ES2260212T3 - Ensayo de deteccion de vih y reactivos para el mismo. - Google Patents

Abstract

Un método para producir un virus recombinante, que comprende la recombinación de una secuencia nucleotídica derivada de una muestra de virus con una secuencia de la cadena principal de una cepa de virus estándar para producir un virus recombinante, en el que la secuencia de la cadena principal comprende una porción de la secuencia de ácido nucleico infecciosa de una cepa de virus de laboratorio que se extiende desde un primer sitio dentro o adyacente al término 3'' o al término 5'' de la secuencia de ácido nucleico infecciosa, y la secuencia nucleotídica derivada de la muestra del virus comprende el resto de la secuencia de ácido nucleico infecciosa.

Description

Ensayo de detección de VIH y reactivos para el mismo.

La presente invención se refiere a métodos para generar virus recombinantes de muestras tales como muestras de virus no caracterizados o muestras clínicas y al uso de los virus así generados en ensayos, predominantemente para el propósito de detectar la susceptibilidad vírica alterada a fármacos y reactivos anti-víricos. La invención también se refiere a secuencias de ácido desoxirribonucleico (ADN) aplicadas en los nuevos métodos y ensayos. Los métodos y ensayos se adaptan para detectar virus resistentes más rápida, sensible y precisamente que los ensayos conocidos, teniendo en cuenta las mutaciones compensatorias adicionales que surgen en las secuencias nucleotídicas diferentes a aquellas que codifican la diana del fármaco anti-vírico, y requiriendo menos eventos de recombinación para generar el virus recombinante.

La resistencia del virus de inmunodeficiencia humana de tipo 1 (VIH-1) a los fármacos anti-retrovíricos presenta un desafío importante en la prevención quimioterapéutica de la progresión del síndrome de inmunodeficiencia adquirida (sida). La adquisición de resistencia vírica se acentúa por una rápida velocidad de recambio del virus in vivo combinada con una alta velocidad de error de la enzima retrotranscriptasa (RT) vírica (Coffin, 1995; Ho et al., 1995; Mansky y Temin, 1995; Wei et al., 1995). Por lo tanto, la meta actual de terapia anti-VIH-1 es como máximo suprimir la replicación del virus como para demorar la aparición de variantes resistentes a los fármacos y mantener niveles de salud de los inmunocitos CD4^{+} durante la mayor cantidad de tiempo posible (Vandamme et al., 1999). Con este fin, las terapias más recientemente introducidas para la infección del VIH-1 usualmente comprenden combinaciones de tres o más fármacos anti-retrovíricos.

El uso simultáneo de inhibidores de la retrotranscriptasa (RT) e inhibidores de proteasa vírica (PR) (inhibidores de proteasa o Pl) ha conducido al surgimiento de las variantes del VIH-1 con mutaciones de resistencia tanto en las dianas de fármacos RT como PR. Estas mutaciones alteran la estructura y/o afinidades químicas de las enzimas diana de modo tal que su capacidad de interactuar con los fármacos se altera o reduce y los fármacos muestran menor actividad contra el virus mutado. Las mutaciones resistentes a fármacos pueden ocurrir potencialmente en las moléculas diana de un fármaco de cualquier otro virus, por ejemplo, se han demostrado las mutaciones asociadas con menor susceptibilidad a análogos de nucleósidos en las timidina quinasas o ADN polimerasas del herpesvirus (Kimberfin and Whitley, 1996; Balfour, 1999).

Puede ser valioso vigilar el surgimiento del virus resistente a fármacos como parte del manejo de infección y enfermedad. Por ejemplo, los ensayos del fenotipo de resistencia de aislamientos de VIH-1 cumple una función importante en el manejo de la enfermedad, identificando el desarrollo de susceptibilidad reducida, resistencia cruzada o re-sensibilización a los muchos fármacos terapéuticos que se encuentran disponibles. El co-cultivo de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de sujetos infectados con PBMC de donantes no infectados es un método que se ha utilizado para aislar VIH-1 de sujetos para ensayos de fenotipia (Japour et al., 1993). El co-cultivo de PBMC no es ideal para una aplicación regular a gran escala, ya que implica el aislamiento de PBMC frescas y se ha demostrado que los tiempos de cultivo prolongados seleccionan menos variantes resistentes a fármacos o una minoría de ellas (Kusumi et al., 1992; Mayers et al., 1998).

El ensayo del virus recombinante (RVA) permite la determinación reproducible de susceptibilidad fenotípica del VIH-1 del plasma del sujeto (Kellam and Larder, 1994; Maschera et al, 1995; Hertogs et al., 1998) y, por lo tanto, ha contribuido decisivamente a orientar la opción de fármacos empleados en la terapia del VIH-1. En el RVA, las secuencias RT y/o PR del VIH-1 se amplían del plasma por reacción en cadena de la polimerasa por retrotranscripción (RT-PCR) y se co-electroporan en células cultivadas CD4^{+} con un clon molecular del provirus HXB2 natural de VIH-1 con deleción de RT y/o PR, denominado vector (un provirus es la secuencia de ADN del VIH-1 infecciosa que está integrada al ADN de la célula hospedante, véase fig. 1). Las secuencias de RT o PR derivadas del plasma se insertan en el sitio de deleción correspondiente del vector natural por recombinación homóloga y el ADN del vector recombinante resultante se inserta en el ADN celular para producir provirus infecciosos de longitud total. La expresión génica de los provirus produce una población de virus con un fenotipo de susceptibilidad a los fármacos representativo de los virus del plasma del sujeto. Las disoluciones madre resultantes del virus se pueden utilizar para pruebas de sensibilidad a los inhibidores de PR y/o RT, dependiendo de qué parte de la información genética en el virus recombinante deriva del aislamiento clínico. El RVA tiene varias ventajas en comparación con el co-cultivo de PBMC, además de ser más rápido y reproducible. La producción de un virus en una cadena principal común permite una comparación más precisa de las sensibilidades de los fármacos y de las características de desarrollo del virus producido, y los tiempos de cultivo más breves minimizan las variantes menores.

La publicación de Martinez-picado et al., 1999 describe plásmidos y métodos simples para una clonación rápida de productos RT-PCR del VIH-1 de muestras de pacientes y su uso para generar clones de virus recombinante infeccioso para fenotipia y genotipia de virus. Se construyeron ocho plásmidos con deleciones diferentes de secuencias que codifican la proteasa del VIH-1 (PR), la retrotranscriptasa (RT) o los sitios de escisión Gag p7/p1 y Gag p1/p6 para clonar productos PCR de VIH-1. Además, se describe un plásmido p83-10 que contiene el genoma del VIH-1 de la mitad 3', incluyendo genes vpr parcial y tat, rev, vpu, env. y nef completos, como también 3'-LTR. No obstante, esta cadena principal (p83-10) que consiste en el genoma del VIH-1 de la mitad 3' de una cepa de virus de laboratorio no se usa en un método para producir el virus recombinante que comprende la secuencia de la cadena principal con el 5' LTR ampliado de la muestra de un paciente.

De modo similar, los ensayos del tipo RVA se pueden dirigir a la detección de mutantes de virus resistentes a fármacos que no sean el VIH-1, mediante la recombinación de secuencias correspondientes a la diana de fármacos anti-víricos, derivados por PCR o RT-PCR de la muestra de un sujeto, con un vector de ADN que incluye un genoma vírico natural que porta una deleción correspondiente a la secuencia que codifica la diana del fármaco.

