CN101365808A - 用于评估hiv病毒适应度的方法、质粒载体和引物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及在给定环境中评价HIV病毒复制能力的方法和装置。特别地，本发明提供了生长竞争检验，其可以利用重组标签化的HIV－1病毒系统来测定相关的病毒适应度。所述方法依靠质粒载体、扩增子、引物和探针，以及由此的能复制的病毒的生成。所述方法和材料可以用于多个领域，包括诊断、药物筛选、药物遗传学和药物开发。
Description
发明领域
本发明涉及在给定环境中评价HIV病毒复制能力的方法和装置。特别地，本发明提供了生长竞争分析，其可以利用经重组标签化的HIV-1病毒系统来测定相对病毒适应度(fitness)。所述方法依靠质粒载体、扩增子、引物和探针以及能复制的病毒的由此生成。所述方法和材料可以用于多个领域，包括诊断、药物筛选、药物遗传学和药物开发。
背景技术
抗逆转录病毒治疗的最终目标是尽可能多和尽可能久地抑制HIV-1复制。维持低至不可检测的HIV-1RNA水平将防止向获得性免疫缺陷综合症(AIDS)的发展，并能使得抗逆转录病毒抗性的出现最小化(Hirschet al.，1998)。然而，即使高效的抗逆转录病毒治疗学(HAART)也不能在所有组织区室中完全地抑制HIV-1复制。所有抗逆转录病毒药物的有效性都受到药物抗性变体的出现的限制，经常显示出在每类药物种类内部的广泛的交叉抗性(Miller，2001；Deeks，2001；Loveday，2001)。在没有抗逆转录病毒治疗(ART)时，这些药物抗性毒株与准种(quasispecies)内的野生型(WT)克隆相比具有降低的适应度(Coffin，1995)。适应性是描述有机体对其环境的复制适应性(adaptability)的复杂参数(在Domingo and Holland，1997；Domingo et al.1999中综述)。通常，适应度的初始的降低与赋予直接药物抗性的初级替代物的出现一致。持续的药物压力容许病毒选择次级突变，其补偿了初级突变，并恢复了药物目标酶[蛋白酶(PR)或逆转录酶(RT)]的酶活性。这种持续的进化将使得适应度恢复到有时比WT病毒更低、类似或甚至更高的水平(Hirsch et al.，1998；Nijhuis et al.，2001；Berkhout，1999a；Clavel et al.，2000；Doyon et al.，1996；
-Mateu and Arts，2001)。因而，“群集(swarm)”或准种中的每个克隆受到各种选择压力，并且具有反映出在特定环境下的性质如活性和稳定性的组合的适应度。在准种周转(turnover)或复制期间，不同的基因组快速地产生，并经历连续的竞争和选择过程(Domingo et al.，1999)。更高适应度的新近出现的变体通常竞争超过更低适应度的克隆，因而，准种可以快速地适应改变中的环境。
相当大的注意已经集中于药物抗性和病毒适应度之间的关系上。与WT分离株相比，赋予对抗逆转录病毒试剂的抗性的若干突变与降低了HIV-1分离株的复制能力和相对适应度(Croteau et al.J Virol 1997；71：1089-96；Larder et al.Science 1995；269：696-9；Harrigan et al.J Virol1998；72：3773-8；Kosalaraksa et al.J Virol 1999；73：5356-63；Wrin et al.Conference on Retroviruses and Opportunistic Infections，San Francisco，January 30-February 2，2000)。HIV-1的高度药物抗性变体的降低的复制能力可能对在被认为是“失败中的”抗逆转录病毒治疗的患者中的持续免疫效益有贡献(Deeks et al.N Engl J Med 2001；344：472-80)。在治疗中断时药物抗性病毒被WT病毒相对快速替代提供了证据证明：在不存在药物压力时，WT病毒相对于药物抗性变体而言，具有显著的适应度优势(Devereux et al.AIDS 1999；13(Suppl)：F123-7；Verhofstedeet al.AIDS 1999；13：2541-6；Miller et al.AIDS 2000；14：2857-67)。因而，在HIV-1PR和RT中的药物抗性突变体的积累显著地损害病毒适应度(Lu et al.，J.Acquir.Immune Defic.Syndr.27：7-13；Martinez-Picado etal.，J.Virol.73：3744-3752)。尽管存在高水平的药物抗性，但降低的病毒适应度仍能促进抗逆转录病毒治疗的持续效益，(Deeks et al.，N.Engl.J.Med.344：472-480)。然而，在不存在药物的情况下，并非所有的抗性突变体一定能降低病毒适应度。例如，在使用含有蛋白酶抑制物(PI)的方案进行治疗期间选择的某些突变体可以改进病毒复制，产生比初始的WT分离株更适应的突变(Nijhuis et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：10537-10541)。
已经报道了用于估计体外相对病毒适应度的多种分析。这些方法中的大多数依靠点突变分析、直接群体测序，或取决于大量的分子克隆的测序来估计群体中WT和突变等位基因的频率(Martinez-Picado et al.JVirol 1999；73：3744-52；Nijhuis et al.AIDS 1999；13：2349-59)。或者，通过从测序层析谱分析相对峰高度来估计等位基因频率(Kosalaraksa etal.J Virol 1999)。然而，克隆分析和点突变分析很可能是耗时的和费力的。此外，对于通过点突变分析研究的每个等位基因需要设计和验证独特的引物。虽然直接群体测试是更为直接的，但是，在测序层析谱上比较相对峰高度是估计混合群体中等位基因频率的不精确的手段(Harrigan et al.J Virol 1998；72：3773-8)。
重组病毒分析已经提供了从血浆分离HIV的相对快速和可重现的方法(Kellam et al.J.Virol.38(1994)，pp.23-30；Maschera et al.J.Virol.69(1995)，pp.5431-5436；Hertogs et al.Antimicrob.Agents Chemother.42(1998)，pp.269-276；and Robinson et al.AIDS Res.Hum.Retr.16(2000)，pp.1149-1156)。通过产生cDNA然后聚合酶链式反应(PCR)来扩增药物目标基因PR和/或RT，并与在相应于扩增区域的区域中具有特异性删除的克隆的原病毒DNA共同转染。在共转染的DNA片段中的重叠区域重新组合产生复制型病毒。Robinson et al.，Journal ofVirological Methods，104(2002)147-160描述了培养HIV-1的方法；其中除了整条PR和RT序列之外，包含Gag-Pol裂解位点的所有Gag基因也来自感兴趣的分离株。
经改良的单循环重组病毒检验已经被用于测定不同HIV-1分离株的复制能力，但其不能提供关于比较适应度的实际数据，因为这种分析没有测量不同病毒物种的竞争性生长(Wrin et al.)。此外，单循环的重组病毒分析限于含有源自受试者的基因或特定突变的HIV-1克隆，此外测试的病毒没有完成完整的复制周期(
-Mateu et al.，2002)。
利用化学发光检测的基于PCR的差示探针杂交分析精确地定量了混合物中WT和突变序列的比例，但是必须针对每个感兴趣的等位基因设计特定的探针(Eastman et al.J Clin Microbiol 1995；33：2777-80)。测序足够大数量的克隆以估计等位基因频率是费力的，而峰高度比较是用于定量病毒准物种混合物的相对不精确的方法。
生长竞争实验涉及用两种不同的HIV-1分离株进行的双感染。可以在混合的感染物中直接比较两种病毒毒株的相对适应度，其中每种毒株被精确地定量，并且可从遗传上和/或表型上与另一种相区分。一种分离株相对于另一种的生长优势是相对适应度的衡量(Holland et al.，1991)。尽管是更费力的，通过允许突变和WT毒株的直接比较，但生长竞争分析提供了对病毒适应度的精确估计。利用这种病毒竞争概念，已经开发出了不同的技术，来定量两种病毒在体外感染集中的最终比例，从而测量相对病毒适应度。许多这些方法比较了相差单个氨基酸取代的HIV-1克隆的适应度，必须依靠大量克隆的测序(Sharma and Crumpacker，1997；Harrigan et al.，1998；Martinez-Picado et al.，1999，2000；Imamichiet al.，2000)。近来的研究采用了更快速的技术来估计群体中两种病毒的相对频率(-Mateu and Arts，2001)。例如，不同版本的杂双链体跟踪分析(HTA)已经被用于对竞争中的两种HIV-1变体进行精确地检测和定量(-Mateu et al.，2000；Nelson et al.，2000；Reschet al.，2001)。新的技术例如实时PCR也被用于双病毒检测(De Rondeet al.，2001)。-Mateu等人(2002)近来开发了新的实时PCR/TaqMan分析，其通过直接与非亚型B HIV-1对照竞争来测量HIV-1亚型B毒株的相对产量。Lu和Kuritzkes(JAIDS，27：7-13，May 2001)开发了新的重组标记物病毒分析(RMVA)，来检测生长竞争分析后的两种HIV-1克隆。在删除RT的原病毒克隆中用两种不同的标记基因(hisD或PLAP)替代nef基因。在生长竞争实验之后，经由对相应标记物的实时PCR来定量含不同的RT编码区的两种RMV克隆(pHIVdeltaenvBSTEIIdelta nef-hisD和pHIVdeltaenvBSTEIIdeltanef-PLAP)的比例。然而，由于包膜(env)区域是HIV基因组最为可变的区域，即，提供了对药物或中和抗体的很多逃避突变的最高频率的突变，因此，外来基因对nef基因的消除或替代将不可避免地影响原始病毒的性质。因而，这种方法仍不能提供可以模拟目标病毒的体内效果的体外模型。
因而存在着对经过标准化的用于测试病毒适应度的方法的需求，所述方法能模拟体内环境、易于使用并易于以精确和精密的方式定量。还需要容许在单个分析试管中进行对多种病毒的多路分析的方法。
本发明的一个目的是提供评估病毒适应度的方法，其可以测量在环境中病毒的复制能力。
本发明的一个目的是提供评估病毒适应度的方法，其可以测量不同病毒物种的竞争生长。
本发明的一个目的是提供评估病毒适应度的方法，其不需要采用为被研究的每个等位基因设计并验证的引物或探针。
本发明的一个目的是提供评估病毒适应度的方法，其对完全完整的复制循环加以测试。
本发明的一个目的是提供评估病毒适应度的方法，其对于在病毒准物种中测定混合物来说是精确的。
本发明的一个目的是提供评估病毒适应度的方法，其在估计病毒适应度方面是精确的。
本发明的一个目的是提供评估病毒适应度的模型，其可以模拟体内条件。
WO03/020878提供了对扩增和检测测试样品中的HIV-1目标序列有用的寡核苷酸引物集、探针和其组合。
Tibotec Pharmaceuticals Ltd.的EP 1283272涉及评估HIV治疗的方法和产品。特别是，测定了HIV包膜蛋白的分子事件和它们对药物的治疗效力的影响。这些方法依靠通过基因分型或表型分型来提供HIV包膜核酸材料并评估治疗。
WO03/011334公开了HIV Tat蛋白或多核苷酸；或HIV Nef蛋白或多核苷酸；或与HIV Nef蛋白或多核苷酸连接的HIV Tat蛋白或多核苷酸；以及HIV gp 120蛋白或多核苷酸在疫苗生产中的用途，所述疫苗适合于针对HIV的人类预防性或治疗性免疫的初次-强化递送，其中所述递送经由轰击方法实现。
WO00/29611涉及对样品中的HIV进行亚型和/或物种全面性检测的方法，其中使用至少一种寡核苷酸，其含有来自以下的至少10个连续核苷酸：(i)HIV的gag gene或pol基因的LTR区域的高度保守区域，(ii)另一种HIV分离物的相应区域的高度保守区域；(iii)源自多种HIV分离物的共有序列的相应区域的、或与之互补的序列的高度保守区域。
FR2869045提供了对可能含有HIV病毒的样品进行分析的方法，所述方法包括以下步骤：(a)提取病毒RNA；(b)对步骤(a)获得的RNA进行逆转录，并用第一对引物扩增从而允许产生包含HIV基因组的至少两个连续基因的全部或部分的、扩增的逆转录产物；(d)使用一组第二对引物对步骤(b)中获得的扩增的逆转录产物进行扩增；(e)与步骤(d)制备的上述扩增产物的载体进行同源重组；(f)对上述至少两个基因的全部或部分编码的病毒蛋白质进行功能分析；(g)测量步骤(e)获得的重组病毒的复制能力。
Tibotec Pharmaceuticals Ltd.的EP 1285971涉及评价HIV治疗的方法和产品。该方法基于评价引起所研究化合物的改变的治疗效力的、在HIV整合酶(int)上的分子事件来实现。这些方法依靠提供整合酶基因并通过基因分型或表型分型所述整合酶基因来评价。
US2005/244818公开了单个细胞水平的表型分析，其可以同时分析HIV-1药物易感性和内在的复制能力。这容许对抗逆转录病毒药物在抑制病毒复制和选择具有降低的复制能力的抗性病毒方面的功能进行定量剖析。所公开的分析提供了对抗逆转录病毒治疗失败的患者合理评价治疗决定的工具。
Weber Jan et al.，The Journal of General Virology，Aug 2003，vol.84，no.Pt8公开了下述TaqMan实时PCR分析，以离体估计在多目标(pol和env)抗逆转录病毒治疗阶段中人类免疫缺陷病毒1型适应度。
WO05/108588涉及基于HIV的重组病毒克隆，其是以下基因操作的结果：HIV片段的删除(例如，Nef基因)而不损失传染能力；掺入不在人类细胞中表达的基因；插入LacZ基因；导入限制性位点以从基础原病毒提取DNA片段和用来自被评估患者的基因取代基因。此外，本发明涉及所述克隆在与AIDS相关的分析方法中的应用。
Van Maarseveen et al.，Journal of Virological methods，vol.133，2006，pages 185-194，公开了下述实时PCR分析，以测定HIV-1蛋白酶变体和/或逆转录酶变体的相对复制能力。
发明内容
本发明涉及用于测定两种HIV病毒在环境中的复制能力的体外或离体方法，所述方法包括下述步骤：
a)产生标签化的重组传染性病毒，其包含标签化的HIV DNA载体和来自第一目标HIV病毒的第一扩增子；其中通过在选自gag、pol、env、tat、rev、nef、vif、vpr和vpu的HIV基因之一中导入一个或多个沉默突变来产生所述标签化的HIV DNA载体；其中所述标签化的HIV DNA载体在其DNA序列中具有删除，所述删除最多对应于(corresponds atmost)或重叠于来自所述第一目标HIV病毒的所述第一扩增子的侧翼区域；其中所述一个或多个沉默突变被导入下述基因中，所述基因不被来自所述第一目标HIV病毒的所述第一扩增子包括；以及其中所述第一扩增子包含来自所述第一目标HIV病毒的gag、pol或env基因、其部分和其组合；
b)产生未标签化的重组传染性病毒，其包含未标签化的HIV DNA载体和来自第二目标HIV病毒的第二扩增子；其中所述未标签化的HIVDNA载体不包含在步骤a)的标签化的HIV DNA载体中导入的一个或多个沉默突变；其中所述未标签化的HIV DNA载体在其DNA序列中具有删除，所述删除最多对应于(corresponds at most)或重叠于来自所述第二目标HIV病毒的所述第二扩增子的侧翼区域；以及其中所述第二扩增子包含来自第二目标HIV病毒的gag、pol或env基因、其部分和其组合；
