ES2354785B2 - Método de evaluación de resistencia de fenotipos de vih-1 a antirretrovirales. - Google Patents
Método de evaluación de resistencia de fenotipos de vih-1 a antirretrovirales. Download PDFInfo
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Abstract
Método de evaluación de resistencia de fenotipos
de VIH-1 a antirretrovirales.
En la presente invención se provee un método de
análisis de la resistencia fenotípica de VIH-1 de
muestras clínicas a antirretrovirales. El método hace uso de
plásmidos en los que se han creado mutaciones que generan sitios
únicos de secuencia original, de modo que permite la clonación de
fragmentos progresivamente mayores del gen pol y/o del gen
que codifica para la proteasa del virus VIH procedentes de pacientes
en estos plásmidos, y por tanto proporciona un modelo capaz de
caracterizar los genes y las subregiones genómicas de
VIH-1 implicadas en la resistencia a
antirretrovirales.
Description
Método de evaluación de resistencia de fenotipos
de VIH-1 a antirretrovirales.
En la presente invención se provee un método de
análisis de la resistencia fenotípica de VIH-1 de
muestras clínicas a antirretrovirales. El método hace uso de
plásmidos en los que se han creado mutaciones que generan sitios
únicos de restricción en posiciones sucesivas del gen pol del
virus VIH-1, siendo la expresión de aminoácidos
idéntica a la de la secuencia original, de modo que permite la
clonación de fragmentos progresivamente mayores del gen pol
y/o del gen que codifica para la proteasa del virus VIH procedentes
de pacientes en estos plásmidos, y por tanto proporciona un modelo
capaz de caracterizar los genes y las subregiones genómicas de
VIH-1 implicadas en la resistencia a
antirretrovirales.
El método objeto de la presente invención
constituye un sistema alternativo para analizar la resistencia
fenotípica de VIH-1 de muestras clínicas a
antirretrovirales, cuya eficacia se muestra en el correspondiente
ejemplo.
Aunque el virus VIH tipo NL4.3 ha sido usado
para la evaluación fenotípica de resistencias de VIH a los
antirretrovirales, los sistemas comerciales y experimentales
similares al que se presenta en esta invención, no son capaces de
facilitar la discriminación en la aportación de diferentes regiones
de los fragmentos clonados en la resistencia de diversos fenotipos
de VIH a antirretrovirales. Por tanto, se provee de un modelo capaz
de caracterizar los genes y las subregiones genómicas de
VIH-1 implicadas en la resistencia a
antirretrovirales. Con ello se permite la clonación y el estudio de
fragmentos progresivamente más largos del mismo gen, con lo que se
puede determinar la aportación de las porciones diferentes del
espacio de secuencia correspondiente al gen pol, usando cada
una de las construcciones tras pseudotiparlas con la secuencia
correspondiente del paciente en la valoración de la resistencia a
los
antirretrovirales.
antirretrovirales.
Las regiones de la proteasa y de la
retrotranscriptasa son reguladoras de la actividad del virus
VIH-1 en etapas clave del proceso de infección y,
por tanto, fundamentales para el éxito de la integración del ADN
viral en el ADN del huésped. La proteasa actúa cortando unidades de
las proteínas Gag, Pol y de la Gag-Pol. La
retrotranscriptasa tiene la función de sintetizar el ADN de doble
cadena del provirus usando como patrón la cadena singular del ARN
viral; es una ADN-polimerasa que actúa como
dependiente del ARN. Una parte de los fármacos empleados para evitar
la progresión del ciclo vital del virus VIH son inhibidores de la
función de estos genes, así pues, los pseudotipos virales
construidos usando secuencias de los genes de los virus aislados en
los pacientes en las construcciones descritas en la presente
invención, permiten valorar el comportamiento in vivo de
estos fármacos en la infección por VIH en experimentos de inhibición
de la infección usando concentraciones crecientes de
antirretrovirales.
El método de la presente invención hace uso de
cuatro plásmidos en los que se han creado mutaciones dirigidas al
tercer nucleótido del codón sin cambio en la traducción de una
secuencia original, para la valoración de la resistencia fenotípica
de VIH-1 a antirretrovirales, es decir, el análisis
fenotípico de resistencias VIH que permite valorar el "fitness"
genético del virus o el papel de mutaciones compensatorias al usar
secuencias más largas de la que habitualmente se usa en este tipo de
análisis con NL4.3, que es la integración en el vector del fragmento
ApaI-PinA1.
Las cuatro construcciones están basadas en un
virus VIH tipo NL4.3 (Adachi et al., 1986. J. Virol.
59:284-291.) NIH AIDS Reagent Reference
Program (Cat. Num.: 144.), en las que se han creado mutaciones
dirigidas al tercer nucleótido del codón, de forma que, siendo la
expresión de aminoácidos idéntica a la de la secuencia original, se
generan sitios únicos de restricción en posiciones sucesivas del gen
pol del virus VIH-1. Mediante este sistema es
posible obtener ácidos nucleicos con cuatro polimorfismos de un solo
nucleótido (de las siglas en inglés SNP, Single nucleotide
polimorphism) y además, al tener secuencias conocidas, podemos
obtener la construcción como ADNs lineales (por corte en lugares
únicos comunes como ApaI) o circulares. Alternativamente
puede obtenerse por transfección con Calphos^{TM} (Invitrogen) en
células empaquetadoras (por ejemplo, células 293T/17), viriones VIH
infecciosos que puedan usarse como origen de ARNs o como herramienta
para la infección experimental "in vivo" y la posible
valoración de la capacidad inhibitoria de los antirretrovirales. Por
tanto, una aplicación clínica o de desarrollo con las construcciones
mencionadas es la evaluación de la resistencia de los diferentes
fenotipos de VIH-1 a antirretrovirales comerciales o
en vías de ensayo.