Los mutantes de VIH-1 con resistencia a los inhibidores de PR frecuentemente muestran menor adaptación como consecuencia de la escisión ineficiente del precursor Gag y las poliproteínas Gag-Pol por la enzima PR mutante (Maschera et al., 1995; Doyon et al., 1996; Maschera et al., 1996a, b; Mammano et al., 1998; Pazhanisamy et al., 1998; Zennou et al, 1998). No obstante, las mutaciones que compensan los defectos de la escisión pueden ocurrir en los sitios de escisión (CS) y funcionan mejorando la adaptación vírica (Doyon et al., 1996; Zhang et al., 1997; Carrillo et al, 1998; Mammano et al., 1998; Alford et al, 1999). Por lo tanto, las mutaciones asociadas con susceptibilidad reducida a los agentes anti-retrovíricos comercializados ocurren en por lo menos tres regiones distintas del genoma del VIH-1: RT, PR y CS.

Las mutaciones de CS compensatorias solamente se han demostrado en forma no ambigua en los CS Gag p7/p1 y p1/p6, no obstante, estos sitios están yuxtapuestos a PR y RT de los genes diana del fármaco y, por lo tanto, se han secuenciado más frecuentemente que los otros CS. Existe un total de nueve CS presentes en las poliproteínas Gag-Pol y Gag, los cuales están potencialmente afectados por las mutaciones PR y, en consecuencia son sitios posibles de mutaciones compensatorias, por lo tanto, parece posible que las mutaciones de CS no caracterizadas puedan ocurrir en CS distintos a aquellos cubiertos en las ampliaciones de PCR actuales. Existen algunos datos recientes de que las mutaciones de CS compensatorias ocurren fuera de los p7/p1 y p1/p6 (Mammano et al, 1998; Alford et al, 1999). Por lo tanto, con el fin de representar verdaderamente la adaptación y resistencia de un virus tal como sucede in vivo, los virus generados a partir de muestras clínicas idealmente deberán incluir todos los CS, tanto como para facilitar la propagación del virus como para minimizar la competencia con cepas potencialmente menos resistentes y más adaptables.

También se puede contemplar que, en el VIH-1 u otros virus, las mutaciones compensatorias pueden ocurrir en proteínas víricas asociadas con la enzima RT en su rol funcional (proteínas accesorias), o en los sitios de unión, activación o iniciación en el genoma ARN desde el cual la enzima RT comienza la retrotranscripción del genoma en la primera etapa de la replicación vírica. De modo similar, en la quimioterapia vírica de determinadas infecciones, la enzima polimerasa vírica es la diana del fármaco, en cuyas circunstancias las mutaciones de resistencia pueden ocurrir en las secuencias víricas que codifican la polimerasa, y las mutaciones compensatorias podrían contemplarse en proteínas accesorias o en secuencias de unión, activación, iniciación de polimerasa, etc. del genoma vírico. Otros mecanismos posibles mediante los cuales los virus podrían superar las mutaciones inducidas por los fármacos que son perjudiciales para el desarrollo vírico incluyen la modulación de expresión de aquellas dianas de fármacos por mutaciones compensatorias en secuencias de ácido nucleico regulatorias o por mutaciones que afectan los factores víricos que controlan los niveles, tiempos o patrones de expresión.

En una mejora al ensayo RVA, descrita en la solicitud de patente internacional No. PCT/GB/00/01639 (publicada como WO00/66774), las secuencias víricas derivadas de plasma se recombinan con un provirus natural clonado que porta una deleción de por lo menos una porción de la secuencia que codifica la diana(s) del fármaco antivírico y, adicionalmente, otra deleción de secuencias que comprenden sitios potenciales de mutación compensatoria, incluyendo CS p7/p1 y p1/p6. Los vectores de ADN para uso en dichos ensayos también se describen en la Publicación Internacional WO00/66774.

En un primer aspecto, la presente invención provee un método para producir un virus recombinante que tiene el perfil de resistencia de una muestra de virus por recombinación de una secuencia nucleotídica derivada de la muestra del virus con una secuencia nucleotídica ("secuencia de la cadena principal") de una cepa de virus de laboratorio, para producir un virus recombinante que tiene el perfil de resistencia de la muestra del virus, en el que la secuencia de la cadena principal comprende una porción de la secuencia de ácido nucleico infeccioso (INAS) de una cepa de virus de laboratorio natural que se extiende desde un primer sitio dentro o adyacente al término 3' (prime tres) o al término 5' (prime cinco) de la INAS, y la secuencia nucleotídica derivada de la muestra del virus comprende prácticamente el resto de la INAS. Una INAS se define como una secuencia de ácido nucleico que es suficiente para producir un virus viable después de la introducción en células susceptibles; en el caso de VIH, la INAS con frecuencia se denomina "provirus".

De acuerdo con un segundo aspecto, la presente invención provee un ensayo para la detección y caracterización, en una muestra de virus, de un virus resistente a un fármaco anti-vírico, comprendiendo el ensayo las etapas de

(i)

producir un virus recombinante que tiene el perfil de resistencia de la muestra del virus por recombinación de una secuencia nucleotídica derivada de la muestra del virus que se sospecha incluye el virus de resistencia a los fármacos con una secuencia nucleotídica ("secuencia de la cadena principal") a partir de una cepa de virus de laboratorio para producir un virus recombinante que tenga el perfil de resistencia de la muestra del virus, en el que la secuencia de la cadena principal comprende una porción de una INAS de un virus de laboratorio que se extiende desde un primer sitio dentro o adyacente al término 3' o al término 5' de la INAS, y la secuencia nucleotídica derivada de la muestra del virus comprende prácticamente el resto de la INAS;

(ii)

incubar células infectadas con el virus recombinante con un fármaco antivírico; y

(iii)

detectar la viabilidad del virus o de las células infectadas después de la incubación para determinar la sensibilidad del virus recombinante al fármaco.

La secuencia de la cadena principal puede comprender 20-90% de la INAS de la cepa de laboratorio, por ejemplo 25-75%, preferentemente por lo menos un tercio de la INAS de la cepa de laboratorio. En realizaciones particulares, la secuencia de la cadena principal proviene de una cepa de virus de laboratorio natural y comprende aproximadamente la mitad de una INAS natural, preferentemente la mitad 3'.

El ensayo de fenotipia de la presente invención puede ser un ensayo basado en cultivo hístico en el que el virus infeccioso recombinante, p. ej., VIH-1, deriva de una muestra clínica. En realizaciones particularmente preferidas, aproximadamente la mitad de la información genética de la variante del virus recombinante formada en el ensayo deriva del aislamiento clínico y el resto por lo general deriva de una cepa vírica de laboratorio estándar, usualmente una cepa natural (la secuencia de la cadena principal). Si el virus que se está probando para resistencia a fármacos es el VIH-1, la cepa de laboratorio estándar preferentemente comprende el extremo 3' del provirus (INAS), que incluye el gen env. Esto se recombina en el cultivo celular con una secuencia derivada de un aislamiento clínico, que incluye por lo menos la secuencia que codifica una diana del fármaco. Preferentemente, la secuencia derivada del aislamiento clínico incluye la diana del fármaco PR y toda la secuencia gag. Esto permite que todos los sitios de escisión (CS) en la región gag se incluyan en el ensayo de resistencia. En una realización particularmente preferida, la secuencia derivada del aislamiento(s) clínico incluye todas las secuencias que codifican las dianas de fármacos PR y RT, y todos los CS en Gag y Pol, es decir desde la unión N-terminal Gag p17/p24 hacia el sitio terminal Pol RNAseH/INT. El ensayo en esta forma se denomina en la presente ensayo FivePrime HIV (FPH) y se resume en la Figura 2.

La recombinación del ADN de la secuencia de la cadena principal, p. ej., en realizaciones preferidas, la porción 3' de la INAS, con el resto de la INAS derivada del virus del plasma de un sujeto, produce la formación de un virus infeccioso que pude utilizarse en los ensayos de sensibilidad a los fármacos.

