を報告している（Elghanian et al, 1997、Mirkin et al, 1996、およびLiu and Lu, 2004）。この戦略は金ナノ粒子（これらの各々が、その表面に取り付けられた別個のDNAオリゴヌクレオチド配列を有する）のバッチの作製を伴う。その後、それらの金ナノ粒子に取り付けられている配列との相補性を有する「架橋性オリゴヌクレオチド」の添加により、金ナノ粒子を凝集させることができる。粒子凝集は結果として、赤色から青色への付随的な色の変化を生じさせる（Mirkin et al, 1996）。それらの架橋性オリゴヌクレオチド内にDNAzyme基質配列を含めることによって、金粒子の凝集を逆転させるメカニズムを生じさせることができることが証明された（Liu and Lu, 2004）。鉛の追加による鉛依存的DNAzymeの活性化は、架橋性オリゴヌクレオチドの切断を引き起こし、結果として、金粒子の解離および青色から赤色への色の変化をもたらした。
変化をモニターするための単純な検出器を、この原理およびMNAzymeなどのMNA複合体を用いて開発することができると考えられる。温度または他の実体もしくは事象の変化は、MNA複合体を活性化して、架橋性オリゴヌクレオチドを切断してナノ粒子の解離および色調の変化を引き起こすことのできるMNAzymeを形成させることができると考えられる。
8．方法の最適化
当業者は、本明細書に記載した方法を、さまざまな実験パラメーターを用いて最適化しうることを容易に理解するであろう。最適化される特定の実験パラメーター、およびそのような最適化のレベルは、用いられる特定の方法、および/または検出しようとする特定の事象に依存すると考えられる。そのようなパラメーターには、時間、温度、塩、界面活性剤、陽イオンおよびジメチルスルホキシド（DMSO）を非限定的に含む他の試薬の濃度、核酸の長さ、相補性、GC含量および融点（Tm）が非限定的に含まれる。そのような方法を行いうる温度は、約20℃から約96℃まで、約20℃から約75℃まで、20℃から約60℃まで、または約20℃から約55℃までの範囲内でありうる。温度は一定であってもよく、またはMNAzymeの組織化および触媒活性と適合性のある一つの温度と、触媒活性に対して非適合性である一つの温度との間を循環させてもよい。
追加的または代替的に、パラメーターおよび/または微小環境の変動を利用して、MNA複合体を不活性状態から活性状態に切り替えることもできる。すなわち、微小環境におけるパラメーターには、温度、波長、塩、界面活性剤、陽イオンの濃度、ならびに組織化助長因子または組織化助長因子成分、パートザイムまたはパートザイム成分、基質、組織化阻害因子、活性阻害因子および活性化因子オリゴヌクレオチド成分を非限定的に含む構造成分およびモジュレーター成分の濃度の変化といった事象を非限定的に含む、本明細書に定義したような「活性化因子」が含まれうる。したがって、パラメーターおよび/または微小環境のそのような最適化を、MNA複合体の分子スイッチとしての使用を達成する目的で企てることができる。
一つの好ましい態様において、MNA複合体を使用する方法を実施するための最適化反応を本明細書において提供する。このような最適化反応では、触媒活性の活性化を非最適化反応の10、20、または30％上まで増大させてもよい。さらに好ましい反応条件は、触媒活性を少なくとも35％または40％、および好ましくは50％以上にまで向上させうる。さらにいっそう好ましい態様において、最適化反応は50％を上回りかつ66％までの、75％までのまたは100％までもの触媒活性の活性化における増加を有してもよい。さらにより好ましい態様において、完全な最適化反応法は100％以上、200％以上または300％以上もの触媒活性の活性化における増加をもたらしうる。他の好ましい反応条件は、非最適化反応条件で実施される方法より1000％以上まで触媒活性の活性化を向上させうる。本明細書において提供する方法を最適化するための非常に好ましい反応条件は、一定の二価カチオンを含めることである。殆どの核酸酵素の触媒活性は、二価カチオンの濃度による影響を濃度依存的様式で受け得る。好ましい最適化反応は、Ba2+、Sr2+、Mg2+、Ca2+、Ni2+、Co2+、Mn2+、Zn2+、およびPb2+のうちの一つまたは複数について最適化されうる。
9．アプタマーを用いる方法
図7を参照すると、活性化因子リガンドを、アプタ-MNAzymeの活性を「オン」または「オフ」に切り替えるために用いることのできる方法が図示されている。活性化因子の非存在下でアプタ-MNAzymeの活性を阻止するために組織化阻害因子を用いる方法が図示されている。これらの方法は、一つまたは複数のリガンドを認識する能力を有する核酸またはタンパク質、ポリペプチドもしくはペプチドまたはこれらの組み合わせを含むことができるアプタマーを使用する。アプタマーは例えば、タンパク質、ポリペプチド、ペプチドもしくは核酸、糖タンパク質、脂質、リポタンパク質、細胞、ウイルス、細菌、古細菌、真菌、抗体、代謝産物、病原体、毒素、汚染物質、毒物、全生物、小分子、ポリマー、金属イオン、金属塩、プリオンまたはそれらの任意の誘導体、部分もしくは組み合わせ、または任意の他の単位に結合することができる（Lee et al., 2004）。
本明細書において好ましいアプタマーは、吸収、回収および再増幅の反復プロセスにより合成核酸の複合ライブラリーから単離することができる短い一本鎖DNAまたはRNAオリゴマーを含むことができる。従ってアプタマーは、アミノ酸または抗生物質などの小分子からタンパク質および核酸構造にわたるほぼあらゆる標的に対して生じさせることができる。好ましい態様において、アプタマーとしては例えば、好ましくは発生および選択技術により生成される核酸結合分子が含まれる。好ましくはアプタマーは、例えば上の表1のとおりのヌクレオチド類似体を含む（しかし、それらに限定されない）DNAもしくはRNA分子、または両方の組み合わせを含むことができる。
単数または複数の組織化助長因子分子、および/または活性阻害因子のいずれかの末端にアプタマーを組み込むことができることが、当業者に認識されるであろう。さらに一つまたは複数のパートザイムオリゴヌクレオチド成分の一つまたは複数に多数のアプタマーを組み込むことができることが、認識されるであろう。図4、パネル（i）および（ii）に図示されている戦略における組織化助長因子は、DNA、RNA、LNA、PNA、または一つまたは複数のヌクレオチド塩基類似体を含有する配列を含むことができる。他の態様において、標的Anは核酸である。このような態様では、標的核酸に相補的な配列が図4中の太線アプタマー配列の代わりになる。さらになお、一つのアプタマーまたは複数のアプタマーを、パートザイムオリゴヌクレオチド成分の少なくとも一つの中に組み込むことができることも理解されるであろう。図7に図示された戦略における組織化助長因子は、例えば、DNA、RNA、LNA、PNA、または一つもしくは複数のヌクレオチド塩基類似体を含む配列を含みうる。
図7に示された戦略では、活性MNAzymeが活性化因子の存在下のみにおいて形成されるような配置で、アプタマー配列がパートザイムの末端に組み込まれる（アプタ-パートザイム）。
一つまたは複数のアプタマーを、パートザイム、組織化助長因子または基質を含むオリゴヌクレオチド成分の任意のものの中に組み込むことができることも、当業者は理解するであろう。さらに、アプタマーを、これらのオリゴヌクレオチドのいずれか一つのいずれかの末端に組み込むこともできると考えられる。
図7に図示された戦略は、（i）リガンドを活性化因子分子として用いてMNAzyme活性を制御するための方法を提供するため、および/または（ii）リガンド活性化因子と接触した場合にMNAzymeを形成するアプタ-MNAzyme複合体を用いる非核酸標的および核酸標的の検出の方法を提供するためのいずれかとして用いることができる。このアプタ-MNAzyme検出戦略のために必要な核酸オリゴヌクレオチドには、以下が含まれる；
（a）標準的なパートザイム；
（b）その末端の一方にアプタマーが組み込まれているパートザイムである、アプタ-パートザイム；
（c）アプタ-パートザイムおよびパートザイムの両方と結合して活性MNAzymeの組織化を可能にするオリゴヌクレオチドである組織化助長因子；
（d）レポーター基質；ならびに
（e）アプタ-パートザイムと、アプタ-パートザイム配列の少なくともアプタマー配列の一部および基質結合アームの一部にわたる領域でハイブリダイズする、組織化阻害因子オリゴヌクレオチド。
活性化因子リガンドの非存在下では（左側のパネル）、組織化阻害因子オリゴヌクレオチドはアプタ-パートザイムと結合し、それ故にレポーター基質の結合と競合してそれを阻止する。この構造は不活性MNA複合体に相当する。活性化因子リガンドが存在する時には（右側のパネル）、それはアプタ-パートザイムのアプタマー配列と結合し、組織化阻害因子オリゴヌクレオチドの結合を阻止して、それ故に、基質の結合、およびこの筋書きでは続いて基質を切断する、触媒的に活性なMNAzymeの形成を可能にする。このため、MNAzymeが形成されて蛍光シグナル生成を引き起こすことができるのは、アプタマーと結合しうる活性化因子の存在下においてのみである。
いくつかの態様において、MNAzyme活性のモジュレーションは、核酸性または非核酸性の標的活性化因子リガンドをスイッチ機序として用いて達成することができる。他の態様において、組織化阻害因子分子は、活性をモジュレートするための他の手段によって操作される。例えば、組織化阻害因子を、選択的熱変性、または結合に関して競合させるためにオリゴヌクレオチドを用いる方法および/もしくは断片を追い出すために分枝鎖移動を用いる方法を含む、いくつかの戦略によって除去することができると考えられる。
10．カスケードを用いる方法
当業者は、本明細書に記載した方法を、本明細書に定義したようなカスケードを遂行させるために用いうることを理解するであろう。本明細書に開示されたような、そのような方法を遂行する具体的な態様には、以下のものが非限定的に含まれる：（1）標的もしくは事象の存在下のみにおいてMNAzymeを形成させて基質を修飾させる、不活性MNA複合体の活性化、ここで前記基質は続いて、検出可能なシグナルの生成などの第二の事象への関与のために利用可能である；または（2）標的もしくは事象の存在下のみにおいてMNAzymeを形成させて基質を修飾させる、不活性MNA複合体の活性化、ここで前記基質は続いて第二の事象への関与のために利用可能であり、前記第二の事象の遂行はさらに、任意の数の以降の事象への関与のためにさらなる基質を利用可能にし、その結果、以降の事象をより早期の事象の遂行への関与のために利用可能にし、それにより、図6、図10および図11（iii）に描写されているようなサイクリックカスケードを作り出すが、ここでそのようなサイクリックカスケードは、例えば、入力事象が低強度であり、例えば標的の存在量が少なく、通常であれば検出可能な出力シグナルがもたらされないような用途において、シグナルを増幅するために利用することができる。
標的分析物の検出のためにデザインされたMNAzyme複製カスケードを生成させるための一つの機序は、SCUDカスケード戦略を用いる。SCUD戦略はさまざまなデザインのカスケードに組み込むことができ、例えば、図6では二つのMNA複合体が組み込まれており；図10では三つのMNA複合体が組み込まれており；図11ではMNA複合体およびDNAzymeリガーゼの両方がカスケード反応に組み込まれている。
SCUD法は、混合物中に存在する成分オリゴヌクレオチドからの活性MNAzymeおよびMNAiの組織化を制御可能であることに依拠している。SCUDの一つの方式が図6に描写されている。このSCUDの例は、シグナル増幅のための一般的な方法を記載している。
図6に図示されているような、SCUD（DNAを用いるシグナルカスケード）として公知であるこの方法の一つの態様は、以下の成分を含む：
（i）以下の三つの領域を含む（図6に描写されたような二重標識RIF（レポーター-阻害因子-助長因子などの）活性阻害因子：
a．第一にRIFの中に組み込まれている時には活性阻害因子であり、第二にRIFが切断された時には蛍光出力シグナルをもたらすという二重の機能を有する、活性阻害因子/レポーター（RI）ドメイン、および
b．MNAzyme 2aの必須成分を形成する活性化因子組織化助長因子成分F2b、
c．RIドメインとF2bドメインとの間に位置し、MNAzyme 1aまたはMNAzyme 2aのいずれかによって切断されうる基質；
（ii）組織化助長因子成分F2a；
（iii）例えば被験試料中に存在する標的核酸であるとも考えられる組織化助長因子F1の存在下のみで活性MNAzyme 1a構造を形成させることのできるパートザイム；この活性MNAzyme 1aは、RIFをRI成分およびF2b成分へと切断し、それ故に蛍光を生じさせ、MNAzyme活性阻害作用を無効化すると同時に新たな活性化因子組織化助長因子成分F2bドメインを生成させることができる；
（iv）パートザイムアームが、遊離した活性化因子組織化助長因子成分F2bに隣接する組織化助長因子成分F2aと結合した時にのみ、活性MNAzyme 2aを形成することのできるパートザイム。このMNAzyme 2aは続いてさらに別のRIFを切断してさらに別のRIおよびF2bを遊離させ、それ故にMNAzyme 2aの自己触媒性自己複製のカスケードおよび同時発生的な蛍光シグナル増幅を作り出すことができると考えられる。
一例として標的核酸となりうると考えられるF1の非存在下では、MNAzyme 2aに対するパートザイムは、完全状態のRIFとともに不活性複合体MNAi 2iを形成すると考えられる。完全状態のRIFは、MNAi 2iの形成における活性阻害因子として機能する。標的分析物の存在下では、活性MNAzyme 1aが形成されて、それ故にRIFを切断し、活性化因子組織化助長因子成分F2bを放出させ、それが続いて自由に会合して活性MNAzyme 2aの成分になると考えられる。MNAzyme 2aはさらに、さらに別のRIFを切断することができるため、これは複製/シグナル増幅カスケードを惹起させると考えられる。
MNAzyme 2aがRIF分子を切断するたびに、新たなMNAzyme 2aの形成のために必要な、さらに別の成分（活性化因子F2b組織化助長因子）が生成されると考えられる。このMNAzymeカスケードは、MNAzyme 2a触媒活性によって生成された産物である成分を用いて、親MNAzymeと同一なMNAzyme 2a複合体の組織化を結果的にもたらす。このため、MNAzyme切断の産物（F2b）は、自己触媒性である自己複製系において、新たな（親）MNAzyme分子の組織化を導くことができる。
本明細書に記載された構造および他の分子スイッチは、自己複製性カスケードを含むカスケードの成分を形成することができる。
図10を参照すると、そのようなカスケードは、例えば標的と相互作用することによって標的の検出に働くMNA複合体を含みうる。このようにして、標的は組織化助長因子として作用し、開始MNAzymeの形成を助長することによってカスケードを惹起させる。この開始MNAzyme（図10におけるMt）は、基質を修飾することができる。修飾は、例えば切断でありうる。この場合には、修飾は、カスケード性の第一のMNAzyme（図10におけるMc1）の形成のための第一の組織化助長因子の生成を結果的にもたらす。カスケード性の第一のMNAzymeは続いて、追加の基質を修飾して、追加の組織化助長因子を生成し、追加のMNAzyme（図10におけるMc2）の形成を導くことができる。この追加のMNAzymeは続いて第一の基質を修飾し、カスケード性の第一のMNAzymeのためのさらなる第一の組織化助長因子を生成させ、それ故にカスケードのより早期の段階へのフィードバックが生成される。いくつかの態様において、組織化助長因子は活性化因子組織化助長因子であってよい。
当業者は、このカスケードにおいて、非切断状態にある第一の基質はカスケード性の第一のMNAzymeの活性阻害因子として作用しうることを認識するであろう。すなわち、カスケード性の第一のMNAzymeは、第一の基質が開始MNAzymeによって切断されて第一の活性化因子組織化助長因子を生成し、それが続いてカスケード性の第一のMNAiを「オフ」状態からカスケード性の第一のMNAzymeの触媒的に活性な「オン」状態に切り替えるように働くまでは、事実上はMNAiである。
同様に、当業者は、非切断状態にある追加の基質が、追加のMNAzymeの活性阻害因子として作用しうることを認識するであろう。すなわち、追加のMNAzymeは、追加の基質がカスケード性の第一のMNAzymeによって切断されて追加の活性化因子組織化助長因子を生成し、それが続いて追加のMNAzymeをオンに切り替えるように働くまでは、事実上はMNAiである。
当業者は、図10が、活性MNAzymeの組織化を助長するために必要な三つの組織化助長因子成分を示していることを認識するであろう。より多いまたはより少ない組織化助長因子成分を同様の図式で利用することも可能と考えられる。
図11を参照すると、本明細書に記載された構造および他の分子スイッチは、標的分子が第一のMNAzymeの形成を助長し、第一の基質の切断を結果的にもたらして二つの切断産物（AaおよびAbと表記）を生成させる、シグナル増幅カスケードを形成することができる。Aaは連結段階（図11に枠iiとして表示）における成分として働き、AbはSCUD増幅（図11に枠iiiとして表示）における成分として働く。Aaは典型的には、DNAzymeリガーゼに対する基質として働きうるように、2',3'-環状リン酸をその3'末端に有する。
連結段階において、DNAzymeリガーゼはAaを第二の基質と連結させて、追加のMNAzymeに対するパートザイムを作り出す（追加のMNAzymeは図11の枠ivに表示されている）。
SCUD増幅段階（図中に枠iiiにより表示）において、Abは、第一の基質を修飾してさらなるAaおよびAbを生成する第二のMNAzymeの組織化助長因子として働く。このさらなるAaおよびAbは、それぞれ連結およびSCUD増幅の段階で利用され、それにより、AaおよびAbの蓄積を結果的にもたらすフィードバック増幅カスケードを形成する。
連結段階の連結産物は、追加の基質を修飾して、標的の存在を示す検出可能な影響を結果的にもたらす、追加のMNAzymeに対するパートザイムである。
本発明の一つの好ましい態様において、基質のうち一つまたは複数の修飾は、蛍光分光法、表面プラズモン共鳴、質量分析法、NMR、電子スピン共鳴、偏光蛍光分光法、円二色性、イムノアッセイ、クロマトグラフィー、放射分析法、電子工学的方法、UV、可視光もしくは赤外分光法、酵素的方法のいずれか一つまたは任意の組み合わせによって検出することができる。
当業者は、このカスケードにおいて、非切断状態にある第一の基質は第二のMNAzymeの活性阻害因子として作用しうることを認識するであろう。すなわち、第二のMNAzymeは、第一の基質が第一のMNAzymeによって切断されて組織化助長因子を生成し、それが続いて第二のMNAiをオンに切り替えるように働くまでは、事実上はMNAiである。
MNAzymeを介した増幅カスケードは、SCUD戦略がアプタマー-MNAzyme系と結び付けられている場合には、核酸標的（DNA/RNA）または他の標的分析物（タンパク質、小分子その他）によって惹起させうると考えられる。反応はリガンドまたは他の入力事象の存在下のみにおいて惹起されるため、それは標的分析物の検出および/または同定のための手法を提供する。MNAzymeを介した増幅カスケードは、多成分核酸複合体の活性化に基づく。ポリメラーゼ連鎖反応またはリガーゼ連鎖反応などの標的増幅手法とは異なり、MNAzymeを介した複製およびシグナル増幅は、過程を助長するためのタンパク質酵素を必要としない。このことは、これらのよく用いられているプロトコールを上回る大きな利点を提供する。さらに、安定化アーム成分または組織化助長因子成分といったいくつかのオリゴヌクレオチド成分を用いてMNAzymeの触媒活性の制御および調節を行いうることは、微小環境における条件および成分によってMNAzymeの組織化を厳密に調節することを可能にする。
MNAzymeを介した増幅カスケードは、広範囲のバイオテクノロジー用途、特に診断に適用しうると考えられる。それらは、シグナル増幅を容易にすることにより、疾患診断のためのタンパク質および核酸の検出を可能にしうると考えられる。触媒性核酸および/またはカスケード反応は、診断以外の用途のためにも、例えば、治療に用いうる可能性のあるナノスケールデバイスおよびスイッチの計算機分析および生体分子エンジニアリングの分野で用いることができる。
11．活性阻害因子または組織化助長因子といった成分の除去により、MNA複合体の活性状態と不活性状態との間の切り替えを可能にする方法
活性MNAzymeと不活性MNA複合体との間の遷移、またはその逆の遷移は、一つまたは複数の活性阻害因子、組織化助長因子、組織化阻害因子、パートザイムもしくは安定化アーム、またはそれらの一部を非限定的に含む、MNA複合体成分の供給または除去によって達成することができる。いくつかの態様において、活性阻害因子は不安定なもしくは切断可能なリンカーまたは基質を含むことができ、それらは活性阻害因子内部の二つまたはそれ以上のドメインの間、例えば活性阻害因子ドメインと活性化因子組織化助長因子ドメインとの間に位置しうる。リンカー部位での切断は、活性化因子組織化阻害因子ドメインからの活性阻害因子ドメインの分離を可能にし、前者は続いて組織化助長因子成分として働いて、活性MNAzymeの組織化を導くことができる。リンカーの切断は、MNAzymeの切断、タンパク質酵素の切断、またはpHおよび/もしくは温度の変化によって誘導される加水分解を非限定的に含む、いくつかの方法によって達成しうると考えられる。
または、組織化阻害因子および/または組織化助長因子を、分枝点移動および/または成分オリゴヌクレオチドに対する相補性を伴う過程を用いて、選択的に除去することもできる。相補性を通じて働くモジュレーターオリゴヌクレオチドは、それらが結合するオリゴヌクレオチドの二次構造を変化させることによってそのように作用しうる。いくつかの態様において、これは、活性化因子配列が他の成分と組織化して活性MNAzymeを形成しうるようになった代替的なコンフォメーションを結果的にもたらしうる。一例として、そのようなモジュレーターオリゴヌクレオチドは、活性化因子分子を非機能性コンフォメーションに拘束させるヘアピンなどの分子内構造の破壊を引き起こすことができる。
いくつかの態様において、活性阻害因子または組織化阻害因子を非限定的に含む阻害因子などのMNA成分を、他の実体とコンジュゲートさせることもできる。いくつかの態様において、成分は、高周波磁場と連動させた金ナノ粒子とコンジュゲートさせることができる。これはハイブリダイゼーションの遠隔的な電子的制御を可能にし、高周波磁場は、周囲の分子には相対的に影響を及ぼさないままで、特定のオリゴヌクレオチドの可逆的熱変性を可能にする、アンテナとして機能する。いくつかの態様において、成分は、成分の捕捉および物理的単離を容易にするためにビオチンで標識することができる。
12．キット
本発明はまた、本明細書に開示された方法を遂行するためのキットも提供する。典型的には、本発明を実施するためのキットは、方法を実施するために必要な試薬のすべてを含む。例えば、一つの態様において、キットは、MNAiなどの不活性MNA複合体を含む第一の容器を含むことができ、ここでMNAzymeを形成させるための前記不活性MNA複合体の不活性化は、活性化因子に対する不活性MNA複合体の曝露を通じての触媒活性の阻害の無効化を必要とし、前記活性化因子は阻害因子の阻害的な影響を無効化する。例えば、一つの態様において、キットは、不活性MNA複合体の形成のための一つまたは複数の成分を別々の容器内に含みうる。
一つの態様において、キットは、不活性MNA複合体に対する成分を含む第一の容器を含むことができ、ここでMNAzymeを形成するための前記MNA複合体の不活性化は、本明細書に記載された方法による、活性化因子に対するMNA複合体の曝露を通じてのMNA複合体の活性化を必要とする。
一般に本発明のキットは、例えば洗浄用試薬および/または本発明の方法の実施の際に必要とされる他の試薬を収容する、一つまたは複数の他の容器も含む。
本発明に関連して区画化キットは、試薬が別々の容器に収容されており、且つ、小さなガラス容器、プラスチック容器またはプラスチックもしくは紙のストリップを含むことができる任意のキットを含む。このような容器は、サンプルおよび試薬の交差汚染を回避しながらの一つの区画から別の区画への試薬の効率的な移送、ならびに定量的様式での一つの区画から別の区画への各容器の薬剤または試薬の添加を可能にすることができる。このようなキットは、試験サンプルを受け入れる容器、アッセイにおいて使用される試薬を収容する容器、洗浄用試薬を収容する容器、および検出試薬を収容する容器も含むことができる。一般に、本発明のキットは、キットの成分を使用して、適切な方法を実行するための使用説明書も含む。本発明のキットおよび方法は、例えば実時間PCR機を含む（しかし、これに限定されない）自動分析装置およびシステムと共に使用することができる。
異なる標的の検出、同定または定量への適用に、本発明の単一のキットを適用できる場合もあり、または代替的に、例えば各標的に特異的な試薬を含有する異なるキットを必要とする場合もある。本発明の方法およびキットは、任意の実体または事象の検出、同定または定量が望ましい任意の状況で適用することができる。
如何なる点においても本発明の範囲を限定するものと見なすべきではない以下の特定の実施例を参照することにより、本発明をさらに詳細に説明する。
実施例
実施例1: パートザイムBが二つの分子を含むMNAzymeの例
MNAzymeの基本設計に関する多くの変化形が本発明において企図される。この実施例では、MNAzymeは組織化助長因子の存在下において、パートザイムA、ならびに二つの成分、すなわちトランケートされたセンサーアームを有するパートザイム成分一つ、および安定化アームとして機能する成分一つを含んだパートザイムBから組織化された。MNAzymeの組織化は、パートザイム・センサーアームおよび組織化助長因子の配列のワトソン・クリック塩基認識によって行われる。以下の実施例では、トランケートされたパートザイムアームおよび安定化アームの使用を実証した。
この実施例において使用したMNAzyme検出戦略を図2 (パネル(ii))におよび図3に図示する。必要なオリゴヌクレオチドを以下に記述する:
（a) 標準的パートザイムA;
（b) 基質アーム、部分的触媒コアおよびトランケートされたセンサーアームを含有する第一の成分、ならびにトランケートされたパートザイム・センサーアームに隣接した状態で、組織化助長因子にハイブリダイズする第二の安定化アーム成分を含むパートザイムB。この安定化アームは、トランケートされたパートザイム・センサーアームが組織化助長因子にハイブリダイズされるとMNAzyme組織化を助長するように設計される; および
（c) 基質、例えばレポータープローブ基質。
活性なMNAzymeの組織化には組織化助長因子の存在も必要になる。
1.1 パートザイムオリゴヌクレオチドおよび安定化アーム
この実施例では、トランケートされたパートザイムB・センサーアームは、長さがわずか5ヌクレオチドであった。パートザイムAおよび二つのパートザイムB成分の配列を以下に示す(5'から3'方向)。以下の配列において、太字の塩基は組織化助長因子とハイブリダイズし、下線を引いた塩基は組織化MNAzymeの触媒コアの一部を形成し、イタリック体の塩基は基質にハイブリダイズする。「-P」はオリゴヌクレオチドの3'リン酸化を示す。

