CN105907720A - 一种hiv抑制剂筛选模型及其制备方法和应用 - Google Patents

一种hiv抑制剂筛选模型及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种HIV抑制剂筛选模型，该筛选模型由细胞模型I，细胞模型II，细胞模型III组成，其中，细胞模型I为重组质粒gp120/pEGFP‑N3与CD4/pDsRed‑N1共转染的HEK293T细胞；细胞模型II为重组质粒gp120/pDsRed‑N1与CXCR4/pEGFP‑N3共转染的HEK293T细胞；细胞模型III为重组质粒CD4/pEGFP‑N3与CXCR4/pDsRed‑N1共转染的HEK293T细胞；所述的重组质粒gp120/pDsRed‑N1和gp120/pEGFP‑N3中所插入的基因gp120的序列为SEQ ID NO.1所示；所述的重组质粒CXCR4/pEGFP‑N3和CXCR4/pDsRed‑N1中所插入的基因CD4的序列为SEQ ID NO.2所示；所述的重组质粒CXCR4/pEGFP‑N3和CXCR4/pDsRed‑N1中所插入的基因CXCR4的序列为SEQ ID NO.3所示。本发明所述的筛选模型具有荧光共振能量转移(FRET)特征，可用于筛选抗HIV药物。

Description

一种HIV抑制剂筛选模型及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物化学，具体涉及引入外来基因修饰的细胞模型，该细胞模型所组成的体系可大规模筛选抗艾滋病药物。
背景技术
艾滋病(acquired immunodeficiency syndrome,AIDS)是由人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiencyvirus,HIV)感染引起的重大传染性疾病。近些年来，艾滋病在全球范围内迅速蔓延，日益威胁全球公共健康、社会、经济和政治稳定(Black RE.Lancet.2013；382(9894):751-753)。由于最有效的艾滋病疫苗还难以在短时期内面世，开发高效、安全和廉价的抗HIV药物依然是挽救艾滋病人生命的关键举措，也是当前艾滋病防治的当务之急。
迄今为止，已有26种抗HIV单体药物和9个固定配伍复方药物被美国FDA批准用于临床(Este J A,CihlarT.Antiviral Res.2010；85(1):25-33)，根据作用机理，可分为三类。第一类是抑制HIV逆转录酶活性的药物，如齐多夫定(zidovudine,ZDV)、拉米夫定(lamivudine,3TC)、地丹诺辛(didanosine,ddI)、扎西他宾(zalcitabine,ddC)等；第二类是作用于修饰HIV蛋白质的蛋白酶抑制剂，如沙奎那韦(saquinavir,SQV)、利托那韦(ritonavir,RTV)、茚地那韦(indinavir,IDV)等；第三类是阻止病毒进入靶细胞的HIV进入抑制剂，如恩夫韦肽(enfuvirtide,T20)和麦瑞韦若克(maraviroc,MVC)。由于前两类药物易诱导HIV耐药性突变，而且对人体有较大的毒副作用，导致越来越多的艾滋病患者无法持续地接受抗HIV药物的治疗(Guendel I,et al.J Virol.2014；88(2):1189-1208)。理论上认为，阻止病毒进入细胞的药物相比针对病毒生活周期的酶类药物更加有效，因为前者可提供一种预防性措施，阻止病毒感染宿主细胞，防患于未然。所以，阻止HIV进入药物被认为是最富有潜力的HIV治疗手段。开发新的阻止病毒进入靶细胞的第三类抗HIV药物，已经成为目前艾滋病药物研究的热点，在艾滋病的防治上具有更好的应用前景。