c)在给定环境中在细胞培养物中混合步骤a)和b)的重组传染性病毒；以及
d)通过检测所述标签化的重组传染性病毒的所述HIV DNA载体部分中的一个或多个沉默突变，和通过检测未标签化的重组传染性病毒的所述HIV DNA载体部分中一个或多个沉默突变的缺乏，通过定量扩增测定总病毒群体内标签化的重组传染性病毒的比例和未标签化的重组传染性病毒的比例。
特别地，所述第一目标病毒可以是WT病毒，所述第二目标病毒可以是突变病毒毒株，或者反过来。备选地，所述第一目标病毒可以是突变病毒毒株，所述第二目标病毒可以是不同的突变病毒毒株。
在一个实施方式中，本发明涉及上文提及的方法，其中针对环境中三种或更多种目标HIV病毒来测定复制能力，所述方法包括下述步骤：
a)产生上文提及的方法的步骤a)的标签化的重组传染性病毒；
b)产生上文提及的方法的步骤b)的未标签化的重组传染性病毒；
c)产生其它一种或多种标签化的重组传染性病毒，每种包含标签化的HIV DNA载体和来自其它一种或多种目标HIV病毒的第三种或后续的扩增子；其中通过在选自gag、pol、env、tat、rev、nef、vif、vpr和vpu的HIV基因之一中导入一个或多个沉默突变来产生所述标签化的HIV DNA载体，所述一个或多个沉默突变不同于这种方法的步骤a)的所述第一标签化的HIV DNA载体的一个或多个沉默突变；其中每种所述标签化的HIV DNA载体在其DNA序列中具有删除，所述删除最多对应于(corresponds at most)或重叠于来自所述第三或后续的目标HIV病毒的所述第三或后续的扩增子的侧翼区域；其中所述一个或多个沉默突变被导入下述基因中，所述基因不被来自所述第三或后续的目标HIV病毒的所述第三或后续的扩增子包括；以及其中所述第三或后续的扩增子包含来自所述第三或后续的目标HIV病毒的gag、pol或env基因、其部分和其组合；
d)在给定的环境中在细胞培养物中混合步骤c)的重组传染性病毒和步骤a)和b)的重组传染性病毒；以及
e)通过检测每种所述标签化的重组传染性病毒的所述HIV DNA载体部分中的一个或多个沉默突变，和通过检测未标签化的重组传染性病毒的所述HIV DNA载体部分中一个或多个沉默突变的缺乏，通过定量扩增测定总病毒群体内每种标签化的重组传染性病毒的比例和未标签化的重组传染性病毒的比例。
本发明提供了重组病毒标记物病毒系统，其中每种所述标签化的HIV DNA载体和所述未标签化的HIV DNA载体包含野生型或突变毒株的主干(backbone)。
重组病毒标记物病毒系统进一步提供了被设计来恢复、制备和分析几种和各种HIV遗传材料的原病毒DNA、质粒构建体、引物和探针。在一个实施方式中，标签化的HIV DNA载体或未标签化的HIV DNA载体是原病毒HIV DNA或质粒DNA。
因为对一个或多个载体进行了标签化，所以可以通过用定量的扩增来定量每种标签化的基因的频率，来容易地测定携带每种标签化的序列的混合培养物中的病毒的比例。从而避免了为每种等位基因设计独特的引物的需要。此外，与原始分离株相比，使用重组病毒消除了感兴趣的编码区外部的多态性或突变对相对适应度的可能影响。这些重组克隆的主要益处之一是：在相同的遗传背景下在当前蛋白酶和逆转录酶抑制物的选择的情况下研究特定编码区的灵活性。实际上，与HIV-1原始分离株相比，使用重组病毒消除了目标编码区外部的多态性或突变的可能的适应度影响。因而，获得了可以用于研究所有类型的HIV变体的适应度的完全标准化方案。
测定病毒适应度的方法对于设计治疗方式可能是有用的。例如，一种方法可以包括：测定在存在一种或多种药物的情况下患者的临床分离株的相对复制能力，并使用所述相对复制能力来确定该患者的适合的药物疗法。
本发明还提供了下述方法，来帮助科学家研究在存在或缺乏环境因素时不同的HIV毒株的进化，所述环境因素例如但不限于，药物压力，稀释因子，竞争性结合蛋白质例如白蛋白、α1-糖蛋白，细胞系等等。
此外，本发明提供了选自SEQ ID NO：1-12、19-20和24-25的引物；HIV质粒载体，其包含HIV基因中标签化的或未标签化的序列和gag、pol或env基因基因序列、其部分和其组合的删除，其中所述标签化的序列在选自gag、pol、env、tat、rev、nef、vif、vpr和vpu的基因之一中包含一个或多个沉默突变。本发明进一步提供了用于定量HIV病毒的病毒适应度的试剂盒。用于测定在一定环境中两种或更多种HIV病毒的病毒适应度的此类试剂盒包含：i)选自SEQ ID NO：1-12、19-20和24-25的一种或多种引物；和/或ii)一种或多种标签化的HIV质粒载体和任选的未标签化的HIV HXB2D质粒载体；和iii)任选的用于定量扩增的探针，如本发明所描述的。还可用至少一种HIV抑制物来使得此类试剂盒完整化。任选地，可以添加带有WT HIV序列的参考原病毒DNA或质粒。任选地，对于HIV感染易感的细胞可以添加到试剂盒中。此外，可以添加其它环境因素。
通过定量扩增对总病毒群体中一种或多种标签化的重组传染性病毒的比例和未标签化的重组传染性病毒的比例的测定通过体外扩增技术来进行，所述技术包括但不限于，聚合酶链式反应(PCR)、链交换扩增(SDA)、转录介导的扩增(TMA)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、自持的序列复制(3SR)、基于转录的扩增(TAS)、滚环扩增(RCA)、环介导的等温扩增(LAMP)和连接酶链式反应(LCR)(由Schweitzer，B.and Kingsmore，S.，2001，Combining nucleic acid amplification anddetection.Current Opinion in Biotechnology，12：21-27综述)。可以使用一些方案来实时监测通过体外扩增技术产生的扩增子积累，所述方案采用LuxTM发荧光引物、可被DNAzymes、QZymes或MNAzymes裂解的探针、
探针、分子信标、蝎子引物(scorpions)或任何其它FRET探针。
本发明进一步提供了一种方法，其中通过采用MNAzymes作为监视技术的聚合酶链式反应进行定量扩增。
来自病毒适应度实验的结果可以用于针对大量的WT和突变HIV毒株开发存在或不存在特定环境因素下特定扩增子的复制能力水平的数据库。特定扩增子的基因型或表型可以与存在其它病毒的情况下所述特定扩增子的复制能力相关联。检索相同的基因型或表型，向数据库进一步提问来鉴定：对于任何被检索序列来说是否已知相应的病毒适应度。在后一种情况中，可以确定有效的病毒适应度。可以生成报告，包括病毒株相对于一种或多种其它毒株(包括WT)的病毒适应度，研究中的毒株的基因型和/或表型，以及其它信息，如测试的环境因素、生物制剂筛截，等等。这种数据库可以与gag、pol或env基因序列信息一起被分析，结果用于确定合适的治疗策略。
附图说明
- 附图1，在中心部分，是完整HIV基因组的示意图。在上部，包膜基因是强调示出的，其表明了标签的位置以及以及用于检测该标签的引物结合的位置。在下半部分，是用于扩增gag蛋白酶扩增子的引物结合的位置的示意图概观，其稍后可以与合适的标签化的或未标签化的质粒载体重新结合。
- 附图2显示了pGEM载体pGEM-HIVdelGPRT的图谱(登记号nrLMBP4568，于2002年7月1日保藏于位于Universiteit Gent-Laboratoriumvoor Moleculaire Biologie的比利时微生物协作保藏所)，其中亚克隆的HIV基因被鉴定出。所述载体具有gag蛋白酶逆转录酶编码序列的删除。
- 附图3显示了pGEM载体的图谱(pGEM-HIVdelGPRT_tagged(env))(登记号nr LMBP 5112，于2005年12月20日保藏于位于Universiteit Gent-Laboratorium voor Moleculaire Biologie的比利时微生物协作保藏所)，其中亚克隆的HIV基因被鉴定出。所述载体具有gag蛋白酶逆转录酶编码序列的删除，并还包含标签化的包膜基因。
- 附图4显示了pGEM载体的图谱(pGEM-HIVdelGPRT_tagged(int))(登记号nr LMBP 5113，于2005年12月20日保藏于位于UniversiteitGent-Laboratorium voor Moleculaire Biologie的比利时微生物协作保藏所)，其中亚克隆的HIV基因被鉴定出。所述载体具有gag蛋白酶逆转录酶编码序列的删除，并还包含标签化的整合酶序列。
- 附图5是对MT4细胞中各种相对输入浓度下HIV HXB2D WT和标签化的HIV HXB2D的随时间的病毒生长情况的比较。
- 附图6描绘了对来自使用双标记共感染的MT4细胞的HIV HXB2DWT和标签化的HIV HXB2D DNA的检测。
- 附图7a、7b和7c显示了针对模板HIV HXB2D和标签化的HIVHXB2D DNA的扩增曲线，其中用引物SEQ ID NO：7和6进行扩增。B-FAM标记对应于HIV HXB2D DNA(附图7a)，D-JOE对应于标签化的HIV HXB2D DNA(附图7b)，TAMRA对应于持家基因(GAPD)(附图7c)。
- 附图8a、8b和8c显示了针对模板HIV HXB2D和标签化的HIVHXB2D DNA的扩增曲线，其中用引物SEQ ID NO：5和6进行扩增。B-FAM标记对应于HIV HXB2D DNA(附图8a)，D-JOE对应于标签化的HIV HXB2D DNA(附图8b)，TAMRA对应于持家基因(GAPD)(附图8c)。
- 附图9a、9b和9c显示了针对模板HIV HXB2D和标签化的HIVHXB2D DNA的扩增曲线，其中用引物SEQ ID NO：8和9进行扩增。B-FAM标记对应于HIV HXB2D DNA(附图9a)，D-JOE对应于标签化的HIV HXB2D DNA(附图9b)，TAMRA对应于持家基因(GAPD)(附图9c)。
- 附图10a、10b和10c显示了针对模板HIV HXB2D和标签化的HIVHXB2D DNA的扩增曲线，其中用引物SEQ ID NO：5、6、7、8和9进行扩增。B-FAM标记对应于HIV HXB2D DNA(附图10a)，D-JOE对应于标签化的HIV HXB2D DNA(附图10b)，TAMRA对应于持家基因(GAPD)(附图10C)。
- 附图11提供了附图7-10中显示的扩增的材料的终点凝胶电泳的图。
- 附图12是对MNAzyme的示范性设计的描述，其中partzymes A和B的底物臂部分(A)结合报告物(Reporter)底物，其上附着了荧光标签(左)和淬灭剂(右)。催化核心部分(C)位于底物臂部分(A)和感受器臂部分(B)之间。在感受器臂部分(B)与目标(Target)结合时，报告物(Repoter)底物在MNAzyme裂解位点(MNAzyme Cleavage Site)被裂解，从而增加了荧光。
- 附图13：多目标的示范性多路分析的示意图：可以使用两种或更多种底物同时检测两种或更多种目标，每种底物特异于一种MNAzyme。优选地，用不同的荧光基团标记底物。在这个实施例中，目标1可以通过监视FAM荧光方面的提高来检测，目标2可以通过监视JOE荧光方面的提高来检测。Q：淬灭剂；FAM，JOE：荧光基团。
- 附图14呈现了用于监视HIV病毒适应度的MNAzyme PCR分析的实例。阐述了双链PCR分析，其使用两种MNAzymes用于两个序列的同时检测和定量。上部的序列HIV HXB2D WT，含有位于被MNAzyme1识别的第二区域的5＇的野生型(WT)序列。在第二(3＇)区域中的灰色圆圈相应于为标签化的野生型碱基。所述下部的序列标签化的HIVHXB2D含有通过感兴趣的HIV目标病毒(T)的扩增衍生的序列，其位于由MNAzyme 2识别的第二区域的5＇。在第二(3＇)区域中的条纹方形相应于沉默突变(标签化的碱基)。正向PCR引物(箭头5＇P)和反向PCR引物(箭头3＇P)指示了上部的HXB2D WT和下部的标签化的HXB2D序列。MNAzyme 1在存在上部HXB2D WT扩增子的情况下适应度，产生在FAM(F)和淬灭剂(Q)之间裂解底物1(S-1)的活性核酸酶。MNAzyme2在存在下部的标签化的HXB2D序列的情况下适应度，产生在JOE(J)和淬灭剂(Q)之间裂解底物2(S-2)的活性核酸酶。
发明的简要说明
定义
术语“病毒适应度”是指任何HIV-1变体在给定环境下，例如在存在或不存在药物的细胞系统中的复制能力。
术语“标签”是指化学部分，其是核苷酸、寡核苷酸或多核苷酸，当其取代另一个序列或添加至另一个序列时，为该序列提供了额外的用途，或赋予了有用的性质，特别是在对其检测或分离方面。特别地，在本发明中，术语“标签”是指下述一个或多个核苷酸，其在HIV DNA载体中被具有独特性的其它一个或多个核苷酸替换，这些核苷酸的替换都是沉默突变，其不破坏HIV DNA的阅读框。在本发明中，一个或多个沉默突变被导入HIV DNA载体中，特别是选自gag、pol、env、tat、rev、nef、vif、vpr和vpu的HIV基因之一中，从而产生“标签化的HIVDNA载体”。
“未标签化的HIV DNA载体”是指不包含导入所述标签化的HIVDNA载体中的一个或多个沉默突变的载体。
“扩增子”被定义为通过离体或体外核酸扩增技术产生的任何核酸分子。特别是，扩增子包含当与引物接触时能与引物杂交并且可以是整个分子或其部分的序列。
来自目标HIV病毒的扩增子是指感兴趣的HIV目标病毒的核酸序列，它的复制能力将要通过本发明来测定。特别地，来自目标HIV病毒的扩增子包含HIV基因之一或其部分以及其组合，所述基因选自gag、pol和env基因，即，gag基因、pol基因的DBM编码区、pol基因的逆转录酶编码区、pol基因的整合酶编码区、env基因、其部分、以及其组合。特别地，来自目标HIV病毒的扩增子选自gag-PR-RT-int、gag-PR-RT、gag-PR、gag、PR-RT-int、RT-int、int、PR-RT、PR、RT、env和其部分。另外，扩增子可以包括侧翼区域，例如，对于gag-PR和PR-RT基因，具有5’LTR序列的那些侧翼区域或其部分。应当理解，这种扩增子可以是各种来源的，包括质粒、来自患者的材料或实验室病毒，包括IIIB和NL4-3，或任何其它突变的或WT病毒。
来自目标HIV病毒的扩增子不能与在定量扩增期间扩增的序列混淆。这种最后的序列或扩增子分别对应于标签化的HIV DNA载体或未标签化的HIV DNA载体的标签化的或未标签化的区域。这些标签化的HIV DNA载体或未标签化的HIV DNA载体最后与来自目标HIV病毒的扩增子重新组合，定量扩增的序列来源于重组病毒。特别地，定量扩增的扩增子包含或缺少在选自gag、pol、env、tat、rev、nef、vif、vpr和vpu的HIV基因之一中导入的一个或多个沉默突变。
“引物”是指DNA或含DNA的核酸分子的短片段，其(i)能在扩增条件下与要扩增的DNA或RNA序列的合适的部分退火，并(ii)经由聚合酶介导的合成启动，本身物理地扩大。
目标核酸序列的“扩增”是指体外目标扩增技术，借此目标序列被拷贝，产生充当进一步的扩增循环的模板的扩增子。这种体外扩增技术包括但不限于，聚合酶链式反应(PCR)、链交换扩增(SDA)、转录介导的扩增(TMA)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、自持的序列复制(3SR)、基于转录的扩增(TAS)、滚环扩增(RCA)、环介导的等温扩增(LAMP)和连接酶链式反应(LCR)。
“环境”是指药物压力，例如抗病毒药物、抗生素或任何其它药物，竞争性结合蛋白质，例如白蛋白、α1糖蛋白、毒素，特定类型的介质、血清和其成分，稀释因子，细胞系，温度，压力，放射等等。
治疗或治疗方式是指通过使用药物、以给定剂量、时间间隔、持续时间、单独地或不同组合地，经由不同的给药途径，在适合的制剂中，等等，对个体的医学状况的管理或处理。
