CN101802216B - 核酸酶和复合体及其使用方法 - Google Patents

核酸酶和复合体及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及利用多组分核酸复合体(MNA复合体)级联的方法。MNA复合体可具有切割或连接酶的活性。进一步，本发明提供了可包括一个或多个DNA核酶的级联。本发明还提供了使用这些级联用于靶的鉴定、检测和定量的方法。

Description

核酸酶和复合体及其使用方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2007年4月5日提交的美国临时专利申请第60/910,427号、2007年4月5日提交的澳大利亚临时专利申请第2007901833号和2007年4月5日提交的美国部分继续申请第11/697,021号的权益。
技术领域
本发明涉及利用多组分核酸(multi-component nucleic acid，MNA)复合体的方法。MNA复合体可以是具有诸如连接酶或切割活性的修饰活性的活性酶(例如MNA酶(MNAzymes)，包括适体-MNA酶(apta-MANzymes))。此外，本发明涉及使用MNA酶并且也可以包括一个或更多DNA核酶(DNAzymes)的级联。本发明还涉及使用这些级联用于靶的鉴定、检测和定量的方法。
发明背景
各种出版物(可包括专利、公布的申请、技术论文和学术论文)在整个说明书中在括号中引用，每种出版物的完整引用可见于说明书的末尾。每种引用的出版物通过引用整体并入本文。
除了核酸进化上优化的功能外，核酸特别的物理和功能特性为许多新的生物分子装置和方法提供机会。设计核酸预期用于治疗实体、生物传感器、纳米级装置和用于分子计算的工具。方法利用了DNA自装配、导电性、信息元件、扩增、转换、分子检测和催化活性的特征。此外，由于DNA是粗壮的、稳定的和热稳定的，它是用于机械或计算装置的分子工程的理想材料。
单链核酸，诸如DNA和RNA，能折叠成可作为高度特异性受体(例如适体)和催化剂(例如核酶、DNA核酶)起作用的复杂的三维结构。此外，杂交对核酸链之间互补性的需求形成了许多技术的基础，所述技术允许靶检测(例如，微阵列分析、RNA印迹法或DNA印迹法)和/或靶扩增(例如聚合酶链反应)。此外，杂交为核酸纳米级构建和基于DNA的计算策略提供了基础。
近20年被发现了许多具有酶或催化活性的核酸分子。RNA酶(“核酶”)天然存在，但可被改造以便特异性识别和修饰靶RNA底物(Haseloff和Gerlach，1988)。体外进化技术促进了更多催化核酸的发现和发展，包括脱通常称为“DNA酶(DNA enzymes)”或“DNA核酶”的氧核糖核酸(综述见Emillson和Breaker，2002)。已发现体外进化的能催化许多反应的DNA核酶和/或核酶，这些反应包括但不限于核酸的切割、核酸的连接、核酸磷酸化、核酸加帽、氨基酸腺苷酰化、辅因子合成、RNA聚合、模板指导的聚合、RNA-蛋白轭合、羟醛反应、醇氧化、醛还原、嘌呤和嘧啶核苷酸的合成、烷基化、酰胺合成、尿素合成、肽键的形成、肽基-RNA的合成、酰基转移、氨酰化、碳酸酯水解、硫代磷酸烷基化、卟啉金属化、碳-碳键的形成、Pd纳米颗粒的形成、联苯异构化、酯键的形成、酰胺键的形成、DNA去糖基化、胸腺嘧啶二聚体的光逆转或氨基磷酸酯的切割(综述见Silverman，2007)。
特别是，已经表征了在通过Watson Crick碱基配对杂交后特异地切割特定核酸序列的DNA核酶和核酶。DNA核酶能切割RNA(Breaker和Joyce，1994；Santoro和Joyce，1997；Santoro和Joyce，1998)或DNA(Carmi等，1996)分子。核酶也能切割RNA(Haseloff和Gerlach，1988)和DNA(Raillard和Joyce，1996)靶序列。
