WO2005108588A1 - Nuevos clones virales recombinantes basados en vih y su utilización en métodos analíticos - Google Patents

Nuevos clones virales recombinantes basados en vih y su utilización en métodos analíticos Download PDF

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WO2005108588A1
WO2005108588A1 PCT/ES2005/000250 ES2005000250W WO2005108588A1 WO 2005108588 A1 WO2005108588 A1 WO 2005108588A1 ES 2005000250 W ES2005000250 W ES 2005000250W WO 2005108588 A1 WO2005108588 A1 WO 2005108588A1
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viral
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José ALCAMÍ PERTEJO
Javier GARCÍA PEREZ
Sonsoles SÁNCHEZ PALOMINO
Nuria GONZÁLEZ FERNÁNDEZ
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Fundación Para La Investigación Y La Prevención Del Sida En España
Instituto De Salud Carlos Iii
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    • C12N2740/16041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/16043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Definitions

  • HIV Human Immunodeficiency Virus
  • the proviral load which reflects the "pool" of lymphocytes infected with HIV, does not diminish by antiretroviral treatment or does so very slowly.
  • the suspension of antiretroviral medication causes a rapid rebound of the load viral at baseline levels, even in patients who were in apparently complete virological suppression ( ⁇ 5 copies of RNA / ml) for two years (Garc ⁇ a et al., 1999). All these data suggest that the prospect of AIDS eradication with currently available drugs seems unlikely (Ho. 1998, Wein et al., 1998, Zhang et al 1999, Furtado et al., 1999, Pomerantz. 1999).
  • Phenotypic resistance determinations are not routinely performed in patients with HIV infection who have virological failure due to their extreme laboriousness and high cost. These phenotypic resistance tests are usually carried out by a method selected from one of the following two groups of systems: a.
  • Classical systems They comprise, in a first step, the isolation of HIV from cultures of lymphocytes of the patient and, in a second step, the infection of target cells in the presence of the different antiretrovirals to determine the inhibitory concentration of the drugs (IC50 ) on a concrete isolate.
  • viral replicative capacity or “fitness” (Ruiz Jarabo et al., 2002, Domingo et al., 2001).
  • the viral fit is a final result of multiple characteristics of the virus in the process of adaptation to its host.
  • a diminished viral fit is associated with the clinical evolution of the disease (Tersmette et al 1995; Learmont et al. 1995).
  • Cremette et al., 1995, Pantaleo et al., 1995, Michael et al., 1995 it is extremely difficult to isolate their viruses in culture due to their low replicative capacity (Cao et al., 1995, Pantaleo et al., 1995, Michael et al., 1995).
  • Viral fitness determination systems are based on competition studies in culture between a wild virus and a virus that has different mutations (Yuste et al., 1999, Iglesias et al., 2002). These methods require prolonged cultivation so they are extremely laborious, expensive and difficult to standardize.
  • neutralizing In contrast to antibodies that block the entry of the virus into the target cell by different mechanisms have efficacy in the control of the infection.
  • This type of antibody is called “neutralizing” and the importance of its role in HIV infection has been shown by different works in recent years (Burton DR, 2002, Moore J and Burton DR., 1999).
  • the measurement of neutralizing antibodies is important in a series of clinical situations, since their presence has been shown to be associated with good prognosis of the infection (Cao et al., 1995, Lathey et al., 1997; Pilgrim et al., 1997, Lomis-Price and cois., 1998).
  • the greatest application of neutralizing antibody detection will occur in the coming years in the evaluation of new vaccines against HIV.
  • viral tropism or HIV's ability to enter the cell through different receptors
  • CCR5 and CXCR4 Two major HIV receptors, called CCR5 and CXCR4 (Loetscher et al., 2000) makes the different viral variants are classified into three categories: R5, X4 and R5X4 depending on their ability to enter the cell by one of the two receptors exclusively or both receptors (Berger et al., 1998).
  • the measurement of viral tropism is not usually performed as a diagnostic test but represents a very useful parameter in certain areas of research.
  • the molecule and its derivatives must be characterized in terms of its toxicity and antiviral activity in a series of models that must be robotizable to allow a high efficiency screening, since they must be tested in the order of thousands of compounds.
  • HIV coreceptors role of structure, posttranslational modifications, and internalization in viral-cell fusion and as targets for entry inhibitors. Biochim Biophys Acta. 2003; 1614: 51-61. Zhang I, Ramratnam B, Tenner-Racz K. And cois. Residual quantifying HIV-1 replication in patients receiving combination antiretroviral therapy. N.Eng. J.Med.1999; 340: 1605-13.
  • the present invention refers to the generation of new HIV-based recombinant viral clones and their use in analytical methods.
  • the definition is the same, but substituting HIV for HIV-1.
  • the recombinant viral clones of the present invention are the clones resulting from a series of genetic manipulations performed on said fragment : of DNA including deletion of viral genes, insertion of marker genes, introduction of mutations and replacement of genes or gene fragments of the original clone by those of other clones or viral populations.
  • deletion of fragments of HIV, such as the Nef gene so as to maintain the infective capacity of the generated recombinant viral clones, insertion, in the proviral DNA of the renilla marker gene, a gene not expressed in human cells.
  • the gene to function as a marker of the infection, that is, a cell that expresses renilla indicates that it has been infected, - insertion of the LacZ gene that codes for the enzyme Beta-galactosidase substituting different sequences of the gene a for, on the one hand , to recognize the frequency of generation of recombinant viruses and, on the other, to avoid the dragging of wild viruses; introduction by directed mutagenesis of restriction sites that allow to easily "extract" certain DNA fragments from the matrix provirus (such as, for example, the Reverse Transcriptase, the Protease, the complete Pol gene, gag, nef, or the envelope of the virus) , to replace them with genes from isolates from patients to be assessed.
  • the matrix provirus such as, for example, the Reverse Transcriptase, the Protease, the complete Pol gene, gag, nef, or the envelope of the virus
  • the system of marking with renilla has multiple advantages compared to the marking systems currently used more commonly, being especially noteworthy that: the detection of renilla is a technique that has a high sensitivity can be performed automatically and is even robotable is a cheap assay detection after infection with a virus renilla carrier as a marker is very fast (24 hours) compared to conventional viral replication detection systems that require between 5 days and a week of culture.
  • the HIV-based recombinant viral clones of the present invention are characterized in that they possess the general structure represented in Figure 8, which comprises in the 5 'to 3' direction the following elements:
  • - gag is the gene that codes for the p55 protein of the capsid formed by 3 protein subunits (MA, CA and NC);
  • - pol is the gene that encodes the viral enzymes necessary for the viral replication process: protease (PRO), reverse transcriptase (RT) and integrase, and flap at its 5 'end with the element gag;
  • - vif is the gene that encodes the Vif protein associated with the infectivity of the extracellular virions, and laps at its 5 'end with the pol element and at its 3' end with the vpr element;
  • - vpr is the gene that encodes the Vpr protein that acts as an accelerator of the replication cycle at different levels, and overlaps its 5 'end with the vif element;
  • - tat is the gene that encodes the Tat protein that is a transactivator, and its second exon is contained in the env sequence
  • - vpu is the gene that codes for Vpu involved in the release of virions
  • - env is the gene encoding the gpl60 protein of the viral envelope
  • - rev is the gene that encodes the Rev protein, responsible for the processing and transport to the cytoplasm of the messenger RNA, and its second exon is contained in the env sequence
  • - nef is the gene that encodes the Nef protein that negatively regulates CD4 and HLA molecules of the infected cell and plays a role in the pathogenicity of the virus, and is truncated in the bases in position 8,796 and 8,887 in the viral genome
  • - Notl is a target for the Notl restriction enzyme that has been introduced by site-directed mutagenesis at the 9,796 position of the viral genome;
  • - Xhol is a restriction target for the Xhol enzyme, located at position 8887 of the viral genome; - Renilla is the gene that codes for Renilla luciferase reporter protein and that has been cloned in the Notl-Xhol restriction sites at positions 5 'and 3', respectively; and - LTR, which at its 5 'end overlaps the 3' end of the nef element.
  • Figure 8 To obtain the viral clones of the invention represented by the general structure ( Figure 8), we start from the proviral vector NL .3 [Adachi A. Gendelman HE, Koenig S, Folks, T, Willey R, Rabson A, Martin MA.
  • IP HIV NL Neo Ren vector of the beta-galactosidase gene at the position of the RT IP HIV NL LacZ / rt Ren
  • Protease IP HIV NL LacZ / pr Ren
  • IP HIV NL LacZ / pol Ren IP HIV NL LacZ / pol Ren
  • IP HIV NL LacZ / pr Ren plasmid From the IP HIV NL LacZ / pr Ren plasmid, destruction of the NarI restriction site external to the provirus by site-directed mutagenesis and introduction of the KspI restriction site at position 4498 by site-directed mutagenesis (IP HIV NL LacZ / gag-pr Ren).
  • IP HIV NL LacZ / gag-pr Ren g.
  • h) Deletion of the envelope in the IP HIV NL Xbal Ren plasmid by cutting with the restriction enzymes Xbal and Notl and cloning in place of the lacZ gene (IP HIV NL LacZ / env Ren). i).
  • IP HIV NL Ren (CECT 5842) It is a recombinant viral clone based on the general structure described above, characterized in that it has unique restriction sites for the Apal and Agel enzymes introduced in positions 2006 and 3485, respectively, as shown in Figure 9.
  • IP HIV NL LacZ / pol Ren (CECT 5847) It is a recombinant viral clone based on the general structure described above, characterized in that it has the cloned LacZ gene in the Apal-Agel restriction sites at positions 5 'and 3' respectively, substituting the fragment of the polque gene codifies for protease and retrotranscriptase, as shown in figure 10.
  • IP HIV NL LacZ / pr Ren (CECT 5846) It is a recombinant viral clone based on the general structure described above, characterized in that it possesses a unique restriction site for the Ncol enzyme introduced by site-directed mutagenesis at position 2593 of the DNA sequence, and the LacZ gene cloned into the Apal -Ncol restriction sites at 5 'and 3' positions, respectively, substituting the pol gene fragment encoding the protease, as depicted in Figure 11.
  • IP HIV NL LacZ / rt Ren (CECT 5845) Recombinant viral clone based on the general structure described above, characterized in that it has a target for the restriction enzyme Ncol that has been introduced by site-directed mutagenesis at position 2593 of the DNA sequence, and the LacZ gene cloned into the Ncol-Agel restriction sites at 5 'and 3' positions respectively, substituting the pol gene fragment encoding the retrotranscriptase ( Figure 12).
