ES2633990T3 - Evaluación del uso de receptor/correceptor viral - Google Patents
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Abstract
Un método para evaluar la neutralización de anticuerpos de VIH-1 que comprende: a) incubar una pluralidad de primeras células que comprenden cada una al menos un vector de expresión de VIH-1 que carece de un ácido nucleico que codifica un polipéptido de la envoltura vírica de VIH-1 y un ácido nucleico que codifica una secuencia de polipéptidos de la envoltura vírica de VIH-1 obtenida de un paciente, comprendiendo la secuencia de polipéptidos de la envoltura del VIH-1 del paciente dominios extracelulares y transmembrana de la proteína de la envoltura vírica, en donde la secuencia del polipéptido de la envoltura del VIH-1 del paciente incluye o no el dominio de cola citoplasmática (CT) intracelular o una porción del mismo, y en donde el vector de expresión del VIH-1 puede comprender secuencias de ácido nucleico que codifican un dominio de cola citoplasmática predefinido constante; de manera que la pluralidad de las primeras células produce partículas víricas que comprenden una población de dominios extracelulares y transmembrana de la proteína de la envoltura vírica de una población de virus VIH-1 del paciente; b) poner en contacto una porción de las partículas víricas producidas en la etapa (a) con un anticuerpo de VIH-1; c) poner en contacto las partículas víricas de las etapas (a) y (b) por separado con una pluralidad de segundas células, en donde las segundas células expresan un receptor de superficie celular al que se unen las partículas víricas y en donde o bien las segundas células o el al menos un vector comprenden un ácido nucleico indicador que produce una señal detectable; d) medir la cantidad de señal detectable producida por la pluralidad de las segundas células con el fin de determinar la infectividad de las partículas víricas; y e) comparar la cantidad de señal medida en la etapa (d) para las porciones de partículas víricas obtenidas de la etapa (a) y de la etapa (b), en donde una cantidad reducida de señal medida para las partículas víricas de la etaba (b) puestas en contacto con el anticuerpo en comparación con las partículas víricas de la etapa (a) mantenidas en ausencia del anticuerpo indica que los virus del paciente comprenden virus que son susceptibles de neutralización por anticuerpos.
Description
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DESCRIPCION
Evaluacion del uso de receptor/correceptor viral Antecedentes de la invencion
La entrada de virus es una nueva diana atractiva para el tratamiento antiviral, y aproximadamente 10 farmacos que estan disenados para bloquear la union del virus o fusion de la membrana estan siendo evaluados actualmente en estudios cllnicos o precllnicos (Richman, 1998; PhRMA, 1999; Stephenson, 1999). Los virus animales con envoltura se unen y entran en la celula hospedadora a traves de la interaccion de protelnas virales en la membrana del virion (protelnas de envoltura) y protelnas de la superficie celular (receptores de virus). La clarividencia y el enlace de receptores es mediado por la protelna de envoltura de superficie.
Sumario de la invencion
Por consiguiente, es un objetivo de la presente divulgacion proporcionar un ensayo fenotlpico sensible y rapido para medir la susceptibilidad de un virus a inhibidores de la entrada del virus. Otro objetivo de la presente divulgacion es proporcionar un sistema de vector retroviral que produzca partlculas de virus que contengan protelnas de envoltura vlrica derivadas de varias fuentes y la identificacion de llneas celulares que expresan receptores vlricos y toleran la replicacion vlrica.
Otro objetivo de la presente divulgacion es proporcionar un vector de expresion para la envoltura vlrica que sea capaz de aceptar segmentos derivados de pacientes que codifican genes de la envoltura.
Otro objetivo de la presente invencion es proporcionar un vector bioseguro que represente la mayorla del genoma vlrico del VIH-1 (HIV-1, en ingles), pero porte un gen indicador de luciferasa en lugar de la region de envoltura.
Otro objetivo de la presente divulgacion es el ensayo fenotlpico que reduce la probabilidad de formar VIH-1 infeccioso recombinante, proporcionando un vector de expresion vlrica que porte una delecion en una region reguladora transcripcional (la copia 3' de U3) del genoma del VIH-1.
Otro objetivo de la presente divulgacion es proporcionar un ensayo capaz de identificar y determinar el tropismo por el receptor/correceptor, que identifica de manera rapida y precisa los pacientes infectados con cepas de un virus tropico.
Estos y otros objetivos pueden lograrse mediante un metodo para determinar si un virus tiene una susceptibilidad alterada a un compuesto, comprendiendo dicho metodo: (a) poner en contacto una celula hospedadora con el compuesto, donde la celula hospedadora comprende un acido nucleico derivado de virus y un gen indicador, la actividad del gen indicador esta afectada por la actividad del acido nucleico derivado de virus de manera que un cambio en la actividad del acido nucleico derivado de virus da como resultado un cambio en la actividad del gen indicador, y el compuesto se dirige directa o indirectamente al acido nucleico derivado de virus o una protelna que codifica, y (b) detectar la actividad del gen indicador, donde una diferencia en la actividad del gen indicador en la celula hospedadora en contacto con el compuesto en relacion con la actividad en ausencia del compuesto, indica que el virus presenta una susceptibilidad alterada al compuesto.
En un aspecto de la divulgacion, una primera celula comprende un acido nucleico derivado de virus que codifica una protelna vlrica y un vector de expresion vlrica que carece del acido nucleico que codifica la protelna vlrica y que comprende un acido nucleico indicador que produce una senal detectable, de manera que la primera celula produce una partlcula vlrica que comprende la protelna vlrica codificada por el acido nucleico derivado de virus. La primera celula puede ponerse en contacto con una segunda celula, por ejemplo, una celula hospedadora, en presencia del compuesto, donde la segunda celula expresa un receptor de superficie celular al que se une la partlcula vlrica. En una realizacion, la presente divulgacion proporciona un metodo para identificar si un compuesto inhibe la entrada de un virus en una celula que comprende: (a) obtener acido nucleico que codifica una protelna de envoltura vlrica de un paciente infectado por el virus; (b) cotransfectar en una primera celula (i) el acido nucleico de la etapa (a), y (ii) un vector de expresion vlrica que carece de un acido nucleico que codifica una protelna de envoltura, y que comprende un acido nucleico indicador que produce una senal detectable, de manera que la primera celula produce partlculas vlricas que comprenden la protelna de envoltura codificada por el acido nucleico obtenido del paciente; (c) poner en contacto las partlculas vlricas producidas en la etapa (b) con una segunda celula en presencia del compuesto, donde la segunda celula expresa un receptor de la superficie celular al que se une el virus; (d) medir la cantidad de senal producida por la segunda celula para determinar la infectabilidad de las partlculas vlricas; y (e) comparar la cantidad de senal medida en la etapa (d) con la cantidad de senal producida en ausencia del compuesto, donde una cantidad reducida de senal medida en presencia del compuesto indica que el compuesto inhibe la entrada del virus en la segunda celula.
En otro aspecto, una primera celula comprende un acido nucleico derivado de virus que codifica una protelna vlrica y un vector de expresion vlrica que carece del acido nucleico que codifica la protelna vlrica, de manera que la primera
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celula produce una partlcuia vlrica que comprende la protelna vlrica codificada por el acido nucleico derivado de virus. La primera celula puede ponerse en contacto con una segunda celula, por ejemplo, una celula hospedadora, en presencia del compuesto, donde la segunda celula expresa un receptor de superficie celular al que se une la partlcula vlrica. Ademas, la segunda celula comprende un acido nucleico indicador que produce una senal detectable. En una realizacion, el acido nucleico indicador se integra en el acido nucleico de la segunda celula.
En una realizacion, la presente divulgacion proporciona un metodo para detectar en un paciente infectado por un virus el desarrollo de una respuesta de anticuerpos capaz de bloquear la infeccion que comprende: (a) poner en contacto una celula hospedadora con una preparacion de anticuerpos del paciente, donde la celula hospedadora comprende un acido nucleico que codifica una protelna vlrica del paciente y un acido nucleico indicador que produce una senal detectable; (b) medir la cantidad de senal detectable producida por la celula hospedadora; y (c) comparar la cantidad de senal medida en la etapa (b) con la cantidad de senal producida en ausencia de la preparacion de anticuerpos, donde una cantidad reducida de senal medida en presencia de la preparacion de anticuerpo indica que el paciente ha desarrollado una respuesta de anticuerpos a la protelna vlrica capaz de bloquear la infeccion.
En otra realizacion, la presente divulgacion proporciona un metodo para detectar en un paciente infectado por un virus el desarrollo de una respuesta de anticuerpos capaz de bloquear la infeccion que comprende: (a) transfectar en una primera celula (i) un acido nucleico que codifica una protelna vlrica del paciente, y (ii) un vector de expresion vlrica que carece de un acido nucleico que codifica la protelna vlrica, y que comprende un acido nucleico indicador que produce una senal detectable, de tal manera que la primera celula produce partlculas vlricas que comprenden la protelna vlrica codificada por el acido nucleico obtenido del paciente; (b) poner en contacto las partlculas vlricas producidas en el paso (a) con una preparacion de anticuerpos del paciente; (c) poner en contacto las partlculas vlricas y la preparacion de anticuerpos del paso (b) con una segunda celula, donde la segunda celula expresa un receptor de la superficie celular al que se une el virus; (d) medir la cantidad de senal detectable producida por la segunda celula para determinar la infectabilidad de las partlculas vlricas; y (e) comparar la cantidad de senal medida en la etapa (d) con la cantidad de senal producida en ausencia de la preparacion de anticuerpos, donde una cantidad reducida de senal medida en presencia de la preparacion de anticuerpos indica que el paciente ha desarrollado una respuesta de anticuerpos a la protelna vlrica capaz de bloquear la infeccion.
En otra realizacion, la presente divulgacion proporciona un metodo para detectar en un paciente infectado por un virus el desarrollo de una respuesta de anticuerpos capaz de bloquear la infeccion que comprende: (a) transfectar en una primera celula (i) un acido nucleico que codifica una protelna vlrica del paciente, y (ii) un vector de expresion vlrica que carece de un acido nucleico que codifica la protelna vlrica, de manera que la primera celula produce partlculas vlricas que comprenden la protelna vlrica codificada por el acido nucleico obtenido del paciente; (b) poner en contacto las partlculas vlricas producidas en la etapa (a) con una preparacion de anticuerpos del paciente; (c) poner en contacto las partlculas vlricas y preparacion de anticuerpos de la etapa (b) con una segunda celula, donde la segunda celula expresa un receptor de la superficie celular al que se une el virus y donde la segunda celula comprende un acido nucleico indicador que produce una senal detectable; (d) medir la cantidad de senal producida por la segunda celula para determinar la infectabilidad de las partlculas vlricas; y (e) comparar la cantidad de senal medida enla etapa (d) con la cantidad de senal producida en ausencia de la preparacion de anticuerpo, donde una cantidad reducida de senal medida en presencia de la preparacion de anticuerpo indica que el paciente ha desarrollado una respuesta de anticuerpos a la protelna vlrica capaz de bloquear la infeccion.
En una realizacion, la protelna vlrica es una protelna de envoltura. En otra realizacion, la protelna vlrica es una protelna de la capside.
En otra realizacion, la presente divulgacion proporciona un metodo para detectar en un paciente infectado por un virus el desarrollo de una respuesta de anticuerpos capaz de bloquear la infeccion que comprende: (a) incubar una primera celula que comprende (i) un acido nucleico que codifica una protelna vlrica del paciente, y (ii) un vector de expresion vlrica que carece de un acido nucleico que codifica la protelna vlrica, y que comprende un acido nucleico indicador que produce una senal detectable, de manera que la primera celula produce partlculas vlricas que comprenden la protelna vlrica codificada por el acido nucleico obtenido del paciente; (b) poner en contacto las partlculas vlricas producidas en la etapa (a) con una preparacion de anticuerpos del paciente; (c) poner en contacto las partlculas vlricas y preparacion de anticuerpos de la etapa (b) con una segunda celula, donde la segunda celula expresa un receptor de la superficie celular al que se une el virus; (d) medir la cantidad de la senal detectable producida por la segunda celula para determinar la infectabilidad de las partlculas vlricas; y (e) comparar la cantidad de senal medida en la etapa (d) con la cantidad de senal producida en ausencia de la preparacion de anticuerpos, donde una cantidad reducida de senal medida en presencia de la preparacion de anticuerpos indica que el paciente ha desarrollado una respuesta de anticuerpos a la protelna vlrica capaz de bloquear la infeccion. En una realizacion, el acido nucleico de (i) es parte del vector de expresion vlrica de (ii). En una realizacion, el acido nucleico de (i) se integra en el genoma de la primera celula. En otra realizacion, el vector vlrico de (ii) se integra en el genoma de la primera celula. En otra realizacion, el acido nucleico de (i) y el vector vlrico de (ii) se integran en el genoma de la primera celula. En una realizacion, la protelna vlrica es una protelna de la capside. En otra realizacion, la protelna vlrica es una protelna de envoltura.
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Breve descripcion de los dibujos
Figura 1A: Estructura de vectores de expresion de envoltura y expresion vlrica
El vector de expresion de la envoltura del VIH (pHIVenv) se modifica para aceptar secuencias de la envoltura que han sido amplificadas a partir de muestras de plasma del paciente. Las designaciones a/b y c/d, hacen referencia a sitios de endonucleasa de restriccion situados en los extremos 5' y 3' de la poliprotelna de envoltura de VIH-1 (gp160). El vector de expresion de VIH (pHIVlucAU3) codifica todas las protelnas del VIH excepto la poliprotelna de envoltura. Una parte del gen de envoltura ha sido eliminada para acomodar un casete genico indicador, en este caso, "luciferasa de luciernaga" que se usa para controlar la capacidad del virus de replicar en presencia o ausencia de farmacos antivirales. La region U3 en el extremo 3' ha sido parcialmente eliminada para evitar la transcripcion desde LTR en el extremo 5' en celulas infectadas. El virus producido en este sistema si limita a una sola ronda de replication.
Figura 1B: Ensayo de entrada basado en celulas
Se llevaron a cabo ensayos de susceptibilidad a farmacos, tropismo por correceptores y neutralization de virus cotransfectando una celula hospedadora con pHIVenv y pHIVlucAU3. La celula hospedadora produce partlculas de VIH que son pseudotipadas con secuencias de envoltura de VIH derivadas de la muestra del paciente o virus de prueba. Las partlculas del virus se recogen (-48 h) tras la transfection y se usan para infectar las celulas diana que expresan receptores de VIH (por ejemplo, CD4) y correceptores (por ejemplo, CXCR4, CCR5). Tras la infection (-72 h) las celulas diana se lisan y se mide la actividad de la luciferasa. El VIH debe completar una ronda de replicacion para infectar con exito la celula hospedadora diana y producir actividad de luciferasa. Si el virus no es capaz de entrar en la celula diana, la actividad de la luciferasa es reducida. Este sistema puede usarse para evaluar la susceptibilidad a inhibidores de entrada, tropismo por receptor y correceptor y neutralizacion del virus.
Figura 2: Vectores de expresion de envoltura del VIH
Las secuencias de envoltura de VIH se amplifican a partir de muestras de paciente y se insertan en vectores de expresion usando los sitios de endonucleasa de restriccion (5' a/b y 3'c/d). La transcripcion de la envoltura se impulsa por el promotor genico temprano inmediato de citomegalovirus humano (CMV). El ARN con envoltura se poliadenila usando una secuencia de senal de poliadenilacion (A+) del virus del simio 40 (SV40). Se disena un intron situado entre el promotor del CMV y las secuencias de envoltura del VIH para aumentar los niveles de ARNm con envoltura en las celulas transfectadas. FL expresa las protefna de envoltura de longitud completa (gp120, gp41); ACT expresa las protelnas de envoltura (gp120, gp21) que carecen del dominio de cola citoplasmatica C-terminal de gp41; +CT expresa protelna de envoltura (gp120, gp41) que contienen un dominio de cola citoplasmatica de gp41 predefinido constante; gp120 expresa protelnas gp120 derivadas del paciente junto con una gyp41 predefinida constante; gp 41 expresa una gyp120 predefinida constante junto con protelnas gp41 derivadas del paciente.
Figura 3A: Ensayo de exploracion de tropismo por el correceptor
En esta figura, el ensayo se lleva a cabo usando dos llneas celulares. Una llnea celular expresa CD4 y CCR5 (seis paneles superiores). La otra llnea celular expresa CD4 y CXCR4 (seis paneles inferiores). El ensayo se lleva a cabo infectando celulas con un alto numero de reservorios de virus recombinante derivado de celulas transfectadas con vectores pHIVlucAU3 y pHIVenv. El ejemplo mostrado representa el analisis de 96 virus dispuestos en una placa de 96 pocillos las infecciones se llevan a cabo en ausencia de farmaco (sin farmaco), o en presencia de un farmaco que inhibe de manera preferente los virus R5-tropicos (inhibidor de CCR) y X4- tropicos (inhibidor de CXCR4). El tropismo por el correceptor se evalua comparando la cantidad de actividad de luciferasa producida en cada tipo celular, tanto en presencia como en ausencia de farmaco (vease la Figura 3B para la interpretation de resultados de ensayo).
Figura 3B: Determination del tropismo por el correceptor
En esta figura, se interpretan los resultados del ensayo comparando la capacidad de cada virus de muestra de infectar (producir actividad de luciferasa) celulas que expresan CD4/CCR5 (celulas R5) o celulas que expresan CD4/CXCR4 (celulas X4). Tambien se evalua la capacidad de un inhibidor de CCR5 o CXCR4 para bloquear especlficamente la infeccion (inhibir la actividad de luciferasa). Los virus X4-tropicos (paneles verdes) infectan celulas X4 pero no celulas R5. La infeccion de celulas X4 se bloquea por el inhibidor de CXCR4. Los virus R5- tropicos (paneles azules) infectan celulas R5 pero no celulas X4. La infeccion de celulas R5 se bloquea por el inhibidor de CCR5. Las mezclas X4/R5 o de tropismo dual (paneles amarillos) infectan celulas x4 y R5. La infeccion de celulas R5 se bloquea por el inhibidor de CCR5 y la infeccion de celulas X4 se bloquea por el inhibidor de CXCR4. Los virus no viables (paneles rojos) no replican ni en celulas X4 ni en celulas R5.
Figura 4A: Medicion de susceptibilidad al inhibidor de entrada para inhibidor de fusion
En esta figura, se demuestra la susceptibilidad al inhibidor de fusion T-20. Las celulas que expresan CD4, CCR5 y CXCR4 se infectaron en ausencia de T-24 y con una amplia gama de concentraciones de T-20 (escala log10 eje x). Se determino el porcentaje de inhibition de replicacion vlrica (eje y) comparando la cantidad de luciferasa producida en celulas infectadas en presencia de T-20 con la cantidad de luciferasa producida en ausencia de T- 20. Se sometieron a ensayo virus de tropismo dual, R5-tropicos y X4-tropicos. Se cuantifico la susceptibilidad al farmaco determinando la concentration de T-20 necesaria para inhibir el 50 % de la replicacion vlrica (CI50, mostrado como llneas discontinuas verticales). Los virus con valores de CI50 mas bajos son mas susceptibles a T-20 que los virus con valores de CI50 mas altos. NL4-3: cepa X4-tropica bien caracterizada JRCSF; cepa R5- tropica bien caracterizada 91US005.11: aislado R5-tropico obtenido del NIH AIDS Research and Reference Reagent Program (ARRRP) 92HT593.1: aislado de tropismo dual (X4R5) obtenido del NIH
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Figura 4B: Medici6n de la susceptibilidad al inhibidor de entrada con mutaciones de resistencia al farmaco En esta figura, se demuestra la susceptibilidad reducida al inhibidor de fusi6n T-20 conferida por las mutaciones de resistencia al farmaco especlficas en la protelna de envoltura gp41. Se infectaron celulas que expresan CD4, CCR5 y CXCR4 en ausencia de T-20 y con una amplia gama de concentraciones de T-20 (escala log10 eje x). El porcentaje de inhibici6n de replicaci6n vlrica (eje y) se determin6 comparando la cantidad de luciferasa producida en celulas infectadas en presencia de T-20 con la cantidad de luciferasa producida en ausencia de T-20. Se sometieron a ensayo virus isogenicos que contenlan una o dos mutaciones especlficas en la protelna de envoltura transmembrana gp41 (destacado en rojo en la leyenda de la figura). La susceptibilidad al farmaco se cuantific6 determinando la concentraci6n de T-20 necesaria para inhibir el 50 % de la replicaci6n vlrica (CI50, mostrado como llneas discontinuas verticales). Los virus con valores de CI50 mas bajos son mas susceptibles a T-20 que los virus con valores de CI50 mas altos.
Sin mutaci6n (secuencia de tipo silvestre): GIV Mutaciones sencillas: GIV, DIM, SIV Mutaciones dobles: DIM, SIM, DTV
Figura 5A: Medici6n de susceptibilidad al inhibidor de entrada para inhibidor de CCR5
En esta figura, se demuestra la susceptibilidad a un inhibidor de CCR5 (compuesto de merck). Se infectaron celulas que expresan CD4 y CCR5 (celulas R5) en ausencia del inhibidor de CCR5 y con una amplia gama de concentraciones de inhibidor de CCR5 (escala log10 eje x). Se determin6 el porcentaje de inhibici6n de replicaci6n vlrica (eje y) comparando la cantidad de luciferasa producida en celulas infectadas en presencia de inhibidor de CCR5 con la cantidad de luciferasa producida en ausencia de inhibidor de CCR5. Se sometieron a ensayo virus de tropismo dual, R5-tr6picos y X4-tr6picos. Se cuantific6 la susceptibilidad al farmaco determinando la concentraci6n de inhibidor de CCR5 necesaria para inhibir el 50 % de la replicaci6n vlrica (CI50, mostrado como llneas discontinuas verticales). Los virus con valores de CI50 mas bajos son mas susceptibles al inhibidor de CCRF que los virus con valores de CI50 mas altos. El virus X4-tr6pico no infect6 las celulas R5. NL4- 3: cepa X4-tr6pica bien caracterizada
JRCSF: cepa R5-tr6pica bien caracterizada 92HT593.1: Aislado de tropismo dual (X4R5) obtenido del NIH ARRRP.