“药物”是指任何试剂，例如化学治疗剂、肽、抗体、反义物、核酶和任何它们的组合，无论它是市场化的还是正在开发的。可以在本发明的分析中测试的抗HIV药物的实例包括所有批准的和正在开发的核苷酸、核苷以及非核苷RT抑制物、PR抑制物、侵入抑制物、包膜抑制物和整合酶抑制物。HIV抑制物包括核苷逆转录酶抑制物(NRTI)、核苷酸逆转录酶抑制物(NtRTI)、非核苷逆转录酶抑制物(NNRTI)、蛋白酶抑制物(PI)、侵入抑制物、融合抑制物、gp41抑制物、gp120抑制物、整合酶抑制物、共同受体抑制物(例如，CCR5、CXCR4、...)、出芽/成熟抑制物，等等。
HIV核苷RT抑制物包括其作用机制包括抑制病毒RT酶的那些化合物。举例而言(且不限于现有的和将来新的化合物)，HIV核苷逆转录酶抑制物包括叠氮胸苷(AZT)、拉米夫定(3TC)、司他夫定(d4T)、扎西他滨(ddC)、去羟肌苷(ddI)、阿巴卡韦(ABC)。
HIV非核苷逆转录酶抑制物包括其作用机制包括抑制病毒逆转录酶的那些化合物。举例而言(且不限于现有的和将来新的化合物)，HHIV非核苷逆转录酶抑制物包括奈韦拉平、地拉韦定、施多宁、TMC120、TMC125、卡普韦林、calanolide、UC781、SJ-1366、二苯甲酮、PETT化合物、TSAO化合物。
HIV核苷酸逆转录酶抑制物包括其作用机制包括抑制病毒逆转录酶的那些化合物。举例而言(且不限于现有的和将来新的化合物)，HIV非核苷酸逆转录酶抑制物包括阿德福韦(PMEA)、替诺福韦(PMPA)和其它膦酸酯。
HIV蛋白酶抑制物包括其作用机制包括抑制病毒蛋白酶的那些化合物。举例而言(且不限于现有的和将来新的化合物)，HIV蛋白酶抑制物包括利托那韦(RTV)、茚地那韦(IDV)、奈非那韦(NFV)、安普那韦(APV)、替利那韦(SC-52151)、替拉那韦(TPV)、沙奎那韦(SQV)、洛匹那韦(LPV)、阿扎那韦、帕利那韦、莫折那韦、BMS186316、DPC 681、DPC 684、AG1776、GS3333、KNI-413、KNI-272、L754394、L756425、LG-71350、PD161374、PD173606、PD177298、PD178390、PD178392、PNU 140135、山楂酸、U-140690、RO033-4649、TMC114、TMC126，它们的前体药物、代谢物、N-氧化物和盐。
HIV侵入抑制物或gp120抑制物包括其作用机制包括抑制病毒侵入或gp120糖蛋白的那些化合物。举例而言(且不限于现有的和将来新的化合物)，现有的将来新的化合物，HIV进入或gp120抑制物包括BMS806、硫酸葡聚糖、苏拉明、菊苣酸。
HIV融合抑制物或gp41抑制物包括其作用机制包括抑制病毒融合或gp41糖蛋白的那些化合物。举例而言(且不限于现有的和将来新的化合物)，HIV融合或gp41抑制物包括T20、T1249。
HIV整合酶抑制物包括其作用机制包括抑制病毒整合酶的那些化合物。举例而言(且不限于现有的和将来新的化合物)，HIV整合酶抑制物包括L-870810、L-870812、pyranodipyrimydines、S-1360。
共同受体抑制物包括其作用机制包括抑制HIV与细胞膜上存在的细胞受体(例如CCR5、CXCR4)的相互作用的那些化合物。举例而言(且不限于现有的和将来新的化合物)，共同受体抑制物包括TAK 779、AMD3100、AMD8664、AMD070、SHC-C、SHC-D、AK602、TAK-220、UK-427，857、T22。
HIV出芽/成熟抑制物包括其作用机制包括抑制病毒出芽/成熟的那些化合物。举例而言(且不限于现有的和将来新的化合物)，HIV出芽/成熟抑制物包括PA-457。
术语“嵌合”指包含来自不同来源的核酸材料的构建体，例如，WT病毒与实验室毒株的组合、WT序列和受试者衍生的临床分离物序列的组合。
病毒
如本文所使用的，人类免疫缺陷病毒(HIV)是指下述任何HIV，其包括实验室毒株、野生型毒株、突变毒株和包含至少一种HIV病毒(例如，HIV临床分离株)的任何生物样品。与本发明相符的HIV毒株是能够感染哺乳动物、特别是人类的任何这种毒株。实例有HIV-1、HIV-2和SIV。
对于本发明的实施，HIV病毒是指包含至少一种HIV病毒的任何样品。例如，样品可以从个体、从细胞培养物获得，或使用重组技术或克隆来产生。
与本发明相符的HIV毒株是能够感染细胞系和人类的任何这种毒株。用于获得质粒的病毒株优选是HIV野生型序列，例如LAI、用于B亚型HIV研究的HXB2D。LAI，也称为IIIB，是野生型HIV毒株。它的一个特别的克隆(这意味着一条序列)是HXB2D。这种HXB2D序列可以掺入质粒中。也可以使用来自其它亚型或群组的HIV的其它克隆。
HIV DNA，例如原病毒DNA，可以代替病毒RNA用于本文描述的方法。在使用RNA的情况中，需要通过适合的逆转录酶将其逆转录成cDNA。描述RNA分析的方案也可以用于DNA分析。然而，如果方案从DNA开始，本领域的技术人员将知道不需要逆转录。被设计赖以扩增RNA链的引物也与DNA退火并扩增DNA。逆转录和扩增可以用单个引物集进行。适合地，可以用半嵌套方法，或更适合地，嵌套方法来逆转录和扩增遗传物质。
来自目标HIV病毒的扩增子
来自目标HIV病毒的扩增子可以从HIV-1临床分离物、定点突变体、或从选择实验得出的病毒获得。任何类型的患者样品可以用于获得期望的扩增子，例如，血清、血液和组织。
病毒RNA可以使用已知的方法分离，例如在Boom，R.et al.(Boom，R.et al.(J.Clin.Microbiol.28(3)：495-503(1990)，通过引用合并进本文)中描述的，或通过其它常规方法，例如酸苯酚方法(例如，酸胍-苯酚-氯仿(AGPC)方法)、异硫氰酸胍操作、采用Chomczynski和Sacchi的方法(Anal.Biochem.162，156-159(1987))。备选地，可以用许多商业的方法例如
病毒RNA试剂盒(Qiagen，Inc.)，从体液如血浆、血清或无细胞液体获得病毒RNA。也可以利用Trizol(Gibco)，按照厂家所述，从沉淀的病毒分离病毒RNA。用于分离病毒RNA的其它商业的试剂盒包括但不限于，Qiagen RNeasy试剂盒、
RNA分离试剂盒Ver.2.11(TaKaRa)、RNAgents总RNA分离系统(Promega)、RNAzol、Tel-Test、Stratagene、Tri-Reagent BD(Sigma)、purescript总RNA分离试剂盒(Gentra Systems，or Qiagen)。
可以使用本领域技术人员已知的方法，例如Maniatis等人(1982)描述的过程从组织提取DNA，其涉及制备细胞溶胞产物，随后用蛋白酶K消化，通过多步骤的苯酚、乙醇沉淀和核糖核酸酶消化提取，实现DNA纯化。任选地，也可以用可获得的商业方法，来从体液获得DNA，例如用 Blood试剂盒用于从血液和体液的DNA分离(Qiagen，Inc.)。
互补DNA可以用Sensiscript RT(Qiagen)合成。核酸可以通过一些技术来扩增，例如聚合酶链式反应(PCR)、链交换扩增(SDA)、滚环扩增(RCA)、环介导的等温扩增(LAMP)、转录介导的扩增(TMA)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、自持的序列复制(3SR)、基于转录的扩增(TAS)和连接酶链式反应(LCR)。
HIV DNA载体
本发明涉及标签化的和未标签化的HIV DNA载体。这种病毒DNA可以是原病毒DNA，即，是能复制的准型病毒，或其它类型的载体，例如质粒。特别地，原病毒DNA和载体或质粒具有在其DNA序列中的删除，所述删除最多对应于或重叠于来自以上所指目标HIV病毒的扩增子的侧翼区域。
在一个实施方式中，本发明涉及标签化的和未标签化的质粒，以及涉及在本文公开的方法中使用所述质粒。完整的HIV序列可以掺入质粒中，或者仅其一部分，例如，本发明中使用的质粒缺少gag、pol和env基因、其部分和其组合。所述删除还可以包含部分侧翼基因，或最终超过一个基因。适合的质粒主干可以选自包括pUC、pBR322和pGEM的组。
在一个实施方式中，每种标签化的HIV DNA载体和未标签化的HIVDNA载体包含野生型或突变毒株的主干。
在一个实施方式中，由标签化的和未标签化的HIV DNA载体包含的质粒DNA包含HXB2D野生型毒株的基因组。
例如，可通过用合适的限制性内切酶处理较长的DNA、用合适的纯化方法纯化消化物、然后使这样获得的感兴趣DNA片段自我连接，来制备含有本发明的DNA的删除构建体。因而，本发明的删除构建体的构建可以通过用限制性内切酶例如ClaI和BcII限制性内切酶消化来实现，这两个酶在特定的位点裂解质粒主干并从而除去gag和蛋白酶序列。备选地，在除去gag和蛋白酶序列之前，可以通过沉默突变将MunI或NheI位点插入质粒中，之后用MunI/BssH II或NheI/BcII分别消化，随后除去gag和蛋白酶序列。
独特的限制性位点指在核酸上被限制性内切酶识别的一个位点的单次出现，或者它不发生在构建体中的别处。可以在扩增之后通过重新连接扩增的质粒的DNA的5＇和3＇末端来创建独特的限制性位点。备选地，独特的限制性位点可能不必创建，因为它可能已经完全地位于末端之一中，5＇或3＇末端。任选地，可以插入独特的限制性位点。任选地，独特的限制性位点的部分可以存在于要扩增的区域中。从扩增衍生的独特的限制性位点的创建是优选的方法，因为这是单步骤的、直接的、简单的和快速的方法。独特的限制性位点进一步与重组病毒的产生相关。
本领域技术人员应当理解，独特的限制性位点的产生将取决于HIV基因组的序列，以及取决于要由此删除的序列。可以用于本发明中的独特的限制性位点是在HIV基因组中仅出现一次的那些，并且可以侧翼于要删除的感兴趣区域，并且不改变阅读框或由感兴趣核酸所编码的蛋白质的序列。任选地，用于扩增的引物可以含有相同的或其它的特异性限制性内切酶位点来便于插入不同的载体中。另外，用于扩增的引物之一可以含有磷酸化的5＇末端-接头以便于外源扩增子的插入。
任选地，获得含有下述WT HIV序列的质粒的方法可以在第二克隆载体中进行，所述WT HIV序列在最多对应于或重叠于要重新组合的扩增子的侧翼区域的区域中具有删除。例如，蛋白酶-逆转录酶区域可以被插入克隆载体例如pGEM质粒中，例如，pGEM3载体的主干可以通过扩增被使用和操作，以除去蛋白酶和/或逆转录酶编码区的部分，从而使得来自样品的其余蛋白酶-逆转录酶序列的插入以不会破坏阅读框的方式进行。被操作的蛋白酶-逆转录酶区域随后被放入pGEM-HXB2D载体中，从而它除了含有相关的蛋白酶-逆转录酶删除之外还含有完全的野生型HIV序列。
蛋白酶-逆转录酶删除载体的实例是pGEM-HXB2D Δ PR-RT，其具有包含整个蛋白酶编码区和大部分逆转录酶编码区的删除。逆转录酶删除载体的实例是pGEM-HXB2D Δ RT，其具有逆转录酶编码区的删除。
技术人员应当理解，本领域已知的其它的HIV载体和克隆操作也可以用于创建缺少gag-PR-RT-int、gag-PR-RT、gag-PR、gag、PR-RT-int、RT-int、int、PR-RT、PR、RT或env的质粒，用于与受试者衍生的序列重组或连接以及创建传染性病毒。例如，可以通过重新将gag-PR-RT-int、gag-PR-RT、gag-PR、gag、PR-RT-int、RT-int、int、PR-RT、PR、RT或env基因的部分导入质粒中来制备删除构建体，在所述质粒中早先已经分别删除了gag-PR-RT-int、gag-PR-RT、gag-PR、gag、PR-RT-int、RT-int、int、PR-RT、PR、RT或env基因。用于扩增感兴趣的区域，即要重新导入的部分的引物是本领域技术人员已知的。一般地，必须创建载体以容许删除的序列的重新插入而不破坏gag-PR-RT-int、gag-PR-RT、gag-PR、gag、PR-RT-int、RT-int、int、PR-RT、PR、RT和env基因的阅读框。
可以通过将一个或多个沉默突变导入以上讨论的质粒构建体来获得标签化的HIV DNA载体。沉默突变的导入将应用于形成质粒的部分的那些基因，即，不形成来自目标HIV病毒的扩增子的部分的那些基因。一个或多个沉默突变可以掺入质粒的任何HIV基因，只要产生的重组病毒的表型保持不变即可。
在一个实施方式中，一个或多个沉默突变的导入在选自gag、pol、env、tat、rev、nef、vif、vpr和vpu的HIV基因之一中进行。在另一个实施方式中，沉默突变的导入在env或pol基因中，特别是在编码包膜蛋白质的env区域中、或在编码整合酶的pol区域中进行。在另一个实施方式中，沉默突变的导入在env基因中进行，在密码子1和857之间、特别是在密码子100和800之间、更特别是在密码子200和600之间、又更特别是在密码子300和500之间、例如在密码子400和500之间、例如在密码子430和490之间、特别是在密码子468和475之间。在另一个实施方式中，沉默突变的导入在编码整合酶酶的pol基因的区域中进行，在密码子1和288之间、特别是在密码子50和275之间、更特别是在密码子100和250之间、又更特别是在密码子150和250之间、例如在密码子200和250之间、特别是在密码子230和231之间。
沉默突变的这种引入可以通过使用QuickChange定点诱变试剂盒(Stratagene)和对感兴趣区域的适合的诱变寡核苷酸引物来实现。定点诱变容许产生点突变，交换核苷酸以及删除或插入单个或多个核苷酸，可能具有氨基酸水平上的改变。对于本发明的范围，定点诱变被用于在感兴趣的基因中插入沉默突变。基本过程使用质粒DNA和两个寡核苷酸引物，所述引物与质粒的反链互补并含有期望的突变。这些引物在聚合酶链式反应(PCR)期间扩增，这继之以用限制性内切酶DpnI消化，限制性内切酶DpnI是对于甲基化的和半甲基化的DNA的特异性核酸内切酶。在这种消化期间，亲本质粒将被除去。具有期望的突变的新创建的质粒可以用于转化E.coli。
特别地，适合的诱变寡核苷酸引物是本文下文描述的引物和它们的同源物，本文要求了对它们的保护。SEQ ID NO：1-2的引物对于将沉默突变掺入pol基因的整合酶编码区域是有用的，SEQ ID NO：3-4对于将沉默突变掺入HIV衍生的质粒的包膜基因中是有用的。
表1：诱变寡核苷酸引物
| SEQ ID NO： | 按5＇到3＇方向列出的引物序列 |
| 1(正向) | TCGGGTTTAT TACAGGGACt cacGtAATCC ACTTTGGAAA GGACCAGC |
| 2(反向) | GCTGGTCCTT TCCAAAGTGG ATTaCgtgaG TCCCTGTAAT AAACCCGA |
| 3(正向) | CCGAGATCTT CAGGCCCGGA GGAGGTGACA TGAGGGACAA TTG |
| 4(反向) | CAATTGTCCC TCATGTCACC TCCTCCGGGC CTGAAGATCT CGG |
这些引物选自SEQ ID NO：1-4，或使用本领域的技术人员已知的算法如FASTA和BLAST测定时与SEQ ID NO：1-4具有至少80％的同源性、优选的90％的同源性、更优选的95％的同源性。在此列出的引物序列任选地可以被标记。适当地，这种标记可以使用荧光、发光或吸光度来检测。此外，位于在此给出的序列上游或下游50个核苷酸(nt)的区域内的引物是本发明的一部分。特别地，引物可以位于在此给出的序列的上游或下游20nt的区域内，它们也是本发明的一部分。并且，包含本文所述的任何引物中存在的至少8个连续碱基的引物构成了本发明的实施方式。感兴趣地，引物包含在此处描述的任一引物中存在的至少12个连续碱基。在本发明的一个方面，引物可以含有接头区域用于克隆。任选地，引物的接头区域可以含有限制性内切酶识别位点。优选地，所述限制性内切酶识别位点是独特的限制性内切酶识别位点。备选地，引物可以与目标区部分地退火。