  • IP HIV NL LacZ / gag-pr Ren (CECT 5848) Recombinant viral clone based on the general structure described above, characterized in that possesses unique restriction sites, introduced by site-directed mutagenesis, for the enzymes NarI and KspI, the latter introduced by site-directed mutagenesis, at positions 637 and 4,498, respectively, of the DNA sequence, respectively, and the LacZ gene cloned into the sites of restriction Apal -Ncol in positions 5 'and 3' respectively, substituting the fragment of the pol gene coding for the protease. ( Figure 13).
  • IP HIV NL LacZ / env Ren (CECT 5844) Recombinant viral clone based on the general structure described above, characterized in that it possesses a unique restriction site for the Xbal enzyme introduced by site-directed mutagenesis at position 6.112 of the DNA sequence, so which allows cloning of the envelope gene of the patient's virus, and also has the cloned LacZ gene at the Xbal-Notl restriction sites at positions 5 'and 3' respectively substituting the env gene. ( Figure 14).
  • IP HIV JRRen (CECT 5843) Recombinant viral clone based on the general structure described above, characterized in that it possesses a unique restriction site for the Xbal enzyme introduced by site-directed mutagenesis at position 6.112 of the DNA sequence, and the gene "env JR -CSF ", which corresponds to the env gene of the JR-CSF clone, replacing the original env gene.
  • This clone is represented in figure 15.
  • the recombinant viral clones of the present invention have been shown to be very useful in. the development or improvement of analytical methods and techniques related to AIDS research. In fact, in the concrete techniques that were described in the section on State of the Art, said clones have supposed important advantages, some of which are detailed below:
  • Systems for determining phenotypic resistance to antiretroviral drugs The proposed invention is based on the cloning system of the gene fragments of the reverse transcriptase, the envelope and the HIV Protease in viral vectors carrying marker genes.
  • This invention presents a series of advantages with respect to those already existing, namely: a) The possibility of separately analyzing the resistance to inhibitors of the Protease, the Reverse Transcriptase and the envelope. This allows the independent evaluation of resistance to different pharmacological groups. b) The use of multiple cycle viral systems. c) Greater efficacy in the evaluation of viral isolates with low replicative capacity.
  • the proposed invention allows to determine this parameter and directly analyze the viral replicative capacity in cellular targets very close to the physiological ones such as peripheral blood lymphocytes. Cloning of the envelope genes and different fragments of the patient's gag-pol DNA in viruses carrying multiple cycle marker genes
  • the present invention allows to overcome the two main disadvantages of the classical techniques of determination of neutralizing capacity in the serum of seropositive patients since it allows to directly analyze the viral replication and its inhibition by the antibodies of the patient. This can be done either on isolates or viral reference clones, or on a recombinant virus in which the envelope of the viral clone has been replaced by the complete envelope of the viral population of the patient. This type of test, named by the applicant
  • “Autologous neutralizing antibody detection test” has a high sensitivity and allows an accurate evaluation of the neutralizing capacity of the patient's serum against the viruses that, at the time of the test, are replicating in your body.
  • Systems for the characterization of viral tropism in HIV infection The proposed invention allows to determine this parameter by means of two tools: the generation of recombinant viruses that carry the complete envelope of the viral population of the patient and the use of a target cell that expresses Stably both receivers (SSPA-B7).
  • Experimental models for the screening of compounds with potential antiviral activity The proposed invention allows the detection of antiviral activity in a microplate format easily robotizable in a model that covers the entire viral replicative cycle by using multiple cycle vectors.
  • the present invention also relates to the use of the viral clones described above in analytical methods for the determination of phenotypic resistance to antiretroviral drugs for the treatment of HIV infection.
  • a specific embodiment of the invention refers to the use of said viral clones in analytical methods for the determination of the replicative capacity of recombinant viruses carrying gag, pol and / or env sequences from patients with HIV infection.
  • the present invention relates to the use of said recombinant viral clones in analytical methods for the characterization of viral tropism in HIV infection.
  • the present invention relates to the use of said recombinant viral clones in analytical methods for the detection of neutralizing antibodies against HIV in the serum of HIV-positive patients and uninfected subjects, whether or not subjected to vaccination.
  • the present invention relates to the use of said recombinant viral clones in analytical methods for the study of the screening and characterization of the antiviral activity of compounds against HIV.
  • Figures la and Ib Illustrative diagrams corresponding to the production of the viral clones of the present invention, according to the process described in the preferred embodiment 1.
  • Figure 2a and 2b Graphic representations corresponding to the results of the tests exposed in section 2.1 of Modes of Realization of the Invention.
  • Figure 3 Graphic representation corresponding to the studies of determination of replicative capacity exposed in section 2.2. of Modes of Realization of the Invention.
  • Figure 4 Expression of CCR5 and CXR4 by the clone SSPA-B7, according to sections 2.3 and 2.4 of Modes of Realization of the Invention.
  • Figure 5 Cytopathic effect induced in the clone SSPA-B7 by the isolates NL4.3 (X4) and Bal (R5), according to sections 2.3 and 2.4 of the embodiments of the invention.
  • Figure 6 Analysis of the neutralizing capacity of the NL-Luc virus of the plasma of a patient under the conditions of section 2.4 (D) of Modes of Carrying Out the Invention.
  • Figure 7 Results of the analysis of the antiviral activity of two compounds studied according to section 2.5 (C) of Modes of Carrying Out the Invention.
  • Figure 8 General structure of the recombinant viral clones of the present invention, where: LTR (long terminal repeats) are the regions with redundant sequence (R) that plays a key role during the retrotranscription process; gag is the gene that codes for the p55 protein of the capsid formed by 3 protein subunits (MA, CA and NC); pol is the gene that encodes the viral enzymes necessary for the viral replication process: protease (PRO), reverse transcriptase (RT) and integrase; vif encodes the Vif protein associated with the infectivity of the extracellular virions; vpr encodes the Vpr protein that acts as an accelerator of the replication cycle at different levels; tat encodes the Tat protein that is a transactivator; vpu encodes for Vpu involved in the release of the virions; env is the gene that encodes the gplSO protein of the viral envelope; rev produces the protein Rev, responsible for the processing and transport to the cytoplasm of messenger RNA; nef encodes
  • Figure 10 Recombinant viral HIV HIV NL LacZ / pol Ren clone, deposited in the Spanish Collection of Cultures Type as CECT 5847, where LacZ - indicates the cloning position of the LacZ gene by substituting a fragment of the pol gene, and the remaining symbols have the meaning mentioned above.
  • Figure 11 Recombinant viral HIV PI NL LacZ / pr Ren clone, deposited before the Spanish Collection of Cultures Type as CECT 5846, where Ncol indicates a unique restriction site of the DNA sequence, and the remaining symbols have the meaning given above.
  • Figure 12 Recombinant Viral HIV HIV NL LacZ / rt Ren clone, deposited with the Spanish Type Culture Collection as CECT 5845, where the different symbols have the same meaning indicated above.
  • Figure 13 Recombinant viral HIV PI NL LacZ / gag-pr Ren clone, deposited before the Spanish Collection of Cultures Type as CECT 5848, where NarI and KspI indicate unique restriction sites in the DNA sequence and the remaining symbols have the meaning dice previously .
  • Figure 14 Recombinant Viral HIV HIV NL LacZ / env Ren clone, deposited with the Spanish Type Culture Collection as CECT 5844, where Xbal indicates a unique restriction site in the DNA sequence, "patient send” indicates the position of cloning of the patient's gene, and the other symbols have the meaning given above.
  • Figure 15 HIV HIV recombinant viral clone JRRen, deposited with the Spanish Type Culture Collection as CECT 5843, where Xbal indicates a unique restriction site in the DNA sequence, "in JR-CSF” it indicates the cloning position of the env gene. of the clone JR-CSF instead of the envelope of NL4.3, and the remaining symbols have the meaning given above.
  • the ability of viruses to complete a replication cycle is quantified by measuring the luciferase activity in the target cells.
  • the activity of protease inhibitors is measured by adding the former to the transfected cells while the activity against reverse transcriptase inhibitors and entry is measured by adding the drugs to the infected cells.
  • the process comprises the following operations: From 0.5 ml of the patient's plasma, extraction of the HIV RNA is carried out. Viral RNA is retrotranscribed and subsequently amplified using specific primers of each viral gene through the polymerase chain reaction.
  • the primers include specific restriction sites for the subsequent cloning in the reference virus of the pol gene or its fragments or of the env gene in the different viral clones according to the type of recombinant virus that it is desired to generate.
  • an in vitro ligation process is performed using T4 ligase.
  • the population of the generated recombinant provirus is transfected in the 293-T cell line and acts as a recombinant virus producing cell.
  • the infectious progeny of recombinant viruses are picked up 48 hours after transfection and used to infect the SSPA-B7 cell line.
  • the last two processes are carried out in the presence of protease inhibitors (treating the 293 -T production cells), reverse transcriptase inhibitors (treating target cells SSPA-B7) or inhibitors. of the viral entry (treating target cells SSPA-B7).
  • the level of sensitivity of the different drugs is defined by the 50% inhibitory concentration of viral replication (IC50) compared to a reference virus without associated resistance mutations. The reading of the sensitivity to the different drugs is done by quantifying the renilla activity by means of a Berthold Orion Microplate luminometer.
  • This clone has been genetically modified in the laboratory producing multiple cycle viral clones that express the Renilla indicator gene instead of nef and in which different restriction targets have been introduced to be able to clone the complete pol gene, the Reverse Transcriptase or Protease fragments separately, the gag-protease and gag-pol regions or the complete env gene.
  • the obtained recombinant viral clones allow to clone the complete pol gene of the patient, the reverse transcriptase and the protease separately and the gag region together with the protease or the complete pol gene. They also allow the cloning of the complete env gene of the patient. All are multi-cycle viruses and very useful when they exist multiple resistance mutations in the RT and the
  • FIG. 2a represents the phenotypic profile of sensitivity of the viral HIV PI NL Ren clone against the following drugs: nucleoside reverse transcriptase inhibitors 3TC (A), AZT / ZDV (B), d4T (C), ddl (D ); non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors; Efavirenz (E); Protease inhibitors: Saquinavir (F).
  • a Possibility of analyzing separately the resistance to protease inhibitors and the reverse transcriptase. This allows the independent evaluation of resistance to different pharmacological groups.
  • b. Greater efficacy in the evaluation of viral isolates with low replicative capacity.
  • c. It allows the follow-up of certain patients in therapeutic failure.
  • d With respect to the system patented by Virologic (US Pat. No.
  • the system of recombinant viral clones of the present invention has significant differences, which impact on the important advantages cited above, namely: Virologic clones the luciferase gene in the envelope and the applicant in Nef. . Virologic uses enzymes similar but not identical to those used here.
  • the system of the present invention has modified the NL4.3 skeleton by mutagenesis.