Figura 5B: Medici6n de susceptibilidad al inhibidor de entrada para inhibidor de CXCR4
En esta figura, se demuestra la susceptibilidad a un inhibidor de CXCR4 (AMD3100). Se infectaron celulas que expresan CD4 y CXCR4 (celulas x4) en ausencia del inhibidor de CXCR4 y con una amplia gama de concentraciones de inhibidor de CXCR4 (escala log10 eje x). El porcentaje de inhibici6n de replicaci6n vlrica (eje y) se determin6 comparando la cantidad de luciferasa producida en celulas infectadas en presencia de inhibidor de CXCR4 con la cantidad de luciferasa producida en ausencia de inhibidor de CXCR4. Se sometieron a ensayo virus de tropismo dual, R5-tr6picos y x4-tr6picos. Se cuantific6 la susceptibilidad al farmaco determinando la concentraci6n de CXCR4 necesaria para inhibir el 50 % de la replicaci6n vlrica (CI50, mostrado como llneas discontinuas verticales). Los virus con valores de CI50 mas bajos son mas susceptibles al inhibidor de CCR5 que los virus con valores de CI50 mas altos. El virus R5-tr6pico no infect6 las celulas X4.
NL4-3: cepa X4-tr6pica bien caracterizada JRCSF: cepa R5-tr6pica bien caracterizada
92HT593.1: Aislado de tropismo dual (X4R5) obtenido del NIH ARRRP.
Figura 6: Amplificaci6n de la secuencia de envoltura
Esta figura demuestra que se generan los amplicones correspondientes a la secuencia de envoltura de longitud completa o secuencia de envoltura eliminada de la cola citoplasmatica. El numero de via corresponde al tropismo por el correceptor mostrado al lado de cada numero a la derecha de los geles.
Figura 7: Expresi6n de correceptor y receptor de la celula diana
Se muestran diagramas de dispersi6n que indican los resultados de ensayos de clasificaci6n de celulas activadas por fluorescencia (FACS) utilizando anticuerpos contra CCR5 o CXCR4 (mostrado en el eje Y). Las llneas celulares expresan los correceptores enumerados bajo los graficos y se muestra la fluorescencia de CD4 a lo largo del eje X. El anticuerpo antiCXCR4 se une mas fuertemente con las celulas que expresan el correceptor correspondiente, CXCR-4.
Figura 8: Inhibici6n por antagonistas de correceptor
Se muestra la inhibici6n de X4 y R5 tras la administraci6n de antagonistas de correceptores.
Figura 9: Peptidos inhibidores de fusi6n
Se muestra la secuencia de aminoacidos y mapa del inhibidor de CXCR4 para un peptido que es un inhibidor de fusi6n entre una membrana vlrica y una membrana celular.
Figura 10: Neutralizaci6n de infectabilidad vlrica
Se incubaron virus con diluciones 1/5 en serie de anticuerpo (plasma) y se usaron para infectar celulas diana U- 87/CD4/CCR5/CXCR4. Se sometieron a ensayo muestras de virus en serie (columnas) frente a muestras de anticuerpos en serie (filas) usando un formato de matriz. Los valores de neutralizaci6n representan la diluci6n de plasma (anticuerpo) exigida para inhibir la infectabilidad del virus en un 50 % (CI50). Cuanto mas alto es el numero, mayor es la diluci6n, lo que refleja tltulos mas altos de neutralizaci6n de los anticuerpos. Se representan las fechas de recolecci6n de muestras como dd/mm/aa. La actividad neutralizante de cada muestra de plasma tambien se someti6 a ensayo frente a dos virus de referencia: NL4-3 (cepa de laboratorio X4), JRCSF (aislado primario R5).
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La presente invencion en sus caracterlsticas concretas puede ser mas evidente a partir de la siguiente descripcion detallada considerada en relacion con las figuras y ejemplos adjuntos. La siguiente descripcion analiza los significados y metodos para llevar a cabo la presente invencion que pertenece a un ensayo fenotlpico relacionado con la identificacion y evaluacion de inhibidores de la entrada vlrica, incluyendo por ejemplo, y no como limitacion de la presente invencion, VIH-1 e inhibidores de la entrada vlrica de VIH-1.
Descripcion detallada de la invencion
Esta divulgacion proporciona un metodo para determinar si un virus presenta una susceptibilidad alterada a un compuesto, comprendiendo dicho metodo: (a) poner en contacto una celula hospedadora con el compuesto, donde la celula hospedadora comprende un acido nucleico derivado de virus y un gen indicador, la actividad del gen indicador esta afectada por la actividad del acido nucleico derivado de virus de manera que un cambio en la actividad del acido nucleico derivado de virus da como resultado un cambio en la actividad del gen indicador, y el compuesto se dirige directa o indirectamente al acido nucleico derivado de virus o una protelna que codifica, y (b) detectar la actividad del gen indicador, donde una diferencia en la actividad del gen indicador en la celula hospedadora en contacto con el compuesto en relacion con la actividad en ausencia del compuesto, indica que el virus presenta una susceptibilidad alterada al compuesto.
En una realizacion, la divulgacion proporciona un metodo para identificar si un compuesto inhibe la entrada de un
virus en una celula que comprende: (a) obtener acido nucleico que codifica una protelna de envoltura vlrica de un
paciente infectado por el virus; (b) cotransfectar en una primera celula (i) el acido nucleico de la etapa (a), y (ii) un vector de expresion vlrica que carece de un acido nucleico que codifica una protelna de envoltura, y que comprende un acido nucleico indicador que produce una senal detectable, de manera que la primera celula produce partlculas vlricas que comprenden la protelna de envoltura codificada por el acido nucleico obtenido del paciente; (c) poner en contacto las partlculas vlricas producidas en la etapa (b) con una segunda celula en presencia del compuesto, donde la segunda celula expresa un receptor de la superficie celular al que se une el virus; (d) medir la cantidad de senal producida por la segunda celula para determinar la infectabilidad de las partlculas vlricas; y (e) comparar la cantidad de senal medida en la etapa (d) con la cantidad de senal producida en ausencia del compuesto, donde una cantidad reducida de senal medida en presencia del compuesto indica que el compuesto inhibe la entrada del virus en la segunda celula.
En otra realizacion, la divulgacion proporciona un metodo para identificar si un compuesto inhibe la entrada de un
virus en una celula que comprende: (a) obtener acido nucleico que codifica una protelna de envoltura vlrica de un
paciente infectado por el virus; (b) cotransfectar en una primera celula (i) el acido nucleico de la etapa (a), y (ii) un vector de expresion vlrica que carece de un acido nucleico que codifica la protelna de envoltura, de tal manera que la primera celula produce partlculas vlricas que comprenden la protelna de envoltura codificada por el acido nucleico obtenido del paciente; (c) poner en contacto las partlculas vlricas producidas en la etapa (b) con una segunda celula en presencia del compuesto, donde la segunda celula expresa un receptor de la superficie celular al que el virus y donde la segunda celula comprende un acido nucleico indicador que produce una senal detectable se une; (d) medir la cantidad de senal producida por la segunda celula para determinar la infectabilidad de las partlculas vlricas; y (e) comparar la cantidad de senal medida en el paso (d) con la cantidad de senal producida en ausencia del compuesto, donde una cantidad reducida de senal medida en presencia del compuesto indica que el compuesto inhibe la entrada del virus en la segunda celula.
En otra realizacion, el acido nucleico indicador comprende un gen indicador. En otra realizacion de la presente invencion, el gen indicador es un gen de luciferasa.
En una realizacion, el receptor de la superficie celular es CD4. En una realizacion, el receptor de la superficie celular es un receptor de quimiocinas. En una realizacion, el receptor de la superficie celular es CXCR4 o CCR5.
En una realizacion, el paciente esta infectado con el virus VIH-1, un virus de hepatitis (como el virus VHB o VHC), o cualquier otro virus. En una realizacion, el acido nucleico de la etapa (a) comprende ADN que codifica gp120 y gp4L. En una realizacion, el vector de expresion vlrica comprende acido nucleico de VIH. En una realizacion, el vector de expresion vlrica comprende un gen gag-pol de VIH. En una realizacion, el vector de expresion vlrica comprende ADN que codifica vif, vpr, tat, rev, vpu, y nef.
En una realizacion, la primera celula es una celula de mamlfero. En una realizacion, la celula de mamlfero es una celula humana. En una realizacion, la celula humana es una celula de rinon de embriones humanos. En una realizacion, la celula del rinon de embrion humano es una celula 293.
En una realizacion, la segunda celula es un linfocito T humano. En una realizacion, la segunda celula es una llnea celular de leucemia de linfocito T humano. En una realizacion, la segunda celula es una celula mononuclear de sangre periferica. En una realizacion, la segunda celula es una celula de astroglioma. En una realizacion, la celula de astroglioma es una celula U87. En una realizacion, la segunda celula es una celula de osteosarcoma humana. En una realizacion, la celula de osteosarcoma humana es una celula HT4.
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En una realizacion, el compuesto se une al receptor de la superficie celular. En una realizacion, el compuesto es un ligando del receptor de la superficie celular. En una realizacion, el compuesto comprende un anticuerpo. En una realizacion, el compuesto inhibe la fusion de la membrana. En una realizacion, el compuesto es un peptido, un peptidomimetico, una molecula organica o un compuesto sintetico. En una realizacion, el compuesto se une a la protelna de envoltura vlrica.
La presente divulgacion proporciona un metodo para hacer una composicion que comprende mezclar el compuesto seleccionado mediante el metodo de detection (metodo para identificar un compuesto) descrito en el presente documento con un vehlculo. En una realizacion, el vehlculo es solution salina, polietilenglicol, una solution amortiguadora, un almidon o un solvente organico.
La presente divulgacion proporciona un metodo para identificar un receptor de la superficie celular que es enlazado por un virus con la infection de una celula por el virus que comprende: (a) obtener partlculas vlricas que comprenden (i) un acido nucleico viral y (ii) un acido nucleico indicador que produce una senal detectable; (b) poner en contacto una celula que expresa un receptor de la superficie celular con las partlculas vlricas del paso (a); y (c) medir la cantidad de senal detectable producida dentro de la celula, donde la production de la senal indica que el receptor de la superficie celular expresado por la celula es enlazado por el virus, identificando as! el receptor de la superficie celular como enlazado al virus con la infeccion de la celula.
La presente divulgacion proporciona tambien un metodo para identificar si un anticuerpo inhibe la entrada de un virus en una celula que comprende: (a) obtener acido nucleico que codifica una protelna de envoltura vlrica de un paciente infectado por el virus; (b) cotransfectar en una primera celula (i) el acido nucleico de la etapa (a), y (ii) un vector de expresion vlrica que carece de un acido nucleico que codifica una protelna de envoltura, y que comprende un acido nucleico indicador que produce una senal detectable, de tal manera que la primera celula produce partlculas vlricas que comprenden la protelna de envoltura codificada por el acido nucleico obtenido del paciente; (c) poner en contacto las partlculas vlricas producidas en la etapa (b) con una segunda celula en presencia del anticuerpo, donde la segunda celula expresa un receptor de la superficie celular al que el virus se une; (d) medir la cantidad de senal producida por la segunda celula para determinar la infectabilidad de las partlculas vlricas; y (e) comparar la cantidad de senal medida en la etapa (d) con la cantidad de senal producida en ausencia del compuesto, donde una cantidad reducida de senal medida en presencia del anticuerpo indica que el anticuerpo inhibe la entrada del virus en la segunda celula.
La presente divulgacion proporciona un metodo para determinar la susceptibilidad de un virus a un compuesto que inhibe la entrada del virus en la celula que comprende: (a) obtener acido nucleico que codifica una protelna de envoltura vlrica de un paciente infectado por el virus; (b) cotransfectar en una primera celula (i) el acido nucleico de la etapa (a), y (ii) un vector de expresion vlrica que carece de un acido nucleico que codifica una protelna de envoltura, y que comprende un acido nucleico indicador que produce una senal detectable, de manera que la primera celula produce partlculas vlricas que comprenden la protelna de envoltura codificada por el acido nucleico obtenido del paciente; (c) poner en contacto las partlculas vlricas producidas en la etapa (b) con una segunda celula en presencia del compuesto, donde la segunda celula expresa un receptor de la superficie celular al que se une el virus; (d) medir la cantidad de senal producida por la segunda celula para determinar la infectabilidad de las partlculas vlricas; y (e) comparar la cantidad de senal medida en la etapa (d) con la cantidad de senal producida en ausencia del compuesto, donde una cantidad reducida de senal medida en presencia del compuesto indica que el virus es susceptible al compuesto.
La presente divulgacion proporciona un metodo para determinar si un virus presenta una resistencia aumentada a un compuesto que inhibe la entrada del virus en una celula en comparacion con un virus de referencia, comprendiendo dicho metodo: (a) determinar la susceptibilidad de un virus a un compuesto, por ejemplo, segun el metodo descrito anteriormente, en un primer momento; (b) determinar la susceptibilidad del virus al compuesto en un segundo momento posterior, y (c) comparar las susceptibilidades determinadas en las etapas (a) y (b), donde una disminucion en la susceptibilidad del segundo momento posterior indica una resistencia aumentada del virus al compuesto.
La presente divulgacion proporciona un metodo para identificar una mutation en un virus que confiere resistencia a un compuesto que inhibe la entrada del virus en una celula que comprende: (a) determinar la secuencia de acido nucleico o la secuencia de aminoacido del virus antes de cualquier tratamiento del virus con el compuesto; (b) obtener un virus resistente al compuesto; (c) determinar la secuencia de acido nucleico o la secuencia de aminoacido del virus resistente de la etapa (b); y (d) comparar la secuencia de acido nucleico o las secuencias de aminoacido de los pasos (a) y (c), respectivamente, para identificar la mutacion en el virus que confiere resistencia al compuesto.
En una realizacion, el virus obtenido en la etapa (b) es el virus de la etapa (a) cultivado en presencia del compuesto hasta que se desarrolla resistencia.
En una realizacion, el virus obtenido en la etapa (b) ese alsla a partir de un paciente que ha sido sometido a tratamiento con el compuesto.
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En una realizacion preferida, la presente divulgacion proporciona un medio y un metodo para medir de manera precisa y reproducible la susceptibilidad de VIH-1 a inhibidores de la entrada de virus.
En otra realizacion preferida, la presente divulgacion tambien proporciona un medio y un metodo para medir de manera precisa y reproducible el tropismo por el correceptor de VlH-1.
En una realizacion preferida, la divulgacion proporciona un medio y un metodo para medir de manera precisa y reproducible la neutralization mediada por anticuerpos de VIH-1.
En una realizacion preferida, la presente divulgacion proporciona ademas un medio y un metodo para descubrir, optimizar y caracterizar farmacos nuevos o novedosos que se dirigen a diversas etapas definidas o aun por definir en el proceso de entrada y union del virus.
En una realizacion preferida, la presente divulgacion proporciona ademas un medio y un metodo para descubrir, optimizar y caracterizar vacunas del VIH-1 (bien preventivas o terapeuticas) que se dirigen a diversas etapas definidas y aun por definir en el proceso de entrada y union del virus.
En una realizacion preferida, la presente divulgacion proporciona un medio y un metodo para identificar mutaciones/sustituciones de aminoacidos en las protelnas de envoltura del VIH-1 (gp41TM y gp120SU) que alteran la susceptibilidad a inhibidores de entrada del virus.
En una realizacion preferida, la presente divulgacion proporciona un medio y un metodo para cuantificar el efecto que tienen las mutaciones especlficas en la envoltura del VIH-1 sobre la susceptibilidad al inhibidor de la entrada de virus.
En una realizacion preferida, la presente divulgacion proporciona ademas un medio y un metodo para determinar las mutaciones/sustituciones de aminoacidos de envoltura del VIH-1 que se observan de manera frecuente, bien solas o en combination, en virus que presentan una susceptibilidad alterada a los inhibidores de entrada de virus.
En una realizacion preferida, la presente divulgacion proporciona un medio y un metodo para identificar mutaciones/sustituciones de aminoacidos en las protelnas de envoltura del VIH-1 (gp41TM y gp120Su) que alteran el tropismo por el correceptor o receptor.
En una realizacion preferida, la presente divulgacion proporciona un medio y un metodo para cuantificar el efecto que tienen las mutaciones especlficas en la envoltura del VIH-1 sobre el tropismo por el receptor o correceptor.
En una realizacion preferida, la presente divulgacion proporciona ademas un medio y un metodo para identificar las mutaciones/sustituciones de aminoacidos de envoltura del VIH-1 que se observan de manera frecuente, bien solas o en combinacion, en virus que presentan tropismo por el correceptor CXCR4 o CCR5.
En una realizacion preferida, la presente divulgacion proporciona un medio y un metodo para identificar mutaciones/sustituciones de aminoacidos en las protelnas de envoltura del VIH-1 (gp41TM y gp120Su) que alteran la neutralizacion medida por anticuerpos.
En una realizacion preferida, la presente divulgacion proporciona un medio y un metodo para cuantificar el efecto que tienen mutaciones especlficas en la envoltura de VIH-1 sobre la neutralizacion mediada por anticuerpos.
En una realizacion preferida, la presente divulgacion proporciona ademas un medio y un metodo para identificar las mutaciones/sustituciones de aminoacidos de la envoltura de VIH-1 que se observan frecuentemente, bien solas o en combinacion, en virus que presentan neutralizacion de virus mediada por anticuerpos.
En una realizacion preferida, la presente divulgacion proporciona ademas un medio y un metodo para identificar los anticuerpos que se observan frecuentemente en virus de muestras de pacientes que son capaces de neutralizar el VIH-1.
En una realizacion preferida, la presente divulgacion proporciona ademas un medio y un metodo para la
identification de virus que necesitan la union a CD4 para la infection.
En una realizacion preferida, la presente divulgacion proporciona ademas un medio y un metodo para la
identificacion de virus que no exigen la union a CD4 para la infeccion.
En una realizacion preferida, la presente divulgacion proporciona tambien un medio y un metodo para la
identificacion de la incidencia de muestras de pacientes que presentan infeccion independiente de CD4.
En una realizacion preferida, la presente divulgacion proporciona ademas un medio y un metodo para la
identificacion de virus que necesitan la union a CD8 para la infeccion.
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En una realizacion preferida, la presente divulgacion proporciona tambien un medio y un metodo para la identification de la incidencia de virus de pacientes que presentan infection dependiente de CD8.
En una realizacion preferida, la presente divulgacion proporciona ademas un medio y un metodo para la identificacion de virus que requieren el enlace al receptor de quimiocina CXCR4, el enlace al receptor de quimiocina CCR5, o el enlace a CXCR4 o CCR5 (tropismo dual) para la infeccion.
En una realizacion preferida, la presente divulgacion proporciona ademas un medio y un metodo para identificar la incidencia de virus que exigen la union al receptor de quimiocina CXCR4, la union al receptor de quimiocina CCR5, o la union a CXCR4 o CCR5 (tropismo dual) para la infeccion.
En una realizacion preferida, la presente divulgacion proporciona ademas un medio y un metodo para identificar las mutaciones/sustituciones de aminoacidos de envoltura del VIH-1 que se observan de manera frecuente, bien solas o en combination, en virus que presentan (a) susceptibilidad alterada a los inhibidores de la entrada de virus, (b) tropismo por el correceptor CXCR4 o CCR5, y (c) neutralization de virus mediada por anticuerpos.
En una realizacion preferida, la presente divulgacion proporciona un medio y un metodo para usar la susceptibilidad a inhibidores de entrada de virus para controlar el tratamiento del VIH-1.
En una realizacion preferida, la presente divulgacion proporciona ademas un medio y un metodo para usar la susceptibilidad a inhibidores de entrada de virus para controlar el tratamiento de pacientes en los que fracase el tratamiento con farmacos antirretrovirales.
En una realizacion preferida, la presente divulgacion proporciona ademas un medio y metodos para usar la susceptibilidad a inhibidores de entrada de virus para controlar el tratamiento de pacientes infectados recientemente con VIH-1.
En una realizacion preferida, la presente divulgacion proporciona un medio y un metodo para usar el tropismo por los correceptores de VIH-1 para controlar el tratamiento del VIH-1 o para controlar el tratamiento de pacientes en los que fracasa el tratamiento con farmacos antirretrovirales.
En una realizacion preferida, la presente divulgacion proporciona ademas un medio y un metodo para usar el tropismo por los correceptores de VIH-1 para controlar el tratamiento de pacientes infectados recientemente con VIH-1.
En una realizacion preferida, la presente divulgacion proporciona ademas un medio y un metodo para medir la neutralizacion mediada por anticuerpos del VIH-1 para controlar la respuesta inicial de anticuerpos protectores tras la vacunacion.
En una realizacion preferida, la presente divulgacion proporciona ademas un medio y un metodo para medir la neutralizacion mediada por anticuerpos de VHC-1 para controlar la respuesta inicial de anticuerpos terapeuticos tras la vacunacion.
En una realizacion preferida, la presente divulgacion proporciona ademas un medio y un metodo para medir la neutralizacion mediada por anticuerpos del VIH-1 con el paso del tiempo para controlar la durabilidad de una respuesta de anticuerpos protectores tras la vacunacion.
En una realizacion preferida, la presente divulgacion proporciona ademas un medio y un metodo para medir la neutralizacion mediada por anticuerpos de VIH-1 para desarrollar y optimizar programas de induccion-refuerzo (prime-boost) de vacunacion que maximicen la potencia y durabilidad de la vacunacion.
Por ejemplo, en el caso del VIH-1, la protelna SU (gp120-SU) esta solidamente asociada a la protelna de envoltura transmembrana (gp41-TM) que ancla el complejo a la membrana del virus. Las protelnas de envoltura gp120 y gp41 se derivan mediante escision de gp160, el producto del precursor no escindido del gen de envoltura. El enlace de VIH-1 a su receptor celular (CD4) y correceptor (CCR5 o CXCR4) promueve cambios conformacionales en la protelna TM resultando en la fusion de la membrana celular y vlrica y la entrada del nucleo del virus en el citoplasma (Retroviruses, 1997). Aunque los nuevos inhibidores de entrada de VIH se dirigen a protelnas de envoltura vlrica (gp120/gp41) o protelnas del hospedador (CD4, CCR5, CXCR4), la mayorla de mutaciones asociadas a la resistencia en VIH-1 se espera que esten localizadas en el gen de envoltura vlrica; por ejemplo, una manera probable en la que los virus pueden evolucionar es cambiar la utilizacion de correceptor. Los bloqueadores de entrada constituyen una clase novedosa de farmacos antirretrovirales, y el potencial de amplia actividad frente a las variantes de VIH-1 resistentes a multiples farmacos actuales es alto. Entre la clase de bloqueadores de entrada viral potenciales se encuentran los inhibidores de fusion, antagonistas de receptor/correceptor y vacunas.