En un tercer aspecto, la presente invención provee la secuencia de cadena principal del ADN que comprende secuencias de una cepa de laboratorio natural que se extiende desde un primer sitio en o adyacente al término 3' o al término 5' de una INAS hacia un segundo sitio dentro de la INAS. En general, la secuencia de la cadena principal incluye el extremo 3' del genoma vírico y cubre por lo menos 25% del genoma, preferentemente por lo menos un tercio del genoma. En realizaciones particulares, la secuencia de la cadena principal comprende aproximadamente la mitad del genoma vírico de la cepa de laboratorio natural; en la que el virus es el VIH-1, preferentemente la mitad 3' de un provirus.

En otro aspecto, la presente invención provee un kit para la ejecución de un método de acuerdo con el primer aspecto de la invención o un ensayo de acuerdo con el segundo aspecto de la invención, comprendiendo el kit una secuencia de la cadena principal de acuerdo con el tercer aspecto de la invención. También se provee una secuencia de la cadena principal de acuerdo con el tercer aspecto de la invención, para uso en un método para producir virus recombinante, por ejemplo, un método de acuerdo con el primer aspecto de la presente invención, y el uso de una secuencia de la cadena principal de acuerdo con el tercer aspecto de la presente invención en un ensayo para la detección de un virus resistente a un fármaco anti-vírico.

En toda la memoria y en las reivindicaciones que siguen, el término "adyacente" al extremo 3' o 5' significa en un sitio que es lo suficientemente cercano a ese extremo para producir un virus recombinante viable después de la recombinación en el método o ensayo de la presente invención. Será evidente para la persona con experiencia en la técnica el modo en que la proximidad al extremo afectará la viabilidad del virus recombinante resultante, y podrá seleccionar un sitio apropiado a partir de sus propios conocimientos o por ensayo y error, sin viremia indebida.

Preferentemente, las dos secuencias de ADN recombinadas en el método y ensayo de la invención representan cada una aproximadamente la mitad del genoma vírico. La longitud del provirus del VIH puede variar entre cepas, de modo que los términos "mitad", "mitad 5'" o "mitad 3" son aproximados. En el caso del VIH, si se utiliza el término "mitad", significa que el gen env yace en la mitad 3', que en general deriva de la cepa del virus de laboratorio y que las secuencias gag, PR y RT, incluyendo los sitos de escisión de proteasa codificados por estas secuencias, yacen en la mitad 5' que en general deriva de la muestra vírica bajo estudio, p. ej., la muestra de un paciente. Convenientemente, la división entre las mitades 3' y 5' del provirus del VIH se puede efectuar en la secuencia que codifica la proteína integrasa vírica (INT), que produce aproximadamente partes iguales, pero como puede comprobarse que la INT es en sí misma una diana de fármacos adecuada o un sitio de mutación de resistencia, en determinadas realizaciones de la invención puede ser conveniente incluir toda la secuencia INT en la "mitad" 5' derivada del paciente.

El ensayo de la presente invención posee diversas ventajas comparado con la tecnología existente para supervisión de la resistencia a fármacos del VIH-1. Una de dichas ventajas es que todos los sitios de escisión de la proteasa Gag (Gag PR CS), es decir, de la unión N-terminal Gag p17/p24 al sitio C-terminal Pol RNAseH/INT, se pueden incluir en el análisis. Esto se puede lograr mediante el uso de una secuencia de ADN a la que le faltan todos estos elementos, p. ej., una secuencia de la cadena principal a la que le falta la mayor parte de la mitad 5' del provirus. Esto se puede lograr usando una secuencia de cadena principal que incluye secuencias que cubren solamente la mitad 3' del provirus del VIH-1 (INAS). Esto se recombina con secuencias derivadas de plasma que comprenden el resto del provirus del VIH-1, es decir, la mitad 5'. Los ensayos de RVA actuales basados en clones províricos eliminados pueden medir solamente los efectos potenciales de cambios en PR, RT, y en los CS Gag p7/p1 y p1/p6, ya que estas son las únicas secuencias faltantes de los vectores utilizados (Hertogs et al., 1998; Robinson et al., 1999, 2000).

Asimismo, la presente invención requiere por lo menos un evento de recombinación menor para generar un provirus de longitud total que los ensayos convencionales. Los ensayos de RVA convencionales requieren un mínimo de cuatro eventos de recombinación para producir un provirus integrado completo, ya que cada extremo en el producto RT-PCR derivado de la muestra de virus del paciente se puede unir con las regiones correspondientes dentro del ADN del vector, luego cada uno de los términos del provirus se deben unir con el genoma celular con el fin de crear un provirus recombinante integrado. No obstante, en el método FPH de la presente invención, existe solo una región de superposición dentro de la secuencia de la cadena principal y, en consecuencia, en total se requieren únicamente tres eventos de recombinación.

La reducción de la cantidad total de eventos de recombinación de ADN requerida tras la introducción de diferentes segmentos de ADN víricos en células susceptibles tendrá un efecto beneficioso en i) la extensión de tiempo entre el procedimiento de transfección y la detección de replicación del virus en los cultivos celulares y ii) la probabilidad general de recuperar el virus de las consideraciones del experimento que se tornan cada vez más importantes con la adaptación reducida de cepas resistentes a fármacos. Ya que el aporte oportuno de datos de sensibilidad puede ser crucial para decisiones de tratamiento en los pacientes infectados con el VIH-1, estos parámetros son importantes para fenotipia de resistencia a los fármacos.

Si los métodos o ensayos de la presente invención se aplican al VIH, los productos (RT-)PCR de muestra derivados de pacientes infectados se pueden co-transfectar con una cadena principal 3' de producto PCR o clon de cualquier cepa previamente caracterizada de VIH-1 para producir un virus viable, por ejemplo, se pueden utilizar cepas que no sean la cepa de laboratorio HXB2 estándar. De este modo, el FPH se puede adaptar fácilmente para generar variantes en las diferentes cepas de la "cadena principal", que podrían ser útiles para examinar los efectos de la cadena principal en adaptación, resistencia a los fármacos o patogenia. La cepa seleccionada para proveer la secuencia de la cadena principal preferentemente debe estar bien caracterizada con el fin de que las variaciones en el cultivo y la sensibilidad a los antivíricos en el virus recombinante producido usando la secuencia de la cadena principal se pueda asignar a la cepa de la cadena principal o a las secuencias derivadas de la muestra del paciente. Una cepa natural es en general adecuada, ya que no contiene mutaciones de resistencia pre-existentes. La cepa de la cadena principal también necesita ser seleccionada en función de las condiciones de cultivo celular que se utilizarán en la generación del virus recombinante y en el ensayo subsiguiente de resistencia a fármacos u otros usos del virus recombinante producido. El experto en la técnica podrá seleccionar una cepa de la cadena principal que exhiba características de replicación suficientemente fuertes en el cultivo celular de interés. Por lo tanto, en toda la memoria y en las reivindicaciones a continuación, la referencia a una "cepa de laboratorio", "cepa de virus de laboratorio", "cepa natural" o a una "cepa de virus de laboratorio natural" significará cualquier cepa vírica previamente caracterizada.

Tal como se analizó previamente, el virus recombinante producido por el método de la presente invención se puede utilizar en ensayos de sensibilidad a fármacos. Un ensayo de sensibilidad adecuado se describe en Pauwels et. al. (1988) y es un ensayo de viabilidad colorimétrico y de reducción de MTT. Las células infectadas con el virus se disponen en placas con pocillos de cultivo hístico y se incuban con el fármaco antivírico que se ha de probar. Después de la incubación, se añade bromuro de MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio) al cultivo celular. Solamente las células vivas producen el producto de azul formazán después de la incubación con MTT. Este producto se detecta leyendo la absorbancia óptica a 540-590 nm, de modo que la lectura de absorbancia produce una medida de las células que han sido protegidas del virus por el fármaco anti-vírico. La resistencia vírica al fármaco produce una disminución en las células sobrevivientes y una disminución en absorbancia a 540-590 nm.