\global\parskip0.950000\baselineskip
El método de construcción de los plásmidos
consistió en amplificar la región de ADN del VIH-1
correspondiente al gen pol contenida en el plásmido pNL4.3
mediante los cebadores SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6, clonar la región
amplificada en un vector de expresión, realizar mutagénesis
dirigidas independientes en el vector mediante el empleo de pares de
cebadores donde el cebador de selección es SEQ ID NO: 11 y el
cebador mutagénico se selecciona de la lista que comprende SEQ ID
NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10 (de modo que se
generaron sitios únicos de restricción en posiciones sucesivas del
gen pol del virus VIH-1), y reclonar de forma
independiente cada uno de los 4 fragmentos obtenidos en el vector
original pNL4.3, obteniendo los plásmidos de secuencias SEQ ID NO: 1
a SEQ ID NO: 4. (Tras obtener las mutaciones en cada uno de los
plásmidos de manera independiente se puede seleccionar el fragmento
de ADN comprendido entre los sitios de restricción
ApaI/PflmI y reclonarlo en el vector original pNL4.3
tras ser digerido previamente con los mismos enzimas de restricción
ApaI y PflmI, en este caso). Por tanto, el plásmido de
que hace uso el método de la presente invención es un plásmido
seleccionado de la lista que comprende SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2,
SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4.
La secuencia de cada uno de los plásmidos está
basada en la del plásmido pNL4.3 que incluye parte de la secuencia
del virus VIH-1. Asimismo, también se considera
cualquier combinación de los plásmidos de la lista. A continuación
describimos las características de las secuencias:
SEQ ID NO: 1. Se sustituyó el nucleótido que
ocupaba la posición 4243 del plásmido original pNL4.3
correspondiente al gen pol que cambió el codón ATA (codifica
para el aminoácido isoleucina) por ATC (también codifica para el
aminoácido isoleucina), generándose de ese modo un nuevo sitio de
restricción ClaI.
SEQ ID NO: 2. Se sustituyó el nucleótido que
ocupaba la posición 4403 del plásmido original pNL4.3
correspondiente al gen pol que cambió el codón CCA (codifica
para el aminoácido prolina) por CCG (también codifica para el
aminoácido prolina), generándose de ese modo un nuevo sitio de
restricción XmaI.
SEQ ID NO: 3. Se sustituyeron dos nucleótidos
que ocupaban las posiciones 4625 y 4626 del plásmido original pNL4.3
correspondiente al gen pol que cambió la secuencia
TGGGCG por TGCCCG. Se produjeron dos cambios de
aminoácido TGG (codifica para el aminoácido triptófano) por TGC
(codifica para el aminoácido cisteína) y GCG (codifica para el
aminoácido alanina) por CCG (codifica para el aminoácido prolina),
generándose de ese modo un nuevo sitio de restricción
XmaI.
SEQ ID NO: 4. Se sustituyó el nucleótido que
ocupaba la posición 4688 del plásmido original pNL4.3
correspondiente al gen pol que cambió el codón TCT (codifica
para el aminoácido serina) por TCG (también codifica para el
aminoácido serina), generándose de ese modo un nuevo sitio de
restricción ClaI.
En este aspecto de la invención también se
incluyen aquellos plásmidos derivados de los plásmidos SEQ ID NO: 1
a SEQ ID NO: 4. Por plásmidos derivados se entienden aquellos que
conservan las mutaciones que los caracterizan y permiten reconocer
las enzimas de restricción que se han descrito anteriormente para
cada uno de ellos.
Un aspecto necesario para aplicar el método de
la presente invención es una célula empaquetadora transfectada con
cualquiera de los plásmidos de la invención.
El término "célula empaquetadora" hace
referencia a cualquier célula modificada para expresar los genes
correspondientes a las proteínas virales necesarias para que se
pueda constituir la partícula viral infectiva a partir de la
construcción que se transfecta.
El término célula "transformada" o
"transfectada" hace referencia a la célula procariota o
eucariota, respectivamente, en la que se ha introducido material
genético externo mediante plásmidos, vectores víricos u otras
herramientas de transferencia de este tipo de material.
Para aplicar el método de la presente invención
también es necesario un virión que contiene el ARN codificado por
cualquiera de los plásmidos de secuencia SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO:
4. El término "virión" se refiere a la partícula viral
infectiva compuesta al menos por:
- Ácido nucleico vírico: el ácido nucleico es ARN de cadena sencilla.
- Proteínas víricas: Pueden ser proteínas estructurales como las que forman la cubierta externa o cápside (por ejemplo las proteínas ENV de los plásmidos de la presente invención), o también pueden ser otro tipo de proteínas enzimáticas (por ejemplo POL, VIF, VPR, TAT, etc...).
Los viriones de la presente invención se
obtienen como consecuencia de la transfección de células
empaquetadoras mediante un plásmido caracterizado por las secuencias
del primer aspecto de la presente invención. Los viriones son
liberados al medio en el que se cultivan las células empaquetadoras
transfectadas.