SEQ ID NO: 1 パートザイムA4 Xd-P:
Figure 2010505394
SEQ ID NO: 2 パートザイムB5 Xd-P成分1:
Figure 2010505394
SEQ ID NO: 3 パートザイムB安定化アーム成分XdS-P:
Figure 2010505394
1.2. レポーター基質
この実施例において使用したレポーター基質は、6-FAM部分により5'末端で、BHQ1部分により3'末端で末端標識したSubBi-2とし、SubBi-2-FBと名付けた。490 nm (FAM励起波長)で励起し、520 nm (FAM放射波長)でSubBi-2-FBの切断をモニターした。SubBi-2-FBの配列を以下に記載する(5'から3'方向); 小文字の塩基はRNAを表し、大文字の塩基はDNAを表す。

SEQ ID NO: 4 SubBi-2-FB:
Figure 2010505394
1.3. 組織化助長因子分子
組織化助長因子として使用した合成オリゴヌクレオチドの配列は以下である(5'から3'方向)。この組織化助長因子はパートザイムBセンサーアームと完全にマッチしていた。ヌクレアーゼ不含水を「標的なし」の対照として標的組織化助長因子の代わりに使用した。

SEQ ID NO: 5 組織化助長因子Xd-T:
Figure 2010505394
1.4 反応条件
触媒的に活性なMNAzymeによるレポーター基質の切断に起因する蛍光シグナルの増加によって、組織化助長因子の検出を測定した。基質の添加によって反応を開始し、全反応の総容量を50 μLとした。FLUOstar OPTIMA (BMG Biotech)にて55℃で反応を行った。各反応の蛍光を2秒毎に計5分間読み取った。反応の全てに200 nM A4Xd-P、200 nM B5Xd-P、1×PCR緩衝液II (Applied Biosystem)および25 mM MgCl2を含めた。さらに、表3に記載のオリゴヌクレオチドを反応に含めた。
(表３) MNAzyme反応におけるさらなる試薬
Figure 2010505394
1.5 結果: パートザイム、および組織化助長因子の存在下における活性なMNAzymeの組織化
組織化助長因子も、パートザイム・安定化アーム成分もともに反応に含まれていた場合(反応(i): 図3)には、活性なMNAzymeが組織化し、基質を切断し、経時的に蛍光の増加をもたらした。対照的に、組織化助長因子の非存在下では蛍光の増加が認められなかった(反応(iii): 図3)。さらに、安定化アームの存在は活性なMNAzymeの形成に不可欠であることが示された。安定化アーム成分を欠く以外は、組織化助長因子を含め全ての反応成分を含有する反応では、経時的に蛍光の増加を生じなかった(反応(ii): 図3)。したがって、パートザイムBのセンサーアームの5塩基では安定なMNAzyme複合体を形成させるのに不十分であったが、安定化アーム成分の存在により、パートザイム・センサーアームの長さの不足(トランケーション)を補うこと、およびストリンジェントな温度条件(この実施例では55℃)の下で安定なMNAzymeの形成を可能にすることができると分かった。安定化アーム成分はしたがって、トランケートされたセンサーアームを有するパートザイムを用いるこの系において、活性なMNAzymeの組織化に不可欠なオリゴヌクレオチドである。
さらに、パートザイム・センサーアームとの単一のヌクレオチドミスマッチを持った、別の組織化助長因子が、パートザイムAおよびパートザイムBの二つの成分を含有する反応の中に含まれた場合、蛍光シグナルは経時的に増加しなかった(データは示されていない)。
この実施例は、MNAzymeが実験条件の下で、完全にマッチした組織化助長因子の存在下においてだけ生じうることを実証している。完全にマッチしたまたはミスマッチした組織化助長因子を供与することにより、活性なMNAzymeと不活性なMNA複合体との間の移行を調節できることを当業者なら理解するであろう。さらに、本実施例は、トランケートされたセンサーアームを含有する第一の分子、および第二の安定化アーム分子を含む、二成分パートザイムの使用も実証している。そのような系における安定化アーム分子の存在に対する要件は、MNAzymeの組織化を調節できる別のツールとなる。
融解温度、配列組成および他の成分のオリゴヌクレオチドとの相補性またはその欠如に関して配列を調整できる、複数のオリゴヌクレオチド成分を含んだMNA系によって高い柔軟性が得られる。トランケートされたアーム、安定化アームを有するパートザイム成分、および組織化助長因子成分を含むが、これらに限定されない短い配列は、本発明のこの局面において特に有用である。
実施例2: 温度によるMNA複合体の組織化および非組織化の調節ならびに温度検知用DNAナノスケール装置の構築へのその適用
MNAzymeの組織化および非組織化を温度によって制御することもできる。温度の上昇または低下は、MNAzymeの触媒活性をスイッチ「オン」および「オフ」にする機序となりうる。温度に対するMNAzymeの感受性を利用して、サーモセンサーおよびレオスタットを構築することができよう。
MNAzymeの成分オリゴヌクレオチドの組織化(ハイブリダイゼーション)に対し、および/またはMNAzymeの触媒活性に対し、温度が高すぎるか低すぎるかのいずれかであったなら、基質を修飾(例えば切断)できる活性な複合体は形成されないであろう。MNAzymeの組織化および/または活性に対し許容される温度であったなら、基質が修飾され、シグナルが生み出されるであろう。
成分オリゴヌクレオチド(例えば、安定化アーム成分および/または組織化助長因子を含め、パートザイム)の融解温度を、塩基組成および/またはオリゴヌクレオチド長を改変することにより変えられることで、MNAzyme系のいっそうの微調整を可能にする系が構築されるようになる。これは、MNAzymeが完全に「オン」または完全に「オフ」の状態にあることを可能にするばかりか、レオスタット系で用いるのに適した活性の漸次的変化も可能にする。それは、MNAzymeの反応が起こる温度範囲の調節も可能にする。
MNAzyme活性と適合しないものからMNAzyme活性と適合するものへの温度の上昇または低下は、MNAzymeによる基質修飾後に生じるシグナルによって検出されるであろう。読み出しは、例えば、蛍光または比色分析とできよう。
MNAzyme複合体は、金ナノ粒子の凝集を引き起こす原因となる、架橋オリゴヌクレオチドを切断することにより温度変化に反応することができよう。これにより、温度変化を検出できる簡単な比色分析装置の開発が可能になるであろう。温度検知用MNAzymeを用いた簡単な装置の発明を、例えば、製薬産業、食品産業および農産業を含む多くの産業において適用できることを当業者なら理解するであろう。
用途の一つでは、MNAzyme温度センサーを温度感受性の薬物または他の化合物と一緒に包装することを伴うことができよう。この包装が適切な温度条件下で(例えば冷蔵下で)貯蔵されなかったなら、MNAzymeが生じ、シグナルを生み出し、したがって化合物を駄目にしたと見なすことができよう。同様に、貯蔵中のある時期に解凍されてしまった食品を特定可能な、MNAzyme温度センサーにより、設定した温度限界の範囲内にあることが必要な食品、例えば、冷凍食品をモニターすることもできよう。
MNAzymeの触媒活性を制御するために温度を使用するこの実施例は、MNAzymeの触媒活性をスイッチ「オン」および「オフ」にする一般戦略を実証している。したがって、触媒速度に影響を与えうる多くの要因により、MNAzymeの組織化および非組織化を制御することができよう。そのような例としては、成分パートザイムまたは組織化助長因子の存在または非存在、塩濃度、pH、二価陽イオンのタイプおよび濃度、添加物の存在または非存在、ならびに温度が挙げられるが、これらに限定されることはない。
実施例3: 活性なMNAzymeまたはMNAiの組織化を助長および阻害するための機序
MNAzymeは、一つまたは複数の組織化助長因子成分の存在下において組織化し、活性な酵素を形成するパートザイムから構成される(例えば図1、2、4 (右側パネル)、図5 (i)および(ii)ならびに図9 (左側構造))。パートザイム・センサーアームに結合する組織化助長因子は、標的分析物であってもよく、または反応混合物に添加されてMNAzymeの組織化を推進する合成核酸分子であってもよい。パートザイムは、活性なMNAzymeの組織化に寄与するその能力に加えて、「活性阻害因子」分子とハイブリダイズする場合に不活性な、非触媒性MNAi複合体に組織化することができる(図4 (左側パネル)、図5および図9 (MNAzyme構造の右側の構造))。種々の代替的オリゴヌクレオチド配列を、活性なMNAzyme複合体またはMNAiのいずれかの組織化を調節するその能力について試験した。
この実施例(図4および5に描いた)では、MNAzymeの組織化を(i) 単一の分子(組織化助長因子F1/2)、または(ii) 二つの分子(組織化助長因子成分F1および組織化助長因子成分F2; これらの配列はともに、助長因子F1/2に存在する配列を含む)の存在下において調べた。助長因子F2は一つのパートザイムのセンサーアーム全体に結合し、もう一つのパートザイムのセンサーアームの4塩基対に結合するように重複している。別の反応では、助長因子F2に加えさらに活性阻害因子ドメインの配列を含んだ配列を有する「活性阻害因子」分子を、MNAi複合体の組織化の方向に反応を推進するその能力について試験した。
3.1 パートザイムオリゴヌクレオチド
以下の配列において、太字の塩基は組織化助長因子とハイブリダイズし、下線を引いた塩基は組織化MNAzymeの触媒コアの一部を形成し、イタリック体の塩基は基質にハイブリダイズする。「-P」はオリゴヌクレオチドの3'リン酸化を示す。