HIV通过三个步骤进入宿主细胞：1)HIV颗粒通过其包膜糖蛋白gp120与靶细胞表面的受体分子CD4黏附；2)gp120发生构象改变，以适应与靶细胞上的辅助受体CCR5或CXCR4结合；3)HIV跨膜蛋白gp41介导病毒包膜与靶细胞膜发生融合。因此，抑制HIV进入过程中的任何一个环节，就能达到抑制HIV感染和治疗艾滋病的目的，这种类型的抗艾滋病药物被称为HIV进入抑制剂(HIV entry inhibitors)(Micewicz ED,Ruchala P.Curr Pharm Des.2013；19(10):1784-1799)。HIV进入抑制剂目前主要有三大类：1)作用于gp120的黏附抑制剂；2)作用于辅助受体的拮抗剂；3)靶向gp41的融合抑制剂。目前已被FDA批准用于艾滋病治疗的HIV进入抑制剂有2种，分别是Roche和Trimeris公司开发的融合抑制剂恩夫韦肽(enfuvirtide,T20)(Mirza RA,Turiansky GW.J Drugs Dermatol.2012；11(10):e35-38)，Pfizer公司开发的CCR5拮抗剂麦瑞韦若克(maraviroc,MVC)(Cossarini F,J Antimicrob Chemother.2012；67(10):2474-2478)。
现有的抗HIV药物并不能彻底清除患者体内的HIV，且长期使用带来的副作用以及耐药性问题日渐突出。因此，开发新靶点的抗HIV药物迫在眉睫，然而目前HIV进入抑制剂的筛选通常以HIV病毒为对象进行筛选，这种筛选方法要在严格的三级生物安全实验室中进行，操作危险性大，并且作用靶点和机理不明，大大影响了筛选效率。因此，急需研究一种可以大规模筛选的有效方法。近年发展起来的荧光共振能量转移(FRET)技术已被广泛应用于生物分子相互作用分析，而光栅型酶标仪等现代化仪器在FRET检测中的应用大大提高了样品的检测效率，从而使FRET成为药物筛选领域里一项不可或缺的新技术。
辅助受体CXCR4是一种趋化因子受体，随着艾滋病病情的发展，HIV将发生构型改变，使病毒能够利用受体CCR5/CXCR4，因而研发辅助受体CXCR4拮抗剂是十分有必要的。理想的CXCR4拮抗剂，不仅能阻止HIV的侵入，还不会影响CXCR4介导的下游信号通路调控。CXCR4可作为HIV进入细胞的辅助受体，因而是目前研究最多的趋化因子受体之一，以CXCR4为靶点的抑制剂有可能会成为新型抗HIV药物。非肽类抑制剂属于CXCR4抑制剂的重要组成部分，尤其是双环拉胺类化合物及其衍生物表现出了较高的抑制活性。AMD3100(Clercq E D.Biochem Pharmacol.2009；77(11):1655-1664.)是小分子CXCR4抑制剂，可与CXCR4胞外环的天冬氨酸残基结合，带正电荷。研究表明，AMD3100作用于HIV-1感染早期阶段，特异性地以CXCR4受体为靶点阻断HIV-1进入细胞，不作用于CCR5受体，也不对gp120蛋白发生作用。由于AMD3100分子量较大，结构中的阳离子不利于分子通过细胞膜，导致不易吸收，口服活性低，所以有人用更小的杂环取代了1个或2个环，改造其结构，试图改善并提高化合物的口服药物利用率。
荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)是指在一对合适的荧光物质间，可通过偶极-偶极的相互作用构成能量供体(donor)和能量受体(acceptor)对，供体分子吸收一定频率的光子后，其电子层被激发到更高的电子能态，且在电子回到基态的过程中，发射出光子能量(hυ)，并传递至受体分子，后者接收能量后再发射出光子hυ’(hυ>hυ’)。在此过程中，供体荧光强度降低(猝灭)，而受体荧光强度增强或发生猝灭，同时伴随着荧光寿命的相应缩短或延长的现象。简单地说荧光共振能量转移是距离很近的两个荧光分子间产生的一种能量转移现象。当供体荧光分子的发射光谱与受体荧光分子的吸收光谱重叠，并且两个分子的距离在10nm范围以内时，就会发生一种非放射性的能量转移，即FRET现象，使得供体的荧光强度比它单独存在时要低得多(荧光猝灭)，而受体发射的荧光却大大增强(荧光活化)，这也是FRET的直观表现。而由于FRET效率与供、受体分子之间的距离存在高度依赖性，对供、受体分子间跃迁偶极相对取向的变化亦特别敏感，因此该项技术起初被用于测定供、受体分子之间相互作用，并已在DNA杂交、蛋白构象变化以及蛋白质-配体相互作用等生命科学的研究中得到广泛应用。