Otro aspecto necesario para aplicar el método de
la presente invención es una célula reporter transfectada con
cualquiera de los viriones según el aspecto anterior.
El término "célula reporter" hace
referencia a la célula que contiene un gen foráneo cuya proteína
puede ser detectada por la medida de su fluorescencia o cualquier
otro gen cuya proteína sea detectable.
Las células que expresan cualquiera de los
plásmidos de la invención pueden ser todas aquellas que admitan la
replicación de los plásmidos descritos con el objeto de conseguir
amplificar el número de copias de cada uno de los citados
plásmidos.
Como se ha mencionado anteriormente, los
viriones definidos en la presente invención contienen el ARN
codificado por la secuencia de los plásmidos SEQ ID NO: 1 a SEQ ID
NO: 4. El virión contiene la secuencia del virus
VIH-1, compuesto por dos copias de ARN de cadena
sencilla (sARN) en las cuales se encuentra la secuencia de la
retrotranscriptasa y la proteasa.
\global\parskip1.000000\baselineskip
En el método de la presente invención, los
plásmidos seleccionados de la lista que comprende SEQ ID NO: 1 a SEQ
ID NO: 4, o cualquiera de sus combinaciones, pueden emplearse para
clonar fragmentos del gen pol y de la proteasa del virus
VIH-1.
En el método de la presente Invención, los
fragmentos del gen pol y de la proteasa que se clonan en los
plásmidos SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 4 proceden de muestras aisladas
de personas infectadas por el virus VIH. Una vez amplificados los
fragmentos procedentes de pacientes infectados, éstos pueden
clonarse mediante la linearización por la acción de enzimas de
restricción y su posterior ligamiento, es decir, mediante el empleo
de técnicas de clonación que forman parte del conocimiento general
común. Las enzimas de restricción óptimas para llevar a cabo las
clonaciones son los pares de enzimas ApaI/ClaI y
ApaI/XmaI para los plásmidos mutados siempre que se
hayan empleado cebadores para amplificar los fragmentos deseados de
la secuencia del VIH-1 que contengan las secuencias
nucleotídicas reconocidas por las enzimas ApaI, ClaI y
XmaI. Estos fragmentos solo pueden clonarse en los plásmidos
descritos en la invención. ApaI es un sitio único común en
todas las construcciones de pNL4.3 ya que aparece en la secuencia
original.
Por tanto, el plásmido de la invención, o
cualquiera de sus combinaciones, los viriones que se obtienen con
los plásmidos tal como se ha descrito anteriormente y la célula
reporter, o cualquiera de sus combinaciones, pueden emplearse
para evaluar la resistencia de fenotipos del virus
VIH-1 a antirretrovirales.
El término "fenotipo" hace referencia a
cualquier característica detectable de un organismo (estructural,
bioquímica, fisiológica o conductual) determinada por una
interacción entre su genotipo y el medio en el que se
desarrolla.
El término "antirretroviral" hace
referencia a una sustancia química o fármaco que es capaz de tratar
la infección por el virus VIH. Los antirretrovirales actúan en
varias etapas del ciclo vital del virus VIH. Los tipos de
antirretrovirales pueden ser: Inhibidores de transcriptasa inversa
(inhibidores de transcriptasa análogos de nucleósidos, inhibidores
de transcriptasa no análogos de nucleótidos (NNRT) e inhibidores de
transcriptasa análogos de nucleótidos (NRT)). Inhibidores de
proteasa (IP), inhibidores de la integrasa, inhibidores de fusión,
anticuerpos monoclonales dirigidos contra
co-receptores, además se pueden usar diversas
mezclas de los anteriores, así como potenciadores de su efecto.
Las mutaciones que caracterizan a los virus VIH,
cuya tasa de replicación es muy elevada y no tienen sistema de
reparación genética, pueden provocar cambios en la resistencia de
los virus a los diferentes antirretrovirales que existen en la
actualidad. La resistencia puede deberse a cambios en algún
aminoácido, estructurales o de cualquier otro tipo que puede tener
como consecuencia la pérdida de afinidad del antirretroviral por la
proteína con la que interactúa.
Para evaluar la resistencia de diferentes
fenotipos de virus VIH a antirretrovirales mediante el método de la
presente invención, es necesaria la clonación, en los plásmidos de
secuencia SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 4., de los fragmentos del gen
que codifica para la polimerasa y/o del gen que codifica para la
proteasa del virus VIH presente en los pacientes por medio de su
amplificación por PCR mediante el uso de un cebador directo común y
diferentes cebadores reversos, incluyendo estos últimos, sitios de
restricción correspondientes a cada uno de los sitios obtenidos por
mutagénesis dirigida en los plásmidos. Posteriormente, se
trasnfectarían estos plásmidos en una línea celular empaquetadora,
se recogerían los viriones liberados, se emplearían los viriones
para infectar células reporter, y tras añadir un
antirretroviral a dichas células se mediría la fluorescencia, dando
una idea de la resistencia al antirretroviral en cuestión.
Una realización preferida de la invención es un
método de evaluación fenotípico de la resistencia de VIH a
antirretrovirales que comprende:
- a.
- recoger muestras biológicas de pacientes infectados por el virus VIH,
- b.
- extraer el ARN de las muestras del paso (a),
- c.