No obstante, es probable que los inhibidores de la entrada del virus generen virus resistentes a farmacos (a traves de mutation del gen de envoltura), complicando as! el tratamiento del paciente de forma similar a lo observado con
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el tratamiento de inhibidor de proteasa (PRI) e inhibidor de transcriptasa inversa (RTI) para el VIH. De hecho, la aprobacion por parte de la FDA de cualquier nuevo farmaco que bloquea la entrada vlrica exigira la evaluacion de datos de resistencia. La necesidad de un ensayo de diagnostico que mida la susceptibilidad a bloqueadores de entrada ha sido documentada en el caso del inhibidor de fusion T-20. Se han descrito virus que presentan susceptibilidad reducida a T-20 tras su paso in vitro en presencia del farmaco. En este momento, no existen ensayos fenotlpicos disponibles convenientes que sean capaces de medir la susceptibilidad a farmacos que bloquean la entrada del virus. Por tanto, los medicos se enfrentaran pronto al reto de personalizar la terapia en ausencia de los instrumentos necesarios para abordar la susceptibilidad a farmacos. Por lo tanto, resultarla extremadamente valioso un ensayo fiable que mida de manera precisa la susceptibilidad a farmacos que inhiben la entrada viral de pacientes infectados.
Por ejemplo, las estimaciones recientes de la Organizacion Mundial de la Salud indican que en todo el mundo hay mas de 33 millones de personas infectadas por el VIH-1, el agente causante de la pandemia del SIDA. Casi un millon de personas estan infectadas en los Estados Unidos y 300.000 estan recibiendo actualmente terapia antiviral (CDC, 1999; OMS 1999). Combatir el SIDA se ha convertido en el objetivo comun de un esfuerzo sin precedentes de las agencias gubernamentales, laboratorios academicos, y la industria farmaceutica/de biotecnologla. La FDA ha aprobado catorce farmacos antivlricos para el tratamiento de la infeccion de VIH-1 (Carpenter et al., 2000) y mas de 20 farmacos adicionales se estan evaluando en ensayos cllnicos en la actualidad (PHRMA, 1999). Los farmacos aprobados inhiben la replicacion de VIH-1 interfiriendo con las actividades enzimaticas de proteasa (PR) o transcriptasa inversa (RT). Los inhibidores de PR (PRI) bloquean la formacion adecuada de protelnas virales que son necesarias para la infeccion y replicacion de virus, mientras que los inhibidores de RT (RTI) bloquean al virus para que no copie su material genetico. Debido a la potencia suboptima, los RTI y PRI actuales se usan muy a menudo en combinacion para erradicar la replicacion vlrica (Carpenter et al., 2000).
Por tanto, lo que se desea es proporcionar un ensayo vlrico seguro, rapido y preciso capaz de evaluar: la actividad de inhibidores de union y entrada del virus (incluyendo los inhibidores de correceptores, receptores y de fusion); el tropismo vlrico por el receptor/correceptor para facilitar el diseno y tratamiento de farmacos inhibidores de la entrada del virus; los cambios en la susceptibilidad a farmacos de virus de pacientes a inhibidores de union y entrada; y la actividad de neutralizacion del virus generada en respuesta a la vacunacion usando antlgenos de protelna de envoltura vlrica.
Los metodos de la presente invencion pueden usarse para cualquier enfermedad vlrica que pueda responder a un inhibidor de la entrada del virus y donde existe una preocupacion respecto a la susceptibilidad al farmaco antivlrico y resistencia a un inhibidor de entrada del virus incluyendo, por ejemplo, sin caracter limitativo, otros lentivirus (por ejemplo, VIH-2), otros retrovirus (por ejemplo, HTLV-1 y 2), hepadnavirus (por ejemplo, virus de la hepatitis B humana), flavivirus (por ejemplo, virus de la hepatitis C humana) y herpesvirus (por ejemplo, citomegalovirus humano).
Los bloqueadores de entrada constituyen una clase novedosa de farmacos antirretrovirales, y el potencial de amplia actividad frente a las variantes de VIH-1 resistentes a multiples farmacos actuales es alto. Entre la clase de bloqueadores de entrada del virus potenciales se encuentran los inhibidores de fusion, antagonistas de receptor/correceptor y vacunas.
Inhibidores de fusion
Los compuestos disenados para inhibir de manera competitiva el cambio conformacional de TM, denominados inhibidores de fusion, son posibles inhibidores de replicacion de VIH-1. Aunque se ha demostrado su actividad en sistemas de cultivos celulares y en pacientes infectados por VIH-1 (Wild et al., 1992; Judice et al., 1997; Kilby et al., 1998), no se ha aprobado ningun inhibidor de fusion para el tratamiento de la infeccion por VIH-1 en Estados Unidos. Los farmacos dentro de esta clase, como T-20 y T-1249 (Trimeris Inc., USA), son el objeto de investigaciones cllnicas avanzadas.
Antagonistas de receptores/correceptores
Ademas de los inhibidores de fusion, que actuan despues de que el VIH-1 haya interactuado con sus receptores, se estan realizando esfuerzos para desarrollar farmacos que eviten que el VIH-1 interactue con CD4 o cualquiera de sus dos correceptores principales. La capacidad de dichos reactivos de inhibir la infeccion de VIH-1 se ha demostrado en sistemas de cultivo celular y modelos animales. Se han identificado compuestos de partida que se dirigen a gp120, CD4, el correceptor CCR5 usado por los virus macrofago-tropicos (R5), o el correceptor CXCR4 usado por los virus tropicos de celulas T (X4) (Allaway et al., 1993; Reimann et al., 1995; Baba et al., 1999; Bridger et al., 1999).
Actualmente, no hay antagonistas de correceptores aprobados para el tratamiento de infeccion de VIH-1 en los Estados Unidos. Los farmacos dentro de estas clases, como PRO 542 (Progenics Inc., EE.UU.), 5a8 (Tanox, EE.UU.), TAK-779 (Takeda Inc., Japon), y AMD-3100 (Anormed Inc., Canada), son el objeto de investigaciones cllnicas en etapa temprana o precllnicas. Por lo tanto, un ensayo capaz de identificar y determinar el tropismo por el
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receptor/ correceptor, que identifique de manera rapida y precisa los pacientes que estan infectados con cepas de un virus tropico (por ejemplo, VIH-1), facilitarla el diseno de farmacos inhibidores de la entrada viral y el tratamiento.
Vacunas
Las vacunas han demostrado ser tambien una estrategia eficaz en la lucha contra las infecciones de virus patogenos en seres humanos, y existen diversas vacunas candidatas a evitar la infeccion del VIH-1 en desarrollo cllnico. Las protelnas de envoltura gp120 y gp41 son las candidatas mas obvias en la intensa busqueda de vacuna del VIH-1, y muchas de las 11 vacunas candidatas en evaluation cllnica se basan en la envoltura (PhRMA, 1999). Se piensa generalmente que una vacuna de envoltura eficaz puede provocar la generation de anticuerpos neutralizantes que bloquean la infeccion del virus (Mascola et al., 2000). Por lo tanto, se necesita urgentemente un ensayo de alto rendimiento sensible que mida de manera fiable la eficacia de dichos anticuerpos neutralizantes y no requiera un cultivo prolongado de virus. Dicho ensayo podrla ayudar de manera significativa a la busqueda de una vacuna del SIDA eficaz. Esto es especialmente cierto, teniendo en cuenta que los ensayos cllnicos de etapas avanzadas abarcan grandes poblaciones de pacientes que se cuentan por miles. Puesto que los anticuerpos neutralizantes deberlan evitar la infeccion con exito de celulas diana, un ensayo del receptor de la envoltura serla beneficioso para actuar como ensayo de neutralization del virus.
Desafortunadamente, la mayorla de estas combinaciones de farmacos son eficaces solo un tiempo limitado en gran parte debido a la aparicion de virus resistentes a farmacos. La falta de funciones de revision inherentes a la RT y ARN polimerasa II, unido a la replication de alto nivel propensa a errores permite a los virus como VIH-1 mutar facilmente (Coffin, 1995). La elevada frecuencia de mutation contribuye a la capacidad de VIH-1 de evadir la terapia de farmacos a largo plazo con exito, lo que resulta en el rebote de la carga viral. Se han descrito mutaciones asociadas a la resistencia para todos los 14 farmacos aprobados asf como muchos compuestos de investigation (Schinazi et al., 1999). Por lo tanto, las variantes de VIH-1 resistentes a multiples farmacos presentan un problema creciente en la atencion de pacientes infectados. Para lograr un beneficio clfnico a largo plazo, es deseable seleccionar aquellos farmacos que supriman al maximo la replicacion vfrica y evitar los farmacos a los que un virus del paciente sea resistente (DHHs, 2000). Las soluciones a largo plazo pueden contar con las pruebas de resistencia a farmacos que pueden controlar a los medicos en la selection de los farmacos mas efectivos frente al virus del paciente. La necesidad de realizar ensayos sobre la resistencia se ha afirmado en directrices recientes de los DHH (DHH, 2000), recomendando que se usen de manera rutinaria ensayos de resistencia cuando se traten pacientes infectados de VIH-1. Los ensayos de susceptibilidad tambien pueden ayudar en el desarrollo de nuevos farmacos que se dirijan a virus resistentes. Un comite asesor del FDA reciente (noviembre 1999) recomendo que se usaran ensayos de resistencia en el desarrollo de nuevos farmacos antivirales para VIH-1.
Se han aplicado diversas estrategias a la evaluacion de la susceptibilidad de farmacos antivlricos. Los ensayos genotlpicos analizan mutaciones en la secuencia de nucleotidos subyacente, o genotipo, e intentan correlacionar estas mutaciones con resistencia a farmacos (Rodriguez-Rosado et al., 1999; Schinazi et al., 1999). Sin embargo, la relation entre genotipo y fenotipo es compleja y no se interpreta facilmente, y los resultados de estos ensayos no son cuantitativos. El uso de datos de susceptibilidad al farmaco genotlpicos exige una interpretation bien por expertos (Baxter et al., 1999) o bien por algoritmos informaticos y no son siempre predictivos del resultado del tratamiento (Piketty et al., 1999).
Los ensayos de susceptibilidad al farmaco fenotlpicos miden y cuantifican directamente la capacidad de los virus de replicarse en presencia del farmaco. Cada ensayo fenotlpico exigla un cultivo del virus prolongado y, por tanto, era lento, intenso en terminos de trabajo, y no se automatizaba facilmente para alto rendimiento (Japour et al., 1993). Como resultado, estos ensayos fenotlpicos tempranos se consideraron poco practicos para la atencion de pacientes. El desarrollo de ensayos de virus recombinantes (Shi y Mellors, 1997; Hertogs et al., 1998) simplifico los ensayos fenotlpicos y aumento el rendimiento. Sin embargo, una gran desventaja de estos ensayos es un tiempo total requerido largo de 4-8 semanas. Mas recientemente, se han desarrollado ensayos de virus recombinantes y otros que son capaces de medir la susceptibilidad al farmaco durante una sola ronda de replicacion (Zennou et al., 1998; Petropoulos et al., 2000), resultando en una drastica reduction en el tiempo total necesario a 8-10 dlas. Los pacientes en los que fracasa la terapia antirretrovlrica pueden beneficiarse de los ensayos fenotlpicos. Dichos ensayos son instrumentos atractivos para la atencion de pacientes porque proporcionan una medida rapida y directa de susceptibilidad al farmaco.
El ensayo de la presente invention puede usarse con otras infecciones vlricas que surgen de infecciones debidas a otros virus dentro de estas familias, as! como infecciones vlricas que surgen de virus en otras familias de virus. Ademas, el ensayo de resistencia y susceptibilidad al farmaco de la presente invencion es util para identificar compuestos para tratar enfermedades vlricas para las que actualmente no hay una terapia disponible.
La estructura, el ciclo de vida y los elementos geneticos de los virus que podrlan someterse a ensayo en el ensayo de resistencia y susceptibilidad al farmaco de la presente invencion resultaran conocidos por los expertos en la tecnica. Para la practica de la presente invencion es util, por ejemplo, comprender el ciclo de vida de un retrovirus, as! como los genes de virus necesarios para la infectabilidad y el rescate de retrovirus. Las celulas infectadas por
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retrovirus liberan un virus de la membrana que contiene un genoma de ARN diploide. El virus, cubierto con una glicoprotelna de envoltura (que sirve para determinar el margen de infectabilidad del huesped), se une a un receptor celular en la membrana plasmatica de la celula a infectar. Tras el enlace del receptor, el virus penetra y pierde el recubrimiento a medida que pasa a traves del citoplasma de la celula hospedadora. Bien en su camino al nucleo o en el nucleo, las moleculas de transcriptasa inversa residentes en el nucleo viral (core) impulsan la slntesis del provirus de ADN de doble cadena, una slntesis que es preparada por el enlace de una molecula de ARNt al ARN viral genomico. El provirus de ADN de doble cadena se integra a continuacion en el genoma de la celula hospedadora, donde puede actuar como un patron transcripcional para protelnas vlricas que codifican ARNm y ARN genomico del virion, que se empaquetara en partlculas del nucleo viral. En su salida de la celula infectada, las partlculas del nucleo (core) se mueven a traves del citoplasma, se unen al interior de la membrana plasmatica de la celula recien infectada, y brotan, llevando con ellas tractos de membrana que contienen producto genico de la glicoprotelna de envoltura codificada de manera vlrica. Este ciclo de infeccion - transcripcion inversa, transcripcion, traduccion, ensamblaje del virion, y brote - se repite una y otra vez a medida que se extiende la infeccion.
El ARN vlrico y, como resultado, el ADN provlrico codifican diversos elementos que actuan en cis que son vitales para la finalizacion con exito del ciclo de vida del virus. El ARN del virion porta el promotor del virus en su extremo 3'. Las acrobacias replicativas situan el promotor del virus en el extremo 5' del genoma provlrico a medida que se transcribe el genoma de manera inversa. Justo en la LTR retrovlrica de 3' al 5' yace el sitio de empaquetamiento del virus. El ciclo de vida del retrovirus exige la presencia de factores de transaction codificados de manera vlrica. La ADN polimerasa (pol)-transcriptasa inversa dependiente de ARN vlrico tambien esta contenida en el nucleo del virus y es vital para el ciclo de vida del virus en el que es responsable de la conversion del ARN genomico al ADN provlrico intermedio integrado. La glicoprotelna de envoltura vlrica, env, es necesaria para la union del virus a la celula no infectada y para la propagation del virus. Tambien hay factores activadores en trans de la transcripcion, llamados transactivadores que pueden servir para modular el nivel de transcripcion del provirus parental integrado. Normalmente, los virus aptos para la replication (no defectuosos) son autonomos ya que codifican todos estos factores que actuan en trans. Sus homologos defectuosos no son autonomos.
En el caso de un virus de ADN, como un hepadnavirus, comprender el ciclo de vida y genes de los virus necesarios para la infeccion es util para la practica de la presente invention. El proceso de entrada del HBV no se ha definido de manera adecuada. La replicacion del VHB utiliza un patron intermedio de ARN. En la celula infectada, el primer paso en la replicacion es la conversion del ADN circular relajado asimetrico (ADNcr) en ADN circular cerrado de manera covalente (ADNccc). Este proceso, que ocurre dentro del nucleo de las celulas del hlgado infectadas, implica la finalizacion de la slntesis de la cadena positiva de ADN y el enlace de los extremos de ADN. En el segundo paso, el ADNccc se transcribe mediante la ARN polimerasa del huesped para generar un patron de ARN de 3,5 kB (pregenoma). El pregenoma forma un complejo con protelna en el nucleo del virus. El tercer paso implica la slntesis de la primera cadena de ADN en sentido negativo copiando el ARN pregenomico usando la transcriptasa inversa de protelna P codificada de manera vlrica. La protelna P tambien actua como cebador de ADN de cadena negativa. Finalmente, la slntesis de la segunda cadena de ADN en sentido positivo se produce copiando la primera cadena de ADN, usando la actividad de la ADN polimerasa de la protelna P y un oligomero de ARN vlrico como cebador. El pregenoma tambien transcribe ARNm para las protelnas del nucleo estructural principales.
Diseno y metodos
(1) Construccion de un vector de expresion para una protefna de envoltura vfrica que es capaz de aceptar segmentos derivados del paciente que codifican la protefna de la envoltura
En una realization, se construyo un vector de expresion de la envoltura capaz de expresar protelnas de envoltura de VIH-1 en celulas transfectadas. Se han descrito vectores de expresion similares, incluyendo un plasmido (pAmphoEnv) construido para expresar la protelna de envoltura del virus anfotropico de la leucemia murina (A-MLV, por sus siglas en ingles) descrito en la patente de Estados Unidos n.° 5.837.464 y (Petropoulos et al., 2000). El vector pAmphoEnv usa el promotor genico temprano inmediato de citomegalovirus humano (CMV) y la secuencia de senal de poliadenilacion de SV40 para producir ARNm de la envoltura de A-MLV en celulas transfectadas. El plasmido pAmphoEnv se modifica eliminando el gen de envoltura del A-MLV e introduciendo sitios de escision de enzima de restriction que puedan permitir la insertion de fragmentos de la envoltura vlrica derivados de varios aislados, como VIH-1. En el caso de VIH-1, el marco de lectura abierto de la envoltura abarca aproximadamente 2.600 nucleotidos y codifica la poliprotelna de envoltura, gp160. La poliprotelna gp160 se escinde mediante una proteasa similar a la furina celular para producir dos subunidades, gp41 y gp120. Los vectores de expresion de la envoltura de VIH-1 pueden construirse en etapas de la siguiente manera:
(a) Reemplazamiento de las secuencias de acido nucleico de la envoltura de A-MLV a partir del vector de expresion de envoltura (pAmphoEnv) con un sitio de donation multiple poliligador
Las secuencias de acido nucleico de la envoltura de A-MLV pueden eliminarse del vector pAmphoEn mediante la digestion con enzimas de restriccion. El vector digerido puede recircularse mediante union a un poliligador oligonucleotido duplex que contiene cuatro sitios de restriccion internos unicos (a, b, c, d) para la insercion de secuencias de envoltura. La reaction de union puede usarse para transformar Escherichia Coli y los clones
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moleculares que contienen la secuencia de poliligador correcta pueden identificarse y confirmarse mediante mapeo de restriccion y secuenciacion del ADN, respectivamente. La introduccion de sitios de clonacion multiple unicos en el vector puede facilitar la insercion de secuencias de envoltura de VIH-1. Los sitios de restriccion en el poliligador pueden elegirse basandose en su ocurrencia infrecuente en las secuencias de envoltura de VIH-1 (base de datos LANL HIV-1,
www.lanl.gov). Este vector puede denominarse pCX. La funcionalidad del vector PCX puede demostrarse insertando un gen indicador o acido nucleico indicador, como luciferasa de luciernaga, en el sitio de clonacion multiple de pCX y midiendo una senal de la actividad del acido nucleico indicador o gen indicador en celulas transfectadas. Segun su uso en el presente documento, "acido nucleico indicador" hace referencia a un acido nucleico que codifica una protelna, estructura de ARN o ADN que bien directamente o bien a traves de una reaccion da lugar a una senal perceptible o que se puede medir, por ejemplo, color o luz de una longitud de onda medible, o la generacion de una estructura de ADN o ARN especlfica usada como indicador que podrla amplificarse usando uno de varios ensayos de amplification cuantitativos.
www.lanl.gov). Este vector puede denominarse pCX. La funcionalidad del vector PCX puede demostrarse insertando un gen indicador o acido nucleico indicador, como luciferasa de luciernaga, en el sitio de clonacion multiple de pCX y midiendo una senal de la actividad del acido nucleico indicador o gen indicador en celulas transfectadas. Segun su uso en el presente documento, "acido nucleico indicador" hace referencia a un acido nucleico que codifica una protelna, estructura de ARN o ADN que bien directamente o bien a traves de una reaccion da lugar a una senal perceptible o que se puede medir, por ejemplo, color o luz de una longitud de onda medible, o la generacion de una estructura de ADN o ARN especlfica usada como indicador que podrla amplificarse usando uno de varios ensayos de amplification cuantitativos.
(b) Insercion de secuencias de envoltura vlrica en el vector de expresion de envoltura pCX
Mediante el uso de cebadores mutagenicos para la amplificacion por PCR, se generan fragmentos de la envoltura vlrica que contienen dos sitios de restriccion unicos (a, b y c, d, respectivamente) adyacentes a los codones de initiation y termination de, por ejemplo, el marco de lectura abierto de la envoltura del VIH-1. La introduccion de dos sitios de restriccion unicos en cada extremo del marco de lectura abierto de la envoltura puede mejorar la posibilidad de clonar fragmentos de la envoltura de VIH-1 que alberguen sitios de restriccion internos para cualquiera de las enzimas encontradas en el sitio de clonacion multiple del vector pCX.
En el caso de VIH-1, los dos clones moleculares bien caracterizados del VIH-1 con diferencias conocidas en los genes de envoltura, NL4-3 (cepa de laboratorio, tropico de linfocitos T, inductora de sincitio) y JR-CDF (un aislado primario, macrofago-tropico no inductor de sincitio) pueden usarse como patron para la amplificacion por PCR. Los productos de amplificacion de 2.600 nucleotidos pueden digerirse con dos enzimas de restriccion (escindiendo cada enzima en un extremo del fragmento; por ejemplo, a y c o b y d) e insertarse posteriormente en el vector pCX mediante union y transformation de Escherichia coli. Los clones moleculares que contienen las secuencias de envoltura apropiada pueden identificarse mediante mapeo de restriccion y confirmarse por secuenciacion de ADN. Los plasmidos resultantes, pHIVenv (NL4-3) y pHIVenv (JR-CSF), pueden usarse para expresar protelnas de envoltura de VIH-1 en celulas transfectadas (Figura 1A). La funcionalidad de los vectores de expresion de envoltura, como los vectores pHIVenv, pueden demostrarse midiendo la slntesis de la envoltura vlrica en celulas transfectadas (Western Blot), y por su capacidad de pseudotipar vectores de retrovirus defectuosos de envoltura. Se han demostrado reservorios de virus de alto tltulo usando la llnea celular 293 de rinon embrionaria humana (Petropoulos et al., 2000), sin embargo, la presente invention no se limita a aquellas llneas celulares. Otras llneas celulares adecuadas usadas como una primera celula para la transfection de acido nucleico obtenido del paciente que codifica una protelna de envoltura vlrica incluyen, a modo de ejemplo y no como limitation de la presente invencion, 5.25; HOX; U87; MT2; PM1; CEM; etc. La llnea celular se modificara mediante ingenierla de manera optima para expresar uno o mas correceptores.