SEQ ID NO 6: パートザイムA RO5A4/2-P:
Figure 2010505394
SEQ ID NO 7: パートザイムB RO5B5/2-P:
Figure 2010505394
3.2 レポーター基質
この実施例のためのレポーター基質は、5'から3'方向に、以下の配列を有するSubBi-2-FBである。SubBi-2-FBは、6-FAM部分により5'末端で、BHQ1部分により3'末端で末端標識された。485 nm (FAM励起波長)で励起し、530 nm (FAM放射波長)でSubBi-2-FBの切断をモニターした。小文字の塩基はRNAを表し、大文字の塩基はDNAを表す。

SEQ ID NO: 4: SubBi-2-FB:
Figure 2010505394
3.3 調節因子オリゴヌクレオチド
いくつかの分子を、この実施例では、MNAzymeおよび/またはMNAiの組織化を調節するその能力について試験した。組織化助長因子F2を構成する配列は、助長因子F1/2および活性阻害因子の配列内にも含まれており、太字で、かつ下線を引いて示されている。

SEQ ID NO 8: 組織化助長因子F1/2:
Figure 2010505394
SEQ ID NO 9: 組織化助長因子F1:
Figure 2010505394
SEQ ID NO 10: 組織化助長因子F2:
Figure 2010505394
SEQ ID NO: 11 活性阻害因子分子:
Figure 2010505394
3.4 反応成分およびMNAzyme活性のモニタリング
MNAzyme活性の実時間モニタリングをBMG LabTech FluoStar蛍光光度計にて総反応容量50 μL中で実施した。反応を4分間55℃で等温的にモニターした。1×PCR緩衝液II (Applied Biosystems)、25 mM MgCl2、200 nMのパートザイムA RO5A4/2-P、200 nMのパートザイムB RO5B5/2-Pならびに(i) 400 nMの組織化助長因子F1/2、または(ii) 400 nMの組織化助長因子成分F1および400 nMの組織化助長因子成分F2、または(iii) 400 nMの活性阻害因子および400 nMの組織化助長因子成分F1、または(iv) 組織化助長因子なしのいずれかを含有する反応混合物の中に蛍光基質SubBi-2-FB (1 μMの溶液10 μl)を注入することにより、反応を開始した。
3.5 結果:
さまざまな調節成分または構造成分オリゴヌクレオチドの組み合わせによる結果を図5に示す。高レベルのMNAzyme切断活性を示す蛍光シグナルの急速な増加を、組織化助長因子F1/2 (図5 (i))、または組織化助長因子成分F1およびF2 (図5 (ii))のいずれかを含有する反応において認めた。助長因子の非存在下では、経時的に蛍光の増加を認めなかった(図5 (iv))。これは、組織化助長因子が必ずしも、切れ目のないオリゴヌクレオチドである必要はなく、パートザイムのセンサーアームの一方に対し相互に隣接した状態で整列する、複数のさらに短い助長因子成分に分けられてもよいことを実証している。
活性阻害因子および助長因子F1を含有する反応では経時的に蛍光シグナルの増加を認めなかった(図5 (iii))。活性阻害因子分子は助長因子F2の配列を含むので、助長因子F2に隣接した付加的な非相補性阻害配列がMNAi複合体の組織化を推進する要素である。MNAiは基質に結合することができるものの、基質を触媒的に修飾することができない。結果的に、MNAi複合体の存在下において基質が切断されず、蛍光が経時的に増加しなかった(図5 (iii))。組織化助長因子成分F1およびF2を含有する反応(図5 (ii))と、組織化助長因子F1および(F2配列を組み入れた)活性阻害因子を含有する反応(図5 (iii))との比較は、活性阻害因子内の阻害ドメインの存在が、MNAi複合体の組織化を推進し、活性なMNAzymeの形成を阻止することにより、酵素活性を調節するツールとなりうることを実証している。
このように、組織化助長因子F1/2の存在下において形成されるように設計したMNAzymeは、蛍光を生み出した。本実施例により、組織化助長因子F1/2は、二つの部分(組織化助長因子成分F1およびF2)に分けられても、触媒的に活性なMNAzymeの組織化を指令する能力を保持できることが実証された。ともに二つの組織化助長因子成分は、これらがパートザイム・センサーアームに対し相互に隣接した状態で結合するなら、活性なMNAzymeの形成を安定化し、蛍光を生じさせることができる。同一の反応条件の下で行ったその後の実験により、組織化助長因子成分F2のみの存在下では経時的に蛍光の増加を認めないことが実証された(データは示されていない)。したがって、この実施例により、活性なMNAzymeへのパートザイムの組織化には複数成分の組織化助長因子の存在が必要になりうることが実証される。複数成分の組織化助長因子が必要とされる場合、これらの成分の一つまたは複数の存在または非存在を用いて、活性なMNAzymeの組織化を制御し、したがって、それらをスイッチオンおよびオフにすることができる。
活性阻害因子分子は、パートザイムにハイブリダイズし、酵素活性な必要なパートザイム・センサーアームに対し二つの組織化助長因子成分の接合部で二次構造を破壊することにより、MNAzymeの組織化を阻止できることがさらに分かった(例として図4および5を参照のこと)。阻害因子分子はパートザイムAまたはBのいずれかに、およびパートザイムのセンサーアームまたは基質アームのいずれかにハイブリダイズするように設計できることを当業者なら理解するであろう。
活性阻害因子、パートザイム・安定化アーム成分および組織化助長因子またはその成分を含む分子を使用して、活性なMNAzymeの組織化およびMNAiなどの不活性な状態を調節することができる。活性化状態(MNAzyme)と不活性化状態(MNAiなど)との間の移行は、活性な高次構造と不活性な高次構造とを繰り返すことにより調節できる、分子スイッチを作出するための機序となりうる。そのような分子スイッチを核酸複製カスケードの制御に(図6、実施例4)、または、分子スケールの治療用、診断用および計算用自律装置の調節に適用することができよう。特定のオリゴヌクレオチド成分の解離を誘導するために利用できる種々のプロトコルは、本書を通じて論じられている。
実施例4: DNAを用いたシグナルカスケード(SCUD)
標的分析物の検出用に設計されたMNAzyme複製カスケードを作出するための機序の一つでは、SCUDカスケード戦略を用いる。例証として、カスケード反応に、二つのMNA複合体が組み入れられる図6の場合に; 三つのMNA複合体が組み入れられる図10の場合に; およびMNA複合体もDNAzymeもともに組み入れられる図11の場合に図示される通り、さまざまな設計のカスケードの中にSCUD戦略を組み入れることができる。
SCUD法は、混合物中に存在する成分オリゴヌクレオチドからの活性なMNAzymeおよびMNAiの組織化を制御する能力に依る。SCUDの一つの形式を図6に描く。このSCUDの例ではシグナル増幅のための一般的方法について記述する。
図6に図示したように、SCUD (Signal Cascade using DNA; DNAによるシグナルカスケード)という、方法の一つのスキーマには以下の成分が含まれる:
(i) 以下の三つの領域を含んだ二重標識RIF (Reporter-Inhibitor-Facilitator; レポーター-阻害因子-助長因子);
a. 第一にRIFへの組み入れ時には活性阻害因子であり、かつ、第二にRIFの切断時には蛍光シグナルを与えるという二重機能を有する活性阻害因子/レポーター(RI)ドメイン、ならびに
b. MNAzyme 2aの必須成分を形成するアクチベータ組織化助長因子成分F2b、
c. MNAzyme 1aまたはMNAzyme 2aのいずれかによって切断されうる、RIドメインとF2bドメインとの間に位置する基質ドメイン、
(ii) 組織化助長因子成分F2a
(iii) 例証として、試験サンプル中に存在する標的核酸であってよい、組織化助長因子F1の存在下においてのみ活性なMNAzyme 1a構造体を形成できるパートザイム; この活性なMNAzyme 1aはRIFをRIおよびF2b成分に切断し、かくして蛍光を生み出し、MNAzyme活性の阻害作用を打ち消し、同時に新たなアクチベータ組織化助長因子成分F2bを生み出すことができる。
(iv) パートザイムアームが組織化助長因子成分F2aを、放出されたアクチベータ組織化助長因子成分F2bに隣接した状態で結合する場合にのみ活性なMNAzyme 2a複合体を形成できるパートザイム。このMNAzyme 2aが今度は、さらに多くのRIFを切断し、さらに多くのRIおよびF2bを放出し、かくしてMNAzyme 2a自己複製および同時に起こる蛍光シグナル増幅のカスケードを作出しうる。
例証として標的核酸でありうる、F1が存在しない場合、MNAzyme 2aのためのパートザイムは完全なRIFとともに、不活性な複合体MNAi 2iを形成しうる。標的分析物が存在する場合、活性なMNAzyme 1aが生じ、かくしてRIFを切断し、自由に結び付いて活性なMNAzyme 2aの成分になることができるアクチベータ組織化助長因子成分F2bを放出しうる。MNAzyme 2aはもっと多くのRIFをさらに切断することができるので、これにより、複製/シグナル増幅カスケードが惹起されうる。
MNAzyme 2aがRIF分子を切断するたびに、新たなMNAzyme 2aの形成に必要なさらに多くの成分(アクチベータF2b組織化助長因子)が作出されうる。MNAzymeカスケードは、MNAzyme 2a触媒活性により生じた産物である成分を用いて、親のMNAzymeと同じMNAzyme 2a複合体の組織化を引き起こす。したがって、MNAzyme切断の産物(F2b)は、自己触媒的である自己複製系で新たな(親の) MNAzyme分子の組織化を指令することができる。
SCUD戦略をアプタ-MNAzyme系と結び付ければ、核酸標的(DNA/RNA)または他の標的分析物(タンパク質、小分子など)のいずれかによりSCUDを惹起することができよう。反応は標的分析物の存在下においてのみ惹起されるので、これは標的分析物の検出および/または同定のための技術になる。この方法は多成分核酸複合体の不活性状態と活性状態との間の移行に基づく。ポリメラーゼ連鎖反応またはリガーゼ連鎖反応のような、標的増幅技術とは異なり、SCUDによるMNAzymeの複製およびシグナル増幅では、プロセスを助長するのにタンパク質酵素が必要ない。さらに、安定化アーム成分または組織化助長因子成分などの、いくつかのオリゴヌクレオチド成分を用いてMNAzymeの触媒活性を制御および調節できることで、MNAzymeの組織化が微小環境における状態および成分によって厳重に調節されるようになる。
実施例5：アデノシン5’-三リン酸などの小分子を含む非核酸分析物の検出へのMNAzymeの適用
アプタマーは、高い親和性および特異性で標的分析物に結合するそれらの能力のため、ランダム配列オリゴヌクレオチドの大きなプールからインビトロで発生させた一本鎖DNAまたはRNA分子である。アプタマーは、タンパク質、炭水化物、脂質、ヌクレオチド、全細胞およびウイルスを含む多くのタイプの標的に特異的結合するそれらの能力のため、選択した。この実施例では、活性化因子リガンドが存在する場合にのみ活性アプタ-MNAzymeを形成する配座でパートザイムの末端にアプタマー配列(アプタ-パートザイム)を組み込んだ。この目的を達成する方法は、図7に図示する後続の実施例において使用する戦略を含めて、幾つかある。
この例示的なアプタ-MNAzyme検出戦略において含まれる核酸オリゴヌクレオチドは図7に図解されており、以下を含む：
（a) 標準的パートザイム;
（b) 末端の一方にアプタマーが組み入れられたパートザイムである、アプタ-パートザイム;
（c) 活性なMNAzymeの組織化を可能にするアプタ-パートザイムとパートザイムの両方に結合する、組織化助長因子;
（d) レポーター基質; および
（e) アプタマー配列の少なくとも一部分およびパートザイム配列の基質結合アームの一部分にまたがる領域においてアプタ-パートザイムにハイブリダイズする、組織化阻害因子オリゴヌクレオチド。
アクチベータリガンドが存在しない場合(図7、パネル(i))、組織化阻害因子オリゴヌクレオチドがアプタ-パートザイムに結合し、かくしてアプタ-パートザイムが基質に結合するのを阻止する。アクチベータリガンドが存在する場合(図7、パネル(ii))、アクチベータリガンドはアプタ-パートザイムのアプタマー配列と相互作用し、かくして、組織化阻害因子の結合を阻止し、活性なアプタ-MNAzymeが組織化し、その後、基質に結合し、基質を切断するのを可能にすることができる。したがって、アプタ-MNAzymeは、アクチベータリガンドの存在下においてのみ生じ、蛍光シグナルの発生を引き起こすことができる。
この戦略を小分子、ATPの検出により実証した。この実施例において使用した27ヌクレオチド長のアプタマー配列は、ATPおよびdATPの結合に対して高い特異性を示すと以前に報告されている(Achenbach, 2005, Huizenga and Szostak, 1995)。
5.1 パートザイムオリゴヌクレオチド、組織化助長因子および阻害オリゴヌクレオチド
この実施例では、ATPアプタマー配列をパートザイムの基質アームに接合して、アプタ-パートザイム分子を作出した(図7)。アプタ-パートザイムおよび標準的パートザイムのセンサーアームは、標的または調節性の分析物が存在する場合にMNAzymeの組織化を推進させるために反応中に含めた、合成による組織化助長因子に結合するように設計した。アプタ-パートザイムAtpA2/1およびパートザイムAtpB3/1の配列を以下に示す(5'から3'方向)。以下の配列において、太字の塩基は組織化助長因子とハイブリダイズし、下線を引いた塩基は組織化MNAzymeの触媒コアの一部を形成し、イタリック体の塩基は基質にハイブリダイズする。さらに、パートザイムAtpA2/1中の標準文字の塩基は、ATPまたはdATPに結合できるDNAアプタマー配列を示す。

SEQ ID NO: 12 アプタ-パートザイムA2 AtpA2/1:
Figure 2010505394
SEQ ID NO: 13 パートザイムB3 AtpB3/1:
Figure 2010505394
組織化助長因子の配列を以下に示す(5'から3'方向)

SEQ ID NO: 14 組織化助長因子AtpC/1:
Figure 2010505394
「組織化阻害因子」オリゴヌクレオチドの配列を以下に示す(5'から3'方向)。

SEQ ID NO: 15 組織化阻害因子AtpR/1:
Figure 2010505394
5.2.レポーター基質
二重標識核酸レポーター基質の切断により、アプタ-MNAzyme活性をモニターした。この実施例のためのレポーター基質は、下のとおりの配列、5’から3’を有するSubBi-1-FBである。下のケースの塩基はRNAを表し、上のケースの塩基はDNAを表す。下線を付けた塩基は、その5’末端の6-FAM部分およびその3’末端のBHQ1部分の位置を示す。490nm（FAM励起波長）での励起と共に、520nm（FAM放射波長）でFAMとBHQ1の間のリボヌクレオチドでのSubBi-1-FBの切断に起因する蛍光の変化をモニターした。