“10:23”和“8:17”DNA核酶能在特定的RNA磷酸二酯键处切割核酸底物。这些DNA核酶切割天然的3’-5’磷酸二酯键合，以便产生具有2’，3’-环状磷酸和5’-羟基基团的反应产物(Santoro和Joyce，1997；综述见Emilsson和Breaker，2002)。
还表征了在与两个独立的底物核酸杂交后特异地连接特定核酸序列的DNA核酶。特定的脱氧核酶(DNA核酶)可连接2’，3’-环状磷酸和5’-羟基产物，产生非天然的2’-5’键合。此类DNA核酶的实例包括“7Z81”和“7Z48”连接酶(Prior等，2004)，以及“7Q10”DNA核酶连接酶(Flynn-Charlebois等，2003)。可连接2’，3’二醇和5’-三磷酸产物并产生天然3’-5’键合的其他DNA核酶已有描述(Coppins和Silverman，2004)。
一些催化核酸具有多个结构域的相似的基本结构，这些结构域包括保守的催化结构域(“催化核心”)，侧翼为两个非保守的底物结合结构域(“臂”)，该底物结合结构域特异识别底物并与底物杂交。具有上述基本结构的核酸的实例包括但不限于：锤头核酶、10:23和8:17DNA核酶、“7Z81”、“7Z48”和“7Q10”DNA核酶连接酶、“UV1C”胸腺嘧啶二聚体光逆转DNA核酶和“DAB22”碳-碳键形成DNA核酶。到目前为止，催化核酸一般是单分子的，尽管具有不只一个组分的催化核酸的实例是已知的，但是这些催化核酸需要广泛的改造(Tabor等，2006，Kurata等，2000)。
已显示催化核酸在形成催化核心的区域仅耐受某些修饰(Perreault等，1990；Perreault等，1991；Zaborowska等，2002；Cruz等，2004；Silverman，2004)。取决于反应条件的严格性，底物臂内可耐受某种程度的错配。然而，Watson Crick碱基配对的要求是足够严格的，以致能够开发出使用催化核酸来帮助区分密切相关的序列的方案(Cairns等，2000)(WO 99/50452)。
诸如PCR的靶扩增和检测技术已广泛用于研究和/或临床诊断。然而，尽管这些技术的能力，每种技术具有内在的缺点。这些技术都要求使用蛋白酶(例如DNA聚合酶、RNA聚合酶、反转录酶和或连接酶)。包含蛋白酶增加了试剂制造的复杂性和费用，并且降低了包含试剂的试剂盒的保存期限。其他相关的技术挑战包括受来自先前反应的复制子(靶扩增子)的污染，引起假阳性信号，和/或由引物序列的复制产生的背景信号(引物-二聚体)或由不依赖于靶的连接造成的背景。
核酸酶和核酸酶级联被认为具有许多生物技术应用，特别在诊断中。通过促进信号的扩增，核酸酶和核酸酶级联可允许检测蛋白质和核酸来用于疾病诊断。
一些研究组已报道使用催化核酸来检测核酸靶和具有比色读数的其他分析物(Elghanian等，1997，Mirkin等，1996和Liu和Lu，2004)。使用单分子催化核酸的信号扩增级联的实例在本领域是已知的。例如，Paul和Joyce(2004)描述了一个由具有连接酶活性的核酶介导的复制级联。在另一个方法中，信号扩增级联使用两种能通过交叉切割导致线性化而彼此活化的无活性、环化10:23DNA核酶(Levy和Ellington，2003)。
