ES2244332B1 - Nuevos clones virales recombinantes basados en vih y su utilizacion en metodos analiticos. - Google Patents
Nuevos clones virales recombinantes basados en vih y su utilizacion en metodos analiticos. Download PDFInfo
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Abstract
Nuevos clones virales recombinantes basados en VIH y su utilización en métodos analíticos. La presente invención se refiere a clones virales recombinantes basados en VIH que poseen la estructura general representada en la figura 8 y son el resultado de las siguientes manipulaciones genéticas: - deleción de fragmentos de VIH (por ejemplo, gen Nef) sin perder capacidad infectiva, - inserción de un gen no expresado en células humanas, - inserción del gen LacZ, - introducción de sitios de restricción para extraer fragmentos de ADN del provirus matriz y sustituirlos por genes de pacientes a valorar. Asimismo, la invención se refiere a la aplicación de dichos clones en métodos analíticos relacionados con el SIDA.
Description
Nuevos clones virales recombinantes basados en
VIH y su utilización en métodos analíticos.
Dentro del amplio campo de la investigación que
se está llevando a cabo en torno al SIDA y más concretamente al
desarrollo de nuevas familias de fármacos, la presente invención se
centra en la generación de unos nuevos clones virales recombinantes
basados en el genoma del Virus de la Inmunodeficiencia Humana (VIH)
destinados a utilizarse ventajosamente en tests de sensibilidad a
fármacos, ensayos de detección de anticuerpos neutralizantes,
estudio del tropismo y capacidad replicativa viral y métodos de
cribado y
\hbox{caracterización de compuestos con actividad
antiviral, etc.}
En los últimos cinco años la evolución clínica
de los pacientes infectados por el VIH ha mejorado
espectacularmente gracias a la introducción de nuevas familias de
fármacos antirretrovirales (Havlir y Lange, 1998), y en consecuencia
se ha producido una disminución en el número de casos de SIDA, de
incidencia de infecciones oportunistas y de mortalidad derivada de
esta enfermedad.
Sin embargo, los éxitos conseguidos con dichos
fármacos lamentablemente no han posibilitado la erradicación de la
enfermedad dado que a pesar de la disminución de la carga viral
plasmática a niveles indetectables, la replicación viral persiste a
bajo nivel en órganos linfoides (Chun y cols., 1997; Finzi y cols,
1997; Wong y cols., 1997). Además, la carga proviral, que refleja
el "pool" de linfocitos infectados por el VIH, no disminuye
por el tratamiento antirretroviral o lo hace muy lentamente.
(Sharkey y cols., 2000; Ramratnam y cols., 2000). Por último la
suspensión de la medicación antirretroviral origina un rápido
repunte de la carga viral a los niveles basales, incluso en
pacientes que se encontraban en supresión virológica aparentemente
completa (<5 copias de ARN/ml) durante dos años (García y cols.,
1999). Todos estos datos sugieren que la perspectiva de
erradicación del SIDA con los fármacos actualmente disponibles
parece improbable (Ho. 1998; Wein y cols., 1998, Zhang y cols 1999;
Furtado y cols., 1999, Pomerantz. 1999). Esta posibilidad de
erradicación conlleva a medio plazo el desarrollo de virus
resistentes a los fármacos antirretrovirales que se utilicen en
cada paciente.
En esta situación, continúan en marcha una serie
de estrategias frente a esta enfermedad que pueden resumirse en
los siguientes puntos:
- -
- Desarrollo de nuevos fármacos y, especialmente de nuevas familias de compuestos con dianas diferentes de las contempladas actualmente por los fármacos antirretrovirales.
- -
- Desarrollo de vacunas terapéuticas y preventivas.
- -
- Desarrollo de estrategias de inmunoterapia dirigidas a potenciar el sistema inmunológico del paciente.
Concomitantemente al desarrollo de estas
estrategias para combatir la enfermedad, es imprescindible el
desarrollo de métodos y técnicas analíticas para evaluar estos
nuevos abordajes: modelos de determinación de resistencias a
antirretrovirales, caracterización biológica de aspectos
cualitativos de la biología del virus y desarrollo de modelos para
la generación de plataformas de cribado y caracterización de la
actividad antiviral de nuevos compuestos. En los párrafos
siguientes se hará referencia a alguno de los métodos analíticos
que se están empleando en la actualidad, y en los que la presente
invención tiene una especial incidencia por sus ventajosas
aportaciones.
Las determinaciones de resistencias fenotípicas
no se realizan de forma rutinaria en los pacientes con infección
por VIH que presentan fracaso virológico, debido a su extrema
laboriosidad y elevado coste. Dichos tests de resistencias
fenotípicas se realizan habitualmente por un método seleccionado
entre uno de los dos grupos de sistemas siguientes:
- a.
- Sistemas clásicos: Comprenden, en un primer paso, el aislamiento del VIH a partir de cultivos de linfocitos del paciente y, en un segundo paso, la infección de células diana en presencia de los distintos antirretrovirales para determinar la concentración inhibitoria de los fármacos (IC50) sobre un aislado concreto. Estos sistemas son terriblemente costosos, largos, tediosos y requieren condiciones de bioseguridad accesibles a muy pocos laboratorios de virología (Richman y cols., 1993; Nagy y cols., 1994).
- b.
- Sistemas basados en técnicas de recombinación genética. En esta tecnología, las secuencias del gen pol son amplificadas a partir del plasma de los pacientes y transfectadas junto con provirus deletados en dichas secuencias, en líneas celulares. Por reacciones de ligación "in vivo", en el interior de estas células se recombina un virus que lleva las secuencias Transcriptasa Inversa y Proteasa del virus del paciente. La progenie viral recombinante generada se utiliza para evaluar la IC50 en la infección de células diana. Existen distintas variantes de esta tecnología en cuanto a las secuencias y pasos de amplificación, células diana y utilización de marcadores (Boucher y cols., 1996; Hertogs y cols., 1998; Ruiz y cols, 1998; Little y cols., 1999; Borden y cols., 1999). A pesar de estos desarrollos que simplifican los sistemas clásicos, las técnicas de ensayos de recombinación viral tienen limitaciones como las bajas tasas de recombinación "in vivo" y su coste y laboriosidad todavía elevados.