SEQ ID NO: 16 SubBi-1-FB：
Figure 2010505394
5.3.標的または調節性の分析物および対照分子
この実施例のための使用した活性化因子リガンド分子は、5’-三リン酸（ATP）およびデオキシアデノシン5’-三リン酸（dATP）であった。グアノシン5’-三リン酸（GTP）およびシトシン5’-三リン酸（CTP）を陰性対照分子として使用した。すべての分子をBiolineから購入した。ヌクレアーゼ不含水を分析物無し対照として使用した。
5.4.反応条件
触媒活性アプタ-MNAzymeによるレポーター基質の切断に起因する蛍光シグナルの増加により、活性化因子リガンドの存在を判断した。基質の添加により反応を開始させ、全反応の総容量は、50μLであった。基質を注入する前に、（二次構造を減少させるために）すべての反応物を60℃で5分間プレインキュベートした。反応は、FLUOstar OPTIMA（BMG Biotech）において47℃で行った。各反応の蛍光を、合計10分間、3秒ごとに読み取った。各反応は、200nM AtpA2/1、200nM AtpB3/1、200nM AtpC/1、200nM AtpR/1、200nM SubBi-1-FB、25mM MgCl2、50mM Tris HCl pH7.5、ならびにATP、またはdATP、またはGTP、またはCTPのいずれかの2mMまたは分析物無し（水対照）の最終濃度を含有した。
5.5 結果: SubBi-1-FBレポーター基質の検出および切断
ATPまたはdATPが存在しない場合、低レベルの蛍光を認め、これは経時的に増加しなかったことから、ATPが存在しない場合、組織化阻害因子が活性なアプタ-MNAzyme/基質複合体の組織化を阻止したことが実証された。ATPまたはdATPが存在する場合、蛍光シグナルはもっと高くなり、そのシグナルは経時的に増加した。これは、阻害因子オリゴヌクレオチドがdATPおよびATPにより取って代わられ、活性なアプタ-MNAzymeが形成されたことを示唆する。アプタ-MNAzymeの組織化はリガンド依存的であった。GTPまたはCTPが存在する場合、低レベルの蛍光を認め、これは経時的に増加しなかった。GTPまたはCTPの存在下において認めた蛍光は、ATPまたはdATPの非存在下において、すなわち、リガンド不含水の対照において認めたものと同様であった。この実施例は、標的分析物に対して高い特異性を示すアプローチにおける分析物検出用のアプタマーにMNAzymeをカップリングできることを実証している。この実施例はさらに、組織化阻害因子分子を用いてアプタ-MNAzymeの組織化を制御できること、およびこの系においてATPがアクチベータリガンドまたは分子調節因子として機能できることを実証している。
この戦略の設計は柔軟でありうることを、当業者なら認識するであろう。アプタマーは、部分的な触媒コア配列を含有する二つのパートザイムのどちらの片端(5'または3')に組み入れられてもよい。したがって、組織化阻害因子はアプタマー領域に結合し、かつ、基質アーム(基質を結合する)またはセンサーアーム(組織化助長因子を結合する)のいずれかに結合しうる。前者の設計の場合(図7およびこの実施例)、阻害因子は基質の結合を遮断する。後者の設計の場合、阻害因子はアプタ-パートザイムとの組織化助長因子の結合を阻止し、それゆえ、活性なMNAzymeの組織化を阻止しうる。
文献のなかには、多くのタイプの分析物を検出できる多数のアプタマーの配列が含まれている。これらにはタンパク質、炭水化物、脂質、プリオン、ヌクレオチド、全細胞およびウイルスが含まれる。これら全てのタイプの分析物に対するアプタマーをパートザイムに連結させて、非常に多様な分子を検出することができよう。アプタマー(またはアプタ-パートザイム)との分析物の結合ともMNAzymeによるレポーター基質の切断とも適合する反応条件(緩衝液、温度、二価陽イオン濃度など)は、実験に基づく試験によって決定することができる。
MNAzyme活性は組織化阻害因子の除去または添加によって調節することができる。オリゴヌクレオチド配列、融解温度およびまたは濃度を変化させることで、いっそうの微調節を達成することができる。MNA内での組織化阻害因子のハイブリダイゼーションは、塩濃度、陽イオン濃度、温度および添加物(例えばDMSO)の存在または非存在を含むが、これらに限定されない、多くの要因によって影響を受ける。したがって、ハイブリダイゼーションに影響を与える実体は、MNA複合体の組織化および非組織化を制御するためのツールとなりうる。
組織化助長因子、組織化阻害因子または他のMNA成分は、物理的操作により、例えば、分子「フック」としての付着部分の物理的特性を利用することにより、および/またはオリゴヌクレオチドの固有の特性、例えば、陰性荷電、もしくは配列相補性を利用することにより除去することができる。
実施例6: リガーゼ活性を有するDNAzymeおよび切断活性を有するMNAzymeを用いた、分子スイッチ
二つのDNA酵素の触媒活性を利用した分子スイッチを、図8に概略してある。第一の反応は、オリゴヌクレオチドを含有するRNAを2',3'-環状リン酸エステルおよび5'-ヒドロキシル産物に切断できるMNAzymeによって媒介される。第二の反応は、2',3'-環状リン酸エステルおよび5'-ヒドロキシル産物を連結できるDNAzymeリガーゼによって媒介される。そのようなDNAzymeの例は当技術分野において公知であり、例証として「7Z81」および「7Z48」リガーゼを含む(Prior et al, 2004)。
最も簡単な形式の場合、MNAzymeがオリゴ1/2を、切断産物オリゴ1およびオリゴ2に切断し、かくして2',3'-環状リン酸エステルおよび5'-ヒドロキシル産物を再生することができ、これらの産物はその後の連結ラウンドに加わることができる。次いでDNAzymeリガーゼは切断産物を、連結のための基質として使用することができる。DNAzymeは第一のオリゴヌクレオチド産物(オリゴ1)を第二のオリゴヌクレオチド産物(オリゴ2)に連結して、オリゴ1/2と同じ配列を有する連結産物を作出することができる。
多重形式の場合、MNAzymeがいくつかのオリゴヌクレオチド、例えば4つのオリゴヌクレオチドを、2',3'-環状リン酸エステルおよび5'-ヒドロキシル末端を有する産物に切断することができよう。これらは16種のDNAzymeリガーゼのセットによって新しい16種のユニークな連結産物(すなわち、オリゴヌクレオチド1、2、3および4の各組み合わせ)に連結されることができよう。
MNAzymeによる切断のための最低限の配列要件が満たされるならば、さらなるMNAzymeが、16種の連結産物オリゴの一つまたは複数を、オリゴヌクレオチド1、2、3および/または4間のオリジナルの接合部以外の部位で切断することができよう。例えば、例1のMNAzymeでは基質内の切断部位にプリン・ピリミジンリボヌクレオチドの存在が必要になる。
MNAzymeのセットが共通の組織化助長因子を用いてよくおよび/またはMNAzymeは前の連結ラウンド由来の連結産物をその組織化助長因子として用いてもよい。したがって、MNAzymeは、オリゴヌクレオチドの連結によって生じた新しい情報(入力)データを「読み込み」と認識することができる。次いでMNAzymeは「書き込み」を切断して、新しい出力産物および/または情報を生み出すことができる。MNAzymeが入力連結産物を読み込み、その後、出発分子のプール中のオリジナルのもの以外の、産物オリゴに切断できる系を用いて、新しい出力配列を再び書き込むまたは再びコードすることができる。
いくつかの態様において、DNAzymeによる連結は、例えば、新しい組織化助長因子、またはその成分を作出することにより、入力データを「書き込む」ことができる。MNAzymeは、パートザイム・センサーアームを用いて組織化助長因子内にコードされる情報を調べることにより、データを「読み込む」ことができる。その後、MNAzymeはデータ、例えば、新しい配列(切断産物)を「書き込み」、かくして新しい出力データを作出することができ、これをDNAzymeリガーゼが(DNAzymeリガーゼに対する基質として機能するためのMNAzyme切断産物の適合性を確認することにより)「読み込む」ことができる。
したがって、このMNAzyme/DNAzymeリガーゼカスケードは自動装置を形成することができる。そのような装置は明確な手続きにしたがい、一つの形態からの情報を別のものに変換することができる。この場合、手続きは、MNAzymeの基質アームおよび/またはセンサーアームならびにDNAzymeリガーゼによりコードされ、指令される。
計算の問題を解決可能とした自動装置がBenenson et al, 2001により、DNAおよびタンパク質酵素(制限エンドヌクレアーゼおよびリガーゼ)を用いて開発されている。カスケード反応において、制限エンドヌクレアーゼが二本鎖DNAを切断し、タンパク質リガーゼが切断産物を連結していた。タンパク質酵素が「ハードウェア」として機能し、DNAが「ソフトウェア」をコードしていた。適切なDNAソフトウェア配列の選択によって、入力データおよび自動装置をプログラミングしていた。この自動装置は制限エンドヌクレアーゼ切断、ハイブリダイゼーションおよび連結サイクルのカスケードを介して進行し、自動装置の最終状態、すなわち計算の結果をコードした検出可能な出力分子をもたらした(Benenson et al, 2001)。
MNAzyme/DNAzymeリガーゼカスケードはBenensonら(2001)によって使用されたカスケードと同じように使用され、かくして、計算の問題を解決できる装置となりうる。Benensonの装置とは異なり、MNAzyme/DNAzymeリガーゼカスケードでは、同じ結果を得るのにタンパク質酵素が必要ない。Benensonの装置は二本鎖DNAによってプログラミングされていたが、MNAzyme/DNAzymeリガーゼカスケードは、例えば、最初の入力オリゴヌクレオチド、MNAzymeの基質アームおよび/またはセンサーアームならびにDNAzymeリガーゼの基質アームを含め、さまざまな配列によってコードされうる。
別の態様において、分子ライブラリーを構築する、および/または分子ライブラリーの多様性を増大する方法として、MNAzyme/DNAzymeリガーゼカスケードを用いオリゴヌクレオチド配列を「組み替える」こともできよう。
一つの態様において、DNAzymeリガーゼを用いて、MNAzymeの成分およびまたは不活性なMNAを作出または破壊することができる。例証として、DNAリガーゼは「活性阻害因子」を「組織化助長因子成分」に付着し、MNAiの組織化(「オフ」状態)を引き起こすことができよう。あるいは、図11の局面(ii)および(iv)に図解されているように、DNAzymeリガーゼはセンサーアームまたは基質アームをパートザイム成分に付着し、組織化を促進することによってMNAzymeに対する「オン」スイッチを形成させてもよい。別の態様において、DNAzymeリガーゼは、例えばビオチン基を用いて、オリゴヌクレオチドが選択的に捕捉されることを可能にする部分で標識された配列を付着してもよく、またはその部分がラジオ波磁場を含有して、ハイブリダイゼーションの遠隔電子制御を助長してもよい。このアプローチは成分分子の選択的除去を可能にし、酵素活性の活性化または阻害を可能にすることができよう。例えば、活性阻害因子をMNAi複合体から選択的に変性させ、活性なMNAzyme状態への移行を可能にすることができる。
いくつかの態様において、DNAzymeによる連結は、例えば、新しい組織化助長因子、またはその成分を作出することにより、入力データを「書き込む」ことができる。MNAzymeは、パートザイム・センサーアームを用いて組織化助長因子内にコードされる情報を調べることにより、データを「読み込む」ことができる。その後、MNAzymeはデータ、例えば、新しい配列(切断産物)を「書き込み」、かくして新しい出力データを作出することができ、これをさらなるDNAzymeリガーゼが基質として機能するためのMNAzyme切断産物の適合性を確認することにより「読み込む」ことができる。
実施例7: MNAzymeおよびMNAi分子スイッチの一つの例示的な構造
活性なMNAzymeの形成に必要な組織化助長因子は、二つまたはそれ以上の成分オリゴヌクレオチドを含むことができる。活性阻害因子オリゴヌクレオチドの存在または非存在は、MNAi構造の形成を促進することができる。そのようなMNAzymeおよびMNAiには多くの設計があることを当業者なら認識するであろう。活性なMNAzyme構造のいくつかの例を図9に示す(パネルA〜D; 左側の構造)。MNAi構造の例を図9に示す(パネルA〜D; 活性なMNAzymeの右側の構造)。この実施例は、図9パネルBの構造c (MNAzyme)およびd (MNAi)に図解されている構造を実証する。
この実験で用いたMNAzymeはパートザイムRO5A4/2および5FAC2B5(6)/2(16)で構成された。これらは、組織化助長因子1 (FAC2)および組織化助長因子2 (d6p-1)という二つのオリゴヌクレオチドによって指令される組織化の後にレポーター基質SubBi-2-FBを切断するように設計されている。この実験は、活性阻害因子を含む複合体の形成によってMNAi複合体が生じることも示す。
7.1 パートザイムオリゴヌクレオチド
以下の配列において、太字の塩基は標的核酸(または組織化助長因子)配列とハイブリダイズし、下線を引いた塩基は組織化MNAzymeの触媒コアの一部を形成し、イタリック体の塩基は基質にハイブリダイズする。

SEQ ID NO: 17 パートザイムA RO5A4/2:
Figure 2010505394
SEQ ID NO: 18 パートザイムB 5FAC2B5(6)/2(16):
Figure 2010505394
7.2 レポーター基質
この実施例のためのレポーター基質は、5'から3'方向に、以下の配列を有するSubBi-2-FBであった。SubBi-2-FBは、6-FAM部分により5'末端で、BHQ1部分により3'末端で末端標識された。485 nm (FAM励起波長)で励起し、530 nm (FAM放射波長)でSubBi-2-FBの切断をモニターした。小文字の塩基はRNAを表し、大文字の塩基はDNAを表す。

SEQ ID NO: 4 SubBi-2-FB:
Figure 2010505394
7.3 助長因子および活性阻害因子オリゴヌクレオチド
使用した組織化助長因子の配列を以下に5'から3'方向に記す。小文字の塩基はRNAを表し、大文字の塩基はDNAを表す。組織化助長因子2と活性阻害因子との間の共通の配列が太字である。
活性阻害因子SubBi-6-TRBは、Texas Red部分により5'末端で、BHQ2部分により3'末端で末端標識された。

SEQ ID NO: 19 組織化助長因子2 (F2) d6p-1: ATCACGCCTCg
SEQ ID NO: 20 組織化助長因子1 (F1) FAC2:
Figure 2010505394
SEQ ID NO: 21 活性阻害因子SubBi-6-TRB:
Figure 2010505394
7.4 反応成分およびMNAzyme活性のモニタリング
MNAzyme活性の実時間モニタリングをSmartCycler (Cepheid)にて総反応容量25 μL中で実施した。反応を30分間52℃で等温的にモニターした。反応混合物の中に蛍光基質SubBi-2-FB (1 μMの溶液5 μl)を注入することにより、反応を開始した。反応混合物には1×PCR緩衝液II (Applied Biosystems)、50 mM MgCl2、200 nMの各パートザイムRO5A4/2および5FAC2B5(6)/2(16)、200 nMの助長因子FAC2ならびに200 nMの組織化助長因子2 (d6p-1)または200 nMの活性阻害因子(SubBi-6-TRB)のいずれかが含有された。
7.5 結果:
この実施例では、組織化助長因子は二つのオリゴヌクレオチド成分で構成される。図9は、MNA、すなわち活性なMNAzyme (パネルB構造c)およびMNAi (パネルB構造d)によって形成される構造の略図を示す。MNAzymeは組織化のために、二つの組織化助長因子(F1およびF2)ならびに二つのパートザイムを必要とする。あるいは、活性阻害因子(I)がパートザイムに結合し、MNAi構造を形成しうる。
この実験では、パートザイムならびに二つの組織化助長因子F1およびF2のインキュベーションによって活性なMNAzymeの形成が起こり、これがレポーター基質を切断し、およそ500単位(400単位から900単位へ)の経時的な蛍光の増加を引き起こした。対照的に、パートザイムと一つの組織化助長因子(F1)および一つの活性阻害因子(I)とのインキュベーションによってMNAi構造の形成が起こり、これはレポーター基質を切断することができなかった。結果として、ベースラインがおよそ20単位(390単位から410単位へ)変動し、経時的に、低いレベルでしか蛍光バックグラウンドの増加を認めなかった。組織化助長因子(F2)および活性阻害因子(I)は、共通配列を含有するため、パートザイムの同じ領域に結合する。しかしながら、活性阻害因子にはあるが、組織化助長因子F2にはない付加的な阻害配列によって、MNAi構造の形成が起こる。活性阻害因子からこの付加的な阻害配列を除去することで、アクチベータ組織化助長因子F2の誘発を引き起こすことができる。したがって阻害配列の付加または除去は、活性なMNAzymeからMNAiにまたはその逆にスイッチングするための機序となる。
実施例8: MNAzymeおよびMNAi分子スイッチ
活性なMNAzymeの形成に必要な組織化助長因子は、二つまたはそれ以上の成分オリゴヌクレオチドを含むことができる。活性阻害因子オリゴヌクレオチドの存在または非存在は、MNAi構造の形成を促進することができる。そのようなMNAzymeおよびMNAi複合体には多くの設計があることを当業者なら認識するであろう。活性なMNAzyme構造の例を図9に示す(パネルA〜D; 左側の構造)。MNAi構造の例を図9に示す(パネルA〜D; 活性なMNAzymeの右側の構造)。この実施例は、図9パネルCの構造e (MNAzyme)およびf (MNAi)に図解されている構造を実証する。
この実験において作出されたMNAzymeは、二つのパートザイム(FACA4/6(22)および5FAC2B5(2)/6(33))ならびに三つの組織化助長因子成分、つまり助長因子1 (F1)および助長因子2 (F2)および助長因子3 (F3)から組織化された。この実験は、活性阻害因子(SubBi-2-FB)ならびに助長因子1 (F1)および(F3)を含む複合体の形成によってMNAi複合体が生じうることも示す。
8.1 パートザイムオリゴヌクレオチド
以下の配列において、太字の塩基は標的核酸(または組織化助長因子)配列とハイブリダイズし、下線を引いた塩基は組織化MNAzymeの触媒コアの一部を形成し、イタリック体の塩基は基質にハイブリダイズする。