突变序列的存在可以通过最终质粒克隆的DNA测序来确认。
本发明提供了HIV质粒载体，其包含标签化的序列；和gag、pol或env基因序列、其部分和其组合的删除；其特征在于标签化的序列在选自gag、pol、env、tat、rev、nef、vif、vpr和vpu的基因之一中包含一个或多个沉默突变；条件是所述一个或多个沉默突变不位于删除的基因序列中。本发明进一步提供了HIV质粒载体，其包含gag、pol或env基因序列、其部分和其组合的删除；并且没有标签化的序列。适当地，HIV质粒载体来自HIV野生型毒株HXB2D(Ratner et al.(1987)AIDSRes.Hum.Retrovir.3：57-69])。适当地，标签化的序列位于选自gag、pol、env、tat、rev、nef、vif、vpr和vpu的一个或多个基因中，优选的位于evn或pol基因中，更优选的位于编码包膜蛋白质的env区域中，或位于编码整合酶的pol区域中。
在本发明的一个实施方式中，标签化的HIV质粒载体在env基因中包含标签化的序列，其在密码子1和857之间、特别是在密码子100和800之间、更特别是在密码子200和600之间、又更特别是在密码子300和500之间、例如在密码子400和500之间、例如在密码子430和490之间、特别是在密码子468和475之间。在env基因中包含标签化的序列的这些HIV质粒载体是要求被保护的。
在本发明的另一个实施方式中，标签化的HIV质粒载体在编码整合酶的pol基因的区域中包含标签化的序列，其在密码子1和288之间、特别是在密码子50和275之间、更特别是在密码子100和250之间、又更特别是在密码子150和250之间、例如在密码子200和250之间、特别是在密码子230和231之间。在pol基因的整合酶编码区域中包含标签化的序列的这些HIV质粒载体是要求被保护的。
特别地，本发明提供了标签化的HIV DNA载体pGEM-HIVdelGPRT_tagged(env)(登记号码LMBP5112，SEQ ID NO：28)和pGEM-HIVdelGPRT_tagged(int)(登记号码LMBP 5113，SEQID NO：29)，其已经于2005年12月20日保藏于位于Universiteit Gent-Plasmidecollectie vakgroep moleculaire biologie的比利时微生物协作保藏所中。
标签化的和未标签化的重组传染性病毒的产生
通过将每种标签化的或未标签化的HIV DNA载体与感兴趣的编码片段，即来自目标HIV病毒的扩增子一起转染入细胞中，随后通过细胞中的无细胞病毒上清液的传代，可以产生重组的标签化和未标签化的传染性的病毒。转染可以通过电穿孔、连接、脂转染或任何其它方法来实现。
为了制备重组HIV病毒，gag-PR-RT-int、gag-PR-RT、gag-PR、gag、PR-RT-int、RT-int、int、PR-RT、PR、RT、env或其部分的扩增序列被掺入标签化的或未标签化的HIV DNA载体中，所述载体包含具有最多相应于所述扩增子的部分的删除的HIV野生型或其突变毒株。在扩增子和删除构建体之间遗传物质交换时产生传染性的克隆，来产生HIV序列。
可以通过在适合的宿主细胞中在载体和扩增子序列的重叠DNA片段之间的同源重组，来将来自目标HIV病毒的扩增子掺入合适的HIVDNA载体。备选地，可以根据本领域标准的克隆操作，在独特的限制性位点，将来自目标HIV病毒的扩增子掺入载体中。后者是直接克隆策略。适合于直接克隆策略的是两种不同的限制性位点，其被用来便于扩增子在合适的方向上的连接。
可以保持重组病毒储备用于将来的分析，例如，生存力测试。
细胞培养
细胞可以选自T细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、郎格罕氏细胞、造血干细胞、外周血单核细胞(PBMC)或前体细胞、人类T淋巴样干细胞系、MT4、MT2、CEM和PM-1细胞。对于HIV序列的同源重组，适合的宿主细胞包括MT4和PM-1。MT4是含有CXCR4共同受体的CD4+T细胞系。PM-1细胞系表达CXCR4和CCR5共同受体。所有上述细胞能够在HIV DNA载体与来自目标HIV病毒的扩增子重组时产生新的传染性病毒颗粒。
在细胞培养中，细胞通常被维持在富含蛋白质的介质中，例如补充有10％的胎牛血清、L-谷氨酰胺(2mM)和抗生素(例如青霉素和链霉素)的RPMI1640中。有趣地，在HIV感染之前，可以用植物凝集素对PBMC细胞进行若干天的刺激，并将其维持在R-20培养基中(补充有20％胎牛血清的RPMI 1640)、L-谷氨酰胺、HEPES缓冲液、重组人类白细胞介素-2；青霉素和链霉素中。
生长竞争分析
然后将重组标签化的和未标签化的病毒以不同的比例混合在一起，例如，0/100，25/75，50/50，75/25，100/0。其它比例可以是0/100、20/80、40/60、60/40、80/20、100/0。如果测试超过两种病毒，例如，三种，比例可以是例如0/0/100、0/33/66、33/66/0。混合的病毒样品被用于感染细胞，所述细胞悬浮在有或没有抗病毒药物或任何其它环境成分中，如本文所描述的。因而，通常悬浮在介质中的细胞以传染剂量的重组标签化的和/或未标签化的病毒来接种。测定病毒滴度(表示为感染复数，MOI)并调整到合适的范围，优选在0.0001和0.01之间，更优选约0.001传染性病毒单位/细胞。
在本发明的一个实施方式中，包含标签化的HIV DNA载体和来自第一目标HIV病毒的第一目标扩增子的标签化的重组传染性病毒与包含未标签化的HIV DNA载体和来自第二目标HIV病毒的第二目标扩增子的未标签化的重组传染性病毒混合。这些病毒在给定的环境中在细胞培养物中混合，通过定量扩增来测定在所述环境中所述标签化的和未标签化的重组病毒的复制能力。
对细胞进行孵育、洗涤、重悬浮、重孵育，所有这些都按照需要来进行。在不同的时间收获上清液，例如在第1、4、7、10和14天。从某一天开始，例如，开始孵育后的第四天，培养物被传代，在孵育、洗涤、重悬浮和重孵育之后，在特定的时点，例如第1、4、7、10、14或任何其它的一天从培养物上清液提取病毒RNA。病毒RNA提取可以根据本领域已知的的几种技术实现，例如，通过使用Qiagen RNA试剂盒。备选地，将细胞与重组传染性病毒一起培养，在特定的时间点，收集细胞，进行基因组DNA提取。基因组DNA提取可以根据本领域已知的几种技术实现，例如，通过使用来自Invitek试剂盒Invisorb DNA细胞HTS96试剂盒/V用于纯化基因组DNA。
在群体中标签化的重组病毒对比未标签化的重组病毒的比例通过定量扩增来测定。
定量扩增
定量扩增提供了用于对将要测定复制能力的病毒进行直接定量所需的数据。在定量扩增期间，从如上所述的细胞培养物或上清液提取的、重组病毒的标签化的和相应的未标签化的区域被扩增和检测，这通常同时进行。任选地，持家基因可以用作内部对照。
结果可以通过参考外部定量标准以绝对项表示，即，以原病毒DNA拷贝数/细胞数的数目，或以与样品中存在的总病毒群体或另一种HIV病毒相比的相对项。
用于核酸序列扩增的技术是本领域已知的。这些包括DNA聚合酶介导的技术，例如聚合酶链式反应(PCR)(参见，例如美国专利No.4,683,202；美国专利No.4,683,195；美国专利No.4,000,159；美国专利No.4,965,188；美国专利No.5,176,995)(Saiki et al.，1985；Chehab etal.，1987)、链交换扩增(“SDA”)(Walker et al.，1992)、滚环扩增(“RCA”)(Lizardi et al.，1998)、逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和环介导的等温扩增(“LAMP”)(Notomi et al.，2000；Nagamine etal.，2002)。其它目标扩增技术是由RNA聚合酶介导的，例如，转录介导的扩增(“TMA”)(Jonas et al.，1993)、自持的序列复制(“3SR”)(Fahy et al.，1991)和基于核酸序列复制的扩增(“NASBA”)(Compton，1991)。通过PCR、RT-PCR、SDA、RCA和LAMP产生的扩增产物(“扩增子”)由DNA组成；而RNA扩增子由TMA、3SR和NASBA产生。
一种已知的定量扩增技术是实时PCR。聚合酶链式反应(PCR)在专利NO.US4683195和US4683202中描述。
本文使用的术语“实时PCR”是指从PCR分析发射的信号在反应期间被监测，作为每个PCR扩增循环期间扩增子产量的指标，即，“实时”地，这与常规的PCR不同，在常规PCR中分析信号在PCR反应的结束时检测。实时PCR一般基于对荧光报告物的检测和定量。信号增加与反应中PCR产物的数量成正比。通过记录每个循环中荧光发射的数量，有可能在指数期监视PCR反应，其中在PCR产物数量方面的第一次显著提高与目标模板的初始数量相关。对于“实时PCR”的一般性说明，参见Dehee et al.J.Virol.Meth.102：37-51(2002)；和Aldea et al.J.Clin.Microbiol.40：1060-1062(2002)(对于“LightCycler，”，其中实时的、动力学的定量容许测量在PCR的log线性阶段期间进行)。
在本发明的一个实施方式中，被定量扩增的HIV标签化重组病毒的序列包含在选自gag、pol、env、tat、rev、nef、vif、vpr和vpu的HIV基因之一中的一个或多个沉默突变。在本发明的一个实施方式中，被定量扩增的HIV未标签化的重组病毒的序列不包含在前一句子中涉及的HIV标签化重组病毒的所述一个或多个沉默突变，即，它缺少所有选自gag、pol、env、tat、rev、nef、vif、vpr和vpu的HIV基因的一个或多个沉默突变。
在本发明的另一个实施方式中，被定量扩增的HIV标签化重组病毒的序列包含在env基因中或在pol基因的整合酶编码区域中的一个或多个沉默突变。在本发明的另一个实施方式中，被定量扩增的HIV未标签化的重组病毒的序列不包含在前一句子中涉及的HIV标签化重组病毒的一个或多个沉默突变，即，它缺少所有在env基因中或在pol基因的整合酶编码区中的所述一个或多个沉默突变。
在一个实施方式中，特异于标签化的和未标签化的重组传染性病毒的定量扩增的正向和反向引物包括SEQ ID NO：5-12。SEQ ID NO：5是正向引物，其延伸标签化的包膜基因，即，包含一个或多个沉默突变的包膜基因。SEQ ID NO：6是反向引物，其延伸标签化的包膜基因和WT包膜基因。SEQ ID NO：7是正向引物，其延伸WT包膜基因。SEQID NO：8-9是正向和反向引物，其延伸持家基因或对照基因。SEQ IDNO：10是正向引物，其延伸标签化的整合酶编码序列，即，包含一个或多个沉默突变的整合酶编码序列，以及WT整合酶编码序列。SEQ IDNO：11是反向引物，其延伸标签化的整合酶编码序列。SEQ ID NO：12是反向引物，其延伸WT整合酶编码序列。
其它的序列可以附加到正向引物上以容许实时PCR监视。此类序列可以包括但不限于，用于LUXTM检测的发荧光探针、用于zymogene检测的反义DNAzyme序列、以及Scorpion探针序列。任选地，用于实时监测的附加的序列可以附着于反向引物。
表2：特异于标签化和未标签化重组传染性病毒的定量扩增的引物
| SEQ ID NO： | 按5＇到3＇方向列出的引物序列 | 对扩增的有用性 |
| 5(正向) | ATGTCACCTCCTCCGGGC | 标签化的env基因 |
| 6(反向) | CAGGAATGCTTGCTGCTG | 标签化的&WT env基因 |
| 7(正向) | ATATCTCCTCCTCCAGGT | WT env基因 |
| 8(正向) | ACAGGCAACTTGGCAAATCAAA | 持家基因 |
| 9(反向) | TGCAGAATAAAACAAATTATAAA | 持家基因 |
| 10(正向) | CAGCAGTACAAATGGCAGTATTCA | 标签化的&WT整合酶编码基因 |
| 11(反向) | TCCTTTCCAAAGTGGATTACGTG | 标签化的整合酶编码基因 |
| 12(反向) | TTTCCAAAGTGGATTTCTGCTG | WT整合酶编码基因 |
在进一步的实施方式中，特异于标签化和未标签化的重组传染性病毒的定量扩增的正向和反向引物包括SEQ ID NO：19-20，和24-25。SEQID NO：19是正向引物，其延伸标签化的包膜基因和WT包膜基因。SEQID NO：20是反向引物，其延伸标签化的包膜基因，和WT包膜基因。SEQ ID NO：24是正向引物，其延伸人类基因组RPLPO基因。SEQ IDNO：25是反向引物，其延伸人类基因组RPLPO基因。
表3：特异于标签化和未标签化重组传染性病毒的定量扩增的引物
| SEQ ID NO： | 按5＇到3＇方向列出的引物序列 | 对扩增的有用性 |
| 19(正向) | ATTAACAAGAGATGGTGGTAA | 标签化的&WT env基因 |
| 20(反向) | GTGCTACTCCTAATGGTTCAA | 标签化的&WT env基因 |
| 24(正向) | CATTCTATCATCAACGGGTA | 人类基因组RPLPO基因 |
| 25(反向) | CAAAGGCAGATGGATCAG | 人类基因组RPLPO基因 |
上文描述的引物和它们的同源物是被要求保护的。这些引物选自SEQ ID NO：5-12、19-20和24-25，或如使用本领域技术人员已知的算法如FASTA和BLAST确定的具有至少80％的同源性、优选的90％的同源性、更优选的95％的同源性。在此列出的引物序列任选地可以被标记。适当地，可以使用荧光、发光或吸光度来检测这种标记。此外，位于在此给出的序列上游或下游50个核苷酸(nt)的区域内的引物构成了本发明的部分。特别地，引物可以位于在此给出的序列的上游或下游20nt的区域内，并且也构成了本发明的部分。并且，包含在此处描述的任一引物中存在的至少8个连续碱基的引物构成了本发明的实施方式。感兴趣地，引物包含在此处描述的任一引物中存在的至少12个连续碱基。在本发明的一个方面，引物可以含有接头区域用于克隆。任选的，引物的接头区域可以含有限制性内切酶识别位点。优选的，所述限制性内切酶识别位点是独特的限制性内切酶识别位点。做为选择，引物可以与目标区部分地退火。
实时PCR的方法使用荧光引物或探针，例如LUXTM发荧光引物、可被DNAzymes或MNAzymes裂解的探针、探针、分子信标、scorpions或任何其它FRET探针。在本发明的其它实施方式中，定量扩增采用能够裂解荧光探针的MNAzymes。
在根据本发明的方法中，定量扩增可以通过聚合酶链式反应、链交换扩增或转录介导的扩增进行，采用LUXTM发荧光引物、探针、分子信标、scorpions、DNAzymes、MNAzymes或任何其它与FRET探针联结的引物。在一个实施方式中，所述定量扩增通过聚合酶链式反应进行，并采用MNAzymes，即，采用在MNAzymes附近的引物和被MNAzymes裂解的探针。
LUXTM引物是用单个荧光基团标记的寡核苷酸。其一般长度为20-30个碱基，它们被设计为具有靠近发夹结构中3＇末端的荧光基团。这种结构内在地使得具有荧光猝灭能力；从而不需要独立的淬灭部分。当引物变为掺入双链PCR产物时，荧光基团被去淬灭，引起荧光信号的显著提高。
分子信标是用于鉴定细胞内存在的特定核苷酸序列的探针(Tyagi etal.，(1998)Nature Biotechnology 16：49-53)。分子信标可以仅由核酸组成，例如DNA或RNA，或者它可以由肽核酸(PNA)结合物组成。分子信标与特定核苷酸序列的结合允许体内或体外地鉴定那些序列的存在。分子信标包括结合物(例如，一种结构，例如量子点标签化的珠子)、探针、荧光基团和淬灭部分。探针是包含茎和环结构的单链寡核苷酸，其中亲水性附着基团附着于单链寡核苷酸的一个末端，淬灭部分附着于单链寡核苷酸的另一个末端。荧光基团可以是任何荧光有机染料或单量子点，从而它的发射不与量子点标签化的珠子的发射重叠。淬灭部分理想地淬灭荧光基团的发光。淬灭荧光基团的发光的任何适合的淬灭部分可以用于以上描述的结合物中。