- amplificar, mediante RT-PCR, fragmentos del gen que codifica para la polimerasa y/o del gen que codifica para la proteasa del virus VIH del ARN del paso (b) mediante el empleo del cebador directo SEQ ID NO: 12 y el cebador reverso seleccionado de la lista que comprende SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10,
- d.
- clonar de forma independiente los fragmentos obtenidos en (c), en los plásmidos SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 4,
- e.
- transfectar los plásmidos obtenidos en (d) en una línea celular empaquetadora y recoger los viriones liberados,
- f.
- infectar células reporter con los viriones obtenidos en (e),
- g.
- añadir un antirretroviral a las células del paso (f) y
- h.
- medir la fluorescencia, calculando la IC_{50}.
Por el término "muestra biológica" se
entiende aquella muestra que procede de un fluido fisiológico como
sangre, plasma, suero u orina y/o cualquier tejido celular
procedente de un organismo vivo. Queda claro por tanto que se trata
de una muestra biológica aislada del organismo vivo.
La técnica de la RT-PCR consigue
amplificar el ADN codificante de los genes deseados mediante el
empleo de cualquier enzima (retrotranscriptasa; RT o transcriptasa
reversa) que utiliza el ARNm aislado de las muestras descritas y un
cebador reverso seleccionado de la lista que comprende SEQ ID NO: 7,
SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10. El cebador conocido como
reverso de cada uno de los pares descritos anteriormente hará de
iniciador para obtener el ADN de cadena simple o monocatenario
complementario a la secuencia de ARNm transcrita.
El siguiente paso es la obtención de fragmentos
de ADN de doble cadena amplificados mediante PCR (de las siglas en
inglés Polimerase Chain Reaction) utilizando como molde el
ADN codificante obtenido mediante la reacción de retrotranscripción
y los pares de cebadores directo/reverso siguientes: el cebador
directo es SEQ ID NO: 12 y el cebador reverso se selecciona de la
lista que comprende SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ
ID NO: 10. Además, para la síntesis del ADN es necesaria la
presencia de nucleótidos dNTPs, es decir, dATP, dTTP, dCTP y dGTP,
ADN polimerasa termoresistente, cloruro de magnesio en una
concentración determinada así como tampones que creen las
condiciones físico-químicas adecuadas para el
funcionamiento de todos los componentes y se consiga con ello la
amplificación.
La clonación de los fragmentos obtenidos en el
paso (c) en los plásmidos de la invención se puede llevar a cabo
mediante los enzimas de restricción ApaI y ClaI o
XmaI.
Tras la selección de los viriones liberados al
medio por las células empaquetadoras puede emplearse un paso
intermedio; la titulación de los viriones del paso (d) por medio de
la infección de una línea celular capaz de formar sincitios. Las
células formadoras de sincitios que pueden ser empleadas para llevar
a cabo la titulación son células MT-2 o cualquier
otra línea celular capaz de formar sincitios. La formación de
sincitios es el efecto citopático de VIH en algunas líneas celulares
y consiste en la formación de acúmulos celulares que pierden el
papel de separación que tiene la membrana externa de forma que
aparecen grandes células llenas de núcleos. La titulación tal como
se entiende en la presente invención es la determinación de la
dilución del sobrenadante con viriones y su capacidad infectiva
relativa. La titulación puede llevarse a cabo de forma alternativa
valorando la presencia de la proteína p24 (que es sintetizada si el
virión es infectivo).
El antirretroviral añadido a las células del
paso (f) se selecciona de la lista disponible que en la actualidad
comprendería zidovudina, didanosina, zalcitabina, estavudina,
lamivudina, abacavir, emtricitabina, nevirapina, delavirdina,
efavirenz, tenofovir, disoproxil fumarato, saquinavir, ritonavir,
indinavir, nelfinavir, amprenavir, lopinavir, atazanavir,
fosamprenavir, tipranavir, darunavir, enfuvirtida, maraviroc,
raltegravir, elvitegravir o cualquier otro inhibidor de
transcriptasa inversa (inhibidor de transcriptasa análogo de
nucleósidos, inhibidor de transcriptasa no análogo de nucleósidos e
inhibidor de transcriptasa análogo de nucleótidos), Inhibidor de
proteasa, inhibidor de la integrasa, inhibidor de fusión,
anticuerpos monoclonales dirigidos contra
co-receptores o potenciadores de su efecto además de
mezclas de los anteriores.
La medida de fluorescencia emitida es debida a
la activación de la expresión del gen reporter GFP dirigido
por el promotor LTR que reconoce el virus VIH-1, al
ser activado por la presencia del transactivador Tat, producido
durante la infección de la célula con el virión infeccioso. La
medida de la fluorescencia puede servir para calcular la IC_{50}.
La IC_{50} es la medida de la efectividad de un compuesto (en este
caso antirretroviral) en su proceso de inhibición biológica o de una
función bioquímica. Por tanto, el IC_{50} representa la
concentración de un compuesto que es necesaria para la inhibición de
la replicación viral in vitro en un 50%.
En una realización más preferida del método
anterior, la célula empaquetadora es 293-T y las
células reporter son CEM-GFP.
A lo largo de la descripción y las
reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no
pretenden excluir otras características técnicas, aditivos,
componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos,
ventajas y características de la invención se desprenderán en parte
de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Las
siguientes figuras y ejemplos se proporcionan a modo de ilustración,
y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
Fig 1. Muestra el mapa genético del plásmido
pNL4.3 CLA 4254 definido por la secuencia SEQ ID NO: 1.
