ES2396342T3 - Métodos de evaluación del tratamiento de un paciente con inhibidores de la entrada viral por medio de ensayos de virus recombinantes - Google Patents

Abstract

Un método para guiar el tratamiento de un paciente, que consta en identificar lasensibilidad de los virus de un paciente a un compuesto diseñado para inhibirla penetración de un virus en una célula al: a) Suministrar una muestra de paciente comprendiendo ácido nucleico quecodifica proteínas de la envoltura viral b) Transfectar dentro de una primera célula (i) El ácido nucleico del paso a) y (ii) Un vector de expresión viral que carece de un ácido nucleico quecodifica una proteína de la envoltura y que comprende un ácidonucleico indicador que produce una señal detectable, De manera que la primera célula produce partículas virales comprendiendoproteínas de la envoltura codificadas por el ácido nucleico del paso a); c) Poner en contacto las partículas virales producidas en el paso b) conuna segunda célula en presencia del compuesto, donde la segundacélula expresa un receptor de superficie celular al que el virus se une; d) Medir la cantidad de señal producida por la segunda célula paradeterminar la infectividad de las partículas virales; y e) Comparar la cantidad de señal medida en el paso d) con la cantidad deseñal producida en ausencia del compuesto, donde una cantidadreducida de señal medida en presencia del compuesto indica lasensibilidad de los virus de un paciente al compuesto; Donde, los compuestos a los que los virus de un paciente son sensibles pueden serutilizados en el tratamiento del paciente.

Description

METODOS DE EVALUACION DEL TRATAMIENTO DE UN PACIENTE CON INHIBIDORES DE LA ENTRADA VIRAL POR MEDIO DE ENSAYOS DE VIRUS RECOMBINANTES Descripcion [0001] A lo largo de esta solicitud, se hace referencia a varias publicaciones por autor 5 y fecha dentro del texto. Las citaciones completas de dichas publicaciones estan

enumeradas en orden alfabetico al final de la especificaci6n que precede a las reivindicaciones. CAMPO DE LA INVENCION [0002] La entrada viral es un nuevo objetivo atractivo para el tratamiento antiviral.

10 Alrededor de 10 farmacos disenados para bloquear la adhesi6n del virus o la fusi6n de la membrana estan siendo evaluados en la actualidad en estudios pre-clinicos o clinicos (Richman, 1998; PhRMA, 1999; Stephenson, 1999). Los virus animales envueltos se adhieren a la celula huesped y penetran en ella por medio de la interacci6n de proteinas virales en la membrana del viri6n (proteinas de la envoltura) y

15 proteinas de la superficie celular (receptores de virus). El reconocimiento y la uni6n de los receptores son intercedidos por la proteina de envoltura de la superficie.

BREVE RESUMEN DE LA INVENCION [0003] Esta revelaci6n alude a un ensayo fenotipico rapido y sensible que mide la sensibilidad de un virus a los inhibidores de la entrada viral.

20 [0004] Esta revelaci6n alude a un sistema de vectores retrovirales que produce particulas virales que contienen proteinas de la envoltura viral derivadas de una variedad de fuentes y a la identificaci6n de lineas celulares que expresan receptores virales y son permisivas para la replicaci6n viral. [0005] Esta revelaci6n alude a un vector de expresi6n para la envoltura viral que es

25 capaz de aceptar segmentos derivados de pacientes que codifican los genes de la envoltura. [0006] Esta revelaci6n alude a un vector bioseguro que representa la mayor parte del genoma viral del VIH-1, pero que transporta un gen reportero luciferasa en lugar de la regi6n de la envoltura.

30 [0007] Esta revelaci6n alude a un ensayo fenotipico que reduce la probabilidad de formar VIH-1 infeccioso recombinante al proporcionar un vector de expresi6n viral que transporta una deleci6n en una regi6n transcripcional reguladora (la copia 3' de U3) del genoma del VIH-1. [0008] Esta revelaci6n alude a un ensayo capaz de identificar y determinar el tropismo

35 por el receptor/correceptor, que identifica rapidamente y con precisi6n a los pacientes infectados por cepas del virus tr6pico.

[0009] La presente invenci6n proporciona un metodo para guiar el tratamiento de un paciente que comprende la identificaci6n de la sensibilidad de los virus de un paciente a un compuesto disenado para inhibir la penetraci6n de un virus en una celula al:

a) Suministrar una muestra del paciente compuesta por acido nucleico 5 que codifica las proteinas de la envoltura viral b) Transfectar dentro de una primera celula

i. El acido nucleico del paso a) y

ii. Un vector de expresi6n viral que carece de un acido nucleico que codifica una proteina de la envoltura y que comprende un

10 acido nucleico indicador que produce una senal detectable, tal que la primera celula produce particulas virales que constan de las proteinas de la envoltura codificadas por el acido nucleico del paso a); c) Poner en contacto las particulas virales producidas en el paso b) con

una segunda celula en presencia del compuesto, en el cual la segunda 15 celula expresa un receptor de la superficie celular al que el virus se une; d) Medir la cantidad de senal producida por la segunda celula para determinar la infectividad de las particulas virales; y e) Comparar la cantidad de senal medida en el paso d) con la cantidad de

20 senal producida en ausencia del compuesto, en el cual una cantidad reducida de senal medida en presencia del compuesto indica la sensibilidad de los virus de un paciente al compuesto;

en el cual, los compuestos a los que los virus de un paciente son sensibles pueden ser utilizados en el tratamiento del paciente. 25 BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS

[0010] Figura 1A. Estructura de los vectores de expresi6n viral y vectores de expresi6n de la envoltura El vector de expresi6n de la envoltura del VIH-1 (pHIUVenv) es modificado para

30 aceptar las secuencias de la envoltura que han sido amplificadas desde muestras de plasma de paciente. Las designaciones a/b y c/d se refieren a sitios de endonucleasa de restricci6n que se encuentran en los extremos ' y 3' de la poliproteina de la envoltura del VIH-1 (gp1�0). El vector de expresi6n del VIH (pHIVIucAU3) codifica todas las proteinas del VIH a excepci6n de la poliproteina

35 de la envoltura. Una parte del gen de la envoltura se ha eliminado para alojar un cassette genico indicador. La "luciferasa de luciernaga" que se utiliza para controlar la habilidad de un virus de reproducirse en presencia o ausencia de farmacos antivirales. La regi6n 3' U3 se ha eliminado parcialmente para prevenir la transcripci6n desde la repetici6n terminal larga (LTR) ' en celulas infectadas. El virus producido en este sistema es limitado a una (nica ronda de replicaci6n.

5 Figura 1B. Ensayo de entrada basado en la celula Las pruebas de sensibilidad farmacol6gica, tropismo por el correceptor y neutralizaci6n viral se realizan mediante la cotransfecci6n de pHIVenv y pHIVIucAU3 en la celula huesped. La celula huesped produce particulas de VIH pseudotipadas con secuencias de la envoltura del VIH derivadas del virus de

10 prueba o de la muestra de paciente. Las particulas virales se recogen (-48h) despues de la transfecci6n y se utilizan para infectar celulas diana que expresan los receptores (ej. CD4) y los correceptores (ej. CXCR4, CCR�) del VIH. Despues de la infecci6n (-��h), las celulas diana se lisan y la actividad de luciferasa se mide. El VIH tiene que completar una ronda de replicaci6n para

15 infectar la celula huesped diana con exito y producir actividad de luciferasa. Si el virus es incapaz de penetrar en la celula diana, la actividad de luciferasa disminuye. Este sistema se puede utilizar para evaluar la sensibilidad a los inhibidores de entrada, el tropismo por el receptor y por el correceptor y la neutralizaci6n viral.

20 Figura 2. Vectores de expresi6n de la envoltura del VIH Las secuencias de la envoltura del VIH se amplifican desde muestras de paciente y se insertan dentro de vectores de expresi6n por medio de sitios de endonucleasa de restricci6n (�' a/b y 3' c/d). La transcripci6n de la envoltura es conducida por el gen temprano promotor del citomegalovirus (CMV) humano. El

25 ARN de la envoltura es poliadenilado mediante una secuencia de senal (A+) de la poliadenilaci6n del virus del simio 40 (SV40). Un intr6n que se encuentra entre el promotor del CMV y las secuencias de la envoltura del VIH esta disenado para incrementar los niveles de ARNm de la envoltura en celulas transfectadas. FL-expresa proteinas de la envoltura de longitud completa

30 (gp1�0, gp41). ACT-expresa proteinas de la envoltura (gp1�0, gp41) que carecen del dominio de la cola citoplasmatica del C-terminal de gp41. +CTexpresa proteinas de la envoltura (gp1�0, gp41) que contienen un dominio constante y predefinido de la cola citoplasmatica de gp41. gp1�0-expresa proteinas gp1�0 derivadas del paciente junto con una gp41 constante

35 predefinida. gp41- expresa una constante predefinida gp1�0 junto con las proteinas gp41 derivadas del paciente.

Figura 3A. Ensayo de evaluaci6n del tropismo por el correceptor En esta figura, los ensayos se realizan mediante dos lineas celulares. Una linea celular expresa CD4 mas CCR� (los seis cuadros de arriba). La otra linea celular expresa CD4 y CXCR4 (los seis cuadros de abajo). El ensayo se realiza

5 mediante la infecci6n de celulas con un gran n(mero de reservas de virus recombinantes derivadas de celulas transfectadas con los vectores pHIVenv y pHIVlucAU3. El ejemplo que se muestra representa el analisis de 9� virus en formato de placas de 9 pocillos. Las infecciones se realizan en ausencia de farmacos (sin farmacos) o en presencia de un farmaco que inhibe

10 preferiblemente o a los virus tr6picos R� (inhibidor de CCR�) o a los virus tr6picos X4 (inhibidor de CXCR4). El tropismo por el correceptor se eval(a mediante la comparaci6n de la cantidad de actividad de luciferasa producida en cada tipo de celula, tanto en presencia como en ausencia de farmaco (ver Figura 3B para la interpretaci6n de los resultados del ensayo).

15 Figura 3B. Determinaci6n del tropismo el correceptor En esta figura, los resultados del ensayo se interpretan mediante la comparaci6n de la habilidad de cada virus de muestra de infectar (producir actividad de luciferasa) en celulas que expresan CD4/CCR� (celulas R�) o celulas que expresan CD4/CXCR4 (celulas X4). Tambien se eval(a la habilidad de un

20 inhibidor de CCR� o CXCR4 de bloquear selectivamente la infecci6n (inhibir actividad de luciferasa). Los virus tr6picos X4 (cuadros verdes) infectan las celulas X4, pero no las celulas R�. La infecci6n de las celulas X4 es bloqueada por el inhibidor de CXCR4. Los virus tr6picos R� (cuadros azules) infectan las celulas R�, pero no las celulas X4. La infecci6n de las celulas R� es bloqueada

25 por el inhibidor de CCR�. Los virus tr6picos duales o mixtos X4/R (cuadros amarillos) infectan las celulas X4 y R �. La infecci6n de las celulas R� es bloqueada por el inhibidor de CCR� y la infecci6n de las celulas X4 es bloqueada por el inhibidor de CXCR4. Los virus no viables (cuadros rojos) no se reproducen ni en celulas X4 ni en celulas R�.

30 Figura 4A. Medici6n de la sensibilidad a los inhibidores de entrada: Inhibidor de fusi6n En esta figura, se demuestra la sensibilidad al inhibidor de fusi6n T-0. Las celulas que expresan CD4, CCR� y CXCR4 fueron infectadas en ausencia de T

�0 y sobre una amplia gama de concentraciones de T-�0 (eje de x escala log10). 35 El porcentaje de inhibici6n de replicaci6n viral (eje de y) se determin6 mediante la comparaci6n de la cantidad de luciferasa producida en las celulas infectadas

en presencia de T-�0 con la cantidad de luciferasa producida en ausencia de T

�0. Los virus tr6picos R�, X4 y los virus tr6picos duales fueron examinados. La sensibilidad a los farmacos se cuantific6 al determinar la concentraci6n de T-�0 requerida para inhibir la replicaci6n viral en un �0� (IC �0 esta expresado con

5 lineas verticales discontinuas).Los virus con valores de IC �0 mas bajos son mas sensibles a T-�0 que los virus con valores de IC �0 mas altos. NL4-3: cepa bien identificada de X4 tr6pico. JRCSF: cepa bien identificada de R� tr6pico. 91US00�.11: cepa aislada de R� tr6pico obtenido del Programa de Referencia de Reactivos de Investigaci6n del SIDA del Instituto Nacional de Salud de los

10 Estados Unidos (NIH AIDS Research Reagent Reference Program, ARRRP). 9�HT �93.1: cepa aislada tr6pica dual (X4R� ) obtenido del NIH ARRRP. 9�HT �99. �4: cepa aislada de X4 tr6pico obtenido del NIH ARRRP. Figura 4B. Medici6n de la sensibilidad a los inhibidores de entrada: Mutaciones de resistencia farmacol6gica

15 En esta figura, se demuestra la sensibilidad reducida al inhibidor de fusi6n T-�0 otorgada por mutaciones de resistencia farmacol6gica especificas en la proteina de la envoltura gp41. Las celulas que expresan CD4, CCR� y CXCR4 fueron infectadas en ausencia de T-�0 y sobre una amplia gama de concentraciones de T-0 (eje de x escala log10). El porcentaje de inhibici6n de replicaci6n viral (eje

20 de y) se determin6 mediante la comparaci6n de la cantidad de luciferasa producida en las celulas infectadas en presencia de T-�0 con la cantidad de luciferasa producida en ausencia de T-�0. Los virus isogenicos que contienen una mutaci6n especifica o dos en la proteina transmembrana de la envoltura gp41 se examinaron (resaltados en rojo en la leyenda de figuras). La sensibilidad

25 a los farmacos se cuantifica al determinar la concentraci6n de T-�0 requerida para inhibir la replicaci6n viral en un �0� (IC �0 esta expresado con lineas verticales discontinuas). Los virus con valores de IC �0 mas bajos son mas sensibles a T-�0 quelos virus con valores de IC �0 mas altos. Sin mutaciones (secuencia de tipo salvaje): GIV

30 Mutaciones simples: GIV, DIM, SIV Mutaciones dobles: DIM, SIM, DTV Figura 5A. Medici6n de la sensibilidad a los inhibidores de entrada: Inhibidor de CCR� En esta figura, se demuestra la sensibilidad al inhibidor de CCR� (compuesto de

35 Merck). Las celulas que expresan CD4 y CCR� (celulas R�) fueron infectadas en ausencia del inhibidor de CCR� y sobre una amplia gama de concentraciones

del inhibidor de CCR� (eje de x escala log10). El porcentaje de inhibici6n de replicaci6n viral (eje de y) se determin6 mediante la comparaci6n de la cantidad de luciferasa producida en las celulas infectadas en presencia del inhibidor de CCR� con la cantidad de luciferasa producida en ausencia del inhibidor de 5 CCR�. Los virus tr6picos R�, X4 y los virus tr6picos duales fueron examinados. La sensibilidad a los farmacos se cuantific6 al determinar la concentraci6n del inhibidor de CCR� requerida para inhibir la replicaci6n viral en un �0� (IC �0 esta expresado con lineas verticales discontinuas). Losvirus con valores de IC �0mas bajos son mas sensibles al inhibidor de CCR� que los virus con valores de IC �0

10 mas altos. El virus tr6pico X4 no infect6 las celulas R�. NL4-3: cepa bien identificada de X4 tr6pico. JRCSF: cepa bien identificada de R� tr6pico. 9�HT �93.1: cepa aislada tr6pica dual (X4R� ) obtenido del NIH ARRRP. Figura 5B. Medici6n de la sensibilidad a los inhibidores de entrada: Inhibidor de CXCR4

15 En esta figura, se demuestra la sensibilidad al inhibidor de CXCR4 (AMD3100). Las celulas que expresan CD4 y CXCR4 (celulas X4) fueron infectadas en ausencia del inhibidor de CXCR4 y sobre una amplia gama de concentraciones del inhibidor de CXCR4 (eje de x escala log10). El porcentaje de inhibici6n de replicaci6n viral (eje de y) se determin6 al comparar la cantidad de luciferasa

20 producida en las celulas infectadas en presencia del inhibidor de CXCR4 con la cantidad de luciferasa producida en ausencia del inhibidor de CXCR4. Los virus tr6picos R�, X4 y los virus tr6picos duales fueron examinados. La sensibilidad a los farmacos se cuantific6 al determinar la concentraci6n del inhibidor de CXCR4 requerida para inhibir la replicaci6n viral en un �0� (IC �0 esta expresado con

25 lineas verticales discontinuas).Los virus con valores de IC �0 mas bajos son mas sensibles a CCR� que los virus con valores de IC �0 mas altos. El virus tr6pico R� no infect6 a las celulas X4. NL4-3: cepa bien identificada de X4 tr6pico. JRCSF: cepa bien identificada de R� tr6pico.

30 9�HT �93.1: cepa aislada tr6pica dual (X4R� ) obtenido del NIH ARRRP. Figura 6. Sensibilidad a los inhibidores de entrada: Inhibidor de fusi6n Esta figura demuestra que los amplicones que corresponden a la secuencia de la envoltura de longitud larga o la secuencia de la envoltura eliminada de la cola citoplasmatica son generados. Los n(meros de las filas corresponden al

35 tropismo por el correceptor mostrado al lado de cada n(mero a la derecha de los geles.

Figura 7. Sensibilidad reducida: Se muestran los diagramas de dispersi6n de los inhibidores de fusi6n que indican los resultados de los ensayos de citofluorometria de flujo (fluorescence activated cell sorting o FACS) en los que se utilizan anticuerpos contra CCR� 6 CXCR4 (mostrados en la eje de y). Las

5 lineas celulares expresan los correceptores enumerados debajo de los diagramas y el fluorescente de CD4 aparece a lo largo del eje de x. El anticuerpo anti-CXCR4 se une con mas fuerza con las celulas que expresan el correceptor correspondiente, CXCR4. Figura 8. Sensibilidad a los inhibidores de entrada: La inhibici6n del inhibidor de

10 CCR� se muestra despues de la administraci6n de los antagonistas de los correceptores. Figura 9. Sensibilidad a los inhibidores de entrada: El mapa del inhibidor de CXCR4 y la secuencia de aminoacidos se muestran para un peptido que es un inhibidor de fusi6n entra una membrana viral y una membrana celular.

15 Figura 10. Inhibici6n por medio de los antagonistas de los correceptores. Figura 11. Mutaciones de resistencia a T-�0. Figura 12. Identificaci6n de las mutaciones de resistencia a los inhibidores de entrada. Figura 13. Peptidos inhibidores de fusi6n.

20 [0011] La invenci6n, con sus caracteristicas particulares, puede quedar mas clara despues la descripci6n detallada siguiente que esta relacionada con las figuras y ejemplos adjuntos. DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION [0012] Esta invenci6n proporciona un metodo para guiar el tratamiento de un paciente,

25 que comprende la identificaci6n de la sensibilidad de los virus de un paciente a un compuesto disenado para inhibir la penetraci6n de un virus en una celula al: (a) suministrar una muestra de paciente compuesta por acido nucleico que codifica las proteinas de la envoltura viral; (b) transfectar dentro de una primera celula (i) el acido nucleico del paso (a) y (ii) un vector de expresi6n viral que carece de un acido nucleico

30 que codifica una proteina de la envoltura y que comprende un acido nucleico indicador que produce una senal detectable, tal que la primera celula produce particulas virales que constan de proteinas de la envoltura codificadas por el acido nucleico del paso (a);

(c) poner en contacto las particulas virales producidas en el paso (b) con una segunda celula en presencia del compuesto, en el cual la segunda celula expresa un receptor

35 de la superficie celular al que el virus se une; (d) medir la cantidad de senal producida por la segunda celula para determinar la infectividad de las particulas virales; y (e) comparar la cantidad de senal medida en el paso (d) con la cantidad de senal producida en ausencia del compuesto, en el cual una cantidad reducida de senal medida en presencia del compuesto indica la sensibilidad de los virus de un paciente al compuesto; en el cual, los compuestos a los que los virus de un paciente son

5 vulnerables pueden ser utilizados en el tratamiento del paciente. [0013] En un modo de realizaci6n de esta invenci6n, el acido nucleico indicador comprende un gen indicador. En otro modo de realizaci6n de esta invenci6n, el gen indicador es un gen de luciferasa. [0014] En un modo de realizaci6n de esta invenci6n, el receptor de la superficie celular

10 es CD4. En un modo de realizaci6n de esta invenci6n, el receptor de la superficie celular es un receptor de quimiocina. En un modo de realizaci6n de esta invenci6n, el receptor de la superficie celular es CXCR4 o CCR�. [0015] En un modo de realizaci6n de esta invenci6n, el paciente es infectado por el virus del VIH-1, un virus de la hepatitis (como el virus VHC o VHB), o cualquier otro

15 virus. [0016] En un modo de realizaci6n de esta invenci6n, el acido nucleico del paso (a) comprende ADN que codifica gp1�0 y gp41. [0017] En un modo de realizaci6n de esta invenci6n, el vector de expresi6n viral comprende acido nucleico del VIH.

20 [0018] En un modo de realizaci6n de esta invenci6n, el vector de expresi6n viral comprende un gen gag-pol del VIH. [0019] En un modo de realizaci6n de esta invenci6n, el vector de expresi6n viral comprende ADN que codifica vif, vpr, tat, rev, vpu y nef. [0020] En un modo de realizaci6n de esta invenci6n, la primera celula es una celula de

25 mamifero. [0021] En un modo de realizaci6n de esta invenci6n, la celula de mamifero es una celula humana. [0022] En un modo de realizaci6n de esta invenci6n, la celula humana es una celula de rin6n embrionaria humana.

30 [0023] En un modo de realizaci6n de esta invenci6n, la celula de rin6n embrionaria humana es una celula 93. [0024] En un modo de realizaci6n de esta invenci6n, la segunda celula es un linfocito T humano. [0025] En un modo de realizaci6n de esta invenci6n, la segunda celula es una linea

35 celular de leucemia de linfocitos T humanos. [0026] En un modo de realizaci6n de esta invenci6n, la segunda celula es una celula

mononuclear de sangre periferica. [0027] En un modo de realizaci6n de esta invenci6n, la segunda celula es una celula de astroglioma. [0028] En un modo de realizaci6n de esta invenci6n, la celula de astroglioma es una

5 celula U8�. [0029] En un modo de realizaci6n de esta invenci6n, la segunda celula es una celula de osteosarcoma humano. [0030] En un modo de realizaci6n de esta invenci6n, la celula de osteosarcoma humano es una celula HT4.

10 [0031] En un modo de realizaci6n de esta invenci6n, el compuesto se une al receptor de la superficie celular. [0032] En un modo de realizaci6n de esta invenci6n, el compuesto es un ligando del receptor de superficie celular. [0033] En un modo de realizaci6n de esta invenci6n, el compuesto comprende un

15 anticuerpo. [0034] En un modo de realizaci6n de esta invenci6n, el compuesto inhibe la fusi6n de la membrana. [0035] En un modo de realizaci6n de esta invenci6n, el compuesto es un peptido, un peptido-mimetico, una molecula organica o un compuesto sintetico.

20 [0036] En un modo de realizaci6n de esta invenci6n, el compuesto se une a la proteina de la envoltura viral. [0037] Tambien se revela un metodo para hacer una composici6n que comprende la mezcla del compuesto identificado por el metodo de examen (metodo para guiar el tratamiento de un paciente descrito aqui con un portador).