Además de la aplicación de FPH en ensayos de sensibilidad al fármaco, la caracterización de virus producidos por FPH puede extender nuestra capacidad de determinar nuevos mecanismos moleculares in vivo de resistencia a los fármacos. Además de nuevas mutaciones en las dianas de fármacos propiamente dichas y en los CS p7/p1 y p1/p6, los mecanismos posibles de resistencia a los fármacos podrían incluir mutaciones compensatorias en CS distintos a p7/p1 y p1/p6 o en factores accesorios o elementos de ácido nucleico que interactúan con las dianas de fármacos. Otras mutaciones asociadas a resistencia pueden modular el ritmo o la intensidad de la expresión génica de las dianas de fármacos o de factores que regulan la actividad de las dianas de fármacos, o pueden modificar la actividad de factores accesorios que no necesariamente compensan la interacción alterada con las dianas de fármacos. El uso del sistema FHP actual de la presente invención permitirá la detección y caracterización de mutaciones asociadas a resistencia que yacen fuera de las secuencias RT, PR y CS utilizadas en el RVA estándar y mejorado.

Como con el RVA, los recombinantes generados por FPH se encuentran en una cepa hospedante conocida con propiedades uniformes y el env se mantiene constante, de modo que el tropismo celular es igual para cualquier recombinante. Otra ventaja del FPH es que el vector puede ser un producto PCR o un plásmido, por lo tanto, no hay un requerimiento de plásmidos províricos eliminados complejos. Hemos adaptado el FPH para efectuar mutantes dirigidas al sitio (véanse los Ejemplos a continuación), lo cual es una situación en la que su mayor eficacia deberá ser una ventaja para construir mutantes con menor capacidad replicativa. Otras aplicaciones incluyen la generación de recombinantes en diferentes cepas hospedantes, simplemente proporcionando un producto PCR de la mitad 3' de la cepa requerida.

La producción de virus recombinantes mediante el método de la presente invención tiene aplicaciones distintas a la provisión de un virus para estudios de fenotipia y resistencia a fármacos. La mayor eficacia de la generación del virus por el método FPH es una ventaja para la generación de mutantes por mutagénesis específica del sitio, especialmente para aquellos mutantes que tienen una adaptación muy reducida que impide su propagación. Para los fines de generar mutantes, se puede utilizar un clon molecular de la mitad 5' del provirus como un molde para la mutagénesis dirigida al sitio (Fig. 3). El virus se puede generar a partir del clon mutante por co-transfección con un clon plásmido de la mitad 3' (Fig. 4). Asimismo, un clon de la mitad 3' se puede mutar y co-transfectar con la mitad 5' de una cepa natural clonada para producir un virus. Usando un método FPH "inverso" o el "ensayo Three-Prime HIV" (TPH), si el fragmento 3', incluyendo las secuencias de codificación env, es a partir del aislamiento y el fragmento 5' es a partir del vector, el FPH también podría utilizarse para examinar los mutantes de escape al sistema inmunológico para estudios inmunológicos. Por ejemplo, en el caso del VIH, la mitad 3' del genoma vírico contiene el gen env, que muestra la mayor variabilidad inmunológica entre los aislamientos. El uso de la cepa de la cadena principal para generar las secuencias 5' y la recombinación de esto con una mitad 3' derivada por PCR a partir de la muestra vírica del paciente producirá el virus recombinante con características de desarrollo predecibles y exhibiendo el perfil inmunológico de la población vírica del paciente.

El planteamiento experimental utilizado en el método FPH para elaborar virus recombinantes también se puede utilizar para enfermedades víricas que no sean el VIH, siempre que haya un sistema de replicación in vitro y que el tamaño de la INAS del virus diana permita la ampliación PCR. El ensayo subsiguiente utilizando el virus recombinante podría, como para el VIH, incluir no solamente ensayos de sensibilidad a los fármacos con compuestos dirigidos contra una enzima vírica específica, sino también pruebas inmunológicas, es decir, para determinar la variabilidad en sitios antigénicos codificados en el producto PCR derivado de un aislamiento clínico.

La presente invención se describe e ilustra también en los siguientes Ejemplos no limitativos y por referencia a los dibujos adjuntos en los que:

La Fig. 1 muestra las estructuras del provirus y genoma vírico del VIH-1;

la Fig.2 es un perfil en forma diagramática del ensayo FivePrime tal como se aplica al VIH (Ensayo FPH);

la Fig. 3 es un diagrama de un plásmido que contiene la mitad 5' del provirus HXB2 (p5'HXB2);

la Fig.4 es un diagrama de un plásmido que contiene la mitad 3' del provirus HXB2 (pHIVTOPO1);

la Fig. 5 es un perfil en forma diagramática de la recombinación mediada por PCR de las secuencias derivadas de plasma del VIH-1;

la Fig. 6 es un diagrama de una construcción de un plásmido que contiene el megacebador U3-R (FPHmegaprim1);

la Fig. 7 muestra datos de un experimento que comparó los índices relativos de producción de virus en el FPH y RVA;

las Figs. 8 A-D muestran geles de agarosa teñidos con bromuro de etidio de los productos de reacción PCR de los Ejemplos 1 a 4;

la Fig. 9 muestra un gel de de agarosa teñido con bromuro de etidio de los productos de reacción PCR del Ejemplo 6.

Los siguientes Ejemplos ilustran cómo el ensayo FPH abarca la ampliación de la mitad 5' del genoma del VIH-1 a partir de muestras clínicas en una serie de pasos enzimáticos diseñados para obtener un producto PCR de par de kilobase \approx4,5 (kbp) final. A partir de la Fig.1 se puede ver que este amplicón contendrá i) la región codificadora para PR, ii) la región codificadora para RT, y iii) las regiones correspondientes a todos los CS Gag y Gag-Pol proteasa. La mitad 3' del genoma que abarca el gen env deriva de una cepa de laboratorio estándar de VIH-1 para facilitar la replicación del virus en líneas celulares CD4+ inmortalizadas. La porción 3' del genoma vírico se puede obtener bien por PCR o a partir de un clon de plásmido. La Fig. 2 muestra cómo las dos porciones del INAS del VIH se recombinan por co-transfección en un cultivo celular adecuado para producir un virus infeccioso. Las disoluciones madre del virus tituladas obtenidas tras la co-transfección de ambos fragmentos subgenómicos se pueden utilizar en los ensayos de sensibilidad a los fármacos. En los Ejemplos, se demuestra el uso de PCR para obtener las secuencias 5' requeridas para el ensayo FPH, la producción de virus recombinante de estas secuencias obtenidas del virus en plasma y, finalmente, se demuestra que el virus se produce más rápidamente por FPH que por RVA.

Ejemplos

Para construir virus infecciosos que reflejan \approx50% de la información genética presente en aislamientos clínicos, se emplea PCR de largo intervalo para obtener la mitad 5' del genoma. Esta técnica ha sido facilitada por el uso de combinaciones de diferentes polimerasas termoestables (Lundberg et al., 1991; Bames, 1992; 1994). Las siguientes secciones describen las ampliaciones de ácido nucleico comenzando por las células mononucleares de sangre periférica (PBMC), ampliando el ADN provírico dentro del ADN celular y también de plasma, usando el planteamiento de reacción en cadena de la polimerasa por retrotranscriptasa (RT-PCR) de largo intervalo acoplada para ampliar las secuencias del virus en plasma. La región U3 que contiene el promotor está ausente en el genoma de ARN VIH-1 (véase Fig. 1). Por lo tanto, se incluye una etapa adicional para añadir esta secuencia (véase Fig. 5), a fin de asegurar que el virus resultante sea totalmente infeccioso (Fang et al., 1999).