En el mapa se muestra la posición relativa de
los genes gag (GAG), pol (POL), env (ENV) y
otros fragmentos (LTR; Long Terminal Repeat, pUC18; fragmento
procedente del vector pUC18,...) así como los sitios de restricción
más comunes para llevar a cabo cortes por enzimas de restricción.
También se muestra la posición de la mutación que da lugar a este
plásmido, en el nucleótido que ocupa la posición 4254.
\newpage
Fig 2. Muestra el mapa genético del plásmido
pNL4.3 XMA 4411 definido por la secuencia SEQ ID NO: 2.
En el mapa se muestra la posición relativa de
los genes gag (GAG), pol (POL), env (ENV) y
otros fragmentos (LTR; Long Terminal Repeat, pUC18; fragmento
procedente del vector pUC18,...) así como los sitios de restricción
más comunes para llevar a cabo cortes por enzimas de restricción.
También se muestra la posición de la mutación que da lugar a este
plásmido, en el nucleótido que ocupa la posición 4411.
\vskip1.000000\baselineskip
Fig 3. Muestra el mapa genético del plásmido
pNL4.3 XMA 4634 definido por la secuencia SEQ ID NO: 3.
En el mapa se muestra la posición relativa de
los genes gag (GAG), pol (POL), env (ENV) y
otros fragmentos (LTR; Long Terminal Repeat, pUC18; fragmento
procedente del vector pUC18,...) así como los sitios de restricción
más comunes para llevar a cabo cortes por enzimas de restricción.
También se muestra la posición de la mutación que da lugar a este
plásmido, en el nucleótido que ocupa la posición 4634.
\vskip1.000000\baselineskip
Fig 4. Muestra el mapa genético del plásmido
pNL4.3 CLA 4696 definido por la secuencia SEQ ID NO: 4.
En el mapa se muestra la posición relativa de
los genes gag (GAG), pol (POL), env (ENV) y
otros fragmentos (LTR; Long Terminal Repeat, pUC18; fragmento
procedente del vector pUC18,...) así como los sitios de restricción
más comunes para llevar a cabo cortes por enzimas de restricción.
También se muestra la posición de la mutación que da lugar a este
plásmido, en el nucleótido que ocupa la posición 4696.
\vskip1.000000\baselineskip
Fig 5. Muestra el patrón de migración en gel
de agarosa de los diferentes fragmentos diferenciales de los
plásmidos definidos por las secuencias SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO:
4.
Patrón electroforético de los cortes de los
plásmidos con enzimas de restricción: (A) Control PM, (B) pNL4.3
cortado con ApaI y PinAI (fragmento 1480 bp), (C)
pNL4.3 C4254 (SEQ ID NO: 1) cortado con ApaI y ClaI
(fragmento2248 bp), (D) pNL4.3 X4411 (SEQ ID NO: 2) cortado con
ApaI y XmaI (fragmento2405 bp), (E) pNL4.3 X4634 (SEQ
ID NO: 3) cortado con ApaI y XmaI (fragmento 2628 bp)
y (F) pNL4.3 X4696 (SEQ ID NO: 4) cortado con ApaI y
ClaI (fragmento 2690 bp).
\vskip1.000000\baselineskip
Fig 6. Muestra los pasos del análisis
fenotípico de resistencias de VIH-1 a
antirretrovirales.
En esta figura se muestra el esquema de los
procesos llevados a cabo para evaluar la resistencia de los
diferentes virus VIH-1 a antirretrovirales.
El plásmido construido se transfecta en células
293T/17. Los viriones infecciosos con el fragmento del gen
pol se titulan en células MT2 formadoras de sinticios y, a
continuación, se infectan células CEM-GFP para que
pueda medirse el nivel de fluorescencia emitida tras añadir fármacos
antirretrovirales.
\vskip1.000000\baselineskip
Fig 7. Muestra un ejemplo demostrativo de las
curvas de inhibición de las células CEM-GFP
infectadas con SEQ ID NO: 1 respecto de las infectadas con pNL4.3
(control) cuando son tratadas con el antirretroviral
INDINAVIR.
NL4.3 con la mutación 4254 hace referencia a SEQ
ID NO: 1.
\vskip1.000000\baselineskip
Fig 8. Muestra un ejemplo demostrativo de las
curvas de inhibición de las células CEM-GFP
infectadas con SEQ ID NO: 2 respecto de las infectadas con pNL4.3
(control) cuando son tratadas con un antirretroviral
INDINAVIR.
NL4.3 con la mutación 4411 hace referencia a SEQ
ID NO: 2.
\vskip1.000000\baselineskip
Fig 9. Muestra un ejemplo demostrativo de las
curvas de inhibición de las células CEM-GFP
infectadas con SEQ ID NO: 4 respecto de las infectadas con pNL4.3
(control) cuando son tratadas con un antirretroviral
INDINAVIR.
NL4.3 con la mutación 4696 hace referencia a SEQ
ID NO: 4.
\vskip1.000000\baselineskip
A continuación se ilustrará la invención
mediante unos ensayos realizados por los inventores que describen la
obtención de los nuevos plásmidos y su ensayo en la evaluación de
los sistemas de extracción de ácidos nucleicos así como en la
evaluación de su resistencia a antirretrovirales.
Las construcciones se crearon con mutaciones
dirigidas a un sitio concreto en el gen pol del virus
VIH-1.