25 [0038] El portador puede ser una soluci6n salina, polietilenglicol, un tamp6n quimico, un almid6n o un disolvente organico. [0039] Un metodo para identificar un receptor de la superficie celular que esta unido por un virus sobre el que la infecci6n de una celula por el virus puede comprender: (a) la obtenci6n de particulas virales que comprenden (i) un acido nucleico viral y (ii) un

30 acido nucleico indicador que produce una senal detectable; (b) el contacto una celula que expresa un receptor de la superficie celular con las particulas virales del paso (a); y (c) la medici6n de la cantidad de senal detectable producida dentro de la celula, en la cual la producci6n de la senal indica que el receptor de la superficie celular expresado por la celula esta unido al virus, determinando, asi, que el receptor de superficie

35 celular esta unido por el virus a la infecci6n de la celula. [0040] Un metodo para identificar si un anticuerpo inhibe la entrada de un virus a una

celula puede comprender: (a) la obtenci6n de acido nucleico que codifica una proteina de la envoltura viral de un paciente infectado por un virus; (b) la cotransfecci6n dentro de una primera celula de (i) el acido nucleico del paso (a) y (ii) un vector de expresi6n viral que carece de un acido nucleico que codifique una proteina de la envoltura y que 5 comprende un acido nucleico indicador que produce una senal detectable, tal que la primera celula produce particulas virales que comprenden la proteina de la envoltura codificada por el acido nucleico obtenido del paciente; (c) el contacto de las particulas virales producidas en el paso (b) con una segunda celula en presencia del anticuerpo, en el cual la segunda celula expresa un receptor de la superficie celular al que el virus 10 se une; (d) la medici6n de la cantidad de senal producida por la segunda celula para determinar la infectividad de las particulas virales; y (e) la comparaci6n de la cantidad de senal medida en el paso (d) con la cantidad de senal producida en ausencia del compuesto, en el cual una cantidad reducida de senal medida en presencia del anticuerpo indica que el anticuerpo inhibe la penetraci6n del virus en la segunda

15 celula. [0041] Un metodo para determinar la sensibilidad de un virus a un compuesto que inhibe la penetraci6n viral en una celula puede comprender: (a) la obtenci6n de acido nucleico que codifica una proteina de la envoltura viral de un paciente infectado por el virus; (b) la cotransfecci6n dentro de una primera celula de (i) el acido nucleico del

20 paso (a) y (ii) un vector de expresi6n viral que carece de un acido nucleico que codifica una proteina de la envoltura y que comprende un acido nucleico indicador que produce una senal detectable, tal que la primera celula produce particulas virales que comprenden la proteina de la envoltura codificada por el acido nucleico obtenido del paciente; (c) el contacto de las particulas virales producidas en el paso (b) con una

25 segunda celula en presencia del anticuerpo, en el cual la segunda celula expresa un receptor de la superficie celular al que el virus se une; (d) la medici6n de la cantidad de senal producida por la segunda celula para determinar la infectividad de las particulas virales; y (e) la comparaci6n de la cantidad de senal medida en el paso (d) con la cantidad de senal producida en ausencia del compuesto, en el cual una cantidad

30 reducida de senal medida en presencia del compuesto indica que el virus es sensible al compuesto. [0042] Un metodo para determinar la resistencia de un virus a un compuesto que inhibe la penetraci6n viral en una celula puede comprender: (a) la determinaci6n de la sensibilidad de un virus a un compuesto seg(n el metodo de la reivindicaci6n 33, en el

35 cual un acido nucleico que codifica una proteina de la envoltura viral se obtiene de un paciente en una primera ocasi6n; (b) la determinaci6n de la sensibilidad del virus al compuesto seg(n el metodo de la reivindicaci6n 33, en el cual el acido nucleico que codifica la proteina de la envoltura viral se obtiene del paciente en una posterior segunda ocasi6n; y (c) la comparaci6n de las sensibilidades determinadas en los pasos (a) y (b), en los cuales una disminuci6n de la sensibilidad en una posterior

5 segunda ocasi6n indica la resistencia del virus al compuesto. [0043] Un metodo para identificar una mutaci6n en un virus que confiere resistencia a un compuesto que inhibe la penetraci6n viral en una celula puede comprender: (a) la determinaci6n de la secuencia del acido nucleico o de la secuencia de aminoacidos del virus antes de cualquier tratamiento del virus con el compuesto; (b) la obtenci6n de

10 un virus resistente al compuesto; (c) la determinaci6n de la secuencia de acido nucleico o de la secuencia de aminoacidos del virus resistente del paso (b); y (d) la comparaci6n de la secuencia de acido nucleico o de las secuencias de aminoacidos de los pasos (a) y (c), respectivamente, para identificar la mutaci6n en el virus que confiere resistencia al compuesto.

15 [0044] El virus obtenido en el paso (b) puede ser el virus del paso (a) cultivado en presencia del compuesto hasta que se desarrolla resistencia. [0045] El virus obtenido en el paso (b) puede estar aislado de un paciente que se ha estado sometiendo a un tratamiento con el compuesto. [0046] S6lo para contexto.

20 [0047] Estos metodos pueden servir para medir con precisi6n y reproducibilidad la sensibilidad del VIH-1 a los inhibidores de la entrada viral. [0048] Estos metodos pueden servir para medir con precisi6n y reproducibilidad el tropismo del VIH-1 por el correceptor. [0049] Estos metodos pueden servir para medir con precisi6n y reproducibilidad la

25 neutralizaci6n del VIH-1 con anticuerpos. [0050] Estos metodos pueden servir para descubrir, optimizar y caracterizar farmacos novedosos o nuevos que estan dirigidos a varios pasos definidos y todavia indefinidos en el proceso de adhesi6n y de penetraci6n del virus. [0051] Estos metodos pueden servir para descubrir, optimizar y caracterizar vacunas

30 contra el VIH-1 (o preventivas, o terapeuticas) que estan dirigidas a varios pasos definidos y todavia indefinidos en la adhesi6n del virus y el proceso de penetraci6n. [0052] Estos metodos pueden servir para identificar sustituciones/mutaciones de aminoacidos en las proteinas de la envoltura del VIH-1 (gp41TM y gp1�0SU) que alteran la sensibilidad a los inhibidores de la entrada viral.

35 [0053] Estos metodos pueden servir para cuantificar el efecto que tienen las mutaciones especificas de la envoltura del VIH-1 en la sensibilidad a los inhibidores de la entrada viral. [0054] Estos metodos pueden servir para determinar sustituciones/mutaciones de aminoacidos de la envoltura del VIH-1 que se observan con frecuencia, solas o en

5 combinaci6n, en virus que presentan una sensibilidad alterada a los inhibidores de la entrada viral. [0055] Estos metodos pueden servir para identificar las sustituciones/mutaciones de aminoacidos en las proteinas de la envoltura del VIH-1 (gp41TM y gp1�0SU) que alteran el tropismo por el receptor o correceptor.

10 [0056] Estos metodos pueden servir para cuantificar el efecto que tienen las mutaciones especificas de la envoltura del VIH-1 en el tropismo por el receptor o correceptor. [0057] Estos metodos pueden servir para identificar las sustituciones/mutaciones de aminoacidos de la envoltura del VIH-1 que se observan con frecuencia, solas o en

15 combinaci6n, en virus que presentan tropismo por los correceptores CXCR4 o CCR�. [0058] Estos metodos pueden servir para identificar las sustituciones/mutaciones de aminoacidos en las proteinas de la envoltura del VIH-1 (gp41TM y gp1�0SU) que alteran la neutralizaci6n con anticuerpos. [0059] Estos metodos pueden servir para cuantificar el efecto que tienen las

20 mutaciones especificas de la envoltura del VIH-1 en la neutralizaci6n con anticuerpos. [0060] Estos metodos pueden servir para identificar las sustituciones/mutaciones de aminoacidos de la envoltura del VIH-1 que se observan con frecuencia, solas o en combinaci6n, en virus que presentan neutralizaci6n viral con anticuerpos. [0061] Estos metodos pueden servir para identificar anticuerpos que se observan con

25 frecuencia en virus de muestras de pacientes que son capaces de neutralizar el VIH-1. [0062] Estos metodos pueden servir para la identificaci6n de virus que requieren la uni6n a CD4 para la infecci6n. [0063] Estos metodos pueden servir para la identificaci6n de virus que no requieren la uni6n a CD4 para la infecci6n.

30 [0064] Estos metodos pueden servir para identificar la incidencia de muestras de pacientes que presentan una infecci6n independiente de CD4. [0065] Estos metodos pueden servir para la identificaci6n de virus que requieren la uni6n a CD8 para la infecci6n. [0066] Estos metodos pueden servir para identificar la incidencia de virus de pacientes

35 que presentan una infecci6n dependiente de CD8.

[0067] Estos metodos pueden servir para la identificaci6n de virus que requieren la uni6n al receptor de quimiocina CXCR4, la uni6n del receptor de quimiocina CCR� o la uni6n de CXCR4 o CCR (tr6pico dual) para la infecci6n. [0068] Estos metodos pueden servir para identificar la incidencia de virus que

5 requieren la uni6n al receptor de quimiocina CXCR4, la uni6n al receptor de quimiocina CCR� o la uni6n de CXCR4 o CCR� (tr6pico dual) para la infecci6n. [0069] Estos metodos pueden servir para identificar las sustituciones/mutaciones de aminoacidos de la envoltura del VIH-1 que se observan con frecuencia, solas o en combinaci6n, en virus que presentan (a) una sensibilidad alterada a los inhibidores de

10 la entrada viral, (b) tropismo por los correceptores CXCR4 o CCR� y (c) neutralizaci6n viral con anticuerpos. [0070] En un modo de realizaci6n preferido, esta invenci6n proporciona un medio y metodo para utilizar la sensibilidad a los inhibidores de la entrada viral para guiar el tratamiento del VIH-1.

15 [0071] En un modo de realizaci6n preferido, esta invenci6n tambien proporciona el medio y metodo para utilizar la sensibilidad a los inhibidores de la entrada viral para guiar el tratamiento de pacientes en los que el tratamiento con farmacos antirretrovirales ha fallado. [0072] En un modo de realizaci6n preferido, esta invenci6n tambien proporciona los

20 medios y metodos para utilizar la sensibilidad a los inhibidores de la entrada viral para guiar el tratamiento de pacientes recien infectados por el VIH-1. [0073] En un modo de realizaci6n preferido, esta invenci6n tambien proporciona un medio y metodo para utilizar el tropismo del VIH-1 por el correceptor para guiar el tratamiento del VIH-1 o para guiar el tratamiento de pacientes en los que el tratamiento

25 con farmacos antirretrovirales ha fallado. [0074] En un modo de realizaci6n preferido, esta invenci6n tambien proporciona el medio y metodo para utilizar el tropismo del VIH-1 por el correceptor para guiar el tratamiento de pacientes recien infectados por el VIH-1. [0075] Estos metodos pueden servir para medir la neutralizaci6n del VIH-1 con

30 anticuerpos para controlar la respuesta inicial de los anticuerpos protectores despues de la vacunaci6n. [0076] Estos metodos pueden servir para medir la neutralizaci6n del VIH-1 con anticuerpos para controlar la respuesta inicial de los anticuerpos terapeuticos despues de la vacunaci6n.

35 [0077] Estos metodos pueden servir para medir la neutralizaci6n del VIH-1 con anticuerpos con el paso del tiempo para controlar la durabilidad de la respuesta inicial

de los anticuerpos protectores despues de la vacunaci6n. [0078] Estos metodos pueden servir para medir la neutralizaci6n del VIH-1 con anticuerpos para desarrollar y optimizar el calendario de vacunaci6n de estimulo primario que maximizan la potencia y la durabilidad de la vacunaci6n.

5 [0079] Por ejemplo, en el caso del VIH-1, la proteina SU (gp1 0-SU) esta estrechamente asociada con la proteina transmembrana de la envoltura (gp41-TM) que ancla el complejo a la membrana viral. Las proteinas de la envoltura gp1�0 y gp41 estan derivadas mediante escisi6n de gp1�0, el precursor sin escindir del gen de la envoltura. La uni6n del VIH-1 a su receptor celular (CD4) y a su correceptor (o CCR� o

10 CXCR4) promueve cambios de conformaci6n en la proteina TM que dan lugar a la fusi6n de la membrana viral y la celular y la penetraci6n de la capside viral en el citoplasma (Retroviruses, 199�). Aunque los nuevos inhibidores de la entrada del VIH se dirigen a las proteinas de la envoltura viral (gp1� 0/gp41) o las proteinas del huesped (CD4, CCR�, CXCR4), se supone que la mayoria de las mutaciones

15 asociadas con la resistencia en el VIH-1 se encuentran en el gen de la envoltura viral, ej. una forma probable en que los virus podrian evolucionar cambiara la utilizaci6n del correceptor. Los bloqueadores de entrada constituyen una clase novedosa de farmacos antirretrovirales, y tienen un potencial alto para una ofrecer una amplia actividad contra las actuales variantes de VIH-1 resistentes a m(ltiples farmacos.

20 Dentro de la clase de los posibles bloqueadores de la entrada viral, se encuentran los inhibidores de fusi6n, los antagonistas del receptor/correceptor y las vacunas. [0080] Sin embargo, es probable que los inhibidores de la entrada viral generen virus resistentes a los farmacos (a traves de la mutaci6n del gen de la envoltura) y compliquen, asi, el tratamiento del paciente de forma similar a lo observado en el

25 tratamiento del VIH con inhibidores de la proteasa (Protease Inhibitor, PRI) e inhibidores de la transcriptasa inversa (Reverse Transcriptase Inhibitor, RTI). De hecho, la aprobaci6n de la agencia de Administraci6n de Alimentos y Medicamentos del gobierno de los Estados Unidos (Food and Drug Administration o FDA) de cualquier otro farmaco nuevo que bloquee la entrada viral requerira la evaluaci6n de

30 los datos de resistencia. La necesidad de una prueba de diagn6stico que mida la sensibilidad a los bloqueadores de entrada ha sido documentada en el caso del inhibidor de fusi6n T-�0. Los virus que presentan una sensibilidad reducida a T-�0 se han registrado despues del paso in vitro en presencia del farmaco. En este momento, no hay disponibles ensayos fenotipicos convenientes que sean capaces de medir la

35 sensibilidad a los farmacos que bloquean la entrada viral. En consecuencia, los medicos pronto se enfrentaran con el desafio de adaptar la terapia en ausencia de las herramientas necesarias para tratar la sensibilidad a los farmacos. Por lo tanto, un ensayo fiable que eval(e con precisi6n la sensibilidad a los farmacos que inhiben la entrada viral en pacientes infectados resultaria muy valioso. [0080] Por ejemplo, estimaciones recientes de la Organizaci6n Mundial de la Salud

5 indican que, en todo el mundo, mas de 33 millones de personas estan infectadas por el VIH-1, el agente causante de la pandemia de SIDA. En los Estados Unidos, estan infectadas casi un mill6n de personas, de las que 300.000 estan recibiendo actualmente una terapia antiviral (CDC, 1999; WHO, 1999). Combatir el SIDA se ha convertido en un objetivo com(n en un esfuerzo sin precedentes de las agencias

10 gubernamentales, los laboratorios academicos y la industria biotecnol6gica/farmaceutica. Catorce farmacos antivirales han sido aprobados por el FDA para el tratamiento de la infecci6n del VIH-1 (Carpenter et al., �000) y mas de �0 farmacos adicionales estan siendo evaluados en pruebas clinicas en la actualidad (PHRMA, 1999). Los farmacos aprobados inhiben la replicaci6n del VIH-1 al interferir

15 en las actividades enzimaticas de la proteasa (PR), o de la transcriptasa inversa (RT). Los inhibidores de PR (PRIs) bloquean la formaci6n adecuada de las proteinas virales que son necesarias para la infecci6n y la replicaci6n del virus, mientras que los inhibidores de RT (RTIs) impiden que el virus copie su material genetico. Debido a una potencia sub-6ptima, los PRIs y RTIs actuales se utilizan casi siempre en combinaci6n

20 para reprimir la replicaci6n viral (Carpenter et al., �000). [0082] Por lo tanto, se desea proporcionar un ensayo viral rapido, preciso y seguro capaz de evaluar:

33. la actividad de los inhibidores de la adhesi6n y la entrada viral (entre los que se incluyen los inhibidores de fusi6n, los inhibidores del receptor y del correceptor);

25 34. el tropismo viral por el receptor/correceptor para facilitar el diseno de farmacos inhibidores de la entrada viral;

3�. los cambios en la sensibilidad de los virus a los farmacos de pacientes a los inhibidores de adhesi6n y entrada; y

3�. la actividad de neutralizaci6n viral generada como respuesta a la vacunaci6n

30 mediante antigenos de proteinas de la envoltura viral [0083] Los metodos de esta invenci6n se pueden utilizar para cualquier enfermedad viral que pueda responder a un inhibidor de la entrada viral y en la que la sensibilidad a los farmacos antivirales y la resistencia a un inhibidor de la entrada viral constituyan una preocupaci6n, por ejemplo, incluyendo, sin caracter limitativo, otros lentivirus (ej.

35 el VIH-�), otros retrovirus (ej. el VLTH-1 y ), hepadnavirus (ej. el virus humano de la hepatitis B), flavivirus (ej. el virus humano de la hepatitis C) y herpesvirus (ej. el citomegalovirus humano). [0084] Los bloqueadores de entrada constituyen una clase novedosa de farmacos antirretrovirales, y tienen un potencial alto para una ofrecer una amplia actividad contra las actuales variantes de VIH-1 resistentes a m(ltiples farmacos. Dentro de la clase de

5 los posibles bloqueadores de la entrada viral, se encuentran los inhibidores de fusi6n, los antagonistas del receptor/correceptor y las vacunas. Inhibidores de fusi6n [0085] Los compuestos disenados para inhibir de forma competitiva el cambio de conformaci6n de TM, llamados inhibidores de fusi6n, son potentes inhibidores de la

10 replicaci6n del VIH-1. Aunque su actividad se ha demostrado tanto en sistemas de cultivo celular como en pacientes infectados por el VIH-1 (Wild et al., 199�; Judice et al., 199�; Kilby et al., 1998), ning(n inhibidor de fusi6n ha sido aprobado todavia para el tratamiento de la infecci6n del VIH-1 en los Estados Unidos. Los farmacos pertenecientes a esta clase, como T-�0 y T-1�49 (Trimeris Inc., USA), estan sujetos a

15 estudios clinicos avanzados. Antagonistas del receptor/correceptor [0086] Ademas de los inhibidores de fusi6n, que act(an despues de que el VIH-1 haya interaccionado con los receptores, se esta trabajando mucho para desarrollar farmacos que impidan que el VIH-1 interaccione con CD4 o cualquiera de sus dos

20 correceptores principales. La habilidad de dichos reactivos de inhibir la infecci6n del VIH-1 se ha demostrado en sistemas de cultivo celular y en modelos animales. Se ha identificado compuestos de partida dirigidos a gp1�0, CD4, al correceptor CCR� que utilizan los virus macr6fago-tr6picos (R �), o al correceptor CXCR4 que utilizan los virus tr6picos de linfocitos T (X4) (Allaway et al., 1993; Reimann et al., 199�; Baba et al.,

25 1999; Bridger et al., 1999). [0087] En la actualidad, ning(n antagonista del correceptor esta aprobado para el tratamiento de la infecci6n del VIH-1 en los Estados Unidos. Los farmacos pertenecientes a esas clases, como PRO �4� (Progenics Inc., USA), �a8 (Tanox, USA), TAK-��9 (Takeda Inc., Japan), y AMD-3100 (Anormed Inc., Canada), son los

30 sujetos de estudios preclinicos o de estudios clinicos en fase inicial. Por lo tanto, un ensayo capaz de identificar y determinar el tropismo por el receptor/correceptor, que identifica con rapidez y precisi6n a los pacientes que estan infectados por cepas de un virus tr6pico (ej. VIH-1), facilitaria el diseno y el tratamiento de farmacos inhibidores de la entrada viral.

35 Vacunas [0088] Las vacunas tambien han demostrado ser una estrategia eficaz en la lucha

contra las infecciones virales patogenicas en humanos. Varias vacunas candidatas a prevenir la infecci6n del VIH-1 estan en desarrollo clinico. Las proteinas de la envoltura gp1�0 y gp41 son las candidatas mas evidentes en la intensa b(squeda de una vacuna contra el VIH-1; muchas de las 11 vacunas candidatas en la evaluaci6n 5 clinica estan basadas en la envoltura (PHRMA, 1999). En general, se cree que una vacuna de la envoltura efectiva puede generar anticuerpos neutralizantes que bloqueen la infecci6n viral (Mascola et al., �000). Por lo tanto, se necesita urgentemente un ensayo de rendimiento sensible que eval(e con fiabilidad la eficacia de dichos anticuerpos neutralizantes y no requiera un cultivo de virus prolongado. 10 Dicho ensayo podria ayudar de forma significativa en la b(squeda de una vacuna contra el SIDA efectiva. Esto es especialmente cierto si se considera que las pruebas clinicas en fase avanzada incluyen a grandes poblaciones de miles de pacientes. Ya que los anticuerpos neutralizantes deberian prevenir la infecci6n de celulas diana con exito, un ensayo del receptor de la envoltura seria beneficioso como ensayo de

15 neutralizaci6n viral. [0089] Desafortunadamente, la mayoria de estas combinaciones farmacol6gicas son efectivas s6lo durante un tiempo limitado debido, en gran parte, a la emergencia de virus resistentes a los farmacos. La falta de funciones de correcci6n inherentes a la RT y ARN polimerasa II junto con la replicaci6n de alto nivel, que es propensa a sufrir

20 errores, permite que los virus como el VIH-1 muten facilmente (Coffin, 199�). Esta alta frecuencia de mutaci6n contribuye a la habilidad del VIH-1 de evadir con exito la terapia farmacol6gica a largo plazo. Como resultado, se produce un rebote de la carga viral. Se han descrito las mutaciones asociadas con la resistencia a cada uno de los 14 farmacos aprobados asi como a muchos compuestos experimentales (Schinazi et al.,

25 1999). En consecuencia, las variantes del VIH-1 resistentes a m(ltiples farmacos plantean un problema creciente en el cuidado de pacientes infectados. Para alcanzar un beneficio clinico a largo plazo, es conveniente seleccionar aquellos farmacos que reprimen al maximo la replicaci6n viral y evitar los farmacos a los que el virus de un paciente es resistente (DHHs, �000). Las soluciones a largo plazo pueden contar con

30 pruebas de resistencia farmacol6gica que pueden guiar a los medicos en la selecci6n de los farmacos mas efectivos contra el virus del paciente. La necesidad de realizar pruebas de resistencia ha quedado confirmada en las directrices recientes del Departamento de Salud y Servicios Humanos de los Estados Unidos (Department of Health and Human Serrices, DHHs), que recomienda que las pruebas de resistencia

35 se tienen que realizar de forma rutinaria cuando se trata a pacientes infectados por el VIH-1. Pruebas de sensibilidad tambien pueden servir de ayuda en el desarrollo de nuevos farmacos dirigidos a los virus resistentes. Un reciente comite asesor del FDA (noviembre de 1999) recomend6 que las pruebas de resistencia fueran utilizadas en el desarrollo de nuevos farmacos antivirales contra el VIH-1.