要实现有效的FRET，供、受体的空间距离要足够接近(1～10nm)，且供体的发射光谱与受体的激发光谱要有一定程度的重叠。此外，选择理想的供、受体分子也是实现FRET的必要条件，可以选用小分子有机染料、荧光蛋白、化学发光物质和荧光聚合物等作为供、受体。一对理想的FRET供体-受体荧光对应该具备以下条件：1.供体的荧光量子产率(QD)要尽量大；2.供体和受体之间光谱串扰(cross-talk)要尽量小；3.供体和受体的光谱重叠较大(＞30％)；4.用于FRET检测的荧光探针在目的细胞中具有较高的信噪比(S/B)；5.能量供体-受体对要有一定强度的光漂白性质。CFP-YFP为目前研究蛋白相互作用中应用最广泛的FRET供-受体对，但CFP-YFP对也存在一定的不足：如荧光量子产率低、传递能量效率低、对环境十分敏感，以及CFP不适合用激光作为激发光等等。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种HIV抑制剂筛选模型，该筛选模型具有荧光共振能量转移(FRET)特征，可以实现在没有HIV病毒参与的情况下，在活细胞中全面、高效、快速、有针对性筛选以gp120、CXCR4、CD4为靶点的抗HIV药物。
本发明解决上述问题的技术方案是：
一种HIV抑制剂筛选模型，该筛选模型由细胞模型I，细胞模型II，细胞模型III组成，其中，
细胞模型I为重组质粒gp120/pEGFP-N3与CD4/pDsRed-N1共转染的HEK293T细胞；
细胞模型II为重组质粒gp120/pDsRed-N1与CXCR4/pEGFP-N3共转染的HEK293T细胞；
细胞模型III为重组质粒CD4/pEGFP-N3与CXCR4/pDsRed-N1共转染的HEK293T细胞；
所述的重组质粒gp120/pDsRed-N1和gp120/pEGFP-N3是在荧光表达载体pDsRed-N1与pEGFP-N3中分别插入HIV包膜糖蛋白gp120的编码基因构成的，其中所述的gp120的碱基序列为SEQ ID NO.1所示；
所述的重组质粒CD4/pEGFP-N3和CD4/pDsRed-N1是在荧光表达载体pEGFP-N3与pDsRed-N1中分别插入受体分子CD4的编码基因构成的，其中所述的CD4的碱基序列为SEQ ID NO.2所示；
所述的重组质粒CXCR4/pEGFP-N3和CXCR4/pDsRed-N1是在荧光表达载体pEGFP-N3与pDsRed-N1中分别插入辅助受体分子CXCR4的编码基因构成的，其中所述的CXCR4的碱基序列为SEQ ID NO.3所示。
上述方案中所述的碱基序列为SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.3由上海英潍捷基广州分公司根据本发明人所提供的序列合成。
本发明所述的一种HIV抑制剂筛选模型的作用机理是：在细胞模型I～细胞模型III中表达gp120、CD4、CXCR4中任意两种蛋白，这两种蛋白分别与一种绿色荧光蛋白和一种红色荧光蛋白嵌合在一起，各自在细胞中形成gp120-CD4、gp120-CXCR4、CD4-CXCR4二聚体，则绿色荧光减弱，红色荧光增强，即发生荧光共振能量转移(FRET)。本发明所述的HIV抑制剂筛选模型筛选出的药物可以影响gp120-CD4、gp120-CXCR4、CD4-CXCR4二聚体的形成，导致荧光共振能量转移减弱，即说明该药物能够抑制gp120-CD4、gp120-CXCR4、CD4-CXCR4二聚体的形成，从而降低FRET效率，是一种有效的HIV进入抑制剂。