Debido a su complejidad y dificultades de
normalización los tests de resistencia fenotípica a fármacos
antirretrovirales están disponibles en la práctica en un pequeño
número de laboratorios y se utilizan esencialmente con fines
diagnósticos.
Existe, por tanto, la necesidad de nuevas
técnicas más sencillas y asequibles que permitan realizar estas
determinaciones en cualquier laboratorio, de forma rápida, simple y
económica.
Entre las características cualitativas
existentes entre los distintos aislados del VIH se encuentra la
"capacidad replicativa" o "fitness" viral (Ruiz Jarabo y
cols., 2002; Domingo y cols., 2001). El fit viral es una resultante
final de múltiples características del virus en el proceso de
adaptación a su hospedador. Sin embargo en algunas situaciones se ha
observado que una fit viral disminuida se asocia con la evolución
clínica de la enfermedad (Tersmette y cols 1995; Learmont y cols
1995). En concreto, en un porcentaje elevado de pacientes
supervivientes a largo plazo es extremadamente difícil aislar sus
virus en cultivo debido a su baja capacidad replicativa (Cao y
cols., 1995; Pantaleo y cols., 1995, Michael y cols., 1995). Quizás
de mayor relevancia clínica es el hecho de que virus de pacientes
multirresistentes parecen replicar con una menor capacidad (Mammano
y cols., 1995; Martiñez-Picado y cols., 1995;
Nijhuis y cols., 2001; Spira y cols., 2003).
Los sistemas de determinación de fitness viral
se basan en estudios de competición en cultivo entre un virus
silvestre y un virus que presentan distintas mutaciones (Yuste y
cols., 1999; Iglesias y cols., 2002). Estos métodos requieren
cultivos prolongados por lo que son extremadamente laboriosos,
costosos y difíciles de normalizar. Sólo recientemente se ha
propuesto la utilización de virus recombinantes para determinar el
fitness viral (Deeks y cols.,2001; Barbour y cols., 2002) aunque
esta técnica no se encuentra adecuadamente normalizada en el
momento actual. Con el fín de poder evaluar de manera precisa la
capacidad replicativa del virus, es imprescindible poder disponer
de técnicas sencillas, fiables, asequibles y rápidas.
La infección por un virus induce en el
hospedador una doble respuesta inmune específica: activación de
linfocitos citotóxicos y producción de anticuerpos (McMichael A.,
2001; Burton DR., 2002). De estos últimos, sólo los anticuerpos que
bloquean la entrada del virus en la célula diana por distintos
mecanismos tienen una eficacia en el control de la infección. Este
tipo de anticuerpos se denominan "neutralizantes" y la
importancia de su papel en la infección por el VIH ha sido puesta
de relieve por distintos trabajos en los últimos años (Burton DR.,
2002; Moore J and Burton DR., 1999).
La medición de anticuerpos neutralizantes tiene
importancia en una serie de situaciones clínicas, ya que se ha
demostrado que su presencia se asocia a buen pronóstico de la
infección (Cao y cols., 1995; Lathey y cols., 1997; Pilgrim y
cols., 1997; Lomis-Price y cols., 1998). Sin
embargo, la mayor aplicación de la detección de anticuerpos
neutralizantes se producirá en los próximos años en la
evaluación.de nuevas vacunas frente al VIH. Existen en la
actualidad más de 50 preparados elaborados bajo normas GMP y 35 en
fase I y II (McMichael AJ and Hanke T., 2003). En la evaluación de
eficacia de estos preparados, la detección de anticuerpos
neutralizantes constituirá junto con la actividad citotóxica frente
al VIH, los dos parámetros que decidirán el pase del preparado a
fases de estudio clínico más avanzadas (Poignard y cols., 1999;
\hbox{Moore JP and Burton DR., 1999; Mc Michael AJ and Rowland
Jones SL., 2001).}
Los tests de neutralización o de detección de
anticuerpos neutralizantes se realizan midiendo la inhibición de la
lisis celular por el VIH en sistemas de infección in vitro
(Sattentau Q., 1996, Langlois y cols., 1998).
Este modelo tiene dos inconvenientes
importantes:
- a.
- Se mide un efecto indirecto de la replicación viral que es la destrucción celular, pero no se mide directamente la replicación del VIH.
- b.
- Se analiza la inhibición de una cepa de laboratorio, con lo que no se detectan anticuerpos frente al virus específico del paciente, un aspecto que puede afectar a la caracterización de una respuesta específica del hospedador.
Se han propuesto otras técnicas basadas en
microscopía o citometría de células infectadas pero revisten una
complejidad que no las hace viables como tests de rutina (Haussmann
y cols., 1987; Mascola y cols., 2002). Recientemente se ha
introducido la técnica de inhibición de infección por virus
recombinantes para analizar la capacidad neutralizante de sueros en
distintos abordajes experimentales (Kolchinski y cols., 2001) y en
muestras clínicas (Wei y cols., 2003; Richman y cols., 2003). Se
hace por tanto imprescindible el desarrollo de nuevas técnicas que
solventen estos dos grandes inconvenientes, permitiendo el análisis
directo de la replicación viral y su inhibición por los anticuerpos
del paciente, de alta sensibilidad y fiabilidad y que puedan
llevarse a cabo de forma sencilla, rápida y económica.
Además de los aspectos cuantitativos de la
replicación viral que viene expresado por la carga viral plasmática,
las diferentes variantes del VIH tienen una serie de
características biológicas que caracterizan su patogenicidad. Entre
éstas, el tropismo viral, o la capacidad del VIH de entrar en la
célula a través de distintos receptores, es una de las
características virales más importantes (Weiss RA., 1996, Oberlin y
cols., 1997; Dorantz y cols., 1996; Glushakova y cols., 1998).
La existencia de dos receptores mayores del VIH,
denominados CCR5 y CXCR4 (Loetscher y cols., 2000) hace que las
distintas variantes virales se clasifiquen en tres categorías: R5,
X4 y R5X4 en función de su capacidad para entrar en la célula por
uno de los dos receptores exclusivamente o ambos receptores (Berger
y cols., 1998).