蝎子引物是含有与探针共价连接的PCR引物的双功能分子。探针中的荧光基团与降低荧光的淬灭剂相互作用。在PCR反应期间，荧光基团和淬灭剂分离，其引起来自反应管的光输出的提高。在Whitcombe，D.，Theaker J.，Guy，S.P.，Brown，T.，Little，S.(1999)-Detection of PCRproducts using self-probing amplicons and fluorescence，Nature Biotech17，804-807中更完整地描述了蝎子引物，其由专利EP1088102保护。
DNAzyme(Santoro，S.and Joyce，G.，1997，A general purpose RNAcleaving DNA enzyme.Proc Natl Acad Sci U S A.94：4262-4266.ReviewedEmilsson，G.M.and Breaker，R.R.，2002，Deoxyribozymes：new activitiesand new applications.Cell.Mol.Life Sci.59，596-607)是催化活性的寡核苷酸，其可以，例如，在特定的磷酸二酯键处裂解核酸底物。DNAzyme由侧翼是两个底物识别结构域的催化结构域组成。其观察到标准的Watson-Crick碱基配对规则，必须与它的底物杂交来适当地催化裂解。DNAzymes可以与体外扩增技术组合使用，例如PCR，作为产生可检测信号的手段，因而容许扩增的核酸目标序列的实时监测(US 6,140,055)DNAzymes通过使用具有5＇tag的引物导入扩增子，所述引物是无活性的、DNAzymes的反义序列。当这些序列案子体外扩增期间被拷贝时，催化活性的正义DNAzyme序列与目标序列一起被共同扩增。这产生了起到DNAzymes的作用、能够裂解报告物底物的扩增子。重要的试剂包括与无活性的、DNAzyme的反义链结合的一种基因特异性引物；和第二种基因特异性引物。在本发明的一个实施方式中，5＇和3＇引物特异于目标扩增子。
除了DNAzyme之外，还存在着DNAzyme特异性荧光底物。这种通用的探针由短的核酸片段组成，所述核酸片段在一个末端被荧光基团标签化，在另一个末端为Black Hole QuencherTM染料(BHQ)。DNAzyme底物最终充当DNA拷贝数的度量。每一轮扩增，活性DNAzymes的数目与DNA拷贝数成正比地提高。DNAzyme活性方面的指数性提高引起荧光的相应增加，容许实时监测DNA扩增。在一种优选的实施方式中，所述方法从多个拷贝的目标DNA开始，因而需要较少的循环来达到检测阈值水平，通常由“Ct”值表示。在DNAzyme特异性荧光底物中存在的荧光基团包括FAM、CAL Fluor 
、JOE和TAMRA染料，等等。它们在它们的激发状态强烈地发射，但在它们的淬灭状态仅微弱地发射。
MNAzymes(Johnson & Johnson Research Pty Limited，Australia的专利申请PCT/AU2006/001473)是基于DNAzymes的催化核酸。MNAzymes由两种或更多种寡核苷酸序列(例如，partzymes)构成，其仅当存在MNAzyme时组装出辅助物(facilitator)分子(在这个专利中，是被定量扩增的标签化的或相应的未标签化的区域)，形成能够催化性修饰底物如报告物底物的活性核酸酶。包含partzyme A和partzyme B的示例性MNAzyme在附图12中描绘。参考附图12，DNA partzymes A和B各自与目标结合，即，MNAzyme组装辅助物分子(例如，通过与碱基配对目标的Watson-Crick碱基配对)。当partzymes A和B在目标上相互邻近地杂交时，仅形成MNAzyme。MNAzyme的底物臂与报告物底物结合，报告物底物的裂解由MNAzyme的催化核心催化，所述催化核心通过partzymes A和B的催化结构域的相互作用形成。MNAzyme裂解荧光基团和淬灭剂染料配对之间的底物，因而产生信号。DNA/RNA嵌合体(报告物底物)的裂解在附图中举例说明。术语“MNAzyme”也称为“多组件核酸酶”。MNAzyme也可以包含稳定化寡核苷酸，其通过与组装辅助物或底物相互作用提供了MNAzyme的稳定性。明显地，为了可检测的催化活性，MNAzyme的形成需要至少是partzyme组件与目标(或组装辅助物)的组装，以及报告物底物的结合，任何这些组件的缺乏将引起催化活性的缺失。
可以通过大量方法的任一种来标记与MNAzymes使用的报告物底物，所述方法包括，例如荧光基团(有或没有一种或多种其它组件，例如淬灭剂)、放射性标记、用生物素标记(例如，生物素化)或化学发光标记。催化核酸的报告物底物也可以包括蛋白质或核酸酶，例如，共价地附着到它们的末端。
与MNAzymes使用的报告物底物可以是一般的报告物底物系统，通过容许容易的设计改变来创建识别不同目标的新的MNAzymes，其容许快速的分析开发。partzymes的底物臂部分和催化核心部分可以保持不变，仅有为新的目标所需的一个或多个partzymes的感受器臂部分的改变。提供一般底物序列，因而相同的底物可以被包括入多种不同目标的分析中。进一步地，相同的底物可以被包括入本文的各种实施方式的方法中，包括其中底物在溶液中游离的、或拴系在或附着于支持物的分析。一系列一般底物可以用于容许多个目标的同时检测的多路反应。使用一般底物的MNAzyme策略提供了相对于一些技术例如
或Beacons的主要优点，这些技术需要设计和使用对每个新的目标特异的探针。
如以下更详细描述地，MNAzymes在能够利用通用或一般报告物底物的某些实施方式中具有有益的性质。这种底物以当前优选的结构在附图12中示出，其中报告物底物包含可检测部分和淬灭剂部分。淬灭剂部分适合于减少或消除来自底物的可检测部分的可检测信号，直到底物被MNAzyme裂解。例如，淬灭剂部分可以包含“Black Hole Quencher 1”(BHQ1)或“Black Hole Quencher 2”(BHQ2)。因而，MNAzyme在可检测部分和淬灭剂部分之间裂解报告物底物，容许两个部分在溶液中分离，从而随着淬灭剂部分远离于可检测部分、或有效地从可检测部分的局部环境中除去，容许可检测信号出现或提高。
通过设计MNAzyme的组件partzymes，得以使用一般或通用报告物底物。通过仅改变partzymes的感受器臂部分，但是通过裂解不变的底物臂，可以设计出特异于多种目标的每一种的大量MNAzymes，所有这些都利用通用报告物底物用于检测。技术人员将理解，就消除针对每个目标定制的或独特的底物需要而言它所提供的益处。每个新的目标仅需要一个或多个感受器臂部分的一个或多个改变；底物臂部分和催化核心部分可以保持恒定。因而，使用MNAzyme，单个报告物底物可以用于单个目标，使用改变的MNAzymes，可以用于一系列分析中的多个目标。多种报告物底物容许多路化，来在单个分析中使用多种MNAzymes检测多个目标，一种MNAzyme针对一个目标。利用MNAzymes的这种多路方法在溶液中或附着在支持系统上容易地实现。本文包括：如本文所述的，在涉及将一种或多种报告物底物、或MNAzyme partzymes或组装辅助物、或其它的酶活性连接到支持物的系统中，可以实现多路的分析。
可以通过提高可检测效果的MNAzyme来修饰底物。在检测过程中，通过MNAzyme的报告物底物修饰可以包括，例如，裂解、连接、卟啉金属取代、碳-碳键、酯键或酰胺键的形成。作为通过MNAzyme的报告物底物修饰的结果，产生了可检测的效果，由此该效果的量是想要测量的目标的数量的指示。可检测效果可以通过多种方法来测量，包括荧光光谱、表面胞质团共振、质谱法、NMR、电子自旋共振、偏振荧光光谱、园二色性、免疫分析、层析、辐射测量、光度测量、闪烁照相术、电子方法、UV、可见光或红外光谱、酶学方法或其任何组合。
在一个实施方式中，报告物底物是SEQ ID NO：17-18，它们各自用不同的荧光基团标记。具有SEQ ID NO：17的底物在5＇末端用6-FAM部分、以及在3＇末端用BHQ部分来末端标记，其被称为SubBi-6-FB。这种底物SEQ ID NO：17对于跟踪未标签化的野生型HXB2D WT扩增子的积累是有用的，可以用492nm的激发在516nm处监测这种底物的裂解。具有SEQ ID NO：18的底物在5＇末端用6-JOE部分、以及在3＇末端用BHQ1部分来末端标记，其被称为SubBi-2-JB。底物SEQ ID NO：18对于跟踪标签化的HXB2D扩增子的积累是有用的，可以用535nm的激发在555nm处监测这种底物的裂解。
在表4中，列出了这些底物。小写字母的碱基代表RNA，大写字母的碱基代表DNA。
表4：报告物底物序列
| SEQ ID NO： | 按5＇到3＇方向列出的底物序列 | 名称 |
| 17 | ATCACGCCTCguTCCTCCCAG | SubBi-6-FB |
| 18 | AAGGTTTCCTCguCCCTGGGCA | SubBi-2-JB |
在进一步的实施方式中，报告物底物是SEQ ID NO：17-18和23，三种不同的报告物底物，它们每一种用不同的荧光基团标记。具有SEQID NO：17的底物在5＇末端用6-FAM部分、以及在3＇末端用BHQ部分来末端标记，其被称为SubBi-6-FB。这种底物SEQ ID NO：17对于跟踪未标签化的野生型HXB2D WT扩增子的积累是有用的，可以用492nm的激发在516nm处监测这种底物的裂解。具有SEQ ID NO：18的底物在5＇末端用6-JOE部分、以及在3＇末端用BHQ1部分来末端标记，其被称为SubBi-2-JB。底物SEQ ID NO：18对于跟踪标签化的HXB2D扩增子的积累是有用的，可以用535nm的激发在555nm处监测这种底物的裂解。具有SEQ ID NO：23的底物在5＇末端用Quasar 670部分、以及在3＇末端用BHQ2部分来末端标记，其被称为SubBi-3-Q6B2。做为选择，具有SEQ ID NO：23的底物可以在5＇末端用TAMRA部分、以及在3＇末端用BHQ2部分来末端标记。这种底物SEQ ID NO：23对于跟踪RPLPO扩增子的积累是有用的，可以用635nm的激发在665nm处监测这种底物的裂解。这三种底物的序列在表5中列出。小写字母的碱基代表RNA，大写字母的碱基代表DNA。
表5：报告物底物序列
| SEQ ID NO： | 按5＇到3＇方向列出的底物序列 | 名称 |
| 17 | ATCACGCCTCguTCCTCCCAG | SubBi-6-FB |
| 18 | AAGGTTTCCTCguCCCTGGGCA | SubBi-2-JB |
| 23 | CAGCACAACCguCACCAACCG | SubBi-3-Q6B2 |
在本发明的一个实施方式中，MNAzyme结构基于包括10:23和8:17DNAzymes的DNAzymes。在各种实施方式中，MNAzymes包含核糖核苷酸碱基和脱氧核糖核苷酸碱基。在更优选的实施方式中，MNAzyme结构至少部分地基于DNAzyme的结构。在其它一些优选的实施方式中，MNAzymes至少包含某些脱氧核糖核苷酸碱基或其类似物。在更优选的实施方式中，MNAzyme的催化核心包含一个或多个脱氧核糖核苷酸碱基或其类似物。在更优选的实施方式中，一个或多个脱氧核糖核苷酸碱基或其类似物被包括在底物的催化作用中。在其它一些实施方式中，在催化核心内的至少一个脱氧核糖核苷酸碱基或它的类似物改善了催化活性。在又另外的实施方式中，相对于没有存在所述脱氧核糖核苷酸碱基的可比较MNAzyme而言，为了以可测量的速率发生催化作用，对于在MNAzyme的催化核心中的至少一个脱氧核糖核苷酸碱基或它的类似物存在着严格的要求。
MNAzymes可以含有一个或多个取代，例如本领域技术人员公知的类似物、衍生物、修饰或改变的碱基、核糖核苷酸、糖类或磷酸盐主干的改变、各种删除、插入、取代、二重化或其它修饰或这些的任何组合。这样的修饰、取代、删除、插入等等可以在感受器和/或底物臂中和/或在催化核心部分中进行，从而分子保持催化活性。对结合底物或组装辅助物的臂的取代或修饰可以是良好耐受性的，实际上是容许分子针对不同的底物/组装辅助物的修整的基础。例如，感受器臂的修饰将容许对不同的组装辅助物的适应，而底物臂的修饰将容许对不同底物的适应。
熟练的技术人员将理解，MNAzymes包括脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸，或者甚至两者。包含至少一个、以及优选的所有的脱氧核糖核苷酸组件寡核苷酸的那些MNAzymes是当前优选的。还优选的是，在MNAzyme的催化核心内包含至少一个脱氧核糖核苷酸碱基、或它的类似物的那些MNAzyme。再更优选的是其中这样的碱基是催化活性所需的那些实施方式。
MNAzyme结构的基本实例在附图12中描绘。显示的结构包含partzyme A和partzyme B，其具有与MNAzyme组装辅助物分子配对的碱基，在此简略显示为目标。通过与目标相互作用Partzymes A和B容许催化核心变得紧密接近从而形成。MNAzyme的底物臂相互作用于或碱基配对于底物，在此称为报告物底物。因而，MNAzyme自我组装，这种过程通过MNAzyme组装辅助物分子目标的存在被便利化。在不存在目标时，将不形成MNAzyme。底物的修饰(在这种情况中，裂解)被在由直立箭头指出的底物内的MNAzyme裂解位点处的MNAzyme的催化核心所催化。在本发明的这个特定实施方式中的底物包含具有可检测信号的可检测部分，例如荧光基团F，以及通过淬灭剂Q的作用对可检测信号F具有淬灭效果的淬灭剂部分。在MNAzyme裂解位点处裂解时，存在着可检测信号的大幅增加，在此处是荧光，其是容易检测和定量的。
更具体地，附图12中显示partzyme A和partzyme B各自包含底物臂部分、催化核心部分和感受器臂部分。在存在目标的情况下，partzymeA和partzyme B的感受器臂部分可以开始与目标的互补部分，例如DNA或RNA序列杂交以及碱基配对。在以这种方式接触目标时，MNAzyme自我组装形成催化核心，其可以修饰被底物臂结合的底物。优选地，MNAzyme的存在通过它的催化活性的检出或测出来检测。这样组装的MNAzyme的底物臂可以啮合底物，例如，附图12中显示的报告物底物，通过底物臂和底物上的互补序列的相互作用。一旦底物这样啮合与底物臂，催化核心可以促进底物的修饰(例如，裂解)，其随后可以被直接地或间接地测量。
在一个实施方式中，本发明提供了被设计以检测两种不同的目标扩增子的partzymes，所述目标扩增子即从未标签化的野生型HXB2D WT扩增的那些，以及从HXB2D标签化的序列扩增的那些。在以下序列中，下划线的碱基形成了组装的MNAzyme的催化核心的部分，粗体的碱基与目标杂交，斜体的碱基与底物杂交。在序列的3＇末端的P代表3＇磷酸基团。
表6：被设计以检测两种不同的目标扩增子的partzymes：即扩增的未标签化的野生型HXB2D WT，以及扩增的HXB2D标签化的序列。
| SEQ ID NO： | 按5＇到3＇方向列出的partzyme序列 | 名称 |
| 13 | ATATCTCCTCCTCCAGGTACAACGAGAGGCGTGAT-P | Partzyme A HXB2D(野生型)WTA4/6-P |
| 14 | CTGGGAGGAAGGCTAGCTCTGAAGATCTCGGACTCATT-P | Partzyme B HXB2D(野生型)WTB5/6-P |