上述HIV抑制剂筛选模型的制备方法包括以下步骤：
(1)将gp120、CD4、CXCR4的编码基因分别插入荧光表达载体pEGFP-N3和pDsRed-N1，构建出6个重组质粒gp120/pDsRed-N1、gp120/pEGFP-N3、CXCR4/pDsRed-N1、CXCR4/pEGFP-N3、CD4/pDsRed-N1和CD4/pEGFP-N3；
(2)以重组质粒gp120/pEGFP-N3与CD4/pDsRed-N1共转染HEK293T细胞，得到细胞模型I；以重组质粒gp120/pDsRed-N1与CXCR4/pEGFP-N3共转染HEK293T细胞，得到细胞模型II；以重组质粒CD4/pEGFP-N3与CXCR4/pDsRed-N1共转染HEK293T细胞，得到细胞模型III。
本发明所述HIV抑制剂筛选模型具有荧光共振能量转移特征，可用于筛选HIV抑制剂，本发明人推荐的筛选方法由以下步骤组成：
(1)用所述的重组质粒gp120/pDsRed-N1、gp120/pEGFP-N3、CXCR4/pDsRed-N1、CXCR4/pEGFP-N3、CD4/pDsRed-N1和CD4/pEGFP-N3分别转染HEK293T细胞，制得6个细胞；然后将6个细胞分别接种在带有盖玻片的24孔细胞培养板中，放在37℃和充入体积浓度为5％CO2气体的细胞培养箱中培养48h，再用PBS洗涤三次，用体积浓度为4％多聚甲醛溶液固定细胞15-20min，然后将载有细胞的盖玻片固定于载玻片上，用封面剂封片，得到6个阴性对照细胞；
(2)将所述的筛选模型接种在带有盖玻片的24孔细胞培养板中，放在37℃和充入体积浓度为5％CO2气体的细胞培养箱中培养46h；接着，将培养后筛选模型分别分成两份，往其中一份加入待筛选药物作用2h；然后，将两份培养后筛选模型分别用PBS洗涤三次，用体积浓度为4％多聚甲醛溶液固定细胞15-20min，然后将载有细胞的盖玻片固定于载玻片上，用封面剂封片，得到加药细胞与空白对照细胞(分别为细胞模型I的加药细胞与空白对照细胞、细胞模型II的加药细胞与空白对照细胞和细胞模型III的加药细胞与空白对照细胞)；
(3)将所得到的阴性对照细胞、空白对照细胞和加药细胞分别置于激光共聚焦显微镜下采用敏化发射法进行FRET检测，将所得到的检测数据用FV10-ASW2.1Viewer软件计算出蛋白间的FRET效率E；能使蛋白间FRET效率E降低的药物即为目标筛选物，否则为非目标筛选物。
上述制备方法中，所述的敏化发射法检测的操作步骤为：以每种重组质粒表达的EGFP为供体，以每种重组质粒表达的DsRED为受体，首先拍摄仅表达供体的对照细胞和仅表达受体的对照细胞，设置共聚焦显微镜的供体、受体荧光的扫描参数，即选择DsRED通道激发光波长488nm，HV为500v，EGFP通道激发光波长559nm，HV为400v，用调整好的参数拍摄供受体共表达的细胞模型；每个细胞模型分别拍摄如下的7张照片：(1)488nm激发仅表达供体的对照细胞在供体通道成像；(2)488nm激发仅表达供体的对照细胞在受体通道成像；(3)488nm激发仅表达受体的对照细胞在受体通道成像；(4)559nm激发仅表达受体的对照细胞在受体通道成像；(5)488nm激发供受体共表达的细胞在供体通道成像；(6)488nm激发供受体共表达的细胞在受体通道成像；(7)559nm激发供受体共表达的细胞在受体通道成像。再将所得照片输入FV10-ASW2.1Viewer软件，计算出供受体间的FRET效率(8)及供受体间的距离(9)。