La medición del tropismo viral no se realiza
habitualmente como test diagnóstico pero representa un parámetro de
gran utilidad en determinadas áreas de investigación. Sin embargo,
la introducción de fármacos específicos de la entrada que tienen
como diana uno de los dos receptores, CCR5 o CXCR4, hace muy
previsible que en el futuro se requiera una caracterización del
tropismo viral del paciente antes de iniciar tratamiento frente a
una de estas dianas (Lazzarin y cols., 2003; Este JA., 2003;
Zaitseva y cols., 2003).
Por lo tanto, existe la necesidad de disponer de
sistemas que permitan la caracterización del tropismo viral en la
infección por el VIH en un paciente, mediante técnicas sencillas y
asequibles a cualquier laboratorio de análisis, sistemas de los
cuales hoy en día se carece.
Los tratamientos actuales no permiten una cura
de la infección por el VIH por lo que el desarrollo de nuevos
fármacos es una prioridad en el contexto de la investigación sobre
el SIDA (De Clercq y cols., 2002). Existen esencialmente dos
fuentes de nuevos fármacos: derivados de productos naturales,
esencialmente procedentes del reino vegetal o generados por química
combinatoria a partir de modelos informáticos o de estructuras
cristalinas de las moléculas diana (Chu and Cutler., 1992; Jung y
cols., 2000; Knowles y cols., 2003; Rudin y cols., 2003; Agrafiotis
y cols., 2002).
En ambos casos, la molécula y sus derivados ha
de ser caracterizada en cuanto a su toxicidad y actividad
antiviral en una serie de modelos que deben ser robotizables para
permitir un cribado de alta eficacia, ya que deben ensayarse del
orden de miles de compuestos. Existen distintos sistemas utilizados
actualmente que van desde los clásicos en que se mide la protección
frente al efecto citopático de un virus de referencia (Pauwels y
cols., 1987), o los específicos que analizan una diana determinada
mediante tests bioquímicos (Hazuda y cols., 2000; Cherepanov y
cols., 1997; Walters y cols., 2003).
No obstante, sigue existiendo una demanda de
sistemas de cribado que permita el desarrollo de modelos
robotizables con los cuales puedan llevarse a cabo los ensayos de
cribado de los miles de compuestos a probar de forma más rápida,
fiable, segura y a menor coste (Federsel y cols., 2003; Bleicher y
cols., 2003).
Pues bien, ante la situación actual
anteriormente expuesta, el solicitante ha encaminado sus esfuerzos
investigadores en la búsqueda de nuevos clones virales
recombinantes, cuya obtención, identificación y aplicaciones les
han permitido la culminación de la presente invención, que
representa un gran avance en la resolución de los problemas e
inconvenientes antes mencionados, como se irá deduciendo fácilmente
de la lectura detallada del resto de la presente memoria
descriptiva.
Seguidamente se proporciona el listado de las
referencia bibliográficas completas que se han ido citando
abreviadamente en los párrafos precedentes.
- Agrafiotis DK et al.
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La presente invención, tal y como se indica en
su enunciado se refiere a la generación de nuevos clones virales
recombinantes basados en VIH y a su utilización en métodos
analíticos.
Dentro del contexto de la presente invención se
denomina clon viral de VIH a un fragmento de ADN que contiene la
totalidad o la práctica totalidad del genoma del VIH incluyendo los
dos LTR de la forma proviral del virus. Para el caso más específico
del VIH-1, la definición es la misma, pero
sustituyendo VIH por VIH-1.
Los clones virales recombinantes de la presente
invención son los clones resultantes de una serie de manipulaciones
genéticas realizadas sobre dicho fragmento de ADN incluyendo
delección de genes virales, inserción de genes marcadores,
introducción de mutaciones y sustitución de genes o fragmentos
génicos del clon original por los de otros clones o poblaciones
virales.
En concreto, en el desarrollo de la presente
invención se ha procedido de acuerdo con las siguientes
estrategias:
- -
- delección de fragmentos del VIH, como el gen Nef, de modo que se mantenga la capacidad infectiva de los clones virales recombinantes generados,
- -
- inserción, en el ADN proviral del gen marcador de renilla, un gen no expresado en células humanas.
- Esto permite que el gen funcione como marcador de la infección, esto es, una célula que expresa renilla indica que se ha infectado;
- -
- inserción del gen LacZ que codifica por el enzima Beta-galactosidasa sustituyendo distintas secuencias del genoma para, por una parte, reconocer la frecuencia de generación de virus recombinantes y, por otra, evitar el arrastre de virus salvajes;
- -
- introducción por mutagénesis dirigida, de sitios de restricción que permitan "extraer" fácilmente determinados fragmentos de ADN del provirus matriz (como, por ejemplo, la Transcriptasa Inversa, la Proteasa, el gen Pol completo, gag, nef, o la envuelta del virus), para sustituirlos por genes de aislados procedentes de pacientes a valorar. Este sistema de "clonaje" y generación de "virus quimera" permite estudiar las características de las distintas proteínas virales de los pacientes en un sistema que presenta todas las ventajas de los genes marcadores.
El sistema de marcado con renilla, presenta
múltiples ventajas frente a los sistemas de marcado utilizados
actualmente de forma más habitual, siendo de destacar especialmente
que:
- -
- la detección de renilla es una técnica que tiene una alta sensibilidad
- -
- se puede realizar de forma automática y es incluso robotizable
- -
- es un ensayo barato
- -
- la detección tras la infección con un virus portador de renilla como marcador es muy rápida (24 horas) frente a los sistemas convencionales de detección de replicación viral que requieren entre 5 días y una semana de cultivo.