SEQ ID NO: 22 パートザイムA FACA4/6(22):
Figure 2010505394
SEQ ID NO: 23 パートザイムB 5FAC2B5(2)/6(33):
Figure 2010505394
8.2 レポーター基質
この実施例のためのレポーター基質は、5'から3'方向に、以下の配列を有するSubBi-6-TRBであった。SubBi-6-TRBは、Texas Red部分により5'末端で、BHQ2部分により3'末端で末端標識された。585 nm (Texas Red励起波長)で励起し、610 nm (Texas Red放射波長)でSubBi-6-TRBの切断をモニターした。小文字の塩基はRNAを表し、大文字の塩基はDNAを表す。

SEQ ID NO: 21 SubBi-6-TRB:
Figure 2010505394
8.3 助長因子および活性阻害因子オリゴヌクレオチド
使用した組織化助長因子の配列を以下に5'から3'方向に記す。組織化助長因子F2と活性阻害因子との間の共通の配列が太字である。小文字の塩基はRNAを表し、大文字の塩基はDNAを表す。活性阻害因子SubBi-2-FBは、6-FAM部分により5'末端で、BHQ1部分により3'末端で末端標識された。

SEQ ID NO: 24 組織化助長因子F1 STAB:
Figure 2010505394
SEQ ID NO: 25 組織化助長因子F2 d2p-1:
Figure 2010505394
SEQ ID NO: 4 活性阻害因子SubBi-2-FB:
Figure 2010505394
SEQ ID NO: 20 組織化助長因子F3 FAC2:
Figure 2010505394
8.4 反応成分およびMNAzyme活性のモニタリング
MNAzyme活性の実時間モニタリングをSmartCycler (Cepheid)にて総反応容量25 μL中で実施した。反応を30分間52℃で等温的にモニターした。反応混合物の中に蛍光基質SubBi-6-TRB (1 μMの溶液5 μl)を注入することにより、反応を開始した。反応混合物には1×PCR緩衝液II (Applied Biosystems)、50 mM MgCl2、200 nMの各パートザイムFACA4/6(22)および5FAC2B5(2)/6(33)、200 nMの助長因子F1 STAB、200 nMの助長因子F3 FAC2ならびに200 nMの組織化助長因子F2 (d2p-1)または200 nMの活性阻害因子(SubBi-2-FB)のいずれかが含有された。
8.5 結果:
この実施例では、組織化助長因子は三つのオリゴヌクレオチド成分で構成される。図9は、MNA複合体、すなわち活性なMNAzyme (パネルC構造e)およびMNAi (パネルC構造f)によって形成される構造の略図を示す。MNAzymeは触媒的に活性な複合体の組織化のために、三つの組織化助長因子成分(F1、F2およびF3)ならびに二つのパートザイムを必要とする。あるいは、活性阻害因子(I)がパートザイムに結合し、MNAi構造を形成しうる。
この実験では、パートザイムならびに三つの組織化助長因子成分F1、F2およびF3のインキュベーションによって活性なMNAzymeの形成が起こり、これがレポーター基質を切断し、およそ330単位(140単位から470単位へ)の経時的な蛍光の増加を引き起こした。対照的に、パートザイムと二つの組織化助長因子(F1およびF3)ならびに一つの活性阻害因子(I)とのインキュベーションによってMNAi構造の形成が起こり、これはレポーター基質を切断することができなかった。結果として、ベースラインがおよそ40単位(80単位から120単位へ)変動し、経時的に、低いレベルでしか蛍光バックグラウンドの増加を認めなかった。組織化助長因子成分(F2)および活性阻害因子は、共通配列を含有するため、パートザイムの同じ領域に結合する。しかしながら、活性阻害因子にはあるが、組織化助長因子成分F2にはない付加的な阻害配列によって、MNAi構造の形成が起こる。活性阻害因子からこの付加的な阻害配列を除去することで、アクチベータ組織化助長因子F2成分の誘発を引き起こすことができる。したがって、阻害配列の付加または除去は活性なMNAzymeからMNAiにまたはその逆にスイッチングするための機序となる。
実施例9: 別のMNAzymeおよびMNAi分子スイッチ
活性なMNAzymeの形成に必要な組織化助長因子は、二つまたはそれ以上の成分オリゴヌクレオチドを含むことができる。活性阻害因子オリゴヌクレオチドの存在または非存在は、MNAi構造の形成を促進することができる。そのようなMNAzymeおよびMNAi複合体には多くの設計があることを当業者なら認識するであろう。活性なMNAzyme構造の例を図9に示す(パネルA〜D; 左側の構造)。MNAi構造の例を図9に示す(パネルA〜D; 活性なMNAzymeの右側の構造)。この実施例は、図9パネルDの構造g (MNAzyme)およびh (MNAi)に図解されている構造を実証する。
この実験におけるMNAzymeは、二つの組織化助長因子成分F1およびF2の存在下において組織化し、かつ、レポーター基質SubBi-2-FBを切断するように設計されているパートザイムで構成された。パートザイムの一つ(4SYNTB6/2(8))のセンサーアームは8塩基にトランケートされている。もう一つのオリゴヌクレオチド、つまり安定化アームsA (B6/tag(13))は、トランケートされたパートザイム(4SYNTB6/2(8))センサーアームに隣接した状態で組織化助長因子F1にハイブリダイズし、かくしてMNAzyme複合体を安定化する。組織化助長因子は二つの成分F1およびF2を有する。
9.1 パートザイムオリゴヌクレオチド
以下の配列において、太字の塩基は標的核酸(または組織化助長因子)配列とハイブリダイズし、下線を引いた塩基は組織化MNAzymeの触媒コアの一部を形成し、イタリック体の塩基は基質にハイブリダイズする。

SEQ ID NO: 26 パートザイムA 4SYNTA5/2(22):
Figure 2010505394
SEQ ID NO: 27 パートザイムB 4SYNTB6/2(8):
Figure 2010505394
9.2 レポーター基質
この実施例のためのレポーター基質は、5'から3'方向に、以下の配列を有するSubBi-2-FBであった。SubBi-2-FBは、6-FAM部分により5'末端で、BHQ1部分により3'末端で末端標識された。485 nm (FAM励起波長)で励起し、530 nm (FAM放射波長)でSubBi-2-FBの切断をモニターした。小文字の塩基はRNAを表し、大文字の塩基はDNAを表す。

SEQ ID NO: 4 SubBi-2-FB:
Figure 2010505394
9.3 助長因子、活性阻害因子および安定化アーム・オリゴヌクレオチド
使用した組織化助長因子成分の配列を以下に5'から3'方向に記す。小文字の塩基はRNAを表し、大文字の塩基はDNAを表す。組織化助長因子1と活性阻害因子との間の共通の配列が太字である。

SEQ ID NO: 28 組織化助長因子F2 (RO5/cA(18)):
Figure 2010505394
SEQ ID NO: 29 組織化助長因子F1 (r2p-SYNT/cB(25):
Figure 2010505394
SEQ ID NO: 30 活性阻害因子(2-SYNT/cB(25)):
Figure 2010505394
SEQ ID NO: 31 安定化アームsA (B6/tag(13)):
Figure 2010505394
9.4 反応成分およびMNAzyme活性のモニタリング
MNAzyme活性の実時間モニタリングをBMG LabTech FluoStar蛍光光度計にて総反応容量50 μl中で実施した。反応を3分間40℃で等温的にモニターした。反応混合物の中に蛍光基質SubBi-2-FB (1 μMの溶液10 μl)を注入することにより、反応を開始した。反応混合物には1×PCR緩衝液II (Applied Biosystems)、25 mM MgCl2、200 nMの各パートザイム4SYNTA5/2(22)および4SYNTB6/2(8)、200 nMの安定化アームB6/tag(13)、200 nMの助長因子F2 RO5/cA(18)ならびに200 nMの組織化助長因子F1 (r2p-SYNT/cB(25))または活性阻害因子(2-SYNT/cB(25))のいずれかが含有された。
9.5 結果:
この実施例では、組織化助長因子は二つのオリゴヌクレオチド成分で構成される。図9は、MNA、すなわち活性なMNAzyme (パネルD構造g)およびMNAi (パネルD構造h)によって形成される構造の略図を示す。MNAzymeは触媒的に活性な複合体の組織化のために、二つの組織化助長因子成分(F1およびF2)、二つのパートザイムならびに一つの安定化アームを必要とする。あるいは、活性阻害因子(I)がパートザイムに結合し、MNAi構造を形成しうる。
この実験では、二つのパートザイム、二つの組織化助長因子成分F1およびF2ならびに一つの安定化アームのインキュベーションによって活性なMNAzymeの形成が起こり、これがレポーター基質を切断し、およそ28,000単位(12,000単位から40,000単位へ)の経時的な蛍光の増加を引き起こした。対照的に、パートザイムと一つの組織化助長因子(F2)、一つの安定化アームおよび一つの活性阻害因子(I)とのインキュベーションによってMNAi構造の形成が起こり、これはレポーター基質を切断することができなかった。ベースラインがおよそ1,500単位(12,000単位から13,500単位へ)変動し、経時的に、低いレベルでしか蛍光バックグラウンドの増加を認めなかった。組織化助長因子成分(F1)および活性阻害因子(I)は、共通配列を含有するため、パートザイムおよび安定化アームの同じ領域に結合する。しかしながら、活性阻害因子にはあるが、組織化助長因子成分F1にはない付加的な阻害配列によって、MNAi構造の形成が起こる。活性阻害因子からこの付加的な阻害配列を除去することで、アクチベータ組織化助長因子F1成分の誘発を引き起こすことができる。したがって、阻害配列の付加または除去は活性なMNAzymeからMNAiにまたはその逆にスイッチングするための機序となる。
実施例10: SCUDカスケード
標的分析物の検出用に設計されたMNAzyme複製カスケードを作出するための機序の一つでは、SCUDカスケード戦略を用いる。例証として、カスケード反応に、二つのMNA複合体が組み入れられる図6の場合に; 三つのMNA複合体が組み入れられる図10の場合に; およびMNA複合体もDNAzymeもともに組み入れられる図11の場合に図示される通り、さまざまな設計のカスケードの中にSCUD戦略を組み入れることができる。
SCUD法は、混合物中に存在する成分オリゴヌクレオチドからの活性なMNAzymeおよびMNAiの組織化を制御する能力に依る。SCUDカスケードの例示的なスキーマの一つを図10に図解する。この戦略では、開始MNAzyme (Mt)は標的(T)の存在下において形成される。この開始MNAzymeが基質(S1)を切断し、かくしてカスケーディングMNAzyme 1 (Mc1)の形成に必要なアクチベータ組織化助長因子成分の一つ(S1f)を作出する。次いでMNAzyme 1が基質(S2)を切断し、かくしてカスケーディングMNAzyme 2 (Mc2)の形成に必要なさらなるアクチベータ組織化助長因子成分を作出する。次いでMNAzyme 2が基質(S1)を切断し、かくしてカスケード反応を開始する。
以下の実験例では、標的の存在下において基質(S1)を二つの断片に切断する開始MNAzyme (Mt)の能力を実証する。これは、開始MNAzyme (Mt)がS1基質を断片に切断でき、この断片の一つ(S1f)がアクチベータ組織化助長因子成分として機能でき、その成分は他の二つの助長因子成分(F1およびF2)と一緒にMNAzyme Mc1を形成でき、これが第二の基質(S2)を切断可能であることをさらに実証する。
この実験において開始MNAzyme MtはパートザイムRO5A5/2-PおよびRO5B6/2-Pで構成された。これらは、ヒトRPLPO遺伝子の一部分(RO5標的)を検出し、かつ、S1基質SubBi-2h-FBを切断するように設計されている。SubBi-2h-FBの切断断片(S1f)は、F1およびF2組織化助長因子成分FAC5およびFAC6とともに、パートザイムCasA4(2h)/6およびCasB5(2h)/6を含むMc1カスケーディングMNAzyme 1のセンサーアームに結合する。基質SubBi-6-TRBを切断するように、完全に組織化された活性なカスケーディングMNAzyme 1を設計した。
10.1 パートザイムオリゴヌクレオチド
以下の配列において、太字の塩基は標的核酸(または組織化助長因子)配列とハイブリダイズし、下線を引いた塩基は組織化MNAzymeの触媒コアの一部を形成し、イタリック体の塩基は基質にハイブリダイズする。「-P」はオリゴヌクレオチドの3'リン酸化を示す。

SEQ ID NO: 51 パートザイムA RO5A5/2-P:
Figure 2010505394
SEQ ID NO: 32 パートザイムB RO5B6/2-P:
Figure 2010505394
SEQ ID NO: 33 パートザイムA CasA4(2h)/6:
Figure 2010505394
SEQ ID NO: 34 パートザイムB CasB5(2h)/6:
Figure 2010505394
10.2 レポーター基質
この実施例のためのS1およびS2レポーター基質は、5'から3'方向に、以下の配列を有するSubBi-2h-FBおよびSubBi-6-TRBであった。SubBi-2h-FBは、6-FAM部分により5'末端で末端標識され、BHQ1部分により3'末端で内部標識された。SubBi-6-TRBは、Texas Red部分により5'末端で、BHQ2部分により3'末端で末端標識された。下線を引いた塩基はフルオロフォアの位置を示す。485 nm (FAM励起波長)で励起し、530 nm (FAM放射波長)でSubBi-2h-FBの切断をモニターした。585 nm (Texas Red励起波長)で励起し、610 nm (Texas Red放射波長)でSubBi-6-TRBの切断をモニターした。小文字の塩基はRNAを表し、大文字の塩基はDNAを表す。

SEQ ID NO: 35 SubBi-2h-FB:
Figure 2010505394
SEQ ID NO: 21 SubBi-6-TRB:
Figure 2010505394
10.3 助長因子オリゴヌクレオチド
パートザイムCasA4(2h)/6およびCasB5(2h)/6のセンサーアームにハイブリダイズさせる組織化助長因子成分として、二つの分子をこの実施例において使用した。F1およびF2組織化助長因子FAC5およびFAC6の配列を以下に5'から3'方向に記す。

SEQ ID NO: 36 組織化助長因子F1 FAC5:
Figure 2010505394
SEQ ID NO: 37 組織化助長因子F2 FAC6:
Figure 2010505394
10.4 標的配列
この実施例のための標的配列は、5'から3'方向に、以下の配列を有する合成オリゴヌクレオチドRO5標的であった。この標的配列はヒトRPLPO遺伝子の一部分、つまり第5エキソンと同じ配列を有する。