[0090] Se han aplicado varias estrategias a la evaluaci6n de la sensibilidad a los

5 farmacos antivirales. Las pruebas genotipicas analizan las mutaciones en la secuencia de nucle6tidos subyacente, o genotipo, e intentan correlacionar esas mutaciones con la resistencia a los farmacos (Rodriguez-Rosado et al., 1999; Schinazi et al, 1999). Sin embargo, la relaci6n entre genotipo y fenotipo es compleja y no se interpreta facilmente y los resultados de dichas pruebas no son cuantitativos. El uso de datos de

10 sensibilidad genotipica a los farmacos requiere la interpretaci6n de expertos (Baxter et al., 1999) o de algoritmos informaticos y no predice siempre el resultado del tratamiento (Piketty et al., 1999). [0091] Los ensayos de sensibilidad fenotipica a los farmacos miden directamente y cuantifican la habilidad de los virus de replicarse en presencia del farmaco. Las

15 pruebas fenotipicas iniciales requerian un cultivo de virus prolongado y eran, en consecuencia, lentas, laboriosas y no se podian automatizar facilmente para obtener un rendimiento alto (Japour et al., 1993). Como resultado, esas pruebas fenotipicas iniciales no se consideraban practicas para la gesti6n de pacientes. El desarrollo de ensayos de virus recombinantes (Shi and Mellors, 199�); Hertogs et al., 1998)

20 simplific6 las pruebas fenotipicas y aument6 el rendimiento. Sin embargo, una desventaja importante de esos ensayos era un tiempo de respuesta prolongado de 4-8 semanas. Mas recientemente, se han desarrollado ensayos de virus recombinantes y otros que son capaces de medir la sensibilidad a los farmacos durante una ronda simple de replicaci6n (Zennou et al., 1998; Petropoulos et al., �000), Como resultado,

25 se ha producido una reducci6n espectacular del tiempo de respuesta a 8-10 dias. Los pacientes en los que la terapia antirretroviral no ha tenido exito pueden beneficiarse de los ensayos fenotipicos. Dichos ensayos son herramientas atractivas para la gesti6n de pacientes porque proporcionan una medida rapida y directa de la sensibilidad a los farmacos.

30 [0092] El ensayo de esta invenci6n puede utilizarse con otras infecciones virales que surjan de infecciones debidas a otros virus pertenecientes a estas familias asi como infecciones virales que surjan de virus de otras familias virales. Ademas, la prueba de sensibilidad y resistencia a los farmacos de esta invenci6n es (til para examinar compuestos que crean enfermedades virales para las que no existe una terapia

35 disponible en la actualidad.

[0093] La estructura, el ciclo vital y los elementos geneticos de los virus que podrian ser evaluados en la prueba de sensibilidad y resistencia farmacol6gica de esta invenci6n serian conocidos en una de las destrezas comunes en la tecnica. Para la practica de esta invenci6n, resulta (til, por ejemplo, la comprensi6n del ciclo de vida de 5 un retrovirus, asi como de los genes virales que se requieren para el rescate y la infectividad del retrovirus. Las celulas infectadas de forma retroviral liberan un virus de la membrana que contiene un genoma diploide del ARN. El virus, incrustado con una glicoproteina de la envoltura (que sirve para determinar el rango de infectividad del huesped), se adhiere a un receptor celular en la membrana plasmatica de la celula que 10 va a ser infectada. Despues de su uni6n al receptor, el virus se internaliza y brota a medida que pasa por el citoplasma de la celula huesped. Durante su camino hacia el n(cleo o ya en el mismo n(cleo, las moleculas de transcriptasa inversa residentes en la capside viral dirigen la sintesis del provirus de ADN bicatenario, una sintesis que se inicia con la uni6n de una molecula ARNt al ARN gen6mico viral. El provirus de ADN 15 bicatenario se integra posteriormente en el genoma de la celula huesped, donde funciona como plantilla de transcripci6n para ambos ARNm que codifican las proteinas virales y el ARN del viri6n gen6mico, que seran empaquetados dentro de las particulas de la capside viral. Durante el proceso de salida de la celula infectada, las particulas de la capside viral se mueven a traves del citoplasma, se adhieren al interior de la

20 membrana plasmatica de la celula recien infectada, y brotan, tomando trechos de la membrana que contienen el producto genetico de la glicoproteina de la envoltura codificado de forma viral. Este ciclo de infecci6n de la transcripci6n inversa, transcripci6n, traducci6n, ensamblaje del viri6n y geminaci6n se repite una y otra vez a medida que la infecci6n se extiende.

25 [0094] El ARN viral y, como resultado, el ADN proviral codifican varios elementos cisreguladores que son esenciales para la finalizaci6n del ciclo vital de los virus. El ARN del viri6n transporta al promotor viral en su extremo 3'. Las acrobacias replicativas colocan al promotor viral en el extremo ' del genoma proviral mientras el genoma viral se transcribe de forma inversa. S6lo en las repeticiones terminales largas (LTR)

30 retrovirales 3' a �' se encuentra el sitio de empaquetamiento viral. El ciclo de vida retroviral requiere la presencia de factores de transacci6n codificados de forma viral. La ADN polimerasa (pol)-transcriptasa inversa dependiente del ARN viral tambien esta contenida dentro de la capside viral y es esencial en el ciclo de vida viral, ya que es responsable de la conversi6n del ARN gen6mico en ADN proviral intermedio integrado.

35 La glicoproteina de la envoltura viral, env, se necesita para la adhesi6n viral a la celula no infectada y para la propagaci6n viral. Tambien existen factores transactivadores de transcripci6n, los llamados transactivadores, que pueden funcionar para modular el nivel de transcripci6n del provirus parental integrado. Normalmente, los virus de replicaci6n competente (no defectuosos) son autosuficientes ya que codifican todos estos factores de transacci6n. Sus hom6logos defectuosos no son autosuficientes.

5 [0095] En el caso de un virus de ADN, como el hepadnavirus, la comprensi6n del ciclo vital y de los genes virales requeridos para la infecci6n es (til en la practica de esta invenci6n. El proceso de entrada del VHB no se ha definido bien. La replicaci6n del VHB utiliza una plantilla de ARN intermedia. En la celula infectada, el primer paso de la replicaci6n es la conversi6n del ADN asimetrico circular relajado (ADNrc) en ADN

10 circular cerrado mediante un enlace covalente (ADNccc). Este proceso, que ocurre dentro del n(cleo de las celulas hepaticas infectadas, implica la finalizaci6n de la sintesis de la cadena positiva de ADN y la ligaci6n de los extremos del ADN. En el segundo paso, el ADNccc es transcrito por la ARN polimerasa huesped para generar una plantilla de ARN de 3, kB (el pregenoma). Este pregenoma esta combinado con

15 proteinas en la capside viral. El tercer paso implica la sintesis de la primera cadena negativa del ADN al copiar el ARN pregen6mico utilizando la transcriptasa inversa de la proteina P codificada de forma viral. La proteina P tambien funciona como iniciador de ADN en la cadena negativa. Por (ltimo, la sintesis de la segunda cadena de ADN en sentido positivo ocurre al copiar la primera cadena de ADN, mediante la actividad

20 de la ADN polimerasa de la proteina P y un olig6mero del ARN viral como iniciador. El pregenoma tambien transcribe ARNm para las principales proteinas estructurales de la capside. Diseno y metodos 3�) Construcci6n de un vector de expresi6n para una proteina de la envoltura viral que

25 es capaz de aceptar segmentos derivados de pacientes que codifican la proteina de la envoltura [0096] En un modo de realizaci6n, se construy6 un vector de expresi6n de la envoltura capaz de expresar las proteinas de la envoltura del VIH-1 en celulas transfectadas. Se han descrito vectores de expresi6n similares, incluyendo un plasmido (pAmphoEnv)

30 construido para expresar la proteina de la envoltura del virus anfotr6pico de la leucemia murina (A-MLV) como se describe en la patente estadounidense n(mero �.83�.4�4 y en Petropoulos et al., �000. El vector pAmphoEnv utiliza el gen de expresi6n inmediata temprana promotor del citomegalovirus (CMV) humano y la secuencia de senal de poliadenilaci6n del SV40 para producir ARNm de la envoltura 35 de A-MLV en celulas transfectadas. El plasmido pAmphoEnv es modificado al suprimir el gen de envoltura de A-MLV e introducir sitios de escisi6n de la enzima de restricci6n

que puedan permitir la inserci6n de fragmentos de la envoltura viral derivados de una variedad de cepas aisladas, como el VIH-1. En el caso del VIH-1, el marco abierto de lectura de la envoltura abarca aproximadamente . �00 nucle6tidos y codifica la poliproteina de envoltura, gp1�0. La poliproteina gp1�0 es escindida por una proteasa

5 celular como la furina para producir dos subunidades: gp41 y gp1�0. Los vectores de expresi6n de la envoltura del VIH-1 se pueden construir en las siguientes fases:

(a) Sustituci6n de las secuencias de acido nucleico de la envoltura de A-MLV a partir del vector de expresi6n de la envoltura (pAmphoEnv) con un sitio poliligador de clonaci6n m(ltiple:

10 [0097] Las secuencias de acido nucleico de la envoltura de A-MLV pueden ser suprimidas del vector pAmphoEnv mediante digesti6n con enzimas de restricci6n. El vector digerido puede ser recirculado mediante ligaci6n a un poliligador oligonucle6tido d(plex que contiene cuatro sitios de restricci6n interna (nicos (a, b, c, d) para la inserci6n de las secuencias de la envoltura. La reacci6n de ligaci6n puede utilizarse

15 para transformar Escherichia coli y los clones moleculares que contienen la secuencia de poliligadores correcta se pueden identificar y confirmar mediante mapas de restricci6n y secuenciaci6n de ADN, respectivamente. La introducci6n de sitios (nicos de clonaci6n m(ltiple en el vector puede facilitar la inserci6n de secuencias de la envoltura del VIH-1. Los sitios de restricci6n dentro del poliligador se pueden elegir

20 basados en la aparici6n poco frecuente en secuencias de la envoltura del VIH-1 (base de datos del VIH-1 del Laboratorio Nacional de Los Alamos, Estados Unidos, www.lanl.gov). Este vector se puede llamar pCX. La funcionalidad del vector pCX se puede demostrar insertando un gen reportero o acido nucleico indicador, como la luciferasa de luciernaga, en el sitio de clonaci6n m(ltiple del pCX y midiendo una senal

25 a partir de la actividad del acido nucleico indicador o del gen reportero en celulas transfectadas. Como se utiliza aqui, "acido nucleico indicador" se refiere a acido nucleico que codifica una proteina, estructura de ADN o ARN que o directamente o mediante una reacci6n da lugar a una senal calculable o perceptible, ej. el color o la luz de longitud de onda calculable o la generaci6n de una estructura especifica de

30 ADN o ARN utilizada como un indicador que podria ser amplificada por medio de cualquier prueba entre una variedad de pruebas de amplificaci6n cuantitativa.

(b) Inserci6n de las secuencias de envoltura viral en el vector de expresi6n de la envoltura pCX: [0098] Utilizando iniciadores mutagenicos para la amplificaci6n de la reacci6n en

35 cadena de la polimerasa (PCR), los fragmentos de la envoltura viral que se generan contienen dos sitios (nicos de restricci6n (a, b y c, d, respectivamente) adyacentes a los codones de inicio y de terminaci6n de, por ejemplo, el marco abierto de lectura de la envoltura del VIH-1. La introducci6n de dos sitios de restricci6n (nicos en cada extremo del marco abierto de lectura de la envoltura puede mejorar las posibilidades de clonar fragmentos de la envoltura del VIH-1 que albergan sitios de restricci6n

5 interna para cualquiera de las enzimas que se encuentran en el sitio de clonaci6n m(ltiple del vector pCX. [0099] En el caso del VIH-1, dos clones moleculares del VIH-1 bien identificados con diferencias conocidas en el gen de la envoltura, NL4-3 (cepa de laboratorio de linfocitos T tr6picos inductores de sincitios) y JR-CSF (una cepa aislada primaria

10 macrofagotr6pica no inductora de sincitios), se pueden utilizar como plantilla para la amplificaci6n de la reacci6n en cadena de la polimerasa. Los productos de la amplificaci6n de �. �00 nucle6tidos pueden ser digeridos con dos enzimas de restricci6n (cada enzima escindiendo en un extremo del fragmento; ej. a y c o b y d) e insertadas despues en el vector pCX mediante ligaci6n y transformaci6n de

15 Escherichia coli. Los clones moleculares que contienen las secuencias de la envoltura apropiadas pueden ser identificados por mapas de restricci6n y confirmados por secuenciaci6n de ADN. Los plasmidos resultantes, pHIVenv (NL4-3) y pHIVenv (JR-CSF), pueden utilizarse para expresar proteinas de la envoltura del VIH-1 en celulas trasnfectadas (Figura 1A). La funcionalidad de los vectores de expresi6n de la

20 envoltura, como en los vectores pHIVenv, se puede demostrar al evaluar la sintesis de la envoltura viral en celulas transfectadas (Western Blot), y mediante su habilidad de pseudotipar los vectores de retrovirus deficientes de la envoltura. Las reservas de virus con titulos altos que utilizan lineas de celulas de rin6n embrionarias humanas �93 han sido probadas (Petropoulos et al., �000). Sin embargo, la presente invenci6n no esta

25 restringida a esas lineas celulares. Otras lineas celulares adecuadas utilizadas como una primera celula para la transfecci6n de acido nucleico obtenido del paciente que codifica una proteina de la envoltura viral incluyen, como un ejemplo y sin estar limitadas a la presente invenci6n, . ��; HOX; U8�; MT ; PM1; CEM; etc. La linea celular sera manipulada de forma 6ptima para expresar uno o mas correceptores.

30 (c) Modificaci6n del vector pCX para mejorar la eficiencia de clonaci6n de las secuencias de la envoltura viral:

[0100] Para mejorar la eficiencia de clonaci6n de los fragmentos de la envoltura viral, el vector de expresi6n pCX se puede modificar insertando un cassette de genes killer de bacterias (ej. control del gen b de muerte celular (ccdB) o de un miembro de la

35 familia genetica hok-killer) bajo control del promotor lac de Escherichia Coli en el sitio de clonaci6n m(ltiple (the et al., 1990; Bernard and Couturier, 199� ; Bernard et al.,

1993). El vector modificado se llama pCXccdB. La transcripci6n del gen killer ccdB es reprimida en cepas bacterianas que expresan el represor laciq, como el JM109. Esta cepa o una equivalente se pueden utilizar para propagar los plasmidos que son portadores del gen asesino ccdB que estan bajo control del promotor lac. Al contrario, 5 en este sistema las cepas bacterianas que no sobreexpresan el represor laciq, como DH�a y Top10, no pueden mantener los plasmidos que expresan el gen ccdB. La actividad de ccdB puede matar a los transformantes. Las celulas DH�a y Top10 se pueden comprar de varios vendedores (Life Technologies o Invitrogen). Utilizando este enfoque de clonaci6n selectiva, el vector de expresi6n parental se propaga en una 10 cepa bacteriana laciq. El vector es digerido con dos enzimas de restricci6n que eliminan el cassette genico ccdB y, en el caso del VIH-1, son compatibles con la inserci6n de secuencias de la envoltura del VIH-1 (a, b, c, d). Despues de la ligaci6n del vector y de los fragmentos de la envoltura, una cepa de bacterias que carecen de laciq se transforma. Una vez transformadas, las bacterias que contienen plasmidos en 15 los que las inserciones de la envoltura viral han reemplazado al gen killer ccdB pueden crecer. Las bacterias que contienen plasmidos que retienen o reconstituyen el gen killer ccdB no pueden sobrevivir. De ese modo, la poblaci6n de bacterias transformadas es enriquecida por los plasmidos que contienen inserciones de la envoltura viral, pero carecen del vector parental que contiene el gen killer ccdB. La 20 construcci6n del vector pCXccdB no es esencial para el exito de la fase I de este proyecto, pero se espera que mejore significativamente la eficiencia de la clonaci6n de secuencias de la envoltura del VIH-1 derivadas de muestras de pacientes. Asi, se puede mejorar la probabilidad de mantener la heterogeneidad de las secuencias virales. La estructura del vector pCXccdB se puede confirmar mediante mapas de

25 restricci6n y secuenciaci6n de ADN.

(d) Inserci6n de las secuencias de la envoltura viral en el vector de expresi6n pCXccdB [0101] La funcionalidad del vector pCXccdB se puede evaluar estableciendo reacciones de ligaci6n que contienen secuencias de la envoltura viral y ADN del vector pCXccdB digerido de manera incompleta. Despues de la transformaci6n bacteriana, el 30 ADN plasmido se puede preparar desde clones individuales de bacterias y analizar mediante digesti6n de restricci6n para la presencia de fragmentos de la envoltura viral y la ausencia de secuencias de ccdB. La viabilidad de este enfoque se eval(a por medio de la amplificaci6n de la regi6n de la envoltura desde un total de 13 clones del VIH-1 disponibles (pCRII-91US00� .11, pCRII-9100�.10, pCRII-9�US���.1, pCRII

35 9�US�11.14, pCRII-91US�1�.4, pCRII-9�US �14.1, pCRII-91HT .11, pCRII-9�BR0�0.4, pCRII-91HT ��1.1A, pCRII-9�HT �93.1, pCRII-9�HT 94.10, pCRII9�HT �9�.4, pCRII-9�HT�99. �4), que se pueden obtener a traves del programa de referencia de reactivos de investigaci6n del SIDA (AIDS Research Reagent Reference Program, ARRRP) de Rockville, Maryland. Cada fragmento se puede insertar en pCXccdB y la estructura de los vectores de expresi6n pHIVenv resultantes se puede

5 confirmar mediante mapas de restricci6n y/o secuenciaci6n de ADN. La funcionalidad de cada vector pHIVenv se puede demostrar al medir la sintesis de las proteinas de la envoltura del VIH-1 en celulas transfectadas (Western Blot), y mediante su habilidad de pseudotipar vectores de retrovirus con deficiencias en la envoltura.

�) Construcci6n de un vector de expresi6n viral bioseguro que comprende acido

10 nucleico indicador en lugar de la regi6n que codifica la proteina de la envoltura [0102] Un vector viral bioseguro se construye para evaluar inhibidores de la entrada viral de acuerdo con medios y metodos similares como se describe en la patente estadounidende n(mero �.83�.4�4 y en Petropoulos et al., �000 utilizados para evaluar inhibidores de PR y RT. El vector de expresi6n viral puede ser cotransfectado

15 dentro de celulas junto con los vectores de expresi6n de la envoltura (descritos arriba) para producir reservas de virus con titulos altos. Dichas reservas de virus pueden ser evaluadas para medir su sensibilidad a los inhibidores de la entrada viral, incluyendo farmacos antivirales y anticuerpos neutralizantes. En el caso del VIH-1, el vector de expresi6n viral puede ser generado a partir de NL4-3, un clon molecular infeccioso del

20 VIH-1 bien identificado. La repetici6n terminal larga (LTR) ' que controla la expresi6n del gen viral puede ser modificada para que la transcripci6n de los genes virales en celulas transfectadas sea conducida por el promotor temprano intermedio de CMV (Naviaux et al., 199�). La mayor parte del gen de la envoltura se puede eliminar, pero los elementos de control importantes como el elemento de respuesta de rev (RRE) y

25 proteinas accesorias que codifican regiones (rev, tat) se retienen. En lugar de las secuencias de la envoltura eliminadas, se inserta un acido nucleico indicador, como un cassette de genes reporteros de luciferasa de luciernaga que esta bajo control de las secuencias promotoras-amplificadoras del CMV (Figuras 1B y 3). La infecci6n del virus se puede controlar midiendo la actividad de luciferasa en celulas infectadas. Es

30 concebible, aunque improbable, que la recombinaci6n interplasmida entre el vector retroviral y, por ejemplo, las secuencias de pHIVenv en celulas transfectadas pueda llevar a la generaci6n de VIH-1 infeccioso. En un esfuerzo de generar un vector bioseguro, se puede llevar a cabo la introducci6n de varias alteraciones geneticas en el genoma del VIH. Por ejemplo, se puede conseguir la deleci6n de la mayor parte del

35 gen de envoltura, a la vez que se retiene la secuencia de control importante, RRE, y tambien la deleci6n de las secuencias transcripcionales de amplificaci6n en la regi6n

U3 de la LTR 3' del vector (Figura �). Durante la replicaci6n del genoma retroviral, la regi6n U3 que se encuentra en el extremo 3' del genoma del virus funciona como la plantilla para la regi6n U3 de la LTR ' del provirus en celulas infectadas. Dichos provirus carecen del elemento promotor fuerte en la regi6n U3 de la LTR ' y, por 5 tanto, son incapaces de producir ARN retroviral en celulas infectadas. Esta estrategia de auto-inactivaci6n (SIN) se ha utilizado con exito para varios sistemas de vectores retrovirales, incluyendo el VIH-1 (Hwang et al., 199�; Miyoshi et al, 1998). En el ensayo de la presente invenci6n, la expresi6n del gen viral no se requiere en celulas infectadas porque la infecci6n viral se mide con una senal detectable producida por el

10 acido nucleico indicador, como la producci6n de actividad de luciferasa, conducida por su propio promotor independiente (Figura 1B). La eliminaci6n de las secuencias de la envoltura y de la regi6n transcripcional de amplificaci6n (U3) se puede realizar mediante procesos de clonaci6n molecular estandar y cada deleci6n se puede verificar con un analisis de secuencias de ADN.

15 [0103] La funcionalidad de este vector, por ejemplo en el caso del VIH-1, llamado pHIVlucAU3, se puede demostrar mediante la co-transfecci6n de celulas �93 con el vector pHIVenv descrito arriba. La transcomplementaci6n eficiente de proteinas virales producida por ambos vectores en las celulas transfectadas puede llevar a la producci6n de particulas virales. Las particulas virales se pueden cultivar desde

20 sobrenadantes de cultivo y se pueden analizar mediante Western blot. Los titulos de virus pueden cuantificarse mediante solicitudes rutinarias de p�4 ELISA, PCR reacci6n en cadena de la polimerasa cuantitativa o ensayos TaqMan.

[0104] No es necesario producir un vector de expresi6n viral auto-inactivante para llevar a cabo la presente invenci6n, pero es aconsejable para mejorar la

25 reproducibilidad y la bioseguridad del ensayo. 3) Identificaci6n de lineas celulares adecuadas que expresan receptores y correceptores y que refuerzan la infecci6n viral [0105] Las distintas lineas celulares de mamiferos que se han descrito antes y son conocidas por reforzar la infecci6n de un virus concreto pueden ser evaluadas. Como

30 se ha tratado aqui para un modo de realizaci6n relacionado con el VIH-1, el ensayo se puede realizar (a) cotransfectando una primera celula con pHIVenv y pHIVlucAU3, (b) cultivando virus despues de la transfecci6n, (c) utilizando dicho virus para infectar una segunda celula, tanto en presencia como en ausencia de inhibidores de la entrada viral y (d) midiendo la producci6n de luciferasa en celulas infectadas.