  • multiple cycle vectors and cloning separated from the RT and Protease and the evaluation of the gag-Protease and gag-pol fragments can be used, aspects that the Virologic system does not allow.
  • 2.2.- DETERMINATION SYSTEM OF ⁇ replicative capacity Figure 3 shows a histogram showing the improvement in the recovery of a virus with multiple resistance mutations in the Protease and the
  • the viral clones subjected to evaluation have been the following: IP HIV NL LacZ / pol Ren, IP HIV NL LacZ / pr Ren, IP HIV NL LacZ / rt Ren, and IP HIV NL LacZ / gag-pr Ren,
  • IP HIV NL LacZ / gag-pr Ren IP HIV NL LacZ / gag-pr Ren
  • the system directly measures antiviral activity, not like the MTT test that measures protection against cytopathic effect, an indirect measure of viral replication.
  • c It has the possibility of cloning the reverse transcriptase or the protease separately, which allows defining in which protein the loss of replicative capacity lies.
  • d It has the possibility of cloning together the gag-pro gene which allows defining the role of cleavage sites in the polyprotein of the viral core by the HIV protease in the improvement of viral replicative capacity. and.
  • the use of viral systems in which replication can be detected with a limited number of cycles allows that, when there is a viral escape, the neutralization curves in multiple cycles of the virus do not equal.
  • the proposed invention is based on the cloning system of gene fragments of the envelope in viral vectors carrying marker genes. A cell that expresses the two is required at the same time Major co-receptors of the CCR5 and CXCR4 viruses.
  • A General description of the technique. The extraction of HIV RNA is performed from 0.5 ml of the patient's plasma. Viral RNA is retrotranscribed and subsequently amplified using primers through the polymerase chain reaction. The primers include specific restriction sites for subsequent cloning in the reference virus and include the entire envelope of the virus.
  • the corresponding viral clones are the following: IP HIV NL Ren, IP HIV JRRen and IP HIV NL LacZ / env Ren. (C) Cells. It has been generated by engineering techniques genetics a cell clone of SSPA-B7 that expresses the CCR5 receptor ( Figure 4) and that is susceptible to infection by virus R5, X4 or R5X4. The infection by these three variants is productive and induces cytopathic effect ( Figure 5).
  • the most remarkable advantages of this system compared to other existing systems currently, are the following: a. The possibility of cloning the complete HIV envelope.
  • Virus It is based on the proviral vector NL4.3 (Adachi et al.
  • Virus 20 activity against antiviral HIV of chemical compounds and derivatives of natural products using viruses carrying marker genes.
  • B Virus. It is based on the proviral vector NL4.3 (Adachi et al., 1986). These clones have been genetically modified in the laboratory producing multiple-cycle viral clones with the envelope of HIV. Limiting the infection to a single replication cycle (18h) can detect an activity
  • the system is very sensitive when using renilla activity.
  • the system directly measures antiviral activity, not like the MTT test that measures protection against cytopathic effect, an indirect measure of viral replication.
  • the system is robotizable and applicable to massive screening.

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Abstract

La presente invención se refiere a clones vírales recombinantes basados en VIH que poseen la estructura general representada en la figura 8 y son el resultado de las siguientes manipulaciones genéticas: -deleción de fragmentos de VIH (por ejemplo, gen Nef) sin perder capacidad infectiva, -inserción de un gen no expresado en células humanas, -inserción del gen LacZ, -introducción de sitios de restricción para extraer fragmentos de ADN del provirus matriz y sustituirlos por genes de pacientes a valorar. Asimismo, la invención se refiere a la aplicación de dichos clones en métodos analíticos relacionados con el SIDA.

Description

TITULO DE LA INVENCIÓN
NUEVOS CLONES VIRALES RECOMBINANTES BASADOS EN VIH Y SU
UTILIZACIÓN EN MÉTODOS ANALÍTICOS.
CAMPO TÉCNICO DE LA INVENCIÓN Dentro del amplio campo de la investigación que se está llevando a cabo en torno al SIDA y más concretamente al desarrollo de nuevas familias de fármacos, la presente invención se centra en la generación de unos nuevos clones virales recombinantes basados en el genoma del Virus de la Inmunodeficiencia Humana (VIH) destinados a utilizarse ventajosamente en tests de sensibilidad a fármacos, ensayos de detección de anticuerpos neutralizantes, estudio del tropismo y capacidad replicativa viral y métodos de cribado y caracterización de compuestos con actividad antiviral, etc.
ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR A LA INVENCIÓN En los últimos cinco años la evolución clínica de los pacientes infectados por el VIH ha mejorado espectacularmente gracias a la introducción de nuevas familias de fármacos antirretrovirales (Havlir y Lange, 1998) , y en «consecuencia se ha producido una disminución en el número de casos de SIDA, de incidencia de infecciones oportunistas y de mortalidad derivada de esta enfermedad. Sin embargo, los éxitos conseguidos con dichos fármacos lamentablemente no han posibilitado la erradicación de la enfermedad dado que a pesar de la disminución de la carga viral plasmática a niveles indetectables, la replicación viral persiste a bajo nivel en órganos linfoides (Chun y cois., 1997; Finzi y cois, 1997; Wong y cois., 1997) . Además, la carga proviral, que refleja el "pool" de linfocitos infectados por el VIH, no disminuye por el tratamiento antirretroviral o lo hace muy lentamente. (Sharkey y cois., 2000; Ramratnam y cois., 2000). Por último la suspensión de la medicación antirretroviral origina un rápido repunte de la carga viral a los niveles básales, incluso en pacientes que se encontraban en supresión virológica aparentemente completa (<5 copias de ARN/ml) durante dos años (García y cois., 1999). Todos estos datos sugieren que la perspectiva de erradicación del SIDA con los fármacos actualmente disponibles parece improbable (Ho. 1998; Wein y cois., 1998, Zhang y cois 1999; Furtado y cois., 1999, Pomerantz. 1999). Esta posibilidad de erradicación conlleva a medio plazo el desarrollo de virus resistentes a los fármacos antirretrovirales utilizados en cada paciente . En esta situación, continúan en marcha una serie de estrategias frente a esta enfermedad que pueden resumirse en los siguientes puntos : - Desarrollo de nuevos fármacos y, especialmente de nuevas familias de compuestos con dianas diferentes de las contempladas actualmente por los fármacos antirretrovirales. Desarrollo de vacunas terapéuticas y preventivas. - Desarrollo de estrategias de inmunoterapia dirigidas a potenciar el sistema inmunológico del paciente . Concomitantemente al desarrollo de estas estrategias para combatir la enfermedad, es imprescindible el desarrollo de métodos y técnicas analíticas para evaluar estos nuevos abordajes: modelos de determinación de resistencias a antirretrovirales, caracterización biológica de aspectos cualitativos de la biología del virus y desarrollo de modelos para la generación de plataformas de cribado y caracterización de la actividad antiviral de nuevos compuestos. En los párrafos siguientes se hará referencia a alguno de los métodos analíticos que se están empleando en la actualidad, y en los que la presente invención tiene una especial incidencia por sus ventajosas aportaciones. Sistemas de determinación de resistencias fenotípicas a fármacos antirretrovirales . Las determinaciones de resistencias fenotípicas no se realizan de forma rutinaria en los pacientes con infección por VIH que presentan fracaso virológico, debido a su extrema laboriosidad y elevado coste. Dichos tests de resistencias fenotípicas se realizan habitualmente por un método seleccionado entre uno de los dos grupos de sistemas siguientes: a. Sistemas clásicos: Comprenden, en un primer paso, el aislamiento del VIH a partir de cultivos de linfocitos del paciente y, en un segundo paso, la infección de células diana en presencia de los distintos antirretrovirales para determinar la concentración inhibitoria de los fármacos (IC50) sobre un aislado concreto. Estos sistemas son terriblemente costosos, largos, tediosos y requieren condiciones de bioseguridad accesibles a muy pocos laboratorios de virología (Richman y cois., 1993; Nagy y cois. , 1994) . b . Sistemas basados en técnicas de recombinación genética . En esta tecnología, las secuencias del gen pol son amplificadas a partir del plasma de los pacientes y transfectadas junto con provirus delecionados en dichas secuencias, en líneas celulares. Por reacciones de ligación "in vivo", en el interior de estas células se recombina un virus que lleva las secuencias Transcriptasa Inversa y Proteasa del virus del paciente. La progenie viral recombinante generada se utiliza para evaluar la IC50 en la infección de células diana. Existen distintas variantes de esta tecnología en cuanto a las secuencias y pasos de amplificación, células diana y utilización de marcadores (Boucher y cois., 1996; Hertogs y cois., 1998; Ruiz y cois, 1998; Little y cois., 1999; Borden y cois., 1999) . A pesar de estos desarrollos que simplifican los sistemas clásicos, las técnicas de ensayos de recombinación viral tienen limitaciones como las bajas tasas de recombinación in vivo y su coste y laboriosidad todavía elevados. Debido a su complejidad y dificultades de normalización, los tests de resistencia fenotípica a fármacos antirretrovirales están disponibles en la práctica en un pequeño número de laboratorios y se utilizan esencialmente con fines diagnósticos. Existe, por tanto, la necesidad de nuevas técnicas más sencillas y asequibles que permitan realizar estas determinaciones en cualquier laboratorio, de forma rápida, simple y económica. Sistemas para la determinación de la capacidad replicativa del VIH. Entre las características cualitativas existentes entre los distintos aislados del VIH se encuentra la