SEQ ID NO: 38 RO5標的:
Figure 2010505394
10.5 反応成分およびMNAzyme活性のモニタリング
MNAzyme活性の実時間モニタリングをSmartCycler (Cepheid)にて総反応容量25 μL中で実施した。反応を12分間50℃で等温的にモニターした。反応混合物の中に蛍光基質SubBi-2h-FBおよびSubBi-6-TRB (各0.5 μMの終濃度にするため各基質の2.5 μM溶液5 μl)を注入することにより、反応を開始した。反応混合物には1×PCR緩衝液II (Applied Biosystems)、25 mM MgCl2、500 nMの各パートザイムRO5A5/2-P、RO5B6/2-P、CasA4(2h)/6およびCasB5(2h)/6、500 nMの各助長因子成分FAC5およびFAC6ならびに100 nMのRO5標的または標的なし(H2O)の対照のいずれかが含有された。
10.6 結果:
RO5標的配列が存在する場合、パートザイムRO5A5/2-PおよびRO5B6/2-Pは開始MNAzyme Mtを形成し、これがS1基質SubBi-2h-FBを切断し、およそ1250単位(1200単位から2450単位へ)のFAM蛍光の増加を引き起こした。切断されたS1基質はS1f助長因子断片の生成をもたらし、その断片がF1およびF2助長因子成分FAC5およびFAC6ならびにパートザイムCasA4(2h)/6およびCasB5(2h)/6と協調して機能し、Mc1カスケーディングMNAzyme 1を形成した。次いで、このMNAzyme 1が第二のS2基質SubBi-6-TRBを切断し、かくしておよそ900単位(250単位から1150単位へ)のTexas Red蛍光の増加を引き起こした。したがって、FAMとTexas Redの両方の蛍光の増加は、このMNAzymeカスケード反応の中に標的配列が存在することを示す。
RO5標的配列が存在しない場合、経時的に、FAM蛍光の増加を認めず、Texas Redの場合ベースラインがおよそ100単位(240単位から340単位へ)変動し、経時的に、低いレベルでしか蛍光バックグラウンドの増加を認めなかった。標的が存在しない場合、パートザイムRO5A5/2-PおよびRO5B6/2-Pは開始MNAzyme Mtを形成することができず、ゆえにS1基質SubBi-2h-FBが切断されず、FAM蛍光が増加しない。切断されたS1基質が存在しない場合には、Mc1カスケーディングMNAzyme 1の形成を指令するS1f助長因子断片が存在しない。未切断のS1基質SubBi-2h-FBは、助長因子FAC5およびFAC6ならびにパートザイムCasA4(2h)/6およびCasB5(2h)/6を含む複合体に依然として結合できるが、これによっては、S2基質SubBi-6-TRBを切断できないMNAi構造が生じる。その結果、Texas Redの蛍光のレベルは低いままである。FAMとTexas Redの両方の蛍光の有意な増加がないことは、このMNAzymeカスケード反応の中に標的配列が存在しないことを示す。
実施例11: 開始MNAzymeによる事象に続いてSCUDフィードバックカスケードによる増幅、次いでDNAzymeリガーゼ媒介性のMNAzymeによる切断の読み出しを用いた標的の検出
この実施例において使用した戦略を図11に図解する。この実施例では、図中の区分(i)〜(iv)に図解の戦略の局面を実証する。
(i) 標的核酸(F1)はMNAzyme 1aの形成を指令し、このMNAzyme 1aが基質Aを切断し、二つの切断産物、つまり連結反応(区分ii)における成分として必要な産物Aaおよび区分(iii)に示した局面におけるアクチベータ組織化助長因子として必要な第二の産物Abを生成する。
(ii) 産物Aaはその3'末端に2',3'-環状リン酸エステルを有し、すなわち、リガーゼ活性を有するDNAzyme 2aの基質として機能するのに適している。DNAzymeリガーゼ2aは、区分(i)の局面において生成された産物Aaを別のオリゴヌクレオチド連結基質Bに連結し、かくしてMNAzyme 4aのための新たなパートザイムを作出する。
(iii) 産物Abは、パートザイム成分からの活性なMNAzyme 3aの形成を指令するアクチベータ組織化助長因子として機能する。MNAzyme 3aは基質Aを切断し、二つの産物AaおよびAbを作出する。次いで、産物Abがアクチベータ組織化助長因子として機能し、これによって、さらに活性なMNAzyme 3aの形成が指令されうる。このMNAzyme 3a系はSCUDによる自己触媒的な自己複製フィードバック増幅カスケードをもたらす。このSCUDカスケードはAbのさらなる蓄積を引き起こし、これがMNAzyme 3aのためのアクチベータ組織化助長因子として機能し、Aaの蓄積時には、DNAzyme 2aの基質として機能しうる。
(iv) Aaおよび基質Bの連結によって生じた連結産物は、MNAzyme 4aのための新たな、連結されたパートザイムを形成する。MNAzyme 4aが助長因子F4とともに生じ、基質Cをフルオロフォアとクエンチャ色素の対との間で切断し、標的核酸F1の存在を示す蛍光シグナルの増加をもたらす。
この実施例において局面(i)、(ii)および(iii)は、単一の試験管中にて単一の温度で同時に行われた。読み出し検出段階(局面iv)は、反応へのさらなる試薬の添加後に実施した。この実施例において使用したDNAzymeリガーゼは、2',3'-環状リン酸エステルおよび5'-ヒドロキシル基から2'-5'ホスホジエステル結合の形成を通じてRNAを連結すると以前に報告されている(Silverman et al)。2',3'-環状リン酸エステル末端を有する5'基質の要件は別として、この実施例において使用したDNAzymeリガーゼは連結接合部に、UA＊G(AまたはG) (ここで＊は連結部位を示す)である特異的な配列モチーフも必要とする。
11.1 DNAzymeリガーゼB
DNAzymeリガーゼとして作用するDNAオリゴヌクレオチド配列を、以下に記載する。

SEQ ID NO 39: DNAzymeリガーゼ7Z81-10/10:
Figure 2010505394
11.2 パートザイムオリゴヌクレオチド
以下の配列において、太字の塩基は標的核酸配列とハイブリダイズし、下線を引いた塩基は組織化MNAzymeの触媒コアの一部を形成し、イタリック体の塩基は基質にハイブリダイズする。
以下は、MNAzyme 1aの成分を形成するパートザイムの配列である。

SEQ ID NO: 40 パートザイムA miR20A2/1:
Figure 2010505394
SEQ ID NO: 41 パートザイムB miR20B3/1:
Figure 2010505394
以下の配列は、連結産物/パートザイムと結び付いてMNAzyme 4aの成分を形成するパートザイムに相当する。

SEQ ID NO: 42 パートザイムB STB5/2(21):
Figure 2010505394
以下は、SCUD MNAzyme 3aの成分を形成するパートザイムの配列である。

SEQ ID NO: 43 パートザイムA 4SYNTA2/1i-10HP:
Figure 2010505394
SEQ ID NO: 44 パートザイムB 4SYNTB3/1i-12HP:
Figure 2010505394
11.3 MNAzyme基質A (MNAzyme 1aおよび3aの基質)
以下の配列において、小文字の塩基はRNAを表し、大文字の塩基はDNAを表す。

SEQ ID NO: 45 preSub5:
Figure 2010505394
11.4 DNAzymeリガーゼ基質B
以下の配列において、小文字の塩基はRNAを表し、大文字の塩基はDNAを表す。以下の配列および5'ヒドロキシル基を有するように3' DNAzymeリガーゼ基質を合成した。

SEQ ID NO: 46 preSub3:
Figure 2010505394
11.5 MNAzyme基質C (MNAzyme 4aの蛍光レポーター基質)
この実施例において使用したレポーター基質はSubBi-2であった。本実施例において、SubBi-2を6-FAM部分により5'末端で、BHQ1部分により3'末端で末端標識し、SubBi-2-FBと名付けた。490 nm (FAM励起波長)で励起し、520 nm (FAM放射波長)でSubBi-2-FBの切断をモニターした。SubBi-2-FBの配列を以下に記載する(5'から3'方向); 小文字の塩基はRNAを表し、大文字の塩基はDNAを表す。

SEQ ID NO: 4 SubBi-2-FB:
Figure 2010505394
11.6 MNAzyme 1aの標的配列F1
MNAzyme 1aにより認識される標的配列は、ヒトミクロRNA miR-20 RNA配列に相同な合成DNAオリゴヌクレオチドであった。これは以下の配列を有した。

SEQ ID NO: 47 D-20標的 (MNAzyme 1a標的):
Figure 2010505394
11.7 MNAzyme 4aの組織化助長因子
MNAzyme 4aの形成に必要な組織化助長因子F4は、以下の配列を有する合成DNAオリゴヌクレオチドであった。

SEQ ID NO: 48 MNAzyme 4aの組織化助長因子F4
Figure 2010505394
11.8 反応条件
全ての反応は下記のように、単一のSmartCycler(登録商標) SmartCap試験管(Cepheid)の中で実施した。MNAzyme 1a切断、DNAzyme 2a連結およびSCUD MNAzyme 3aカスケード増幅(それぞれ、局面(i)、(ii)および(iii))は、SmartCycler(登録商標)サーマルサイクラーシステム(Cepheid)にて2時間40℃の等温インキュベーションを介し、初めの単一反応容量15 μl中で同時に実施した。反応物には200 nM preSub5、100 nM preSub3、100 nMのDNAzymeリガーゼ7Z81-10/10、MNAzyme 1aのためのパートザイム(50 nM miR20A2/1および300 nM miR20B3/1)、20 nMの、MNAzyme 3aのためのパートザイム(パートザイムA 4SYNTA2/1i-10HPおよびパートザイムB 4SYNTB3/1i-12HP)、150 mM NaCl、2 mM KCl、50 mM Tris HCl (25℃でpH 9.0)および50 mM MgCl2ならびに100 nMのD-20標的もしくは100 pMのD-20標的もしくは100 fMのD-20標的、または標的なし(dH2Oのみの対照)のいずれかが含有された。
対照の反応物はSCUD MNAzyme 3aパートザイム成分を含まず、したがって局面(i)、(ii)および(iv)しか起こさなかった。これらの反応物には200 nM preSub5、100 nM preSub3、100 nMのDNAzymeリガーゼ7Z81-10/10、MNAzyme 1aのためのパートザイム(50 nM miR20A2/1および300 nM miR20B3/1)、150 mM NaCl、2 mM KCl、50 mM Tris HCl (25℃でpH 9.0)および50 mM MgCl2ならびに100 nMのD-20標的もしくは100 pMのD-20標的もしくは100 fMのD-20標的、または標的なし(dH2Oのみの対照)のいずれかが含有された。
SCUDおよび対照反応物のインキュベーションの後、検出試薬のアリコート10 μlをSmartCap System試験管に添加して、総反応容量25 μl中300 nMのパートザイムSTB5/2(21)、100 nMの、MNAzyme 4aのための組織化助長因子F4、150 mM NaCl、2 mM KCl、50 mM Tris HCl (25℃でpH 9.0)、50 mM MgCl2および100 nMの基質SubBi-2-FBの終濃度を得た。反応物を55℃から80℃(80秒間55℃、20秒間80℃)に90サイクル、熱サイクル処理(thermocycle)し、SmartCycler(登録商標) (Cepheid)にて55℃で蛍光をモニターした。
MNAzyme基質C (SubBi-2-FB)の切断による蛍光の増加をSCUDおよび対照反応物に対して経時的にモニターした。蛍光の閾値レベルを蛍光100単位に設定し、閾値蛍光レベルを得るための各反応の時間を測定した。
11.9 結果
最初の等温相(対照反応に対する局面(i)および(ii)ならびにSCUD増幅カスケードを含む反応に対する局面(i)、(ii)および(iii)を含む)に続く、熱サイクル処理相(局面(iv))の間に蛍光を測定した。SCUDカスケード成分および100 nMの標的を含有する反応では、1サイクルの範囲内で閾値蛍光に達し、反応は10サイクルでプラトーに達した(表4)。SCUDカスケード成分および100 pMの標的を含有する反応では、19回目のサイクルで閾値蛍光に達し、反応は80サイクル後も依然としてプラトーに達していなかった。SCUDカスケード成分および100 fMの標的を含有する反応では、18サイクルで閾値蛍光に達し、反応は80サイクル後も依然としてプラトーに達していなかった。
対照的に、SCUDカスケード成分を含有するが、しかし標的を欠く反応では80サイクルの熱サイクル処理の後に閾値に達することができなかった。したがって、閾値蛍光の達成はこれらの反応における標的核酸の存在を示すものであった。
(表４) 閾値蛍光に達する時間
Figure 2010505394
SCUDカスケード成分を欠くが、しかし100 nMの標的を含有した対照反応では、1サイクルの範囲内で閾値蛍光に達し、反応は34サイクルでプラトーに達した(表4)。100 pMの標的を含有する対照反応では、59サイクルで閾値蛍光に達し、反応は80サイクル後も依然としてプラトーに達していなかった。100 fMの標的を含有する対照反応では、80サイクル後も閾値蛍光に達しなかった。同様に、標的を欠いた対照反応では、80サイクルの後に閾値に達することができなかった。したがって、閾値蛍光の達成はこれらの反応における標的核酸の存在を示すものであった。上記の所見は、局面(i)、(ii)、(iii)および(iv) (図11)の全成分を含有する反応における以下の酵素増幅段階と一致する。第一に、MNAzyme 1aはF1特異的な標的(D-20)の存在下において基質Aを切断し、二つの断片(AaおよびAb)を作出する(局面(i))。Aa断片は、2',3'-環状リン酸エステル末端を持った5'断片
Figure 2010505394
であった。第二に、Ab産物はアクチベータ組織化助長因子成分として機能し、これによって活性なMNAzyme 3aの形成が指令される。MNAzyme 3aは基質Aを切断し、二つの産物AaおよびAbを作出する。次いで、産物Abは助長因子として機能することができ、これによって、さらに多くの活性なMNAzyme 3aの形成が指令される。かくして、MNAzyme 3a系はSCUDによる自己触媒的な自己複製フィードバック増幅カスケードをもたらす(局面(iii))。このSCUDカスケードはまた、Aaのさらなる蓄積を引き起こし、これがDNAzyme 2aの基質として機能しうる。第三に、5'断片Aaは、反応混合物中に存在する第二のリガーゼ基質Bに連結し、これによって
Figure 2010505394
(ここで大文字はDNA塩基を表し、小文字はRNA塩基を表す)の配列を有する新たなオリゴヌクレオチド(連結産物Aa/B)の形成が起こる(局面(ii))。この連結産物が今度は、MNAzyme 4aのためのパートザイム成分として機能する。最後に、この新たに作出されたパートザイムが第二のパートザイム(STB5/2(21))およびF4組織化助長因子と結び付いて、MNAzyme 4aを作出する(局面(iv))。次いで、MNAzyme 4aはMNAzyme基質C (SubBi-2-FB)を切断し、フルオロフォアおよびクエンチャ色素の対の分離をもたらし、かくして蛍光の増加を引き起こす。
局面(i)、(ii)および(iv) (図11)の成分のみを含有する対照反応では、上記の所見は以下の事象と一致する。第一に、MNAzyme 1aはF1特異的な標的(D-20)の存在下においてMNAzyme基質Aを切断し、二つの断片(AaおよびAb)を作出する(局面(i))。Aa断片は、2',3'-環状リン酸エステル末端を持った5'断片
Figure 2010505394
である。5'断片Aaは、反応混合物中に存在する第二のリガーゼ基質Bに連結し、これによって新たなオリゴヌクレオチド(連結産物(Aa/B) (局面(ii))の形成が起こる。この連結産物が今度は、MNAzyme 4aのためのパートザイム成分として機能する。最後に、この新たに作出されたパートザイムが第二のパートザイム(STB5/2(21))およびF4組織化助長因子と結び付いて、MNAzyme 4aを作出する(局面(iv))。次いで、MNAzyme 4aはMNAzyme基質C (SubBi-2-FB)を切断し、フルオロフォア・クエンチャ色素の対の分離をもたらし、かくして蛍光の増加を引き起こす。
標的を欠いた反応は、SCUD MNAzyme成分を含んだまたは欠いた反応での蛍光シグナルの発生が標的核酸の存在に依っていたことを示す。SCUD MNAzyme成分を含んだ、しかし標的を欠いた反応では、助長因子断片Abが形成されず、ゆえに完全な基質AがMNAzyme 3aのためのパートザイムに結合し、MNAi複合体を形成した。図9は、SCUD MNA複合体によって形成される構造、すなわち活性なMNAzyme 3a (パネルA構造a)およびMNAi (パネルA構造b)の略図を示す。MNAzymeは組織化助長因子(図9中のパネルA構造a内のF1)、または基質の切断によって生成されうるアクチベータ組織化助長因子(図11局面(iii)中のAb)を必要とする。図9パネルA構造bに示すように、完全な基質はMNAi構造に結合し、活性阻害因子(I)として機能しうる。この実験においてMNAzyme 3aを作出するために使用したパートザイムは、パートザイム双方の末端に自己相補性の領域を有するセンサーアームを持っていた。組織化阻害因子は相補性領域間の領域において結合する(図9パネルA構造aおよび図11 (iii) MNAzyme 3a)。
SCUD MNAzyme成分を含んだまたは欠いた反応の検出限界の比較から、SCUD成分の存在がシグナルの増幅をもたらし、これによってさらに少量の標的の検出が可能になることが実証される。SCUD MNAzyme 3aパートザイム成分を欠いた反応では、分子1×109個の検出限界を有した(100 pMの出発濃度)。それに対し、SCUD成分を含んだ反応では分子1×106個を検出することができた(100 fMの出発濃度)。さらに、閾値を超えるシグナルが、MNAzyme 3aのためのSCUDパートザイム成分を欠いた反応の場合の59サイクルに比べSCUD成分を含有する反応では19サイクルの後、分子1×109個に対し検出された。したがって、開始MNAzyme (1a)とともにSCUD成分(MNAzyme 3aのためのパートザイム)が存在することで、アクチベータ組織化助長因子成分Abが作出され、かくして、検出の時間も検出の限界もともに引き下げることが可能になった。この機序は、各SCUD MNAzyme 3aがさらに多くのMNAzyme 3aのためのさらに多くの助長因子を作出し、シグナル増幅の機序をもたらすフィードバックに依っている(局面(iii)図11)。このSCUDシグナル増幅法は、核酸酵素の触媒活性だけに依り、かつ、PCRのような他の核酸標的増幅法において用いられるものなどのタンパク質酵素に依らない機序によってシグナル増幅を可能にする。さらに、SCUD増幅は、試薬を40℃でインキュベートした実験の第一段階の間に、等温的に行われた。結論として、SCUDは自己触媒的な自己複製能があり、等温条件の下でシグナル増幅を引き起こす。SCUDは、タンパク質酵素を要しない形式にて検出の感度および速度の増大を可能にする。
実施例12: MNA複合体を用いた全加算器
MNAzymeを含むMNA複合体を利用して、分子全加算器を開発することができる。MNAzymeに基づく全加算器をいかにして構築できるかの一つの例示的な設計スキーマを図12に示す。
全加算器は以下の表、表5にしたがい、入力を3つのチャネル(A、B、C)で受け取り、入力に基づいて出力を2つのチャネル(X、Y)に生じる。
（表５）
Figure 2010505394
明確にするため、表中の空のセルによって消失(または「オフ」)シグナルを示す。要約すれば、出力Xは正確に1つのまたは3つ全ての入力のいずれかのある場合にオンであり、出力Yは2つまたは3つの入力のある場合にオンである。全加算器は、通常、入力および出力として電気シグナルを用い回路論理により実行されるのに対し、この系は生物学的過程を用い、検出可能な事象によって入力を表し、検出可能な事象または検出可能な影響のいずれかによって出力を表し、実行されうる。
表から分かるように、空白の場合(入力なし)に加え、入力の組み合わせは7通りが可能である。これらのうち3つは、正確に1つの入力がある(論理NANDNANDによって表される)場合であり、3つは2つの入力がある(論理ANDによって表される)場合であり、1つは3つ全ての入力がある(論理ANDANDによって表される)場合である。
図12に描いた一つの系では、試験管に加えられる入力の、どの組み合わせでも、期待される結果(例えば、蛍光)を生み出す単一の試験管で用いるようにこれらの7つの論理ゲートが設計されている。ゲートは反応容器への添加の前に全て別々に構築される。図12では、黒色のオリゴヌクレオチドは、ゲートがプールされる前に予め複合体化されており、かつ、実際のゲートを含み、青色および緑色の基質は、異なるフルオロフォアが付着された基質を表し、かつ、2つの出力シグナルを含み、FAC(「助長因子」)分子は入力を構成する。それぞれのゲートのパートザイムは、レポーターアームもセンサーアームもともに同じ基質およびFACまたはCオリゴヌクレオチドを結合する場合を除き、ユニークな配列でそれぞれ構成されよう。これらの場合には、図12に示したANDゲート2および3のBパートザイム、NANDNANDゲート2および3のBパートザイム、ならびにNANDNANDゲート1およびANDANDゲートのBパートザイムなど、同じパートザイムを2つの別個のゲートの構築に用いることができる。FAC1およびFAC2オリゴヌクレオチドは組織化助長因子として作用し、FAC3はアームスタビライザーとして作用するが、しかしこのスキーマにおいて、全てのFACオリゴヌクレオチドが同じ目的で用いられており、それは論理ゲートを活性化/不活性化することである。「C」オリゴヌクレオチド(C1、C2、C3)はその対応するFACオリゴヌクレオチドに相補的であり、パートザイムと予め複合体化されている。FACは、反応容器に加えられると、分枝点移動(branch migration)過程を介してその相補的なCオリゴヌクレオチドを剥離し、相補Cオリゴヌクレオチドを含んだゲートを不活性化しうる。この過程は、分枝点移動が開始されうる遊離配列を供与するために、Cオリゴヌクレオチドおよびその対応するFACオリゴヌクレオチドを伸長することによって可能になる。
この設計により、いずれか1つおよびただ1つのFACの添加では第一の蛍光色(この実施例では、図12に示すように「青色」蛍光)をもたらし、2つのFACのいずれかの組み合わせでは第二の蛍光色(図12中の「緑色」蛍光)を生じ、3つ全てのFACが反応容器に導入される場合には、両方の蛍光色(図12中の「青色」および「緑色」)を生じうる。
図12を参照して、以下の説明をする。例えば、FAC分子が存在しないなら、各複合体が活性となるのに必要な全ての成分が利用できるとは限らないので、全ての複合体は不活性のままであろう。蛍光は認められないであろう。
例えば、FAC1だけが入力であるなら:
● FAC1は、予め複合体化されたパートザイム、C2およびC3オリゴヌクレオチドならびに基質と結合する場合に図12中の1番目のNANDNANDゲートを活性化し、青色蛍光を生ずる。これは同様に、2番目および3番目のNANDNANDゲートのC1オリゴヌクレオチドを剥離するが、これらはいずれにしても、活性なMNAzymeを形成するのにFAC2およびFAC3が利用可能でないため不活性である。
● FAC1だけが利用可能である場合、ANDANDおよびANDゲートは、活性化を可能とするのに他のFAC分子を必要とするので、活性ではない。
例えば、FAC1およびFAC2が入力であるなら、以下が起こるであろう:
● 図12の3番目のANDゲートは、活性なMNAzymeを形成するのにともに必要なオリゴヌクレオチドが利用可能であるので活性であり、緑色蛍光を生ずる。
● 図12の他の2つのANDゲートは、FAC3を必要とするので、活性化されないであろう。
● ANDANDゲートは、必要なFAC分子の2つしか利用可能ではないので、活性ではないであろう。
● FAC1およびFAC2は、それぞれ、図12の1番目および2番目のNANDNANDゲートの複合体に利用可能である。しかしながら、FAC1は図12の2番目のNANDNANDゲートにおけるその相補的なC1オリゴヌクレオチドを剥離し、したがって、それは活性ではないであろう。FAC2は図12の1番目のNANDNANDゲートにおけるその相補的なC2オリゴヌクレオチドを剥離し、したがって、それは活性ではないであろう。3番目のNANDNANDゲートは、FAC3を必要とするので(かつC1およびC2は同様に、それぞれ、FAC1およびFAC2によって剥離されうるので)、活性ではない。
● したがっていずれのゲートからも青色蛍光は認められない。
● 関連のあるANDゲートだけが緑色蛍光をもたらす。
例えば、3つ全てのFACオリゴヌクレオチドが存在するなら:
● ANDゲート、およびANDANDゲートが活性化され、それぞれ、緑色および青色の蛍光を生ずる。
● NANDNANDゲートは、「C」オリゴヌクレオチドがその各FACオリゴヌクレオチドにより剥離されうるという事実によって、活性化されないであろう。
当業者なら、そのようなスキーマを同様に、FACオリゴヌクレオチドのその他任意の組み合わせに適用できることを認識するであろう。
ある全加算器からの出力を別の全加算器のインプットとして使用できることを当業者なら理解するであろう。
参考文献
特許および特許公報
PCT国際公開番号WO99/45146
PCT国際公開番号WO99/50452
米国特許第6,140,055号
米国特許第6,201,113号
米国特許第6,365,724号
その他の参考文献
Figure 2010505394
Figure 2010505394
Figure 2010505394
Figure 2010505394