Los clones virales recombinantes de la presente
invención se caracterizan porque poseen la siguiente Estructura
General I:
donde:
- LTR (long terminal repeats) son las regiones
con secuencia redundante (R) que juega un papel primordial durante
el proceso de retrotranscripción;
- gag es el gen que codifica para la
proteína p55 de la cápsida formada por 3 subunidades proteicas (MA,
CA y NC);
- pol es el gen que codifica las enzimas
virales necesarias para el proceso de replicación viral: proteasa
(PRO), la transcriptasa inversa (RT) e integrasa;
- vif codifica la proteína Vif asociada
con la infecciosidad de los viriones extracelulares;
- vpr codifica la proteína Vpr que actúa
como acelerador del ciclo de replicación a distintos niveles;
- tat codifica la proteína Tat que es un
transactivador;
- vpu codifica para Vpu implicada en la
liberación de los viriones;
- env es el gen que codifica la proteína
gp160 de la envuelta viral;
- rev produce la proteína Rev, encargada
del procesamiento y transporte al citoplasma del ARN mensajero;
- nef codifica la proteína Nef que regula
negativamente moléculas CD4 y HLA de la célula infectada y desempeña
un papel en la patogenicidad del virus:
- Notl y Xhol indican sitios únicos de
restricción en la secuencia de ADN;
- Renilla indica la posición de clonaje del gen
reportero.
Para la obtención de los clones virales de la
invención representados por la estructura general (I), se parte del
vector proviral NL4.3 [Adachi A. Gendelman HE, Koenig S, Folks, T,
Willey R, Rabson A, Martin MA. Production of acquired
immunodeficiency syndrome-asociated retrovirus in
human and nonhuman cells transfected with an infectious molecular
clone. J. Virol. 1986 Aug;59(2):284-91.) el
cual se modifica genéticamente en el laboratorio mediante distintas
operaciones. A continuación se resumen las etapas seguidas en la
generación de los distintos clones virales. Entre paréntesis y
negrita se da la denominación de las construcciones genéticas
-intermedias y finales- genera-
das:
das:
a). Introducción por mutagénesis dirigida el
sitio de restricción Not I al inicio del gen nef (IP NL
Not).
b). Delección del gen nef (corte con los
enzimas de restricción Not I y XhoI).
c). Clonación del gen de renilla en las
posiciones Not I/Xho I. (IP HIV NL Ren). Estructura general
I.
d). Eliminación de la única diana Nco I mediante
digestión y relleno con Klenow e introducción por mutagénesis
dirigida de otro sitio de restricción Nco I en la posición
correspondiente al aminoácido 15 de la retrotranscriptasa (cambio de
glicina por alanina). (IP HIV NL Nco Ren).
e). Clonaje en el vector IP HIV NL Nco
Ren del gen beta-galactosidasa en la posición de
la RT (IP HIV NL LacZ/rt Ren), Proteasa (IP HIV NL LacZ/pr
Ren), o el gen Pol completo (IP HIV NL LacZ/pol Ren) con
el fin de aumentar la eficacia de clonaje y evitar el arrastre de
poblaciones minoritarias del virus de referencia. Los clones
religados sin el inserto del paciente dan colonias azules, mientras
que el plásmido que ha incorporado la RT, Pr o el gen pol completo
del paciente da colonias blancas.
f). A partir del plásmido IP HIV NL LacZ/pr
Ren, destrucción del sitio de restricción NarI externo al
provirus mediante mutagénesis dirigida e introducción del sitio de
restricción KspI en la posición 4498 por mutagénesis dirigida (IP
HIV NL LacZ/gag-pr Ren).
g). Introducción por mutagénesis dirigida del
sitio de restricción XbaI en la posición 6112 en el clon IP HIV
NL Ren (IP HIV NL Xba Ren).
h) Delección de la envuelta en el plásmido IP
HIV NL XbaI Ren mediante el corte con los enzimas de restricción
XbaI y NotI y clonaje en su lugar del gen lacZ (IP HIV NL
LacZ/env Ren).
i). Generación del clon viral IP HIV JR Ren
clonando la envuelta del clon JR-CSF en el plásmido
IP HIV NL LacZ/Env Ren.
Los vectores finales así generados corresponden
a los nuevos clones virales recombinantes objeto de la presente
invención, comprendidos todos ellos dentro de la estructura general
I. Dichos clones virales han sido depositados en la Colección
Española de Cultivos Tipos (Universidad de Valencia, Burjassot,
Valencia, España), conforme a la normativa del Tratado de Budapest
sobre el reconocimiento internacional del depósito de
microorganismos a los fines del procedimiento en materia de
patentes.
Seguidamente se proporcionan las estructuras
particulares de dichos clones virales, indicando entre paréntesis
junto a su denominación en el contexto de la presente memoria, la
que les ha sido asignada por la CECT:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
donde:
Apa I y Age I representan sitios únicos de
restricción en la secuencia de ADN y los restantes símbolos tienen
el significado dado anteriormente para la Estructura general I.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
donde
LacZ indica la posición de clonaje del gen LacZ
sustituyendo un fragmento del gen pol,
y los restantes símbolos tienen el significado
dado anteriormente.
donde Nco I indica un sitio único
de restricción en la secuencia de
ADN,
y los restantes símbolos tienen el significado
dado anteriormente.
donde los diferentes símbolos
tienen los mismos significados indicados
anteriormente.
donde NarI y KspI indican sitios
únicos de restricción en la secuencia de ADN y los restantes
símbolos tienen el significado dado
anteriormente.
donde XbaI indica un sitio único de
restricción en la secuencia de ADN, "env paciente", indica la
posición de clonaje del gen del
paciente,
y los demás símbolos tienen el significado dado
anteriormente.
donde XbaI indica un sitio único de
restricción en la secuencia de ADN, "env
JR-CSF" indica la posición de clonaje del gen env
del clon JR-CSF en lugar de la envuelta de NL 4.3, y
los restantes símbolos tienen el significado dado
anteriormente.
Los clones vírales recombinantes de la presente
invención han mostrado ser muy útiles en el desarrollo o mejora de
métodos y técnicas analíticas relacionados con las investigaciones
en torno al SIDA. De hecho, en las técnicas concretas que se
describieron en el apartado del Estado de la Técnica, dichos clones
han supuesto importantes ventajas, algunas de las cuales se detallan
seguidamente:
La invención propuesta se basa en el sistema de
clonación de los fragmentos génicos de la transcriptasa inversa, de
la envuelta y de la Proteasa del VIH en vectores virales portadores
de genes marcadores. Esta invención presenta una serie de ventajas
respecto de las ya existentes, a saber:
- a)
- La posibilidad de analizar separadamente la resistencia a inhibidores de la Proteasa, de la Transcriptasa Inversa y de la envuelta. Esto posibilita la evaluación independiente de resistencias a distintos grupos farmacológicos.