"capacidad replicativa" o "fitness" viral (Ruiz Jarabo y cois., 2002; Domingo y cois., 2001) . El fit viral es una resultante final de múltiples características del virus en el proceso de adaptación a su hospedador. Sin embargo en algunas situaciones se ha observado que una fit viral disminuida se asocia con la evolución clínica de la enfermedad (Tersmette y cois 1995; Learmont y cois 1995) . En concreto, en un porcentaje elevado de pacientes supervivientes a largo plazo es extremadamente difícil aislar sus virus en cultivo debido a su baja capacidad replicativa (Cao y cois., 1995; Pantaleo y cois., 1995, Michael y cois., 1995). Quizás de mayor relevancia clínica es el hecho de .que virus de pacientes multirresistentes parecen replicar con una menor capacidad (Mammano y cois., 2000; Martinez-Picado y cois., 2000; Nijhuis y cois., 2001; Spira y cois., 2003). Los sistemas de determinación de fitness viral se basan en estudios de competición en cultivo entre un virus silvestre y un virus que presenta distintas mutaciones (Yuste y cois. ,1999; Iglesias y cois. ,2002). Estos métodos requieren cultivos prolongados por lo que son extremadamente laboriosos, costosos y difíciles de normalizar. Sólo recientemente se ha propuesto la utilización de virus recombinantes para determinar el fitness viral (Deeks y cois., 2001; Barbour y cois., 2002) aunque esta técnica no se encuentra adecuadamente normalizada en el momento actual. Con el fin de poder evaluar de manera precisa la capacidad replicativa del virus, es imprescindible poder disponer de técnicas sencillas, fiables, asequibles y rápidas. Sistemas para la detección de la presencia de anticuerpos neutralizantes como parámetro de respuesta de eficacia de vacunas experimentales y de tratamientos inmunomoduladores . La infección por un virus induce en el hospedador una doble respuesta inmune específica: activación de linfocitos citotóxicos y producción de anticuerpos (McMichael A., 2001; Burton DR.,2002). De estos últimos, sólo los anticuerpos que bloquean la entrada del virus en la célula diana por distintos mecanismos poseen eficacia en el control de la infección. Este tipo de anticuerpos se denominan "neutralizantes" y la importancia de su papel en la infección por el VIH ha sido puesta de manifiesto por distintos trabajos en los últimos años (Burton DR., 2002; Moore J and Burton DR.,1999) . La medición de anticuerpos neutralizantes tiene importancia en una serie de situaciones clínicas, ya que se ha demostrado que su presencia se asocia a buen pronóstico de la infección (Cao y cois., 1995; Lathey y cois., 1997; Pilgrim y cois., 1997; Lomis-Price y cois., 1998). Sin embargo, la mayor aplicación de la detección de anticuerpos neutralizantes se producirá en los próximos años en la evaluación de nuevas vacunas frente al VIH. Existen en la actualidad más de 50 ' .preparados elaborados bajo normas GMP y 35 en fase I y II (McMichael AJ and Hanke T.,2003). En la evaluación de eficacia de estos preparados, la detección de anticuerpos neutralizantes constituirá junto con la actividad citotóxica frente al VIH, los dos parámetros que .-decidirán el pase del preparado a fases de estudio clínico más avanzadas (Poignard y cois., 1999; Moore JP . and Burton DR.,1999; Me Michael AJ and Rowland Jones SL. ,2001) . Los tests de neutralización o de detección de anticuerpos neutralizantes se realizan midiendo la inhibición de la lisis celular por el VIH en sistemas de infección in vi tro (Sattentau Q.,1996, Langlois y cois. , 1998) . Este modelo tiene dos inconvenientes importantes: a. Se mide un efecto indirecto de la replicación viral que es la destrucción celular, pero no se mide directamente la replicación del VIH. b. Se analiza la inhibición de una cepa de laboratorio, con lo que no se detectan anticuerpos frente al virus específico del paciente, un aspecto que puede afeotar a la caracterización de una respuesta específica del hospedador . Se han propuesto otras técnicas basadas en microscopía o citometría de células infectadas pero revisten una complejidad que no las hace viables como tests de rutina (Haussmann y cois., 1987; Mascóla y cois., 2002). Recientemente se ha introducido la técnica de inhibición de infección por virus recombinantes para analizar la capacidad neutralizante de sueros en distintos abordajes experimentales (Kolchinski y cois., 2001) y en muestras clínicas (Wei y cois., 2003; Richman y cois., 2003). Se hace, por tanto, imprescindible el desarrollo de nuevas técnicas que solventen estos dos grandes inconvenientes, permitiendo el análisis directo de la replicación viral y su inhibición por los anticuerpos del paciente, de alta sensibilidad y fiabilidad y que puedan llevarse a cabo de forma sencilla, rápida y económica. Sistemas para la caracterización del tropismo viral en la infección por el VIH. Además de los aspectos cuantitativos de la replicación viral que viene expresado por la carga viral plasmática, las diferentes variantes del VIH tienen una serie de características biológicas que caracterizan su patogenicidad. Entre éstas, el tropismo viral, o la capacidad del VIH de entrar en la célula a través de distintos receptores, es una de las características virales más importantes (Weiss RA.,1996, Oberlin y cois., 1997; Dorantz y cois., 1996; Glushakova y cois. ,1998) . La existencia de dos receptores mayores del VIH, denominados CCR5 y CXCR4 (Loetscher y cois., 2000) hace que las distintas variantes virales se clasifiquen en tres categorías: R5, X4 y R5X4 en función de su capacidad para entrar en la célula por uno de los dos receptores exclusivamente o ambos receptores (Berger y cois., 1998). La medición del tropismo viral no se realiza habitualmente como test diagnóstico pero representa un parámetro de gran utilidad en determinadas áreas de investigación. Sin embargo, la introducción de fármacos específicos de la entrada que tienen como diana uno de los dos receptores, CCR5 o CXCR4 , hace muy previsible que en el futuro se requiera una caracterización del tropismo viral del paciente antes de iniciar tratamiento frente a una de estas dianas (Lazzarin y cois ., 2003 ;Este JA., 2003; Zaitseva y cois., 2003) . Por lo tanto, existe la necesidad de disponer de sistemas que permitan la caracterización del tropismo viral en la infección por el VIH en un paciente, mediante técnicas sencillas y asequibles a cualquier laboratorio de análisis, sistemas de los cuales hoy en día se carece. Modelos experimentales que permitan el rápido cribado de compuestos con potencial actividad antiviral . Los tratamientos actuales no permiten una cura de la infección por el VIH por lo que el desarrollo de nuevos fármacos es una prioridad en el contexto de la investigación sobre el SIDA (De Clercq y cois., 2002). Existen esencialmente dos fuentes de nuevos fármacos: derivados de productos naturales, esencialmente procedentes del reino vegetal o generados por química combinatoria a partir de modelos informáticos o de estructuras cristalinas de las moléculas diana (Chu and Cutler., 1992; Jung y cois., 2000; Kno les y cois., 2003; Rudin y cois ., 2003 ;Agrafiotis y cois., 2002). En ambos casos, la molécula y sus derivados ha de ser caracterizada en cuanto a su toxicidad y actividad antiviral en una serie de modelos que deben ser robotizables para permitir un cribado de alta eficacia, ya que deben ensayarse del orden de miles de compuestos. Existen distintos sistemas utilizados actualmente que van desde los clásicos en que se mide la protección frente al efecto citopático de un virus de referencia -(Pauwels y cois., 1987), o los específicos que analizan una diana determinada mediante tests bioquímicos (Hazuda y cois., 2000; Cherepanov y cois., 1997; Walters y cois. ,2003) . No obstante, sigue existiendo una demanda de sistemas de cribado que permita el desarrollo de modelos robotizables con los cuales puedan llevarse a cabo los ensayos de cribado de los miles de compuestos a probar de forma más rápida, fiable, segura y a menor coste (Federsel y cois., 2003; Bleicher y cois. ,2003). Pues bien, ante la situación actual anteriormente expuesta, el solicitante ha encaminado sus esfuerzos investigadores en la búsqueda de nuevos clones virales recombinantes, cuya obtención, identificación y aplicaciones les han permitido la culminación de la presente invención, que representa un gran avance en la resolución de los problemas e inconvenientes antes mencionados, como se irá deduciendo fácilmente de la lectura detallada del resto de la presente memoria descriptiva Seguidamente se proporciona el listado de las referencias bibliográficas completas que se han ido citando abreviadamente en los párrafos precedentes. - Agrafiotis DK et al. Combinatorial informatics in the post-genomics ERA. Nat Rev Drug Discov. 2002; 1:337 - Barbour JD, Wrin T, Grant RM, Martin JN, Segal MR, Petropoulos CJ, Deeks SG. 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DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención, tal y como se indica en su enunciado se refiere a la generación de nuevos clones virales recombinantes basados en VIH y a su utilización en métodos analíticos. Dentro del contexto de la presente invención se denomina clon vira! de VIH a un fragmento de ADN que contiene la totalidad o la práctica totalidad del genoma del VIH incluyendo los dos LTR de la forma proviral del virus. Para el caso más específico del VIH-1, la definición es la misma, pero sustituyendo VIH por VIH-1. Los clones virales recombinantes de la presente invención son los clones resultantes de una serie de manipulaciones genéticas realizadas sobre dicho fragmento : de ADN incluyendo deleción de genes virales, inserción de genes marcadores, introducción de mutaciones y sustitución de genes o fragmentos génicos del clon original por los de otros clones o poblaciones virales. En concreto, en el desarrollo de la presente invención se ha procedido de acuerdo con las siguientes estrategias : deleción de fragmentos del VIH, como el gen Nef, de modo que se mantenga la capacidad infectiva de los clones virales recombinantes generados, inserción, en el ADN proviral del gen marcador de renilla, un gen no expresado en células humanas. Esto permite que el gen funcione como marcador de la infección, esto es, una célula que expresa renilla indica que se ha infectado,- inserción del gen LacZ que codifica para el enzima Beta-galactosidasa sustituyendo distintas secuencias del geno a para, por una parte, reconocer la frecuencia de generación de virus recombinantes y, por otra, evitar el arrastre de virus salvajes; introducción por mutagénesis dirigida, de sitios de restricción que permitan "extraer" fácilmente determinados fragmentos de ADN del provirus matriz (como, por ejemplo, la Transcriptasa Inversa, la Proteasa, el gen Pol completo, gag, nef, o la envuelta del virus), para sustituirlos por genes de aislados procedentes de pacientes a valorar. Este sistema de "clonaje" y generación de "virus quimera" permite estudiar las características de las distintas proteínas virales de los pacientes en un sistema que presenta todas las ventajas de los genes marcadores . El sistema de marcado con renilla, - presenta múltiples ventajas frente a los sistemas de marcado utilizados actualmente de forma más habitual, siendo de destacar especialmente que: la detección de renilla es una técnica que tiene una alta sensibilidad se puede realizar de forma automática y es incluso robotizable es un ensayo barato la detección tras la infección con un virus portador de renilla como marcador es muy rápida (24 horas) frente a los sistemas convencionales de detección de replicación viral que requieren entre 5 días y una semana de cultivo. Los clones virales recombinantes basados en VIH de la presente invención se caracterizan porque poseen la estructura general representada en la figura 8, que comprende en dirección 5 ' a 3 ' los siguientes elementos :