(c) Modificar el vector pCX para mejorar la eficiencia de clonacion de secuencias de envoltura vlrica
Para mejorar la eficiencia de clonacion de fragmentos de la envoltura vlrica, el vector de expresion PCX puede modificarse insertando un casete genico que elimina bacterias (por ejemplo, control de gen b de muerte celular (ccdB) o un miembro de la familia de genes asesinos hok) bajo control del promotor lac de Escherichia coli en sitios de clonacion multiple (Gerdes et al., 1990; Bernard y Couturier, 1992; Bernard et al., 1993). Este vector modificado se denomina pCXccdB. La transcription del gen asesino ccdB se reprime en las cepas bacterianas que expresan el represor 1 aci, como JM109. Puede usarse esta o una cepa equivalente para propagar plasmidos que porten el gen asesino ccdB que estan bajo el control del promotor lac. Por el contrario, en este sistema las cepas bacterianas que no sobreexpresan el represor laciq, como DH5a y Top10, no pueden mantener plasmidos que expresan el gen ccdB. Los transformantes pueden morir debido a la actividad de ccdB. Las celulas DH5a y Top10 pueden comprarse de diversos vendedores (Life Technologies o Invitrogen). Usando este metodo de la clonacion selectiva, el vector de expresion parental se propaga en una cepa bacteriana 1aciq. El vector se digiere con dos enzimas de restriccion que eliminan ambas el casete genico de ccdB, y, en el caso de VIH-1, son compatibles con la insercion de secuencias de envoltura del VIH-1 (a, b, c, d). Tras la union del vector y fragmentos de envoltura, se transforma una cepa de bacteria que carece de laciq. Una vez transformados, pueden cultivarse los plasmidos que contienen bacterias en los que los insertos de envoltura vlrica han reemplazado al gen asesino ccdB. Los plasmidos que contienen bacterias que retienen o reconstituyen el gen asesino ccdB no pueden sobrevivir. De este modo, la poblacion de bacterias transformadas se enriquece por los plasmidos que contienen insertos de envoltura vlrica, pero falta en el vector parental que contiene el gen ccdB. La construction del vector pCXccdB no es esencial para el exito de la fase I de este proyecto, pero se espera que mejore de manera significativa la eficiencia de clonacion de secuencias de envoltura de VIH-1 derivada de muestras de pacientes; por tanto, la probabilidad de mantener la heterogeneidad de secuencias virales puede mejorarse. La estructura del vector pCXccdB puede confirmarse por mapeo de restriccion y secuenciacion de ADN.
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(d) Insertar secuencias de envoltura vlrica en el vector de expresion de pCXccdB
La funcionalidad del vector pCXccdB puede evaluarse preparando reacciones de enlace que contengan secuencias de envoltura vlrica y ADN del vector pCXccdB digerido de manera incompleta. Tras la transformacion bacteriana, puede prepararse plasmido de ADN a partir de clones bacterianos individuales y analizarse mediante digestion de restriction para detectar la presencia de fragmentos de la envoltura vlrica y la ausencia de secuencias de ccdB. La viabilidad de este metodo se somete a ensayo mediante amplification de la region de envoltura de un total de 13 clones de VIH-1 disponibles (pCRII-91US005.11, pCRII-91006.10, pCRII-92US657.1, pCRII-92US711.14,
pCRII91US7124, pCRII-92US714.1, pcRII-91HT652.11, pCRII-92BR020.4, pCRII-91HT651.1A, pCRII-92HT593.1, pCRII-92HT594.10, pCRII92HT596.4, pCRII-92HT599.24), que se pueden obtener a traves del AIDS Research Reagent Reference Program (ARRRP), Rockville, Maryland. Cada fragmento puede insertarse en pCXccdB y la estructura de los vectores de expresion pHIVenv resultantes puede confirmarse mediante mapeo de restriccion y/o secuenciacion de ADN. La funcionalidad de cada vector pHIVenv puede demostrarse mediante medicion de la slntesis de protelna de envoltura de VIH-1 en celulas transfectadas (Western Blot), y por su capacidad de pseudotipar vectores de retrovirus de envoltura deficiente.
(2) Construccion de un vector de expresion vlrica bioseguro que comprende acido nucleico indicador en lugar de la codificacion la protelna de envoltura
Se construye un vector vlrico bioseguro para evaluar los inhibidores de la entrada del virus segun medios y metodos similares descritos en la patente de Estados Unidos n.° 5.837.464 y Petropoulos et al., 2000 usados para evaluar los inhibidores de PR y RT. El vector de expresion vlrica puede cotransfectarse en celulas junto con los vectores de expresion de envoltura (descritos anteriormente) para producir reservorios de virus de alto tltulo. Dichos reservorios de virus pueden evaluarse para definir la susceptibilidad a inhibidores de entrada del virus, incluyendo farmacos antivlricos y anticuerpos neutralizantes. En el caso del VIH-1, el vector de expresion vlrica puede generarse a partir de NL4-3, un clon molecular infeccioso bien caracterizado de VIH-1. La repetition terminal larga (LTR) en 5' que controla la expresion genica del virus puede modificarse de manera que la transcription de los genes vlricos en las celulas transfectadas se impulse por el promotor temprano inmediato CMV (Naviaux et al., 1996). La mayorla del gen de envoltura puede eliminarse, pero los elementos de control importantes como el elemento de respuesta rev (RRE, en ingles) y regiones codificantes de protelnas accesorias (rev, tat) se conservan. En lugar de las secuencias de envoltura eliminadas, se inserta un acido nucleico indicador, como un casete genico indicador de luciferasa de luciernaga que esta bajo el control de secuencias potenciadoras de promotor de CMV (Figuras 1B y 3). La infection del virus puede controlarse por medicion de la actividad de luciferasa en celulas infectadas. Es posible, aunque poco probable, que la recombination interplasmldica entre el vector del retrovirus y, por ejemplo, las secuencias de pHIVenv en celulas transfectadas pueda llevar a la generation de VIH-1 infeccioso. En un esfuerzo por generar un vector bioseguro, puede hacerse una introduction de diversas alteraciones geneticas en el genoma del VIH. Por ejemplo, puede lograrse la elimination de la mayor parte del gen de envoltura, mientras se conserva la secuencia de control importante, RRE, y tambien la eliminacion de las secuencias potenciadoras de la transcripcion en la region U3 de la LTR 3' del vector (Figura 2). Durante la replication del genoma del retrovirus, la region U3 situada en el extremo 3' del genoma del virus actua como el patron para la region U3 de la LTR 5' del provirus en celulas infectadas. Dichos provirus carecen del elemento promotor fuerte en la region U3 de la LTR 5' y por tanto no son capaces de producir ARN retrovlrico en celulas infectadas. Esta estrategia de autoinactivacion (SIN, en ingles) se ha usado con exito para diversos sistemas de vector retrovlrico, incluyendo VIH-1 (Hwang et al., 1997; Miyoshi et al, 1998). En el ensayo de la presente divulgation, la expresion del gen vlricol no es necesaria en las celulas infectadas porque la infeccion de virus se mide mediante una senal detectable producida por el acido nucleico indicador, como la production de actividad de luciferasa, impulsada por su propio promotor independiente (Figura 1B). La deletion de secuencias de envoltura y la region potenciadora de transcripcion (U3) puede lograrse mediante procedimientos de donation molecular estandares, y cada delecion puede verificarse mediante analisis de la secuencia de ADN.
La funcionalidad de este vector, por ejemplo en el caso de VIH-1, designado pHIVlucAU3, puede demostrarse mediante cotransfeccion de celulas 293 con el vector pHIVenv descrito anteriormente. La transcomplementacion eficiente de protelnas vlricas producidas por ambos vectores en las celulas transfectadas puede llevar a la produccion de partlculas vlricas. Las partlculas de virus pueden recogerse a partir de sobrenadantes de cultivo y analizarse mediante transferencia de Western. Los tltulos de virus pueden cuantificarse mediante aplicaciones rutinarias de ELISA para p24, PCR cuantitativa o ensayos TaqMan.
No es necesario producir un vector de expresion vlrica autoinactivante para llevar a cabo la presente invention, pero es deseable para mejorar la reproducibilidad y bioseguridad del ensayo.
(3) Identificacion de llneas celulares adecuadas que expresan receptores y correceptores y apoyan la infeccion viral
Pueden evaluarse diferentes llneas celulares de mamlferos que se han descrito previamente y son conocidas por apoyar la infeccion de un virus particular. Segun se ha analizado en el presente documento para una realization relacionada con VIH-1, el ensayo se puede llevar a cabo (a) cotransfectando una primera celula con pHIVenv y pHIVlucAU3, (b) recogiendo el virus tras la transfection, (c) usando este virus para infectar una segunda celula,
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tanto en presencia como en ausencia de inhibidores de entrada de virus, y (d) midiendo la produccion de luciferasa en celulas infectadas.
La Tabla 1 enumera ejemplos representativos de dichas llneas celulares evaluadas para detectar la infeccion de VIH-1, incluyendo la llnea celular y su receptor/correceptor asociado. Pueden obtenerse diversas de estas llneas celulares de depositos celulares publicos.
Las partlculas vlricas recogidas de cultivos de celulas 293 transfectadas pueden usarse para infectar varias llneas celulares diferentes. En el caso de VIH-1, el vector pHIVlucAU3 contiene deleciones en el gen de envoltura y el potenciador-promotor U3 descrito anteriormente, por tanto, la infeccion de una llnea celular permisiva con partlculas de virus producidas por este vector se limita a una sola ronda de replicacion. Esto incluye (a) la union y entrada del virus, mediada por las protelnas de envoltura vlrica, producidas en trans mediante el vector pHIVenv tal como se ha descrito, (b) la conversion de ARN vlrico de una sola cadena en ADN de doble cadena por RT, y (c) la integracion de ADN vlrico en el genoma de la celula hospedadora (formacion de provirus). La transcripcion activa de genes vlricos por ARN polimerasa II que se produce normalmente en celulas infectadas tras la integracion provlrica puede limitarse mediante delecion de secuencias potenciadoras-promotoras vlricas esenciales en el vector pHIVlucAU3. Sin embargo, esta restriction no puede interferir con la expresion del gen de luciferasa en celulas infectadas ya que este gen se impulsa independientemente de la expresion genica del virus usando un promotor de CMV interno (Figura 1B). La cantidad de actividad de luciferasa producida tras la infeccion puede usarse como una medida de la infectabilidad del virus.
La union de VIH-1 y entrada en las celulas hospedadoras requiere la interaction con un receptor primario (CD4) y uno de varios correceptores, en la mayorla de casos CCR5 o CXCR4. Se pueden examinar llneas celulares que son conocidas por expresar diversas combinaciones de CD4, CCR5 y CXCR4. Especlficamente, se evaluan las llneas celulares enumeradas en la Tabla 1 que expresan (a) CD4 mas CCRS, (b) Cd4 mas CXCR4, y (c) CD4 mas CCR5 mas CXCR4. Las llneas celulares que expresan solo el receptor CD4, o bien solo el correceptor CCR5 o CXCR4, pueden servir de controles utiles y pueden usarse para evaluar aislados de VIH-1 que no requieren la union de CD4 o que usan correceptores distintos de CCR5 y CXCR4. El criterio principal para decidir la idoneidad de una llnea celular puede ser la infectabilidad medida por la produccion de luciferasa (104-106 unidades relativas de luz). Ademas, se pueden evaluar las llneas celulares basandose en tasas de crecimiento, viabilidad, estabilidad y otros parametros segun se considere necesario. Se pueden seleccionar llneas celulares que sean faciles de mantener y por ejemplo, que produzcan grandes cantidades de actividad de luciferasa tras la infeccion, que puedan ser infectadas por diferentes tropismos por el receptor de la envoltura, por ejemplo, CD4/CXCR4 y CD4/CCR5. Existen disponibles en depositos publicos, como el ARRRP, llneas celulares adicionales bien caracterizadas que soportan, por ejemplo, la replicacion de VIH y expresan el receptor y correceptores de VIH-1 (por ejemplo, CEM-NKr- CCR5; categorla de liberation a).
Ademas, las llneas celulares pueden mejorarse usando procedimientos convencionales, promoviendo la infeccion mediante la adicion de polibreno a celulas (Porter et al., 1998). Por ejemplo, en el caso del VIH, se pueden identificar otras llneas celulares posibles para su uso en la presente invention mediante infeccion con cepas de laboratorio de VIH-1 y comparando los tltulos de infectabilidad del virus recombinante con aquellos obtenidos con VIH-1 infeccioso, o mediante la transfection de celulas directamente con los plasmidos de expresion vlrica descritos en el presente documento, y consiguiendo la produccion de virus. La acumulacion de transcritos del virus puede comprobarse usando un ensayo cuantitativo de RT-PCR. Pueden identificarse llneas celulares adecuadas para otros virus de manera similar.
La presente invencion puede optimizar las condiciones de ensayo y permitir la realization de ensayos de alto rendimiento de las muestras de pacientes usando la automatization. Los metodos de preparation de muestras pueden optimizarse para capturar de manera eficaz el ARN de envoltura y genomico del virus. Las condiciones de RT-PCR pueden optimizarse para permitir la amplification de secuencias de envoltura vlrica derivadas de pacientes, como secuencias de envoltura de VIH-1 (-2.600 pares de bases) a baja carga vlrica (-500 copias por ml).
(4) Demostracion de la utilidad del ensayo
La utilidad del ensayo de la presente divulgation queda demostrada por los resultados logrados a partir de: (1) ensayo de la inhibicion dependiente de la dosis de la entrada del virus en presencia de inhibidores bien caracterizados; y el (2) ensayo de la inhibition dependiente de la dosis de infeccion en presencia de anticuerpos neutralizantes de VIH-1 bien caracterizados.
Se evaluaron las siguientes aplicaciones del ensayo de entrada de virus de la presente divulgacion:
i) detection de la inhibicion de replicacion de VIH-1 por inhibidores de union y entrada del virus (incluyendo inhibidores de receptor, correceptor y de fusion).
ii) medicion de cambios en la susceptibilidad a inhibidores de union y entrada de VIH-1; y
iii) deteccion de actividad de neutralization de anticuerpos generados en respuesta a las vacunas dirigidas contra protelnas de envoltura de VIH-1.
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En una realizacion preferido, el ensayo puede llevarse a cabo (a) cotransfectando una primera celula con vectores pHIVenv y pHIVlucAU3, (b) recogiendo virus tras aproximadamente 48 h despues de la transfeccion, (c) usando este virus para infectar una segunda celula, tanto en presencia como ausencia de inhibidores de entrada de virus y (d) midiendo la produccion de luciferasa aproximadamente 48-72 h tras la infeccion. La inhibicion dependiente de la dosis de la replicacion de VIH-1 puede evaluarse frente a una amplia gama de concentraciones de inhibidor de entrada de virus usando un formato de 96 pocillos. La gama de concentracion apropiada puede determinarse emplricamente para cada inhibidor. Los datos pueden representarse como el porcentaje de inhibicion de actividad de luciferasa frente a concentracion del farmaco (log10). Los analisis de datos pueden llevarse a cabo usando software informatico. Se usan curvas de inhibicion para determinar las concentraciones inhibitorias al 50 % (CI50) para farmacos o anticuerpos especlficos (Figura 6).
Se evaluan protelnas de envoltura derivadas de varios aislados de VIH-1 bien caracterizados usando vectores pHIVenv construidos tal como se ha descrito anteriormente. Para definir el tropismo por el correceptor de la envoltura, en el caso de VIH-1, se evalua la infeccion usando celulas que expresan CD4 mas CXCR4 y CD4 mas CCR5 tal como se ha descrito anteriormente. Puede usarse una amplia variedad de compuestos que se sabe que inhiben la entrada de VIH-1 (Tabla 2), incluyendo agentes no especlficos tales como polianiones sulfonados (sulfato de dextrano y heparina) con el ensayo de la presente divulgacion. Tambien son adecuadas para su uso en la presente divulgacion las quimiocinas tales como Rantes y SDF-1, los ligandos naturales para los receptores de quimiocinas CCR5 y CXCR4, respectivamente (vease Alkhatib et al., 1996; Bleul et al., 1996). Ademas, se usaron inhibidores de entrada de virus tales como T-20 y T1249 (Trimeris, Inc.), PRO 52 (Progenics), 5a8 (Tanox) para evaluar la utilidad del ensayo de la presente divulgacion. La toxicidad del farmaco en celulas diana se evalua usando ensayos de citotoxicidad o viabilidad estandares (por ejemplo, exclusion del colorante, MTS, ATP).
Se han descrito mutantes de VIH-1 que presentan susceptibilidad reducida al inhibidor de fusion T20 (Rimsky et al., 1998) y los determinantes geneticos (mutaciones) que permiten que estos virus se repliquen en presencia de farmaco dentro de la protelna de envoltura (gp41-TM). Para demostrar que el ensayo de la presente divulgacion es capaz de medir cambios en la susceptibilidad al farmaco (es decir, resistencia), (a) se generan vectores pHIVenv que portan estos genes de envoltura mutantes, (b) se cotransfectan las primeras celulas usando estos vectores y el vector pHIVlucAU3, (c) se recogen los virus portadores de estas protelnas de envoltura mutantes, y (d) se someten a ensayo los virus para determinar la infectabilidad en presencia de T20. Se evalua la susceptibilidad al farmaco reducida deT20 comparando la CI50 de virus que portan las protelnas de envoltura mutantes y aquellos que carecen de las mutaciones de resistencia al farmaco definidas. Los virus portadores de protelnas de envoltura con mutaciones de resistencia al farmaco pueden presentar valores de CI50 mas altos que los virus portadores de protelnas de envoltura que carecen de mutaciones de resistencia al farmaco, es decir, la inhibicion puede requerir una concentracion de farmaco mas alta (equivalente a los datos presentados en la Figura 8). Pueden introducirse mutaciones de resistencia a farmacos en los vectores de expresion de envoltura (pHIVenv) usando tecnicas de mutagenesis dirigida estandares segun los protocolos estandares (Petropoulos et al., 2000; Ziermann et al., 2000).
Es ampliamente aceptado que las vacunas eficaces que protegen de la infeccion por VIH-1 deben provocar una respuesta inmunitaria humoral fuerte caracterizada por anticuerpos neutralizadores generalmente de reaccion cruzada. Por lo tanto, el suero de sujetos vacunados se evalua de manera rutinaria para detectar la presencia de anticuerpos neutralizantes de alto tltulo dirigidos contra el inmunogeno. De manera mas reciente, el uso del modelo de macaco de virus quimerico (SHIV) de virus de inmunodeficiencia del simio (SIV)/VIH-1, Mascola y sus colaboradores demostraron que la transferencia pasiva de dichos anticuerpos neutralizantes llevaba a una carga vlrica reducida tras exposition a la mucosa (Mascola et al., 2000). El ensayo de la presente invention puede usarse para determinar de manera fiable y rapida la actividad de neutralization del virus de anticuerpos generada en respuesta a las vacunas dirigidas a antlgenos de envoltura, como antlgenos de la envoltura de VIH-1. Por ejemplo, el ensayo puede (a) generar vectores pHIVenv que expresan varias protelnas de envoltura bien caracterizadas, (b) cotransfectar una primera celula usando estos vectores y el vector pHIVlucAU3, (c) recolectar virus e incubar con diluciones en serie de preparaciones de anticuerpos o suero de vacuna (d) someter a ensayo estos virus para detectar la infectabilidad en una segunda celula. Los analisis de datos y determinaciones de CI50 pueden llevarse a cabo tal como se ha descrito previamente y en la bibliografla. En el caso de VIH-1, pueden seleccionarse virus para representar diferentes contextos geneticos de VIH-1 (por ejemplo, variante A, B, C, D, E, F), tropismos por el correceptor y celulas diferentes (macrofago/CCR5, celula T/CXCR4), y diferentes propiedades de la envoltura (aislado primario o crecimiento adaptado de laboratorio, inductor o no de sincitio) (Tabla 2). Puede resultar beneficioso preparar reservorios de un tltulo definido de cada virus para optimizar la sensibilidad y reproducibilidad del ensayo usando un aporte de virus de aproximadamente 20-100 TCID50/pocillo y realizando ajustes segun sea necesario. Las preparaciones de anticuerpos pueden seleccionarse basandose en propiedades de neutralizacion previamente documentadas, bien funcionales, como su capacidad de neutralizar aislados primarios, o flsicas, como su capacidad de unirse a epltopos de gp120 o gp41 especlficos (Tabla 2). El rendimiento del ensayo puede evaluarse con la actividad de estos reactivos de anticuerpo bien caracterizados en ensayos de neutralizacion de virus convencionales tal como se describe en la bibliografla cientlfica. Puede usarse suero de un grupo ampliamente representativo de sujetos infectados por el VIH-1 para establecer el intervalo apropiado de diluciones de suero que puede maximizar la sensibilidad del ensayo, minimizando al mismo tiempo la citotoxicidad. Puede evaluarse la citotoxicidad usando ensayos de viabilidad o citotoxicidad estandares (por ejemplo, exclusion del colorante, MTS, ATP).
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Los siguientes ejemplos se presentan para ilustrar y explicar en mayor medida la presente invencion y no deben considerarse limitativos en ningun sentido.
Ejemplo 1: medicion de la susceptibilidad fenotfpica del farmaco para inhibidores de entrada de VIH-1
El presente ejemplo proporciona un medio y un metodo para medir de manera reproducible y precisa la susceptibilidad a inhibidores de la union y entrada de VIH-1 (anteriormente referido de manera colectiva como entrada). Basandose en este ejemplo, el medio y un metodo para medir la susceptibilidad a inhibidores de entrada de VIH-1 pueden adaptarse a otros virus, incluyendo, sin caracter limitativo, otros lentivirus (por ejemplo, VIH-2), otros retrovirus (por ejemplo, HTLV-1 y 2), hepadnavirus (por ejemplo, virus de la hepatitis B humana), flavivirus (por ejemplo, virus de la hepatits C humana) y herpesvirus (por ejemplo, citomegalovirus humano). Este ejemplo proporciona ademas un medio y un metodo para medir alteraciones (aumentos o disminuciones) en la susceptibilidad a inhibidores de entrada.
Las mediciones de la susceptibilidad al inhibidor de entrada se llevan a cabo usando adaptaciones de los medios y metodos para ensayos de resistencia y susceptibilidad de farmacos fenotlpicos descritos en la patente de Estados Unidos n.° 5.837.464 (Publicacion Internacional numero WO 97/27319).