本领域目前需要靶的检测，特别是使用诸如级联的扩增系统的检测，例如涉及包含多个核酸酶和特别是至少一个多组分核酸酶(MNA酶)的级联的检测系统。本发明提供了涉及包含至少一个具有连接酶活性的核酸酶的核酸酶级联的检测方法。此外，使用具有连接酶活性的核酸酶允许形成核酸复合体组分，诸如装配促进子(assembly facilitator)、部分酶(partzyme)、底物、DNA核酶或其组分。
发明概述
本发明的一方面提供了一种用于检测至少一个靶的存在的方法，该方法包括：
(a)提供至少第一核酸复合体的至少两个或多个寡核苷酸组分和至少一个底物，其中至少第一寡核苷酸组分和第二寡核苷酸组分能够在靶存在下自装配形成包含具有连接酶活性的催化上有活性的多组分核酸酶(MNA连接酶)的至少第一核酸酶，
(b)使所述两个或多个寡核苷酸组分和至少一个底物与推测含有至少一个靶的样品在允许以下的条件下接触：
(1)所述至少一个具有催化活性的MNA连接酶的自装配，和
(2)所述至少一个MNA连接酶的催化活性；并
(c)确定所述至少一个MNA连接酶的催化活性的存在，其中催化活性的存在指示所述至少一个靶的存在。
本发明的另一个方面提供了一种用于检测靶的方法，该方法包括：
a)提供包含需要与所述靶缔合以促进形成第一核酸酶的组分的第一核酸复合体，其中所述第一核酸复合体还包含至少一个底物，并
b)提供能与第一核酸酶催化的反应产物缔合的第二核酸复合体的至少一个组分
并形成能作为第二核酸酶起作用的第二核酸复合体
其中所述核酸酶的至少一个具有连接酶活性，并且所述核酸酶的至少一个是MNA酶，其中所述方法包括：
i)使推测含有靶的样品与第一核酸复合体接触，其中所述靶与所述第一核酸复合体缔合以促进形成所述第一核酸酶，并
ii)使第一核酸酶催化的反应产物与所述第二核酸复合体的至少一个组分接触，因此允许形成作为所述第二核酸酶起作用的第二核酸复合体，并且
其中第一或第二核酸酶的至少一个或两个的活性指示所述靶的存在。
在一个实施方案中，该方法可还包括：
提供能与第一或第二核酸酶或两者催化的反应产物缔合的第三核酸复合体的至少一个组分，
并形成能作为第三核酸酶起作用的第三核酸复合体，其中所述方法包括：
使第一或第二核酸酶或两者催化的反应产物与所述第三核酸复合体的至少一个组分接触，因此允许形成作为所述第三核酸酶起作用的第三核酸复合体，并且
其中第一、第二或第三核酸酶或其任何组合的活性指示所述靶的存在。
在另一个实施方案中，该方法可还包括：
提供能与所述第一、第二或第三核酸酶的至少一个的产物缔合的至少一个其他核酸复合体的至少一个组分，
并形成能作为至少一个其他核酸酶起作用的至少一个其他核酸复合体，其中所述方法包括：
使所述第一、第二或第三核酸酶的至少一个催化的反应产物与所述至少一个其他核酸复合体的至少一个组分接触，因此允许形成作为所述至少一个其他核酸酶起作用的至少一个其他核酸复合体，并且
其中第一、第二、第三或至少一个其他核酸酶或其任何组合的活性指示所述靶的存在。
在一个实施方案中，所述核酸酶的至少一个可具有切割活性或连接酶活性。此外，第一核酸酶可以是MNA酶。进一步，核酸酶的至少一个可以是DNA核酶。
在另一个实施方案中，任一种核酸酶催化的反应产物可选自包含装配促进子、部分酶、底物、DNA核酶、稳定臂或其组分的组。
在一个实施方案中，靶可以是核酸。
在一个实施方案中，所述组分的至少一个可还包含至少一个适体，其中所述方法可还包括提供所述第一核酸复合体的至少一个装配促进子和至少一个装配抑制子，其中所述靶与所述适体缔合，允许所述第一核酸复合体作为第一核酸酶起作用。
在一个实施方案中，靶是非核酸靶。装配促进子可以是待检测的其他靶。
在一个进一步的实施方案中，所述核酸酶的至少一个或其任何组合催化的反应产物与上述核酸复合体的至少一个的至少一个组分缔合，因此允许形成作为其他所述上述核酸酶起作用的其他所述上述核酸复合体的至少一个。