35 [0106] La tabla 1 enumera los ejemplos representativos de dichas lineas celulares evaluadas para la infecci6n del VIH-1, incluyendo la linea celular y su receptor/correceptor asociado. Varias de estas lineas de celulas se pueden obtener de bancos p(blicos de celulas. [0107] Las particulas virales recogidas de cultivos de celulas �93 transfectadas se pueden utilizar para infectar una variedad de lineas celulares diferentes. En el caso del

5 VIH-1, el vector pHIVlucAU3 contiene deleciones en el gen de la envoltura y el promotor-amplificador de U3 como se ha descrito anteriormente. Por lo tanto, la infecci6n de una linea celular permisiva con particulas virales producidas por ese vector se restringe a una (nica ronda de replicaci6n. Esto incluye (a) la adhesi6n y la entrada del virus, intervenidas por las proteinas de la envoltura viral producidas en

10 trans mediante el vector pHIVenv como se ha descrito, (b) la conversi6n de ARN monocatenario viral en ADN bicatenario mediante transcriptasa inversa, y (c) la integraci6n del ARN viral en el genoma de la celula huesped (formaci6n del provirus). La transcripci6n activa de los genes virales mediante ARN polimerasa II que ocurre normalmente en celulas infectadas despues de la integraci6n proviral se puede

15 restringir a traves de la supresi6n de secuencias promotoras-amplificadoras virales esenciales in el vector pHIVlucAU3. Sin embargo, esa restricci6n no puede interferir con la expresi6n del gen de luciferasa en celulas infectadas, ya que ese gen es conducido, independientemente de la expresi6n del gen viral, mediante un promotor de CMV interno (Figura 1B). La cantidad de actividad de luciferasa que se produce

20 despues de la infecci6n se puede utilizar como medida de la infectividad viral. [0108] La adhesi6n y la entrada del VIH-1 en las celulas huesped requieren una interacci6n con un receptor primario (CD4) y uno de los varios correceptores, normalmente CCR� o CXCR4. Las lineas celulares que expresan varias combinaciones de CD4, CCR� y CXCR4 pueden ser evaluadas. En particular, se

25 eval(an las lineas celulares enumeradas en la Tabla 1 que expresan (a) CD4 mas CCR�, (b) CD4 mas CXCR4 y (c) CD4 mas CCR� mas CXCR4. Las lineas celulares que expresan el receptor CD4 por si solo o, o el correceptor CCR� por si solo o el correceptor CXCR4 por si solo, pueden funcionar como controles (tiles y se pueden utilizar para evaluar las cepas de VIH-1 aisladas que no requieren uni6n con CD4 o

30 que utilizan correceptores distintos de CCR� y CXCR4. El criterio principal para juzgar la idoneidad de las lineas celulares puede ser la infectividad medida por la producci6n de luciferasa (104-10 unidades ligeras relativas). Ademas, las lineas celulares se pueden evaluar basadas en tasas de crecimiento, viabilidad, estabilidad y otros parametros que se consideren necesarios. Las lineas celulares se pueden seleccionar

35 para que sean faciles de mantener y, por ejemplo, produzcan grandes cantidades de actividad de luciferasa despues de la infecci6n, que puede ser realizada mediante distintos tropismos por los receptores de la envoltura, ej. CD4/CXCR4 y CD4/CCR�. Lineas celulares adicionales bien identificadas que refuerzan, por ejemplo, la replicaci6n del VIH y expresan el receptor y los correceptores del VIH-1 (ej. CEM-NKr-CCR�; categoria de liberaci6n a) estan disponibles a traves de bancos p(blicos como el ARRRP. [0109] Asimismo, las lineas celulares se pueden amplificar mediante procedimientos estandar, como la promoci6n de la infecci6n al anadir Polybrene a las celulas (Porter et al., 1998). Por ejemplo, en el caso del VIH, se puede identificar otras posibles lineas celulares para su utilizaci6n con la presente invenci6n mediante la infecci6n de cepas de VIH-1 del laboratorio y la comparaci6n de las titulos de infectividad de virus recombinantes a las obtenidas con VIH-1 infeccioso o mediante la transfecci6n de celulas directamente con los plasmidos de expresi6n viral descritos en esta publicaci6n, y la puntuaci6n para la producci6n de virus. La acumulaci6n de transcripciones virales se puede comprobar con la utilizaci6n de una reacci6n en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR) cuantitativa. Las lineas celulares apropiadas para otros virus se pueden identificar de una manera similar. [0110] La presente invenci6n puede optimizar las condiciones del ensayo y permitir las pruebas de alto rendimiento de muestras de pacientes mediante automatizaci6n. Los metodos de preparaci6n de muestras pueden ser optimizados para capturar de manera eficiente los ARNs virales del genoma y de la envoltura. Las condiciones de la reacci6n en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa se pueden optimizar para posibilitar la amplificaci6n de las secuencias de la envoltura viral derivadas de pacientes, como las secuencias de la envoltura del VIH-1 (-�, �00 pares de bases) a bajas cargas virales (-�00 copias por ml). 4) Demostraci6n de la utilidad de la prueba [0111] La utilidad del ensayo de la presente invenci6n se demuestra con los resultados logrados a partir de: (1) pruebas de inhibici6n, dependiente de la dosis, de la entrada viral en presencia de inhibidores bien identificados y ( �) pruebas de inhibici6n, dependiente de la dosis, de la infecci6n en presencia de anticuerpos neutralizantes del VIH-1 bien identificados. [0112] Las siguientes aplicaciones para el ensayo de entrada viral han sido evaluadas: i) detectar la inhibici6n de la replicaci6n del VIH-1 mediante inhibidores de la adhesi6n y la entrada del virus (incluyendo inhibidores de fusi6n, de receptor y de correceptor); ii) medir los cambios en la sensibilidad de los inhibidores de la adhesi6n y la entrada del VIH-1, y iii) detectar la actividad neutralizante de los anticuerpos generada en respuesta a las

vacunas dirigidas contra las proteinas de la envoltura del VIH-1. [0113] En un modo de realizaci6n preferido, el ensayo se puede realizar (a) cotransfectando una primera celula con los vectores pHIVenv y pHIVlucAU3, (b) cultivando virus despues de aproximadamente 48 horas despues de la transfecci6n,

5 (c) utilizando ese virus para infectar a una segunda celula, tanto en presencia como en ausencia de inhibidores de la entrada viral y (d) midiendo la producci6n de luciferasa aproximadamente 48-��horas despues de la infecci6n. La inhibici6n, dependiente de la dosis, de la replicaci6n del VIH-1 se puede evaluar en contraste con una amplia gama de concentraciones de inhibidores de la entrada viral utilizando un formato de 9�

10 pocillos. La gama de concentraci6n apropiada puede ser determinada empiricamente para cada inhibidor. Los datos pueden ser determinados como el porcentaje de inhibici6n de actividad de luciferasa vs. la concentraci6n farmacol6gica (log10). El analisis de los datos se puede realizar mediante un software informatico. Las curvas de inhibici6n se utilizan para determinar las concentraciones inhibidoras en un �0�

15 (IC �0) para farmacos o anticuerpos especificos (Figura 6). [0114] Las proteinas de la envoltura derivadas de una variedad de cepas aisladas del VIH-1 bien identificadas se eval(an mediante los vectores pHIVenv construidos como se describe anteriormente. Para definir el tropismo por el correceptor de la envoltura, en el caso del VIH-1, la infecci6n mediante celulas que expresan CD4 mas CXCR4 y

20 CD4 mas CCR� se eval(a como se describe anteriormente. Una amplia variedad de compuestos que se conocen por inhibir la entrada del VIH-1 (Tabla �), incluyendo agentes no especificos como polianiones sulfonatados (sulfato de dextrano y heparina) se pueden utilizar en el ensayo de la presente invenci6n. Quimiocinas como Rantes y SDF-1, los ligandos naturales de los receptores de quimiocina CCR� y

25 CXCR4, respectivamente (ver Alkhatib et al., 199�; Bleul et al., 199�), son tambien apropiados para ser utilizados con la presente invenci6n. Asimismo, inhibidores de la entrada viral como T �0 y T1�49 (Trimeris, Inc.), PRO �4� (Progenics), �a8 (Tanox) han sido utilizados para evaluar la utilidad del ensayo de la presente invenci6n. [0115] La toxicidad farmacol6gica en celulas diana se eval(a por medio de los

30 ensayos estandar de viabilidad o citotoxicidad (ej. tinci6n por exclusi6n, MTS ATP). [0116] Se han descrito los VIH-1 mutantes que muestran sensibilidad reducida al inhibidor de fusi6n T 0 (Rimsky et al., 1998) y las determinaciones geneticas (mutaciones) que permiten que esos virus se repliquen en presencia del mapa farmacol6gico dentro de la proteina de la envoltura (gp41-TM). Para demostrar que el

35 ensayo de la presente invenci6n es capaz de medir cambios en sensibilidad a los farmacos (ej. resistencia), (a) se generan vectores pHIVenv que transportan dichos

genes mutantes de la envoltura, (b) se cotransfectan las primeras celulas por medio de esos vectores y el vector pHIVlucAU3, (c) se cultivan los virus que transportan dichas proteinas mutantes de la envoltura y (d) se eval(a la infectividad de los virus en presencia de T �0. Una sensibilidad farmacol6gica reducida a T 0 es evaluada 5 mediante la comparaci6n de la IC �0 de los virus que portan proteinas mutantes de la envoltura con los que carecen de las mutaciones de resistencia farmacol6gica definidas. Los virus que portan las proteinas de la envoltura con mutaciones de resistencia farmacol6gica pueden mostrar valores de IC �0 mas altos que los virus que portan proteinas de la envoltura que carecen de mutaciones de resistencia

10 farmacol6gica. Es decir, la inhibici6n puede requerir una concentraci6n farmacol6gica mas alta (equivalente a los datos que presenta la Figura 8). Las mutaciones de resistencia farmacol6gica se pueden introducir en vectores de expresi6n de la envoltura (pHIVenv) mediante tecnicas estandar de mutagenesis de sitio dirigido seg(n protocolos estandar (Petropoulos et al., 000; Ziermann et al., �000).

15 [0117] Es por todos aceptado que las vacunas efectivas que protegen de la infecci6n del VIH-1 deberian provocar una fuerte respuesta inmunitaria humoral caracterizada por anticuerpos neutralizantes de reacci6n cruzada en general. En consecuencia, el suero de los individuos vacunados se eval(a habitualmente para comprobar la presencia de anticuerpos neutralizantes con titulos altos dirigidos al inmunogen. Mas

20 recientemente, utilizando el modelo macaco del virus quimerico (VISH) del virus de la inmunodeficiencia del simio (VIS)/VIH-1, Mascola y sus companeros han mostrado que la transferencia pasiva de tales anticuerpos neutralizantes caus6 la carga viral reducida despues del desafio de las mucosas (Mascola et al., �000). El ensayo de entrada viral se puede utilizar con rapidez y fiabilidad para determinar la actividad de

25 neutralizaci6n viral de los anticuerpos generada como respuesta a las vacunas dirigidas a antigenos de la envoltura, como los antigenos de la envoltura del VIH-1. Por ejemplo, el ensayo puede (a) generar vectores pHIVenv que expresen una variedad de proteinas de la envoltura bien identificadas, (b) contransfectar una primera celula mediante esos vectores y el vector pHIVlucAU3, (c) cultivar virus e incubar con

30 diluciones en serie de preparados de anticuerpos o suero de vacunaci6n, (d) hacer un analisis para determinar la infectividad de esos virus en una segunda celula. El analisis de los datos y las determinaciones de IC �0 se pueden realizar como se ha descrito anteriormente y en el material publicado. En el caso del VIH-1, los virus se pueden seleccionar para que representen distintos antecedentes geneticos del VIH-1 (ej. clado

35 A, B, C, D, E, F), tropismos por celulas y correceptores distintos (macr6fago/CCR�, linfocito T/CXCR4) y distintas propiedades de la envoltura (crecimiento adaptado al

laboratorio o cepa aislada, inductor y no inductor de sinticios (Tabla �). Puede ser beneficioso preparar reservas de un titulo definido de cada virus para optimizar la sensibilidad y reproducibilidad del ensayo mediante una entrada de virus de aproximadamente �0-100 TCID �0/pocillo y hacer ajustes seg(n sea necesario. Los 5 preparados de anticuerpos pueden ser seleccionados a partir de propiedades de neutralizaci6n que hayan sido previamente documentadas, o bien propiedades funcionales, como la habilidad de neutralizar cepas aisladas primarias, o bien fisicas, como la habilidad para unir epitopos gp1�0 o gp41 especificos (Tabla �). La realizaci6n del ensayo de la presente invenci6n puede juzgarse a la luz de la actividad 10 de esos reactivos de anticuerpos bien identificados en ensayos de neutralizaci6n viral convencionales como se describe en las publicaciones cientificas. El suero de un grupo representativo en general de individuos infectados por el VIH-1 se puede utilizar para establecer una variedad apropiada de diluciones de suero que puede maximizar la sensibilidad del ensayo, pero minimizar la citotoxicidad. La citotoxicidad se puede

15 evaluar mediante viabilidad estandar o ensayos de citotoxicidad (ej. tinci6n de exclusi6n, MTS, ATP) [0118] Los siguientes ejemplos se presentan para ilustrar y explicar mas la presente invenci6n y no deberian ser considerados con caracter limitativo en ning(n caso.

EJEMPLO 1

20 Medicion de la sensibilidad farmacologica fenotipica a los inhibidores de la entrada del VIH-1 [0119] Este ejemplo proporciona un medio y metodo para calcular con precisi6n y reproducibilidad la sensibilidad a los inhibidores de adhesi6n y entrada del VIH-1 (hasta ahora referidos en conjunto como entrada). Basado en este ejemplo, el medio y

25 metodo para calcular la sensibilidad a los inhibidores de entrada del VIH-1 se puede adaptar a otros virus, incluyendo, sin caracter limitativo, otros lentivirus (ej. VIH-�), otros retrovirus (ej. VLTH-1 and �), hepadnavirus (ej. el virus humano de la hepatitis B), flavivirus (ej. el virus humano de la hepatitis C) y herpesvirus (ej. el citomegalovirus humano). Este ejemplo proporciona tambien un medio y metodo para calcular

30 alteraciones (incrementos y disminuciones) en la sensibilidad a los inhibidores de entrada. [0120] Las mediciones de la sensibilidad a los inhibidores de entrada se realizan mediante las adaptaciones del medio y metodo de pruebas fenotipicas de sensibilidad y resistencia farmacol6gica descritas en la patente estadounidense .83� .4�4

35 (Publicaci6n internacional n(mero WO 9�/ ��319). [0121] Un vector, un ejemplo del vector de expresi6n de la envoltura, (pHIVenv) esta

disenado para expresar la proliproteina de la envoltura (gp1�0) codificada por las secuencias de la envoltura del VIH derivadas de pacientes (Figura 1). Despues, gp1�0 es escindido por una proteasa celular para generar las subunidades de la superficie (gp1�0SU) y transmembrana (gp41TM) que comprenden la proteina de la

5 envoltura en la superficie de las particulas del virus del VIH-1. Un segundo vector, un ejemplo del vector de expresi6n viral, (o pHIVluc o pHIVluc U3) esta disenado para expresar ARNs gen6micos y subgen6micos y todas las proteinas del VIH excepto la poliproteina de la envoltura (Figuras 1A-1B). [0122] En esta aplicaci6n, el/los segmento(s) derivados del paciente corresponden a la

10 regi6n codificadora (-�, kB) de la poliproteina de envoltura del VIH-1 (gp1�0) y representan o (a) secuencias de la envoltura amplificadas por la reacci6n en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR) mediante ARN viral aislado del virus derivado de individuos infectados por el VIH, o (b) secuencias de la envoltura derivadas de clones moleculares del VIH-1 que contienen mutaciones especificas

15 introducidas por medio de mutagenesis de sitio dirigido de un clon molecular parental (normalmente NL4-3). [0123] El aislamiento de ARN viral fue realizado mediante procedimientos estandar, ej. RNAgents Total RNA Isolation System, Promega, Madison WI o RNAzol, Tel-Test, Friendswood, TX). El protocolo RT-PCR fue dividido en dos pasos. Una transcriptasa

20 inversa retroviral [ej. Superscript II (Invitrogen, Life Technologies) la transcriptasa inversa del M-MuLV de Moloney (Roche Molecular Systems, Inc., Branchburg, NJ) o la transcritasa inversa del virus de la mieloblastosis aviar (AMV), (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)] fue utilizada para copiar ARN viral en la primera cadena del ADNc. Despues, el ADNc se amplific6 a un n(mero alto de copias por medio de la ADN

25 polimerasa termoestable [ej. Taq (Roche Molecular Systems, Inc., Branchburg, NJ), Tth (Roche Molecular Systems, Inc., Branchburg, NJ), PrimeZyme (aislado de Thermus brockianus, Biometra, Gottingen, Germany)] o una combinaci6n de polimerasas termoestables como se describe para la realizaci6n de "reacci6n en cadena de la polimerasa larga" (Barnes, W.M., (1994) Proc. Natl. Acad. Sci, USA 91,

30 ��1�-���0) [ej. Expand High Fidelity PCR System (Taq + Pwo), (Boehringer Mannheim. Indianapolis, IN) O GeneAmp XL PCR kit (Tth + Vent), (Roche Molecular Systems, Inc., Branchburg, NJ), Advantage-�, (CloneTech). [0124] El Oligo-dT fue utilizado para la transcripci6n inversa del ARN viral en la primera cadena de ADNc. Los iniciadores de la reacci6n en cadena de la polimerasa

35 de la envoltura, el indicador directo Xho/Pin y el iniciador reverso Mlu/Xba (Tabla 3) fueron utilizados para amplificar los segmentos derivados de pacientes. Estos iniciadores estan disenados para amplificar el gen de la envoltura de -�, kB que codifica la poliproteina de la envoltura gp1� 0, mientras introduce los sitios de reconocimiento Xho I y Pin AI en el extremo ' del producto de amplificaci6n de la reacci6n en cadena de la polimerasa y los sitios Mlu I y Xba I en el extremo 3' del

5 producto de amplificaci6n de la reacci6n en cadena de la polimerasa. [0125] Los segmentos derivados de pacientes (producto de amplificaci6n de la secuencia de envoltura , kB) se insertaron en los vectores de expresi6n de la envoltura del VIH-1 por medio de la digesti6n de la endonucleasa de restricci6n, la ligaci6n del ADN y los metodos de transformaci6n bacteriana como se describen en la

10 patente estadounidense n(mero .83�.4�4 (Publicaci6n internacional n(mero WO 9�/ ��319), con adaptaciones de poca importancia. El producto de amplificaci6n de -�, kB fue digerido con Xho I o Pin AI en el extremo ' y Mlu I o Xba en el extremo 3'. La productos de digesti6n resultantes fueron ligados, mediante ADN ligasa, en los sitios ' Xho I/Pin AI y 3' Mlu I/Xba I de los vectores de expresi6n pCXAS o pCXAT 15 modificados. Se ha descrito la construcci6n de los vectores pCXAS y pCXAT [ejemplo �, patente estadounidense �.83�.4�4 (Publicaci6n internacional n(mero WO 9�/ ��319)]. Los vectores modificados pCXAS y pCXAT contienen un sitio de restricci6n Pin AI ademas de los sitios de restricci6n Xho I, MluI y Xba I que existen en pCXAS y pCXAT. El sitio Pin Al fue introducido entre los sitios Xho I y Mlu I mediante 20 mutagenesis de sitio dirigido, para que los cuatro sitios se localizaran del ' al 3' en el siguiente orden: Xho I, Pin AI, Mlu I y Xba I. En un modo de realizaci6n preferido, los productos de amplificaci6n de �, kB fueron digeridos con Pin AI y Mlu I y ligados en el �' Pin AI y en el 3' Mlu I del vector de expresi6n pCXAS modificado. Los productos de reacci6n de ligaci6n se utilizaron para transformar E.coli. Despues de un periodo de 25 incubaci6n de �4-3� horas a 30-3�� C, el ADN plasmido del vector de expresi6n fue purificado a partir de los cultivos de E.coli. Para asegurar que los preparados del vector de expresi6n representan adecuadamente las cuasi-especies del VIH presentes en el suero de un paciente dado, muchas (>100) transformantes de E.coli independientes se juntaron y se utilizaron para los preparados de ADN plasmido de

30 pHIVenv. Los vectores que se recopilan de esta manera a fin de expresar proteinas de la envoltura derivadas de virus de pacientes se llaman en conjunto pHIVenv (Figuras 1 y 3). [0126] Los vectores de expresi6n del VIH gen6mico pHIVluc y pHIVluc@U3 estan disenados para transcribir el ARN gen6mico del VIH y los ARNm subgen6micos y para

35 expresar todas las proteinas del VIH excepto la proliproteina de la envoltura (Figura 1B). En esos vectores, una parte del gen de la envoltura se ha suprimido para acomodar un cassette genico indicador funcional, en este caso, la luciferasa de luciernaga que se utiliza para controlar la habilidad de replicaci6n del virus en presencia o ausencia de farmacos antivirales. En pHIVluc@U3, una parte de la regi6n 3' U3 se ha suprimido para prevenir la transcripci6n de ARNs virales de las LTR �' en

5 celulas infectadas. [0127] Los ensayos de sensibilidad para los inhibidores de la entrada del VIH-1 se realizaron mediante celulas huesped de empaquetamiento que estan compuestas de la linea de celulas de rin6n embrionarias humanas �93 (Cell Culture Facility, UC San Francisco, SF, CA) y celulas huesped diana que estan compuestas de la linea celular

10 de osteosarcoma humano que expresa CD4 (HT4) mas CCR y CXCR4 o la linea celular de astrocitoma (U-8�) que expresa CD4 y CCR� 6 CD4 y CXCR4. [0128] Las pruebas de sensibilidad farmacol6gica se realizaron por medio de pHIVenv y pHIVluc o pHIVluc U3. Las particulas del VIH pseudotipado que contienen proteinas de la envoltura codificadas por el segmento derivados de paciente fueron producidas

15 mediante la transfecci6n de una celula huesped de empaquetamiento (HEK �93) con el ADN vector de la prueba de resistencia. Las particulas virales se recogieron (-48 h) despues de la transfecci6n y se utilizaron para infectar las celulas diana (HT4/CCR�/CXCR4, o U-8�/CD4/CXCR4, o U-8�/CD4/CCR�) que expresan receptores (es decir, CD4) y correceptores (es decir, CXCR4, CCR�) del VIH. Despues

20 de la infecci6n (-��h), las celulas diana son lisadas y la actividad de luciferasa es medida. El VIH debe completar una ronda de replicaci6n para infectar la celula huesped diana con exito y producir actividad de luciferasa. La cantidad de actividad de luciferasa detectada en las celulas infectadas se utiliza como medida directa de "infectividad" (Figuras 1 y 2). Si por cualquier raz6n (ej. falta del receptor o correceptor

25 adecuado, actividad farmacol6gica inhibitoria, uni6n con los anticuerpos neutralizantes), el virus es incapaz de entrar en la celula diana, la actividad de luciferasa disminuye. La sensibilidad farmacol6gica se eval(a mediante la comparaci6n de la infectividad en ausencia de farmacos con la la infectividad en presencia de farmacos. La sensibilidad farmacol6gica relativa se puede cuantificar

30 mediante la comparaci6n de la sensibilidad del virus de prueba con la sensibilidad de un virus de referencia bien identificado (en estado natural) derivado de un clon molecular del VIH-1, por ejemplo NL4-3 o HXB . [0129] Las celula huesped de empaquetamiento fueron sembradas en placas de 10 cm de diametro y fueron transfectadas un dia despues de la siembra con pHIVenv y

35 pHIVluc o pHIVlucAU3. Las transfecciones se realizaron mediante un procedimiento de coprecipitaci6n de calcio-fosfato. Los medios de cultivo celular que contenian la precipitaci6n de ADN fueron reemplazados por el medio fresco, de una a �4 horas, despues de la transfecci6n. Los medios de cultivo celular que contenian particulas virales fueron cultivados normalmente dos dias despues de la transfecci6n y fueron filtrados con un filtro de 0,4�-mm. Antes de la infecci6n, las celulas diana fueron

5 sembradas en medios de cultivo celular. Los farmacos inhibidores de entrada fueron anadidos a celulas diana normalmente en el momento de la infecci6n (ocasionalmente, un dia antes de la infecci6n). Normalmente, 3 dias despues de la infecci6n, las celulas diana se analizaron para medir la actividad de luciferasa mediante el reactivo Steady-Glo (Promega) y un lumin6metro.