- b)
- La utilización de sistemas virales de ciclo múltiple.
- c)
- Una mayor eficacia en la evaluación de aislados virales con baja capacidad replicativa.
La invención propuesta permite determinar este
parámetro y analizar directamente la capacidad replicativa viral en
dianas celulares muy próximas a las fisiológicas como linfocitos de
sangre periférica. El clonaje de los genes de la envuelta y
distintos fragmentos del ADN de gag-pol del
paciente en virus portadores de genes marcadores de ciclo múltiple
(Renilla) confiere al virus quimérico las propiedades replicativas
del virus mutado. A diferencia de los sistemas de evaluación del
fitness viral, extremadamente laboriosos, el desarrollo permite el
análisis de la capacidad replicativa del virus recombinante de forma
prácticamente continua.
La presente invención permite superar los dos
inconvenientes principales de las técnicas clásicas de determinación
de capacidad neutralizante en el suero de pacientes seropositivos ya
que permite analizar directamente la replicación viral y su
inhibición por los anticuerpos del paciente. Esto es posible
realizarlo tanto sobre aislados o clones virales de referencia, como
sobre un virus recombinante en el que la envuelta del clon viral ha
sido sustituida por la envuelta completa de la población viral del
paciente.
Este tipo de ensayo, denominado por el
solicitante "test autólogo de detección de anticuerpos
neutralizantes" tiene una elevada sensibilidad y permite una
evaluación precisa de la capacidad neutralizante del suero del
paciente frente a los virus que, en el momento del ensayo, estén
replicando en su organismo.
La invención propuesta permite determinar este
parámetro mediante dos herramientas: la generación de virus
recombinantes que portan la envuelta completa de la población viral
del paciente y la utilización de una célula diana que expresa
establemente ambos receptores (SSPA-B7).
La invención propuesta permite realizar en un
formato de microplaca fácilmente robotizable la detección de la
actividad antiviral en un modelo que abarca todo el ciclo
replicativo viral mediante la utilización de vectores de ciclo
múltiple. Con relación a los sistemas de determinación de actividad
antiviral actualmente existentes que valoran la protección frente al
efecto citopático, el sistema propuesto permita analizar la
inhibición directa de la replicación del VIH y acorta
considerablemente los tiempos de cribado (screening).
Figuras 1a y 1b: Esquemas ilustrativos
correspondientes a la producción de los clones virales de la
presente invención, conforme al proceso descrito en la realización
preferida 1.
Figura 2a y 2b: Representaciones gráficas
correspondientes a los resultados de los ensayos expuestos en el
apartado 2.1 de Modos de Realización de la Invención.
Figura 3: Representación gráfica correspondiente
a los estudios de determinación de capacidad replicativa expuestos
en el apartado 2.2. de Modos de Realización de la Invención.
Figura 4: Expresión de CCR5 y CXR4 por el clon
SSPA-B7, conforme al apartado 2.3 y 2.4 de Modos de
Realización de la Invención.
Figura 5: Efecto citopático inducido en el clon
SSPA-B7 por los aislados NL4.3(X4) y Bal
(R5), conforme al apartado 2.3 y 2.4 de Modos de Realización de la
Invención.
Figura 6: Análisis de la capacidad neutralizante
del virus NL-Luc del plasma de un paciente en las
condiciones del apartado 2.4(D) de Modos de Realización de la
Invención.
Figura 7: Resultados de los análisis de la
actividad antiviral de dos compuestos estudiados según el apartado
2.5(C) de Modos de Realización de la Invención.
Seguidamente se ilustra la presente invención
con una descripción detallada de realizaciones preferidas, en la que
se muestran los clones virales recombinantes de la invención así
como sus principales aplicaciones junto con alguna de las técnicas
generales de ingeniería genética empleadas en los diferentes casos,
y todo ello haciendo uso de las figuras adjuntas para mayor
claridad.
Se basa en el sistema de clonación de los
fragmentos génicos de la transcriptasa inversa y de la proteasa del
VIH en vectores virales portadores de genes marcadores.
En la Figura 1a y 1b puede observarse
esquemáticamente como se producen las partículas virales durante las
48 horas posteriores a la transfección del plásmido viral en células
293T. La línea celular 293T se obtuvo del Depósito de la ATCC. El
clon SSPA-B7 ha sido obtenido por el solicitante a
partir de la línea celular MT-2 mediante
transfección de un vector de expresión del gen CCRS provisto de un
marcador de resistencia para Geneticina. Después de la transfección
se recogen los sobrenadantes y se infectan las células diana
SSPA-B7. La capacidad de los virus para completar
un ciclo de replicación se cuantifica midiendo la actividad
luciferasa en las células diana. La actividad de los inhibidores de
la proteasa se mide añadiendo los primeros a las células
transfectadas mientras que la actividad frente a inhibidores de la
transcriptasa inversa y de la entrada se mide añadiendo los
fármacos a las células infectadas.
El proceso comprende las siguientes
operaciones:
- -
- A partir de 0,5 ml de plasma del paciente se realiza la extracción del ARN del VIH.
- -
- El ARN viral es retrotranscrito y posteriormente amplificado utilizando cebadores específicos de cada gen viral mediante la reacción en cadena de la polimerasa. Los cebadores incluyen sitios de restricción específicos para el posterior clonaje en el virus de referencia del gen pol o sus fragmentos o del gen env en los diferentes clones virales según el tipo de virus recombinante que se desea generar.
- -
- Tras la digestión enzimática del amplificado y del virus de referencia se realiza un proceso de ligación in vitro utilizando la T4 ligasa.
- -
- La población del provirus recombinante generado se transfecta en la línea celular 293-T y actúa como célula productora de virus recombinantes.
- -
- La progenie infecciosa de virus recombinantes se recoge a las 48 horas de la transfección y se utiliza para infectar la línea celular SSPA-B7.
- -
- Cuando la aplicación es la determinación de resistencias a antiretrovirales los dos últimos procesos se realizan en presencia de inhibidores de la Proteasa (tratando las células productoras 293-T), inhibidores de la transcriptasa inversa (tratando las células diana SSPA-B7) o inhibidores de la entrada viral (tratando las células diana SSPA-B7).