| 15 | CTTCTCCAATTGTCCCTCATACAACGAGAGGAAACCTT-P | Partzyme A HXB2D(标签化的)TgA4/2-P |
| 16 | TGCCCAGGGAGGCTAGCTGTCACCTCCTCCGGG-P | Partzyme B HXB2D(标签化的)TgB5/2·P |
在进一步的实施方式中，本发明提供了被设计来检测三种不同的目标扩增子的partzymes，即，从未标签化的野生型HXB2D WT序列扩增的那些、从HXB2D标签化的序列扩增的那些、以及从RPLPO基因扩增的那些。在以下序列中，下划线的碱基形成了组装的MNAzyme的催化核心的部分，粗体的碱基与目标杂交，斜体的碱基1与底物杂交。在序列的3＇末端的P代表3＇磷酸基团。
表7：被设计以检测三种不同的目标扩增子的partzymes：即扩增的未标签化的HXB2D WT序列、扩增的HXB2D标签化的序列、以及扩增的RPLPO序列。
| SEQ ID NO： | 按5＇到3＇方向列出的partzyme序列 | 名称 |
| 13 | ATATCTCCTCCTCCAGGTACAACGAGAGGCGTGAT-P | Partzyme A HXB2D(野生型)WTA4/6-P |
| 14 | CTGGGAGGAAGGCTAGCTCTGAAGATCTCGGACTCATT-P | Partzyme B HXB2D(野生型)WTB5/6-P |
| 15 | CTTCTCCAATTGTCCCTCATACAACGAGAGGAAACCTT-P | Partzyme A HXB2D(标签化的)TgA4/2-P |
| 16 | TGCCCAGGGAGGCTAGCTGTCACCTCCTCCGGG-P | Partzyme B HXB2D(标签化的)TgB5/2-P |
| 21 | CAAACGAGTCCTGGCCTTGTCTACAACGAGGTTGTGCTG-P | Partzyme A RPLPORO5A4/3-P |
| 22 | CGGTTGGTGAGGCTAGCTGTGGAGACGGATTACACCTTC-P | Partzyme B RPLPORO5B5/3-P |
多种MNAzymes在本发明中是有用的，因为它们容许检测相差少至一个核苷酸的相关的序列。类似地，独特的报告物底物是检测几种目标的每一种所需的。在某些情况下，为了使该方法多路化，需要为每个报告物底物使用不同的或独特的可检测信号来便于该方法的设计。
根据用于扩增核酸(即，DNA或RNA)的操作来扩增目标核酸，包括本发明的重组病毒的标签化的或相应的未标签化的区域。优选地，使用体外扩增的标准方法。在扩增期间产生的扩增子充当MNAzyme的目标，由此，MNAzyme活性是目标存在的指示。本领域技术人员应当理解，这种监测可以在允许扩增和MNAzyme组装和催化活性的条件下在单个容器中进行，或者，通过在最后时或扩增反应的过程中除去样品，MNAzyme分析可以在扩增之后、或在整个扩增中的时间点进行。
还应当理解，组合目标扩增与催化核酸活性的方法或方案可能需要特定的反应条件。优选地，反应条件适合于聚合酶活性(用于扩增)以及底物的催化性核酸修饰(用于检测)。对于DNAzymes已经描述了例如在PCR期间用于在高温下测定同时的催化活性和聚合酶活性的条件的方案(Impey et al.，2000)。在这个文章中展现了包括臂长度、缓冲液、温度、二价离子浓度和添加剂作用的因素的影响。DNA酶适合于与体外扩增策略一起使用。例如，通过在扩增期间本领域高温，它们不被不可逆地变性。
在本发明的一个实施方式中，根据一种方法进行定量扩增，用于检测至少一种目标或组装辅助物的存在，其中目标或组装辅助物是如上所述的重组病毒的一个标签化的或相应的未标签化的区域，所述方法包括：
a)提供两种或更多种寡核苷酸组件，其中至少第一寡核苷酸组件和第二寡核苷酸组件在存在至少第一组装辅助物的情况下自我组装来形成至少第一催化活性多组件核酸酶(MNAzyme)；
b)提供至少第一报告物底物，所述第一底物能够被所述第一MNAzyme修饰，其中通过所述MNAzyme的所述底物的所述修饰提供了可检测效果；
c)在允许以下的条件下，使所述两种或更多种寡核苷酸组件与可能含有所述至少第一组装辅助物的样品接触：
(1)所述至少第一MNAzyme的自我组装，和
(2)所述至少第一MNAzyme的催化活性；以及
d)检测所述可检测的效果。
检测至少一个目标或组装辅助物的存在的方法可以进一步包括提供至少第三和第四寡核苷酸组件，其中所述至少第三和至少第四寡核苷酸组件能够在存在至少一个其它的目标或组装辅助物的情况下自我组装来形成至少一个其它的催化活性MNAzyme，其中至少一个其它的报告物底物存在于所述样品中，所述其它的报告物底物能够仅被所述其它的MNAzyme修饰，其中所述修饰提供了所述其它的可检测效果。
病毒复制能力的测定
获得对于标签化和/或未标签化的重组病毒的随时间的阈值循环(Ct)值的标准曲线，并标绘在标准曲线上，一般地从对照或持家基因获得，在给定病毒群体中或在给定环境下的给定标签化物种的比例被显示和计算。
本发明的方案和产物可以用于各种诊断的、临床的、毒理学的研究和法医目的，包括药物发现、设计患者治疗、药物效力测定以及患者管理。当前的方法可以与其它分析一起使用。结果可以在计算机模型和数据库中实施。
另外，本发明的方案和产品还允许监视抗HIV化合物对病毒适应度的影响。
病毒适应度分析可以用作高通量筛选分析或包含高通量筛选分析的部分，所述分析中评估多种HIV毒株和环境组合。来自病毒适应度实验的结果可以用于开发在存在其它HIV毒株和环境因素的情况下复制能力水平的数据库。
本发明还提供了下述试剂盒。所述试剂盒可以用于任何在此描述的方法。在一个实施方式中，所述试剂盒可以用于测定在一定环境中两种或更多种目标HIV病毒的复制能力。本发明的试剂盒可以包含标签化的HIV质粒载体、未标签化的HIV质粒载体、引物、和探针。在另一个实施方式中，所述试剂盒包含细胞系。在本发明的一个实施方式中，所述试剂盒包含选自SEQ ID NO：1-12、19-20和24-25的一种或多种引物；和/或根据本发明的标签化的HIV质粒载体，以及任选的未标签化的HIVHXB2D质粒载体。所述试剂盒可以进一步包含环境成分。做为选择，所述试剂盒还可以包含partzymes SEQ ID NO：13-16以及21-22。
本发明的方法的步骤的顺序可以改变。技术人员将能够确定在步骤顺序上什么改变是合适的。根据在此公开的本发明的说明书和实践的考虑，本发明的其它实施方式对于本领域技术人员是显而易见的。说明书和实施例意欲被认为仅是示例性的，而保护范围由权利要求表明。
以下的非限制性实例帮助阐述本发明的原则。
实验部分
缩写
MNAzyme：多组分核酸酶，或多部分核酸酶；
DNAzyme：脱氧核糖核酸酶；
RNAzyme：核糖核酸酶，或核酶；
PCR：聚合酶链式反应；
dH2O：去离子蒸馏水；
F：荧光基团；
Q：淬灭剂；
JOE或6-JOE：6-羧基-4’，5’-二氯-2’，7’-二甲氧基荧光素；
FAM或6-FAM：6-羰基荧光素；
BHQ1：Black Hole Quencher 1；
BHQ2：Black Hole Quencher 2.
实施例1
根据在EP877937、EP1283272或EP1285971中解释的方案制备重组病毒。具有标签化的包膜基因的病毒是质粒载体pGEM-HIVdelGPRT_tagged(env)和扩增子GPRT的重组的结果。具有标签化整合酶序列的病毒是质粒载体pGEM-HIVdelGPRT_tagged(int)和扩增子GPRT的重组的结果。具有标签化序列的病毒是质粒载体pGEM-HIVdelGPRT和扩增子GPRT的重组的结果。扩增子GPRT是指由gag基因的最后81个氨基酸、蛋白酶基因的完整序列、逆转录酶基因的p51部分组成的序列。GPRT扩增子从突变病毒毒株和从WT病毒毒株获得。来自突变毒株的GPRT扩增子与标签化的质粒载体重组。来自WT毒株的GPRT扩增子与未标签化的质粒载体重组。来自突变毒株的GPRT扩增子与未标签化质粒载体的重组，以及来自WT毒株的GPRT扩增子与标签化的质粒载体的重组是另一种选择。
质粒载体pGEM-HIVdelGPRT_tagged(env)的序列被SEQ ID NO：13包括。质粒载体pGEM-HIVdelGPRT_tagged(int)的序列被SEQ IDNO：14包括。质粒载体pGEM-HIVdelGPRT的序列，即，没有标签，被SEQ ID NO：15包括。
以下的包膜基因序列在下划线的区域中显示了已经导入沉默突变(以粗体和小写字母标记)的地方：
标签化的包膜基因(SEQ ID N°26)：
ATGAGAGTGAAGGAGAAATATCAGCACTTGTGGAGATGGGGGTGGAGATGGGGCACCATGCTCCTTGGGATGTTGATGATCTGTAGTGCTACAGAAAAATTGTGGGTCACAGTCTATTATGGGGTACCTGTGTGGAAGGAAGCAACCACCACTCTATTTTGTGCATCAGATGCTAAAGCATATGATACAGAGGTACATAATGTTTGGGCCACACATGCCTGTGTACCCACAGACCCCAACCCACAAGAAGTAGTATTGGTAAATGTGACAGAAAATTTTAACATGTGGAAAAATGACATGGTAGAACAGATGCATGAGGATATAATCAGTTTATGGGATCAAAGCCTAAAGCCATGTGTAAAATTAACCCCACTCTGTGTTAGTTTAAAGTGCACTGATTTGAAGAATGATACTAATACCAATAGTAGTAGCGGGAGAATGATAATGGAGAAAGGAGAGATAAAAAACTGCTCTTTCAATATCAGCACAAGCATAAGAGGTAAGGTGCAGAAAGAATATGCATTTTTTTATAAACTTGATATAATACCAATAGATAATGATACTACCAGCTATAAGTTGACAAGTTGTAACACCTCAGTCATTACACAGGCCTGTCCAAAGGTATCCTTTGAGCCAATTCCCATACATTATTGTGCCCCGGCTGGTTTTGCGATTCTAAAATGTAATAATAAGACGTTCAATGGAACAGGACCATGTACAAATGTCAGCACAGTACAATGTACACATGGAATTAGGCCAGTAGTATCAACTCAACTGCTGTTAAATGGCAGTCTAGCAGAAGAAGAGGTAGTAATTAGATCTGTCAATTTCACGGACAATGCTAAAACCATAATAGTACAGCTGAACACATCTGTAGAAATTAATTGTACAAGACCCAACAACAATACAAGAAAAAGAATCCGTATCCAGAGAGGACCAGGGAGAGCATTTGTTACAATAGGAAAAATAGGAAATATGAGACAAGCACATTGTAACATTAGTAGAGCAAAATGGAATAACACTTTAAAACAGATAGCTAGCAAATTAAGAGAACAATTTGGAAATAATAAAACAATAATCTTTAAGCAATCCTCAGGAGGGGACCCAGAAATTGTAACGCACAGTTTTAATTGTGGAGGGGAATTTTTCTACTGTAATTCAACACAACTGTTTAATAGTACTTGGTTTAATAGTACTTGGAGTACTGAAGGGTCAAATAACACTGAAGGAAGTGACACAATCACCCTCCCATGCAGAATAAAACAAATTATAAACATGTGGCAGAAAGTAGGAAAAGCAATGTATGCCCCTCCCATCAGTGGACAAATTAGATGTTCATCAAATATTACAGGGCTGCTATTAACAAGAGATGGTGGTAATAGCAACAATGAGTCCGAGATCTTCAGgCCcGGAGG AGGtGAcATGAGGGACAATTGGAGAAGTGAATTATATAAATATAAAGTAGTAAAAATTGAACCATTAGGAGTAGCACCCACCAAGGCAAAGAGAAGAGTGGTGCAGAGAGAAAAAAGAGCAGTGGGAATAGGAGCTTTGTTCCTTGGGTTCTTGGGAGCAGCAGGAAGCACTATGGGCGCAGCGTCAATGACGCTGACGGTACAGGCCAGACAATTATTGTCTGGTATAGTGCAGCAGCAGAACAATTTGCTGAGGGCTATTGAGGCGCAACAGCATCTGTTGCAACTCACAGTCTGGGGCATCAAGCAGCTCCAGGCAAGAATCCTGGCTGTGGAAAGATACCTAAAGGATCAACAGCTCCTGGGGATTTGGGGTTGCTCTGGAAAACTCATTTGCACCACTGCTGTGCCTTGGAATGCTAGTTGGAGTAATAAATCTCTGGAACAGATTTGGAATCACACGACCTGGATGGAGTGGGACAGAGAAATTAACAATTACACAAGCTTAATACACTCCTTAATTGAAGAATCGCAAAACCAGCAAGAAAAGAATGAACAAGAATTATTGGAATTAGATAAATGGGCAAGTTTGTGGAATTGGTTTAACATAACAAATTGGCTGTGGTATATAAAATTATTCATAATGATAGTAGGAGGCTTGGTAGGTTTAAGAATAGTTTTTGCTGTACTTTCTATAGTGAATAGAGTTAGGCAGGGATATTCACCATTATCGTTTCAGACCCACCTCCCAACCCCGAGGGGACCCGACAGGCCCGAAGGAATAGAAGAAGAAGGTGGAGAGAGAGACAGAGACAGATCCATTCGATTAGTGAACGGATCCTTGGCACTTATCTGGGACGATCTGCGGAGCCTGTGCCTCTTCAGCTACCACCGCTTGAGAGACTTACTCTTGATTGTAACGAGGATTGTGGAACTTCTGGGACGCAGGGGGTGGGAAGCCCTCAAATATTGGTGGAATCTCCTACAGTATTGGAGTCAGGAACTAAAGAATAGTGCTGTTAGCTTGCTCAATGCCACAGCCATAGCAGTAGCTGAGGGGACAGATAGGGTTATAGAAGTAGTACAAGGAGCTTGTAGAGCTATTCGCCACATACCTAGAAGAATAAGACAGGGCTTGGAAAGGATTTTGCTATAA
以下的整合酶编码区域的序列在下划线的区域中显示了已经导入沉默突变(以粗体和小写字母标记)的地方：
标签化的整合酶编码序列(SEQ ID No 27)：
TTTTTAGATGGAATAGATAAGGCCCAAGATGAACATGAGAAATATCACAGTAATTGGAGAGCAATGGCTAGTGATTTTAACCTGCCACCTGTAGTAGCAAAAGAAATAGTAGCCAGCTGTGATAAATGTCAGCTAAAAGGAGAAGCCATGCATGGACAAGTAGACTGTAGTCCAGGAATATGGCAACTAGATTGTACACATTTAGAAGGAAAAGTTATCCTGGTAGCAGTTCATGTAGCCAGTGGATATATAGAAGCAGAAGTTATTCCAGCAGAAACAGGGCAGGAAACAGCATATTTTCTTTTAAAATTAGCAGGAAGATGGCCAGTAAAAACAATACATACAGACAATGGCAGCAATTTCACCAGTGCTACGGTTAAGGCCGCCTGTTGGTGGGCGGGAATCAAGCAGGAATTTGGAATTCCCTACAATCCCCAAAGTCAAGGAGTAGTAGAATCTATGAATAAAGAATTAAAGAAAATTATAGGACAGGTAAGAGATCAGGCTGAACATCTTAAGACAGCAGTACAAATGGCAGTATTCATCCACAATTTTAAAAGAAAAGGGGGGATTGGGGGGTACAGTGCAGGGGAAAGAATAGTAGACATAATAGCAACAGACATACAAACTAAAGAATTACAAAAACAAATTACAAAAATTCAAAATTTTCGGGTTTATTACAGGGACtcacGtAATCCACTTTGGAAAGGACCAGCAAAGCTCCTCTGGAAAGGTGAAGGGGCAGTAGTAATACAAGATAATAGTGACATAAAAGTAGTGCCAAGAAGAAAAGCAAAGATCATTAGGGATTATGGAAAACAGATGGCAGGTGATGATTGTGTGGCAAGTAGACAGGATGAGGATTAG