10 [0130] En un modo de realizaci6n, se demostr6 la sensibilidad a los farmacos inhibidores de fusi6n (T-�0, tambien llamados DP1�8; Trimeris, Research Triangle Park, NC) (Figura 6). Las celulas diana (HT4/CCR�/CXCR4) que expresan CD4, CCR� y CXCR4 fueron infectadas en ausencia de T-�0 y sobre una amplia gama de concentraciones de T-�0 (eje de x escala log10). El porcentaje de inhibici6n de

15 replicaci6n viral (eje de y) se determin6 mediante la comparaci6n de la cantidad de luciferasa producida en las celulas infectadas en presencia de T-�0 con la cantidad de luciferasa producida en ausencia de T-�0. Los virus tr6picos R� (JRCSF, 91US00�.11), los virus tr6picos X4 (NL4-3, 9 HT �99. �4) y los virus tr6picos duales (9�HT �93.1) fueron examinados. La sensibilidad farmacol6gica se cuantific6 mediante

20 la determinaci6n de la concentraci6n de T-�0 requerida para inhibir la replicaci6n viral en un �0� (IC �0 esta expresado con lineas discontinuas verticales en la Figura 6). Los virus con valores de IC �0 mas bajos son mas sensibles a T-�0 que los virus con valores de IC �0 mas altos. [0131] En otros modos de realizaci6n, la sensibilidad a una amplia variedad de

25 inhibidores de entrada se puede medir. Dichos inhibidores incluyen, sin caracter limitativo, los farmacos y compuestos que aparecen en la Tabla 4 (tabla de farmacos contra el VIH). [0132] En un segundo modo de realizaci6n, se demostr6 la sensibilidad a un inhibidor de CCR� perteneciente a la clase de compuestos de butano 4-(piperidin-1-yl) [Dorn,

30 C.P. et al., (�001), Finke, P.E. et al., ( �001); Merck, West Point, PA]. Las celulas diana (U-8�/CD4/CCR�) que expresan CD4 y CCR� (celulas R�) fueron infectadas en ausencia del inhibidor de CCR� y sobre una amplia gama de concentraciones de inhibidores de CCR� (eje de x escala log10). El porcentaje de inhibici6n de replicaci6n viral (eje de y) se determin6 mediante la comparaci6n de la cantidad de luciferasa

35 producida en las celulas infectadas en presencia del inhibidor de CCR� con la cantidad de luciferasa producida en ausencia del inhibidor de CCR�. Los virus tr6picos R�

(JRCSF), los virus tr6picos X4 (NL4-3) y los virus tr6picos duales (9�HT�93.1) fueron examinados. La sensibilidad farmacol6gica se cuantific6 mediante la determinaci6n de la concentraci6n del inhibidor de CCR� requerida para inhibir la replicaci6n viral en un �0� (IC �0 esta expresado con lineas de puntos/discontinuas verticales en la Figura 8).

5 Los virus con valores de IC �0 mas bajos son mas sensibles al inhibidor de CCR� que los virus con valores de IC �0 mas altos.Los virus tr6picos X4no infectaron a las celulas diana U-8�/CD4/CCR�. [0133] En un tercer modo de realizaci6n, se demostr6 la sensibilidad a un inhibidor de CXCR4 (AMD3100; AnorMED). Las celulas diana (U-8�/CD4/ CXCR4) que expresan

10 CD4 y CXCR4 (celulas R�) fueron infectadas en ausencia del inhibidor de CXCR4 y sobre una amplia gama de concentraciones de inhibidores de CXCR4 (eje de x escala log10). El porcentaje de inhibici6n de replicaci6n viral (eje de y) se determin6 mediante la comparaci6n de la cantidad de luciferasa producida en las celulas infectadas en presencia del inhibidor de CXCR4 con la cantidad de luciferasa producida en ausencia

15 del inhibidor de CXCR4. Los virus tr6picos R� (JRCSF), los virus tr6picos X4 (NL4-3) y los virus tr6picos duales (9�HT �93.1) fueron examinados. La sensibilidad a los farmacos se cuantific6 mediante la determinaci6n de la concentraci6n del inhibidor de CXCR4 requerida para inhibir la replicaci6n viral en un �0� (IC �0 esta expresado con lineas discontinuas verticales en la Figura 9).Los virus con valores de IC �0mas bajos

20 son mas sensibles al inhibidor de CCR� que los virus con valores de IC �0 mas altos. Los virus tr6picos R� no infectaron las celulas diana U-8�/CD4/ CXCR4. [0134] La sensibilidad a un inhibidor de CD4 (ej. al anticuerpo monoclonal murino �A8; Tanox, Houston, TX) se puede medir. Las celulas diana (ej. HT4/CCR�/CXCR4, U8�/CD4/CXCR4, o U-8� /CD4/CCR�) que expresan CD4 y uno o ambos correceptores

25 pueden ser infectadas en ausencia del farmaco inhibidor de CD4 y sobre una amplia gama de concentraciones farmacol6gicas de inhibidores de CD4 (eje de x escala log10). El porcentaje de inhibici6n de replicaci6n viral (eje de y) se puede determinar mediante la comparaci6n de la cantidad de luciferasa producida en las celulas infectadas en presencia del inhibidor de CD4 con la cantidad de luciferasa producida

30 en ausencia del inhibidor de CD4. Los virus tr6picos R� (ej. JRCSF), los virus tr6picos X4 (ej. NL4-3) y los virus tr6picos duales (ej. 9�HT �93.1) se pueden examinar. La sensibilidad a los farmacos se puede cuantificar mediante la determinaci6n de la concentraci6n del inhibidor de CD4 requerida para inhibir la replicaci6n viral en un �0� (IC �0).Los virus con valores de IC �0 mas bajos son mas sensibles al inhibidor de CD4

35 quelos virus convalores de IC �0 mas altos.

EJEMPLO 2

Descubrimiento, optimizacion y caracterizacion de inhibidores de la entrada viral nuevos y novedosos [0135] En un modo de realizaci6n, el ensayo de entrada viral se puede utilizar para identificar nuevos compuestos o entes quimicos que inhiben la entrada viral. Las

5 celulas diana (ej. HT4/CCR�/CXCR4, U-8� /CD4/CXCR4, o U-8� /CD4/CCR�) que expresan CD4 y uno o ambos correceptores pueden ser infectadas en presencia de miembros individuales de quimiotecas grandes (pruebas de alto rendimiento, high throughput screening o HTS). La habilidad de un compuesto de inhibir la replicaci6n viral (una HTS) se puede determinar mediante la comparaci6n de la cantidad de

10 luciferasa producida en las celulas diana infectadas en presencia de un compuesto especifico con la cantidad de luciferasa producida en ausencia del compuesto. [0136] En otro modo de realizaci6n, el ensayo de entrada viral se puede utilizar para optimizar la actividad antiviral de los compuestos de partida identificados por la HTS. Los derivados quimicos modificados de compuestos de partida se pueden examinar

15 para identificar derivados especificos que han amplificado la actividad inhibidora de la entrada viral. Las celulas diana (ej. HT4/CCR�/CXCR4, U-8� /CD4/CXCR4, o U-8�/CD4/CCR�) que expresan CD4 y uno o ambos correceptores pueden ser infectadas en ausencia del inhibidor candidato y sobre una amplia gama de concentraciones de candidatos inhibidores (eje de x escala log10). El porcentaje de

20 inhibici6n de replicaci6n viral (eje de y) se puede determinar mediante la comparaci6n de la cantidad de luciferasa producida en las celulas infectadas en presencia del candidato inhibidor con la cantidad de luciferasa producida en ausencia del inhibidor candidato. La sensibilidad farmacol6gica se puede cuantificar mediante la determinaci6n de la concentraci6n del inhibidor candidato requerida para inhibir la

25 replicaci6n viral en un 0� (IC �0).Los compuestos derivados con valores de IC �0 mas bajos son inhibidores de entrada viral mas potentes (tienen una mayor actividad antiviral) quelos derivados con valores de IC �0 mas altos. [0137] En otro modo de realizaci6n, el ensayo de entrada viral se puede utilizar para caracterizar el mecanismo de acci6n de nuevos farmacos inhibidores de la entrada

30 viral candidatos y la actividad viral en contraste con un espectro de virus que pueden diferir en sensibilidad. Las celulas diana (ej. HT4/CCR�/CXCR4, U-8� /CD4/CXCR4, o U-8�/CD4/CCR�) que expresan CD4 y uno o ambos correceptores pueden ser infectadas en ausencia del nuevo farmaco inhibidor de entrada candidato y sobre una amplia gama de concentraciones de farmacos inhibidores de entrada (eje de x escala

35 log10). El porcentaje de inhibici6n de replicaci6n viral (eje de y) se puede determinar mediante la comparaci6n de la cantidad de luciferasa producida en las celulas infectadas en presencia del nuevo inhibidor de entrada con la cantidad de luciferasa producida en ausencia del nuevo inhibidor de entrada. Los virus tr6picos R� (ej. JRCSF), los virus tr6picos X4 (ej. NL4-3) y los virus tr6picos duales (ej. 9 HT �93.1) se pueden examinar. La sensibilidad a los farmacos se puede cuantificar mediante la

5 determinaci6n de la concentraci6n de inhibidor de CD4 requerida para inhibir la replicaci6n viral en un �0� (IC �0). [0138] Para determinar si el nuevo inhibidor de entrada act(a bloqueando los correceptores CCR� o CXCR4, los virus tr6picos R� se ponen a prueba contra el nuevo inhibidor en celulas U-8�/CD4/CCR� y los virus tr6picos X4 se ponen a prueba

10 contra el nuevo inhibidor en celulas U-8� /CD4/CXCR4. La inhibici6n de la infecci6n de los virus R� revela el antagonismo del correceptor CCR� y, a la inversa, la inhibici6n de la infecci6n de los virus X4 revela el antagonismo del correceptor CXCR4. La inhibici6n de la infecci6n de los virus R� y X4 puede revelar el antagonismo de CD4 o la inhibici6n de la fusi6n de la membrana.

15 [0139] Para caracterizar la actividad de un nuevo inhibidor contra virus que muestran resistencia, o tienen una sensibilidad reducida, a otros inhibidores de la entrada viral del mismo tipo, o de tipo distinto, cuadros seleccionados de virus resistentes a los farmacos se pueden analizar en el ensayo de entrada viral mediante el nuevo inhibidor de entrada viral. El cuadro puede incluir virus con niveles variados de sensibilidad a los

20 inhibidores de CCR�, los inhibidores de CXCR4, los inhibidores de CD4 e inhibidores de fusi6n de la membrana. El cuadro puede incluir virus con una mutaci6n especifica o mas que esten asociadas con una sensibilidad/resistencia reducida a un inhibidor de entrada o mas.

EJEMPLO 3

25 Identificacion de sustituciones�mutaciones de amino�cidos de la envoltura �ue alteran la sensibilidad a los inhibidores de la entrada viral [0140] Este ejemplo proporciona un medio y metodo para identificar mutaciones en la envoltura del VIH-1 que confieren una sensibilidad/resistencia reducida a los inhibidores de la entrada viral. Este ejemplo tambien proporciona un medio y metodo

30 para cuantificar el grado de sensibilidad reducida a los inhibidores de entrada que confieren las mutaciones en la envoltura especificas. [0141] Las secuencias de la envoltura derivadas de muestras de pacientes, o los clones individuales derivados de muestras de pacientes, o las secuencias de la envoltura disenadas mediante mutagenesis de sitio dirigido para que contengan

35 mutaciones especificas, se analizan en el ensayo de entrada para cuantificar la sensibilidad a los farmacos basada en un estandar de referencia bien identificado (ej.

NL4-3, HXB �). [0142] En un modo de realizaci6n, se eval(a la sensibilidad a las muestras longitudinales del paciente (virus recogidos del mismo paciente en diferentes fechas de evaluaci6n). Por ejemplo, la sensibilidad a los inhibidores de entrada se mide antes

5 de iniciar la terapia, antes o despues de introducir cambios en el tratamiento farmacol6gico, o antes o despues de introducir cambios en marcadores virol6gicos (n(mero de copia de ARN), inmunol6gicos (linfocitos T CD4) o clinicos (infecci6n oportunista) de progresi6n de la enfermedad.

An�lisis genotipico de muestras del VIH de pacientes

10 [0143] Las secuencias de la envoltura que representan conjuntos de muestras de pacientes, o clones derivados de conjuntos de pacientes, pueden ser analizadas mediante todos los metodos de secuenciaci6n de ADN de amplia disponibilidad. En un modo de realizaci6n, las secuencias de muestras del VIH de pacientes son determinadas por medio de la purificaci6n del ARN viral, RT/PCR y electroforesis

15 quimica y capilar en gel que secuencia los finalizadores de cadena dideoxinucle6tidos (Applied Biosystems, Foster City, CA). Las secuencias de la envoltura de conjuntos de virus de pacientes o clones son comparadas con secuencias de referencia, otras muestras de pacientes o con una muestra obtenida del mismo paciente antes de la iniciaci6n de la terapia, si existe disponibilidad. El genotipo es examinado para analizar

20 las secuencias que son distintas de la secuencia de referencia o de pre-tratamiento y estan correlacionadas con las diferencias en la sensibilidad a los inhibidores de entrada. Sensibilidad a los inhibidores de entrada de mutantes de sitio dirigido [0144] Los cambios genotipicos que se correlacionan con los cambios de salud se

25 eval(an con la construcci6n de vectores de expresi6n de la envoltura (pHIVenv) que contienen la mutaci6n especifica en un contexto genetico definido, sensible a los farmacos (ej. cepa de referencia NL4-3). Las mutaciones pueden incorporarse por si solas y/o en combinaci6n con otras mutaciones que se cree que modulan la sensibilidad al inhibidor de entrada. Las mutaciones en la envoltura se introducen

30 dentro de vectores pHIVenv mediante cualquiera de los metodos de amplia disponibilidad para la mutagenesis de sitio dirigido. En un modo de realizaci6n, se utiliza el metodo mega-iniciador de la reacci6n en cadena de la polimerasa para la mutagenesis de sitio dirigido (Sarkar, G. and Summer, S.S., 1990). Un vector pHIVenv que contiene una mutaci6n o grupo de mutaciones especificas en la envoltura se

35 analiza mediante el ensayo de entrada viral descrito en el Ejemplo 1. La sensibilidad a los farmacos del virus con mutaciones en la envoltura se compara con la sensibilidad a los farmacos de un virus definido geneticamente sensible a los farmacos que carece de las mutaciones especificas bajo evaluaci6n. Los cambios observados en la sensibilidad a los inhibidores de entrada se atribuyen a las mutaciones introducidas en el vector pHIVenv.

5 [0145] En un modo de realizaci6n, se demuestra la sensibilidad reducida al inhibidor de fusi6n T-�0 que confieren las mutaciones especificas de resistencia farmacol6gica en la proteina de la envoltura gp41 (Figura ). Las celulas que expresan CD4, CCR� y CXCR4 fueron infectadas en ausencia de T-�0 y sobre una amplia gama de concentraciones de T-�0 (eje de x escala log10). El porcentaje de inhibici6n de

10 replicaci6n viral (eje de y) fue determinado mediante la comparaci6n de la cantidad de luciferasa producida en las celulas infectadas en presencia de T-�0 con la cantidad de luciferasa producida en ausencia de T-�0. Los virus isogenicos que contienen una mutaci6n especifica o dos en la proteina transmembrana de la envoltura gp41 se analizaron (resaltados en rojo en la leyenda de figuras; Rimsky et al., J. Virol. ��: 98

15 993). La sensibilidad a los farmacos se puede cuantificar al determinar la concentraci6n de T-�0 requerida para inhibir la replicaci6n viral en un �0� (IC �0, expresado con lineas verticales de puntos). Los virus con valores de IC �0 mas bajos son mas sensibles aT-0 que los virus con valores de IC �0 mas altos. [0146] En un modo de realizaci6n, fueron introducidas mutaciones de resistencia

20 farmacol6gica en virus tr6picos X4 (NL4-3) y virus tr6picos R� (JRCSF) bien identificados. La sensibilidad a T-�0 se midi6 mediante el ensayo de entrada viral (Figura 7). El n(mero de veces que cambi6 la sensibilidad a T-�0 para cada virus fue determinado al dividir la IC �0 del virus de prueba entre la IC �0 de la cepa HXB� del VIH

1. La sensibilidad a T-0 de virus mutantes similares ha sido documentada en las

25 publicaciones cientificas (Rimsky et al.). En este modo de realizaci6n, los virus con una mutaci6n dentro del motivo de GIV de gp41 (DIV, GIM, SIV) fueron menos sensibles a T-�0 que el virus en estado natural (GIV) (Figura 11). Los virus con dos mutaciones dentro del motivo de GIV (DIM, SIM, DTV) fueron menos sensibles a T-�0 que los virus con una o ninguna mutaci6n en el motivo de GIV (Figura 11).

30 [0147] En otro modo de realizaci6n, las mutaciones que pueden conferir una reducida (o incrementada) sensibilidad al inhibidor de entrada son identificados mediante la secuenciaci6n de los genes de envoltura de los virus sensibles y resistentes. Las deducidas secuencias de aminoacidos de los virus sensibles y resistentes se comparan para identificar mutaciones candidatas de resistencia a los farmacos. La

35 habilidad de una mutaci6n especifica de conferir sensibilidad a los farmacos alterada se confirma o refuta por medio de la introducci6n de la mutaci6n en un virus sensible a los farmacos y la medici6n de la sensibilidad del virus mutante en el ensayo de entrada viral. En el ejemplo representado aqui, una extensi6n corta de secuencias de aminoacidos dentro de la primera repetici6n heptad (HR-1) de la proteina transmembrana de la envoltura gp41 del VIH-1 se alinea para virus que muestren

5 diferentes sensibilidades a T-�0 (Figura 11). Los aminoacidos resaltados representan mutaciones que confieren una sensibilidad reducida a T-�0.

[0148] Analisis fenotipicos y genotipicos similares se pueden utilizar para identificar secuencias de aminoacidos de la envoltura que (a) alteran/influencian la sensibilidad a los inhibidores de CCR� o CXCR4, (b) especifican X4, R� y el tropismo dual y (c)

10 obtienen anticuerpos neutralizantes. [0149] En un modo de realizaci6n, se demuestra la sensibilidad reducida a los inhibidores de los correceptores (CCR�, CXCR4) otorgada por secuencias/mutaciones de aminoacidos de la envoltura especificas. [0150] Tambien en otro modo de realizaci6n, se demuestra la sensibilidad reducida

15 inhibidores del receptor (CD4) otorgada por secuencias/mutaciones de aminoacidos de la envoltura especificas.

EJEMPLO 4 Determinacion del tropismo del VIH-1 por los receptores y correceptores [0151] Este ejemplo proporciona un medio y metodo para determinar el tropismo por

20 los correceptores del VIH-1. Este ejemplo tambien proporciona un medio y metodo para determinar el tropismo por los receptores del VIH-1. [0152] En un modo de realizaci6n, se identific6 a virus que utilizan el correceptor CCR�. En un modo de realizaci6n relacionado, se identific6 a virus que utilizan el correceptor CXCR4. En un modo de realizaci6n tambien relacionado, se identificaron

25 virus que utilizan CCR� y CXCR4. En un modo de realizaci6n tambien relacionado, se identificaron virus que utilizan correceptores diferentes de CCR� o CXCR4. [0153] En un modo de realizaci6n, se identificaron virus que utilizan el receptor CD4. En un modo de realizaci6n relacionado, se identificaron virus que utilizan CD8. En un modo de realizaci6n tambien relacionado, se identificaron virus que no requieren CD4

30 o CD8 para infectar celulas. [0154] En este modo de realizaci6n, el ensayo se realiza mediante dos lineas celulares. Una linea celular expresa CD4 mas CCR� (U-8�/CD4/CCR�), tambien llamadas celulas R en esta solicitud. La otra linea celular expresa CD4 and CXCR4 (U-8�/CD4/CXCR4), tambien llamadas celulas X4 en esta solicitud. El ensayo de

35 entrada viral se realiza mediante la infecci6n de cultivos de celulas individuales con

reservas de virus recombinantes derivadas de celulas transfectadas con vectores pHIVenv y pHIV luc o pHIVlucDU3. Los vectores pHIVenv contienen secuencias derivadas de virus de pacientes y expresan proteinas de la envoltura del VIH-1 (gp1�0SU, gp41TM). En este modo de realizaci6n, los virus son evaluados utilizando 5 celulas diana R� y X4 cultivadas en placas de 9 pocillos. (Figura 3A). Normalmente, las celulas R� y X4 se siembran un dia antes de la infecci6n. La infecci6n con cada reserva de virus se realiza en ausencia de farmaco (sin farmaco), en presencia de concentraciones inhibidoras de un farmaco que preferiblemente inhibe los virus tr6picos R� (inhibidor de CCR�, ej. un compuesto de butano piperidin 1yl) y en 10 presencia de concentraciones inhibidoras de un farmaco que preferiblemente inhibe los virus tr6picos X4 (inhibidor de CXCR4, ej. AMD3100). El tropismo por los correceptores se eval(a mediante la comparaci6n de la cantidad de luciferasa producida en cada tipo de celula, tanto en presencia como en ausencia de farmacos. En este modo de realizaci6n, los resultados del ensayo se interpretan al comparar la 15 habilidad de cada virus para infectar preferiblemente (producir actividad de luciferasa) celulas R� o celulas X4, o tanto celulas X4 como R� si el virus es tr6pico dual. La habilidad del inhibidor de CCR� o CXCR4 de bloquear selectivamente la infecci6n (inhibir actividad de luciferasa) tambien se eval(a (Figura 3B). En este modo de realizaci6n, los virus tr6picos X4 infectan celulas X4 pero no celulas R� y la infecci6n 20 de celulas X4 es bloqueada por el inhibidor de CXCR4 (AMD3100). En este modo de realizaci6n, los virus tr6picos R� infectan celulas R� pero no celulas X4 y la infecci6n de celulas R� es bloqueada por el inhibidor de CCR� (compuesto de butano piperidin 1yl). En este modo de realizaci6n, los virus tr6picos duales, o mezclas de virus tr6picos X4 y R �, infectan tanto celulas X4 como R� y la infecci6n de celulas R� es bloqueada

25 por el inhibidor de CCR y la infecci6n de celulas X4 es bloqueada por el inhibidor de CXCR4. En este modo de realizaci6n, los virus no viables no se replican ni en celulas X4 ni R� (no se produce actividad de luciferasa). [0155] En otro modo de realizaci6n, el ensayo se realiza mediante tres o mas lineas celulares. Una linea celular expresa CD4 mas CCR� (U-8�/CD4/CCR�), tambien

30 llamadas celulas R en esta solicitud. La otra linea celular expresa CD4 y CXCR4 (U8�/CD4/CXCR4), tambien llamadas celulas X4 en esta solicitud. Las lineas celulares adicionales expresan CD4 mas otros correceptores candidatos del VIH-1, incluyendo, sin caracter limitativo, BONZO, BOB, etc. Ver Tabla 1. Estas lineas celulares adicionales expresan otros correceptores candidatos, pero no expresan CCR� o

35 CXCR4. El ensayo de entrada viral se realiza mediante la infecci6n de cultivos de celulas individuales con reservas de virus recombinantes derivadas de celulas

transfectadas con vectores pHIVenv y pHIV luc o pHIVlucDU3. Los vectores pHIVenv contienen secuencias derivadas de virus de pacientes y expresan proteinas de la envoltura del VIH-1(gp1 �0SU, gp41TM). En este modo de realizaci6n, los virus son evaluados utilizando celulas cultivadas en placas de 9� pocillos. La infecci6n con cada 5 reserva de virus se realiza en celulas R�, celulas X4 y las lineas celulares que expresan CD4 mas los correceptores candidatos. El tropismo por los correceptores se eval(a mediante la comparaci6n de la cantidad de actividad de luciferasa producida en cada tipo de celula. En este modo de realizaci6n, los resultados del ensayo se interpretan mediante la comparaci6n de la habilidad de cada virus para infectar 10 preferiblemente (producir actividad de luciferasa) celulas R� o celulas X4 o la linea celular que expresa el correceptor candidato. En este modo de realizaci6n, los virus tr6picos X4 infectan celulas X4 pero no celulas R�. En este modo de realizaci6n, los virus tr6picos R� infectan celulas R� pero no celulas X4. En este modo de realizaci6n, los virus tr6picos duales, o mezclas de virus tr6picos X4 y R �, infectan tanto celulas X4