由于本发明所述的HIV抑制剂筛选模型能筛选出影响形成gp120-CD4、gp120-CXCR4、CD4-CXCR4二聚体的可抑制HIV感染细胞的药物，因此本发明所述的HIV抑制剂筛选模型可实现在没有HIV病毒参与的情况下，在活细胞中全面、高效、快速、有针对性筛选以gp120、CXCR4、CD4为靶点的抗HIV药物。本发明还具有筛选信号强，灵敏度高，作用机理明确的优点。
附图说明
图1为构建HIV抑制剂筛选模型所用的质粒的图谱，其中，A为pEGFP-N3的图谱，B为pDsRed-N1的图谱。
图2为敏化发射法检测gp120、CD4和CXCR4蛋白之间的相互作用的显微照片(×20倍)，其中，A为检测空载体pEGFP-N3与pDsRed-N1共转染的阴性对照细胞，B为检测细胞模型I，C为检测细胞模型II；D为检测细胞模型III；上述A～D图中，A1-D1为488nm激发仅表达供体的对照细胞在供体通道成像；A2-D2为488nm激发仅表达供体的对照细胞在受体通道成像；A3-D3为488nm激发仅表达受体的对照细胞在受体通道成像；A4-D4为559nm激发仅表达受体的对照细胞在受体通道成像；A5-D5为488nm激发供受体共表达的细胞在供体通道成像；A6-D6为488nm激发供受体共表达的细胞在受体通道成像；A7-D7为559nm激发供受体共表达的细胞在受体通道成像；A8-D8为供受体间的FRET效率，A9-D9为供受体间的距离。
图3为AMD3100处理后敏化发射法检测gp120、CD4和CXCR4蛋白之间的相互作用的显微照片(×20倍)，其中，A为检测细胞模型I，B为检测细胞模型II；C为检测细胞模型III；上述A～C图中，A1-C1为488nm激发仅表达供体的对照细胞在供体通道成像；A2-C2为488nm激发仅表达供体的对照细胞在受体通道成像；A3-C3为488nm激发仅表达受体的对照细胞在受体通道成像；A4-C4为559nm激发仅表达受体的对照细胞在受体通道成像；A5-C5为488nm激发供受体共表达的细胞在供体通道成像；A6-C6为488nm激发供受体共表达的细胞在受体通道成像；A7-C7为559nm激发供受体共表达的细胞在受体通道成像；A8-C8为供受体间的FRET效率，A9-C9为供受体间的距离。
图4为anti-human CD4IgG处理后敏化发射法检测gp120、CD4和CXCR4蛋白之间的相互作用的显微照片(×20倍)，其中，A为检测细胞模型I，B为检测细胞模型II；C为检测细胞模型III；上述A～C图中，A1-C1为488nm激发仅表达供体的对照细胞在供体通道成像；A2-C2为488nm激发仅表达供体的对照细胞在受体通道成像；A3-C3为488nm激发仅表达受体的对照细胞在受体通道成像；A4-C4为559nm激发仅表达受体的对照细胞在受体通道成像；A5-C5为488nm激发供受体共表达的细胞在供体通道成像；A6-C6为488nm激发供受体共表达的细胞在受体通道成像；A7-C7为559nm激发供受体共表达的细胞在受体通道成像；A8-C8为供受体间的FRET效率，A9-C9为供受体间的距离。
具体实施方式
制备例
一、材料和仪器：
1、碱基序列为SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.3由上海英潍捷基广州分公司合成
2、质粒pEGFP-N3：购自美国Clonetech公司
3、质粒pDsRed-N1：购自美国Clonetech公司
4、工具酶XhoI、EcoI、PstI、KpnI均购自Takara公司
5、激光共聚焦显微镜(Olympus FV1000Olympus Corp日本)
二、方法：
三、构建gp120、CD4、CXCR4的荧光表达载体：