Ejemplo 1 PCR de largo intervalo de la región 5'LTR-gag-pol a partir de ADN de PBMC

La purificación de ADN de las PBMC de 13 sujetos se llevó a cabo con el kit Qiagen QIAmp DNA Blood y se amplió con 2 rondas de PCR usando el kit de PCR PlatinumTaq High Fidelity de Gibco BRL. Los cebadores de la primera ronda fueron: LTR-1 e INT-1; Los cebadores de la segunda ronda fueron LTR-2 y INT-2 (Tabla 1). Los ciclos térmicos utilizados para el PCR fueron los siguientes: 1ª ronda: 94º durante 30 segundos (s), (1 ciclo); 93º durante 10 s, 65º durante 30 s, 68º durante 4 minutos (m) 30 s, (10 ciclos); 93º durante 10 s, 60º durante 30 s, 68º durante 4 m 30s + 5 s adicionales durante cada ciclo consecutivo, (25 ciclos). Segunda ronda: 94º durante 30 s, (1 ciclo); 93º durante 10 s, 60º durante 30 s, 68º durante 4 m 30 s, (10 ciclos); 93º durante 10 s, 55º durante 10 s, 68º durante 4 m 30 s + 5 s adicionales durante cada ciclo consecutivo, (25 ciclos).

En la Fig. 8A, se presenta un gel de agarosa teñido con bromuro de etidio 0,7% (p/v), que muestra la separación electroforética de los fragmentos de ADN (Gel 1). El producto de ampliación 4,4 kbp VIH-1 LTR-gag-pol deseado se indica mediante la flecha de la derecha, el tamaño de los marcadores de tamaño seleccionados se indica a la izquierda (LTR es una abreviatura de la repetición terminal larga). Cabe destacar que a pesar de la presencia de bandas de tamaño incorrecto en algunas de las muestras, los productos son capaces de producir virus en el FPH siempre que esté presente el fragmento 4,4 kbp, por lo tanto, por lo menos 11/13 (85%) sería funcional.

TABLA 1 Secuencias de cebadores

Nombre del cebador	Secuencia del cebador (5' \rightarrow 3')
LTR-1	CACACACAAGGCTACTTCCCTGATTGGCAG
LTR-2	CCTGATTGGCAGAACTACACACCAG
INT-1	AAGATGTTCAGCCTGATCTCTTACCTGTCC
INT-2	TCCACTGGCTACATGAACTGCTACT
R-1	GCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTCA
U5-1	TGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTA
gag5'R	CTTAATACTGACGCTCTCGCACCCAT
BsaHI(LTR-R)	TCGGGGGCCACTGCTAGAGATTTTCCA
INT-F	ATGGCTAGTGATTTTAACCTGCCACCT
pIBI20-3'CS	TGCCAAGCTTGCATGCCACGCGT
CS2	GAGGACCCGGCCATAAAGCAAGAGTTTTGGC
OUT3'	CATTGCTCTCCAATTACTGTGATATTTCTCATG

Ejemplo 2 RT-PCR de largo intervalo de la región gag-pol de plasma

Se purificó ARN de plasma de 6 sujetos infectados con VIH-1, usando el Ensayo Ultrasensitive Roche Amplicor HIV-1 Monitor, y se retrotranscribió usando Superscript II RT (Gibco BRL). Una reacción de retrotranscripción consistió (en un volumen total de 50 \mul) en 1x Tampón First Strand , DTT 10, cebador INT-1 500 nM, 500 \muM cada dNTP, 20 \mug/ml BSA, 5% (v/v) DMSO, 40 unidades (u) de inhibidor de RNasin ribonucleasa (Promega), 200 u Superscript II RT, 20 \mul extracto de ARN. La reacción RT se incubó a 45º durante 45 m y luego se añadieron 50 \mul de la siguiente mezcla de PCR: 1x tampón PCR High Fidelity, MgSO_{4} 2 mM, cebador R-1 400 nM, 3,5 u mezcla enzimática PlatinumTaq High Fidelity. La muestra se sometió luego al ciclo térmico descrito para la ampliación de la primera ronda de ADN de PBMC en el Ejemplo 1. Se utilizó el kit Platinum Taq High Fidelity para la segunda ronda con 5 \mul de la reacción de la primera ronda y cebadores PCR U5-1 y INT-2. El ciclo térmico fue idéntico al PCR de la segunda ronda de ADN de PBMC.

En la fotografía de la Fig. 8B, se indica el Gel 2, el fragmento de VIH-1 de 3,9 kbp. Cinco de seis (83%) dieron productos de tamaño correcto.

Ejemplo 3 Recombinación mediada por PCR (PMR)

Debido a la ausencia de la región U3 que contiene el promotor de las secuencias 5' del genoma VIH-1 ARN (véanse Figuras 1 y 5), existe el riesgo de que los productos RT-PCR del plasma tengan menos infectividad. Por lo tanto, se busca añadir la región U3 por recombinación mediada por PCR (PMR; Fang et al., 1999). Las regiones U3 y R se ampliaron por PCR a partir de LTR de un plásmido que contenía un provirus HXB2 con deleción de RT, y el producto de ampliación se utilizó como megacebador para PMR (Figura 5). El megacebador se generó usando Pfu polimerasa (Stratagene) con las condiciones estándar recomendadas por el fabricante y cebadores LTR-1 y gag5'R. Después del ciclo térmico, se añadieron 10 u de la endonucleasa de restricción específica del sitio metilado Dpnl a cada reacción y se incubó a 37º durante 4 horas para degradar el ADN molde. Se purificaron muestras de diez reacciones de 100 \mul con el kit de purificación PCR Qiagen Quiaquick y se combinaron.

Las reacciones PMR se llevaron a cabo usando el kit PCR PlatinumTaq High Fidelity y (en reacciones de 50 \mul) 10 \mul de megacebador (\approx 1 \mug), 2 \mul producto RT-PCR (\approx 200 ng) y 200 nM cebador INT2. El ciclo fue idéntico al PCR de la segunda ronda de ADN de PBMC. Los productos de reacción se presentan en el Gel 3 (Fig. 8C).

Las reacciones se desarrollaron para las 5 muestras que habían generado productos RT-PCR en el Ejemplo 2, que muestran el fragmento 4,4 kbp esperado de la adición de la región U3. Los productos en el control y en la muestra 1 son productos PCR del plásmido molde utilizado para la generación del megacebador, sugiriendo que la digestión de Dpnl fue insuficiente para eliminar completamente el molde. Debido a esta contaminación, se clonaron el megacebador U3-R en un plásmido de secuencia de la cadena principal y se utilizó este nuevo plásmido como un molde para generar el cebador por PCR (Fig. 6). Alternativamente, el cebador se puede cortar del plásmido con las enzimas de restricción BamHI y BsaHI, y purificarse con gel antes del uso.

Ejemplo 4 Producción de virus de ARN de plasma por el método FPH

El megacebador se generó por PCR del plásmido molde pFPHmegaprim1 (Fig. 6). El molde se degradó por digestión de DpnI y el cebador estuvo entonces listo para usar directamente en una reacción PMR sin ningún requerimiento de purificación. Se llevó a cabo una reacción PMR con siete productos RT-PCR de plasma, los productos se muestran en el Gel 4 (Fig. 8D). Con el fin de generar un virus a partir de los productos, se construyó un plásmido que contenía la mitad 3' de un provirus HXB2 (pHXBTOPO1; Fig. 4). Esta construcción proporcionó un método conveniente - un método para generar un virus tras la co-transfección con productos RT-PCR por FPH. Las co-transfecciones se llevaron a cabo tal como se describe (Robinson et al., 1999, 2000). Se observó un efecto citopático vírico en las siete muestras y se recogieron en un período de tiempo post-transfección de 9-14 días.