15 como R �. En este modo de realizaci6n, la infecci6n de las lineas celulares que expresan correceptores candidatos alternativos (ni CCR� ni CXCR4) se atribuye al tropismo por el correceptor alternativo. En este modo de realizaci6n, los virus no viables no se replican ni en celulas X4 ni R� . [0156] En otro modo de realizaci6n, el ensayo se realiza mediante cuatro lineas

20 celulares. Una linea celular expresa CD4 mas CCR� (U-8�/CD4/CCR�), tambien llamadas celulas R en esta solicitud. Una segunda linea celular expresa CD4 y CXCR4 (U-8� /CD4/CXCR4), tambien llamadas celulas X4 en esta solicitud. Una tercera linea celular expresa CD8 y CCR� (U-8�/CD8/CCR�), tambien llamadas celulas CD8/R en esta solicitud. Una cuarta linea celular expresa CD8 y CXCR4 (U

25 8�/CD8/CXCR4), tambien llamadas celulas CD8/X4 en esta solicitud. El ensayo de entrada viral se realiza mediante la infecci6n de cultivos de celulas individuales con reservas de virus recombinantes derivadas de celulas transfectadas con vectores pHIVenv y pHIV luc o pHIVlucDU3. Los vectores pHIVenv contienen secuencias derivadas de virus de pacientes y expresan proteinas de la envoltura del VIH

30 1(gp1�0SU, gp41TM). En este modo de realizaci6n, los virus se eval(an utilizando celulas cultivadas en placas de 9� pocillos. La infecci6n con cada reserva de virus se realiza en celulas R�, celulas X4, celulas CD8/R� y celulas CD8/X4. El tropismo por los correceptores se eval(a mediante la comparaci6n de la cantidad de actividad de luciferasa producida en cada tipo de celula. En este modo de realizaci6n, los

35 resultados del ensayo se interpretan mediante la comparaci6n de la habilidad de cada virus para infectar preferiblemente (producir actividad de luciferasa) celulas R�, celulas X4, celulas CD8/R o celulas CD8/X4. En este modo de realizaci6n, los virus tr6picos CD4 infectan celulas X4 y/o celulas R �. En este modo de realizaci6n, los virus tr6picos CD8 infectan celulas CD8/R y/o celulas CD8/X4. En este modo de realizaci6n, los virus tr6picos duales (utilizaci6n de receptores CD4 y CD8) infectan celulas X4 y/o

5 celulas R� mas celulas CD8/X4 o celulas CD8/R �. En este modo de realizaci6n, la infecci6n de las lineas celulares que expresan CD8 pero no CD4 se atribuye al tropismo por el receptor CD8. En este modo de realizaci6n, los virus no viables no se replican ni en celulas X4 ni R�. [0157] En otro modo de realizaci6n tambien relacionado, el ensayo se realiza

10 mediante dos lineas celulares. Una linea celular expresa CD4 mas CCR� y CXCR4 (HT4/CCR�/CXCR4). Una segunda linea celular expresa CD8 mas CCR� y CXCR4 (HOS/CD8/CCR�/CXCR4). El ensayo de entrada viral se realiza mediante la infecci6n de cultivos de celulas individuales con reservas de virus recombinantes derivadas de celulas transfectadas con vectores pHIVenv y pHIV luc o pHIVlucDU3. Los vectores

15 pHIVenv contienen secuencias derivadas de virus de pacientes y expresan proteinas de la envoltura del VIH-1 (gp1�0SU, gp41TM). En este modo de realizaci6n, los virus son evaluados utilizando celulas cultivadas en placas de 9� pocillos. La infecci6n con cada reserva de virus se realiza en celulas HT4/CCR�/CXCR4 y celulas HOS/CD8/CCR�/CXCR4. El tropismo por los correceptores se eval(a mediante la

20 comparaci6n de la cantidad de actividad luciferasa producida en cada tipo de celula. En este modo de realizaci6n, los resultados del ensayo se interpretan mediante la comparaci6n de la habilidad de cada virus para infectar preferiblemente (producir actividad de luciferasa) celulas HT4/CCR�/CXCR4 o celulas HOS/CD8/CCR�/CXCR4. En este modo de realizaci6n, los virus tr6picos CD4 infectan celulas

25 HT4/CCR�/CXCR4, pero no celulas HOS/CD8/CCR�/CXCR4. En este modo de realizaci6n, los virus tr6picos CD8 infectan celulas HOS/CD8/CCR�/CXCR4, pero no celulas HT4/CCR�/CXCR4. En este modo de realizaci6n, los virus tr6picos duales (utilizaci6n de receptores CD4 y CD8) infectan tanto celulas HT4/CCR�/CXCR4 como celulas HOS/CD8/CCR�/CXCR4. En este modo de realizaci6n, la infecci6n de las

30 lineas celulares que expresan CD8 pero no CD4 se atribuye al tropismo por el receptor CD8. En este modo de realizaci6n, los virus no viables no se replican en celulas X4 ni

R. [0158] En otro modo de realizaci6n, el ensayo se realiza mediante dos lineas celulares. Una linea celular expresa CD4 mas CCR� y CXCR4 (HT4/CCR�/CXCR4).

35 Una segunda linea celular expresa CCR� y CXCR4, pero no CD4 ni CD8 (HOS/CCR�/CXCR4). El ensayo de entrada viral se realiza mediante la infecci6n de

cultivos de celulas individuales con reservas de virus recombinantes derivadas de celulas transfectadas con vectores pHIVenv y pHIV luc o pHIVlucDU3. Los vectores pHIVenv contienen secuencias derivadas de virus de pacientes y expresan proteinas de la envoltura del VIH-1 (gp1�0SU, gp41TM). En este modo de realizaci6n, los virus 5 se eval(an utilizando celulas cultivadas en placas de 9� pocillos. La infecci6n con cada reserva de virus se realiza en celulas HT4/CCR�/CXCR4 y celulas HOS/CCR�/CXCR4. La infecci6n independiente de CD4 y CD8 se eval(a mediante la comparaci6n de la cantidad de actividad de luciferasa producida en cada tipo de celula. En este modo de realizaci6n, los resultados del ensayo se interpretan mediante 10 la comparaci6n de la habilidad de cada virus de infectar preferiblemente (producir actividad de luciferasa) celulas HT4/CCR�/CXCR4 o celulas HOS/CCR�/CXCR4. En este modo de realizaci6n, los virus dependientes de CD4 infectan celulas HT4/CCR�/CXCR4, pero no celulas HOS/CCR /CXCR4 celulas. En este modo de realizaci6n, los virus tr6picos CD4 infectan tanto celulas HOS/CCR�/CXCR4 como

15 celulas HT4/CCR�/CXCR4. En este modo de realizaci6n, la infecci6n de las lineas celulares que carecen de la expresi6n de CD4 se atribuye a la infecci6n independiente de CD4. En este modo de realizaci6n, los virus no viables no se replican ni en celulas X4 ni en celulas R� .

EJEMPLO 5

20 Identificacion de sustituciones�mutaciones de amino�cidos de la envoltura �ue alteran el tropismo por los correceptores y receptores [0159] Este ejemplo proporciona un medio y metodo para identificar las secuencias de aminoacidos de la envoltura del VIH-1 que especifican, o alteran, el tropismo por los correceptores (X4 vs. R vs. X4/R dual). Este ejemplo tambien proporciona un medio

25 y metodo para identificar las secuencias de aminoacidos de la envoltura del VIH-1 que especifican el uso de correceptores distintos a CXCR4 o CCR�. Este ejemplo tambien proporciona un medio y metodo para identificar las secuencias de aminoacidos de la envoltura del VIH-1 que especifican el tropismo por los receptores (CD4 vs. CD8). [0160] Las secuencias de la envoltura derivadas de muestras de pacientes, los clones

30 individuales derivados de muestras de pacientes o las secuencias de la envoltura disenadas mediante mutagenesis de sitio dirigido para que contengan mutaciones especificas, se eval(an en el ensayo de entrada para determinar el tropismo por los correceptores como se describe en el E�emplo 4. [0161] En un modo de realizaci6n, se evalu6 el tropismo por los correceptores de

35 muestras longitudinales de pacientes (virus recogidos del mismo paciente en diferentes puntos temporales). Por ejemplo, el tropismo por los correceptores se evalu6 antes de iniciar la terapia, antes o despues de introducir cambios en el tratamiento farmacol6gico, o antes o despues de introducir cambios en marcadores virol6gicos (n(mero de copia de ARN), inmunol6gicos (linfocitos T CD4) o clinicos (infecci6n oportunista) de progresi6n de la enfermedad.

5 [0162] En otro modo de realizaci6n, el tropismo por los correceptores se evalu6 para analizar muestras recogidas de un gran n(mero de pacientes diferentes. En un modo de realizaci6n mas tardio, el tropismo por los correceptores se evalu6 para analizar muestras recogidas de un gran n(mero de pacientes representando poblaciones de virus y poblaciones de pacientes diferentes. Dichas poblaciones de pacientes pueden

10 incluir, sin caracter limitativo, pacientes recien infectados, pacientes con infecci6n cr6nica, pacientes con un estado avanzado de la enfermedad y pacientes sometiendose a terapia o inmunoterapia antirretroviral. Dichas poblaciones de virus pueden incluir, sin caracter limitativo, virus con caracteristicas geneticas distintas (clado A, B, C, D, E, F, G), virus sensibles a los farmacos antirretrovirales, virus con

15 una sensibilidad/resistencia reducida a los farmacos antirretrovirales. An�lisis genotipico de muestras de VIH de pacientes [0163] Las secuencias de la envoltura que representan conjuntos de muestras de pacientes, o clones derivados de conjuntos de pacientes, pueden ser analizados mediante todos los metodos de secuenciaci6n de ADN de amplia disponibilidad. En un

20 modo de realizaci6n, se determinan secuencias de muestras de VIH de pacientes mediante la purificaci6n del ARN viral, RT/PCR y electroforesis quimica y capilar en gel que secuencia los finalizadores de cadena didesoxinucle6tidos (Applied Biosystems, Foster City, CA). Las secuencias de la envoltura de conjuntos de virus de pacientes o clones se comparan con secuencias de referencia, otras muestras de

25 pacientes o con una muestra obtenida del mismo paciente antes del inicio de la terapia, si existe disponibilidad. El genotipo se eval(a para analizar las secuencias que son distintas de la secuencia de referencia o pretratamiento y estan correlacionadas con diferencias en la sensibilidad a los inhibidores de entrada.

Tropismo por los receptores y correceptores de virus caracterizados

30 gen�ticamente [0164] Las secuencias de aminoacidos que se correlacionan con el tropismo por los correceptores se eval(an mediante la construcci6n de vectores de expresi6n de la envoltura (pHIVenv) que contienen una mutaci6n especifica en un contexto genetico definido (ej. NL4-3 para el tropismo de X4, JRCSF para el tropismo de R�). Las

35 mutaciones pueden incorporarse por si solas y/o en combinaci6n con otras mutaciones que se cree que modulan el uso de los correceptores. Las mutaciones de la envoltura

se introducen dentro de vectores pHIVenv mediante cualquiera de los metodos de amplia disponibilidad para la mutagenesis de sitio dirigido. En un modo de realizaci6n, se utiliza el metodo mega-iniciador de la reacci6n en cadena de la polimerasa para la mutagenesis de sitio dirigido (Sarkar, G. and Summer, S.S., 1990). Un vector pHIVenv 5 que contiene una mutaci6n o grupo de mutaciones especificas de la envoltura se eval(a mediante el ensayo de entrada viral descrito en el Ejemplo 1. El tropismo por los correceptores del virus que contiene mutaciones en la envoltura se compara con el tropismo por los correceptores de un virus geneticamente definido que carece de las mutaciones especificas bajo evaluaci6n. La habilidad de una mutaci6n especifica de

10 conferir tropismo por los correceptores alterado se confirma o refuta por medio de la introducci6n de la mutaci6n en un virus de referencia bien identificado y la evaluaci6n del tropismo por los correceptores del virus mutante en el ensayo de entrada viral como se describe en el E�emplo 4. Los cambios observados en el tropismo por los correceptores se atribuyen a las mutaciones introducidas en el vector pHIVenv.

15 [0165] En un modo de realizaci6n, los determinantes geneticos del tropismo de R� son identificados mediante la evaluaci6n de secuencias de aminoacidos dentro de la regi6n V3 de la proteina de envoltura de la superficie gp1�0. Las secuencias de aminoacidos bajo evaluaci6n son identificadas mediante la comparaci6n de secuencias de aminoacidos de grandes n(meros de virus X4 tr6picos y R� tr6picos. Se seleccionan

20 diferencias consistentes entre los virus X4 y R� para evaluaci6n. Los virus isogenicos basados en un clon parental de X4 bien identificado (ej. NL4-3, HXB �) que contiene mutaciones especificas "candidatas de R�" de la regi6n V3 de la proteina de la envoltura gp1�0 se construyen mediante mutagenesis de sitio dirigido y se examinan para analizar el tropismo por los correceptores como se describe en el E�emplo 4. Las

25 celulas que expresan CD4 mas CCR� (ej. U-8� /CD4/CCR�) o CD4 mas CXCR4 (U8�/CD4/CXCR4) son infectadas en ausencia de un inhibidor de R� (compuesto de butano piperidin 1yl) y de X4 (AMD3100) y en presencia de concentraciones inhibidoras de R� y concentraciones farmacol6gicas de X4. Las sustituciones de aminoacidos que cambian el virus tr6pico X4 en un virus tr6pico R estan

30 caracterizadas como determinantes geneticos del tropismo de R�. [0166] En un modo de realizaci6n relacionado, los determinantes geneticos del tropismo de X4 son identificados mediante la evaluaci6n de secuencias de aminoacidos dentro de la regi6n V3 de la proteina de envoltura de la superficie gp1�0. Las secuencias de aminoacidos bajo evaluaci6n son identificadas mediante la

35 comparaci6n de secuencias de aminoacidos de grandes n(meros de virus X4 tr6picos y R� tr6picos. Se seleccionan diferencias consistentes entre los virus X4 y R� para evaluaci6n. Los virus isogenicos basados en un clon parental de R� bien identificado (ej. JRCSF) que contiene mutaciones especificas "candidatas de X4" en la regi6n V3 de la proteina de envoltura gp1�0 se construyen mediante mutagenesis de sitio dirigido y se examinan para analizar el tropismo por los correceptores como se decribe

5 en el E�emplo 4. Las celulas que expresan CD4 mas CCR� (ej. U-8� /CD4/CCR�) o CD4 mas CXCR4 (U-8 /CD4/CXCR4) son infectadas en ausencia de un inhibidor de R� (compuesto de butano piperidin 1yl) y de X4 (AMD3100) y en presencia de concentraciones inhibidoras de R� y concentraciones farmacol6gicas de X4. Las sustituciones de aminoacidos que cambian el virus tr6pico X4 en un virus tr6pico R

10 estan caracterizadas como determinantes geneticos del tropismo de R �. [0167] En un modo de realizaci6n relacionado, los determinantes geneticos del tropismo de X4 o R son identificados por medio de la evaluaci6n de las secuencias de aminoacidos dentro de la totalidad de la proteina de envoltura de la superficie gp1�0.

15 [0168] En un modo de realizaci6n relacionado, los determinantes geneticos del tropismo de X4 o R son identificados por medio de la evaluaci6n de las secuencias de aminoacidos dentro de la proteina transmembrana de la envoltura gp41. [0169] En un modo de realizaci6n relacionado, los determinantes geneticos que especifican el uso de correceptores diferentes de CCR� y CXCR4 son identificados

20 por medio de la evaluaci6n de las secuencias de aminoacidos dentro de la regi6n V3 de la proteina de envoltura de la superficie gp1 �0. Las secuencias de aminoacidos bajo evaluaci6n son identificadas mediante la comparaci6n de las secuencias de aminoacidos de virus que son capaces de replicarse en celulas que no expresan CXCR4 o CCR�, pero que si que expresan otros correceptores candidatos. Se

25 seleccionan diferencias consistentes en las secuencias de aminoacidos entre esos virus que no son X4 ni R� y los virus X4 y R� para evaluaci6n. Los virus isogenicos basados en un clon parental de un X4 bien identificado (ej. NL4-3) o de un R� bien identificado (ej. JRCSF) que contiene mutaciones candidatas especificas que no son de X4 ni de R� en la regi6n V3 de la proteina de envoltura gp1�0 se construyen

30 mediante mutagenesis de sitio dirigido y se examinan para analizar el tropismo por los correceptores como se decribe en el E�emplo 4. Las celulas que expresan CD4 mas CCR� (ej. U-8� /CD4/CCR�), CD4 mas CXCR4 (U-8�/CD4/CXCR4) y CD4 mas otros correceptores candidatos (U-8� /CD4/X) son infectadas en ausencia de un inhibidor de R� (compuesto de butano piperidin 1yl) y de X4 (AMD3100) y en presencia de

35 concentraciones inhibidoras de R� y concentraciones farmacol6gicas de X4. Las sustituciones de aminoacidos que confieren tropismo por un correceptor que no sea de X4 ni de R� estan caracterizadas como determinantes geneticos del tropismo por el correceptor especifico. [0170] En un modo de realizaci6n relacionado, los determinantes geneticos del tropismo por otros correceptores son identificados por medio de la evaluaci6n de las

5 secuencias de aminoacidos dentro de toda la proteina de envoltura de la superficie gp1�0. [0171] En un modo de realizaci6n relacionado, los determinantes geneticos del tropismo por otros correceptores son identificados por medio de la evaluaci6n de las secuencias de aminoacidos dentro de la proteina transmembrana de la envoltura

10 gp41. [0172] En otro modo de realizaci6n, los determinantes geneticos que especifican el uso de CD8 (ademas de, o en lugar de CD4) como receptor del VIH-1 son identificados por medio de la evaluaci6n de las secuencias de aminoacidos dentro de la regi6n V3 de la proteina de envoltura de la superficie gp1�0. Las secuencias de

15 aminoacidos bajo evaluaci6n son identificadas mediante la comparaci6n de las secuencias de aminoacidos de virus que son capaces de replicarse en celulas que no expresan CD4, pero que expresan CD8. Diferencias consistentes en las secuencias de aminoacidos entre dichos virus tr6picos CD4 y virus tr6picos CD8 son seleccionadas para evaluaci6n. Los virus isogenicos basados en clones parentales tr6picos de CD4

20 bien identificados (ej. NL4-3, JRCSF) que contienen mutaciones especificas "candidatas de CD8" en la regi6n V3 de la proteina de envoltura gp1�0 se construyen mediante mutagenesis de sitio dirigido y se examinan para analizar el tropismo por el receptor CD8 como se describe en el E�emplo 4. Las celulas que expresan CD4 mas CCR� (ej. U-8�/CD4/CCR�), CD4 mas CXCR4 (U-8�/CD4/CXCR4) CD8 mas CCR�

25 (ej. U-8�/CD8/CCR�), CD8 mas CXCR4 (U-8�/CD8/CXCR4) son infectadas. Las sustituciones de aminoacidos que permiten la replicaci6n en celulas que expresan CD8 pero no expresan CD4 estan caracterizadas como determinantes geneticos del tropismo por CD8. [0173] En un modo de realizaci6n relacionado, los determinantes geneticos del

30 tropismo por CD8 son identificados por medio de la evaluaci6n de las secuencias de aminoacidos dentro de la totalidad de la proteina de envoltura de la superficie gp1�0. [0174] En un modo de realizaci6n relacionado, los determinantes geneticos del tropismo por CD8 son identificados por medio de la evaluaci6n de las secuencias de aminoacidos dentro de la totalidad de la proteina transmembrana de la envoltura gp41.

35 EJEMPLO 6 Medicion de la neutralizacion de los anticuerpos del VIH-1

[0175] Este ejemplo proporciona un medio y metodo para evaluar la neutralizaci6n del VIH-1 con anticuerpos, tambien llamada neutralizaci6n viral en esta solicitud. Este ejemplo tambien proporciona un medio y metodo para evaluar la actividad de neutralizaci6n viral de los anticuerpos dentro de los pacientes infectados por el VIH-1. 5 Este ejemplo tambien proporciona un medio y metodo para evaluar la actividad de neutralizaci6n viral de los anticuerpos dentro de individuos o animales vacunados con vacunas terapeuticas y vacunas candidatas. Este ejemplo tambien proporciona un medio y metodo para evaluar la actividad de neutralizaci6n viral de los anticuerpos dentro de individuos o animales vacunados con vacunas protectoras (preventivas o

10 profilacticas) y vacunas candidatas. Este ejemplo tambien proporciona un medio y metodo para evaluar la actividad de neutralizaci6n viral o los preparados de anticuerpos monoclonales o policlonales especificos. [0176] Secuencias de la envoltura derivadas de muestras de pacientes, clones individuales derivados de muestras de pacientes o secuencias de la envoltura

15 disenadas mediante mutagenesis de sitio dirigido para que contengan mutaciones especificas son examinados en el ensayo de entrada para evaluar la neutralizaci6n con anticuerpos. [0177] En un modo de realizaci6n, se evalu6 la neutralizaci6n con anticuerpos en muestras longitudinales de pacientes (virus recogidos del mismo paciente en

20 diferentes puntos temporales). Por ejemplo, la neutralizaci6n con anticuerpos se evalu6 antes de la vacunaci6n, durante el curso de la vacunaci6n y en puntos temporales graduales despues de que se complete la vacunaci6n. En un modo de realizaci6n relacionado, los sueros de animales incluyendo, sin caracter limitativo, ratones, ratas, conejos, cerdos y ganado se eval(an antes de la

25 inoculaci6n con vacunas candidatas, durante un curso de la inoculaci6n repetida y en puntos temporales graduales despues de que se complete la inoculaci6n. En un modo de realizaci6n, la neutralizaci6n viral se eval(a para vacunas preventivas y vacunas candidatas. En otro modo de realizaci6n, la neutralizaci6n viral se eval(a para vacunas terapeuticas.