选取如图1所示的表达绿色荧光蛋白的质粒pEGFP-N3和表达红色荧光蛋白的质粒pDsRed-N1作为gp120、CD4、CXCR4的荧光表达载体，再按下表1所示的酶切位点，分别对CD4、CXCR4、gp120的编码基因及所述的表达载体进行相应的限制性酶切，以形成互补的粘性末端；所述的酶切位点的选择要保证插入基因与载体上的荧光蛋白基因之间有约15个氨基酸的间隔距离。然后，在连接酶作用下进行连接，得到6个重组质粒gp120/pDsRed-N1、gp120/pEGFP-N3、CXCR4/pDsRed-N1、CXCR4/pEGFP-N3、CD4/pDsRed-N1、CD4/pEGFP-N3，再将所得到的重组质粒分别转化到大肠杆菌DH5α中进行质粒扩增。
表1
基因 质粒 插入位点 重组质粒
gp120 pEGFP-N3 XhoI,EcoI gp120/pEGFP-N3
gp120 pDsRed-N1 XhoI,KpnI gp120/pDsRed-N1
CD4 pEGFP-N3 XhoI,PstI CD4/pEGFP-N3
CD4 pDsRed-N1 XhoI,EcoI CD4/pDsRed-N1
CXCR4 pEGFP-N3 XhoI,PstI CXCR4/pEGFP-N3
CXCR4 pDsRed-N1 XhoI,EcoI CXCR4/pDsRed-N1
四、构建HIV抑制剂筛选模型：
1、HEK293T细胞的培养
先将盖破片经多聚赖氨酸处理后再放入24孔细胞培养板中，然后按0.5-2×105个/孔将HEK293T细胞接种于培养板内，再按每孔1mL加入无抗生素的1640完全细胞培养基，置于37℃，充入体积浓度为5％CO2气体的细胞培养箱中培养至细胞贴壁融合率达到50％～60％。
2、构建细胞模型
重组质粒gp120/pEGFP-N3与CD4/pDsRed-N1、gp120/pDsRed-N1与CXCR4/pEGFP-N3、CD4/pEGFP-N3与CXCR4/pDsRed-N1两两一组用脂质体Lipofectamime 3000分别共同转染步骤1培养的HEK293T细胞，得到细胞模型I、细胞模型II和细胞模型III。
五、结果验证：
将所制备的细胞模型I～细胞模型III培养48h后，用PBS洗涤三次，再用体积浓度为4％的多聚甲醛溶液固定，然后将载有细胞模型的盖玻片固定于载玻片上，用封面剂封片，通过共聚焦显微镜，用敏化发射法进行FRET检测；每个实验组采集7张图像，并在Sensitized Emission界面下分析计算，结果如图2所示。与阴性对照细胞中EGFP和DsRed相比较(见图2A)，细胞模型I中gp120-EGFP和CD4-DsRed之间(见图2B)，细胞模型II中gp120-DsRed和CXCR4-EGFP之间(见图2C)，细胞模型III中CD4-EGFP和CXCR4-DsRed之间(见图2D)的FRET效率分别是0.652、0.669、0.565，蛋白距离均小于10nm。该结果证实三种蛋白gp120、CD4、CXCR4两两之间存在相互作用，有FRET现象发生，即本发明所述的HIV抑制剂筛选模型已成功建立。
筛选例
例1
1、待筛选药物
中文名称：AMD3100，购于Sigma公司。
化学名称：1,1'-[1,4-亚苯基双(亚甲基)]双[1,4,8,11-四氮杂环十四烷]
特征：AMD3100其分子量较大，结构中的阳离子不利于分子通过细胞膜，导致不易吸收，口服活性低，且可引起心律异常等毒副作用。
作用机制：AMD3100是小分子CXCR4抑制剂，作用于HIV-1感染的早期阶段，特异性地阻断以CXCR4为辅助受体的HIV-1进入细胞，不作用于CCR5受体，也不对gp120蛋白发生作用。
2、筛选方法
(1)用制备例中所得到的6个重组质粒gp120/pDsRed-N1、gp120/pEGFP-N3、CXCR4/pDsRed-N1、CXCR4/pEGFP-N3、CD4/pDsRed-N1和CD4/pEGFP-N3分别转染HEK293T细胞，制得6个细胞；然后将6个细胞分别接种在带有盖玻片的24孔细胞培养板中，放在37℃和充入体积浓度为5％CO2气体的细胞培养箱中培养48h，再用PBS洗涤三次，用体积浓度为4％多聚甲醛溶液固定细胞15-20min，然后将载有细胞的盖玻片固定于载玻片上，用封面剂封片，得到6个阴性对照细胞；