Para ello, la región del pNL4.3 entre los
lugares de secuencia 1548 y 5979 se amplificó con el cebador directo
SEQ ID NO: 5 y con el cebador reverso SEQ ID NO: 6. Ambos
corresponden a porciones de secuencia en el gen pol, se usó
con este propósito polimerasa de alta fidelidad (Expand high
fidelity PCR System). El fragmento amplificado se clonó en el
vector TOPO TA (Invitrogen). Una vez probada la correcta orientación
de los insertos realizados se procedió a llevar a cabo cuatro de
mutagénesis dirigidas individuales (Transformer
Site-Directed Mutagénesis Kit (Clontech))
usando los cuatro cebadores para mutagénesis siguientes: SEQ ID NO:
7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10.
Se utilizó otro cebador para selección que
incluye el sitio de restricción NcoI definida por la
secuencia SEQ ID NO: 11. Tras obtener las mutaciones se cortó el
fragmento, ApaI/PflmI que incluye cada mutación y se
reinsertó en el fragmento correspondiente obtenido en pNL4.3, de
esta forma se obtuvieron los cuatro plásmidos mutados.
Los cuatro plásmidos que se obtuvieron tras el
proceso de mutagénesis dirigida fueron:
- SEQ ID NO: 1 (pNL4.3 CLA 4254) (Fig 1): Se
sustituyó el nucleótido que ocupaba la posición 4243 del plásmido
original pNL4.3 correspondiente al gen pol que cambió el
codón ATA (codifica para el aminoácido isoleucina) por ATC (también
codifica para el aminoácido isoleucina), generándose de ese modo un
nuevo sitio de restricción ClaI. El fragmento generado va
desde la posición que ocupa el sitio de restricción ApaI a
ClaI con un tamaño de 2248 pb.
- SEQ ID NO: 2 (pNL4.3 XMA 4411) (Fig 2): Se
sustituyó el nucleótido que ocupaba la posición 4403 del plásmido
original pNL4.3 correspondiente al gen pol que cambió el
codón CCA (codifica para el aminoácido prolina) por CCG (también
codifica para el aminoácido prolina), generándose de ese modo un
nuevo sitio de restricción XmaI. El fragmento generado va
desde la posición que ocupa el sitio de restricción ApaI a
XmaI con un tamaño de 2405 pb.
- SEQ ID NO: 3 (pNL4.3 XMA 4634) (Fig 3): Se
sustituyeron dos nucleótidos que ocupaban las posiciones 4625 y 4626
del plásmido original pNL4.3 correspondiente al gen pol que
cambió la secuencia TGGGCG por TGCCCG. Se produjeron
dos cambios de aminoácido TGG (codifica para el aminoácido
triptófano) por TGC (codifica para el aminoácido cisteína) y GCG
(codifica para el aminoácido alanina) por CCG (codifica para el
aminoácido prolina), generándose de ese modo un nuevo sitio de
restricción XmaI. El fragmento generado va desde la posición
que ocupa el sitio de restricción ApaI a XmaI con un
tamaño de 2628 pb. El virus producido resultó no infeccioso e
incapaz de producir sinticios, por tanto, puede ser considerado como
control negativo.
- SEQ ID NO: 4 (pNL4.3 CLA 4696) (Fig 4): Se
sustituyó el nucleótido que ocupaba la posición 4688 del plásmido
original pNL4.3 correspondiente al gen pol que cambió el
codón TCT (codifica para el aminoácido serina) por TCG (también
codifica para el aminoácido serina), generándose de ese modo un
nuevo sitio de restricción ClaI. El fragmento generado va
desde la posición que ocupa el sitio de restricción ApaI a
ClaI con un tamaño de 2690 pb.
El control de las mutaciones se llevó a cabo
mediante digestión de los plásmidos con las enzimas de restricción
apropiadas así como mediante la secuenciación de las construcciones.
En la columna 1 de la Fig 5 se muestra el patrón de bandas de un ADN
control cuyo tamaño de banda (nº de pares de bases) es conocido y
por tanto, sirve de referencia para determinar el tamaño de las
bandas obtenidas tras la digestión de cada uno de los plásmidos
construidos. En el resto de columnas se muestran dos bandas
correspondientes a ADN lineal obtenido mediante corte por digestión
de los enzimas de restricción ApaI/Pim AI,
ApaI/ClaI, ApaI/XmaI,
ApaI/XmaI y ApaI/ClaI que proceden de
los plásmidos pNL4.3 (plásmido original), p4254 (SEQ ID NO: 1),
p4411 (SEQ ID NO: 2), p4634 (SEQ ID NO: 3) y p4696 (SEQ ID NO: 4),
respectivamente. La banda más grande (migra más lentamente),
correspondiente a cada uno de los plásmidos, pertenece a la mayor
parte del ADN del plásmido y las bandas más pequeñas (migran más
lentamente) pertenecen al ADN de parte del gen gag y
pol del virus VIH-1.
\vskip1.000000\baselineskip
Mediante el empleo de la técnica de
amplificación por RT-PCRs se obtuvieron fragmentos
del gen pol del virus VIH-1 de pacientes
infectados. Se usaron los pares de cebadores SEQ ID NO: 12 (cebador
directo con el sitio de restricción ApaI) y SEQ ID NO: 7
(cebador reverso con el sitio de restricción ClaI), SEQ ID
NO: 8 (cebador reverso con el sitio de restricción XmaI), SEQ
ID NO: 9 (cebador reverso con el sitio de restricción XmaI) o
SEQ ID NO: 10 (cebador reverso con el sitio de restricción
ClaI).