30 [0178] En otro modo de realizaci6n, la neutralizaci6n viral es evaluada para/en muestras recogidas de un gran n(mero de pacientes diferentes. [0179] En otro modo de realizaci6n, la neutralizaci6n viral es evaluada para/en muestras recogidas de un gran n(mero de pacientes diferentes que representan distintas poblaciones de pacientes y distintas poblaciones de virus. Las "poblaciones

35 de pacientes" pueden incluir, sin caracter limitativo, pacientes recien infectados, pacientes con infecci6n cr6nica, pacientes con un estado avanzado del VIH/SIDA,

pacientes con una progresi6n de la enfermedad rapida, pacientes con una progresi6n de la enfermedad lenta (llamados normalmente no progresadores a largo plazo), pacientes que estan sometiendose a terapia o inmunoterapia antirretroviral (ej. interleukin-� u otras citocinas), pacientes vacunados y no vacunados. Las "poblaciones 5 de virus" pueden incluir, sin caracter limitativo, virus con caracteristicas geneticas y origenes geograficos distintos (clado A; B, C, D, E, F, G), virus sensibles a los farmacos antirretrovirales, virus con una sensibilidad/resistencia reducida a los farmacos antirretrovirales, cepas primarias aisladas, cepas aisladas adaptadas al crecimiento en cultivo celular (llamados a menudo virus adaptados al laboratorio), virus

10 inductores de sinticios (SI), virus no inductores de sinticios (NSI), virus tr6picos macr6fagos (M), virus tr6picos de linfocitos T (T) y virus tr6picos duales (M y T). Caracterizacion de anticuerpos de pacientes (anticuerpos de pacientes vs. cuadro de virus est�ndar) [0180] En este modo de realizaci6n, el ensayo se realiza mediante una linea de

15 celulas diana que expresa el receptor CD4 del VIH-1 mas los correceptores CCR� y CXCR4 (HT4/CCR�/CXCR4) del VIH-1. Dicha linea celular es capaz de evaluar la actividad neutralizante de anticuerpos para tanto los virus tr6picos R� como X4. En un modo de realizaci6n relacionado, el ensayo se realiza mediante dos lineas de celulas diana. Una linea celular expresa CD4 mas CCR (U-8�/CD4/CCR�) y se utiliza para

20 evaluar los virus tr6picos R�. Otra linea celular expresa CD4 mas CXCR4 (U8�/CD4/CXCR4) y se utiliza para evaluar los virus tr6picos X4. El ensayo de entrada viral se realiza al infectar los cultivos de celulas diana individuales con reservas de virus recombinantes derivadas del empaquetamiento de celulas huesped transfectadas con los vectores pHIVenv y pHIVluc o pHIVlucDU3. En este modo de realizaci6n, los

25 vectores pHIVenv contienen secuencias de la envoltura de virus especificos bien identificados y expresan proteinas de la envoltura del VIH-1 (gp1�0SU, gp41TM). Dichos virus representan un "cuadro de virus estandar" (ver descripci6n de poblaci6n de virus arriba). Algunos, pero no todos, ejemplos razonables de virus que pueden constituir un cuadro estandar se enumeran en la Tabla 4. Un cuadro de virus estandar

30 se utiliza para comparar la actividad de anticuerpos neutralizantes de los sueros obtenidos de muchos pacientes diferentes y/o animales (ver descripci6n de poblaci6n de pacientes arriba). En este modo de realizaci6n, los virus son evaluados utilizando celulas diana R� y X4 cultivadas en placas de 9� pocillos. Normalmente, las celulas diana se plated en .000 celulas por pocillo para HT4/CCR�/CXCR4 o 10.000 celulas

35 por pocillo para U-8� /CD4/CCR� y U-8�/CD4/CXCR4 un dia antes de la infecci6n. Antes de la infecci6n de la celula diana, cada reserva de virus es preincubada con los

sueros o preparados de anticuerpos (normalmente durante 1 hora) que se estan evaluando. Los sueros o preparados de anticuerpos se examinan sin diluir y en disoluciones incrementalmente mayores (normalmente de cuatro a cinco disoluciones consecutivas de 10 veces). La infecci6n de celulas diana con cada reserva de virus 5 tambien se realiza en ausencia de anticuerpos (sin anticuerpos). La neutralizaci6n viral se eval(a mediante la comparaci6n de la cantidad de actividad de luciferasa producida en celulas diana, tanto en presencia como en ausencia de anticuerpos. En este modo de realizaci6n, los resultados del ensayo se interpretan al comparar la habilidad de cada anticuerpo para bloquear selectivamente la infecci6n de las celulas diana (reducir

10 o eliminar la actividad de luciferasa). La actividad de neutralizaci6n viral se cuantifica al observar la disoluci6n de anticuerpos mas alta (mas diluida) que es capaz de bloquear la infecci6n de la celula diana (ej. la disoluci6n mas alta que sea capaz de reducir en un �0� la actividad de luciferasa producida en ausencia del anticuerpo).

Caracterizacion del VIH-1 de pacientes (virus de pacientes vs. cuadro est�ndar

15 de virus) [0181] En este modo de realizaci6n, el ensayo se realiza mediante una linea de celulas diana que expresa el receptor CD4 del VIH-1 mas los correceptores CCR� y CXCR4 (HT4/CCR�/CXCR4) del VIH-1. Dicha linea celular es capaz de evaluar la actividad neutralizante de anticuerpos para tanto los virus tr6picos R� como los X4. En

20 un modo de realizaci6n relacionado, el ensayo se realiza mediante dos lineas de celulas diana. Una linea celular expresa CD4 mas CCR� (U-8� /CD4/CCR�) y se utiliza para examinar los virus tr6picos R�. Otra linea celular expresa CD4 mas CXCR4 (U8�/CD4/CXCR4) y se utiliza para evaluar los virus tr6picos X4. El ensayo de entrada viral se realiza al infectar los cultivos de celulas diana individuales con reservas de

25 virus recombinantes derivadas del empaquetamiento de celulas huesped transfectadas con los vectores pHIVenv y pHIVluc o pHIVlucDU3. En este modo de realizaci6n, los vectores pHIVenv contienen secuencias de la envoltura derivadas de virus de pacientes y expresan proteinas de la envoltura del VIH-1 (gp1�0SU, gp41TM). En este modo de realizaci6n, los virus de poblaciones de pacientes diferentes (ver descripci6n

30 de poblaci6n de pacientes arriba), y/o poblaciones de virus diferentes (ver descripci6n de poblaci6n de virus arriba) se utilizan para construir vectores pHIVenv. VIH pseudotipado derivado de vectores pHIVenv es evaluado en el ensayo de entrada viral para determinar si estos son sensibles a la neutralizaci6n mediante un cuadro de preparados de anticuerpos especificos bien identificados. Dichos anticuerpos

35 representan un "cuadro de anticuerpos estandar". Algunos, pero no todos, ejemplos razonables de virus que pueden constituir un cuadro estandar se enumeran en la

Tabla 4. En este modo de realizaci6n, la neutralizaci6n de virus se eval(a utilizando celulas diana R� y X4 cultivadas en placas de 9� pocillos. Normalmente, las celulas diana se plated en .000 celulas por pocillo para HT4/CCR�/CXCR4 o 10.000 celulas por pocillo para U-8� /CD4/CCR� y U-8�/CD4/CXCR4 un dia antes de la infecci6n. 5 Antes de la infecci6n de la celula diana, cada reserva de virus es incubada con cada uno de los preparados de anticuerpos (normalmente durante 1 hora) en el cuadro de anticuerpos estandar. Los sueros o preparados de anticuerpos se examinan sin diluir y en disoluciones (normalmente de cuatro a cinco disoluciones consecutivas de 10 veces). La infecci6n de celulas diana con cada reserva de virus tambien se realiza en 10 ausencia de farmacos (sin farmacos). La neutralizaci6n viral se eval(a al comparar la cantidad de actividad de luciferasa producida en celulas diana, tanto en presencia como en ausencia de anticuerpo. En este modo de realizaci6n, los resultados del ensayo se interpretan al comparar la habilidad de cada anticuerpo de bloquear selectivamente la infecci6n de las celulas diana (reducir o eliminar la actividad de

15 luciferasa). La actividad de neutralizaci6n viral se cuantifica al observar la disoluci6n de anticuerpos mas alta (mas diluida) que es capaz de bloquear la infecci6n de la celula diana (ej. la disoluci6n mas alta que sea capaz de reducir en un �0� la actividad de luciferasa producida en ausencia del anticuerpo).

EJEMPLO 7

20 Identificacion de secuencias de amino�cidos de la envoltura del VIH-1 �ue obtienen, alteran o previenen las respuestas de anticuerpos neutralizantes [0182] Este ejemplo proporciona un medio y metodo para identificar secuencias de aminoacidos de la envoltura del VIH-1 que obtienen, alteran o previenen la neutralizaci6n de la infecci6n del VIH-1 con anticuerpos (tambien llamada

25 neutralizaci6n viral en esta solicitud). [0183] Las secuencias de la envoltura derivadas de muestras de pacientes, los clones individuales derivados de muestras de pacientes, o las secuencias de la envoltura disenadas mediante mutagenesis de sitio dirigido para que contengan mutaciones especificas, se eval(an en el ensayo de entrada para determinar el tropismo por los

30 correceptores como se describe en el E�emplo 6. [0184] En un modo de realizaci6n, se eval(a la neutralizaci6n con anticuerpos en las muestras longitudinales de pacientes (virus recogidos del mismo paciente en diferentes puntos temporales). Por ejemplo, la neutralizaci6n viral se eval(a antes de la vacunaci6n, durante el curso de la vacunaci6n y en puntos temporales graduales

35 despues de que se completara la vacunaci6n. En un modo de realizaci6n, la neutralizaci6n viral es evaluada para vacunas preventivas. En otro modo de realizaci6n, la neutralizaci6n viral es evaluada para vacunas terapeuticas. [0185] En otro modo de realizaci6n, la neutralizaci6n viral es evaluada para/en muestras recogidas de un gran n(mero de pacientes diferentes. En tambien otro modo de realizaci6n, la neutralizaci6n viral es evaluada para/en muestras recogidas de un

5 gran n(mero de pacientes diferentes que representan distintas poblaciones de pacientes y distintas poblaciones de virus. Dichas "poblaciones de pacientes" pueden incluir, sin caracter limitativo, pacientes recien infectados, pacientes con infecci6n cr6nica, pacientes con enfermedad avanzada, pacientes que estan sometiendose a terapia o inmunoterapia antirretroviral, individuos vacunados y no vacunados. Las

10 "poblaciones de virus" pueden incluir, sin caracter limitativo, virus con caracteristicas geneticas distintas (clado A; B, C, D, E, F, G), virus sensibles a los farmacos antirretrovirales, virus con una sensibilidad/resistencia reducida a los farmacos antirretrovirales, cepas primarias aisladas, cepas aisladas adaptadas al crecimiento en el cultivo celular (llamados a menudo virus adaptados al laboratorio), virus inductores

15 de sinticios (SI), virus no inductores de sinticios (NSI), virus tr6picos macr6fagos (M), virus tr6picos de linfocitos T (T) y virus tr6picos duales (M y T). An�lisis genotipico de muestras de VIH de pacientes [0186] Las secuencias de la envoltura que representan conjuntos de muestras de pacientes, o clones derivados de conjuntos de pacientes, pueden ser analizados

20 mediante todos los metodos de secuenciaci6n de ADN de amplia disponibilidad. En un modo de realizaci6n, las secuencias de muestras de VIH de pacientes son determinadas por medio de la purificaci6n del ARN viral, RT/PCR y electroforesis quimica y capilar en gel que secuencia los finalizadores de cadena didesoxinucle6tidos (Applied Biosystems, Foster City, CA). Las secuencias de la envoltura de conjuntos de

25 virus de pacientes o clones se comparan con secuencias de referencia, muestras de otros pacientes o con una muestra obtenida del mismo paciente antes de la iniciaci6n de la terapia, si existe disponibilidad. El genotipo se eval(a para analizar las secuencias que son distintas de la secuencia de referencia o de pretratamiento y estan correlacionadas con las diferencias en la sensibilidad a los inhibidores de entrada.

30 Neutralizacion con anticuerpos de virus gen�ticamente caracterizados [0187] Las secuencias de aminoacidos de la envoltura que se correlacionan con la neutralizaci6n viral son evaluadas mediante la construcci6n de vectores de expresi6n de la envoltura (pHIVenv) que contienen una mutaci6n especifica en un contexto genetico definido (ej. NL4-3 para el tropismo de X4, JRCSF para el tropismo de R�).

35 Las mutaciones pueden ser incorporadas por si solas y/o en combinaci6n con otras mutaciones que se cree que modulan la neutralizaci6n viral. Las mutaciones de la

envoltura se introducen dentro de vectores pHIVenv utilizando cualquiera de los metodos de amplia disponibilidad para la mutagenesis de sitio dirigido. En un modo de realizaci6n, se utiliza el metodo mega-iniciador de la reacci6n en cadena de la polimerasa para la mutagenesis de sitio dirigido (Sarkar, G. and Summer, S.S., 1990). 5 Un vector pHIVenv que contiene una mutaci6n o grupo de mutaciones de la envoltura especifica se eval(a mediante el ensayo de entrada viral descrito en el E�emplo 6. Preparados de anticuerpos especificos (ej. preparados de anticuerpos monoclonales o policlonales bien identificados), suero de pacientes infectados por el VIH o suero de individuos vacunados se puede seleccionar para comparar la actividad neutralizante. 10 La neutralizaci6n de anticuerpos del virus que contiene mutaciones de la envoltura se compara con la neutralizaci6n de anticuerpos de un virus geneticamente definido que carece de las mutaciones especificas bajo evaluaci6n. La habilidad de una mutaci6n especifica de conferir, alterar o prevenir la neutralizaci6n de anticuerpos se confirma o refuta por medio de la introducci6n de la mutaci6n en un virus de referencia bien

15 identificado y de la evaluaci6n de la neutralizaci6n con anticuerpos del virus mutante en el ensayo de entrada viral como se describe en el E�emplo 6. Los cambios observados en la neutralizaci6n viral se atribuyen a las mutaciones especificas introducidas en el vector pHIVenv. [0188] En un modo de realizaci6n, los determinantes geneticos de la neutralizaci6n

20 viral son identificados al evaluar secuencias de aminoacidos dentro de la regi6n V3 de la proteina de envoltura de la superficie gp1�0. Las secuencias de aminoacidos bajo evaluaci6n son identificadas al comparar secuencias de aminoacidos de grandes n(meros de virus que pueden, o no pueden, ser neutralizados por diversos preparados de anticuerpos, sueros de pacientes o sueros de individuos vacunados bien

25 identificados. Diferencias consistentes en las secuencias de aminoacidos de la regi6n V3 entre virus que pueden, o no pueden, ser neutralizados se seleccionan para evaluaci6n. Los virus isogenicos basados en un clon parental bien identificado (ej. NL4-3, HXB , JRCSF) que contiene mutaciones especificas candidatas de neutralizaci6n viral en la regi6n V3 de la proteina de la envoltura gp1�0 se construyen

30 mediante mutagenesis de sitio dirigido y se examinan para analizar la neutralizaci6n con anticuerpos como se describe en el E�emplo 6. Las celulas que expresan CD4 mas CCR� (ej. U-8� /CD4/CCR�), CD4 mas CXCR4 (U-8�/CD4/CXCR4), o CD4 mas CCR� mas CXCR4 (HT4/CCR�/CXCR4) son infectadas. Las sustituciones de aminoacidos que cambian, obtienen, alteran o previenen la neutralizaci6n de

35 anticuerpos se consideran importantes para la neutralizaci6n viral. [0189] En un modo de realizaci6n relacionado, los determinantes de la neutralizaci6n

viral son identificados al evaluar secuencias de aminoacidos dentro de la totalidad de la proteina de envoltura de la superficie gp1�0. [0190] En un modo de realizaci6n relacionado, los determinantes de la neutralizaci6n viral son identificados al evaluar secuencias de aminoacidos dentro de la proteina

5 transmembrana de la envoltura gp41.

EJEMPLO 8 Medicion de la sensibilidad a los inhibidores de entrada viral para guiar las decisiones terap�uticas [0191] Este ejemplo proporciona un medio y metodo para utilizar la sensibilidad a los

10 inhibidores de entrada viral para guiar el tratamiento del VIH-1. Este ejemplo tambien proporciona un medio y metodo para utilizar la sensibilidad a los inhibidores de entrada viral para guiar el tratamiento de pacientes que han recibido tratamiento antirretroviral previo con un inhibidor de la entrada viral. Esta invenci6n tambien proporciona un medio y metodo para utilizar la sensibilidad a los inhibidores de entrada viral para guiar

15 el tratamiento de pacientes que no han recibido tratamiento antirretroviral previo con un inhibidor de la entrada viral. [0192] En un modo de realizaci6n, se utiliza la sensibilidad de los virus de paciente los a inhibidores de la entrada viral para guiar el tratamiento de pacientes en los que han fallado regimenes antirretrovirales que incluyen un inhibidor de la entrada viral o mas.

20 El fracaso del tratamiento (tambien llamado fracaso virol6gico) se define en general como el tratamiento antiviral parcialmente supresor que deriva en niveles detectables de virus, que se miden normalmente en el plasma del paciente). La orientaci6n puede incluir, sin caracter limitativo, (a) la clarificaci6n de las opciones de tratamiento farmacol6gico disponibles, (b) la selecci6n de regimenes de tratamiento mas activos,

25 (c) la clarificaci6n de la etiologia del aumento de la carga viral en pacientes tratados (ej. adherencia pobre, resistencia a los farmacos) y (d) la reducci6n de la utilizaci6n de farmacos inactivos y posiblemente t6xicos. En este modo de realizaci6n, los vectores de prueba de resistencia se derivan de muestras de virus de pacientes y se eval(an para analizar la sensibilidad a diversos inhibidores de la entrada viral utilizando el

30 ensayo fenotipico de entrada viral. Los inhibidores de la entrada viral pueden incluir, sin caracter limitativo, inhibidores de fusi6n (ej. T-�0, T-1�49), antagonistas de los correceptores (AMD3100, AMD8��4, TAK��9, PRO �4� y compuestos de butano piperidin 1yl) y antagonistas de CD4 (MAb �A8). Las decisiones terapeuticas apropiadas estan basadas en los resultados del ensayo de la entrada viral (e�. ver

35 Figura 4B) y los resultados de las pruebas de laboratorio y la informaci6n clinica relevantes adicionales.

[0193] En otro modo de realizaci6n, la sensibilidad de los virus de pacientes a los inhibidores de la entrada viral se utiliza para guiar el tratamiento de pacientes que no han sido previamente tratados con regimenes antirretrovirales que incluyan un inhibidor de la entrada viral o mas. La orientaci6n puede incluir, sin caracter limitativo, 5 (a) la clarificaci6n de las opciones de tratamiento farmacol6gico disponibles, (b) la selecci6n de regimenes de tratamiento mas activos, (c) la clarificaci6n de la sensibilidad de referencia a los inhibidores de la entrada viral y (d) la reducci6n de la utilizaci6n de farmacos inactivos y posiblemente t6xicos. Determinar la sensibilidad de referencia de los inhibidores de entrada viral en pacientes que nunca se han sometido 10 a tratamiento es importante por dos razones. Primero, la sensibilidad natural de los virus a los inhibidores de la entrada viral puede variar en gran medida. (e�. ver Figura 4A). Segundo, la utilizaci6n incrementada de inhibidores de la entrada viral derivara sin duda en la generaci6n de variantes resistentes a los farmacos que pueden transmitirse a individuos recien infectados. En este modo de realizaci6n, los vectores 15 de prueba de resistencia se derivan de muestras de virus de paciente y se eval(an para examinar la sensibilidad a diversos inhibidores de la entrada viral utilizando un ensayo fenotipico de entrada viral. Los inhibidores de la entrada viral pueden incluir, sin caracter limitativo, inhibidores de fusi6n (ej. T-�0, T-1�49), antagonistas de los correceptores (AMD3100, AMD8��4, TAK��9, PRO �4� y compuestos de butano

20 piperidin 1yl) y antagonistas de CD4 (MAb �A8). Las decisiones terapeuticas apropiadas estan basadas en los resultados del ensayo de entrada viral y los resultados de las pruebas de laboratorio y la informaci6n clinica relevantes adicionales.

EJEMPLO 9

25 Medicion del tropismo del VIH-1 por los correceptores para guiar las decisiones terap�uticas [0194] Este ejemplo proporciona un medio y metodo para utilizar el tropismo del VIH-1 por los correceptores (CCR�, CXCR4) para guiar el tratamiento del VIH-1. Este ejemplo tambien proporciona un medio y metodo para utilizar el tropismo del VIH-1 por

30 los correceptores para guiar el tratamiento de pacientes en los que el tratamiento con farmacos antirretrovirales ha fallado. Esta invenci6n tambien proporciona un medio y metodo para utilizar el tropismo del VIH-1 por los correceptores para guiar el tratamiento de pacientes recien infectados por el VIH-1. [0195] Este ejemplo proporciona un medio y metodo para utilizar el tropismo del VIH-1

35 por los correceptores para guiar el tratamiento del VIH-1. Este ejemplo tambien proporciona un medio y metodo para utilizar el tropismo del VIH-1 por los correceptores para guiar el tratamiento de pacientes que han recibido tratamiento antirretroviral previo con un inhibidor de la entrada viral. Esta invenci6n tambien proporciona un medio y metodo para utilizar el tropismo del VIH-1 por los correceptores para guiar el tratamiento de pacientes que no han recibido tratamiento

5 previo con un inhibidor de la entrada viral. [0196] En un modo de realizaci6n, el tropismo por los correceptores del virus de un paciente se utiliza para guiar el tratamiento de un paciente en el que han fallado los regimenes antirretrovirales que incluyen un antagonista de los correceptores o mas. El fracaso del tratamiento (tambien llamado fracaso virol6gico) se define en general como

10 el tratamiento antiviral parcialmente supresor que deriva en niveles detectables de virus, que se miden normalmente en el plasma del paciente). La orientaci6n puede incluir, sin caracter limitativo, (a) la clarificaci6n de la etiologia del aumento de la carga viral en pacientes tratados (ej. adherencia pobre, resistencia a los farmacos, cambio en el tropismo por los correceptores), (b) la clarificaci6n de las opciones de tratamiento

15 farmacol6gico disponibles, (c) la selecci6n de regimenes de tratamiento mas activos, y

(d) la reducci6n de la utilizaci6n de farmacos inactivos y posiblemente t6xicos. Controlar el tropismo por los correceptores en pacientes que estan recibiendo un tratamiento con antagonistas de CCR� tiene una importancia clinica, ya que la presi6n farmacol6gica puede derivar en un cambio al correceptor CXCR4. Los virus X4 20 (tropismo por los correceptores CXCR4) estan asociados con un diagn6stico mas pobre comparados con los virus R� (tropismo por los correceptores CCR�). En este modo de realizaci6n, los vectores de prueba de resistencia se derivan de muestras de virus de pacientes y se examinan para analizar la sensibilidad a diversos antagonistas de los correceptores utilizando el ensayo fenotipico de entrada viral. Los antagonistas

25 de los correceptores pueden incluir, sin caracter limitativo AMD3100, AMD8��4, TAK��9, PRO �4� y compuestos de butano piperidin 1yl. Las decisiones terapeuticas apropiadas estan basadas en los resultados del ensayo de entrada viral (e�. ver Figura 4B) y los resultados de las pruebas de laboratorio y la informaci6n clinica relevantes adicionales.

30 [0197] En otro modo de realizaci6n, el tropismo por los correceptores de un virus de paciente se utiliza para guiar el tratamiento de pacientes que no han sido previamente tratados con regimenes antirretrovirales que incluyan un antagonista de los correceptores o mas. La orientaci6n puede incluir, sin caracter limitativo, (a) la clarificaci6n del tropismo de referencia por los correceptores a los inhibidores de

35 entrada viral, (b) la clarificaci6n de las opciones de tratamiento farmacol6gico disponibles, (c) la selecci6n de regimenes de tratamiento mas activos, y (d) la

reducci6n de la utilizaci6n de farmacos inactivos y posiblemente t6xicos. Determinar el tropismo de referencia por los correceptores tiene una importancia clinica significativa. El tratamiento con el antagonista de los correceptores apropiado (tropismo de R� vs. de X4) o antagonistas (tropismo dual o tropismo mixto) es probable que derive en una 5 respuesta mas potente y duradera. En este modo de realizaci6n, los vectores de prueba de resistencia se derivan de muestras de virus de pacientes y se examinan para analizar la sensibilidad a diversos inhibidores de la entrada viral utilizando el ensayo fenotipico de entrada viral. Los antagonistas de los correceptores pueden incluir, sin caracter limitativo AMD3100, AMD8�� 4, TAK��9, PRO �4� y compuestos de

10 butano piperidin 1yl. Las decisiones terapeuticas apropiadas estan basadas en los resultados del ensayo de entrada viral (e�. ver Figura 4B) y los resultados de las pruebas de laboratorio y la informaci6n clinica relevantes adicionales.