Se disena un vector, un ejemplo del vector de expresion de la envoltura, (pHIVenv) para expresar la poliprotelna de envoltura (gp160) codificada por las secuencias de envoltura de VIH derivadas de pacientes (Figura 1). Gp160 se escinde posteriormente mediante una proteasa celular para generar las subunidades de superficie (gp120SU) y transmembrana (gp41TM) que comprenden la protelna de envoltura en la superficie de partlculas del virus VIH-1. Se disena un segundo vector, un ejemplo del vector de expresion vlrica (pHIVluc o pHIVlucAU3) para expresar ARN virales genomicos y subgenomicos y todas las protelnas del VIH excepto la poliprotelna de envoltura (Figuras 1A y 1B).
En esta aplicacion, el segmento o segmentos derivados de pacientes corresponden a la region codificante (-2.5 KB) de la poliprotelna de envoltura del VIH-1 (gp160) y representan (a) secuencias de envoltura amplificadas mediante el metodo de reaccion en cadena de la polimerasa con transcripcion inversa (RT-PCR) usando ARN vlrico aislado de virus derivado de sujetos infectados con VIH, o (b) secuencias de envoltura derivadas de clones moleculares de VIH- 1 que contienen mutaciones especlficas introducidas por mutagenesis dirigida de un clon molecular parental (normalmente NL4-3).
Se realizo un aislado de ARN viral usando procedimientos estandares (por ejemplo, RNAgents Total RNA Isolation System, Promega, Madiosn WI o RNAzol, Tel-Test, Friendswood, TX). El protocolo de RT-PCR se dividio en dos etapas. Se uso una transcriptasa inversa retroviral [por ejemplo, Superscript II (Invitrogen, Life Technologies) transcriptasa inversa Moloney MuLV (Roche Molecular Systems, Inc., Branchburg, NJ), o transcriptasa inversa del virus de la mieloblastosis aviar (AMV), (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)] para copiar ARN viral en ADNc de primera cadena. A continuacion se amplifico el ADNc a un alto numero de copias usando ADN polimerasa termoestable [por ejemplo, Taq (Roche Molecular Systems, Inc., Branchburg, NJ), Tth (Roche Molecular Systems, Inc., Branchburg, NJ), PrimeZyme (aislado de Thermus brockianus, Biometra, Gottingen, Alemania)] o una combinacion de polimerasas termoestables descritas para la realizacion de "PCR larga" (Barnes, W.M., (1994) Proc. Natl. Acad. Sci, USA 91, 2216-2220) [por ejemplo, Expand High Fidelity PCR System (Taq + Pwo), (Boehringer Mannheim. Indianapolis, IN) OR GeneAmp XL PCR kit (Tth + Vent), (Roche Molecular Systems, Inc., Branchburg, NJ), Advantage-2, (CloneTech).
Se uso oligo-dT para la transcripcion inversa de ARN vlrico en ADNc de primera cadena. Se usaron cebadores de la PCR de envoltura, cebador directo Xho/Pin y cebador inverso Mlu/Xba (Tabla 3) para amplificar segmentos derivados de pacientes. Estos cebadores se disenan para amplificar el gen de envoltura de 02,5 kB que codifica la poliprotelna de envoltura gp160, mientras se introducen sitios de reconocimiento Xho I y Pin Al en el extremo 5' del producto de amplificacion por PCR, y los sitios Mlu I y Xba I en el extremo 3' del producto de amplificacion por PCR.
Los segmentos derivados de pacientes (producto de amplificacion de secuencia de envoltura de 2,5 kB) se insertaron en vectores de expresion de envoltura de VIH-1 usando metodos de digestion con endonucleasa de restriction, enlace de ADN y transformation bacteriana como los descritos en la patente de Estados Unidos n.° 5.837.464 (Publicacion Internacional n° WO 97/27319), con adaptaciones menores. El producto de amplificacion de - 2,5 kB se digirio con Xho I o Pin Al en el extremo 5' y Mlu I o Xba I en el extremo 3'. Los productos de digestion resultantes se ligaron, usando ADN ligasa, en los sitios 5' Xho I/Pin Al y 3' Mlu I/Xba I de vectores de expresion pCXAS o pCXAT modificados. Se ha descrito la construction de los vectores pCXAS y pCXAT (en la Patente de Estados Unidos numero 5.937.464 (Publicacion Internacional n° WO 97/27319)). Los vectores pCXAS y pCXAT modificados contienen un sitio de restriccion Pin Al ademas de los sitios de restriccion Xho I, Mlul y Xba I que existen en pCXAS y pCXAT. Se introdujo el sitio Pin Al entre los sitios Xho I y Mlu I mediante mutagenesis dirigida, de manera que se situaran cuatro sitios de 5' a 3' en el siguiente orden: Xho I, Pin AI, Mlu I y Xba I. En una realizacion preferido, fueron digeridos productos de amplificacion de 2,5 kB con Pin Al y Mlu I y se unieron en el sitio 5' Pin Al y el sitio 3' Mlu I del vector de expresion pCXAS modificado. Se usaron productos de reaccion de enlace para
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transformer E. coli. Tras un periodo de incubacion de 24-36 h a 30-37 °C, se purifico el ADN plasmldico del vector de expresion de cultivos de E. coli. Para asegurar que las preparaciones de vector de expresion representan adecuadamente las cuasiespecies de VIH presentes en el suero de un paciente dado, se reunieron muchos (>100) transformantes de E. coli independientes y se usaron para las preparaciones de ADN plasmldico de pHIVenv. Los vectores que se ensamblan de este modo para los fines de expresar protelnas de envoltura derivadas de virus de pacientes se denominan de manera colectiva pHIVenv (Figuras 1 y 3).
Se disenan los vectores de expresion de VIH genomico pHIVluc y pHIVlucAU3 para transcribir ARN genomico de VIH y ARN subgenomicos y para expresar todas las protelnas de VIH excepto la poliprotelna de envoltura (Figura 1B). En estos vectores, se ha eliminado una parte del gen de envoltura para acomodar un casete genico indicador funcional, en este caso, "luciferasa de luciernaga" que se usa para controlar la capacidad del virus de replicar en presencia o ausencia de farmacos antivlricos. En pHIVlucAU3, se ha eliminado una parte de la region 3' de U3 para evitar la transcripcion de ARN virales de la LTR 5' en celulas infectadas.
Los ensayos de susceptibilidad para inhibidores de entrada de VIH-1 se llevaron a cabo usando celulas hospedadoras empaquetadoras que constan de la llnea celular de rinon embrionaria humana 293 (Cell Culture Facility, UC San Francisco, SF, CA) y celulas hospedadoras diana que constan de una llnea celular de osteosarcoma humano (HOS) que expresa CD4 (HT4) mas, CCR5, y CXCR4, o llneas celulares de astrocitoma (U- 87) que expresan CD4 y CCR5 o CD4 y CXCR4.
Se llevo a cabo un ensayo de susceptibilidad al farmaco usando pHIVenv y pHIVluc o pHIVlucAU3. Se produjeron partlculas de VIH pseudotipadas que contenlan protelnas de envoltura codificadas por el segmento derivado del paciente mediante transfeccion de una celula hospedadora empaquetadora (HEK 293) con vector de ADN del ensayo de resistencia. Se recogieron partlculas de virus (048 h) tras la transfeccion y se usaron para infectar celulas diana (HT4/CCR5/CXCR4, o U-87/CD4/CXCR4, o U-87/CD4/CCR5) que expresen receptores (es decir, CD4) y correceptores (es decir, CXCR4, CCR5) de VIH. Tras la infeccion (072 h) las celulas diana son lisadas y se mide la actividad de la luciferasa. El VIH debe completar un ronda de replicacion para infectar con exito la celula hospedadora diana y producir actividad de luciferasa. La cantidad de actividad de luciferasa detectada en las celulas infectadas se usa como medida directa de "infectabilidad" (Figura 1 y 2). Si por cualquier razon (por ejemplo, falta del receptor o correceptor apropiado, actividad de farmaco inhibidor, enlace de anticuerpo neutralizante), el virus es incapaz de entrar en la celula diana, la actividad de luciferasa disminuye. La susceptibilidad al farmaco se evalua comparando la infectabilidad en ausencia de farmaco con la infectabilidad en presencia de farmaco. La susceptibilidad al farmaco relativa puede cuantificarse comparando la susceptibilidad del virus de "ensayo" con la susceptibilidad de un virus de referencia bien caracterizado (tipo silvestre) derivado de un clon molecular de VIH-1, por ejemplo NL4-3 o HXB2.
Las celulas hospedadoras empaquetadoras se cultivaron en platos de 10 cm de diametro y se transfectaron un dla tras el cultivo en placas con pHIVenv y pHIVluc o pHIVlucAU3. Se llevaron a cabo las transfecciones usando un procedimiento de coprecipitacion de calcio-fosfato. El medio de cultivo celular que contiene el precipitado de ADN se sustituyo por medio fresco, de una a 24 horas, tras la transfeccion. El medio de cultivo celular que contiene partlculas vlricas se recogio normalmente 2 dlas despues de la transfeccion y se paso por un filtro de 0,45 mm. Antes de la infeccion, se colocaron las celulas diana en placas en el medio de cultivo celular. Se anadieron normalmente farmacos inhibidores de entrada a celulas diana en el momento de la infeccion (en ocasiones, un dla antes de la infeccion). Normalmente, tres dlas despues de la infeccion se sometieron a ensayo celulas diana para detectar la actividad de luciferasa usando un reactivo Steady-Glo (Promega) y un luminometro.
En una realizacion, se demostro la susceptibilidad a un farmaco inhibidor de fusion (T-20, tambien denominado DP178; Trimeros, Research Triangle Park, NC) (Figura 6). Las celulas diana (HT4/cCr5/CxCR4) que expresan CD4, CCR5 y CXCR4 se infectaron en ausencia de T-20 y con una amplia gama de concentraciones de T-20 (escala log10 eje x). El porcentaje de inhibicion de replicacion vlrica (eje y) se determino comparando la cantidad de luciferasa producida en celulas infectadas en presencia de T-20 con la cantidad de luciferasa producida en ausencia de T-20. Se sometieron a ensayo virus R5-tropicos (JRCSF, 9IUS005.11), X4-tropicos (NL4-3, 92HT599.24) y con tropismo dual (92HT593.1). La susceptibilidad al farmaco se cuantifica determinando la concentracion de T-20 necesaria para inhibir la replicacion vlrica en un 50 % (CI50, mostrado como llneas discontinuas verticales en la Figura 6). Los virus con valores de CI50 mas bajos son mas susceptibles a T-20 que los virus con valores de CI50 mas altos.
En otras realizaciones, puede medirse la susceptibilidad a una amplia variedad de inhibidores de entrada. Estos inhibidores incluyen, sin caracter limitativo, los farmacos y compuestos enumerados en la Tabla 4 (tabla de farmacos anti VIH).
En una segunda realizacion, se demuestra la susceptibilidad a un inhibidor de CCR5 que pertenece a la clase de compuestos de 4-(piperidin-1-il) butano (Dom, C.P. et al., (2001), Finke, P.E. et al., (2001); Merck, West Point, PA). Se infectaron celulas diana (U87/CD4/CCR5) que expresan CD4 y CCR5 (celulas R5) en ausencia del inhibidor de CCR5 y con una amplia gama de concentraciones de inhibidor de CCR5 (escala log10 eje x). El porcentaje de
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inhibicion de replicacion vlrica (eje y) se determino comparando la cantidad de luciferasa producida en celulas infectadas en presencia de inhibidor de CCR5 con la cantidad de luciferasa producida en ausencia de inhibidor de CCR5. Se sometieron a ensayo virus de tropismo dual (92HT593.1) R5-tropicos (JRCSF) y X4-tropicos (NL4-3). La susceptibilidad al farmaco se cuantifico determinando la concentracion de inhibidor de CCR5 necesaria para la replicacion vlrica en un 50 % (CI50, mostrado como llneas discontinuas verticales en la Figura 8). Los virus con valores de CI50 mas bajos son mas susceptibles al inhibidor de CCR5 que los virus con valores de CI50 mas altos. El virus X4-tropico no infecto las celulas diana U-87/CD4/CCR5.
En un tercer modo de realizacion, se demostro la susceptibilidad a un inhibidor de CXCR4 (AMD3100; AnorMED). Se infectaron celulas diana (U87/CD4/CXCR4) que expresan CD4 y CXCR4 en ausencia del inhibidor de CXCR4 y con una amplia gama de concentraciones de inhibidor de CXCR4 (escala log10 eje x). Se determino el porcentaje de inhibicion de replicacion vlrica (eje y) comparando la cantidad de luciferasa producida en celulas infectadas en presencia de inhibidor de CXCR4 con la cantidad de luciferasa producida en ausencia de inhibidor de CXCR4. Se sometieron a ensayo virus de tropismo dual (92HT593.1) R5-tropicos (JRCSF) y X4-tropicos (NL4-3). La susceptibilidad al farmaco se cuantifica determinando la concentracion de inhibidor de CXCR4 necesaria para inhibir la replicacion vlrica en un 50 % (CI50, mostrado como llneas discontinuas verticales en la Figura 9). Los virus con valores de CI50 mas bajos son mas susceptibles al inhibidor de CCR5 que los virus con valores de CI50 mas altos. El virus R5-tropico no infecto las celulas diana U-87/CD4/CXCR4.
Se puede medir la susceptibilidad a un inhibidor de CD4 (por ejemplo, anticuerpo monoclonal murino 5A8; Tanox, Houston, TX). Las celulas diana (por ejemplo, HT4/CCR5/CXCR4, U-87/CD4/CXCR4, o U-87/CD4/CCR5) que expresan CD4 y uno o ambos correceptores pueden infectarse en ausencia del farmaco inhibidor de CD4 y con una amplia gama de concentraciones de farmaco inhibidor de CD4 (escala log10 eje x). El porcentaje de inhibicion de replicacion vlrica (eje y) puede determinarse comparando la cantidad de luciferasa producida en celulas infectadas en presencia de inhibidor de CD4 con la cantidad de luciferasa producida en ausencia de inhibidor de CD4. Pueden someterse a ensayo virus R5-tropicos (por ejemplo, JRCSF), X4-tropicos (por ejemplo, NL4-3) y de tropismo dual (por ejemplo, 92HT593.1). Puede cuantificarse la susceptibilidad al farmaco determinando la concentracion de inhibidor de CD4 necesaria para inhibir la replicacion vlrica en un 50 % (CI50). Los virus con valores de CI50 mas bajos son mas susceptibles al inhibidor de CD4 que los virus con valores de CI50 mas altos.
Ejemplo 2: descubrimiento, optimizacion y caracterizacion de inhibidores nuevos y novedosos de la entrada de virus
En una realizacion, el ensayo de entrada de virus puede usarse para identificar nuevos compuestos/entidades qulmicas que inhiben la entrada de virus. Las celulas diana (por ejemplo, HT4/CCR5/CXCR4, U-87/CD4/CXCR4, o U-37/CD4/CCR5) que expresan CD4 y uno o ambos correceptores pueden infectarse en presencia de elementos individuales de grandes bibliotecas qulmicas (detection de alto rendimiento, HTS en ingles). La capacidad de un compuesto de inhibir la replicacion vlrica (un "hit") puede determinarse comparando la cantidad de luciferasa producida en celulas diana infectadas en presencia de un compuesto especlfico con la cantidad de luciferasa producida en ausencia del compuesto.
En otra realizacion, puede usarse el ensayo de entrada de virus para optimizar la actividad antiviral de compuestos de partida identificados mediante HTS. Los derivados qulmicos modificados de compuestos de partida pueden someterse a ensayo para identificar derivados especlficos que tengan actividad inhibidora de entrada de virus mejorada. Las celulas diana (por ejemplo, HT4/CCR5/CXCR4, U-87/CD4/CXCR4, o U-87/CD4/CCR5) que expresan CD4 y uno o ambos correceptores pueden infectarse en ausencia del inhibidor candidato y con una amplia gama de concentraciones de inhibidor candidato (escala log10 eje x). El porcentaje de inhibicion de replicacion vlrica (eje y) puede determinarse comparando la cantidad de luciferasa producida en celulas infectadas en presencia de inhibidor candidato con la cantidad de luciferasa producida en ausencia del inhibidor candidato. Puede cuantificarse la susceptibilidad al farmaco determinando la concentracion de inhibidor candidato necesaria para inhibir la replicacion vlrica en un 50% (CI50). Los compuestos derivatizados con valores de CI50 mas bajos son inhibidores mas potentes de la entrada de virus (tienen una mayor actividad antiviral) que los derivados con valores de CI50 mas altos.
En otra realizacion mas, puede usarse el ensayo de entrada de virus para caracterizar el mecanismo de action de nuevos farmacos inhibidores de entrada de virus candidatos, y la actividad antiviral frente a un espectro de virus puede diferir en susceptibilidad. Las celulas diana (por ejemplo, HT4/CCR5/CXCR4, U87/CD4/CXCR4, o U- 87/CD4/CCR5) que expresan CD4 y uno o ambos correceptores pueden infectarse en ausencia del nuevo farmaco inhibidor de entrada candidato y con una amplia gama de concentraciones de farmaco inhibidor de entrada (escala log10 eje x). El porcentaje de inhibicion de la replicacion vlrica (eje y) puede determinarse comparando la cantidad de luciferasa producida en celulas infectadas en presencia de nuevo inhibidor de entrada con la cantidad de luciferasa producida en ausencia de nuevo inhibidor de entrada. Pueden someterse a ensayo virus R5-tropicos (por ejemplo, JRCSF), X4-tropicos (por ejemplo, NL4-3) y de tropismo dual (por ejemplo, 92HT593.1). Puede cuantificarse la susceptibilidad al farmaco determinando la concentracion de inhibidor de CD4 necesaria para inhibir la replicacion vlrica en un 50 % (CI50).
Para determinar si el nuevo inhibidor de entrada actua bloqueando los correceptores CCR5 o CXCR4, se someten a
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ensayo los virus R5-tropicos frente al nuevo inhibidor en celulas U-87/CD4/CCR5 y los virus X4-tropicos se someten a ensayo frente al nuevo inhibidor usando celulas U-87/CD4/CXCR4. La inhibicion de infeccion de virus R5 es indicativa de antagonismo del correceptor CCR5 y al contrario, la inhibicion de infeccion del virus X4 es indicativa de antagonismo del correceptor CXCR4. La inhibicion de infeccion de virus R5 y X4 puede ser indicativa de antagonismo de CD4 o la inhibicion de fusion de la membrana.
Para caracterizar la actividad de un nuevo inhibidor frente a virus que presentan resistencia, o presentan susceptibilidad reducida, a otros inhibidores de entrada de virus de la misma clase, o diferente clase, los paneles seleccionados de virus resistentes al farmaco pueden someterse a ensayo en el ensayo de entrada de virus usando el nuevo farmaco inhibidor de entrada. El panel puede incluir virus con diferentes niveles de susceptibilidad a inhibidores de CCR5, inhibidores de CXCR4, inhibidores de CD4 e inhibidores de fusion de la membrana. El panel puede incluir virus con una o mas mutaciones especlficas que se asocian a resistencia/susceptibilidad reducida a uno o mas inhibidores de entrada.
Ejemplo 3: identificacion de sustituciones/mutaciones de aminoacidos de envoltura que alteran la susceptibilidad a inhibidores de entrada de virus
Este ejemplo proporciona un medio y un metodo para identificar mutaciones en la envoltura de VIH-1 que confieren una resistencia/susceptibilidad reducida a inhibidores de entrada de virus. Este ejemplo proporciona tambien un medio y un metodo para cuantificar el grado de susceptibilidad reducida a inhibidores de entrada conferido por las mutaciones de envoltura especlficas.
Las secuencias de envoltura derivadas de muestras de pacientes, o clones individuales derivados de muestras de pacientes, o secuencias de envoltura modificadas mediante mutagenesis dirigida para contener mutaciones especlficas, se someten a ensayo de entrada para cuantificar la susceptibilidad al farmaco basandose en un estandar de referencia bien caracterizado (por ejemplo, NL4-3, HXB2).
En una realizacion, se evalua la susceptibilidad a muestras de paciente longitudinales (virus recogidos del mismo paciente en diferentes momentos temporales). Por ejemplo, la susceptibilidad a inhibidores de entrada se mide antes de iniciar la terapia, antes o despues de cambios en el tratamiento de farmacos, o antes o despues de cambios en marcadores virologicos (numero de copias de ARN), inmunologicos (linfocitos T CD4), o cllnicos (infeccion oportunista) del avance de la enfermedad.
Analisis genotfpico de muestras de VIH de pacientes
Las secuencias de envoltura que representan conjuntos de muestras de pacientes, o clones derivados de conjuntos de pacientes, pueden analizarse por cualquier metodo de secuenciacion de ADN disponible comunmente. En una realizacion, se determinan secuencias de muestra de VIH del paciente usando purificacion de ARN vlrico, RT/PCR y analisis de secuenciacion del terminador de cadena dideoxinucleotido y electroforesis capilar en gel (Applied Biosystems, Foster City, CA). Las secuencias de envoltura de conjuntos de virus de pacientes o clones se comparan a secuencias de referencia, otras muestras de pacientes, o a una muestra obtenida del mismo paciente antes de la iniciacion de la terapia, si esta disponible. Se examina el genotipo para detectar secuencias que sean diferentes de la secuencia de referencia o secuencia antes del tratamiento y se correlaciona con diferencias en la susceptibilidad a inhibidor de entrada.
Susceptibilidad a inhibidor de entrada de mutantes dirigidos
Los cambios genotlpicos que se correlacionan con cambios en la salud se evaluan construyendo vectores de expresion de envoltura (pHIVenv) que contienen la mutacion especlfica en un contexto genetico definido y susceptible a farmacos (por ejemplo, cepa de referencia NL4-3). Las mutaciones pueden incorporarse solas y/o en combinacion con otras mutaciones que se piense que modulan la susceptibilidad al inhibidor de entrada. Se introducen mutaciones de la envoltura en vectores pHIVenv usando cualquiera de los metodos comunmente disponibles para la mutagenesis dirigida. En una realizacion de la presente invencion, se usa el metodo de PCR de megacebador para mutagenesis dirigida (Sarkar, G. y Summer, S.S., 1990). Se somete a ensayo un vector pHIVenv que contiene una mutacion de envoltura especlfica o grupo de mutaciones usando el ensayo de entrada de virus descrito en el Ejemplo 1. La susceptibilidad al farmaco del virus que contiene mutaciones de la envoltura se compara con la susceptibilidad al farmaco de un virus susceptible al farmaco definido geneticamente que carece de las mutaciones especlficas bajo evaluacion. Los cambios observados en la susceptibilidad al inhibidor de entrada se atribuyen a las mutaciones especlficas introducidas en el vector pHIVenv.