(2)将制备例中所得到的筛选模型(即细胞模型I、细胞模型II和细胞模型III)接种在带有盖玻片的24孔细胞培养板中，放在37℃和充入体积浓度为5％CO2气体的细胞培养箱中培养46h；接着，将培养后的筛选模型分别分成两份，往其中一份加入1μM AMD3100作用2h；然后，将两份培养后的筛选模型分别用PBS洗涤三次，用体积浓度为4％多聚甲醛溶液固定细胞15-20min，然后将载有细胞的盖玻片固定于载玻片上，用封面剂封片，得到加药细胞与空白对照细胞(即细胞模型I的加药细胞与空白对照细胞、细胞模型II的加药细胞与空白对照细胞和细胞模型III的加药细胞与空白对照细胞)；
(3)将所得到的阴性对照细胞、空白对照细胞和加药细胞分别置于激光共聚焦显微镜下采用敏化发射法进行FRET检测，将所得到的检测数据用FV10-ASW2.1Viewer软件计算出蛋白间的FRET效率E；实验结果如图3所示：从图中可以看出，相对于空白对照组(见图2B、C、D)，加药组细胞模型II中gp120-DsRed与CXCR4-EGFP之间(见图3B)，细胞模型III中CD4-EGFP与CXCR4-DsRed之间(见图3C)的FRET效率明显降低，而细胞模型I中gp120-EGFP与CD4-DsRed之间(见图3A)的FRET效率变化不大，可见AMD3100是一种有效的以CXCR4为靶点的HIV抑制剂。
例2
1、待筛选药物
名称：anti-human CD4IgG，购于Biolegend公司。
特征：大分子蛋白，口服利用率低。
作用机制：CD4特异性中和抗体，通过特异性与CD4结合，抑制HIV进入细胞。
2、筛选方法
(1)用制备例中所得到的6个重组质粒gp120/pDsRed-N1、gp120/pEGFP-N3、CXCR4/pDsRed-N1、CXCR4/pEGFP-N3、CD4/pDsRed-N1和CD4/pEGFP-N3分别转染HEK293T细胞，制得6个细胞；然后将6个细胞分别接种在带有盖玻片的24孔细胞培养板中，放在37℃和充入体积浓度为5％CO2气体的细胞培养箱中培养48h，再用PBS洗涤三次，用体积浓度为4％多聚甲醛溶液固定细胞15-20min，然后将载有细胞的盖玻片固定于载玻片上，用封面剂封片，得到6个阴性对照细胞；
(2)将制备例中所得到的筛选模型(即细胞模型I、细胞模型II和细胞模型III)接种在带有盖玻片的24孔细胞培养板中，放在37℃和充入体积浓度为5％CO2气体的细胞培养箱中培养46h；接着，将培养后的筛选模型分别分成两份，往其中一份加入1μM anti-human CD4IgG作用2h；然后，将两份培养后的筛选模型分别用PBS洗涤三次，用体积浓度为4％多聚甲醛溶液固定细胞15-20min，然后将载有细胞的盖玻片固定于载玻片上，用封面剂封片，得到加药细胞与空白对照细胞(即细胞模型I的加药细胞与空白对照细胞、细胞模型II的加药细胞与空白对照细胞和细胞模型III的加药细胞与空白对照细胞)；
(3)将所得到的阴性对照细胞、空白对照细胞和加药细胞分别置于激光共聚焦显微镜下采用敏化发射法进行FRET检测，将所得到的检测数据用FV10-ASW2.1Viewer软件计算出蛋白间的FRET效率E；实验结果如图4所示：从图中可以看出，相对于空白对照组(见图2B、C、D)，加药组细胞模型I中gp120-EGFP与CD4-DsRed之间(见图4A)，细胞模型III中CD4-EGFP与CXCR4-DsRed之间(见图4C)的FRET效率明显降低，而细胞模型II中gp120-DsRed与CXCR4-EGFP之间(见图4B)的FRET效率变化不大，可见anti-human CD4IgG是一种有效的以CD4为靶点的HIV抑制剂。