一旦产生重组病毒，制备含有7.5 x 106个MT4-LTR-EGFP细胞的六个试管。然后，根据下式制备8ml重组病毒预稀释物(MOI：感染复数)：
0.001MOI的最终稀释物/20＝预稀释因数
根据下表8，在下述条件下将重组病毒添加到重悬浮的细胞中：
表8
| 比例Tag/WT | 标签病毒的数量(mL)(HIV HXB2D-标签化的) | WT病毒的数量(mL)(HIV HXB2D WT) |
| 100/0 | 2.5 | 0 |
| 0/100 | 0 | 2.5 |
| 80/20 | 2 | 0.5 |
| 50/50 | 1.25 | 1.25 |
| 20/80 | 0.5 | 2 |
| 对照 | 0 | 0 |
病毒和细胞的混合物在37℃孵育30分钟，随后在1200×g旋转孵育10分钟。除去上清液，用培养基洗涤细胞。试管在200×g离心5分钟，团粒重悬浮在培养基中。将重悬浮的细胞添加到含有培养基的培养烧瓶中，并在37℃孵育。仔细地记录时间。
每24小时之后，对烧瓶记录致细胞病变效果和荧光。在0小时(洗涤步骤后)、15小时、24小时、39小时、48小时、63小时、72小时、和87小时，收集6ml重悬浮的细胞培养物。通过离心回收上清液和细胞：在1800×g 10分钟之后，收集2×1.5ml上清液。
将400μl PBS添加到上清液的其余部分中，来重悬浮细胞团粒。重悬浮的细胞分到2个试管中，上清液和细胞都保持在-80℃。
根据供应商提供的方案，使用来自Invitek(Westburg)的InvisorbSpin Blood Mini试剂盒从细胞团提取DNA。用分光光度计测量DNA浓度，将DNA浓度调节到100ng/μl。样品然后保存在-20℃。
在实时分析中测试2μl保存的样品。将DNA添加到实时PCR混合物中，并置于PCR仪中。实时PCR混合物含有野生型引物混合物、通用底物FAM、标签引物混合物、通用底物JOE、对照引物混合物、通用底物FAMTAM、具有FAMTAM的BD Qtaq PCR缓冲液、PCR级水以及BD Qtaq DNA聚合酶混合物。
2μl DNA模板与实时PCR混合物的混合物置于热循环仪(ABI7700)中，采用以下程序：
产生的Ct(阈值循环)值被用于测定标签病毒和野生型病毒的复制能力。
在附图5中，在MT4细胞中在各种相关的输入浓度下HIV HXB2DWT和标签化的HIV HXB2D的病毒生长的比较。进一步的在附图6中，描绘了来自使用双标记共感染的MT4细胞的HIV HXB2D和标签化的HIV HXB2D DNA的检测，其中标签化的引物连接到JOE探针，未标签化的野生型引物连接到FAM探针。
在附图7a、7b和7c中，对用于共感染MT4细胞的模板HIV HXB2D和标签化的HIV HXB2D DNA显示了三条扩增曲线。使用的引物是SEQID NO：7和6，使用的标记是：
B-FAM 针对HIV HXB2D DNA(附图7a)
D-JOE 针对标签化的HIV HXB2D DNA(附图7b)
TAMRA 针对持家基因(GAPD)(附图7C)
在附图8a、8b和8c中，对用于共感染MT4细胞的模板HIV HXB2D和标签化的HIV HXB2D DNA显示了三条扩增曲线。使用的引物是SEQID NO：5和6，使用的标记是：
B-FAM 针对HIV HXB2D DNA(附图8a)
D-JOE 针对标签化的HIV HXB2D DNA(附图8b)
TAMRA 针对持家基因(GAPD)(附图8c)
在附图9a、9b和9c中，对用于共感染MT4细胞的模板HIV HXB2D和标签化的HIV HXB2D DNA显示了三条扩增曲线。使用的引物是SEQID NO：8和9，使用的标记是：
B-FAM 针对HIV HXB2D DNA(附图9a)
D-JOE 针对标签化的HIV HXB2D DNA(附图9b)
TAMRA 针对持家基因(GAPD)(附图9c)
在附图10a、10b和10c中，对用于共感染MT4细胞的模板HIVHXB2D和标签化的HIV HXB2D DNA显示了三条扩增曲线。使用的引物是SEQ ID NO：5、6、7、8和9，使用的标记是：
B-FAM 针对HIV HXB2D DNA(附图10a)
D-JOE 针对标签化的HIV HXB2D DNA(附图10b)
TAMRA 针对持家基因(GAPD)(附图10c)
在附图11中提供了附图7-10中显示的扩增的材料的终点凝胶电泳的图片。图片清楚地显示了，已经开发了可行的三联分析，其能够区分未标签化的WT和标签化的HIV DNA载体模板(即，HIV HXB2D vs.标签化的HIV HXB2D DNA)，甚至是在存在基因组DNA背景的情况下。PCR效力在90％和110％之间，数据拟合标准曲线的相关系数是≥0.99。在1-和n-plex之间的ΔCt(即，阈值循环的变异)是≤1循环。
实施例2：MNAzymes用于经由二联实时PCR来定量HIV核酸序列
的用途
多组分核酸酶(MNAzymes)含(i)特异性识别并结合组装辅助物，例如目标核酸的感受器区域；(ii)催化核心区域；和(iii)结合底物的底物区域。MNAzymes由两个(或更多个)独立的寡核苷酸“partzymes”组成，所述“partzymes”仅在存在组装辅助物的情况下形成活性酶。催化活性的MNAzyme可以在荧光基团和淬灭剂染料配对之间裂解核酸报告物底物，从而产生荧光信号。组装辅助物的实例包括目标被分析物，例如DNA或RNA序列。MNAzymes可以用于容许检测通过聚合酶链式反应(PCR)或其它体外扩增技术产生的目标DNA扩增子。进一步地，利用MNAzymes的实时PCR检测容许测定反应中起初存在的目标的数量。
开发了利用两种MNAzymes来便于实时监测的二联PCR分析，用于对(i)未标签化的HIV HXB2D WT序列和(ii)被修饰以含有四个沉默突变(标签)的标签化的HIV HXB2D序列进行同时检测和定量。设计标签碱基，从而它们不影响复制能力但是容许标签化的HXB2D序列和未标签化的HXB2D WT序列之间的辨别(附图14)。标签的不存在或存在分别提供了“野生型”序列(WT)或通过对感兴趣的HIV目标病毒扩增衍生的那些序列的存在的代替性标记物，其位于未标签化或标签化的区域的上游。
2.1.用于二联PCR分析的Partzyme寡核苷酸
多个目标可以在包含多种独特的MNAzymes的一个多路化反应中同时检测。每种MNAzyme具有特异于一个目标的感受器臂，和特异于一系列一般报告物底物的独特成员的底物臂，所述报告物底物每一种用不同的荧光基团来标记。在以下的实施例中，设计MNAzymes以检测两种不同的目标扩增子，即，从未标签化的野生型HXB2D WT扩增的那些，以及从HXB2D标签化的序列扩增的那些。
针对每个目标的partzymes A and B的序列在以下从5＇到3＇列出。在以下序列中，下划线的碱基形成了组装的MNAzyme的催化核心的部分，粗体的碱基与目标杂交，斜体的碱基与底物杂交。在每个序列末端的P代表3＇磷酸基团。
表9
| SEQ ID NO： | 按5＇到3＇方向列出的partzyme序列 | 名称 |
| 13 | ATATCTCCTCCTCCAGGTACAACGAGAGGCGTGAT-P | Partzyme A HXB2D(野生型)WTA4/6-P |
| 14 | CTGGGAGGAAGGCTAGCTCTGAAGATCTCGGACTCATT-P | Partzyme B HXB2D(野生型)WTB5/6-P |
| 15 | CTTCTCCAATTGTCCCTCATACAACGAGAGGAAACCTT-P | Partzyme A HXB2D(标签化的)TgA4/2-P |
| 16 | TGCCCAGGGAGGCTAGCTGTCACCTCCTCCGGG-P | Partzyme B HXB2D(标签化的)TgB5/2·P |
2.2.报告物底物
在这个实施例中，使用了两种不同的报告物底物，每一种用不同的荧光基团标记。底物的序列以下从5＇向3＇书写。在当前的实施例中，第一底物SubBi-6在5＇末端用6-FAM部分、以及在3＇末端用BHQ部分来末端标记，其被称为SubBi-6-FB。底物SubBi-6-FB对于跟踪未标签化的HXB2D WT扩增子的积累是有用的，可以用492nm的激发在516nm处监测SubBi-6-FB的裂解。第二底物SubBi-2在5＇末端用6-JOE部分、以及在3＇末端用BHQ1部分来末端标记，其被称为SubBi-2-JB。底物SubBi-2-JB对于跟踪HXB2D标签化的扩增子的积累是有用的，可以用535nm的激发在555nm处监测SubBi-2-JB的裂解。小写字母的碱基代表RNA，大写字母的碱基代表DNA。
表10
| SEQ ID NO： | 按5＇到3＇方向列出的底物序列 | 名称 |
| 17 | ATCACGCCTCguTCCTCCCAG | SubBi-6-FB |
| 18 | AAGGTTTCCTCguCCCTGGGCA | SubBi-2-JB |
2.3.用于目标序列的扩增的PCR引物
引物5HIV和3HIV被用于野生型和标签化的目标HXB2D序列的扩增。通过PCR使用以下列出的寡核苷酸PCR引物产生扩增子。
表11
| SEQ ID NO： | 按5＇到3＇方向列出的引物序列 | 名称 |
| 19(正向) | ATTAACAAGAGATGGTGGTAA | 5HIV |
| 20(反向) | GTGCTACTCCTAATGGTTCAA | 3HIV |
2.4.反应成分：对目标序列的扩增和定量
在25μL的总反应体积中进行对目标序列的实时扩增和定量。所有的反应在Mx3005PTM QPCR系统(Stratagene)中进行。循环参数是，95℃ 7分钟，95℃ 15秒和60℃ 30秒(每个循环温度降低1℃)的10个循环，最后95℃ 15秒和50℃ 120秒的40个循环。反应含有40nM的3HIV和400nM的5HIV，200nM的每种partzyme(WTA4/6-P、WTB5/6-P、TgA4/2-P和TgB5/2-P)、200nM的每种底物(SubBi-6-FB和SubBi-2-JB)、7mM MgCl2、200μM每种dNTP，10单位Rnasin(Promega)、1×Immobuffer(Bioline)和1单位的Immolase(Bioline)。如以下表12中表明的，双份的反应含有或缺少质粒或基因组DNA模板。
表12：反应中存在的目标DNA序列
2.5.结果：对未标签化的和标签化的目标序列的同时扩增以及使用
目标特异性MNAzymes经由两种不同报告物底物裂解进行的检测
通过监视由于SubBi-6-FB被MNAzyme1(包含partzymes WTA4/6-P和WTB5/6-P)裂解在FAM上荧光的提高，实时地检测和定量未标签化的HXB2D WT序列。MNAzyme 1仅在存在合适的组装辅助物的情况下形成，即由HXB2D WT质粒或原病毒HXB2D WT目标序列的扩增(以下表13和14)产生的扩增子。在不存在HXB2D WT质粒或原病毒DNA的情况下，在FAM通道上随着时间没有荧光信号的提高。进一步的，在存在单独的来自标签化的原病毒DNA的扩增子的情况下，在FAM通道上随着时间没有荧光信号的提高。
通过监视由于SubBi-2-JB被MNAzyme2(包含partzymes TgA4/2-P和TgB5/2-P)裂解在JOE上荧光的提高，实时地检测和定量标签化的HXB2D序列。MNAzyme 2仅在存在合适的组装辅助物的情况下形成，即由标签化的HXB2D质粒或标签化的原病毒HXB2D目标序列的扩增(以下表13和14)产生的扩增子。在不存在标签化的质粒或原病毒HXB2D模板DNA的情况下，在JOE通道上随着时间没有荧光信号的提高。进一步的，在存在单独的来自未标签化的HXB2D WT原病毒DNA的扩增子的情况下，在JOE通道上随着时间没有荧光信号的提高。
通过相对于达到阈值荧光时的循环数(Ct)来对质粒浓度的log值进行绘图，对未标签化的和标签化的HXB2D质粒目标产生标准曲线。以下在表13中显示的每种已知数量(标准)的Ct值是两份反应的平均值。对未标签化的和标签化的目标序列显示了标准曲线的相关系数(R2)和斜率以及反应效率。
表13：对含有未标签化的野生型和标签化的HXB2D质粒的反应的分析
根据从未标签化的和标签化的HXB2D质粒产生的标准曲线，来估计MT-4基因组DNA混合物内的未标签化的WT和标签化的HXB2D原病毒的拷贝数(表14)。每种未标签化的和标签化的HXB2D原病毒序列的拷贝数被表示为总拷贝数(未标签化的加上标签化的原病毒序列)的百分比，将估计值与原始spiked MT-4混合物中的百分比相比较。
具有含100％未标签化的原病毒序列或100％标签化的原病毒序列的基因组MT-4的样品能被很容易地相互区分(表14)。在仅存在标签化的原病毒序列的情况下，随着时间过去MNAzyme 1没有产生荧光方面的背景提高。类似地，在仅存在未标签化的原病毒序列的情况下，随着时间过去MNAzyme 2没有产生荧光方面的背景提高。利用MNAzyme分析，未标签化序列的未标签化序列比标签化序列比例为80％、50％和20％的混合物分别被计算为含有77％、47％和21％的未标签化的序列。
表14：以各种百分比存在的未标签化的和标签化的原病毒DNA序列的扩增和检测的反应结果
这个实施例中的MNAzyme PCR反应容许同时检测和产生标准曲线，以用于在二联反应中定量未标签化的和标签化的核酸HXB2D序列。该分析容许辨别未标签化的和标签化的序列，反之亦然。进一步的，MNAzyme分析能够测定样品中存在的未标签化的和标签化的原病毒HXB2D DNA的绝对和相对数量。因而，MNAzyme PCR提供了在HIV病毒适应度分析中实时监测HIV-1序列的方法。
实施例3：MNAzymes用于经由三联实时PCR来定量HIV和对照核
酸序列的用途
开发利用三种MNAzymes来便于实时监测的三联PCR分析，用于对(i)未标签化的HIV HXB2D WT序列，(ii)被修饰以含有四个沉默突变(标签)的标签化的HIV HXB2D序列，和(iii)对照人类RPLPO基因进行同时检测和定量。设计标签碱基，从而它们不影响复制能力但是容许修饰的标签化HXB2D序列和未标签化的HXB2D WT序列之间的辨别。标签的不存在或存在分别提供了“野生型”WT序列或通过对感兴趣的HIV目标病毒扩增衍生的那些序列的存在的代替性标记物，其位于未标签化或标签化的区域的上游。
3.1.用于三联PCR分析的Partzyme寡核苷酸
多个目标可以在包含多种独特的MNAzymes的一个多路化反应中同时检测。每种MNAzyme具有特异于一个目标的感受器臂，和特异于一系列一般报告物底物的独特成员的底物臂，所述报告物底物每一种用不同的荧光基团来标记。在以下的实施例中，设计MNAzymes以检测三种不同的目标扩增子，即，从未标签化的HXB2WT扩增的那些，从标签化的HXB2D序列扩增的那些以及从RPLPO基因扩增的那些。
对于每个目标的partzymes A and B的序列在以下从5＇到3＇列出。在以下序列中，下划线的碱基形成了组装的MNAzyme的催化核心的部分，粗体的碱基与目标杂交，斜体的碱基与底物杂交。在序列末端的P代表3＇磷酸基团。
表15
| SEQ ID NO： | 按5＇到3＇方向列出的partzyme序列 | 名称 |