Claims (116)

  1. 触媒コア部分、センサーアーム部分および基質アーム部分のうち少なくとも一つ、ならびに組織化助長因子（assembly facilitator）オリゴヌクレオチド、基質オリゴヌクレオチド、活性阻害因子および組織化阻害因子またはそれらの任意の組み合わせを含む群から選択される少なくとも一つのさらなるオリゴヌクレオチド成分を含む少なくとも一つのオリゴヌクレオチドパートザイム（oligonucleotide partzyme）を含む、分子スイッチであって、多成分核酸（MNA）複合体を形成することができる分子スイッチ。
  2. 分解された複合体、部分的に組織化した複合体、完全に組織化したMNAzyme、または完全に組織化した触媒的に不活性なMNA複合体を含む、請求項1記載のスイッチ。
  3. MNAiを含む、請求項1または2記載のスイッチ。
  4. 活性阻害因子が、前記オリゴヌクレオチドの少なくとも一つに対して実質的に非相補的なヌクレオチド配列を含む、請求項1記載のスイッチ。
  5. パートザイムセンサーアーム、パートザイム基質アーム、組織化助長因子オリゴヌクレオチドおよび基質オリゴヌクレオチドのうち一つまたは複数が、少なくとも二つの分子を含む、請求項1〜4のいずれか一項記載のスイッチ。
  6. パートザイムセンサーアーム、パートザイム基質アーム、組織化助長因子オリゴヌクレオチド、基質オリゴヌクレオチド、活性阻害因子または組織化阻害因子のうち一つまたは複数が、少なくとも一つの自己相補性領域を含む、請求項1〜5のいずれか一項記載のスイッチ。
  7. パートザイムセンサーアーム、パートザイム基質アーム、組織化助長因子オリゴヌクレオチドまたは基質オリゴヌクレオチドのうち一つまたは複数が、少なくとも一つのアプタマーおよび少なくとも一つの組織化阻害因子をさらに含む、請求項1または2記載のスイッチ。
  8. その少なくとも一つの成分を、入力事象に対する複合体の感度が増大もしくは低下するように、および/または出力シグナルの強度が変化するように適合させることができる、請求項1〜7のいずれか一項記載のスイッチ。
  9. 活性阻害因子が、組織化助長因子ドメイン、活性阻害因子ドメイン、レポータードメイン、基質ドメイン、またはそれらの任意の組み合わせのうち少なくとも一つを含む、請求項1〜6のいずれか一項記載のスイッチ。
  10. 少なくとも一つの安定化アームをさらに含む、請求項1〜9のいずれか一項記載のスイッチ。
  11. その少なくとも一つの成分が核酸を含む、請求項1〜10のいずれか一項記載のスイッチ。
  12. その少なくとも一つの成分が、少なくとも一つのナノ粒子、ミクロ粒子、またはそれらの組み合わせをさらに含む、請求項1〜11のいずれか一項記載のスイッチ。
  13. 分子スイッチとしてのMNA複合体の使用であって、該複合体が入力事象に応答して不活性MNA複合体から活性MNA複合体に遷移する、使用。
  14. 不活性複合体が、分解された複合体、部分的に組織化した複合体、または完全に組織化した触媒的に不活性なMNA複合体を含む、請求項13記載の使用。
  15. 不活性複合体が組織化阻害因子を含む、請求項14記載の使用。
  16. 触媒的に不活性なMNA複合体がMNAiである、請求項14記載の使用。
  17. MNAiが、活性阻害因子ドメイン、活性化因子組織化助長因子ドメイン、レポータードメイン、基質ドメイン、またはそれらの任意の組み合わせのうち少なくとも一つを含む活性阻害因子を含む、請求項16記載の使用。
  18. 活性MNAzymeへの遷移が、MNAiからの少なくとも活性阻害因子または活性阻害因子ドメインの置き換え（displacement）を含む、請求項16または17記載の使用。
  19. 置き換えが、活性阻害因子ドメインと活性化因子組織化助長因子ドメインとを連結している切断可能な基質の切断を伴う、請求項18記載の使用。
  20. 入力事象が、阻害因子の除去またはその阻害機能の不活性化である、請求項13記載の使用。
  21. 入力事象が、触媒的に活性なMNAzymeの組織化を結果的にもたらす、請求項13記載の使用。
  22. 入力事象が、（i）外因性の供給（provision）によってもたらされるか、または（ii）MNA複合体の環境内での反応の産物である、活性化因子の供給を含む、請求項13記載の使用。
  23. 分子スイッチとしてのMNA複合体の使用であって、該複合体が入力事象に応答して活性MNA複合体から不活性MNA複合体に遷移する、使用。
  24. 活性複合体がMNAzymeである、請求項23記載の使用。
  25. 不活性MNA複合体への遷移が、活性MNA複合体の分解に伴うものである、請求項23記載の使用。
  26. 不活性MNA複合体への遷移が、不活性MNA複合体の組織化に伴うものである、請求項23記載の使用。
  27. 入力事象が、阻害因子の添加またはその阻害機能の活性化である、請求項23記載の使用。
  28. 入力事象が阻害因子の結合である、請求項23記載の使用。
  29. 阻害因子が組織化阻害因子である、請求項28記載の使用。
  30. 阻害因子が活性阻害因子または活性阻害因子ドメインである、請求項28記載の使用。
  31. 不活性MNA複合体がMNAiである、請求項23記載の使用。
  32. 活性阻害因子または組織化阻害因子が、（i）外因性の供給によってもたらされるか、または（ii）MNA複合体の環境内での反応の産物である、請求項27〜30のいずれか一項記載の使用。
  33. 遷移が出力シグナルの変化を結果的にもたらす、請求項13〜32のいずれか一項記載の使用。
  34. 入力事象が、温度、塩濃度、イオン強度、pH、二価陽イオンの有無、種類もしくは濃度、電荷、磁荷の変化、物理的操作、およびMNAもしくはモジュレーター成分もしくは微小環境の成分の濃度の変化、またはそれらの任意の組み合わせを含む群から選択される、請求項13〜32のいずれか一項記載の使用。
  35. 出力シグナルの変化が、以前には存在していなかったシグナルの出現、以前に存在していたシグナルの消失、または出力シグナルの増加もしくは減少である、請求項33記載の使用。
  36. 出力シグナルが基質の修飾の程度に依存し、該修飾が、切断、連結、ポルフィリンメタル化（prophyrin metallation）、炭素-炭素結合、エステル結合もしくはアミド結合の形成、またはそれらの任意の組み合わせを含む群から選択される、請求項33記載の使用。
  37. 出力シグナルが、蛍光分光法、表面プラズモン共鳴、質量分析法、NMR、電子スピン共鳴、偏光蛍光分光法、円二色性、イムノアッセイ、クロマトグラフィー、放射分析、光度計測法、シンチグラフィー、電子工学的方法、UV、可視光もしくは赤外分光法、酵素的方法、またはそれらの任意の組み合わせによって決定される、請求項33記載の使用。
  38. 決定が、出力シグナルを定量化することが可能な様式で行われる、請求項37記載の使用。
  39. 入力事象の大きさが、定量化された出力シグナルから決定される、請求項38記載の使用。
  40. 入力事象または出力シグナルの一方または両方が増幅される、請求項33記載の使用。
  41. 出力シグナル増幅がシグナルカスケードによる、請求項40記載の使用。
  42. 二つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチド成分、および少なくとも一つの活性阻害因子分子を含む、MNAi。
  43. 少なくとも一つの組織化助長因子をさらに含む、請求項42記載のMNAi。
  44. 活性阻害因子が、活性化因子組織化助長因子ドメイン、活性阻害因子ドメイン、レポータードメイン、基質ドメイン、またはそれらの任意の組み合わせのうち少なくとも一つを含む、請求項42または43記載のMNAi。
  45. 活性阻害因子ドメイン、活性化因子組織化助長因子ドメインおよびレポータードメインのうち少なくとも二つが、活性阻害因子の別個のドメイン上に位置する、請求項44記載のMNAi。
  46. 活性阻害因子ドメイン、活性化因子組織化助長因子ドメインおよびレポータードメインのうち少なくとも二つが、不安定なリンカーまたは切断可能な基質によって連結されている、請求項44または45記載のMNAi。
  47. 基質が、活性化因子組織化助長因子ドメイン、活性阻害因子ドメイン、レポータードメイン、またはそれらの任意の組み合わせのうち少なくとも一つを含む、請求項42〜46のいずれか一項記載のMNAi。
  48. 活性阻害因子が、二つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチド成分のうち少なくとも一つに対して実質的に非相補的なヌクレオチド配列を含む、請求項42〜47のいずれか一項記載のMNAi。
  49. 組織化助長因子が標的である、請求項43記載のMNAi。
  50. 標的が、DNA、メチル化DNA、アルキル化DNA、RNA、メチル化RNA、マイクロRNA、siRNA、shRNA、tRNA、mRNA、snoRNA、stRNA、smRNA、プレ-マイクロRNAおよびプリ-マイクロRNA、他の非コーディングRNA、リボソームRNA、それらの誘導体、アンプリコン、またはそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される核酸である、請求項49記載のMNAi。
  51. MNAiの少なくとも一つの成分がアプタマーをさらに含む、請求項42または43記載のMNAi。
  52. 少なくとも二つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチド成分を含むMNAi組成物であって、少なくとも第一のオリゴヌクレオチド成分および第二のオリゴヌクレオチド成分が少なくとも一つのMNA複合体活性阻害因子の存在下で自己組織化することができ、少なくとも該第一および該第二のオリゴヌクレオチド成分のそれぞれが基質アーム部分、触媒コア部分およびセンサーアーム部分を含み；自己組織化が起こると、該第一および第二のオリゴヌクレオチド成分のセンサーアーム部分がセンサーアームとして作用し、第一および第二のオリゴヌクレオチド成分の基質アーム部分が基質アームとして作用し、かつ第一および第二のオリゴヌクレオチド成分の触媒コア部分が非機能性触媒コアを形成し；かつ
    自己組織化が起こると、少なくとも一つのセンサーアームが前記活性阻害因子と相互作用し、かつ前記第一および第二のオリゴヌクレオチド成分がその各々の触媒コア部分の会合のために近傍に維持されて、非機能性触媒コアを形成する、MNAi組成物。
  53. 少なくとも一つの組織化助長因子をさらに含む、請求項52記載のMNAi組成物。
  54. 活性阻害因子が、活性化因子組織化助長因子ドメイン、活性阻害因子ドメイン、レポータードメイン、基質ドメイン、またはそれらの任意の組み合わせのうち少なくとも一つを含む、請求項52記載のMNAi組成物。
  55. 活性阻害因子ドメイン、活性化因子組織化助長因子ドメインおよびレポータードメインのうち少なくとも二つが、活性阻害因子の別個のドメイン上に位置する、請求項54記載のMNAi組成物。
  56. 活性阻害因子ドメイン、活性化因子組織化助長因子ドメインおよびレポータードメインのうち少なくとも二つが、不安定なリンカーまたは切断可能な基質によって連結されている、請求項54または55記載のMNAi組成物。
  57. 活性阻害因子が基質である、請求項52記載のMNAi組成物。
  58. 活性阻害因子が、二つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチド成分のうち少なくとも一つに対して実質的に非相補的なヌクレオチド配列を含む、請求項52記載のMNAi組成物。
  59. 複合体の少なくとも一つの成分が少なくとも一つのアプタマーまたはその部分を含み、該アプタマーまたはその部分が、核酸、タンパク質、糖タンパク質、脂質、リポタンパク質、細胞、ウイルス、細菌、古細菌、真菌、抗体、代謝産物、病原体、毒素、汚染物質、毒物、小分子、ポリマー、金属イオン、金属塩、プリオン、またはそれらの任意の誘導体、部分もしくは組み合わせを含む群から選択されるリガンドと結合する、請求項52記載のMNAi組成物。
  60. 第一のMNAzyme、実質的に触媒的に不活性な形態で最初は存在するMNA複合体（MNAi）、該第一のMNAzymeによって修飾されて検出可能な影響をもたらしうる活性阻害因子を含むシグナルカスケードを用いる、組織化助長因子の検出のための方法であって、該活性阻害因子が活性阻害因子および潜在的基質の両方であり；かつ
    前記第一のMNAzymeの触媒活性が可能な条件下での、前記組織化助長因子と該第一のMNAzymeに対するパートザイムとの会合が、該第一のMNAzymeの触媒活性を助長し、それによって前記活性阻害因子の修飾をもたらして、活性化因子組織化助長因子ドメインおよび該活性阻害因子の活性阻害因子ドメインを放出させ、該放出が前記検出可能な影響をもたらし；かつ
    前記放出された活性化因子組織化助長因子ドメインが、前記MNA複合体の成分からの第二のMNAzymeの組織化を助長し；かつ
    前記第二のMNAzymeの触媒活性が前記活性阻害因子を修飾して、さらなる活性阻害因子ドメインおよびさらなる活性化因子組織化助長因子ドメインを放出させ、該放出がさらなる検出可能な影響をもたらし；かつ
    前記のさらなる活性化因子組織化助長因子ドメインが追加の第二のMNAzymeの組織化を助長し、それによってさらなる触媒的に活性な第二のMNAzymeをもたらし、それによって該組織化助長因子の存在を示すさらなる検出可能な影響をもたらす、
    検出方法。
  61. 活性阻害因子がレポーター-阻害因子-助長因子である、請求項60記載の方法。
  62. 活性阻害因子、第一のMNAzymeまたは第二のMNA複合体成分のうち一つまたは複数が、不溶性支持体に結び付けられる、請求項60または61記載の方法。
  63. 活性阻害因子、第一のMNAzymeまたは第二のMNA複合体成分のうち一つまたは複数が溶液中に遊離している、請求項60〜62のいずれか一項記載の方法。
  64. 活性阻害因子が、組織化助長因子ドメイン、活性阻害因子ドメイン、レポータードメイン、基質ドメイン、またはそれらの任意の組み合わせのうち少なくとも一つを含む、請求項60〜63のいずれか一項記載の方法。