En una realizacion, se demuestra la susceptibilidad reducida al inhibidor de fusion T-20 conferida por mutaciones en la resistencia al farmaco especlficas en la protelna de envoltura gp41 (Figura 7). Se infectan celulas que expresan CD4, CCR5 y CXCR4 en ausencia de T-20 y con una amplia gama de concentraciones de T-20 (escala log10 eje x). El porcentaje de inhibicion de replicacion vlrica (eje y) se determino comparando la cantidad de luciferasa producida en celulas infectadas en presencia de T-20 con la cantidad de luciferasa producida en ausencia de T-20. Se sometieron a ensayo los virus isogenicos que contienen una o dos mutaciones especlficas en la protelna de
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envoltura transmembrana gp41 (destacado en rojo en la leyenda de la figura; Rimsky et al., J. Virol. 72: 986-993). Se cuantifica la susceptibilidad al farmaco determinando la concentracion de T-20 necesaria para inhibir la replicacion vlrica en un 50 % (CI50, mostrado en llneas discontinuas verticales). Los virus con valores de CI50 mas bajos son mas susceptibles a T-20 que virus con valores CI50 mas altos.
En una realizacion, se introdujeron mutaciones de resistencia al farmaco en virus X4-tropicos (NL4-3) y R5-tropicos (JRCSF) bien caracterizados. Se midio la susceptibilidad a T-20 usando el ensayo de entrada de virus (Figura 7). Se determino el nivel de cambio (en ingles, fold change o FC) en la susceptibilidad a T-20 para cada virus dividiendo la CI50 del virus de prueba por la CI50 de la cepa HXB2 del VIH-1. La sensibilidad a T-20 de virus mutantes similares se ha presentado en la bibliografla cientlfica (Rimsky et al.,). En este modo de realizacion, los virus con una mutacion dentro del motivo GIV de gp41 (DIV, GIM, SIV) eran menos susceptibles a T20 que los virus de tipo silvestre (GIV). Los virus con dos mutaciones en el motivo GIV (DIM, SIM, DTV) eran menos susceptibles a T20 que los virus con una o ninguna mutacion en el motivo GIV.
En otra realizacion, las mutaciones que pueden conferir susceptibilidad reducida (o aumentada) al inhibidor de entrada se identifican mediante secuenciacion de los genes de envoltura de los virus resistentes y sensibles. Las secuencias de aminoacidos deducidas de los virus resistentes y sensibles se comparan para identificar mutaciones candidatas de resistencia al farmaco. La capacidad de una mutacion especlfica de conferir susceptibilidad al farmaco alterada se confirma o desmiente introduciendo la mutacion en un virus sensible al farmaco y midiendo la susceptibilidad del virus mutante en el ensayo de entrada de virus. En el ejemplo representado aqul, un tramo corto de secuencias de aminoacidos en la primera repeticion heptad (HR-1) de la protelna de envoltura transmembrana gp41 del VIH-1 se alinea para virus que presentan diferentes susceptibilidades a T-20. Los aminoacidos destacados representan mutaciones conocidas para conferir susceptibilidad reducida a T-20.
Pueden usarse analisis fenotlpicos y genotlpicos similares para identificar secuencias de aminoacidos de envoltura que (a) alteran/influencian la susceptibilidad a inhibidores de CCR5 o CXCR4, (b) especificar tropismo a X4, R5 y dual, y (c) producir anticuerpos neutralizantes.
En una realizacion, se demuestra la susceptibilidad reducida a inhibidores de correceptor (CCR5, CXCR4) conferida por mutaciones/secuencias de aminoacidos de envoltura especlficas.
En otra realizacion, se demuestra la susceptibilidad reducida a inhibidores de correceptor (CD4) conferida por mutaciones/secuencias de aminoacidos de envoltura especlficas.
Ejemplo 4: determinacion de tropismo por receptor y correceptor de VIH-1
Este ejemplo proporciona un medio y un metodo para determinar el tropismo por el correceptor de VIH-1. Este ejemplo proporciona tambien un medio y un metodo para determinar el tropismo por el receptor de VIH-1.
En una realizacion, se identifican virus que usan el correceptor CCR5. En una realizacion relacionada, se identifican virus que usan el correceptor CXCR4. En otra realizacion relacionada, se identifican virus que usan CCR5 y CXCR4. En otra realizacion relacionada, se identifican virus que usan correceptores distintos a CCR5 y CXCR4.
En otra realizacion, se identifican virus que usan el receptor CD4. En otra realizacion relacionada, se identifican virus que usan CD8. En otra realizacion relacionada, se identifican virus que no requieren CD4 o CD8 para infectar celulas.
En esta realizacion, el ensayo se lleva a cabo usando dos llneas celulares. Una llnea celular expresa CD4 mas CCR5 (U87/CD4/CCR5), tambien denominadas celulas R5 en la presente solicitud. La otra llnea celular expresa CD4 y CXCR4 (U87/CD4/CXCR4), tambien denominadas celulas X4 en la presente solicitud. El ensayo de entrada de virus se lleva a cabo infectando cultivos celulares individuales con reservorios de virus recombinantes derivados de celulas transfectadas con vectores pHIVenv y pHIV luc o pHIVlucAU3. Los vectores pHIVenv contienen secuencias derivadas de virus de pacientes y expresan protelnas de envoltura de VIH-1 (gp120SU, gp41TM). En este modo de realizacion, se evaluan virus en el uso de celulas diana R5 y X4 cultivadas en placas de 96 pocillos (Figura 3A). Normalmente, las celulas R5 y X4 se colocan en placas un dla antes de la infeccion. Se lleva a cabo la infeccion con cada reservorio de virus en ausencia de farmaco (sin farmaco), en presencia de concentraciones inhibidoras de un farmaco que inhibe preferiblemente virus R5-tropicos (inhibidor de CCR, por ejemplo, un compuesto de piperidin1il butano), y en presencia de concentraciones inhibidoras de un farmaco que inhibe preferentemente virus X4-tropicos (inhibidor de CXCR4, por ejemplo, AMD3100). El tropismo por el correceptor se evalua comparando la cantidad de actividad de luciferasa producida en cada tipo celular, tanto en presencia como en ausencia de farmaco. En este modo de realizacion, los resultados del ensayo se interpretan comparando la capacidad de cada virus de infectar preferentemente (producir actividad de luciferasa) celulas R5 o celulas X4, o ambas celulas R5 y X4 si el virus presenta tropismo dual. Se evalua tambien la capacidad del inhibidor de CCR5 o CXCR4 de bloquear especlficamente la infeccion (inhibir actividad de luciferasa) (Figura 3B). En este modo de realizacion, los virus X4-tropicos infectan celulas X4 pero no celulas R5 y la infeccion de celulas X4 es bloqueada por el inhibidor de CXCR4 (AMD3100). En este modo de realizacion, los virus R5-tropicos infectan celulas R5 pero
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no celulas X4 y la infeccion de celulas R5 es bloqueada por el inhibidor de CCR5 (compuesto de piperidin-1 il butano). En este modo de realizacion, los virus de tropismo dual, o mezclas de virus X4-tropicos y R5-tropicos infectan tanto celulas X4 como R5 y la infeccion de celulas R5 es bloqueada por el inhibidor de CCR5 y la infeccion de celulas X4 es bloqueada por el inhibidor de CXCR4. En este modo de realizacion, los virus no viables no replican ni en celulas X4 ni r5 (no se produce actividad de luciferasa).
En otra realizacion, el ensayo se lleva a cabo usando tres o mas llneas celulares. Una llnea celular expresa CD4 mas CCR5 (U87/CD4/CCR5), tambien denominadas celulas R5 en esta solicitud. La otra llnea celular expresa CD4 y CXCR4 (U87/CD4/CXCR4), tambien denominadas celulas X4 en esta solicitud. Llneas celulares adicionales expresan CD4 mas otros correceptores de VIH-1 candidatos, incluyendo, sin caracter limitativo, BONZO, BOB, etc. Vease Tabla 1. Estas llneas celulares adicionales expresan otros correceptores candidatos, pero no expresan CCR5 o CXCR4. El ensayo de entrada de virus se lleva a cabo infectando cultivos celulares individuales con reservorios de virus recombinantes derivados de celulas transfectadas con vectores pHIVenv y pHIV luc o pHIVlucAU3. Los vectores pHIVenv contienen secuencias derivadas de virus de pacientes y expresan protelnas de envoltura de VIH-1 (gp120SU, gp41TM). En este modo de realizacion, se evaluan virus usando celulas cultivadas en placas de 96 pocillos. La infeccion con cada reservorio de virus se lleva a cabo en celulas R5, celulas X4 y las llneas celulares que expresan CD4 mas los correceptores candidatos. El tropismo por el correceptor se evalua comparando la cantidad de actividad de luciferasa producida en cada tipo celular. En esta realizacion, los resultados del ensayo se interpretan comparando la capacidad de cada virus de infectar preferentemente (producir actividad de luciferasa) celulas R5 o celulas X4, o la llnea celular que expresa el correceptor candidato. En esta realizacion, los virus X4- tropicos infectan las celulas X4 pero no las celulas R5. En esta realizacion, los virus R5-tropicos infectan las celulas R5 pero no las celulas X4. En esta realizacion, los virus de tropismo dual o una mezcla de virus X4-tropicos y R5- tropicos infectan tanto celulas X4 como celulas R5. En esta realizacion, la infeccion de llneas celulares que expresan correceptores candidatos alternativos (ni CCR5 ni CXCR4) se atribuye al tropismo por el correceptor alternativo. En esta realizacion, los virus no viables no se replican ni en celulas X4 ni R5.
En otra realizacion, el ensayo se lleva a cabo usando cuatro llneas celulares. Una llnea celular expresa CD4 mas CCR5 (U87/CD4/CCR5), tambien denominadas celulas R5 en la presente solicitud. Una segunda llnea celular diferente expresa CD4 y CXCR4 (U87/CD4/CXCR4), tambien denominadas celulas X4 en esta solicitud. Una tercera llnea celular expresa CD8 mas CCR5 (U87/CD8/CCR5), tambien denominadas celulas CD8/R5 en la presente solicitud. Una cuarta llnea celular expresa CD8 y CXCR4 (U87/CD8/CXCR4), tambien denominadas celulas CD8/X4 en la presente solicitud. El ensayo de entrada de virus se lleva a cabo infectando cultivos celulares individuales con reservorios de virus recombinantes derivados de celulas transfectadas con vectores pHIVenv y pHIV luc o pHIVlucAU3. Los vectores pHIVenv contienen secuencias derivadas de virus de pacientes y expresan protelnas de envoltura de VIH-1 (gp120SU, gp41TM). En esta realizacion, se evaluan virus usando celulas cultivadas en placas de 96 pocillos. La infeccion con cada reservorio de virus se lleva a cabo en celulas R5, celulas X4, celulas CD8/R5 y celulas CD8/X4. El tropismo por el correceptor se evalua comparando la cantidad de actividad de luciferasa producida en cada tipo celular. En este modo de realizacion, los resultados del ensayo se interpretan comparando la capacidad de cada virus de infectar preferentemente (producir actividad de luciferasa) celulas R5, celulas X4, celulas CD8/R5 o celulas CD8/X4. En esta realizacion, los virus CD4-tropicos infectan las celulas X4 y/o celulas R5. En esta realizacion, los virus CD8-tropicos infectan las celulas CD8/R5 y/o celulas CD8/X4. En esta realizacion, los virus de tropismo dual (uso del receptor CD4 y CD8) infectan celulas X4 y/o celulas R5 mas celulas CD8/X4 y/o CD8/R5. En esta realizacion, la infeccion de llneas celulares que expresan CD8 pero no CD4 se atribuye al tropismo por el receptor CD8. En esta realizacion, los virus no viables no se replican ni en celulas X4 ni R5.
En otra realizacion relacionada, el ensayo se lleva a cabo usando dos llneas celulares. Una llnea celular expresa CD4 mas CCR5 y CXCR4 (HT4/CCR5/CXCR4). Una segunda llnea celular expresa CD8 mas CCR5 y cXcR4 (HOS/CD8/CCR5/CXCR4). El ensayo de entrada de virus se lleva a cabo infectando cultivos celulares individuales con reservorios de virus recombinantes derivados de celulas transfectadas con vectores pHIVenv y pHIV luc o pHIVlucAU3. Los vectores pHIVenv contienen secuencias derivadas de virus de pacientes y expresan protelnas de envoltura de VIH-1 (gp120SU, gp41TM). En esta realizacion, se evaluan virus usando celulas cultivadas en placas de 96 pocillos. La infeccion con cada reservorio de virus se lleva a cabo en celulas HT4/CCR5/CXCR4 y celulas HOS/CD8/CCR5/CXCR4. El tropismo por el correceptor se evalua comparando la cantidad de actividad de luciferasa producida en cada tipo celular. En esta realizacion, los resultados de este ensayo se interpretan comparando la capacidad de cada virus de infectar preferentemente (producir actividad de luciferasa) celulas RT4/CCR5/CXCR4 o celulas HOS/CD8/CCR5/CXCR4. En esta realizacion, los virus CD4-tropicos infectan celulas HT4/CCR5/CXCR4, pero no celulas HOS/CD8/CCR5/CXCR4. En esta realizacion, los virus CD8-tropicos infectan celulas HOS/CD8/CCR5/CXCR4, pero no celulas HT$/CCR5/CXCR4. En esta realizacion, los virus con tropismo dual (uso del receptor CD4 y CD8) infectan tanto celulas HT4/CCR5/CXCR4 como celulas HOS/CD8/CCR5/CXCR. En esta realizacion, la infeccion de las llneas celulares que expresan CD8 pero no CD4 se atribuye a tropismo por el receptor CD8. En esta realizacion, los virus no viables no se replican ni en celulas X4 ni R5.
En otra realizacion, el ensayo se lleva a cabo usando dos llneas celulares. Una llnea celular expresa CD4 mas CCR5 y CXCR4 (HT4/CCR5/CXCR4). Una segunda llnea celular expresa CCR5 y CXCR4 pero no CD4 o CD8 (HOS/CCR5/CXCR4). El ensayo de entrada de virus se lleva a cabo infectando cultivos celulares individuales con reservorios de virus recombinantes derivados de celulas transfectadas con vectores pHIVenv y pHIV luc o
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pHIVlucAU3. Los vectores pHIVenv contienen secuencias derivadas de virus de pacientes y expresan protelnas de envoltura de VIH-1 (gp120SU, gp41TM). En esta realization, se evaluan virus usando celulas cultivadas en placas de 96 pocillos. La infection con cada reservorio de virus se lleva a cabo en celulas HT4/CCR5/CXCR4 y celulas HOS/CCR5/CXCR4. La infeccion independiente de CD4 y CD8 se evalua comparando la cantidad de actividad de luciferasa producida en cada tipo celular. En esta realizacion, los resultados del ensayo se interpretan comparando la capacidad de cada virus de infectar preferentemente (producir actividad de luciferasa) celulas HT4/CCR5/CXCR4 o celulas HOS/CCR5/CXCR4. En esta realizacion, los virus dependientes de CD4 infectan celulas HT4/CCR5/CXCR4, pero no celulas HOS/CCR5/CXCR4. En este modo de realizacion, los virusindependientes de CD4 infectan tanto celulas HOS/CCR5/CXCR4 como celulas HT4/CCR5/CXCR4. En esta realizacion, la infeccion de llneas celulares que carecen de expresion de CD4 se atribuye a infeccion independiente de CD4. En esta realizacion, los virus no viables no se replican ni en celulas X4 ni R5.
Ejemplo 5: identificacion de mutaciones/sustituciones de aminoacidos de la envoltura de VIH-1 que alteran el tropismo por el receptor y correceptor
Este ejemplo proporciona un medio y un metodo para identificar secuencias de aminoacido de la envoltura del VIH1 que especifican, o alteran, el tropismo por el correcptor (X4 frente a R5 frente a X4/R5 dual). Este ejemplo proporciona tambien un medio y un metodo para identificar secuencias de aminoacido de la envoltura de VIH-1 que especifican el uso de correceptor distinto a CXCR4 o CCR5. El ejemplo proporciona tambien un medio y un metodo para identificar secuencias de la envoltura de VIH-1 que especificas, o tropismo por el receptor (CD4 frente a CD8).
Las secuencias de envoltura derivadas de muestras de pacientes, o clones individuales derivados de muestras de pacientes, o secuencias de envoltura modificadas mediante mutagenesis dirigida para contener mutaciones especificas, se someten a ensayo de entrada para determinar el tropismo por el correceptor tal como se describe en el Ejemplo 4.
En una realizacion, se evalua el tropismo por el correceptor de muestras de paciente longitudinales (virus recogidos del mismo paciente en diferentes momentos temporales). Por ejemplo, el tropismo por el correceptor se evalua antes de iniciar la terapia, antes o despues de cambios en el tratamiento con el farmaco, o antes o despues de cambios en marcadores virologicos (numero de copias de ARN), inmunologicos (linfocitos T CD4), o cllnicos (infeccion oportunista) del avance de la enfermedad.
En otra realizacion, se evalua el tropismo por el correceptor para muestras recogidas de un gran numero de pacientes diferentes. En otra realizacion, se evalua el tropismo por el correceptor para muestras recogidas de un gran numero de pacientes que representan poblaciones de pacientes y virus diferentes. Dichas poblaciones de pacientes pueden incluir, sin caracter limitativo, pacientes infectados recientemente, pacientes infectados de manera cronica, pacientes con enfermedad avanzada y pacientes que estan sometidos a terapia antirretroviral o inmunoterapia. Dichas poblaciones de virus pueden incluir, sin caracter limitativo, virus con distintas caracterlsticas geneticas (variante A, B, C, D, E, F, G), virus susceptibles a farmacos antirretrovlricos, virus con resistencia/susceptibilidad reducida a farmacos antirretrovlricos.
Analisis genotfpico de muestras de VIH de pacientes
Las secuencias de envoltura que representan conjuntos de muestras de pacientes, o clones derivados de conjuntos de pacientes, pueden analizarse por cualquier metodo de secuenciacion de ADN disponible comunmente. En una realizacion, se determinan secuencias de muestras de VIH de pacientes usando purification de ARN vlrico, RT/PCR y analisis de secuenciacion del terminador de cadena dideoxinucleotido y electroforesis capilar en gel (Applied Biosystems, Foster City, CA). Las secuencias de envoltura de conjuntos de virus de pacientes o clones se comparan a secuencias de referencia, otras muestras de pacientes, o a una muestra obtenida del mismo paciente antes de iniciar la terapia, si se dispone de ella. Se examina el genotipo para detectar secuencias que sean diferentes de las de referencia o secuencias de antes del tratamiento y se correlaciona con diferencias en la susceptibilidad al inhibidor de entrada.
Tropismo por el correceptor y receptor de virus caracterizados geneticamente
Las secuencias de aminoacidos de la envoltura que correlacionan el tropismo por el correceptor se evaluan construyendo vectores de expresion de la envoltura (pHIVenv) que contienen una mutation especlfica en un contexto genetico definido (por ejemplo, NL4-3 para tropismo X4, JRCSF para tropismo R5). Las mutaciones pueden incorporarse solas y/o en combination con otras mutaciones de las que se piense que modulan el uso de correceptor. Se introducen mutaciones de la envoltura en vectores pHIVenv usando cualquiera de los metodos comunmente disponibles para la mutagenesis dirigida. En una realizacion, se usa el metodo de PCR de megacebador para mutagenesis dirigida (Sarkar, G. y Summer, S.S., 1990). Se somete a ensayo un vector pHIVenv que contiene una mutacion de envoltura especlfica o grupo de mutaciones usando el ensayo de entrada de virus descrito en el Ejemplo 1. El tropismo por el correceptor del virus que contiene mutaciones en la envoltura se compara al tropismo por el correceptor de un virus definido geneticamente que carece de las mutaciones especificas bajo evaluation. La capacidad de una mutacion especlfica de conferir tropismo por el correceptor alterado se
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confirma o desmiente introduciendo la mutacion en un virus de referenda bien caracterizado y evaluando el tropismo por el correceptor del virus mutante en el ensayo de entrada de virus como se ha descrito en el Ejemplo 4. Los cambios observados en el tropismo por el correceptor se atribuyen a las mutaciones especlficas introducidas en el vector pHIVenv.
En una realization, los determinantes geneticos del tropismo R5 se identifican evaluando secuencias de aminoacidos con el bucle V3 de la protelna de envoltura de superficie gp120. Las secuencias de aminoacidos bajo evaluation se identifican comparando las secuencias de aminoacidos de un gran numero de virus X4-tropicos y R5- tropicos. Se seleccionan diferencias consistentes entre los virus R5 y X4 para su evaluacion. Se construyen virus isogenicos basados en un clon parental de X4 bien caracterizado (por ejemplo, NL4-3, HXB2) que contiene mutaciones "R5 candidatas" especlficas en el bucle V3 de la protelna de envoltura gp120 mediante mutagenesis dirigida y se someten a ensayo para evaluar el tropismo por el correceptor tal como se describe en el Ejemplo 4. Se infectan celulas que expresan CD4 mas CcR5 (por ejemplo, U-87/CD4/CCR5) o CD4 mas CXCR4 (U- 87/CD4/CXCR4) en ausencia de un inhibidor de R5 (compuesto piperidin-1 il butano) y de X4 (AMD3100) y en presencia de concentraciones inhibidoras de R5 y concentraciones de farmaco de X4. Las sustituciones de aminoacido que cambian el virus X4-tropico a un virus R5-tropico se caracterizan como determinantes geneticos de tropismo R5.
En una realizacion relacionada, los determinantes geneticos del tropismo X4 se identifican evaluando secuencias de aminoacidos con el bucle V3 de la protelna de envoltura de superficie gp120. Las secuencias de aminoacidos bajo evaluacion se identifican comparando las secuencias de aminoacidos de un gran numero de virus X4-tropicos y R5- tropicos. Se seleccionan diferencias consistentes entre los virus R5 y X4 para su evaluacion. Se construyen virus isogenicos basados en un clon parental de R5 bien caracterizado (por ejemplo, JRCSF) que contienen mutaciones "X4 candidatas" especlficas en el bucle V3 de la protelna de envoltura gp120 mediante mutagenesis dirigida y se someten a ensayo para evaluar el tropismo por el correceptor tal como se describe en el Ejemplo 4. Se infectan celulas que expresan CD4 mas CCR5 (por ejemplo, U-87/CD4/CCR5) o CD4 mas CXCR4 (U-87/CD4/CXCR4) en ausencia de un inhibidor de R5 (compuesto piperidin-1 il butano) y de X4 (AMD3100) y en presencia de concentraciones inhibidoras de R5 y concentraciones de farmaco de X4. Las sustituciones de aminoacido que cambian el virus X4-tropico a un virus R5-tropico se caracterizan como determinantes geneticos de tropismo R5.