本发明的另一方面提供了一种使用级联来检测第一装配促进子的方法，该方法包括：
a)提供第一MNA酶的组分、至少一个第一MNA酶的底物、第一DNA核酶连接酶、第一DNA核酶连接酶的底物、第二装配促进子、至少一个第二MNA酶的底物和第二MNA酶的第一部分酶，其中所述方法包括：
b)使所述第一装配促进子与所述第一MNA酶的所述组分在允许所述第一MNA酶的催化活性的条件下缔合，因此有助于所述第一MNA酶的催化活性，因此允许所述第一MNA酶底物的修饰，其中
第一MNA酶底物的修饰导致第二DNA核酶连接酶底物的产生；并且
其中第一DNA核酶连接酶与第一和第二DNA核酶连接酶的底物装配；并且
其中DNA核酶连接酶的催化活性产生第二MNA酶的第二部分酶，并且其中；
在允许第二MNA酶催化活性的条件下，所述第二MNA酶的第二部分酶与所述第二装配促进子和第二MNA酶的第一部分酶的缔合促进了所述第二MNA酶的催化活性，因此允许至少第二MNA酶底物的修饰，其中所述底物的任一个或其组合的修饰指示所述第一装配促进子的存在。
本发明的另一方面提供了一种使用级联来检测第一装配促进子的方法，该方法包括：
a)提供第一MNA酶的组分、至少一个第一MNA酶的底物、DNA核酶连接酶、第一DNA核酶连接酶的底物、至少一个第二MNA酶的底物和第二MNA酶的第一和第二部分酶，其中所述方法包括：
b)使所述第一装配促进子与所述第一MNA酶的组分在允许所述第一MNA酶的催化活性的条件下缔合，因此有助于所述第一MNA酶的催化活性，因此允许所述第一MNA酶底物的修饰，其中
第一MNA酶底物的修饰导致第二DNA核酶连接酶底物的产生；并且
其中第一DNA核酶连接酶与第一和第二DNA核酶连接酶的底物装配；并且
其中DNA核酶连接酶的催化活性产生第二MNA酶的第二装配促进子；并且
其中在允许所述第二MNA酶催化活性的条件下，所述第二装配促进子与所述第二MNA酶的第一和第二部分酶的缔合促进了所述第二MNA酶的催化活性，因此允许至少第二MNA酶底物的修饰，其中所述底物的任一个或其组合的修饰指示所述第一装配促进子的存在。
在一个实施方案中，第二MNA酶催化的反应产物可以是使第三核酸酶发挥作用所需的组分。第三MNA酶催化的反应产物可以是参与由第二MNA酶或DNA核酶连接酶或两者催化的反应的组分。
本发明的另一方面提供了一种使用级联来检测第一装配促进子的方法，该方法包括：
a)提供第一MNA酶的组分、至少一个第一MNA酶的底物、第二MNA酶的组分(其中所述第二MNA酶具有连接酶活性)、第二MNA酶的第二装配促进子、第二MNA酶的底物、第三MNA酶的第三装配促进子、至少一个第三MNA酶的底物和第三MNA酶的第一部分酶，其中所述方法包括：
b)使所述第一装配促进子与所述第一MNA酶的所述组分在允许所述第一MNA酶的催化活性的条件下缔合，因此有助于所述第一MNA酶的催化活性，因此允许所述第一MNA酶底物的修饰，其中；
第一MNA酶底物的修饰导致第四MNA酶底物的产生；并且
其中第二MNA酶的装配促进子帮助第二MNA酶的组分与第二和第四MNA酶底物装配；并且
其中第二MNA酶的催化连接酶活性产生第三MNA酶的第二部分酶，并且其中；
在允许第三MNA酶催化活性的条件下，所述第三MNA酶的第一和第二部分酶与所述第三装配促进子的缔合促进了所述第三MNA酶的催化活性，因此允许至少第三MNA酶底物的修饰，其中所述底物的任一个或其组合的修饰指示所述第一装配促进子的存在。
本发明的另一方面提供了一种使用级联来检测第一装配促进子的方法，该方法包括：
a)提供第一MNA酶的组分、至少一个第一MNA酶的底物、第二MNA酶的组分(其中所述第二MNA酶具有连接酶活性)、第二MNA酶的第二装配促进子、第二MNA酶的底物、第三MNA酶的第一和第二部分酶和至少一个第三MNA酶的底物，其中所述方法包括：