- LTR ( long terminal repeats) o secuencias redundantes (R) terminales, que contiene numerosas secuencias consenso para factores de transcripción que regulan la expresión viral;
- gag es el gen que codifica para la proteína p55 de la cápsida formada por 3 subunidades proteicas (MA, CA y NC) ;
- pol es el gen que codifica las enzimas virales necesarias para el proceso de replicación viral: proteasa (PRO) , la transcriptasa inversa (RT) e integrasa, y solapa en su extremo 5' con el elemento gag; - vif es el gen que codifica la proteína Vif asociada con la infecciosidad de los viriones extracelulares, y solapa en su extremo 5' con el elemento pol y en su extremo 3' con el elemento vpr;
- vpr es el gen que codifica la proteína Vpr que actúa como acelerador del ciclo de replicación a distintos niveles, y solapa en su extremo 5' con el elemento vif;
- tat es el gen que codifica la proteína Tat que es un transactivador, y su segundo exón se encuentra contenido en la secuencia env; - vpu es el gen que codifica para Vpu implicada en la liberación de los viriones;
- env es el gen que codifica la proteína gpl60 de la envuelta viral;
- rev es el gen que codifica la proteína Rev, encargada del procesamiento y transporte al citoplasma del ARN mensajero, y su segundo exón se encuentra contenido en la secuencia env; - nef es el gen que codifica la proteína Nef que regula negativamente moléculas CD4 y HLA de la célula infectada y desempeña un papel en la patogenicidad del virus, y se encuentra truncado en las bases en posición 8.796 y 8.887 en el genoma viral; - Notl es una diana para el enzima de restricción Notl que ha sido introducida por mutagénesis dirigida en la posición 9.796 del genoma viral;
- Xhol es una diana de restricción para el enzima Xhol, situada en la posición 8.887 del genoma viral; - Renilla es el gen que codifica para la- proteína reportera luciferasa de Renilla y que ha sido clonado en los sitios de restricción Notl-Xhol en posiciones 5' y 3', respectivamente; y - LTR, que en su extremo 5' solapa con el extremo 3' del elemento nef . Para la obtención de los clones virales de la invención representados por la estructura general (Figura 8), se parte del vector proviral NL .3 [Adachi A. Gendelman HE, Koenig S, Folks, T, Willey R, Rabson A, Martin MA. Production of acquired immunodeficiency syndrome-asociated retrovirus in human and nonhuman cells transfected with an infectious molecular clone. J. Virol. 1986 Aug;59 (2) :284-91. ) el cual se modifica genéticamente en el laboratorio mediante distintas operaciones . A continuación se resumen las etapas seguidas en la generación de los distintos clones virales. Entre paréntesis y negrita se da la denominación de las construcciones genéticas -intermedias y finales- generadas: a) . Introducción por mutagénesis dirigida del sitio de restricción Not I al inicio del gen nef (IP NL Not) . b) . Deleción del gen nef (corte con los enzimas de restricción Not I y Xhol) . c) . Clonación del gen de renilla en las posiciones Not I/Xho I. (IP HIV NL Ren) .Estructura general (Figura 8) . d) . Eliminación de la única diana Neo I mediante digestión .y relleno con Klenow e introducción por mutagénesis dirigida de otro sitio de restricción Neo I en la posición correspondiente al aminoácido 15 de la retrotranscriptasa, la posición 2593 de la secuencia de ADN, (cambio de glicina por alanina) . (IP HIV NL Neo Ren) . e) . Clonaje en el vector IP HIV NL Neo Ren del gen beta-galactosidasa en la posición de la RT (IP HIV NL LacZ/rt Ren) , Proteasa (IP HIV NL LacZ/pr Ren), o el gen Pol completo (IP HIV NL LacZ/pol Ren) con el fin de aumentar la eficacia de clonaje y evitar el arrastre de poblaciones minoritarias del virus de referencia. Los clones religados sin el inserto del paciente dan colonias azules, mientras que el plásmido que ha incorporado la RT, Pr o el gen pol completo del paciente da colonias blancas. f) . A partir del plásmido IP HIV NL LacZ/pr Ren, destrucción del sitio de restricción NarI externo al provirus mediante mutagénesis dirigida e introducción del sitio de restricción KspI en la posición 4498 por mutagénesis dirigida (IP HIV NL LacZ/gag-pr Ren) . g) . Introducción por mutagénesis dirigida del sitio de restricción Xbal en la posición 6112 en el clon IP HIV NL Ren (IP HIV NL Xba Ren) h) Deleción de la envuelta en el plásmido IP HIV NL Xbal Ren mediante el corte con los enzimas de restricción Xbal y Notl y clonaje en su lugar del gen lacZ (IP HIV NL LacZ/env Ren) . i) . Generación del clon viral IP HIV JR Ren clonando la envuelta del clon JR-CSF en el plásmido IP HIV NL LacZ/Env Ren. Los vectores finales así generados corresponden a los nuevos clones virales recombinantes objeto de la presente invención, comprendidos todos ellos dentro de la estructura general (Figura 8) . Dichos clones virales han sido depositados en la Colección Española de Cultivos Tipos (Universidad de Valencia, Burjassot, Valencia, España) , conforme a la normativa del Tratado de Budapest sobre el reconocimiento internacional del depósito de microorganismos a los fines del procedimiento en materia de patentes . Seguidamente se proporcionan las estructuras particulares de dichos clones virales, indicando entre paréntesis junto a su denominación en el contexto de la presente memoria, la que les ha sido asignada por la CECT:
IP HIV NL Ren (CECT 5842) Es un clon viral recombinante basado en la estructura general descrita anteriormente, caracterizado porque posee sitios únicos de restricción para los enzimas Apal y Agel introducidos en las posiciones 2006 y 3485, respectivamente, tal y como se representa en la figura 9.
IP HIV NL LacZ/pol Ren (CECT 5847) Es un clon viral recombinante basado en la estructura general descrita anteriormente, caracterizado porque posee el gen LacZ clonado en los sitios de restricción Apal-Agel en posiciones 5' y 3' respectivamente, sustituyendo el fragmento del gen polque codifica para la proteasa y la retrotranscriptasa, tal y como se representa en la figura 10.
IP HIV NL LacZ/pr Ren (CECT 5846) Es un clon viral recombinante basado en la estructura general descrita anteriormente, caracterizado porque posee un sitio único de restricción para el enzima Ncol introducido por mutagénesis dirigida en la posición 2593 de la secuencia de ADN, y el gen LacZ clonado en los sitios de restricción Apal -Ncol en posiciones 5' y 3', respectivamente, sustituyendo el fragmento del gen pol que codifica para la proteasa, tal y como se representa en la figura 11.
IP HIV NL LacZ/rt Ren (CECT 5845) Clon viral recombinante basado en la estructura general descrita anteriormente, caracterizado porque posee una diana para el enzima de restricción Ncol que ha sido introducida por mutagénesis dirigida en la posición 2593 de la secuencia de ADN, y el gen LacZ clonado en los sitios de restricción Ncol-Agel en posiciones 5' y 3' respectivamente, sustituyendo el fragmento del gen pol que codifica para la retrotranscriptasa (Figura 12) .
IP HIV NL LacZ/gag-pr Ren (CECT 5848) Clon viral recombinante basado en la estructura general descrita anteriormente, caracterizado porque posee sitios únicos de restricción, introducidos por mutagénesis dirigida, para los enzimas NarI y KspI, este último introducido por mutagénesis dirigida, en las posiciones 637 y 4.498, respectivamente, de la secuencia de ADN, respectivamente, y el gen LacZ clonado en los sitios de restricción Apal -Ncol en posiciones 5' y 3' respectivamente, sustituyendo el fragmento del gen pol que codifica para la proteasa. (Figura 13) .
IP HIV NL LacZ/env Ren (CECT 5844) Clon viral recombinante basado en la estructura general descrita anteriormente, caracterizado porque posee un sitio único de restricción para el enzima Xbal introducido por mutagénesis dirigida en la posición 6.112 de la secuencia de ADN, de modo que permite el clonaje del gen de la envuelta del virus del paciente, y posee además el gen LacZ clonado en los sitios de restricción Xbal-Notl en posiciones 5' y 3' respectivamente sustituyendo el gen env. (Figura 14) .
IP HIV JRRen (CECT 5843) Clon viral recombinante basado en la estructura general descrita anteriormente, caracterizado porque posee un sitio único de restricción para el enzima Xbal introducido por mutagénesis dirigida en la posición 6.112 de la secuencia de ADN, y el gen "env JR-CSF" , que corresponde al gen env del clon JR-CSF, sustituyendo al gen env original . Este clon se representa en la figura 15.
Los clones virales recombinantes de la presente invención han mostrado ser muy útiles en. el desarrollo o mejora de métodos y técnicas analíticas relacionados con las investigaciones en torno al SIDA. De hecho, en las técnicas concretas que se describieron en el apartado del Estado de la Técnica, dichos clones han supuesto importantes ventajas, algunas de las cuales se detallan seguidamente : Sistemas de determinación de resistencias fenotípicas a fármacos antirretrovirales : La invención propuesta se basa en el sistema de clonación de los fragmentos génicos de la transcriptasa inversa, de la envuelta y de la Proteasa del VIH en vectores virales portadores de genes marcadores . Esta invención presenta una serie de ventajas respecto de las ya existentes, a saber: a) La posibilidad de analizar separadamente la resistencia a inhibidores de la Proteasa, de la Transcriptasa Inversa y de la envuelta. Esto posibilita la evaluación independiente de resistencias a distintos grupos farmacológicos. b) La utilización de sistemas virales de ciclo múltiple. c) Una mayor eficacia en la evaluación de aislados virales con baja capacidad replicativa.