En una realizacion relacionada, los determinantes geneticos del tropismo X4 o R5 se identifican evaluando secuencias de aminoacidos en la protelna de envoltura de superficie gp120 completa.
En una realizacion relacionada, los determinantes geneticos del tropismo X4 o R5 se identifican evaluando secuencias de aminoacidos en la protelna de envoltura transmembrana gp41.
En una realizacion relacionada, los determinantes geneticos que especifican el uso de correceptores diferentes a CCR5 y CXCR4 se identifican evaluando secuencias de aminoacidos en el bucle V3 de la protelna de envoltura de superficie gp120. Las secuencias de aminoacidos bajo evaluacion se identifican comparando las secuencias de aminoacidos de virus que son capaces de replicar en celulas que no expresan CXCR4 o CCR5, pero si expresan otros correceptores candidatos. Se seleccionan diferencias consistentes en secuencias de aminoacidos entre estos virus que no son X4, ni R5 y los virus X4 y R5 para su evaluacion. Los virus isogenicos basados en un clon parental de R5 (por ejemplo, JRCSF) o X4 (por ejemplo, NL4-3) bien caracterizado que contiene mutaciones que "no son candidatas de X4, ni R5" especlficas en el bucle V3 de la protelna de envoltura gp120 se construyen mediante mutagenesis dirigida y se someten a ensayo para el tropismo por el correceptor como se ha descrito en el Ejemplo 4. Las celulas que expresan CD4 mas CCR5 (por ejemplo, U-87/CD4/CCR5), CD4 mas CXCR4 (U87/CD4/CXCR4), y CD4 mas otros correceptores candidatos (U87/CD4/X) se infectan en ausencia de un inhibidor de R5 (compuesto de piperidin-1 il butano) y X4 (AMD3100) y en presencia de concentraciones inhibidoras de R5 y concentraciones de farmaco de X4. Las sustituciones de aminoacidos que confieren tropismo por un correceptor no X4 y no R5 se caracterizan como determinantes geneticos de tropismo por el correceptor especlfico.
En una realizacion relacionada, los determinantes geneticos del tropismo por otros correceptores se identifican evaluando secuencias de aminoacidos en la protelna de envoltura de superficie gp120 completa.
En una realizacion relacionada, los determinantes geneticos de tropismo por otros correceptores se identifican evaluando secuencias de aminoacido en la protelna de envoltura transmembrana gp41.
En otra realizacion, los determinantes geneticos que especifican el uso de CD8 (ademas de, o en lugar de CD4) como un receptor para VIH-1 se identifican evaluando secuencias de aminoacido en el bucle V3 de la protelna de envoltura de superficie gp120. Las secuencias de aminoacidos bajo evaluacion se identifican comparando las secuencias de aminoacidos de virus que son capaces de replicar en celulas que no expresan CD4, pero si expresan CD8. Se seleccionan diferencias consistentes en secuencias de aminoacidos entre estos virus CD4-tropicos y CD8- tropicos para su evaluacion. Los virus isogenicos basados en un clon parental CD4-tropico (por ejemplo, NL4-3, JRCSF) bien caracterizado que contienen mutaciones "CD8 candidatas" especlficas en el bucle V3 de la protelna de envoltura gp120 se construyen mediante mutagenesis dirigida y se someten a ensayo para el tropismo por el receptor CD8 como se ha descrito en el Ejemplo 4. Se infectan celulas que expresan cD4 mas CCR5 (por ejemplo,
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U-87/CD4/CCR5), CD4 mas CXCR4 (U-87/CD4/CXCR4), CD8 mas CCR5 (por ejemplo, U-87/CD8/CCR5), CD8 mas CXCR4 (U87/CD8/CXCR4). Las sustituciones de aminoacido que permiten la replicacion en celulas que expresan CD8 pero no CD4 se caracterizan como determinantes geneticos del tropismo CD8.
En una realizacion relacionada, los determinantes geneticos del tropismo CD8 se identifican evaluando secuencias de aminoacidos en la protelna de envoltura de superficie gp120 completa.
En una realizacion relacionada, los determinantes geneticos del tropismo CD8 se identifican evaluando secuencias de aminoacidos en la protelna de envoltura transmembrana gp41.
Ejemplo 6: medicion de neutralizacion de anticuerpos de VIH-1
Este ejemplo proporciona un medio y un metodo para evaluar la neutralizacion mediada por anticuerpo de VIH-1, tambien denominada neutralizacion del virus en esta solicitud. Este ejemplo tambien proporciona un medio y un metodo para evaluar la actividad de neutralizacion del virus de anticuerpos en pacientes infectados con VIH-1. Este ejemplo tambien proporciona un medio y un metodo para evaluar la actividad neutralizante de virus de anticuerpos en sujetos o animales vacunados con vacunas terapeuticas y vacunas candidatas. Este ejemplo tambien proporciona un medio y un metodo para evaluar la actividad neutralizante de virus de anticuerpos en sujetos o animales vacunados con vacunas protectoras (profilacticas o preventivas) y vacunas candidatas. Este ejemplo tambien proporciona un medio y un metodo para evaluar la actividad neutralizante de virus o preparaciones de anticuerpos monoclonales o policlonales especlficos.
Las secuencias de envoltura derivadas de muestras de pacientes, o clones individuales derivados de muestras de pacientes, o secuencias de envoltura modificadas mediante mutagenesis dirigida para contener mutaciones especlficas, se someten a ensayo de entrada para evaluar la neutralizacion mediada por anticuerpo.
En una realizacion, se evalua la neutralizacion mediada por anticuerpo en muestras de paciente longitudinales (virus recogidos del mismo paciente en diferentes momentos temporales). Por ejemplo, se evalua la neutralizacion de virus antes de la vacunacion, durante el curso de la vacunacion, y en momentos temporales graduales tras la terminacion del programa de vacunacion. En una realizacion relacionada, el suero de animales que incluye, sin caracter limitativo, ratones, ratas, conejos, cerdos y ganado, se evalua antes de la inoculacion con vacunas candidatas, durante un programa de inoculacion repetida, y en momentos temporales graduales tras la terminacion del programa de inoculacion. En una realizacion, se evalua la neutralizacion del virus para vacunas preventivas y vacunas candidatas. En otra realizacion, se evalua la neutralizacion del virus para vacunas terapeuticas.
En otra realizacion, se evalua la neutralizacion de virus para muestras recogidas de un gran numero de pacientes diferentes. En otra realizacion, se evalua la neutralizacion de virus para muestras recogidas de un gran numero de pacientes que representan poblaciones de pacientes diferentes y poblaciones de virus diferentes. Las "poblaciones de pacientes" pueden incluir, sin caracter limitativo, pacientes infectados recientemente, pacientes infectados de manera cronica, pacientes con la enfermedad del SIDA/VIH avanzada, pacientes con un avance de la enfermedad rapido, pacientes con un avance de la enfermedad lento (normalmente denominados pacientes sin progresion a largo plazo), pacientes que se estan sometiendo a terapia antirretroviral o inmunoterapia (por ejemplo, interleucina-2 u otras citocinas), sujetos vacunados y no vacunados. Las "poblaciones de virus" pueden incluir, sin caracter limitativo, virus con diferentes caracterlsticas geneticas y orlgenes geograficos (variante A, B, C, D, E, F, G), virus susceptibles a farmacos antirretrovlricos, virus con resistencia/susceptibilidad reducida a farmacos antirretrovlricos, aislados primarios, aislados adaptados para su cultivo en cultivo celular (a menudo denominados virus adaptados de laboratorio), virus inductores de sincitio (SI), virus no inductores de sincitio (NSI), virus macrofago-tropicos (M), virus tropicos de celulas T (T) y virus con tropismo dual (M y T).
Caracterizacion de anticuerpo de paciente (anticuerpo de paciente vs. panel de virus estandar)
En esta realizacion, el ensayo se lleva a cabo usando una llnea celular diana que expresa el receptor CD4 de VIH-1 mas los correceptores CCR5 y CXCR4 de VIH-1 (HT4/CCR5/CXCR4). Dicha llnea celular es capaz de evaluar la actividad neutralizante de anticuerpos para los virus R5-tropicos y X4-tropicos. En una realizacion relacionada, el ensayo se lleva a cabo usando dos llneas celulares diana. Una llnea celular expresa CD4 mas CCR5 (U- 87/CD4/CCR5) y se usa para someter a ensayo virus R5-tropicos. Otra llnea celular expresa CD4 mas CXCR4 (U- 87/CD4/CXCR4) y se usa para evaluar virus X4-tropicos. El ensayo de entrada de virus se lleva a cabo infectando cultivos de celulas diana individuales con reservorios de virus recombinantes derivados de celulas hospedadoras empaquetadoras transfectadas con vectores pHIVenv y pHIVluc o pHIVlucAU3. En esta realizacion, los vectores pHIVenv contienen secuencias de envoltura de virus especlficos bien caracterizados y expresan las protelnas de envoltura de VIH-1 (gp120SU, gp41TM). Dichos virus representan un "panel de virus patron" (vease aenteriormente la descripcion de la poblacion de virus). Algunos, pero no todos, los ejemplos de virus razonables que pueden constituir un panel patronr se enumeran en la Tabla 4. Se usa un panel de virus patron para comparar la actividad de anticuerpo neutralizante de suero obtenido de muchos pacientes diferentes y/o animales (vease la descripcion anteriormente de poblacion de paciente). En esta realizacion, se evaluan virus usando celulas diana cultivadas en placas de 96 pocillos. Normalmente, las celulas diana se colocan en placas a 5.000 celulas por pocillo para
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HT4/CCR5/CXCR4 o 10.000 celulas por pocillo para U-87/CD4/CCR5 y U-87/CD4/CXCR4 un dla antes de la infeccion. Antes de la infeccion de celulas diana, se preincuba cada reservorio de virus con el suero o la preparation de anticuerpo (normalmente 1 h) que se esta evaluando. El suero o preparaciones de anticuerpos se someten a ensayo no diluidas y en diluciones gradualmente mayores (normalmente 4 o 5 diluciones 1:10 en serie). La infeccion de celulas diana con cada reservorio de virus se lleva a cabo tambien en ausencia de anticuerpo (sin anticuerpo). La neutralization de virus se evalua comparando la cantidad de actividad de luciferasa producida en celulas diana, tanto en presencia como en ausencia de anticuerpo. En esta realization, los resultados del ensayo se interpretan comparando la capacidad de cada anticuerpo para bloquear preferentemente la infeccion de celulas diana (reducir o eliminar la actividad de luciferasa). La actividad de neutralizacion de virus se cuantifica observando la mayor dilution de anticuerpo (mas diluido) que es capaz de bloquear la infeccion de celulas diana (por ejemplo, la dilucion mas alta que es capaz de reducir la actividad de luciferasa producida en ausencia de anticuerpo en un 50 %).
Caracterizacion de VIH-1 de paciente (virus de paciente frente a panel de anticuerpo patron)
En esta realizacion, el ensayo se lleva a cabo usando una llnea celular diana que expresa el receptor CD4 de VIH-1 mas los correceptores CCR5 y CXCR4 de VIH-1 (HT4/CCR5/CXCR4). Dicha llnea celular es capaz de evaluar la actividad nuetralizante de anticuerpos para virus R5-tropicos y X4-tropicos. En una realizacion relacionada, el ensayo se lleva a cabo usando dos llneas celulares diana. Una llnea celular expresa CD4 mas CCR5 (U- 87/CD4/CCR5) y se usa para someter a ensayo virus R5-tropicos. Otra llnea celular expresa CD4 mas CXCR4 (U- 87/CD4/CXCR4) y se usa para evaluar virus X4-tropicos. El ensayo de entrada de virus se lleva a cabo infectando cultivos de celulas diana individuales con reservorios de virus recombinantes derivados de celulas huesped empaquetadoras transfectadas con vectores pHIVenv y pHIVluc o pHIVlucAU3. En este modo de realizacion, los vectores pHIVenv contienen secuencias de envoltura derivadas de virus de pacientes y expresan protelna de envoltura de VIH-1 (gp120SU, gp41TM). En este modo de realizacion, virus de diferentes poblaciones de pacientes (vease anteriormente la description de la poblacion de pacientes), y/o diferentes poblaciones de virus (vease la description anterior de poblacion de virus) se usan para construir vectores pHIVenv. Se evalua el VIH pseudotipado derivado de vectores pHIVenv en el ensayo de entrada de virus para determinar si son susceptibles a neutralizacion mediante un panel de preparaciones de anticuerpos bien caracterizados especlficos. Dichos anticuerpos representan un "panel de anticuerpos patron". Algunos, pero no todos, los ejemplos de anticuerpos razonables que pueden constituir un panel patron se enumeran en la Tabla 4. En este modo de realizacion, se evalua la neutralizacion de virus usando celulas diana cultivadas en placas de 96 pocillos. Normalmente, las celulas diana se colocan en placas a 5.000 celulas por pocillo para HT4/CCR5/CXCR4 o 10.000 celulas por pocillo para U- 87/CD4/CCR5 y U-87/CD4/CXCR4 un dla antes de la infeccion. Antes de la infeccion, cada reservorio de virus derivado de paciente se incuba con cada una de las preparaciones de anticuerpo (normalmente durante 1 h) en el panel de anticuerpo patron. El suero o las preparaciones de anticuerpos se someten a ensayo no diluidas y en diversas diluciones (normalmente 4 o 5 diluciones 1:10 en serie). La infeccion de celulas diana con cada reservorio de virus se lleva a cabo tambien en ausencia de farmaco (sin farmaco). La neutralizacion de virus se evalua comparando la cantidad de actividad de luciferasa producida en celulas diana, tanto en presencia como en ausencia de anticuerpo. En este modo de realizacion, los resultados del ensayo se interpretan comparando la capacidad de cada anticuerpo para bloquear preferentemente la infeccion de celulas diana (reducir o eliminar la actividad de luciferasa). Se cuantifica la actividad de neutralizacion de virus observando la mayor dilucion de anticuerpo (mas diluido) que es capaz de bloquear la infeccion de celulas diana (por ejemplo, la dilucion mas alta que es capaz de reducir la actividad de luciferasa producida en ausencia de anticuerpo en un 50 %).
Caracterizacion de VIH-1 de paciente (virus de paciente frente a anticuerpo de paciente)
Este ejemplo proporciona un metodo para detectar en un paciente la evolution de una respuesta de anticuerpo neutralizante y de cepas virales que evitan la respuesta neutralizante. En este modo de realizacion, el ensayo se lleva a cabo usando una llnea celular diana que expresa el receptor CD4 de VIH-1 mas los correceptores cCR5 y CXCR4 de VIH-1 (U87/CD4/CCR5/CXCR4 o HT4/CCR5/CXCR4). Dicha llnea celular es capaz de evaluar la actividad neutralizante de anticuerpos para los virus R5-tropicos y X4-tropicos. En una realizacion relacionada, el ensayo se lleva a cabo usando dos llneas celulares diana. Una llnea celular expresa CD4 mas CCR5 (U- 87/CD4/CCR5) y se usa para someter a ensayo virus R5-tropicos. Otra llnea celular expresa CD4 mas CXCR4 (LT- 87/CD4/CXCR4) y se usa para evaluar virus X4-tropicos. El ensayo de entrada de virus se lleva a cabo infectando cultivos de celulas diana individuales con reservorios de virus recombinantes derivados de celulas hospedadoras empaquetadoras transfectadas con vectores pHIVenv y pHIVA o pHIVA DU3 . En esta realizacion, los vectores pHIVenv contienen secuencias de envoltura derivadas de virus de pacientes y expresan las protelnas de envoltura de VIH-1 (gp120SU, gp41TM). En esta realizacion, se usan poblaciones de virus diferentes para construir vectores pHIVenc. Las poblaciones de virus diferentes se derivan de muestras de plasma en serie (es decir, longitudinales) (es decir, virus recogidos del mismo paciente en diferentes momentos temporales). Se evalua VIH pseudotipado derivado de vectores pHIVenv en el ensayo de entrada de virus para determinar si son susceptibles a neutralizacion mediante un panel de anticuerpos que se derivan de muestras de plasma en serie del paciente. Por tanto, en esta realizacion, el mismo paciente es la fuente tanto de las poblaciones de virus como de los anticuerpos. En esta realizacion, se evaluan virus usando celulas diana cultivadas en placas de 96 pocillos, por ejemplo. Normalmente, las celulas diana se colocan en placas a 10.0000 celulas por pocillo para las llneas celulares U- 87/CD4/CCR5/CXCR4, U-87/CD4/CCR5 y U-87/CD4/CXCR4 o a 5.000 celulas por pocillo para la llnea celular
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HT4/CCR5/CXCR4. Las celulas diana se colocan en placas el dla de la infeccion. Antes de la infeccion de celulas diana, se preincuba cada reservorio de virus con el suero o la preparacion de anticuerpo (normalmente 1 h) que se esta evaluando. El suero o las preparaciones de anticuerpo se someten a ensayo sin diluir y en diluciones gradualmente mayores (normalmente de cuatro a cinco diluciones 1:5 o 1:10 en serie). La infeccion de celulas diana con cada reservorio de virus se lleva a cabo tambien en ausencia de anticuerpo (sin anticuerpo). La neutralizacion de virus se evalua comparando la cantidad de actividad de luciferasa producida en celulas diana, tanto en presencia como en ausencia de anticuerpo. En esta realizacion, los resultados del ensayo se determinan comparando la capacidad de anticuerpos derivados del paciente en diferentes momentos temporales para bloquear preferentemente la infeccion de celulas diana (reducir o eliminar la actividad de luciferasa) de los virus pseudotipados derivados del paciente en diferentes momentos temporales. La actividad de neutralizacion de virus se cuantifica observando la mayor dilucion de anticuerpo (mas diluido) que es capaz de bloquear la infeccion de celulas diana (por ejemplo, la dilucion mas alta que es capaz de reducir la actividad de luciferasa producida en ausencia de anticuerpo en un 50 %). Por tanto, este modo de realizacion permite someter a ensayo en un paciente la coevolucion con el tiempo de cepas de VIH inmunologicamente diferentes y la respuesta de anticuerpo neutralizante.
Este metodo se uso en un grupo de 14 pacientes sin tratamiento previo con infeccion de VIH primaria. Se tomaron muestras de plasma de cada paciente a intervalos de 2-4 meses (el seguimiento medio fue de 18 meses, con un intervalo de 6-39 meses). Se incubaron virus con diluciones 1:5 en serie de anticuerpos y se usaron para infectar celulas diana que expresaban CD4 mas los correceptores CCR5 y CXCR4. Se descubrio que 12 de los 14 pacientes generaron fuertes respuestas de anticuerpos neutralizantes al virus. Se proporcionan los datos de un paciente representativo en la Figura 10. Sin embargo, cada virus secuencial escapo de manera consistente y rapida de la respuesta de anticuerpo neutralizante concurrente. Los tltulos de neutralizacion maxima (media dilucion 1:1497, intervalo 1:339-1:4627) se desarrollaron varios meses despues de la aparicion de un virus y la respuesta permanecio elevada muchos meses, hasta anos, despues. Los tltulos de anticuerpo neutralizante fueron generalmente mayores para virus tempranos que para virus tardlos del mismo paciente. Las respuestas de neutralizacion a un virus primario R5 heterologo (JR-CSF) fueron debiles y tardlas. Las respuestas a una cepa de laboratorio X4 (NL4-3) aumentaron con el tiempo, pero variaron en intensidad entre pacientes. La magnitud de respuesta de anticuerpo neutralizante a virus autologo no se correlaciono con ARN de VIH plasmatico medio o la duracion de infeccion VIH. Por tanto, la tasa de escape de neutralizacion vlrica es notable e indica que el anticuerpo neutralizante puede ejercer un nivel previamente inapreciable de presion selectiva sobre la evolucion del virus. Estos datos conllevan importantes implicaciones para la historia natural y el desarrollo de vacunas.
Ejemplo 7: identificacion de secuencias de aminoacido de la envoltura del VIH-1 que provoquen, alteren o eviten respuestas de anticuerpo neutralizantes
Este ejemplo proporciona un medio y un metodo para identificar secuencias de aminoacido de la envoltura de VIH-1 que provocan/fomentan, o alteran, o evitan la neutralizacion mediada por anticuerpos de la infeccion de VIH-1 (tambien denominado neutralizacion de virus en la presente solicitud).
Las secuencias de envoltura derivadas de muestras de pacientes, o clones individuales derivados de muestras de pacientes, o secuencias de envoltura modificadas mediante mutagenesis dirigida para contener mutaciones especlficas, se someten a ensayo de entrada para determinar el tropismo por el correceptor tal como se describe en el Ejemplo 6.
En una realizacion, se evalua la neutralizacion mediada por anticuerpo en muestras de paciente longitudinales (virus recogidos del mismo paciente en diferentes momentos temporales). Por ejemplo, se evalua la neutralizacion de virus antes de la vacunacion, durante el programa de vacunacion, y en momentos temporales graduales tras la terminacion del programa de vacunacion. En una realizacion, se evalua la neutralizacion del virus para vacunas preventivas. En otra realizacion, se evalua la neutralizacion del virus para vacunas terapeuticas.
En otra realizacion, se evalua la neutralizacion de virus para muestras recogidas de un gran numero de pacientes diferentes. En otra realizacion, se evalua la neutralizacion de virus para muestras recogidas de un gran numero de pacientes que representan poblaciones de pacientes y virus diferentes. Dichas poblaciones de pacientes pueden incluir, sin caracter limitativo, pacientes recientemente infectados, pacientes infectados de manera cronica, pacientes con enfermedad avanzada, pacientes que se estan sometiendo a terapia antirretroviral o inmunoterapia, sujetos vacunados y no vacunados. Dichas poblaciones de virus pueden incluir, sin caracter limitativo, virus con distintas caracterlsticas geneticas (variante A, B, C, D, E, F, G), virus susceptibles a farmacos antirretrovlricos, virus con resistencia/susceptibilidad reducida a farmacos antirretrovlricos, aislados primarios o aislados adaptados para su cultivo en cultivo celular (a menudo denominados virus adaptados de laboratorio), virus inductores de sincitio (SI) o virus no inductores de sincitio (NSI), virus macrofago-tropicos (M), virus tropicos de celulas T (T) y virus con tropismo dual (M y T).