b)所述第一装配促进子与所述第一MNA酶的组分在允许所述第一MNA酶的催化活性的条件下缔合，因此有助于所述第一MNA酶的催化活性，因此允许所述第一MNA酶底物的修饰，其中；
所述第一MNA酶底物的修饰导致第四MNA酶底物的产生；并且
其中第二MNA酶的装配促进子帮助第二MNA酶的所述组分与第二和第四MNA酶底物装配；并且
其中第二MNA酶的催化连接酶活性产生第三MNA酶的第三装配促进子，并且其中；
所述第三MNA酶的第一和第二部分酶与所述第三装配促进子在允许第三MNA酶催化活性的条件下的缔合促进了所述第三MNA酶的催化活性，因此允许至少第三MNA酶底物的修饰，其中所述底物的任一个或其组合的修饰指示所述第一装配促进子的存在。
在一个实施方案中，第三MNA酶催化的反应产物可以是允许第四核酸酶功能所需的组分。第四核酸酶催化的反应产物可以是参与第二或第三MNA酶或两者催化的反应的组分。
在一个实施方案中，所述底物的任一个或其组合的修饰提供了可检测的效应。至少一个底物的修饰可选自包含以下的组：核酸的切割、核酸的连接、核酸的磷酸化、核酸加帽、氨基酸腺苷酰化、辅因子合成、RNA聚合、模板指导的聚合、RNA-蛋白轭合、羟醛反应、醇氧化、醛还原、嘌呤和嘧啶核苷酸的合成、烷基化、酰胺合成、尿素合成、肽键的形成、肽基-RNA的合成、酰基转移、氨酰化、碳酸酯水解、硫代磷酸烷基化、卟啉金属化、碳-碳键的形成、Pd纳米颗粒的形成、联苯异构化、酯键的形成、酰胺键的形成、DNA去糖基化、胸腺嘧啶二聚体的光逆转和氨基磷酸酯的切割。
第一装配促进子可以是待鉴定、待检测或待定量的靶。
在一个实施方案中，DNA核酶连接酶可选自包含DNA核酶连接酶7Z81、7Z48、7Q10和9DB1的组。
在另一个实施方案中，第二MNA酶的产物可以是第二DNA核酶连接酶的底物，其中DNA核酶连接酶有助于第一和第二DNA核酶连接酶底物的连接，因此产生第二MNA酶的另外的第二部分酶。第二MNA酶的产物可以是第二DNA核酶连接酶的底物，其中DNA核酶连接酶有助于第一和第二DNA核酶连接酶底物的连接，因此产生第二MNA酶的另外的第二装配促进子。此外，第三MNA酶的产物可以是第四MNA酶的底物，其中第二MNA酶有助于第二和第四MNA酶底物的连接，因此产生第三MNA酶的另外的第二部分酶。
在一个进一步的实施方案中，第三MNA酶的产物可以是第四MNA酶的底物，其中第二MNA酶有助于第二和第四MNA酶底物的连接，因此产生第三MNA酶的另外的第三装配促进子。
本发明的另一方面提供了一对分离的核酸作为催化核心序列加入MNA连接酶部分酶对的应用，其中所述核酸对选自由以下组成的组：TGGAGGTGGGCTC(SEQ ID NO：47)和ACG(SEQ ID NO：48)、GGAGGTGGGCTC(SEQ ID NO：49)和ACGT(SEQ ID NO：50)、GGAGGTTAGCTC(SEQ ID NO：71)和ACGGCGGAGTGATTG(SEQ IDNO：72)、TGGGAGGTTAGCTC(SEQ ID NO：73)和ACGGCGGAGTGAT(SEQ ID NO：74)、ATTGGGAGGTTAGCTC(SEQ ID NO：75)和ACGGCGGAGTG(SEQ ID NO：76)、TGATTGGGAGGTTAGCTC(SEQ IDNO：77)和ACGGCGGAG(SEQ ID NO：78)、AGTGATTGGGAGGTTAGCTC(SEQ ID NO：79)和ACGGCGG(SEQ IDNO：80)、GGAGTGATTGGGAGGTTAGCTC(SEQ ID NO：81)和ACGGC(SEQ ID NO：82)。