- -
- El nivel de sensibilidad de los distintos fármacos se define mediante la concentración inhibitoria del 50% de la replicación viral (IC50) en comparación con un virus de referencia sin mutaciones de resistencia asociadas.
- -
- La lectura de la sensibilidad a los distintos fármacos se realiza cuantificando la actividad renilla mediante un luminómetro Berthold Orion Microplate.
- Se parte del vector proviral NL4.3 (Adachi et al. 1986). Este clon ha sido modificado genéticamente en el laboratorio produciendo clones virales de ciclo múltiple que expresan el gen indicador Renilla en lugar de nef y en los que se han introducido diferentes dianas de restricción para poder clonar el gen pol completo, los fragmentos Transcriptasa inversa o Proteasa separadamente, las regiones gag-proteasa y gag-pol o el gen env completo.
Los clones virales recombinantes obtenidos
permiten clonar el gen pol completo del paciente, la
Transcriptasa inversa y la proteasa separadamente y la región
gag junto con la proteasa o el gen pol completo.
Asimismo permiten el clonaje del gen env completo del
paciente. Todos son virus de ciclo múltiple y muy útiles cuando
existen múltiples mutaciones de resistencia en la RT y la Proteasa
del paciente ya que se mejora la capacidad replicativa final.
- En las operaciones más importantes anteriormente mencionadas, se emplean los siguientes cebadores y las siguientes células:
5' TATGAAACTTACGGGGATACTTGGG 3' (posición 5697
-5721 del pNL4.3)
5' CTGCCAATCAGGGAAGTAGCCTTGTGT 3' (posición 9135
-9161 del pNL4.3)
(diana XbaI)
5'
GTAGCAATAATAATAGC TCTAGA GCTGTGGTCCATAGTAATC3'
(posición 6097 - 6138 del pNL4.3)
(diana Not I) 5'
TACTTTTT GCGGCCGC GCCACCCATCTTATAGC
(posición 8779 - 8811 del pNL4.3)
El procedimiento expuesto en los apartados
anteriores empleando los cebadores, sondas, secuencias dianas,
líneas celulares y condiciones indicadas ha permitido la obtención
de los clones virales de la presente invención:
Los clones ensayados han sido los
siguientes:
Los resultados de los ensayos efectuados con
estos clones virales conforme al sistema de la invención para la
determinación de resistencias fenotípicas frente a fármacos
antirretrovirales se ilustran en las figuras 2a y 2b.
La figura 2a representa el perfil fenotípico de
sensibilidad al clon viral IP HIV NL Ren frente a los
siguientes fármacos: inhibidores de la transcritasa inversa análogos
a nucleósidos 3TC (A), AZT/ZDV (B), d4T (C), ddI (D); inhibidores de
la transcriptasa inversa no análogos a nucleósidos; Efavirenz (E);
inhibidores de la proteasa: Saquinavir (F).
La figura 2b es una representación gráfica
ilustrativa de un estudio de la determinación de la resistencia de
AZT en un virus Widl type (línea continua) y en virus con las
mutaciones M41L,K70R,T215F,K219Q (línea discontinua):Fold=36.
Entre las ventajas de este sistema frente a
otros sistemas existentes en la actualidad, pueden mencionarse los
siguientes:
- a.
- Posibilidad de analizar separadamente la resistencia a inhibidores de la proteasa y de la transcriptasa inversa. Esto posibilita la evaluación independiente de resistencias a distintos grupos farmacológicos.
- b.
- Mayor eficacia en la evaluación de aislados virales con baja capacidad replicativa.
- c.
- Permite el seguimiento de determinados pacientes en fracaso terapéutico.
- d.
- Con respecto al sistema patentado por Virologic (Patente US 5.837.464), el sistema de clones virales recombinantes de la presente invención tiene sensibles diferencias, las cuales repercuten en las importantes ventajas citadas anteriormente, a saber:
- \bullet
- Virologic clona el gen luciferasa en la envuelta y el solicitante en Nef.
- \bullet
- Virologic utiliza enzimas similares pero no idénticos a los que se utilizan aquí.
- \bullet
- El sistema de la presente invención ha modificado por mutagénesis el esqueleto de NL4.3
- \bullet
- En la presente invención se pueden utilizar vectores de ciclo múltiple y clonaje separado de la RT y Proteasa y la evaluación de los fragmentos gag-Proteasa y gag-pol aspectos que el sistema de Virologic no permite.
En la figura 3 se representa un histograma en el
que se demuestra la mejora en la recuperación de un virus con
múltiples mutaciones de resistencia en la Proteasa y la RT cuando se
realiza el clonaje por separado de ambos fragmentos, que del gen
pol en bloque. Este efecto es debido al acúmulo de pérdida de
fitness viral que puede dar virus con escasa capacidad replicativa
difícil de detectar en ensayos de ciclo único cuando se suman las
pérdidas de fit debido a mutaciones en la Transcriptasa Inversa y la
Proteasa.
Los clones virales sometidos a evaluación han
sido los siguientes:
Las ventajas más destacables del sistema de la
invención respecto a otros existentes en la actualidad, son las
siguientes:
- a.
- El sistema es muy sensible al utilizar la actividad renilla.
- b.
- El sistema mide directamente actividad antiviral, no como el test de MTT que mide protección frente al efecto citopático, una medida indirecta de la replicación viral.
- c.
- Tiene la posibilidad de clonar separadamente la transcriptasa inversa o la proteasa lo que permite definir en qué proteína radica la pérdida de capacidad replicativa.
- d.
- Tiene la posibilidad de clonar conjuntamente el gen gag-pro lo que permite definir el papel de sitios de escisión en la poliproteína del core viral por la proteasa del VIH en la mejora de la capacidad replicativa viral.
- e.
- La utilización de sistemas virales en los que puede detectarse replicación con un número limitado de ciclos permite que, cuando existe escape viral, no se igualen las curvas de neutralización en múltiples ciclos del virus.
La invención propuesta se basa en el sistema de
clonación de los fragmentos génicos de la envuelta en vectores
virales portadores de genes marcadores. Se requiere a la vez una
célula que exprese los dos correceptores mayores del virus CCR5 y
CXCR4.