Ejemplo 5 Eficacias comparativas de FPH y RVA

Se examinó la posibilidad de que el virus se produjera más rápidamente por FPH, en comparación a RVA. Se mutó el plásmido p5'HXB2 (Fig. 2) para introducir una mutación 150V en el gen PR, o una mutación M184V en RT. Ambas mutaciones conducen a una reducción en la adaptación vírica (Back et al., 1996; Pazhanisamy et al., 1998; Robinson et al., 1999, 2000). Se generó un producto PCR a partir de los plásmidos mutados que cubrieron la mitad 5' del provirus (cebadores LTR-2 y INT-2 - Tabla 1) o cubrieron la deleción de CS, PR y RT en el vector del RVA pHXB\DeltaCSPRTC (Robinson et al. 1999, 2000; cebadores CS2 y OUT3'). Ambos conjuntos de productos PCR tenían regiones de superposición con sus vectores respectivos. Los productos se co-transfectaron en células MT4 con 5 \mug de los vectores linealizados pHXBTOPO1 o pHXB\DeltaCSPRTC, respectivamente. Cada mutante se examinó por triplicado tanto por FPH como por RVA. Las muestras de los sobrenadantes de cultivo celular se tomaron en los días 6, 8 y 10 post-transfección y las concentraciones de antígeno p24 del VIH en los sobrenadantes muestreados se determinaron por inmunoensayo enzimático, con el fin de proveer una indicación cuantitativa del aspecto del virus (kit Murex HIV Mab, Abbott Diagnostics). Los resultados promediados se presentan en la Figura 7. Con ambos mutantes, los niveles de p24 fueron significativamente superiores en los sobrenadantes del FPH en todos los puntos de tiempo. Con el mutante I50V, las diferencias estuvieron en el intervalo de 5,9 veces superior en el día 6 a 3,9 veces superior en el día 10. En las muestras de M184V, las diferencias de concentración de p24 estuvieron en el intervalo de 3,9 veces superior en el día 6 a 4,8 veces superior en el día 8. Los datos validan la teoría de que el FPH es un método más eficaz para generar virus que el RVA. El resultado de este experimento dependió de la cantidad de superposición entre el producto PCR y el vector. Si la superposición fue mayor en el FPH que en el RVA, debido a los cebadores que se utilizaron para generar los productos PCR, la eficacia de la recombinación en lugar de la cantidad total de eventos de recombinación podría explicar la diferencia observada en el aspecto del virus. No obstante, la superposición total en las muestras del FPH fue de 182 nucleótidos (nt), mientras que en el RVA la superposición en la región 5' fue de 161 nt y la superposición de 3' fue de 176 nt, por lo tanto, las regiones totales de homología fueron mayores en el RVA (superposición total de 337 nt). En consecuencia, la explicación más probable de la rapidez relativa del FPH fue el número reducido de eventos de recombinación requeridos para reconstruir un provirus completo. En los ensayos en los que el virus de molde tiene una o más mutaciones compensatorias situadas más arriba de los CS p7/p1 y p1/p6, la mutación o mutaciones de los CS situadas más arriba estarían incluidas en los recombinantes de FPH pero ausentes en los recombinantes producidos por el RVA. En dichos casos, uno pronosticaría que el FPH sería incluso más rápido que el RVA.

Ejemplo 6 Generación de virus de plasma por FPH

En este experimento, se utilizó el plasma de tres pacientes infectados con VIH-1 que experimentaban insuficiencia virológica en los regímenes de terapia que contiene Pl, como la base para el FPH a fin de generar un virus recombinante. El virus del plasma del Paciente 1 tuvo una mutación 154M en la proteasa, que es una mutación asociada con la resistencia a amprenavir (APV) (véase Tabla 2, a continuación). El virus del Paciente 2 tuvo mutación L10I, M46I, 150V a Lp1'F en el sitio de escisión de proteasa p1/p6, las cuales son todas mutaciones típicas de la resistencia a APV de alto nivel. El aislamiento 3 tuvo una serie de mutaciones coherentes con una combinación de inhibidores de proteasa utilizados en la terapia (indinavir (IDV) seguidos de APV), L10I, L63P, A71V, V82A-y Ap2V en el sitio de escisión de proteasa p7/p1 que son típicos de susceptibilidad a IDV reducida, y L101, V321 y M46L se asocian tanto con vías de resistencia a IDV como a APV.

La región 5' del genoma se amplió a partir de estos plasmas por RT-PCR. Los viriones en hasta 1 ml de plasma se sedimentaron a partir del paciente infectado con VIH-1 por centrifugación a 50.000 xg durante 80 minutos (m) a 4º. El ARN vírico se extrajo del sedimento usando el kit de aislamiento de ARN PUREscript Total (Gentra Systems). En síntesis, se añadieron 500 \mul de Disolución de Lisis Celular que contenía 20 \mug de glucógeno como vehículo (Roche Molecular Biochemicals) y la muestra se calentó hasta 65º durante 5 minutos para asegurar la lisis completa. La proteína y el ADN se precipitaron añadiendo 200 \mul de Disolución de Precipitación de Proteína-ADN y se incubó en hielo durante 5 minutos, y luego se eliminó de la disolución por centrifugación a 20.000 xg por 5 m. El ARN vírico se precipitó del sobrenadante, añadiéndose a 600 \mul de propan-2-ol e invirtiendo suavemente 50 veces. El ARN se sedimentó a 20.000 xg durante 15 minutos, se lavó con 600 \mul 70% (v/v) etanol, se secó a temperatura ambiente, se disolvió en 50 \mul de agua libre de nucleasa y se conservó a -80º.

El ADN complementario se sintetizó con Sensiscript RT (Qiagen). Las mezclas de reacción consistieron (en un volumen de 50 \mul) en: 1x tampón de reacción Sensiscript, 500 \muM cada dNTP, cebador INT-1 500 nM, 25 unidades de inhibidor Rnasin RNasa (Promega), 5% (v/v) DMSO, 2,5 \mul Sensiscript RT y 25 \mul extracto de ARN. La reacción se incubó a 37º durante 1 hora para completar la síntesis de ADNc. Luego se llevaron a cabo las reacciones PCR de la primera ronda y se anidaron con ADN polimerasa Platinum Pfx. Las reacciones PCR de la primera ronda consistieron en (50 \mul volumen): 4 \mul tampón 10x Pfx, 1 \mul 1 0 mM cada dNTP, 0,8 \mul MgSO_{4} 50 mM, 300 nM cada uno de los cebadores R-1 y INT-1,1 \mul polimerasa Platinum Pfx y 30 \mul ADNc. El ciclo térmico fue de la siguiente manera: 94º durante 2 minutos (m); 93º durante 10 segundos (s), 65º durante 30 s, 68º durante 4 m 30 s (10 ciclos); 93º durante 10 s, 60º durante 30 s, 68º durante 4 m 30 s + 5 s adicionales para cada ciclo consecutivo (25 ciclos); 68º durante 7 m. Las reacciones anidadas contenían (en 100 \mul): 9 \mul tampón 10x Platinum Pfx, 2,7 \mul mezcla 10 mM dNTP, 1:8 \mul MgSO_{4}, INT-2 300 nM y U5-1,2 \mul polimerasa Platinum Pfx y 10 \mul de reacción de la primera ronda. El ciclo térmico fue de la siguiente manera: 94º durante 2 minutos (m); 93º durante 10 segundos (s), 60º durante 30 s, 68º durante 4 m 30 s (10 ciclos); 93º durante 10 s, 55º durante 30 s, 68º durante 4 m 30 s + 5 s adicionales para cada ciclo consecutivo (25 ciclos); 68º durante 7 m.