Los cebadores fueron diseñados con la ayuda del
programa Primer3 Output
(http://www-genome.wi.mit.edu) incluyendo el sitio
de restricción de ApaI en el cebador directo y el
XmaI/ClaI en cada cebador reverso, necesarios para
el
posterior ligamiento de los fragmentos de ApaI-XmaI/ClaI del paciente en cada uno de los cuatro plásmidos generados.
posterior ligamiento de los fragmentos de ApaI-XmaI/ClaI del paciente en cada uno de los cuatro plásmidos generados.
Es decir, se generaron cuatro alternativas
viables para la construcción de virus para el análisis de
resistencias fenotípicas con fragmentos más largos que los
tradicionalmente usados Apa I-PinAI.
\vskip1.000000\baselineskip
Experimento
I
Para construir un sistema de valoración
fenotípica de la infección del VIH-1, que ampliase
las posibilidades de pseudotipado del virus VIH-1
con el fragmento de la región gag-pol estudiada
actualmente (ApaI2010-PinAI3486 = 1476 pb), fueron
introducidas en el gen pol cuatro mutaciones mediante
mutagénesis dirigida de manera que se formaran cuatro nuevos sitios
de reconocimiento para enzimas de restricción (dos sitios para
ClaI y dos para XmaI). De este modo se amplían los
posibles fragmentos genéticos a estudiar en los virus recombinados a
2248, 2405, 2628 y 2690 pb hasta abarcar toda la región de la
proteasa y de la retrotranscriptasa.
Las mutaciones se realizaron en el vector
pNL4.3, tras lo cual cada uno fue transfectado mediante fosfato
cálcico en la línea celular empaquetadora 293-T.
48-72 horas post-transfección se
cosecharon los sobrenadantes que contenían los viriones liberados al
medio y se titularon por el método de formación de sincitios en la
línea celular MT-2. En este punto conviene recordar
que el virus que incluye el plásmido definido por SEQ ID NO: 3
(pNL4.3X4634) (Fig 3) resultó no infeccioso e incapaz de producir
sinticios, por tanto, puede ser considerado como control negativo.
Se utilizaron inóculos virales de 5x10^{5} dosis infectivas/ml
para infectar células reporter CEM-GFP. Los ensayos
de infección in vitro se optimizaron y protocolizaron para su
aplicación en la determinación de la replicación viral (Fig 6).
Las células CEM-GFP son células
T humanas que contienen un promotor LTR (Long Terminal
Repeaf) que dirigen la expresión de la proteína
"reporter" GFP (Green Fluorescent Protein). El
promotor LTR tiene una región, transactivating responsive
sequence (TAR), que reconoce la proteína TAT
(Trans-activating proteína). La proteína TAT es
liberada al medio extracelular por las células infectadas y es
recogida por las células sanas donde activa la replicación del virus
VIH induciendo la fosforilación del dominio
C-terminal de la ARN polimerasa II. Las células
infectadas por el virus VIH (en el caso de esta invención, los
plásmidos que contienen la secuencia de los genes
gag-pol del virus) expresan el gen GFP tanto más
cuanto mayor es la infección. De este modo, cuando se añade un
antirretroviral después de una infección por VIH, la medida de la
expresión del gen GFP variará en base al nivel de resistencia del
virus infectado.
Las mediciones de los niveles de fluorescencia
emitidos por las células en cultivo en cada caso fueron realizadas
mediante fluorimetría, procesadas en una hoja de cálculo creada con
el programa Excel (Microsoft) y utilizada para el cálculo de las IC
50 que se realizó con el programa GraFit32.
Se ensayaron in vitro infecciones del
plásmido base pNL4.3, de un plásmido semejante pero con mutaciones
que lo hacen resistente a inhibidores de proteasa,
pL10R/M46I/L63P/V82T/184V* (L10R), y de los plásmidos de la presente
invención, mutados en el gen pol. A partir de los resultados
obtenidos en estos ensayos se pudo establecer la dinámica de la
infección con estos virus y comparar su comportamiento modificando
de forma secuencial las características de su gen pol.
Tras los primeros resultados, se consiguieron
testar las construcciones de la presente invención con los métodos
de la empresa VIRCO. Los resultados se presentan en la tabla 1.
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- Nucleoside Reverse Transcriptase Inhibitor (NRTI),
- Non-Nucleoside Reverse Transcriptase Inhibitor (NNRTI),
- Protease Inhibitor (IP)
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados realizados por triplicado y en
colaboración con VIRCO (Mechelen (Bélgica)) mostraron la
concordancia entre las predicciones fenotípicas y genotípicas al
comparar los resultados del fenotipado con las predicciones del
sistema VIRCOType.
El valor a partir del cual se considera
resistente fue establecido por la empresa VIRCO (www.vircolab.com) y
se basa en valores en la lectura de fluorescencia de más de 3 y
criterios de respuesta clínica.
Conclusión preliminar: Las construcciones
realizadas y su funcionamiento tras la inclusión de los fragmentos
correspondientes posibilita el trabajo con fragmentos más amplios y
es aplicable al estudio de efectos de mutaciones a más distancia de
las convencionales ApaI-PinAI.