本发明的另一方面提供了一种MNA连接酶，其包含作为催化核心序列加入部分酶对的一对分离的核酸，其中所述核酸对选自由以下组成的组：TGGAGGTGGGCTC(SEQ ID NO：47)和ACG(SEQ ID NO：48)、GGAGGTGGGCTC(SEQ ID NO：49)和ACGT(SEQ ID NO：50)、GGAGGTTAGCTC(SEQ ID NO：71)和ACGGCGGAGTGATTG(SEQ IDNO：72)、ATTGGGAGGTTAGCTC(SEQ ID NO：75)和ACGGCGGAGTG(SEQ ID NO：76)、TGATTGGGAGGTTAGCTC(SEQ ID NO：77)和ACGGCGGAG(SEQ ID NO：78)、AGTGATTGGGAGGTTAGCTC(SEQ IDNO：79)和ACGGCGG(SEQ ID NO：80)、GGAGTGATTGGGAGGTTAGCTC(SEQ ID NO：81)和ACGGC(SEQ IDNO：82)。
本发明的另一个方面提供了一种MNA连接酶来连接两个底物的应用，其中在所述底物被所述MNA连接酶的底物臂接合后，所述底物由所述MNA连接酶连接形成产物。
在一个实施方案中，产物可与至少一个核酸复合体的组分缔合。
在另一个实施方案中，产物可选自包含以下的组：装配促进子、部分酶、底物、DNA核酶、稳定臂、活性抑制子、装配抑制子或其组分。产物可参与级联。
在另一个实施方案中，至少一个底物是核酸酶催化的反应产物。
本发明的另一个方面提供了一种用于检测多个靶的方法，该方法包括：
a)提供多个第一核酸复合体，每个包含需要与所述多个靶之一缔合来帮助多个第一核酸酶形成的组分，其中每个所述多个第一核酸复合体还包含至少一个底物，并
b)提供多个第二核酸复合体的每个的至少一个组分，该组分能与由多个第一核酸酶催化的多个反应产物缔合并形成能作为多个第二核酸酶起作用的多个第二核酸复合体，其中所述核酸酶的至少一个具有连接酶活性，并且所述核酸酶的至少一个是MNA酶，其中所述方法包括：
i)使推测包含所述多个靶的样品与多个第一核酸复合体接触，其中所述多个靶与所述多个第一核酸复合体缔合以促进所述多个第一核酸酶的形成，并
ii)使多个第一核酸酶催化的反应的多个产物与多个第二核酸复合体的每个的至少一个组分接触，因此允许作为所述多个第二核酸酶起作用的多个所述第二核酸复合体的形成，并且
其中第一或第二或两者的多个核酸酶的活性指示所述多个靶的存在。
在一个实施方案中，多个第一或第二核酸酶的任一个催化的反应产物的至少一个可以是允许至少一个其他核酸酶功能所需的组分。
在另一个实施方案中，核酸酶的任一个催化的反应产物的至少一个与上述核酸复合体的任一个的组分缔合，因此允许核酸复合体的至少一个作为其他核酸酶起作用。
本发明的另一个方面提供了至少两种寡核苷酸作为多组分核酸连接酶(MNA连接酶)底物的应用，其中在所述底物被所述MNA连接酶的底物臂接合后，所述底物由一种MNA连接酶修饰。
本发明的另一方面提供了一种用于检测至少两个靶的方法，其中所述方法包括：
a)提供至少两个核酸复合体，每个包含需要与所述多个靶的至少一个缔合来帮助至少两个核酸酶复合体形成的组分，并
b)使推测包含所述至少两个靶的样品与所述至少两个核酸复合体接触，其中所述靶与所述核酸复合体缔合以便有助于所述核酸酶复合体的形成，并且其中由每个核酸酶复合体活性产生的至少一个产物是形成其他核酸酶复合体所需的，并且
其中其他核酸酶复合体的活性指示所述至少两个靶的存在。
在一个实施方案中，所述核酸酶复合体的至少一个可具有连接酶活性。进一步地，所述核酸酶复合体的至少一个可以是MNA酶复合体。