Se añadió LTR a los productos anidados por PMR antes de la transfección. Las reacciones PMR añadieron exitosamente las secuencias LTR a los productos anidados (Fig. 9). Las reacciones RT-PCR de la primera ronda también se utilizaron como moldes para generar productos para RVA por co-transfección con pHXB\DeltaCSPRTC. Los productos PCR por triplicado se co-transfectaron en células MT4 con el plásmido linealizado pHXBTOPO1, en el caso de los productos PMR, y con pHXB\DeltaCSPRTC linealizado para los productos RVA. Se observó el efecto citopático vírico y el virus susceptible de titulación se recogió en los sobrenadantes. No se aisló ningún virus 2 usando FPH y solamente uno de los cultivos de triplicado del virus 3 produjo el virus infeccioso. Todos los cultivos RVA produjeron el virus.

Ejemplo 7 Los recombinantes generados por FPH pueden exhibir menor susceptibilidad a los fármacos que aquellos generados por RVA

Con el fin de determinar si las secuencias extra en los recombinantes del FPH contienen determinantes de susceptibilidad, se probaron los virus recombinantes contra diversos fármacos. La susceptibilidad a los fármacos se determinó por el ensayo de viabilidad celular colorimétrico de reducción de bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT) previamente descrito (Pauwels et al. 1988; Robinson et al., 2000). Los cambios en susceptibilidad se definieron como incremento en veces en CI50 en relación con WT (HXB2). Las secuencias nucleotídicas se determinaron usando secuenciadores capilares ABI 3700 y finalizadores Big Dye. La susceptibilidad a todos los Pl probados y al inhibidor de retrotranscriptasa zidovudina (ZDV) fue inferior en los virus generados por FPH que en aquellos generados por el RVA, según lo determinado en dos experimentos por separado (Tablas 3A y B, a continuación). La mayor diferencia observada fue con ZDV, con el cual el virus 1 exhibió una susceptibilidad 4,8 mayor cuando se generó por RVA que cuando se generó con FPH . El virus 1 también produjo una susceptibilidad 2,2 veces superior (Tabla 3A) o 4 veces superior (Tabla 3B) al IDV y una susceptibilidad 2,9 veces superior (Tabla 3A) o 3,2 veces superior al APV cuando se generó por RVA. El virus 3 también exhibió una diferencia en susceptibilidad entre las dos técnicas, pero menos marcada con el virus 1. Nuevamente, la diferencia más grande fue con el ZDV (2,9 veces), la diferencia más grande con los Pl se observó con APV (1,9 ó 2,0 veces). El virus 2 obtenido vía RVA mostró un gran nivel de resistencia tanto a ZDV como a APV (>84 veces y 16 o >21 veces superior que el tipo natural, respectivamente), coherente con la teoría de que puede tener poca capacidad replicativa, y coherente con nuestra incapacidad de aislarlo usando FPH.

En este experimento, se ha demostrado que los recombinantes generados por FPH pueden exhibir susceptibilidades inferiores a los fármacos que aquellos generados por un método convencional, debido a la inclusión de elementos de secuencias adicionales (en este caso en gag) que no se representan en el RVA estándar. Este hallazgo tiene implicaciones importantes para el uso de ensayos de fenotipia de susceptibilidad, ya que implica que la susceptibilidad en algunos aislamientos puede haber sido previamente desestimada. La aplicación del nuevo ensayo deberá revelar nuevos conocimientos de la biología de susceptibilidad a los fármacos y permitir estimaciones más confiables en cuanto a la eficacia de los fármacos.

TABLA 2 Genotipos y antecedentes terapéuticos

Aislamiento	Genotipo proteasa	Genotipo RT	Terapia PI	Semanas bajo terapia	Terapia RTI anterior
clínico			anterior	PI
1	154M	A62V, V75T,	APV	28	3TC, ZDV,
		M184V			d4T
2	L10I, M46I, I50V,	ND	APV	79	3TC, ZDV,
	L63R, A71T,				d4T
3	L10I, V321, M46L,	M41 m/l,	IDV, APV	52 semanas	ddl, 3TC,
	L63P, A71V, V82A	T69N,		IDV, 8	ZDV, d4T
		M184V		semanas APV
\begin{minipage}[t]{155mm} Obsérvese que el virus del paciente 3 se catalogó como de haber recibido solamente IDV, no obstante, el perfil de genotipia y resistencia (no se muestran los datos) sugiere que APV fue la terapia predominante. \end{minipage}

TABLA 3A Susceptibilidades a fármacos de recombinantes generados a partir de plasma por FPH o RVA

Virus	Método	CE50 del fármaco en nM (resistencia en veces)
	RVA/FPH	APV	IDV	RTV	NFV	SQV
1	FPH	366,0 (5,4)	31,2 (1,1)	205,0 (3,1)	70,0 (2,3)	13,1 (1,0)
	RVA	128,0 (1,9)	14,2 (0,48)	90,4 (1,4)	26,9 (0,90)	6,56 (0,5)
2	FPH	ND	ND	ND	ND	ND
	RVA	1070,0 (16)	18,7 (0,63)	454,0 (7,0)	70,8 (2:4)	9,06 (0,69)
3	FPH	718,0 (11)	1250 (42)	1790,0 (27)	591,0 (20)	16,4 (1,3)
	RVA	396,0 (5,9)	689,0 (23)	1400,0 (22)	390,0 (13)	13,7 (1,0)
HXB2	N/A	67,5 (1,0)	29,7 (1,0)	65,1 (1,0)	29,9 (1,0)	13,1 (1,0)

TABLA 3B

Virus	Método	CE50 del fármaco en nM (resistencia en veces)
	RVA/FPH	APV	IDV	ZDV
3.1	FPH	865,0 (7,7)	60,1 (2,0)	76,1 (2,7)
	RVA	211,0 (1,7)	11,6 (-2,7)	12,3 (-2,5)
3.2	FPH	691,0 (6,1)	57,1 (1,9)	65,3 (2,3)
	RVA	245,0 (2,0)	16,5 (-1,9)	ND
3.3	FPH	619,0 (5,5)	53,2 (1,7)	35,1 (1,2)
4.1	RVA	>2500 (>21)	65,0 (2,1)	>5000 (>163)
4.2	RVA	2010,0 (17)	23,8 (-1,3)	>5000 (>163)
4.3	RVA	>2500 (>21)	39,3 (1,3)	>5000 (>163)
5.1	FPH	1570,0 (14)	2230,0 (72)	48,2 (1,7)
5.2	RVA	802,0 (6,6)	1520,0 (49)	16,5 (-1,9)
WT	FPH	113,0 (1,0)	30,8 (1,0)	28,3 (1,0)
	RVA	121,0 (1,0)	31,2 (1,0)	30,7 (1,0)

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Leyendas en Figuras Figura 3 Clon del plásmido de la mitad 5' del provirus HXB2

El plásmido p5'HXB2 se construyó clonando un producto LTR-1/INT-1 PCR a partir de ADN celular de MT4 infectado con HXB2 natural en el vector pCR2.1 TOPO (Invitrogen). Se usó la ADN polimerasa para lectura de prueba Pfx para la ampliación (Gibco BRL). El plásmido se puede linealizar con Xbal antes de la co-transfección con ADN para producir el virus.

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Figura 4 Clon del plásmido de la mitad 3' del provirus HXB2

El plásmido pHXBTOPO1 se construyó clonando un producto INT-F/PIB13'CS PCR del vector de RVA
pHXB\DeltaPR (Maschera et al., 1995), en el vector pCR2.1TOPO (Invitrogen). Se usó la ADN polimerasa de lectura de prueba Pfu para la ampliación (Stratagene). El plásmido se linealizó con Spel antes de la co-transfección con productos RT-PCR.