- Sistemas para la determinación de la capacidad replicativa del VIH: La invención propuesta permite determinar este parámetro y analizar directamente la capacidad replicativa viral en dianas celulares muy próximas a las fisiológicas como linfocitos de sangre periférica. El clonaje de los genes de la envuelta y distintos fragmentos del ADN de gag-pol del paciente en virus portadores de genes marcadores de ciclo múltiple
(Renilla) confiere al virus quimérico las propiedades replicativas del virus mutado. A diferencia de los sistemas de evaluación del fitness viral, extremadamente laboriosos, el desarrollo permite el análisis de la capacidad replicativa del virus recombinante de forma prácticamente continua. Sistemas para la detección de la presencia de anticuerpos neutralizantes : La presente invención permite superar los dos inconvenientes principales de las técnicas clásicas de determinación de capacidad neutralizante en el suero de pacientes seropositivos ya que permite analizar directamente la replicación viral y su inhibición por los anticuerpos del paciente. Esto es posible realizarlo tanto sobre aislados o clones virales de referencia, como sobre un virus recombinante en el que la envuelta del clon viral ha sido sustituida por la envuelta completa de la población viral del paciente. Este tipo de ensayo, denominado por el solicitante
"test autólogo de detección de anticuerpos neutralizantes" tiene una elevada sensibilidad y permite una evaluación precisa de la capacidad neutralizante del suero del paciente frente a los virus que, en el momento del ensayo, estén replicando en su organismo. Sistemas para la caracterización del tropismo viral en la infección por el VIH: La invención propuesta permite determinar este parámetro mediante dos herramientas : la generación de virus recombinantes que portan la envuelta completa de la población viral del paciente y la utilización de una célula diana que expresa establemente ambos receptores (SSPA-B7) . Modelos experimentales para el cribado de compuestos con potencial actividad antiviral : La invención propuesta permite realizar en un formato de microplaca fácilmente robotizable la detección de la actividad antiviral en un modelo que abarca todo el ciclo replicativo viral mediante la utilización de vectores de ciclo múltiple. Con relación a los sistemas de determinación de actividad antiviral actualmente existentes que valoran la protección frente al efecto citopático, el sistema propuesto permite analizar la inhibición directa de la replicación del VIH y acorta considerablemente los tiempos de cribado (screening) . Así, la presente invención también se refiere al uso de los clones virales descritos anteriormente en métodos analíticos para la determinación de resistencias fenotípicas a fármacos antirretrovirales para el tratamiento de la infección por VIH. Una realización concreta de la invención se refiere al uso de dichos clones virales en métodos analíticos para la determinación de la capacidad replicativa de virus recombinantes que portan secuencias gag, pol y/o env de pacientes con infección por VIH. Por otro lado, la presente invención se refiere al uso de dichos clones virales recombinantes en métodos analíticos para la caracterización del tropismo viral en la infección por VIH. En otra realización particular, la presente invención se refiere al uso de dichos clones virales recombinantes en métodos analíticos para la detección de anticuerpos neutralizantes frente al VIH en el suero de pacientes seropositivos para VIH y sujetos no infectados, sometidos o no a vacunación. Por último, la presente invención se refiere al uso de dichos clones virales recombinantes en métodos analíticos para el estudio del cribado y caracterización de la actividad antiviral de compuestos frente al VIH.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figuras la y Ib: Esquemas ilustrativos correspondientes a la producción de los clones virales de la presente invención, conforme al proceso descrito en la realización preferida 1. Figura 2a y 2b: Representaciones gráficas correspondientes a los resultados de los ensayos expuestos en el apartado 2.1 de Modos de Realización de la Invención. Figura 3 : Representación gráfica correspondiente a los estudios de determinación de capacidad replicativa expuestos en el apartado 2.2. de Modos de Realización de la Invención. Figura 4: Expresión de CCR5 y CXR4 por el clon SSPA- B7 , conforme al apartado 2.3 y 2.4 de Modos de Realización de la Invención. Figura 5: Efecto citopático inducido en el clon SSPA-B7 por los aislados NL4.3(X4) y Bal (R5) , conforme al apartado 2.3 y 2.4 de Modos de Realización de la Invención. Figura 6: Análisis de la capacidad neutralizante del virus NL-Luc del plasma de un paciente en las condiciones del apartado 2.4 (D) de Modos de Realización de la Invención. Figura 7: Resultados de los análisis de la actividad antiviral de dos compuestos estudiados según el apartado 2.5 (C) de Modos de Realización de la Invención.
Figura 8: Estructura general de los clones virales recombinantes de la presente invención, donde: LTR (long terminal repeats) son las regiones con secuencia redundante (R) que juega un papel primordial durante el proceso de retrotranscripción; gag es el gen que codifica para la proteína p55 de la cápsida formada por 3 subunidades proteicas (MA, CA y NC) ; pol es el gen que codifica las enzimas virales necesarias para el proceso de replicación viral: proteasa (PRO), la transcriptasa inversa (RT) e integrasa; vif codifica la proteína Vif asociada con la infecciosidad de los viriones extracelulares; vpr codifica la proteína Vpr que actúa como acelerador del ciclo de replicación a distintos niveles; tat codifica la proteína Tat que es un transactivador; vpu codifica para Vpu implicada en la liberación de los viriones; env es el gen que codifica la proteína gplSO de la envuelta viral; rev produce la proteína Rev, encargada del procesamiento y transporte al citoplasma del ARN mensajero; nef codifica la proteína ' Nef que regula negativamente moléculas CD4 y HLA de la célula infectada y desempeña un papel en la patogenicidad del virus; Notl y Xhol indican sitios únicos de restricción en la secuencia de ADN; Renilla indica la posición de clonaje del gen reportero. Figura 9: Clon viral recombinante IP HIV NL Ren, depositado en la Colección Española de Cultivos Tipo como .- CECT 5842, donde Apal y Agel representan sitios únicos de
- , restricción en la secuencia de ADN, y los restantes símbolos tienen el significado dado anteriormente para la Figura 8. Figura 10 : Clon viral recombinante IP HIV NL LacZ/pol Ren, depositado en la Colección Española de Cultivos Tipo como CECT 5847, donde LacZ - indica la posición de clonaje del gen LacZ sustituyendo un .fragmento del gen pol , y los restantes símbolos tienen el significado mencionado anteriormente. Figura 11: Clon viral recombinante IP HIV NL LacZ/pr Ren, depositado ante la Colección Española de Cultivos Tipo como CECT 5846, donde Ncol indica un sitio único de restricción de la secuencia de ADN, y los restantes símbolos tienen el significado dado anteriormente. Figura 12 : Clon viral recombinante IP HIV NL LacZ/rt Ren, depositado ante la Colección Española de Cultivos Tipo como CECT 5845, donde los diferentes símbolos tienen el mismo significado indicado anteriormente. Figura 13 : Clon viral recombinante IP HIV NL LacZ/gag-pr Ren, depositado ante la Colección Española de Cultivos Tipo como CECT 5848, donde NarI y KspI indican sitios de únicos de restricción en la secuencia de ADN y los restantes símbolos tienen el significado dado anteriormente . Figura 14 : Clon viral recombinante IP HIV NL LacZ/env Ren, depositado ante la Colección Española de Cultivos Tipo como CECT 5844, donde Xbal indica un sitio único de restricción en la secuencia de ADN, "env. paciente" indica la posición de clonaje del gen del paciente, y los demás símbolos tienen el significado dado anteriormente . Figura 15: Clon viral recombinante IP HIV JRRen, depositado ante la Colección Española de Cultivos Tipo como CECT 5843, donde Xbal indica un sitio único de restricción en la secuencia de ADN, "en JR-CSF" indica la posición de clonaje del gen env del clon JR-CSF en lugar de la envuelta de NL4.3 , y los restantes símbolos tienen el significado dado anteriormente.
MODOS DE REALIZACIÓN DE LA INVENCIÓN Seguidamente se ilustra la presente invención con una descripción detallada de realizaciones preferidas, en la que se muestran los clones virales recombinantes de la invención así como sus principales aplicaciones junto con alguna de las técnicas generales de ingeniería genética empleadas en los diferentes casos, y todo ello haciendo uso de las figuras adjuntas para mayor claridad.
1.- OBTENCIÓN DE CLONES VIRALES RECOMBINANTES . - Se basa en el sistema de clonación de los fragmentos génicos de la transcriptasa inversa y de la proteasa del VIH en vectores virales portadores de genes marcadores. (A) Descripción general de la técnica: En la Figura la y Ib puede observarse esquemáticamente cómo se producen las partículas virales durante las 48 horas posteriores a la transfección del plásmido viral en células 293T. La línea celular 293T se obtuvo del Depósito de la ATCC. El clon SSPA-B7 ha sido obtenido por el solicitante a partir de la línea celular MT-2 mediante transíección de un vector de expresión del gen CCR5 provisto de un marcador de resistencia para Geneticina. Después de la transfección se recogen los sobrenadantes y se infectan las células diana SSPA-B7. La capacidad de los virus para completar un ciclo de replicación se cuantifica midiendo la actividad luciferasa en las células diana. La actividad de los inhibidores de la proteasa se mide añadiendo los primeros a las células transfectadas mientras que la actividad frente a inhibidores de la transcriptasa inversa y de la entrada se mide añadiendo los fármacos a las células infectadas . El proceso comprende las siguientes operaciones: A partir de 0,5 mi de plasma del paciente se realiza la extracción del ARN del VIH. El ARN viral es retrotranscrito y posteriormente amplificado utilizando cebadores específicos de cada gen viral mediante la reacción en cadena de la polimerasa. Los cebadores incluyen sitios de restricción específicos para el posterior clonaje en el virus de referencia del gen pol o sus fragmentos o del gen env en los diferentes clones virales según el tipo de virus recombinante que se desea generar. Tras la digestión enzimática del amplificado y del virus de referencia se realiza un proceso de ligación in vi tro utilizando la T4 ligasa. - La población del provirus recombinante generado se transfecta en la línea celular 293-T y actúa como célula productora de virus recombinantes. La progenie infecciosa de virus recombinantes se recoge a las 48 horas de la transfección y se utiliza para infectar la línea celular SSPA-B7. Cuando la aplicación es la determinación de resistencias a antirretrovirales, los dos últimos procesos se realizan en presencia de inhibidores de la Proteasa (tratando las células productoras 293 -T) , inhibidores de la transcriptasa inversa (tratando las células diana SSPA-B7) o inhibidores de la entrada viral (tratando las células diana SSPA-B7) . El nivel de sensibilidad de los distintos fármacos se define mediante la concentración inhibitoria del 50% de la replicación viral (IC50) en comparación con un virus de referencia sin mutaciones de resistencia asociadas. La lectura de la sensibilidad a los distintos fármacos se realiza cuantificando la actividad renilla mediante un luminómetro Berthold Orion Microplate. (B) Virus: Se parte del vector proviral NL4.3 (Adachi et al. 1986). Este clon ha sido modificado genéticamente en el laboratorio produciendo clones virales de ciclo múltiple que expresan el gen indicador Renilla en lugar de nef y en los que se han introducido diferentes dianas de restricción para poder clonar el gen pol completo, los fragmentos Transcriptasa inversa o Proteasa separadamente, las regiones gag- proteasa y gag-pol o el gen env completo. Los clones virales recombinantes obtenidos permiten clonar el gen pol completo del paciente, la Transcriptasa inversa y la proteasa separadamente y la región gag junto con la proteasa o el gen pol completo. Asimismo permiten el clonaje del gen env completo del paciente. Todos son virus de ciclo múltiple y muy útiles cuando existen múltiples mutaciones de resistencia en la RT y la