Experimento
II
Se ha desarrollado según lo previsto en el
proyecto un método de evaluación de las resistencias fenotípicas
propio. Dicho método presentó diferencias con las estrategias de
evaluación del método desarrollado por VIRCO o Virologic pero
los resultados obtenidos fueron coherentes con los obtenidos en las
pruebas realizadas en colaboración con VIRCO.
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\vskip1.000000\baselineskip
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Los valores en negrita indican resistencia a
antirretrovirales.
El plásmido pCHUS es un vector mínimo que
contiene el genoma completo HIV procedente de pNL4.3, así como el
gen de resistencia a ampicilina y el origen de replicación derivados
de pUC18, que permiten su propagación en E. coli. El plásmido
tiene un tamaño de 11.538 pb y posee varios sitios de restricción
únicos nuevos. Este vector minimizado puede facilitar no sólo su
propia manipulación genética, sino también los procesos de
transformación tanto en E. coli como en cultivos celulares e
incluso podría permitir la mutagénesis in vitro directamente,
sin necesidad de clonaciones y subclonaciones (Molecular
Biotechnology. 2004. 28:87-95).
Conclusión preliminar: el modelo desarrollado y
su medida posibilita el estudio de la infección por virus VIH en un
modelo fenotípico con un rendimiento adecuado y permitiría testar
antirretrovirales convencionales usando las construcciones de la
presente invención personalizadas con secuencias pol del
virus de pacientes.
En las Fig 7, 8 y 9 se muestran las curvas de
respuesta de los plásmidos definidos según las secuencias SEQ ID NO:
1, SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 4 respectivamente.
\newpage
A continuación mostramos los resultados
numéricos de cada una de las curvas de respuesta.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
- IC_{50}: 1,17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
- IC_{50}: 1,23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
- IC_{50}: 1,04
\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> Universidade de Santiago de
Compostela
\hskip1cmNanogap
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Método de evaluación de resistencia
de fenotipos de VIH-1 a antirretrovirales
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 1596.15-2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14883
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> misc_recomb
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Plásmido p4254
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14883
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> misc_recomb
\vskip0.400000\baselineskip
<223> p4411
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14883
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> misc_recomb
\vskip0.400000\baselineskip
<223> p4634
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14883
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> misc_recomb
\vskip0.400000\baselineskip
<223> p4696
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la inmunodeficiencia
humana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> virus de la inmunodeficiencia
humana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> primer_bind
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Usado en la mutagénesis directa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> primer_bind
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Usado en la mutagénesis directa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> primer_bind
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Usado en la mutagénesis directa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> primer_bind
\vskip0.400000\baselineskip
<223> usado en la mutagénesis directa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> primer_bind
\vskip0.400000\baselineskip
<223> usado en la mutagénesis directa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> primer_bind
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sitio de restricción ApaI
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (2)
1. Método de evaluación de la resistencia de
fenotipos de VIH a antirretrovirales que comprende:
- a.
- recoger muestras biológicas de pacientes infectados por el virus VIH,
- b.
- extraer el ARN de las muestras del paso (a),
- c.
- amplificar, mediante RT-PCR, fragmentos del gen que codifica para la polimerasa y/o del gen que codifica para la proteasa del virus VIH del ARN del paso (b) mediante el empleo del cebador directo SEQ ID NO: 12 y el cebador reverso seleccionado de la lista que comprende SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10,
- d.
- clonar de forma independiente los fragmentos obtenidos en (c), en los plásmidos seleccionados de la lista que comprende SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4,
- e.
- transfectar los plásmidos obtenidos en (d) en una línea celular empaquetadora y recoger los viriones liberados,
- f.
- infectar células reporter con los viriones obtenidos en (e),
- g.
- añadir un antirretroviral a las células del paso (f) y
- h.
- medir la fluorescencia.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Método según la reivindicación 1 donde la
célula empaquetadora es 293-T y las células
reporter son CEM-GFP.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES201001193A ES2354785B2 (es) | 2008-09-30 | 2010-09-30 | Método de evaluación de resistencia de fenotipos de vih-1 a antirretrovirales. |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200802766 | 2008-09-30 | ||
| ES201001193A ES2354785B2 (es) | 2008-09-30 | 2010-09-30 | Método de evaluación de resistencia de fenotipos de vih-1 a antirretrovirales. |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2354785A1 ES2354785A1 (es) | 2011-03-18 |
| ES2354785B2 true ES2354785B2 (es) | 2011-10-13 |
Family
ID=43640325
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES201001193A Expired - Fee Related ES2354785B2 (es) | 2008-09-30 | 2010-09-30 | Método de evaluación de resistencia de fenotipos de vih-1 a antirretrovirales. |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| ES (1) | ES2354785B2 (es) |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ATE302287T1 (de) * | 1999-05-28 | 2005-09-15 | Virco Nv | Neue mutationsprofile der hiv-1 reverse transcriptase in verbindung mit phänotypischem medikamentresistenz |
| ES2244332B1 (es) * | 2004-05-10 | 2007-02-16 | Fundacion Para La Investigacion Y La Prevencion Del Sida En España | Nuevos clones virales recombinantes basados en vih y su utilizacion en metodos analiticos. |
-
2010
- 2010-09-30 ES ES201001193A patent/ES2354785B2/es not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2354785A1 (es) | 2011-03-18 |
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|---|---|---|---|
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