  65. 活性阻害因子が検出可能な部分およびクエンチャーを含み、第一のまたは第二のMNAzymeによる該活性阻害因子の修飾が起こると、該検出可能な部分によってもたらされる検出可能な影響が増加または減少する、請求項60〜64のいずれか一項記載の方法。
  66. 検出可能な影響が、蛍光分光法、表面プラズモン共鳴、質量分析法、NMR、電子スピン共鳴、偏光蛍光分光法、円二色性、イムノアッセイ、クロマトグラフィー、放射分析、光度計測法、シンチグラフィー、電子工学的方法、UV、可視光もしくは赤外分光法、酵素的方法、またはそれらの任意の組み合わせによって検出される、請求項60記載の方法。
  67. 検出可能な影響が測定され、該測定の大きさが組織化助長因子の量を示す、請求項65または66記載の方法。
  68. 組織化助長因子が標的である、請求項60記載の方法。
  69. 標的が、DNA、メチル化DNA、アルキル化DNA、RNA、メチル化RNA、マイクロRNA、siRNA、shRNA、tRNA、mRNA、snoRNA、stRNA、smRNA、プレ-マイクロRNAおよびプリ-マイクロRNA、他の非コーディングRNA、リボソームRNA、それらの誘導体、アンプリコン、またはそれらの任意の組み合わせを含む群から選択される核酸である、請求項68記載の方法。
  70. 第一のMNAzymeおよび/または第二のMNA複合体の成分のうち少なくとも一つがアプタマーをさらに含む方法であって、該アプタマーと結合するリガンドの検出をもたらす、請求項60記載の方法。
  71. リガンドが、タンパク質、ポリペプチド、ペプチドまたは核酸、糖タンパク質、脂質、リポタンパク質、細胞、ウイルス、細菌、古細菌、真菌、抗体、代謝産物、病原体、毒素、汚染物質、毒物、生物体全体、小分子、ポリマー、金属イオン、金属塩、プリオン、またはそれらの任意の誘導体、部分もしくは組み合わせを含む、請求項70記載の方法。
  72. 組織化助長因子が、入力事象として作用する合成オリゴヌクレオチドである、請求項60記載の方法。
  73. 触媒的に活性なMNAzymeの組織化が、温度、塩濃度、イオン強度、pH、二価陽イオンの有無、種類もしくは濃度、電荷、磁荷の変化、物理的操作、およびMNAもしくはモジュレーター成分もしくは微小環境の成分の濃度の変化、またはそれらの任意の組み合わせを含む群から選択される入力事象によって調節される、請求項60記載の方法。
  74. 標的の存在下で形成される開始MNAzyme；該開始MNAzymeの産物の存在下で形成される第一のMNAzyme；該第一のMNAzymeの産物の存在下で形成される追加のMNAzymeを含むカスケードを用いて標的を検出する方法であって、以下の段階：
    （i）第一の基質を該開始MNAzymeにより修飾して第一の組織化助長因子を生成させる段階；
    （ii）前記第一のMNAzymeを前記第一の組織化助長因子により組織化させる段階；
    （iii）追加の基質を前記第一のMNAzymeにより修飾して追加の組織化助長因子を生成させる段階；
    （iv）前記追加のMNAzymeを前記追加の組織化助長因子により組織化させる段階；
    （v）前記第一の基質を前記追加のMNAzymeにより修飾して前記第一の組織化助長因子を生成させる段階；
    （vi）前記第一のMNAzymeを（v）から放出された前記第一の組織化助長因子により組織化させ、それによって増幅カスケードを形成させる段階
    を含む方法であり；かつ
    前記第一のまたは前記追加の基質のうち少なくとも一つの前記修飾が、前記標的の存在を示す検出可能な影響を生じさせる、方法。
  75. 第一のまたは追加の組織化助長因子の一方または両方が、活性化因子組織化助長因子である、請求項74記載の方法。
  76. 第一の基質が第一のMNAzymeの活性阻害因子である、請求項74記載の方法。
  77. 増幅カスケードがフィードバック増幅カスケードである、請求項74記載の方法。
  78. 追加の基質が、追加のMNAzymeに対する活性阻害因子である、請求項74記載の方法。
  79. 第一および/または追加のMNAzymeが、少なくとも一つの組織化助長因子の存在下で触媒的に活性となる二つのパートザイムを含む、請求項74記載の方法。
  80. 第一および/または追加のMNAzymeが、少なくとも二つの組織化助長因子成分の存在下で触媒的に活性となる二つのパートザイムを含む、請求項74記載の方法。
  81. 第一および/または追加のMNAzymeが、三つまたはそれ以上の組織化助長因子成分の存在下で触媒的に活性となる二つのパートザイムを含む、請求項74記載の方法。
  82. 標的が、検出、同定または定量化しようとする組織化助長因子分子である、請求項74記載の方法。
  83. 標的が核酸を含む、請求項74記載の方法。
  84. 核酸が、DNA、メチル化DNA、アルキル化DNA、RNA、メチル化RNA、マイクロRNA、siRNA、shRNA、tRNA、mRNA、snoRNA、stRNA、smRNA、プレ-マイクロRNAおよびプリ-マイクロRNA、他の非コーディングRNA、リボソームRNA、それらの誘導体、アンプリコン、またはそれらの任意の組み合わせを含む群から選択される、請求項83記載の方法。
  85. 核酸の供給源が、合成、哺乳動物、ヒト、動物性、植物、真菌、細菌、ウイルス、古細菌、またはそれらの任意の組み合わせを含む群から選択される、請求項84記載の方法。
  86. MNAzymeの少なくとも一つが少なくとも一つのアプタマーをさらに含む、請求項74記載の方法。
  87. アプタマーが少なくとも一つのリガンドと結合する、請求項86記載の方法。
  88. リガンドが、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、核酸、糖タンパク質、脂質、リポタンパク質、細胞、ウイルス、細菌、古細菌、真菌、抗体、代謝産物、病原体、毒素、汚染物質、毒物、生物体全体、小分子、ポリマー、金属イオン、金属塩、プリオン、またはそれらの任意の誘導体、部分もしくは組み合わせを含む群から選択される、請求項87記載の方法。
  89. MNAzymeまたは基質の少なくとも一つの成分が、不溶性支持体に結び付けられているか、または溶液中に遊離している、請求項74〜88のいずれか一項記載の方法。
  90. 一つまたは複数の基質が検出可能な部分およびクエンチャー部分を含み、MNAzymeの少なくとも一つによる基質の修飾が起こると、該検出可能な部分によって検出可能な影響がもたらされる、請求項74記載の方法。
  91. 検出可能な影響が、蛍光分光法、表面プラズモン共鳴、質量分析法、NMR、電子スピン共鳴、偏光蛍光分光法、円二色性、イムノアッセイ、クロマトグラフィー、放射分析、光度計測法、シンチグラフィー、電子工学的方法、UV、可視光もしくは赤外分光法、酵素的方法、またはそれらの任意の組み合わせのうち少なくとも一つによって検出される、請求項90記載の方法。
  92. 検出可能な影響が測定され、該測定の大きさが標的の量を示す、請求項90または91記載の方法。
  93. 第一のMNAzymeに対するパートザイム、第一の基質、第二のMNAzymeに対するパートザイム、DNAzymeリガーゼ、第二の基質、追加のMNAzymeに対する追加のパートザイムおよび組織化助長因子、ならびに追加の基質を含むシグナル増幅カスケードを用いて標的を検出するための方法であって、以下の段階を含む方法：
    （i）検出しようとする標的分子の存在下で、第一のMNAzymeに対する前記パートザイムから前記第一のMNAzymeを形成させる段階；
    （ii）前記第一の基質を前記第一のMNAzymeで切断して、複数の切断産物を生成させる段階；
    （iii）前記切断産物の少なくとも一つを前記DNAzymeリガーゼによって前記第二の基質と連結させて、前記追加のMNAzymeに対する連結されたパートザイムを作り出す段階；
    （iv）前記切断産物の少なくとも一つによる組織化によって、第二のMNAzymeに対する該パートザイムから前記第二のMNAzymeを形成させる段階；
    （v）前記第一の基質を前記第二のMNAzymeで切断して、さらなる前記複数の切断産物を生成させる段階；
    （vi）さらなる前記複数の切断産物の少なくとも一つによる組織化によってさらなる前記第二のMNAzymeを形成させる段階であって、それによるさらなる該第二のMNAzymeの組織化が、さらなる該複数の切断産物の蓄積を結果的にもたらす増幅カスケードを形成し、さらなる該複数の切断産物の少なくとも一つが前記DNAzymeリガーゼに対する基質として作用する段階；
    （vii）前記組織化助長因子と一緒に、前記追加のパートザイムを用いて、および前記連結されたパートザイムを用いて、前記追加のMNAzymeを形成させる段階；
    （viii）前記追加の基質を前記追加のMNAzymeにより修飾して、前記標的の存在を示す検出可能な影響を結果的にもたらす段階。
  94. 増幅カスケードがフィードバック増幅カスケードである、請求項93記載の方法。
  95. 第二の基質と連結された切断産物が、その3'末端に2',3'-環状リン酸を有する、請求項93記載の方法。
  96. 切断産物の少なくとも一つが活性化因子組織化助長因子である、請求項93記載の方法。
  97. 標的が、検出、同定または定量化しようとする分子である、請求項93記載の方法。
  98. 標的が核酸を含む、請求項97記載の方法。
  99. 核酸が、DNA、メチル化DNA、アルキル化DNA、RNA、メチル化RNA、マイクロRNA、siRNA、shRNA、tRNA、mRNA、snoRNA、stRNA、smRNA、プレ-マイクロRNAおよびプリ-マイクロRNA、他の非コーディングRNA、リボソームRNA、それらの誘導体、アンプリコン、またはそれらの任意の組み合わせを含む群から選択される、請求項98記載の方法。
  100. 核酸の供給源が、合成、哺乳動物、ヒト、動物、植物、真菌、細菌、ウイルス、古細菌、またはそれらの任意の組み合わせを含む群から選択される、請求項99記載の方法。
  101. 第一のMNAzymeに対するパートザイム、第一の基質、第二のMNAzymeに対するパートザイム、DNAzymeリガーゼ、第二の基質、追加のパートザイム、追加のMNAzymeに対する組織化助長因子および追加の基質のうち少なくとも一つが、少なくとも一つのアプタマーをさらに含む、請求項93記載の方法。
  102. アプタマーが少なくとも一つのリガンドと結合する、請求項101記載の方法。
  103. リガンドが、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、核酸、糖タンパク質、脂質、リポタンパク質、細胞、ウイルス、細菌、古細菌、真菌、抗体、代謝産物、病原体、毒素、汚染物質、毒物、生物体全体、小分子、ポリマー、金属イオン、金属塩、プリオン、またはそれらの任意の誘導体、部分もしくは組み合わせを含む群から選択される、請求項102記載の方法。
  104. 第一のMNAzymeに対するパートザイム、第一の基質、第二のMNAzymeに対するパートザイム、DNAzymeリガーゼ、第二の基質、追加のパートザイム、追加のMNAzymeに対する組織化助長因子および追加の基質のうち少なくとも一つが、少なくとも一つのナノ粒子、ミクロ粒子、またはそれらの組み合わせをさらに含む、請求項93記載の方法。
  105. 第一のMNAzymeに対するパートザイム、第一の基質、第二のMNAzymeに対するパートザイム、DNAzymeリガーゼ、第二の基質、追加のパートザイム、追加のMNAzymeに対する組織化助長因子および追加の基質のうち少なくとも一つが、不溶性支持体に結び付けられているか、または溶液中に遊離している、請求項93記載の方法。
  106. 基質の少なくとも一つが検出可能な部分およびクエンチャー部分を含み、MNAzymeによる基質の修飾が起こると、該検出可能な部分によって検出可能な影響がもたらされる、請求項93記載の方法。
  107. 検出可能な影響が、蛍光分光法、表面プラズモン共鳴、質量分析法、NMR、電子スピン共鳴、偏光蛍光分光法、円二色性、イムノアッセイ、クロマトグラフィー、放射分析、光度計測法、シンチグラフィー、電子工学的方法、UV、可視光もしくは赤外分光法、酵素的方法、またはそれらの任意の組み合わせのうち少なくとも一つによって検出される、請求項93記載の方法。
  108. 検出可能な影響が測定され、該測定の大きさが標的の量を示す、請求項93記載の方法。
  109. 複数のMNA複合体を含む全加算器であって、二つの出力の四通りの可能な組み合わせを生成するために三つの入力の八通りの可能な組み合わせを含む全加算器であり、該四通りの可能な組み合わせが、出力無し（no output）、第一の出力、第二の出力、または第一および第二の両方の出力である、全加算器。
  110. 入力無し（no input）の存在が出力無しを生じさせる、請求項109記載の全加算器。
  111. 任意の厳密に一つの入力に応答して第一の出力を生成する、請求項109記載の全加算器。
  112. 任意の厳密に二つの入力に応答して第二の出力を生成する、請求項109記載の全加算器。
  113. 三つの入力に応答して第一および第二の出力を生成する、請求項109記載の全加算器。
  114. 入力の少なくとも一つが検出可能な事象である、請求項109記載の全加算器。
  115. 出力の少なくとも一つが、蛍光分光法、表面プラズモン共鳴、質量分析法、NMR、電子スピン共鳴、偏光蛍光分光法、円二色性、イムノアッセイ、クロマトグラフィー、放射分析、光度計測法、シンチグラフィー、電子工学的方法、UV、可視光もしくは赤外分光法、酵素的方法、またはそれらの任意の組み合わせのうち少なくとも一つによって決定される、検出可能な事象または検出可能な影響である、請求項109記載の全加算器。
  116. 第一または第二の出力の一つが、もう一つの全加算器に対する入力として作用する、請求項109記載の全加算器。
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