A partir de 0,5 ml de plasma del paciente se
realiza la extracción del ARN del VIH.
- -
- El ARN viral es retrotranscrito y posteriormente amplificado utilizando cebadores mediante la reacción en cadena de la polimerasa. Los cebadores incluyen sitios de restricción específicos para el posterior clonaje en el virus de referencia e incluyen toda la envuelta del virus.
\newpage
- -
- Tras la digestión enzimática del amplificado y del virus de referencia se realiza un proceso de ligación in vitro utilizando la T4 ligasa.
- -
- La población de virus recombinantes generados se transfecta en la línea celular 293-T y actúa como célula productora de virus recombinantes.
- -
- La progenie infecciosa de virus recombinantes se recoge a las 48 horas de la transfección y se utiliza para infectar la línea celular diana SSPA-B7 que expresa CCR5 y CXCR4 (Figura 4).
Se parte del vector proviral NL4.3 (Adachi et
al. 1986). Estos clones han sido modificados genéticamente en el
laboratorio produciendo clones virales de ciclo múltiple y en los
que se clona el gen env completo. Con el virus recombinante
generado se puede analizar el tropismo viral o la resistencia a
inhibidores de la entrada. Los correspondientes clones virales son
los siguientes:
Se ha generado mediante técnicas de ingeniería
genética un clon celular de SSPA-B7 que expresa el
receptor CCR5 (Figura 4) y que es susceptible a la infección por
virus R5, X4 6 R5X4. La infección por estas tres variantes es
productiva e induce efecto citopático (Figura 5).
Las ventajas más destacables de este sistema
frente a otros sistemas existentes en la actualidad, son las
siguientes:
- a.
- La posibilidad de clonar la envuelta completa del VIH. Otros sistemas utilizan la recombinación que presenta una eficacia muy baja o clonan fragmentos más pequeños de la envuelta.
- b.
- La disponibilidad de una célula propia que expresa los receptores CCR5 y CXCR4.
- c.
- Su utilización en tests fenotípicos a inhibidores de la entrada.
La invención propuesta se basa en la medición de
la actividad neutralizante en el suero de pacientes frente a la
infección de una línea permisiva de virus portadores de genes
marcadores y con diferentes envueltas. El sistema incluye dos clones
virales con envueltas R5 y X4 y una célula que expresa los dos
correceptores mayores del virus CCR5 y CXCR4.
Se parte del vector proviral NL4.3 (Adachi et
al. 1986). Estos clones han sido modificados genéticamente en el
laboratorio produciendo clones virales de ciclo múltiple y en los
que se clona el gen env completo. Con el virus recombinante generado
se puede analizar la capacidad neutralizante frente a distintas
envueltas del virus incluyendo la del virus del propio paciente. Los
correspondientes clones virales así obtenidos y evaluados han sido
los
siguientes:
siguientes:
Se ha generado mediante técnicas de ingeniería
genética un clon celular de SSPA-B7 que expresa el
receptor CCR5 (figura 4) y que es susceptible a la infección por
virus R5, X4 o R5X4. La infección por estas tres variantes es
productiva e induce efecto citopático (figura 5).
Los resultados de los ensayos efectuados con
estos clones virales conforma el sistema de la invención para la
detección y titulación de anticuerpos neutralizantes que se
ilustran en la figura 6.
Dicha figura 6 es una representación gráfica en
la que se ilustran los resultados del análisis de la capacidad
neutralizante del virus HIV NL Ren del plasma de un paciente antes
(4.35) y después (4.2) de realizar una serie de interrupciones
controladas de tratamiento. En el ensayo clásico de MTT no se
pudieron observar diferencias entre ambas muestras.
Entre las ventajas del sistema respecto a otros
existentes en la actualidad cabe destacar las siguientes:
- a.
- El sistema es muy sensible al utilizar la actividad renilla.
- b.
- El sistema mide directamente actividad antiviral, no como el test de MTT que mide protección frente al efecto citopático, una medida indirecta de la replicación viral.
- c.
- Tiene la posibilidad de clonar la envuelta completa de diferentes VIH o incluso la del propio paciente ("test de neutralización autóloga").
- d.
- La utilización de sistemas virales en los que puede detectarse replicación con un número limitado de ciclos permite que, cuando existe escape viral, no se igualen las curvas de neutralización en múltiples ciclos del virus.
- e.
- La disponibilidad de una célula propia que expresa los receptores CCR5 y CXCR4.
- f.
- El interés renovado en el estudio de anticuerpos neutralizantes en el contexto de nuevos modelos de vacunas y su utilización como marcador surrogado que aumentará la demanda de estos tests en un futuro inmediato.
- g.
- El sistema es robotizable.
La invención propuesta se basa en la medición de
la actividad frente al VIH antiviral de compuestos químicos y
derivados de productos naturales utilizando virus portadores de
genes marcadores.
Se parte del vector proviral NL4.3 (Adachi et
al. 1986). Estos clones han sido modificados genéticamente en el
laboratorio produciendo clones virales de ciclo múltiple con la
envuelta del VIH.
Limitando la infección a un solo ciclo de
replicación (18 h) se puede detectar una actividad antiviral desde
el proceso de entrada hasta la transcripción/traducción de
proteínas virales. En este periodo de tiempo no se detectaría la
acción antiviral en pasos posteriores como en el caso de los
inhibidores de proteasa o los inhibidores de encapsidamiento o
gemación viral.
Para estos casos se evalúa la actividad renilla
más allá del primer ciclo (18 horas). Una disminución en la
actividad luciferasa en el ciclo único y múltiple indica que el
compuesto actúa en estadíos previos al procesamiento de proteínas
virales. Sin embargo, si sólo actúa sobre el ciclo múltiple
indicaría que actúa en estadías post- integración/replicación viral.
El correspondiente clon viral recombinante es el siguiente.
Los resultados de los ensayos efectuados con
estos clones virales conforme al sistema de la invención para el
cribado de compuestos, se ilustran en la Figura 7, en la cual se
muestran las representaciones gráficas correspondientes al análisis
de la actividad antiviral de dos compuestos derivados de productos
vegetales. En el ensayo clásico de MTT se mide la toxicidad del
compuesto (línea con rombos) y la protección frente al efecto
citopático (línea con cuadrados). En los paneles de la derecha se
analiza la inhibición de la replicación de un virus luciferasa.