Claims (3)

1.一种HIV抑制剂筛选模型，该筛选模型由细胞模型I，细胞模型II，细胞模型III组成，其中，
细胞模型I为重组质粒gp120/pEGFP-N3与CD4/pDsRed-N1共转染的HEK293T细胞；
细胞模型II为重组质粒gp120/pDsRed-N1与CXCR4/pEGFP-N3共转染的HEK293T细胞；
细胞模型III为重组质粒CD4/pEGFP-N3与CXCR4/pDsRed-N1共转染的HEK293T细胞；
所述的重组质粒gp120/pDsRed-N1和gp120/pEGFP-N3是在荧光表达载体pDsRed-N1与pEGFP-N3中分别插入HIV包膜糖蛋白gp120的编码基因构成的，其中所述的gp120的碱基序列为SEQ ID NO.1所示；
所述的重组质粒CD4/pEGFP-N3和CD4/pDsRed-N1是在荧光表达载体pEGFP-N3与pDsRed-N1中分别插入受体分子CD4的编码基因构成的，其中所述的CD4的碱基序列为SEQ ID NO.2所示；
所述的重组质粒CXCR4/pEGFP-N3和CXCR4/pDsRed-N1是在荧光表达载体pEGFP-N3与pDsRed-N1中分别插入辅助受体分子CXCR4的编码基因构成的，其中所述的CXCR4的碱基序列为SEQ ID NO.3所示。
2.权利要求1所述的一种HIV抑制剂筛选模型的制备方法，该方法包括以下步骤：
(1)将gp120、CD4、CXCR4的编码基因分别插入荧光表达载体pEGFP-N3和pDsRed-N1，构建出6个重组质粒gp120/pDsRed-N1、gp120/pEGFP-N3、CXCR4/pDsRed-N1、CXCR4/pEGFP-N3、CD4/pDsRed-N1和CD4/pEGFP-N3；
(2)以重组质粒gp120/pEGFP-N3与CD4/pDsRed-N1共转染HEK293T细胞，得到细胞模型I；以重组质粒gp120/pDsRed-N1与CXCR4/pEGFP-N3共转染HEK293T细胞，得到细胞模型II；以重组质粒CD4/pEGFP-N3与CXCR4/pDsRed-N1共转染HEK293T细胞，得到细胞模型III。
3.权利要求1所述的一种HIV抑制剂筛选模型用于筛选HIV抑制剂的方法，该方法由以下步骤组成：
(1)用所述的重组质粒gp120/pDsRed-N1、gp120/pEGFP-N3、CXCR4/pDsRed-N1、CXCR4/pEGFP-N3、CD4/pDsRed-N1和CD4/pEGFP-N3分别转染HEK293T细胞，制得6个细胞；然后将6个细胞分别接种在带有盖玻片的24孔细胞培养板中，放在37℃和充入体积浓度为5％CO2气体的细胞培养箱中培养48h，再用PBS洗涤三次，用体积浓度为4％多聚甲醛溶液固定细胞15-20min，然后将载有细胞的盖玻片固定于载玻片上，用封面剂封片，得到6个阴性对照细胞；
(2)将所述的筛选模型接种在带有盖玻片的24孔细胞培养板中，放在37℃和充入体积浓度为5％CO2气体的细胞培养箱中培养46h；接着，将培养后筛选模型分别分成两份，往其中一份加入待筛选药物作用2h；然后，将两份培养后筛选模型分别用PBS洗涤三次，用体积浓度为4％多聚甲醛溶液固定细胞15-20min，然后将载有细胞的盖玻片固定于载玻片上，用封面剂封片，得到加药细胞与空白对照细胞；
(3)将所得到的阴性对照细胞、空白对照细胞和加药细胞分别置于激光共聚焦显微镜下采用敏化发射法进行FRET检测，将所得到的检测数据用FV10-ASW2.1Viewer软件计算出蛋白间的FRET效率E；能使蛋白间FRET效率E降低的药物即为目标筛选物，否则为非目标筛选物。
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