Proteasa del paciente ya que se mejora la capacidad replicativa final. (C) Cebadores: En las operaciones más importantes anteriormente mencionadas, se emplean los siguientes cebadores y las siguientes células: - Mutagénesis
Mutagénesis Not I: 5' GCTATAAGATGGGTGGCGCGGCCGCAAAAAGTAGTGTGATTGG 3'
5' CCAATCACACTACTTTTTGCGGCCGCGCCACCCATCTTATAGC 3'
Mutagénesis Neo I:
5' CCAGTAAAATTAAAGCCAGCCATGGATGGCCCAAAAG 3'
5' CTTTTGGGCCATCCATGGCTGGCTTTAATTTTACTGG 3' Mutagénesis Ksp I:
5' GAAGCAGAAGTAATTCCCGCGGAGACAGGGCAAGAAAC 3'
5' GTTTCTTGCCCTGTCTCCGCGGGAATTACTTCTGCTTC 3'
Mutagénesis Nar I:
5' GAAAATACCGCATCAGGACCCATTCGCCATTCAGGC 3' 5' GCCTGAATGGCGAATGGGTCCTGATGCGGTATTTTC 3'
Mutagénesis Xbal:
5'GCATTAGTAGTAGCAATAATAATAGCTCTAGAGCTGTGGTCCATAGTAATCAT AG
5'CTATGATTACTATGGACCACAGCTCTAGAGCTATTATTATTGCTACTACTAATG C
- Amplificación de gen pol de pacientes POL : 5 ' GCCAAAAATTGCAGGGCCCCTAGGA3 ' 5 « TCTTTTGATGGGTCATAATACACTCCATGTACCGG3 ' PRO : 5 • GCCAAAAATTGCAGGGCCCCTAGGA3 • 5 • CATGCCATGGCTGGCTTTAATTTTACTGGTACAGTC3 ' RT : 5 • CATGCCATGGATGGCCCAAAAGTTAAACAATGGCC3 ' 5 > TCTTTTGATGGGTCATAATACACTCCATGTACCGG3 ' GAG-PR: 5 • GGAAAATCTCTAGCAGTGGCGCCCGAACAG3 " 5 « CATGCCATGGCTGGCTTTAATTTTACTGGTACAGTC3 ' GAG-POL : 5' GGAAAATCTCTAGCAGTGGCGCCCGAACAG3 ' 5 • CTTGCCCTGTCTCTGCTGGAATTACTTCTGC3 •
- Amplificación gen Env de pacientes . Primera amplificación: 5' TATGAAACTTACGGGGATACTTGGG 3' (posición 5697 -5721 del pNL4.3) 5' CTGCCAATCAGGGAAGTAGCCTTGTGT 3' (posición 9135 - 9161 del pNL4.3) . Nested-PCR: (diana Xbal) 5' GTAGCAATAATAATAGCTCTAGAGCTGTGGTCCATAGTAATC3' (posición 6097 - 6138 del pNL4.3) (diana Not I) 5 ' TACTTTTTGCGGCCGCGCCACCCATCTTATAGC (posición 8779 - 8811 del pNL4.3)
(D) Clones virales recombinantes basados en VIH. El procedimiento expuesto en los apartados anteriores empleando los cebadores, sondas, secuencias dianas, líneas celulares y condiciones indicadas ha permitido la obtención de los clones virales de la presente invención: IP HIV NL Ren: Número de Depósito CECT 5842 IP HIV NL LacZ/pr Ren: Número de Depósito CECT 5846 IP HIV NL LacZ/rt Ren: Número de Depósito CECT 5845 IP HIV NL LacZ/pol Ren: Número de Depósito CECT 5847 IP HIV NL LacZ/gag-pr Ren: Número de Depósito CECT 5848 IP HIV NL LacZ/env Ren: Número de Depósito CECT 5844 IP HIV JRRen: Número de Depósito CECT 5843 2.- EVALUACIÓN DE LOS CLONES VIRALES DE LA INVENCIÓN EN DIFERENTES SISTEMAS DE DETERMINACIÓN ANALÍTICA 2.1.- SISTEMA DE DETERMINACIÓN DE RESISTENCIAS FENOTÍPICAS A FÁRMACOS ANTIRRETROVIRALES Los clones ensayados han sido los siguientes: IP HIV NL Ren, IP HIV NL LacZ/pol Ren, IP HIV NL LacZ/pr Ren, IP HIV NL LacZ/rt Ren, IP HIV NL LacZ/ gag-pr Ren y IP HIV NL LacZ/env Ren. Los resultados de los ensayos efectuados con estos clones virales conforme al sistema de la invención para la determinación de resistencias fenotípicas frente a fármacos antirretrovirales se ilustran en las figuras 2a y 2b. La figura 2a representa el perfil fenotípico de sensibilidad del clon viral IP HIV NL Ren frente a los siguientes fármacos : inhibidores de la transcriptasa inversa análogos a nucleósidos 3TC (A) , AZT/ZDV (B) , d4T (C) , ddl (D) ; inhibidores de la transcriptasa inversa no análogos a nucleósidos; Efavirenz (E) ; inhibidores de la proteasa: Saquinavir (F) . La figura 2b es una representación gráfica ilustrativa de un estudio de la determinación de la resistencia de AZT en un virus Wild type (línea continua) y en virus con las mutaciones M41L, K70R, T215F, K219Q (línea discontinua) :Fold=36 Entre las ventajas de este sistema frente a otros ' sistemas existentes en la actualidad, pueden mencionarse los siguientes: a. Posibilidad de analizar separadamente la resistencia a inhibidores de la proteasa y de la transcriptasa inversa. Esto posibilita la evaluación independiente de resistencias a distintos grupos farmacológicos, 'b. Mayor eficacia en la evaluación de aislados virales con baja capacidad replicativa. c. Permite el seguimiento de determinados pacientes en fracaso terapéutico. d. Con respecto al sistema patentado por Virologic (Patente US 5.837.464) , el sistema de clones virales recombinantes de la presente invención tiene sensibles diferencias, las cuales repercuten en las importantes ventajas citadas anteriormente, a saber: Virologic clona el gen luciferasa en la envuelta y el solicitante en Nef. . Virologic utiliza enzimas similares pero no idénticos a los que se utilizan aquí. El sistema de la presente invención ha modificado por mutagénesis el esqueleto de NL4.3 . En la presente invención se pueden utilizar vectores de ciclo múltiple y clonaje separado de la RT y Proteasa y la evaluación de los fragmentos gag-Proteasa y gag-pol aspectos que el sistema de Virologic no permite. 2.2.- SISTEMA DE DETERMINACIÓN DE LA ^CAPACIDAD REPLICATIVA. En la figura 3 se representa un histograma en el que se demuestra la mejora en la recuperación de un virus con múltiples mutaciones de resistencia en la Proteasa y la
RT cuando se realiza el clonaje por separado de ambos fragmentos, que del gen pol en bloque. Este efecto es debido al acumulo de pérdida de fitness viral que puede dar virus con escasa capacidad replicativa difícil de detectar en ensayos de ciclo único cuando se suman las pérdidas de fit debido a mutaciones en la Transcriptasa Inversa y la Proteasa. Los clones virales sometidos a evaluación han sido los siguientes: IP HIV NL LacZ/pol Ren, IP HIV NL LacZ/pr Ren, IP HIV NL LacZ/rt Ren, y IP HIV NL LacZ/gag-pr Ren, Las ventajas más destacables del sistema de la invención respecto a otros existentes en la actualidad, son las siguientes: a. El sistema es muy sensible al utilizar la actividad renilla. b. El sistema mide directamente actividad antiviral, no como el test de MTT que mide protección frente al efecto citopático, una medida indirecta de la replicación viral. c. Tiene la posibilidad de clonar separadamente la transcriptasa inversa o la proteasa lo que permite definir en qué proteína radica la pérdida de capacidad replicativa. d. Tiene la posibilidad de clonar conjuntamente el gen gag-pro lo que permite definir el papel de sitios de escisión en la poliproteína del core viral por la proteasa del VIH en la mejora de la capacidad replicativa viral. e. La utilización de sistemas virales en los que puede detectarse replicación con un número limitado de ciclos permite que, cuando existe escape viral, no se igualen las curvas de neutralización en múltiples ciclos del virus. 2.3.- SISTEMA DE DETERMINACIÓN DEL TROPISMO VIRAL, RESISTENCIAS FENOTÍPICAS A INHIBIDORES DE LA FUSIÓN. La invención propuesta se basa en el sistema de clonación de los fragmentos génicos de la envuelta en vectores virales portadores de genes marcadores. Se requiere a la vez una célula que exprese los dos correceptores mayores del virus CCR5 y CXCR4. (A) Descripción general de la técnica. A partir de 0,5 mi de plasma del paciente se realiza la extracción del ARN del VIH. El ARN viral es retrotranscrito y posteriormente amplificado utilizando cebadores mediante la reacción en cadena de la polimerasa. Los cebadores incluyen sitios de restricción específicos para el posterior clonaje en el virus de referencia e incluyen toda la envuelta del virus . Tras la digestión enzimática del amplificado y del virus de referencia se realiza un proceso de ligación in vitro utilizando la T4 ligasa. - La población de virus recombinantes generados se transfecta en la línea celular 293 -T y actúa como célula productora de virus recombinantes. La progenie infecciosa de virus recombinantes se recoge a las 48 horas de la transfección y se utiliza para infectar la línea celular diana SSPA-B7 que expresa CCR5 y CXCR4 (Figura 4) . (B) Virus. Se parte del vector proviral NL4.3 (Adachi et al. 1986) . Estos clones han sido modificados genéticamente en el laboratorio produciendo clones virales de ciclo múltiple y en los que se clona el gen env completo . Con el virus recombinante generado se puede analizar el tropismo viral o la resistencia a inhibidores de la entrada. Los correspondientes clones virales son los siguientes: IP HIV NL Ren, IP HIV JRRen y IP HIV NL LacZ/env Ren. (C) Células. Se ha generado mediante técnicas de ingeniería genética un clon celular de SSPA-B7 que expresa el receptor CCR5 (Figura 4) y que es susceptible a la infección por virus R5, X4 ó R5X4. La infección por estas tres variantes es productiva e induce efecto citopático (Figura 5) . Las ventajas más destacables de este sistema frente a otros sistemas existentes en la actualidad, son las siguientes: a. La posibilidad de clonar la envuelta completa del VIH. Otros sistemas utilizan la recombinación que presenta una eficacia muy baja o clonan fragmentos más pequeños de la envuelta. b. La disponibilidad de una célula propia que expresa los receptores CCR5 y CXCR4. c. Su utilización en tests fenotípicos a inhibidores de la entrada.
2.4.- SISTEMA DE DETECCIÓN Y TITULACIÓN DE ANTICUERPOS NEUTRALIZANTES. (A) Descripción general de la técnica. La invención propuesta se basa en la medición de la actividad neutralizante en el suero de pacientes frente a la infección de una línea permisiva de virus portadores de genes marcadores y con diferentes envueltas. El sistema incluye dos clones virales con envueltas R5 y X4 y una célula que expresa los dos correceptores mayores del virus CCR5 y CXCR4. (B) Virus: Se parte del vector proviral NL4.3 (Adachi et al.