| 13 | ATATCTCCTCCTCCAGGTACAACGAGAGGCGTGAT-P | Partzyme A HXB2D(野生型)WTA4/6-P |
| 14 | CTGGGAGGAAGGCTAGCTCTGAAGATCTCGGACTCATT-P | Partzyme B HXB2D(野生型)WTB5/6-P |
| 15 | CTTCTCCAATTGTCCCTCATACAACGAGAGGAAACCTT-P | Partzyme A HXB2D(标签化的)TgA4/2·P |
| 16 | TGCCCAGGGAGGCTAGCTGTCACCTCCTCCGGG-P | Partzyme B HXB2D(标签化的)TgB5/2-P |
| 21 | CAAACGAGTCCTGGCCTTGTCTACAACG AGGTTGTGCTG-P | Partzyme A RPLPO RO5A4/3-P |
| 22 | CGGTTGGTGAGGCTAGCTGTGGAGACGGATTACACCTTC-P | Partzyme B RPLPO RO5B5/3-P |
3.2.报告物底物
在这个实施例中，使用了三种不同的报告物底物，每一种用不同的荧光基团标记。底物的序列以下从5＇向3＇书写。在当前的实施例中，第一底物SubBi-6在5＇末端用6-FAM部分、以及在3＇末端用BHQ部分来末端标记，其被称为SubBi-6-FB。底物SubBi-6-FB对于跟踪未标签化的野生型HXB2D WT扩增子的积累是有用的，可以用492nm的激发在516nm处监测SubBi-6-FB的裂解。第二底物SubBi-2在5＇末端用6-JOE部分、以及在3＇末端用BHQ1部分来末端标记，其被称为SubBi-2-JB。底物SubBi-2-JB对于跟踪标签化的HXB2D扩增子的积累是有用的，可以用535nm的激发在555nm处监测SubBi-2-JB的裂解。第三底物SubBi-3在5＇末端用Quasar 670部分、在3＇末端用BHQ2部分标记，其被称为SubBi-3-Q6B2。底物SubBi-3-Q6B2被用于监视RPLPO扩增子的积累，用635nm的激发在665nm处监测SubBi-3-Q6B2的裂解。三种底物的序列在以下列出。小写字母的碱基代表RNA，大写字母的碱基代表DNA。
表16
| SEQ ID NO： | 按5＇到3＇方向列出的底物序列 | 名称 |
| 17 | ATCACGCCTCguTCCTCCCAG | SubBi-6-FB |
| 18 | AAGGTTTCCTCguCCCTGGGCA | SubBi-2-JB |
| 23 | CAGCACAACCguCACCAACCG | SubBi-3-Q6B2 |
3.3.用于目标序列的扩增的PCR引物
引物5HIV和3HIV被用于对野生型和标签化的目标HXB2D序列进行扩增。引物5RO5和3 RO5被用于扩增人类基因组RPLPO基因。寡核苷酸PCR引物的序列在以下列出。
表17
| SEQ ID NO： | 按5＇到3＇方向列出的引物序列 | 名称 |
| 19(正向) | ATTAACAAGAGATGGTGGTAA | 5HIV |
| 20(反向) | GTGCTACTCCTAATGGTTCAA | 3HIV |
| 24(正向) | CATTCTATCATCAACGGGTA | 5RO5 |
| 25(反向) | CAAAGGCAGATGGATCAG | 3RO5 |
3.4.反应成分：目标序列的扩增和定量
目标序列的实时扩增和定量在25μL的总反应体积中进行。所有的反应在Mx3005PTM QPCR系统(Stratagene)中进行。循环参数是，95℃ 7分钟，95℃ 15秒和60℃ 30秒(每个循环温度降低1℃)的10个循环，最后95℃ 15秒和50℃ 120秒的40个循环。反应含有400nM的5HIV、40nM的3HIV、40nM的5RO5、200nM的5RO5、200nM的每种partzyme(WTA4/6-P、WTB5/6-P、TgA4/2-P、TgB5/2-P、RO5A4/3-P和RO5B5/3-P)、200nM的每种底物(SubBi-6-FB、SubBi-2-JB和SubBi-3-Q6B2)、7mM MgCl2、200μM每种dNTP，10单位Rnasin(Promega)、1×Immobuffer(Bioline)和1单位的Immolase(Bioline)。如下表18所示的，双份的反应含有或缺少质粒或基因组DNA模板。
表18：反应中存在的目标DNA序列
3.5.结果：同时扩增未标签化的野生型和标签化的目标HXB2D序
列以及对照RPLPO基因序列以及使用目标特异性MNAzymes经由三种
不同报告物底物裂解进行检测
通过监视由于SubBi-6-FB被MNAzyme1(包含partzymes WTA4/6-P和WTB5/6-P)裂解在FAM上荧光的提高，实时地检测和定量未标签化的HXB2D-WT序列。MNAzyme 1仅在存在合适的组装辅助物的情况下形成，即由未标签化的HXB2D WT质粒或未标签化的原病毒HXB2DWT目标序列的扩增(以下表19和20)产生的扩增子。在不存在未标签化的HXB2D WT质粒或原病毒DNA的情况下，在FAM通道上随着时间没有荧光信号的提高。进一步地，在存在单独的来自标签化的原病毒DNA的扩增子的情况下，在FAM通道上随着时间没有荧光信号的提高。
通过监视由于SubBi-2-JB被MNAzyme 2(包含partzymes TgA4/2-P和TgB5/2-P)裂解在JOE上荧光的提高，实时地检测和定量标签化的HXB2D序列。MNAzyme 2仅在存在合适的组装辅助物的情况下形成，即由标签化的HXB2D质粒或标签化的原病毒HXB2D目标序列的扩增(以下表19和20)产生的扩增子。在不存在标签化的质粒或原病毒HXB2D模板DNA的情况下，在JOE通道上随着时间没有荧光信号的提高。进一步地，在存在单独的来自未标签化的HXB2D WT原病毒DNA的扩增子的情况下，在JOE通道上随着时间没有荧光信号的提高。
通过监视由于SubBi-3-Q6B2被MNAzyme 3(包含partzymesRO5A4/3-P和RO5B5/3-P)裂解在Quasar通道上荧光的提高，实时地检测和定量RPLPO基因。MNAzyme 3仅在存在基因组DNA的情况下形成。在存在提取自K562或MT-4细胞的基因组DNA的情况下观察到荧光的增加。在缺少基因组DNA的情况下随着时间的过去没有荧光信号的提高。
通过相对于达到阈值荧光时的循环数(Ct)来标绘质粒浓度的log值，对未标签化的和标签化的HXB2D质粒目标产生标准曲线。以下在表19中显示的每种已知数量的质粒(标准)的Ct值是两份反应的平均值。显示了RPLPO的Ct值，对所有的标准获得的相似的值表明在所有的标准中存在相似数量的基因组DNA。对未标签化的和标签化的目标序列显示了标准曲线的相关系数(R2)和斜率，以及反应效力。
表19：未标签化的和标签化的HXB2D目标以及对照RPLPO序列的实时分析的结果
根据从未标签化的和标签化的HXB2D质粒产生的标准曲线来估计在MT-4基因组DNA混合物内的未标签化的和标签化的HXB2D原病毒的拷贝数(表20)。每种未标签化的和标签化的HXB2D原病毒序列的拷贝数被表示为总拷贝数(未标签化的加上标签化的原病毒序列)的百分比，估计值与原始spiked MT-4混合物中的百分比相比较。
具有含100％未标签化的原病毒序列或100％标签化的原病毒序列的基因组MT-4的样品很容易地相互区分(表20)。在仅存在标签化的原病毒序列的情况下，随着时间过去MNAzyme 1没有产生荧光方面的背景提高。类似地，在仅存在未标签化的原病毒序列的情况下，随着时间过去MNAzyme 2没有产生荧光方面的背景提高(表20)。80％、50％和20％未标签化序列的未标签化序列比标签化序列比例的混合物，利用MNAzyme分析被分别地计算含有74％、47％和28％的未标签化的序列。
表20：以各种百分比存在的未标签化的和标签化的原病毒DNA序列的扩增和检测的反应结果(三联MNAzyme形式)
这个实施例中的MNAzyme PCR反应容许同时检测和产生标准曲线，用于在三联反应中定量未标签化的和标签化的核酸HXB2D序列。该分析容许辨别未标签化的和标签化的序列，反之亦然。进一步地，MNAzyme分析能够测定样品中存在的未标签化的和标签化的原病毒HXB2D DNA的绝对和相对数量。RPLPO基因序列可以提供标准或测试样品中基因组DNA数量的内部对照。因而，三联MNAzyme PCR提供了在HIV病毒适应度分析中实时监测HIV-1序列的方法。
Claims (20)
1.一种用于测定两种HIV病毒在环境中的复制能力的离体或体外方法，所述方法包括下述步骤：
e)产生标签化的重组传染性病毒，其包含标签化的HIV DNA载体和来自第一目标HIV病毒的第一扩增子；其中所述标签化的HIV DNA载体通过在选自gag、pol、env、tat、rev、nef、vif、vpr和vpu的HIV基因之一中导入一个或多个沉默突变来产生；其中所述标签化的HIVDNA载体在其DNA序列中具有删除，所述删除最多对应于或重叠于来自所述第一目标HIV病毒的所述第一扩增子的侧翼区域；其中所述一个或多个沉默突变被导入下述基因中，所述基因不被来自所述第一目标HIV病毒的所述第一扩增子包括；以及其中所述第一扩增子包含来自所述第一目标HIV病毒的gag、pol或env基因、其部分和其组合；
f)产生未标签化的重组传染性病毒，其包含未标签化的HIV DNA载体和来自第二目标HIV病毒的第二扩增子；其中所述未标签化的HIVDNA载体不包含在步骤a)的标签化的HIV DNA载体中导入的一个或多个沉默突变；其中所述未标签化的HIV DNA载体在其DNA序列中具有删除，所述删除最多对应于或重叠于来自所述第二目标HIV病毒的所述第二扩增子的侧翼区域；以及其中所述第二扩增子包含来自第二目标HIV病毒的gag、pol或env基因、其部分和其组合；
g)在给定环境中在细胞培养物中混合步骤a)和b)的重组传染性病毒；以及
h)通过检测所述标签化的重组传染性病毒的所述HIV DNA载体部分中的一个或多个沉默突变，和通过检测所述未标签化的重组传染性病毒的所述HIV DNA载体部分中一个或多个沉默突变的缺乏，通过定量扩增测定总病毒群体内标签化的重组传染性病毒的比例和未标签化的重组传染性病毒的比例。
2.一种用于测定三或更多种HIV病毒在环境中的复制能力的离体或体外方法，所述方法包括下述步骤：
a)产生权利要求1中步骤a)的标签化的重组传染性病毒；
b)产生权利要求1中步骤b)的未标签化的重组传染性病毒；
c)产生其它的一种或多种标签化的重组传染性病毒，每种包含标签化的HIV DNA载体和来自其它一种或多种目标HIV病毒的第三种或后续的扩增子；其中通过在选自gag、pol、env、tat、rev、nef、vif、vpr和vpu的HIV基因之一中导入一个或多个沉默突变来产生所述标签化的HIV DNA载体，所述一个或多个沉默突变不同于这个权利要求的步骤a)的所述第一标签化的HIV DNA载体的一个或多个沉默突变；其中每种所述标签化的HIV DNA载体在其DNA序列中具有删除，所述删除最多对应于(corresponds at most)或重叠于来自所述第三或后续的目标HIV病毒的所述第三或后续的扩增子的侧翼区域；其中所述一个或多个沉默突变被导入下述基因中，所述基因不被来自所述第三或后续的目标HIV病毒的所述第三或后续的扩增子包括；以及其中所述第三或后续的扩增子包含来自所述第三或后续的目标HIV病毒的gag、pol或env基因、其部分和其组合；
d)在给定的环境中在细胞培养物中混合步骤c)的重组传染性病毒和步骤a)和b)的重组传染性病毒；以及
e)通过检测每种所述标签化的重组传染性病毒的所述HIV DNA载体部分中的一个或多个沉默突变，和通过检测所述未标签化的重组传染性病毒的所述HIV DNA载体部分中一个或多个沉默突变的缺乏，通过定量扩增测定总病毒群体内每种标签化的重组传染性病毒的比例和未标签化的重组传染性病毒的比例。
3.根据权利要求1-2的任一项的方法，其中所述扩增通过聚合酶链式反应(PCR)、链交换扩增(SDA)、转录介导的扩增(TMA)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、自持的序列复制(3SR)、基于转录的扩增(TAS)、滚环扩增(RCA)、环介导的等温扩增(LAMP)或连接酶链式反应(LCR)进行。
4.根据权利要求1-3的任一项的方法，其中所述定量扩增利用LuxTM发荧光引物、可被DNAzymes或MNAzymes裂解的探针、TaqMan探针、分子信标、蝎子引物或任何其它FRET探针来监测。
5.根据权利要求1-4的任一项的方法，其中所述定量扩增通过聚合酶链式反应、采用邻近MNAzymes的引物和被MNAzymes裂解的探针来进行。
6.根据权利要求1-5的任一项的方法，其中每种所述标签化的HIVDNA载体和所述未标签化的HIV DNA载体包含野生型或突变毒株的主干。
7.根据权利要求6的方法，其中每种所述标签化的HIV DNA载体和所述未标签化的HIV DNA载体是原病毒HIV DNA或质粒DNA。
8.根据权利要求7的方法，其中所述质粒DNA包含HXB2D野生型毒株的基因组。
9.根据权利要求1-8的任一项的方法，其中所述来自目标HIV病毒的扩增子包含选自gag-PR-RT-int、gag-PR-RT、gag-PR、gag、PR-RT-int、RT-int、int、PR-RT、PR、RT、evn和其部分的序列之一。
10.根据权利要求1-9的任一项的方法，其中所述环境包含一种或多种药物、一种或多种结合蛋白或其混合物。
11.根据权利要求1-10的任一项的方法，其中通过在HIV DNA载体的pol基因的整合酶编码区中导入一个或多个沉默突变来产生所述标签化的HIV DNA载体，其中所述一个或多个沉默突变的导入使用引物SEQ ID NO：1-2来进行。
12.根据权利要求1-10的任一项的方法，其中通过在HIV DNA载体的env基因中导入一个或多个沉默突变来产生所述标签化的HIVDNA载体，其中所述一个或多个沉默突变的导入使用引物SEQ ID NO：3-4来进行。
13.一种标签化的HIV质粒载体，其中所述质粒载体的主干是野生型HXB2D，所述载体包含
-标签化的序列；和
-gag、pol或env基因序列、其部分和其组合的删除；
其特征在于，所述标签化的序列在选自gag、pol、env、tat、rev、nef、vif、vpr和vpu的基因之一中包含一个或多个沉默突变；以及条件是所述一个或多个沉默突变不位于所述删除的基因序列中。
14.根据权利要求13的标签化的HIV质粒载体，其中所述标签化的序列包含在env基因中或在pol基因的整合酶编码区域中的一个或多个沉默突变。
15.根据权利要求14的标签化的HIV质粒载体，其中所述质粒载体是SEQ ID NO：28(pGEM-HIVdelGPRT_tagged(env))或29(pGEM-HIVdelGPRT_tagged(int))。
16.选自SEQ ID NO：1-16、19-22和24-25的寡核苷酸。
17.标签化的HIV包膜基因序列，其中所述标签化的HIV包膜基因序列是SEQ ID NO：26。
18.标签化的HIV整合酶编码基因序列，其中所述标签化的HIV整合酶编码基因序列是SEQ ID NO：27。
19.一种用于离体或体外测定两种或更多种HIV病毒在环境中的复制能力的试剂盒，所述试剂盒包含：
-选自SEQ ID NO：1-12、19-20和24-25的一种或多种寡核苷酸；和/或
-根据权利要求13-15的任一项的一种或多种标签化的HIV质粒载体，和任选的未标签化的HIV HXB2D质粒载体。
20.根据权利要求19的试剂盒，其进一步包括选自SEQ ID NO：13-16和21-22的一种或多种寡核苷酸。
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