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Figura 6 Clon del plásmido del megacebador U3-R

El plásmido de pFPHmegaprim1 se construyó clonando un producto PCR, LTR-1/BsaHl(L TR-R) del vector de RVA pHXB\DeltaPR (Maschera, et al., 1995), en el vector pCR2.1TOPO (Invitrogen). Se usó la ADN polimerasa de lectura de prueba Pfu para la ampliación (Stratagene). El megacebador se puede generar por ampliación PCR de digestión con BamHI y BsaHI.

\vskip1.000000\baselineskip

Figura 9 Productos de recombinación mediada por PRC (PMR) mediante FPH (Ejemplo 6)

M

= \hskip0.4cm Marcador de tamaño de ADN Plus de 1kB (Gibco BRL)

1 N

= \hskip0.4cm producto anidado del aislamiento 1

*

= \hskip0.4cm 634-bp megacebador

-con

= \hskip0.4cm control negativo

Los tamaños se indican en pares de kilobases.

Claims (28)

1. Un método para producir un virus recombinante, que comprende la recombinación de una secuencia nucleotídica derivada de una muestra de virus con una secuencia de la cadena principal de una cepa de virus estándar para producir un virus recombinante, en el que la secuencia de la cadena principal comprende una porción de la secuencia de ácido nucleico infecciosa de una cepa de virus de laboratorio que se extiende desde un primer sitio dentro o adyacente al término 3' o al término 5' de la secuencia de ácido nucleico infecciosa, y la secuencia nucleotídica derivada de la muestra del virus comprende el resto de la secuencia de ácido nucleico infecciosa.

2. Un ensayo para la detección y caracterización, en una muestra de virus de un virus resistente a un fármaco anti-vírico, comprendiendo el ensayo las etapas de;

(i)

producir un virus recombinante que tiene el perfil de resistencia de la muestra del virus por recombinación de una secuencia nucleotídica derivada de la muestra del virus con una secuencia de la cadena principal de una cepa de virus estándar, en la que la secuencia de la cadena principal comprende una porción de una secuencia de ácido nucleico infecciosa de la cepa del virus de laboratorio que se extiende desde un primer sitio dentro o adyacente al término 3' o al término 5' de la secuencia de ácido nucleico infecciosa, y la secuencia nucleotídica derivada de la muestra del virus comprende el resto de la secuencia de ácido nucleico infecciosa;

(ii)

incubar células infectadas con el virus recombinante con un fármaco antivírico; y

(iii)

detectar la viabilidad del virus o de las células infectadas después de la incubación para determinar la sensibilidad del virus recombinante al fármaco.

3. Un ensayo de acuerdo con la reivindicación 2, en el que la secuencia de la cadena principal comprende 20-90% de la secuencia de ácido nucleico infecciosa de la cepa del virus de laboratorio.

4. Un ensayo de acuerdo con la reivindicación 3, en el que la secuencia de la cadena principal comprende 25-75% de la secuencia de ácido nucleico infecciosa de la cepa del virus de laboratorio.

5. Un ensayo de acuerdo con la reivindicación 4, en el que la secuencia de la cadena principal comprende por lo menos un tercio de la secuencia de ácido nucleico infecciosa de la cepa del virus de laboratorio.

6. Un ensayo de acuerdo con la reivindicación 5, en el que la secuencia de la cadena principal comprende aproximadamente la mitad de la secuencia de ácido nucleico infecciosa de la cepa del virus de laboratorio.

7. Un ensayo de acuerdo con la reivindicación 6, en el que la secuencia de la cadena principal comprende la mitad 3' de la secuencia de ácido nucleico infecciosa de la cepa del virus de laboratorio.

8. Un ensayo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7, en el que el virus es el VIH-1 y la secuencia de la cadena principal deriva de un provirus de ADN del VIH-1 natural.

9. Un ensayo de acuerdo con la reivindicación 8, en el que la secuencia de la cadena principal de ADN incluye una secuencia de dentro del gen integrasa y que se extiende hacia el extremo 3' del 3' LTR.

10. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la secuencia de la cadena principal comprende 20-90% de la secuencia de ácido nucleico infecciosa de la cepa del virus de laboratorio.

11. Un método de acuerdo con la reivindicación 10, en el que la secuencia de la cadena principal comprende 25-75% de la secuencia de ácido nucleico infecciosa de la cepa del virus de laboratorio.

12. Un ensayo de acuerdo con la reivindicación 11, en el que la secuencia de la cadena principal comprende por lo menos un tercio de la secuencia de ácido nucleico infecciosa de la cepa del virus de laboratorio.

13. Un ensayo de acuerdo con la reivindicación 12, en el que la secuencia de la cadena principal comprende aproximadamente la mitad de la secuencia de ácido nucleico infecciosa de la cepa del virus de laboratorio.

14. Un ensayo de acuerdo con la reivindicación 13, en el que la secuencia de la cadena principal comprende la mitad 3' de la secuencia de ácido nucleico infecciosa de la cepa del virus de laboratorio.

15. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 o una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14, en el que el virus es el VIH-1 y la secuencia de la cadena principal deriva de un provirus de ADN del VIH-1 natural.

16. Un método de acuerdo con la reivindicación 15, en el que la secuencia de la cadena principal del ADN incluye una secuencia de dentro del gen integrasa y que se extiende hacia el extremo 3' del 3' LTR.

17. Un método de acuerdo con la reivindicación 15 ó 16, en el que la secuencia de la cadena principal del ADN incluye el gen env.

18. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la secuencia derivada de la muestra del virus incluye la secuencia que codifica la diana de fármacos proteasa.

19. Un método de acuerdo con la reivindicación 18, en el que la secuencia derivada de la muestra del virus incluye la secuencia gag.

20. Un método de acuerdo con la reivindicación 18 o la reivindicación 19, en el que la secuencia derivada de la muestra del virus incluye las secuencias que codifican las dianas de fármacos proteasa y retrotranscriptasa y todos los sitios de escisión de proteasa en Gag y Pol.

21. Uso de una secuencia de la cadena principal que comprende secuencias que se extienden desde un primer sitio en o adyacente al término 3' o al término 5' de una secuencia de ácido nucleico infecciosa de la cepa del virus de laboratorio hacia un segundo sitio dentro de la secuencia de ácido nucleico infecciosa de la cepa del virus de laboratorio en un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 10-20 para producir un virus recombinante.

22. Uso de una secuencia de la cadena principal que comprende secuencias que se extienden desde un primer sitio en o adyacente al término 3' o 5' de una secuencia de ácido nucleico infecciosa de una cepa de virus de laboratorio hacia un segundo sitio dentro de la secuencia de ácido nucleico infecciosa de la cepa del virus de laboratorio en un ensayo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2-9 para la detección de virus resistentes a un fármaco anti-vírico.

23. Uso de acuerdo con la reivindicación 21 o la reivindicación 22, en el que la secuencia de la cadena principal comprende el extremo 3' de la secuencia de ácido nucleico infecciosa de la cepa del virus de laboratorio.

24. Uso de acuerdo con la reivindicación 23, en el que la secuencia de la cadena principal comprende por lo menos 25% de la secuencia de ácido nucleico infecciosa.

25. Uso de acuerdo con la reivindicación 23 o la reivindicación 24, en el que la secuencia de la cadena principal comprende por lo menos un tercio de la secuencia de ácido nucleico infecciosa.

26. Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 23 a 25, en el que la secuencia de la cadena principal comprende aproximadamente la mitad de la secuencia de ácido nucleico infecciosa de la cepa del virus de laboratorio.

27. Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 23 a 26, en el que la cepa del virus de laboratorio es el VIH-1 natural y la secuencia comprende la mitad 3' del provirus del VIH.

28. Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 23 a 27, en el que la secuencia de la cadena principal del ADN incluye una secuencia que se extiende desde dentro del gen integrasa hacia el extremo 3' del 3' LTR.