Ambos compuestos están siendo caracterizados en su mecanismo de
acción en este momento y conocemos que el compuesto 039 es un
inhibidor de la entrada viral.
Cabe destacar las siguientes ventajas del
sistema respecto a otros existentes en la actualidad
- a.
- No se han descrito sistemas de evaluación de actividad antiviral utilizando virus recombinantes.
- b.
- El sistema es muy sensible al utilizar la actividad renilla.
- c.
- El sistema mide directamente actividad antiviral, no como el test de MTT que mide protección frente al efecto citopático, una medida indirecta de la replicación viral.
- d.
- El sistema es robotizable y aplicable a cribado masivo.
Claims (13)
1. Clones virales recombinantes basados en VIH,
caracterizados porque poseen la siguiente estructura
general:
- (I)
- donde LTR son regiones con secuencia redundante (R) que juega un papel primordial durante el proceso de retrotranscripción; gag es el gen que codifica para la proteína p55 de la cápsida formada por 3 subunidades proteicas (MA, CA y NC); pol es el gen que codifica las enzimas virales necesarias para el proceso de replicación viral: proteasa (PRO), la transcriptasa inversa (RT) e integrasa; vif codifica la proteína Vif asociada con la infecciosidad de los viriones extracelulares; vpr codifica la proteína Vpr que actúa como acelerador del ciclo de replicación a distintos niveles; tat codifica la proteína Tat que es un transactivador; vpu codifica para Vpu implicada en la liberación de los viriones; env es el gen que codifica la proteína gp160 de la envuelta viral; rev produce la proteína Rev, encargada del procesamiento y transporte al citoplasma del ARN mensajero; nef codifica la proteína Nef que regula negativamente moléculas CD4 y HLA de la célula infectada y desempeña un papel en la patogenicidad del virus; NotI y XhoI indican sitios únicos de restricción en la secuencia de ADN; Renilla indica la posición de clonaje del gen reportero.
2. Clon viral recombinante según la
reivindicación 1, caracterizado porque dicho clon es el clon
IP HIV NL Ren, depositado en la Colección Española de Cultivos Tipo
como CECT 5842 y que tiene la siguiente estructura general:
donde Apa I y Age I representan
sitios únicos de restricción en la secuencia de ADN y los restantes
símbolos tienen el significado dado anteriormente para la Estructura
general
I.
3. Clon viral recombinante según la
reivindicación 1, caracterizado porque dicho clon es el clon
IP HIV NL LacZ/rt Ren, depositado en la Colección Española de
Cultivos Tipo como CECT 5845 y que tiene la siguiente estructura
general:
donde LacZ indica la posición de
clonaje del gen LacZ indica la posición de clonaje del gen LacZ
sustituyendo un fragmento del gel pol, y los restantes símbolos
tienen los significados definidos en las reivindicaciones
precedentes.
4. Clon viral recombinante según la
reivindicación 1, caracterizado porque dicho clon es el clon
IP HIV NL LacZ/pr Ren, depositado en la Colección Española de
Cultivos Tipo como CECT 5846 y que tiene la siguiente estructura
general:
donde NcoI indica un sitio único de
restricción en la secuencia de ADN, y los restantes símbolos tienen
el significado dado en las reivindicaciones
precedentes.
5. Clon viral recombinante según la
reivindicación 1, caracterizado porque dicho clon es el clon
IP HIV NL LacZ/pol Ren, depositado en la Colección Española de
Cultivos Tipo como CECT 5847 y que tiene la siguiente estructura
general:
donde los diferentes símbolos
tienen el significado dado en las reivindicaciones
precedentes.
6. Clon viral recombinante según la
reivindicación 1, caracterizado porque dicho clon es el clon
IP HIV NL LacZ/gag-pr Ren, depositado en la
Colección Española de Cultivos Tipo como CECT 5848 y que tiene la
siguiente estructura general:
donde NarI y KspI indican sitios
únicos de restricción en la secuencia de ADN y los restantes
símbolos tienen el significado dado en las reivindicaciones
precedentes.
7. Clon viral recombinante según la
reivindicación 1, caracterizado porque dicho clon es el clon
IP HIV NL LacZ/env Ren, depositado en la Colección Española de
Cultivos Tipo como CECT 5844 y que tiene la siguiente estructura
general:
donde XbaI indica un sitio único de
restricción en la secuencia de ADN, "env paciente", indica la
posición de clonaje del gen del paciente, y los demás símbolos
tienen el significado dado en las reivindicaciones
precedentes.
8. Clon viral recombinante según la
reivindicación 1, caracterizado porque dicho clon es el clon
IP HIV JR Ren, depositado en la Colección Española de Cultivos Tipo
como CECT 5843 y que tiene la siguiente estructura general:
donde XbaI indica un sitio único de
restricción en la secuencia de ADN; "env
JR-CSF" indica la posición de clonaje del gen env
del clon JR-CSF en lugar de la envuelta de
NL4.3,
y los restantes símbolos tienen el significado
dado en las reivindicaciones precedentes.
9. Uso de clones virales recombinantes basados
en VIH, según la reivindicación 1, en métodos analíticos para la
determinación de resistencias fenotípicas a fármacos
antirretrovirales para el tratamiento de la infección por VIH.
10. Uso de clones virales recombinantes basados
en VIH conforme a la reivindicación 1, en métodos analíticos para la
determinación de la capacidad replicativa de virus recombinantes que
portan secuencias gag, pol y/o env de pacientes con infección
por VIH.
11. Uso de clones virales recombinantes basados
en VIH conforme a la reivindicación 1, en métodos analíticos para la
caracterización del tropismo viral en la infección por VIH.
12. Uso de clones virales recombinantes basados
en VIH conforme a la reivindicación 1, en métodos analíticos para la
detección de anticuerpos neutralizantes frente al VIH en suero de
pacientes seropositivos para VIH sometidos o no a vacunación.
13. Uso de clones virales recombinantes basados
en VIH conforme a la reivindicación 1, en métodos analíticos para el
estudio del cribado y caracterización de la actividad antiviral de
nuevos compuestos frente a VIH.
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