1986) . Estos clones han sido modificados genéticamente en el laboratorio produciendo clones virales de ciclo múltiple y en los que se clona el gen env completo. Con el virus recombinante generado se puede analizar la capacidad neutralizante frente a distintas envueltas del virus incluyendo la del virus del propio paciente . Los correspondientes clones virales así obtenidos y evaluados han sido los siguientes: IP HIV NL Ren, IP HIV JRRen y IP HIV NL LacZ/env Ren (C) Células. Se ha generado mediante técnicas de ingeniería genética un clon celular de SSPA-B7 que expresa el receptor CCR5 (figura 4) y que es susceptible a la infección por virus R5 , X4 o R5X4. La infección por estas tres variantes es productiva e induce efecto citopático (figura 5) . (D) Resultados . Los resultados de los ensayos efectuados con estos clones virales conforma el sistema de la invención para la detección y titulación de anticuerpos neutralizantes que se ilustran en la figura 6. Dicha figura 6 es una representación gráfica en la que se ilustran los resultados del análisis de la capacidad neutralizante del virus HIV NL Ren del plasma de un paciente antes (4.35) y después (4.2) de realizar una serie de interrupciones controladas de tratamiento. En el ensayo clásico de MTT no se pudieron observar diferencias entre ambas muestras. Entre las ventajas del sistema respecto a otros existentes en la actualidad cabe destacar las siguientes: a. El sistema es muy sensible al utilizar la actividad renilla. b. El sistema mide directamente actividad antiviral, no como el test de MTT que mide protección frente al efecto citopático, una medida indirecta de la replicación viral. c. Tiene la posibilidad de clonar la envuelta completa de diferentes VIH o incluso la del propio paciente ("test de neutralización autóloga") . d. La utilización de sistemas virales en los que puede detectarse replicación con un número limitado de ciclos permite que, cuando existe 5 ' escape viral, no se igualen las curvas de neutralización en múltiples ciclos del virus. e. La disponibilidad de una célula propia que expresa los receptores CCR5 y CXCR4. f. El interés renovado en el estudio de anticuerpos 10 • neutralizantes en el contexto de nuevos modelos de vacunas y su utilización como marcador surrogado que aumentará la demanda de estos tests en un futuro inmediato . g. El sistema es robotizable. 15. 2.5. -SISTEMA DE CRIBADO DE COMPUESTOS Y PRODUCTOS CON POTENCIAL ACTIVIDAD FRENTE AL VIH (A) Descripción general de la técnica. La invención propuesta se basa en la medición de la
20 actividad frente al VIH antiviral de compuestos químicos y derivados de productos naturales utilizando virus portadores de genes marcadores . (B) Virus. Se parte del vector proviral NL4.3 (Adachi et al . 25 1986) . Estos clones han sido modificados genéticamente en el laboratorio produciendo clones virales 'de ciclo múltiple con la envuelta del VIH. Limitando la infección a un solo ciclo de replicación (18h) se puede detectar una actividad
30 antiviral desde el proceso de entrada hasta la transcripción/traducción de proteínas virales. En este periodo de tiempo no se detectaría la acción antiviral en pasos posteriores como en el caso de los inhibidores de proteasa o los inhibidores de encapsidamiento o gemación 35 viral. Para estos casos se evalúa la actividad renilla más allá del primer ciclo (18 horas) . Una disminución en la actividad luciferasa en el ciclo único y múltiple indica que el compuesto actúa en estadios previos al procesamiento de proteínas virales. Sin embargo, si sólo actúa sobre el ciclo múltiple indicaría que actúa en estadios post-integración/replicación viral. El correspondiente clon viral recombinante es el siguiente. IP HIV NL Ren. (C) Resultados: Los resultados de los ensayos efectuados con estos clones virales conforme al sistema de la invención para el cribado de compuestos, se ilustran en la Figura 7, en la cual se muestran las representaciones gráficas correspondientes al análisis de la actividad antiviral de dos compuestos derivados de productos vegetales . En el ensayo clásico de MTT se mide la toxicidad del compuesto (línea con rombos) y la protección frente al efecto citopático (línea con cuadrados) . En los paneles de la derecha se analiza la inhibición de la replicación de un virus luciferasa. Ambos compuestos están siendo caracterizados en su mecanismo de acción en este momento y conocemos que el compuesto 039 es un inhibidor de la entrada viral . Cabe destacar las siguientes ventajas del sistema respecto a otros existentes en la actualidad a. No se han descrito sistemas de evaluación de actividad antiviral utilizando virus recombinantes . b. El sistema es muy sensible al utilizar la actividad renilla. c. El sistema mide directamente actividad antiviral, no como el test de MTT que mide protección frente al efecto citopático, una medida indirecta de la replicación viral. El sistema es robotizable y aplicable a cribado masivo.

Claims

- REIVINDICACIONES -
1.- Clones virales recombinantes basados en VIH, caracterizados porque poseen una estructura general que comprenden en dirección 5' a 3' los siguientes elementos: -LTR o secuencias redundantes terminales que contienen secuencias consenso para factores de transcripción que regulan la expresión viral; -gag es el gen que codifica para la proteína p55 de la cápsida formada por las 3 subunidades proteicas MA, CA y NC; -pol es el gen que codifica las enzimas virales necesarias para el proceso de replicación viral, y solapa en su extremo 5 ' con el elemento gag; -vif es el gen que codifica la proteína Vif, y solapa en su extremo 5 ' con el elemento pol y en su extremo 3 ' con el elemento vpr; -vpr es el gen que codifica la proteína Vpr y solapa en su extremo 5 ' con el elemento vif; -tat es el gen que codifica la proteína Tat, su segundo exón se encuentra contenido en la secuencia env; -vpu es el gen que codifica para Vpu; -env es el gen que codifica la proteína gpl60 de la envuelta viral; -rev es el gen que codifica la proteína Rev, su segundo exón se encuentra contenido en la secuencia env; -nef es el gen que codifica la proteína Nef, y que se encuentra truncado en las bases en posición 8.796 y 8.887 en el genoma viral; -Notl es una diana para el enzima de restricción Notl que ha sido introducida por mutagénesis dirigida en la posición 8.796 del genoma viral; -Xhol es una diana de restricción para el enzima Xhol, situada en la posición 8.887 del genoma viral ; -Renilla es el gen que codifica para la proteína reportera luciferasa de Renilla y que ha sido clonado en los sitios de restricción Notl-Xhol en posiciones 5' y 3', respectivamente; y -LTR que en su extremo 5 ' solapa con el extremo 3 ' del elemento nef .
2 . - Clon viral recombinante según la reivindicación 1, caracterizado porque dicho clon es el clon IP HIV NL
Ren, depositado en la Colección Española de Cultivos Tipo como CECT 5842, que posee sitios únicos de restricción para los enzimas Apa I y Agel introducidos por mutagénesis dirigida en las posiciones 2006 y 3485, respectivamente.
3. - Clon viral recombinante según la reivindicación 1, caracterizado porque dicho clon es el clon IP HIV NL LacZ/rt Ren, depositado en la Colección Española de Cultivos Tipo como CECT 5845, que posee una diana para el enzima de restricción Ncol que ha sido introducida por mutagénesis dirigida en la posición 2593 en la secuencia de ADN, y el gen LacZ clonado en los sitios de restricción Ncol-Agel en posiciones 5' y 3', respectivamente, sustituyendo el fragmento del gen pol que codifica para la retrotranscriptasa.
4.- Clon viral 'recombinante según la reivindicación 1, caracterizado porque dicho clon es el clon IP HIV NL LacZ/pr Ren, depositado en la Colección Española de Cultivos Tipo como CECT 5846, que posee un sitio único de restricción para el enzima Ncol introducido por mutagénesis dirigida en la posición 2593 de la secuencia de ADN, y el gen LacZ clonado en los sitios de restricción Apal-Ncol en posiciones 5' y 3' respectivamente, sustituyendo el fragmento del gen pol que codifica para la proteasa.
5. - Clon viral recombinante según la reivindicación 1, caracterizado porque dicho clon es el clon IP HIV NL LacZ/pol Ren, depositado en la Colección Española de Cultivos Tipo como CECT 5847, que posee el gen LacZ clonado en los sitios de restricción Apal-Agel en posiciones 5' y 3' respectivamente, sustituyendo el fragmento del gen pol que codifica para la proteasa y la retrotranscriptasa.
6. - Clon viral recombinante según la reivindicación 1, caracterizado porque dicho clon es el clon IP HIV NLL " a.cZ/ gag -pr Ren, depositado en la Colección Española de Cultivos Tipo como CECT 5848, que posee sitios únicos de restricción, introducidos por mutagénesis dirigida, para los enzimas NarI y KspI , este último introducido por mutagénesis dirigida, en las posiciones 637 y 4498, respectivamente, de la secuencia de ADN, y el gen LacZ clonado en los sitios de restricción Apal-Ncol en posiciones 5' y 3" respectivamente, sustituyendo el fragmento del gen pol que codifica para la proteasa.
7. - Clon viral recombinante según la reivindicación 1, caracterizado porque dicho clon es el clon IP HIV NL
LacZ/env Ren, depositado en la Colección Española de Cultivos Tipo como CECT 5844, que posee un sitio único de restricción para el enzima Xbal introducido por mutagénesis dirigida en la posición 6112 de la secuencia de ADN, y el gen LacZ clonado en los sitios de restricción Xbal-Notl en posiciones 5' y 3' respectivamente, sustituyendo el gen env.
8. - Clon viral recombinante según la reivindicación 1, caracterizado porque dicho clon es el clon IP HIV JR
Ren, depositado en la Colección Española de Cultivos Tipo como CECT 5843, que posee un sitio único de restricción para el enzima Xbal introducido por mutagénesis dirigida en la posición 6112 de la secuencia de ADN, y el gen "env
JR-CSP" que corresponde al gen env del clon JR-CSF sustituyendo al gen env original .
9.- Uso de clones virales recombinantes definidos en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en métodos analíticos para la determinación de resistencias fenotípicas a fármacos antirretrovirales para el tratamiento de la infección por VIH .
10.- Uso de clones virales recombinantes definidos en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en métodos analíticos para la determinación de la capacidad replicativa de virus recombinantes que portan secuencias gag, pol y/o env de pacientes con infección por VIH.
11.- Uso de clones virales recombinantes definidos en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en métodos analíticos para la caracterización del tropismo viral en la infección por VIH.
12. - Uso de clones virales recombinantes definidos en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en métodos analíticos para la detección de anticuerpos neutralizantes frente al VIH en suero de pacientes seropositivos para VIH y sujetos no infectados, sometidos o no a vacunación.
13. - Uso de clones virales recombinantes definidos en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en métodos analíticos para el estudio del cribado y caracterización de la actividad antiviral de compuestos frente a VIH.
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