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Tabla 1

Células

Celula

Receptor

5.25

CXCR4, CD4, CCR5 (no expresado bien) BONZO

5.25.Luc4.M7

CD4, CCR5, BONZO

HOS.CD4.CCR5

CD4, CCR5

HOS.CD4.CXCR4

CD4, CXCR4

HOS.CD4

CD4, nivel bajo de expresi6n de CCR5 y CXCR4

HOS HT4 R5 GFP wt

CD4, CXCR4, CCR5

HOS.CD4.CCR5.GFP.M7#6*

CD4, CXCR4, CCR5

P4.CCR5

CD4, CXCR4, CCR5

U87.CD4

CD4

U87.CD4 R5

CD4, CCR5

U87.CD4 X4

CD4, CXCR4

MT2

CD4, CXCR4

MT4

CD4, CXCR4

PMl

CD4, CXCR4, CCR5

CEM NKr CCR5

CD4, CXCR4, CCR5

Tabla 2 Virus y reactivos representativos

Virus

Envolturaa Fuente

89.6, SF2

RS-X4ISIIB ARRRPb

92BR014,92US076

RS-X4ISIIB ARRRP

JR-CSF, 91US00S

RSINSIIB ARRRP

91US0S4

SIIB ARRRP

NL43, MN, ELI

X4IB ARRRP

92HTS99

X4 ARRRP

92UG031

RSINSIIA ARRRP(INTERNO)

92TH014, 92TH026

RSINSIIB ARRRP(INTERNO)

Virus

Envolturaa Fuente

92BR02S, 93MW9S9

RSISIIC ARRRP(INTERNO)

92UG03S

RSINSIID ARRRP(INTERNO)

92TH022, 92TH023

RSINSIIE ARRRP(INTERNO)

93BR020

RS-X4ISIIF ARRRP(INTERNO)

Anticuerpos

Epitope FUENTE

Mabs 2FS, 1S77

gp41 TM ARRRP

Mabs IG1b12, 2G12, 17b, 48D

gp120 SU ARRRP

Sueros de neutralizaci6n #2, VIH-IG

Policlonal ARRRP

Inhibidores de entrada

Diana Fuente

CD4-IG

gp120 SU Genentech

CD4-IGG2

gp120 SU Adarc

SCD4

Sigma Progenics

T20 (DP178)

gp41 TM Trimeris

Rantes, MIP1aIb

CCRS SIGMAIARRRP

SDFlaIb

CXCR4 SIGMAIARRRP

AMD 3100

CXCR4 AnorMed

Sulfato de dextrano, heparina

No especifica Sigma

aRS (correceptor CCRS), X4 (correceptor CXCR4) SI (inductor de sinticio), NSI (no inductor de sinticio), A,B,C,D,E,F (designaci6n del clado de la envoltura) b Programa de Referencia de Reactivos de Investigaci6n del SIDA (AIDS Research and Reference Reagent Program)

Tabla 3

Iniciadores examinados para analizar la amplificaci6n de la envoltura del VIH

INICIADORES DE RT

RT env N3

5'-GGA GCA TTT ACA AGC AGC AAC ACA GC-3'

RT env 9720

5'-TTC CAG TCA VAC CTC AGG TAC-3'

RT env 9740

5'-AGA CCA ATG ACT TAY AAG G-3'

INICIADORES DE PCR 5'

5'env

5' -GGG CTC GAG ACC GGT CAG TGG CAA TGA GAG TGA AG- 3'

5'env Xho/Pin

5'-GGG CTC GAG ACC GGT GAG CAG AAG ACA GTG GCA ATG A-3'

5'env START

5'-GGG CTC GAG ACC GGT GAG CAG AAG ACA GTG GCA ATG -3'

INICIADORES DE PCR 3'

3' env

5' -GGG TCT AGA ACG CGT TGC CAC CCA TCT TAT AGC AA- 3'

3'env Xba/Mlu

5'-GGG TCT AGA ACG CGT CCA CTT GCC ACC CAT BTT ATA GC-3'

3'env STOP

5'-GGG TCT AGA ACG CGT CCA CTT GCC ACC CAT BTT A-3'

3' delta CT

5' -GAT GGT CTA AGA CGC TGT TCA ATA TCC CTG CCT AAC TC- 3'

Todos los experimentos se encuentran en bloque virol6gico numero 0l88

Tabla 4 (Cuadro 3)

Nombre generico (abreviaci6n)

Marca Empresa Fecha de aprobaci6n por el FDA

zidovudine, AZT

Retrovir Glaxo Wellcome marzo 87

didanosine, ddl

Videx Bristol Myers-Squibb octubre 91

zalcitabine, ddC

Hivid Hoffman-La Roche junio 92

stavudine, d4T

Zerit Bristol Myers-Squibb junio 94

lamivudine, 3TC

Epivir Glaxo Wellcome noviembre 9S

saquinavir, SQV, hgc

Invirase Hoffman-La Roche diciembre 9S

saquinavir, SQV, sgc

Fortovase Hoffman-La Roche noviembre 97

ritonavir, RTV

Norvir Abbott Laboratories marzo 96

indinavir, IDV

Crixivan Mercc &Co., Inc. marzo 96

nevirapine, NVP

Viramune Boehringer Ingelheim junio 96

nelfinavir, NFV

Viracept Agouron Pharmaceuticals marzo 97

delavirdine, DLV

Rescriptor Pharmacia &Upjohn abril 97

ZDVV3TC

Combivir Glaxo Wellcome septiembre 97

efavirenz, EFV

Sustiva DuPont Pharmaceuticals septiembre 98

abacavir, ABC

Ziagen Glaxo Wellcome febrero 99

amprenavir

Agenerase Glaxo Wellcome abril 99

lopinavirIritonavir

Kaletra Abbott septiembre 2000

Nombre generico (abreviaci6n)

Marca Empresa Fecha de aprobaci6n por el FDA

ZDVV3TCVABC

Trizivir GlaxoSmithKline noviembre 2000

Placa

Repetici6n Tiempo de finalizaci6n Temp. de inicio Temp. de fin. C6digo de barras

1

1

6:39:36 PM 21.6 21.7 NIA

0.S CPS (CPS)

18

26648

S4 6970 37406 71S8 38 1386 930 100 1184

19248

262 72 18972 3478 3946 S010 46 14 11004

106

9038 4002 32 238 26 976 34 38 48

38

2000 S28 16 16 36 298 S2 14 S4

122

2984 7264 40 38 20 23344 1S340 44 1S6

36

S2 28 40 28 40 62 32 38 22

22

32 28 98S8 68 3802 46 11470 19S8 42

30

64 36 3846 3390 S78S8 12620 126186 68 34

Placa

Repetici6n Tiempo de finalizaci6n Temp. de inicio Temp. de fin. C6digo de barras

2

1 6:41:S1 PM 21.S 21.6 NIA

0.S CPS (CPS)

34

26294

S6 6728 38882 7S14 24 1048 1326 40 1134

189S6

190 72 204S8 4418 4714 S398 S8 26 10708

30

1S002 4766 42 246 44 972 30 28 42

40

2620 808 32 28 86 378 38 22 32

92

S434 9638 36 42 38 24348 2S446 34 96

44

44

14 46 46 62 92 36 44 S4

30

44 28 8346 142 3468 30 7684 1438 44

36

S4 30 3784 3840 6S330 14284 130290 S6 32

Placa

Repetici6n Tiempo de finalizaci6n Temp. de inicio Temp. de fin. C6digo de barras

3

1 6:44:06 PM 21.6 21.6 NIA

0.S CPS (CPS)

Placa

Repetici6n Tiempo de finalizaci6n Temp. de inicio Temp. de fin. C6digo de barras

3

1 6:44:06 PM 21.6 21.6 NIA

16

18S90

18 4306 23902 S386 30 924 894 32 660

8698

148 34 14088 2880 3142 3160 40 46 7616

30

102S2 3S42 38 172 34 842 30 32 44

28

2396 370 28 26 66 172 32 22

28

64

3784 4822 32 28 24 6188 S702 34 120

16

28 62 26 28 30 38 38 38 44

38

S2 40 7020 68 1798 62 7324 1076 S0

32

S0 70 3824 3138 S3670 13088 104608 32 38

Placa

Repetici6n Tiempo de finalizaci6n Temp. de inicio Temp. de fin. C6digo de barras

4

1 6:46:20 PM 21.7 21.8 NIA

0.S CPS (CPS)

24

19926

46 S086 27182 SSS0 26 704 974 32 862

11214

1S8 42 1S882 3026 2694 29S6 26 20 S294

S6

11426 32S2 82 270 S2 814 36 40 64

32

2916 SS6 42 30 64 242 38 24 36

72

3220 7618 36 38 44 12112 10878 32 246

32

48 22 30 28 24 136 30 S6 34

32

38 40 8844 86 2386 S4 49S6 1372 S0

22

34 40 3498 27S4 S9808 11014 6S428 34 40

Placa

Repetici6n Tiempo de finalizaci6n Temp. de inicio Temp. de fin. C6digo de barras

S

1 6:48:3S PM 21.9 21.9 NIA

0.S CPS (CPS)

38

38

28 40 30 38 234 46 30 46 30

Placa

Repetici6n Tiempo finalizaci6n de Temp. inicio de Temp. de fin. C6digo barras de

S

1 6:48:3S PM 21.9 21.9 NIA

26

20 32 976 190 S8 46 24 28 2298

42

3260 420 S0 36 34 102 26 34 24

28

378 88 32 34 32 40 42 S4 26

36

62 11690 38 44 32 42 42 26

36

46

22 44 38 S8 32 38 30 32 36

22

38 S2 40 42 26 34 S0 200 36

36

80 S2 40 36 40 S2 S4 22 40

Placa

Repetici6n Tiempo finalizaci6n de Temp. inicio de Temp. de fin. C6digo barras de

6

1 6:S0:S0 PM 21.8 21.9 NIA

0.S CPS (CPS)

30

26

28 40 34 40 S0 38 44 34 36

42

28 32 1068 114 38 22 46 30 2268

36

3S08 6S6 48 40 34 88 30 34 S6

28

166 S6 28 18 40 18 38 32 34

32

114 S732 32 42 34 38 34 S0 34

36

22 36 40 30 20 30 26 42 40

46

24 26 32 60 28 32 40 120 36

32

S8 S8 32 24 40 S0 36 12 38

112

30488

7474

60

9736

32

S2

38

40

32

44

28

42

24

Placa

Repetici6n Tiempo finalizaci6n de Temp. inicio de Temp. de fin. C6digo de barras

6

1 6:S0:S0 PM 21.8 21.9 NIA

38

36

82

27748

6786

40

96S4

30

S2

30

22

24

46

48

34

42

46

34

48

23382

2842

32

7616

34

36

26

34

24

62

34

42

32

S0

32

44

21176

4906

44

6906

32

42

40

32

42

24

24

46

28

Placa

Repetici6n Tiempo finalizaci6n de Temp. de inicio Temp. de fin. C6digo de barras

6

1 6:S0:S0 PM 21.8 21.9 NIA

24

18

34

22

1290

26

40

24

30

48

46

42

38

12

34

36

42

36

40

40

1280

40

30

36

26

32

38

S2

26

36

20

36

40

18

1

######## 21.7 21.8 NIA

0.S CPS (CPS)

32

24

14218 S6 21S86 28 4034 36 S2 42088 40

4780

174 71276 730 48 326 28 12022 1288 7198

694S2

1S306 4008 44 792 180 S0 182 2S292 718

72

3922 S46 128 44 66 30 900 11984 3194

30

88 18820 40438 4882 10S946 8466 4934 470 20386

1

######## 21.7 21.8 NIA

3420

934 344 6268 S012 170 3S46 S04 8164 22214

344

82 S344 S330 6710 1880 338 4286 2112 466

S80

1018 S16 318 302 40 414 32 20 S2

Placa

Repetici6n Tiempo finalizaci6n de Temp. de inicio Temp. de fin. C6digo de barras

2

1 ######## 21.9 21.9 NIA

0.S CPS (CPS)

22

44

14062 36 21726 32 3942 24 46 42324 S0

4324

124 63S02 492 44 242 172 10S76 12S8 7SS2

66204

146S8 3S68 S6 S24 282 S6 172 24186 S06

128

3S26 3S4 168 20 S4 60 S28 10074 2622

40

78 17378 38076 S944 89S20 10042 SS64 470 17964

4118

638 336 4110 3624 222 4160 318 7SS0 28660

438

114 3SS4 3384 S470 1892 188 3494 2066 484

440

940 466 282 292 38 472 36 24 38

Placa

Repetici6n Tiempo finalizaci6n de Temp. de inicio Temp. de fin. C6digo de barras

3

1 ######## 21.9 22 NIA

0.S CPS (CPS)

36

36

38 28 28 38 28 36 42 114 40

32

34 80 26 16 36 30 18 26 30

126

106 34 42 30 46 22 26 32 S8

26

46 42 38 34 20 18 34 24 36

28

146 1S7S6 76 32 26 42 S2 36 106

34

S0 20 24 32 18 38 18 36 38

38

38

28 36 80 S0 38 44 34

38

40

30 38 30 24 22 38 36 34 36

Placa

Repetici6n Tiempo de finalizaci6n Temp. inicio de Temp. de fin. C6digo de barras

4

1 ######## 21.9 22 NIA

0.S CPS (CPS)

16

24

70 30 26 26 40 18 32 66 30

24

46 118 34 26 40 34 26 26 S0

132

116 84 34 34 48 34 38 30 38

32

30 32 28 26 40 46 28 12 26

34

84 12036 94 38 34 44 24 38 86

24

28 42 44 24 28 40 26 48 32

62

24 S8 32 66 26 28 44 32 22

44

80 60 28 40 28 28 34 32 36

Placa

Repetici6n Tiempo de finalizaci6n Temp. de inicio Temp. de fin. C6digo de barras

S

1 ######## 22 22 NIA

0.S CPS (CPS)

34

38

11132 26 6696 34 3960 44 40 29S48 40

762

48 39888 88 40 30 36 8416 1262 4096

S20S8

80S0 2S24 60 4S0 168 32 340 22410 S34

106

2080 172 170 38 38 30 444 7478 24S8

30

46 16428 2S792 4240 4S094 2092 630 334 17130

2498

732 3S8 S044 3236 202 2124 292 4806 13736

290

30 3986 886 4S84 240 110 940 1286 162

4S6

816 438 294 260 44 S24 40 34 22

Placa

Repetici6n Tiempo de finalizaci6n Temp. de inicio Temp. de fin. C6digo de barras

6

1 ######## 22 22.1 NIA

0.S CPS (CPS)

32

Placa

Repetici6n Tiempo de finalizaci6n Temp. de inicio Temp. de fin. C6digo de barras

6

1 ######## 22 22.1 NIA

40

13240 38 77S6 38 3368 24 40 36836 48

914

34 44702 64 S0 20 24 8048 996 3826

S0234

9110 1S74 46 S36 270 20 382 21124 424

200

1888 240 108 28 46 30 288 9302 21S4

46

28 17S32 29872 S846 S1810 2346 938 286 22146

3048

862 206 S668 3686 166 2092 214 4384 1S762

390

64 3S18 926 4362 318 176 1032 924 1S6

672

810 314 242 2S2 26 378 30 20 34

43332

38

4314

178S6

3S72

424

16106

23794

S48

3376

1S146

19S92

77S2

4078

48

42

4S846

26

4480

14374

2422

408

11888

24960

478

31S2

19740

13822

9198

4136

38

S0

60

46

Placa

Repetici6n Tiempo de finalizaci6n Temp. de inicio Temp. de fin. C6digo de barras

6

1 ######## 22 22.1 NIA

48

80

8

28

100

60

34

24

S0

S8

30

28

22

26

60

34

36

S6

36

28

46

S8

36

36

30

1S0

30

28

18

28

30628

34

1S98

12372

1046

S12

10024

1S470

388

2730

13012

12386

6768

2204

38

20

30392

36

1714

11S88

Placa

Repetici6n Tiempo de finalizaci6n Temp. de inicio Temp. de fin. C6digo de barras

6

1 ######## 22 22.1 NIA

804

682

142S4

16620

612

3346

14404

12S86

69S6

2938

S0

38

LISTADO DE SECUENCIAS

5 <110> ViroLogic, Inc.

<120> COMPOSICIONES Y METODOS PARA EVALUAR LA UTILIZACION DE RECEPTORESICORRECEPTORES VIRALES E INHIBIDORES DE ENTRADA VIRAL POR MEDIO DE ENSAYOS DE VIRUS RECOMBINANTES

<130> 2793I6S166APCT 10 <140> 09I874,47S, 60I29S,871

<141> 2001-06-04

<160> 16

<170> versi6n PatentIn 3.1

<210> 1 15 <211> 26

<212> ADN

<213> Iniciadores de RT para la envoltura del VIH

<400> 1

<210> 2

<211> 21

<212> ADN

<213> Iniciador de RT para la envoltura del VIH

<400> 2

<210> 3

<211> 19

<212> ADN

<213> Iniciador de RT para la envoltura del VIH

<400> 3

<210> 4

<211> 3S

<212> ADN

<213> Iniciador de PCR

<400> 4

<210> S

<211> 37

<212> ADN

<213> Iniciador de PCR

<400> S

<210> 6

<211> 36

<212> ADN

<213> Iniciador de PCR

<400> 6

<210> 7

<211> 3S

<212> ADN

<213> Iniciador de PCR

<400> 7

<210> 8

<211> 38

<212> ADN

<213> Iniciador de PCR

<400> 8

<210> 9

<211> 34

<212> ADN

<213> Iniciador de PCR

<400> 9

<210> 10

<211> 38

<212> ADN

<213> Iniciador de PCR

<400> 10

<210> 11

<211> 10

<212> PRT

<213> Mutaci6n de resistencia de inhibidor de la entrada viral

<400> 11

<210> 12

<211> 10

<212> PRT

<213> Mutaci6n de resistencia de inhibidor de la entrada viral

<400> 12 <210> 13

<211> 10

<212> PRT

<213> Mutaci6n de resistencia de inhibidor de la entrada viral

<220>

<221> MISC�FEATURE

<222> (S)..(S)

<223> Donde X� G or S

<220>

<221> MISC�FEATURE

<222> (7)..(7)

<223> Donde X�V or M

<400> 13

<210> 14

<211> 10

<212> PRT

<213> Mutaci6n de resistencia de inhibidor de la entrada viral

<400> 14

<210> 1S

<211> 10

<212> PRT

<213> Mutaci6n de resistencia de inhibidor de la entrada viral

<220>

<221> MISC�FEATURE

<222> (S)..(S)

<223> Donde X� G or D

<400> 1S

<210> 16

<211> 36

<212> PRT

<213> P� ptido inhibidor de fusi6n

<400> 16

Claims (29)

1. Reivindicaciones

   1. Un metodo para guiar el tratamiento de un paciente, que consta en identificar la sensibilidad de los virus de un paciente a un compuesto disenado para inhibir la penetraci6n de un virus en una celula al:

   a) Suministrar una muestra de paciente comprendiendo acido nucleico que codifica proteinas de la envoltura viral b) Transfectar dentro de una primera celula

   (i)

   El acido nucleico del paso a) y

   (ii)

   Un vector de expresi6n viral que carece de un acido nucleico que codifica una proteina de la envoltura y que comprende un acido nucleico indicador que produce una senal detectable,

   De manera que la primera celula produce particulas virales comprendiendo proteinas de la envoltura codificadas por el acido nucleico del paso a);

   c) Poner en contacto las particulas virales producidas en el paso b) con

   una segunda celula en presencia del compuesto, donde la segunda celula expresa un receptor de superficie celular al que el virus se une;

   d) Medir la cantidad de senal producida por la segunda celula para determinar la infectividad de las particulas virales; y

   e) Comparar la cantidad de senal medida en el paso d) con la cantidad de senal producida en ausencia del compuesto, donde una cantidad reducida de senal medida en presencia del compuesto indica la sensibilidad de los virus de un paciente al compuesto;

   Donde, los compuestos a los que los virus de un paciente son sensibles pueden ser utilizados en el tratamiento del paciente.

2. 2.

   El metodo de la reivindicaci6n 1, en el cual el acido nucleico indicador comprende un gen indicador.

3. 3.

   El metodo de la reivindicaci6n �, en el cual el gen indicador es un gen de luciferasa.

4. 4.

   El metodo de la reivindicaci6n 1, en el cual el receptor de superficie celular es CD4.

5. 5.

   El metodo de la reivindicaci6n 1, en el cual el receptor de superficie celular es un receptor de quimiocina.

6. 6.

   El metodo de la reivindicaci6n 1, en el cual el receptor de superficie celular es CXCR4 o CCR�.

7. 7.

   El metodo de la reivindicaci6n 1, en el cual el paciente es infectado con el virus VIH

   1.

8. 8.

   El metodo de la reivindicaci6n 1, en el cual el acido nucleico del paso a) comprende ADN que codifica gp1�0 y gp41.

9. 9.

   El metodo de la reivindicaci6n 1, en el cual el vector de expresi6n viral comprende acido nucleico del VIH.

10. 10.

    El metodo de la reivindicaci6n 9, en el cual el vector de expresi6n viral comprende un gen gag-pol del VIH.

11. 11.

    El metodo de la reivindicaci6n 9, en el cual el vector de expresi6n viral comprende ADN que codifica vif, vpr, tat, rev, vpu y nef.

12. 12.

    El metodo de la reivindicaci6n 1, en el cual la primera celula es una celula de mamifero.

13. 13.

    El metodo de la reivindicaci6n 1�, en el cual la celula de mamifero es una celula humana.

14. 14.

    El metodo de la reivindicaci6n 13, en el cual la celula humana es una celula de rin6n embrionaria humana.

15. 15.

    El metodo de la reivindicaci6n 14, en el cual la celula de rin6n embrionaria humana es una celula �93.

16. 16.

    El metodo de la reivindicaci6n 1, en el cual la segunda celula es un linfocito T humano.

17. 17.

    El metodo de la reivindicaci6n 1, en el cual la segunda celula es una linea celular de leucemia de linfocitos T humanos.

18. 18.

    El metodo de la reivindicaci6n 1, en el cual la segunda celula es una celula mononuclear de sangre periferica.

19. 19.

    El metodo de la reivindicaci6n 1, en el cual la segunda celula es una celula de astroglioma.

20. 20.

    El metodo de la reivindicaci6n 19, en el cual la celula de astroglioma es una celula U8�.

21. 21.

    El metodo de la reivindicaci6n 1, en el cual la segunda celula es una celula de osteosarcoma humano.

22. 22.

    El metodo de la reivindicaci6n �1, en el cual la celula de osteosarcoma humano es una celula HT4.

23. 23.

    El metodo de la reivindicaci6n 1, en el cual el compuesto se une al receptor de superficie celular.

24. 24.

    El metodo de la reivindicaci6n 1, en el cual el compuesto es un ligando del receptor de superficie celular.

25. 25.

    El metodo de la reivindicaci6n �3, en el cual el compuesto comprende un anticuerpo.

26. 26.

    El metodo de la reivindicaci6n 1, en el cual el compuesto inhibe la fusi6n de la membrana.

27. 27.

    El metodo de la reivindicaci6n 1, en el cual el compuesto es un peptido, un peptido-mimetico, una molecula organica o un compuesto sintetico.

28. 28.

    El metodo de la reivindicaci6n 1, en el cual el compuesto se une a la proteina de envoltura viral.

29. 29.

    El metodo de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el cual el metodo se utiliza para guiar el tratamiento de pacientes en los que el tratamiento con farmacos antirretrovirales ha fallado.

    Vector de expresi6n de la envoltura:

    Envoltura del VIH

    Vectores de expresi6n de la envoltura del VIH

    FIGURA 2

    Inhibici6n �