Analisis genotlpico de muestras de VIH de pacientes
Las secuencias de envoltura que representan conjuntos de muestras de pacientes, o clones derivados de conjuntos de pacientes, pueden analizarse mediante cualquier metodo de secuenciacion de ADN disponible comunmente. En
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una realizacion, se determinan secuencias de muestra de VIH del paciente usando purificacion de ARN vlrico, RT/PCR y analisis de secuenciacion del terminador de cadena dideoxinucleotido y electroforesis capilar en gel (Applied Biosystems, Foster City, CA). Las secuencias de envoltura de conjuntos de virus de pacientes o clones se comparan a secuencias de referencia, otras muestras de pacientes, o a una muestra obtenida del mismo paciente antes de la iniciacion de la terapia, si esta disponible. Se examina el genotipo para detectar secuencias que sean diferentes de las de referencia o secuencias de antes del tratamiento y se correlaciona con diferencias en la susceptibilidad a inhibidor de entrada.
Neutralizacion mediada por anticuerpo de virus geneticamente caracterizados
Las secuencias de aminoacidos de la envoltura que se correlacionan con la neutralizacion de virus se evaluan construyendo vectores de expresion de la envoltura (pHIVenv) que contienen una mutacion especlfica en un contexto genetico definido (por ejemplo, NL4-3 para tropismo X4, JRCSF para tropismo R5). Las mutaciones pueden incorporarse solas y/o en combinacion con otras mutaciones que se piense que modulan la neutralizacion de virus. Se introducen mutaciones de la envoltura en vectores pHIVenv usando cualquiera de los metodos comunmente disponibles para la mutagenesis dirigida. En una realizacion, se usa el metodo de PCR de megacebador para mutagenesis dirigida (Sarkar, G. y Summer, S.S., 1990). Se somete a ensayo un vector pHIVenv que contiene una mutacion de envoltura especlfica o grupo de mutaciones usando el ensayo de entrada de virus descrito en el Ejemplo 6. Pueden seleccionarse preparaciones de anticuerpo especlficas (es decir, preparaciones de anticuerpos monoclonales o policlonales bien caracterizados), suero de pacientes infectados con VIH, o suero de sujetos vacunados para comparar la actividad neutralizante. La neutralizacion de anticuerpos del virus que contiene mutaciones en la envoltura se compara con la neutralizacion de anticuerpo de un virus definido geneticamente que carece de las mutaciones especlficas bajo evaluacion. La capacidad de una mutacion especlfica para conferir, alterar o evitar la neutralizacion de anticuerpo se confirma o desmiente introduciendo la mutacion en el virus de referencia bien caracterizado y evaluando la neutralizacion mediada por anticuerpos del virus mutante en el ensayo de entrada de virus descrito en el Ejemplo 6. Los cambios observados en la neutralizacion del virus se atribuyen a las mutaciones especlficas introducidas en el vector pHIVenv.
En una realizacion, los determinantes geneticos de la neutralizacion de virus se identifican evaluando secuencias de aminoacidos en el bucle V3 de la protelna de envoltura de superficie gp120. Las secuencias de aminoacidos bajo evaluacion se identifican comparando las secuencias de aminoacidos de un gran numero de virus que pueden, o no pueden neutralizarse mediante diversas preparaciones de anticuerpos bien caracterizados, suero de pacientes o suero de sujetos vacunados. Se seleccionaron diferencias consistentes en secuencias de aminoacidos del bucle V3 entre virus que pueden, o no pueden neutralizarse para su evaluacion. Los virus isogenicos basados en un clon parental bien caracterizado (por ejemplo, NL4-3, HXB2, JRCSF) que contiene mutaciones "de neutralizacion de virus candidatas" en el bucle V3 de la protelna de envoltura gp120 se construyen mediante mutagenesis dirigida y se someten a ensayo para evaluar la neutralizacion mediada por anticuerpos tal como se ha descrito en el Ejemplo 6. Se infectan celulas que expresan CD4 mas CCR5 (por ejemplo, U-87/CD4/CCR5),CD4 mas CXCr4 (U- 87/CD4/CXCR4), o CD4 mas CCR5 y CXCR4 (HT4/cCR5/cXcR4). Las sustituciones de aminoacidos que cambian, provocan, alteran o evitan la neutralizacion de anticuerpos se consideran importantes para la neutralizacion de virus.
En una realizacion relacionada, los determinantes geneticos de neutralizacion de virus se identifican evaluando secuencias de aminoacidos en la protelna de envoltura de superficie gp120 completa.
En una realizacion relacionada, los determinantes geneticos de neutralizacion de virus se identifican evaluando secuencias de aminoacidos en la protelna de envoltura transmembrana gp41.
Ejemplo 8: medicion de susceptibilidad a inhibidores de la entrada de virus para controlar las decisiones sobre tratamientos
Este ejemplo proporciona un medio y un metodo para usar la susceptibilidad a inhibidores de entrada de virus para controlar el tratamiento del VIH-1. Este ejemplo proporciona ademas un medio y un metodo para usar la susceptibilidad al inhibidor de entrada de virus para controlar el tratamiento de pacientes que han recibido un tratamiento antirretroviral previo con un inhibidor de entrada de virus. La presente divulgacion proporciona ademas un medio y un metodo para usar la susceptibilidad al inhibidor de entrada de virus para controlar el tratamiento de pacientes que no han recibido un tratamiento previo con un inhibidor de entrada de virus.
En una realizacion, se usa la susceptibilidad de virus del paciente a inhibidores de la entrada de virus para controlar el tratamiento de pacientes en los que fracasan reglmenes antirretrovlricos que incluyen uno o mas inhibidores de entrada de virus. El fracaso del tratamiento (tambien denominado fracaso virologico) se define generalmente como tratamiento antivlrico parcialmente supresor que resulta en niveles detectables de virus, que se mide normalmente en el plasma de pacientes). La gula puede incluir, sin caracter limitativo, (a) clarificacion de opciones de tratamiento de farmacos disponibles, (b) selection de reglmenes de tratamiento mas activos, (c) clarificacion de la etiologla de carga vlrica creciente en pacientes tratados (es decir, pobre adherencia, resistencia al farmaco), y (d) reduction en el uso de farmacos potencialmente toxicos e inactivos. En este modo de realizacion, los vectores del ensayo de
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resistencia se derivan de muestras de virus de pacientes y se someten a ensayo para evaluar la susceptibilidad a diversos inhibidores de entrada de virus usando el ensayo de entrada de virus fenotipico. Los inhibidores de entrada de virus pueden incluir, sin caracter limitativo, inhibidores de fusion (por ejemplo, T-20, T-1249), antagonistas de correceptores (AMD3100, AMD8664, TAK779, PR0542, y compuestos peperidin-1 il butano) y antagonistas de CD4 (MAb 5A8). Las decisiones de tratamiento apropiadas se basan en los resultados del ensayo de entrada de virus (por ejemplo, vease Figura 4B) y resultados de ensayos de laboratorio relevantes adicionales e information clinica.
En otra realization, se usa la susceptibilidad de virus del paciente a inhibidores de la entrada de virus para controlar el tratamiento de pacientes que no han sido tratados previamente con regimenes antirretrovirales que incluyen uno o mas inhibidores de entrada de virus. La guia debe incluir, sin caracter limitativo, (a) clarification de opciones de tratamiento de farmacos disponibles, (b) selection de regimenes de tratamiento mas activos, (c) clarificacion de la susceptibilidad de referencia a inhibidores de entrada de virus, y (d) reduction en el uso de farmacos potencialmente toxicos e inactivos. Determinar la susceptibilidad de referencia de inhibidores de entrada de virus en pacientes que no han recibido tratamiento es importante por dos razones. Primero, la susceptibilidad natural de los virus a inhibidores de entrada puede variar ampliamente. (por ejemplo, vease Figura 4A). Segundo, el uso aumentado de inhibidores de entrada de virus resultara indudablemente en la generation de variantes resistentes al farmaco que pueden transmitirse a sujetos infectados recientemente. En este modo de realizacion, los vectores de ensayo de resistencia se derivan de muestras de virus de pacientes y se someten a ensayo de susceptibilidad a diversos inhibidores de entrada de virus usando el ensayo de entrada de virus fenotipico. Los inhibidores de entrada de virus pueden incluir, sin caracter limitativo, inhibidores de fusion (por ejemplo, T-20, T-1249), antagonistas de correceptores (AMD3100, AMD8664, TAK779, PR0542, y compuestos peperidin-1 il butano) y antagonistas de CD4 (MAb 5A8). Las decisiones de tratamiento adecuadas se basan en los resultados del ensayo de entrada de virus y resultados de ensayos de laboratorio relevantes adicionales e informacion clinica.
Ejemplo 9: medicion de tropismo por el correceptor de VIH-1 para controlar las decisiones de tratamiento
Este ejemplo proporciona un medio y un metodo para usar el tropismo por el correceptor de VIH-1 (CCR5, CXCR4) para controlar el tratamiento del VIH-1. Este ejemplo proporciona tambien un medio y un metodo para usar el tropismo por el correceptor de VIH-1 para controlar el tratamiento de pacientes en los que fracasa el tratamiento de farmacos antirretrovirales. La presente divulgation proporciona ademas un medio y metodos para usar el tropismo por el correceptor de VIH-1 para controlar el tratamiento de pacientes infectados recientemente con VIH-1.
Este ejemplo proporciona un medio y un metodo para usar el tropismo por el correceptor de virus VIH-1 para controlar el tratamiento del VIH-1. Este ejemplo proporciona ademas un medio y un metodo para usar el tropismo por el correceptor de VIH-1 para controlar el tratamiento de pacientes que han recibido un tratamiento antirretroviral previo con un inhibidor de entrada de virus. Esta divulgacion proporciona ademas el medio y un metodo para usar el tropismo por el correceptor de VIH-1 para controlar el tratamiento de pacientes que no han recibido un tratamiento previo con un inhibidor de entrada de virus.
En una realizacion, el tropismo por el correceptor de un virus de paciente se usa para controlar el tratamiento de un paciente en el que fracasan los regimenes de antirretroviricos que incluyen uno o mas antagonistas de correceptores. El fracaso del tratamiento (tambien denominado fracaso virologico) se define generalmente como tratamiento antivirico parcialmente supresor que resulta en niveles detectables de virus, que se mide normalmente en el plasma de pacientes). La guia puede incluir, sin caracter limitativo, (a) clarificacion de la etiologia de carga viral creciente en pacientes tratados (es decir, pobre adherencia, resistencia al farmaco, cambio en el tropismo por el correceptor), (b) clarificacion de opciones de tratamiento de farmacos disponibles, (c) seleccion de regimenes de tratamiento mas activos, y (d) reduccion en el uso de farmacos potencialmente toxicos e inactivos. El control de tropismo por el correceptor en pacientes que reciben tratamiento con antagonistas de CCR5 tiene importancia clinica, ya que la presion del farmaco puede resultar en un cambio a tropismo por el correceptor CXCR4. Los virus X4 (tropismo por el correceptor CXCR4) se asocian a un pronostico mas desfavorable comparado a los virus R5 (tropismo por el correceptor CCR5). En esta realizacion, los vectores del ensayo de resistencia se derivan de muestras de virus de pacientes y se someten a ensayo para evaluar la susceptibilidad a diversos antagonistas del correceptor usando el ensayo de entrada de virus fenotipico. Los antagonistas del correceptor pueden incluir, sin caracter limitativo, AMD3100, AMD8664, TAK779, PR0542, y compuestos de peperidin-lil butano. Las decisiones de tratamiento adecuadas se basan en los resultados del ensayo de entrada de virus (por ejemplo, vease Figura 4B) y resultados de ensayos de laboratorio relevantes adicionales e informacion clinica.
En otra realizacion, se usa el tropismo por el correceptor de un virus de paciente para controlar el tratamiento de pacientes que no han sido tratados previamente con regimenes antirretroviricos que incluyen uno o mas antagonistas de correceptores. La guia puede incluir, sin caracter limitativo, (a) clarificacion del tropismo por el correceptor de referencia, (b) clarificacion de opciones de tratamiento de farmacos disponibles, (c) seleccion de regimenes de tratamiento mas activos, (d) reduccion en el uso de farmacos inactivos y potencialmente toxicos. Determinar el tropismo por el correceptor de referencia tiene una importancia clinica significativa. El tratamiento con el antagonista del correceptor adecuado (tropismo R5 vs. X4), o antagonistas (tropismo dual o tropismo mixto) es probable que resulte en una respuesta mas potente y duradera. En este modo de realizacion, los vectores de ensayo de resistencia se derivan de muestras de virus de pacientes y se someten a ensayo para evaluar la susceptibilidad a
diversos inhibidores de entrada de virus usando el ensayo de entrada de virus fenotipico. Los antagonistas de correceptores pueden incluir, sin caracter limitativo, AMD3100, AMD8664, TAK779, PR0542, y compuestos de peperidin-lil butano. Las decisiones de tratamiento adecuadas se basan en los resultados del ensayo de entrada de virus y resultados de ensayos de laboratorio relevantes adicionales e informacion clinica.
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TABLA 1
CELULAS
- Celula
- Receptor
- 5.25
- CXCR4, CD4, CCR5 ( no expresadas bien ) BONZO
- 5.25 JUic4.M7
- CD4, CCR5, BONZO
- HOS.CD4.CCR5
- CD4, CCR5
- HOS.CD4.CXCR4
- CD4, CXCR4
- HOS.C3D4
- CD44 bajo nivel de expresion de CCR5 y CXCR4
- HOS HT4 R5 GFP wt
- CD4, CXCR4, CCR5
- HOS.CD4.CCR5.GEP.M7#6*
- CD4, CXCR4, CCR5
- P4.CCR5
- CD4, CXCR4, CCR5
- U87.CD4
- CD4
- U87.CD4R5
- CD4, CCR5
- US7.CD4X4
- CD4, CXCR4
- MX2
- CD4, CXCR4
- MT4
- CD4, CXCR4
- PM1
- CD4, CXCR4, CCR5
- CEm NKr CCR5
- CD4, CXCR4, CCR5
Claims (15)
- 5101520253035404550REIVINDICACIONES1. Un metodo para evaluar la neutralizacion de anticuerpos de VIH-1 que comprende:a) incubar una pluralidad de primeras celulas que comprenden cada una al menos un vector de expresion de VIH-1 que carece de un acido nucleico que codifica un polipeptido de la envoltura vlrica de VIH-1 y un acido nucleico que codifica una secuencia de polipeptidos de la envoltura vlrica de VIH-1 obtenida de un paciente, comprendiendo la secuencia de polipeptidos de la envoltura del VIH-1 del paciente dominios extracelulares y transmembrana de la protelna de la envoltura vlrica, en donde la secuencia del polipeptido de la envoltura del VIH-1 del paciente incluye o no el dominio de cola citoplasmatica (CT) intracelular o una porcion del mismo, y en donde el vector de expresion del VIH-1 puede comprender secuencias de acido nucleico que codifican un dominio de cola citoplasmatica predefinido constante; de manera que la pluralidad de las primeras celulas produce partlculas vlricas que comprenden una poblacion de dominios extracelulares y transmembrana de la protelna de la envoltura vlrica de una poblacion de virus VIH-1 del paciente;b) poner en contacto una porcion de las partlculas vlricas producidas en la etapa (a) con un anticuerpo de VIH-1;c) poner en contacto las partlculas vlricas de las etapas (a) y (b) por separado con una pluralidad de segundas celulas, en donde las segundas celulas expresan un receptor de superficie celular al que se unen las partlculas vlricas y en donde o bien las segundas celulas o el al menos un vector comprenden un acido nucleico indicador que produce una senal detectable;d) medir la cantidad de senal detectable producida por la pluralidad de las segundas celulas con el fin de determinar la infectividad de las partlculas vlricas; ye) comparar la cantidad de senal medida en la etapa (d) para las porciones de partlculas vlricas obtenidas de la etapa (a) y de la etapa (b), en donde una cantidad reducida de senal medida para las partlculas vlricas de la etaba (b) puestas en contacto con el anticuerpo en comparacion con las partlculas vlricas de la etapa (a) mantenidas en ausencia del anticuerpo indica que los virus del paciente comprenden virus que son susceptibles de neutralizacion por anticuerpos.
- 2. El metodo de la reivindicacion 1, en donde las primeras celulas comprende un acido nucleico que codifica la secuencia de polipeptidos de la envoltura vlrica de vIH-1 que comprende los dominios extracelular y transmembrana de la protelna de la envoltura vlrica insertada en un primer vector, y un segundo vector de expresion vlrica que carece del acido nucleico que codifica las secuencias de polipeptidos de la envoltura vlrica del VIH-1.
- 3. El metodo de las reivindicaciones 1 o 2, en donde el anticuerpo se obtiene de un paciente.
- 4. El metodo de las reivindicaciones 1 o 2, en donde el anticuerpo deriva de un panel de anticuerpos previamente caracterizados.
- 5. El metodo de las reivindicaciones 1 o 2, en donde el receptor es al menos uno de CD4, CXCR4 o CCR5.
- 6. El metodo de las reivindicaciones 1 o 2, en donde la pluralidad de las primeras celulas son un tipo de celula humana.
- 7. El metodo de las reivindicaciones 1 o 2, en donde las segundas celulas son una de un linfocito T humano, una celula mononuclear de sangre periferica, una celula de astroglioma o una celula de osteosarcoma humano.
- 8. El metodo de cualquiera de las anteriores reivindicaciones, en donde el acido nucleico que codifica la secuencia de polipeptidos de la envoltura vlrica de VIH-1 que comprende los dominios extracelular y transmembrana de la protelna de la envoltura vlrica y/o el vector de expresion vlrica se integra en el genoma de la primera celula.■fs.ENSAYO DE ENTRADADE VIH PHENOSENSEVECTOR DE EXPRESION DE ENVOLTURA: pHIVenUENVOLTURA DE V1H
imagen1 a/b c/dVECTOR DE EXPRESION DE VIH-1 : pHIVIutAUiimagen2 PHENOSENSE™ VIH: ENSAYOCELULARADN ADNpHIVIucAU3 pHIVenuo * oimagen3 imagen4 ANADIDGSFIG. IBESTRATEGIAS DE EXPRESION DE ENVOLTURA DE VIHimagen5 imagen6 CELULAS QUE EXPRESAN CCR5SIN FARMACOINHIBIDORCCR5INHIBIDORCXCR4SIN FARMACOINHIBIDORCCR5INHIBIDORCXCR4imagen7 REPLICA 1 REPLICA 2■ <100 RLUimagen8 100-1000 RLUimagen9 CELULAS QUE EXPRESAN CXCR4^ 1000-10,000 RLU I | >10,000 RLUFIG.3AHOJAALTERNATIVA (NORMA 26]3CELULASR5 CELU LAS X4- SIN FARMACO
- 181134; *0;
- INHIBIDOR DE RS
- 1119,258 I
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- 12,020 1
- 111
- 10,839
-
- 8.580
- 3,384
- 99
- 10
- 43
- 72
SIN FARMACO INHIBIDOR DERS INHIBIDOR DEX4M INHIB. POH INHIBIDOR DE RS % INHIB. POH INHIBIDOR DE X4- R5
- X4 R5:X4
- X\>-43-
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FIG.3BCOi—i- ri nn| i r p-ri-1 tt[ -r -i- r T- rr92HT599.2+ (X+)JRCSF (R5)imagen12 1,0E-51.0E-4 1,0£-3 1,0E-2CONCENTRACION DE FARMACO1 jOE-1FIG.4A% INH!B!CIONimagen13 - G
- I V
- 0
- I V
- G
- I M
- S
- I V
- D
- I M
- S
- I M
D T VCON CENTRA CION DE FARMACOFIG.4Bimagen14 FARMACO: INHIBIDOR DE R5 CELULA: CD4/CCR5FIG.5AcnhJimagen15 CELULA: CD4/CXCR4imagen16 AMPLIFICACION DESECUENCIA DE ENVOLTURAcnCOimagen17 FL ACTimagen18 123456 1.23456Tropismo por el correceptor N? de aislados
1. R5 -
2. R5/X4 -
3. R5 -
4. R5/X4 -
5. R5 -
6. R5/X4NP: plasma negatiuo VIH
X4 15
R5 24
X4/R5 15Indefinido35Subtipo de enwoltura Ne de aislados
--------r.—---------zj c-~ ~ -
VARIANT! A 2
VARIANT! B 7g
VARIANT! C 7VARIANT! D
VARIANT!! '
FIG.6 3HOiA ALTERNATIVA (NORMA 26)EXPRESION DE CORRECEPTOR Y RECEPTOR DE CELULA DIANAtro? * io2J- 1
- 1___ 10 ] W i ___y£!«.yj3_________
- 1
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10V 10'imagen19 WCM FifeOATA.03J10° ItTUrFIG.710° 101 TO2 to3 104GDI FTTCCD4CEL U LAS CCR5 + CKCR4imagen20 101 Vt WCM FTTCDATA.03510"'■i .......10° 101 102 10J 10* CD4 FTTCCD4CELULAS CCR5imagen21 £ 102-i. i ■ II ui |10° 101 TO2 103 104CD4 FTTCCD4CELULAS CHCR4INHIBICION POR ANTAGONISTAS DE CORRECEPTORimagen22 imagen23 LHaLUCiQCo9COmcr:Ol—□_LUuLUCtouimagen24 7iinaLUCctOqOiladoOu<C£LuLUoUimagen25 CvjJjLncdLUCcdO9DOir»□c O i— Cl LUULUCdOUNOIDI9IHNI %oooimagen26 cvl - 11. 1/1 s *LUo O_ Q=t 59i.sciO> o S U r_N <id ci. f. <(JLUCiCiO(JHOJA ALTERNATIVA (NORMA 26)PEPTIDOSINHIBIDORESDE FUSIONHIV-1^ EXTRACELULAR INTRACELULAR
imagen27 FIG.9VIRUS DEPACIENTE V. ANTICUERPOS DE PACIENTEcnFECIHA PLASMA (ANTICUERPO)- VRU5
- 2/9/99 29/11/99 29/2/00 31/5/00 30/0/00 22/n/OO 14/2/01 30/5/01 11/9/01
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FIG. 10
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