根据本发明的另一方面，提供了具有连接酶活性的MNA酶(MNA连接酶)将活性MNA酶转变成MNAi复合体的应用；其中
所述活性MNA酶是在至少第一装配促进子组分和第二装配促进子组分存在的情况下形成的，并且其中
所述MNA连接酶在至少第三装配促进子存在的情况下形成，并且其中
所述MNA连接酶促进所述第二装配促进子组分与活性抑制子组分连接形成活性抑制子；并且其中
所述活性抑制子与所述MNA酶的一个或多个组分缔合形成MNAi复合体。
在一个实施方案中，装配促进子、活性抑制子组分或活性抑制子的至少一个可以是核酸分子。
在一个实施方案中，装配促进子、活性抑制子组分或活性抑制子的至少一个可以包含DNA或其类似物。
根据本发明的另一方面，提供了一种具有连接酶活性的包含至少两个或多个寡核苷酸组分的多组分核酸酶，其中至少第一寡核苷酸组分和第二寡核苷酸组分在MNA连接酶装配促进子存在的情况下自装配形成催化上有活性的具有连接酶活性的多组分核酸酶(MNA连接酶)，
其中所述至少第一和所述第二寡核苷酸组分的每个包含底物臂部分、催化核心部分和感应臂部分；
其中一旦自装配，所述第一和第二寡核苷酸组分的感应臂部分作为MNA连接酶的感应臂，第一和第二寡核苷酸组分的底物臂部分作为MNA连接酶的底物臂，第一和第二寡核苷酸组分的催化核心部分作为MNA连接酶的催化核心；并且
其中MNA连接酶的感应臂与所述MNA连接酶装配促进子相互作用，以便保持第一和第二寡核苷酸组分邻近用于它们各自催化核心部分的缔合，以便形成MNA连接酶的催化核心，所述催化核心能连接至少两个底物，并且
其中所述MNA连接酶的所述底物臂接合第一和第二底物，以便所述MNA酶的所述催化核心能连接所述底物。
在一个实施方案中，具有连接酶活性的多组分核酸酶的所述寡核苷酸组分、装配促进子或底物的至少一个可包含DNA或其类似物。
在一个实施方案中，底物的连接可提供可检测的效应。
本发明的另一方面提供了一种包含至少两个寡核苷酸部分酶以及至少3个其他寡核苷酸组分的组合物，每个寡核苷酸部分酶包含至少催化核心部分、感应臂部分和报告臂部分，所述其他寡核苷酸组分包含装配促进子寡核苷酸和至少两个底物核酸，其中所述组合物能形成能连接底物核酸的多组分核酸复合体。
在一个实施方案中，组合物的所述寡核苷酸组分、装配促进子或底物的至少一个可包含DNA或其类似物。
本发明的另一方面提供了一种包含至少两个或多个寡核苷酸组分的组合物，其中至少第一寡核苷酸组分和第二寡核苷酸组分在MNA酶装配促进子存在的情况下自装配形成催化上有活性的具有连接酶活性的多组分核酸酶(MNA连接酶)。
其中所述至少第一和所述第二寡核苷酸组分的每个包含底物臂部分、催化核心部分和感应臂部分；
其中一旦自装配，所述第一和第二寡核苷酸组分的感应臂部分作为MNA连接酶的感应臂，第一和第二寡核苷酸组分的底物臂部分作为MNA连接酶的底物臂，第一和第二寡核苷酸组分的催化核心部分作为MNA连接酶的催化核心；
并且其中MNA连接酶的感应臂与所述MNA酶装配促进子相互作用，以便保持第一和第二寡核苷酸组分邻近用于它们各自催化核心部分的缔合，以便形成MNA连接酶的催化核心，所述催化核心能连接至少一个底物与另一个底物，并且
其中所述MNA连接酶的所述底物臂接合第一和第二底物，以便所述MNA连接酶的所述催化核心能连接所述底物。
在一个实施方案中，底物的连接可提供可检测的效应。
在一个实施方案中，组合物的所述寡核苷酸组分、装配促进子或底物的至少一个可包含DNA或其类似物。
本发明的另一方面提供了一种具有连接酶活性的多组分核酸酶，其中所述MNA酶的至少一个寡核苷酸组分还包含适体。
在另一方面，装配促进子或底物的至少一个还包含适体。
在一个实施方案中，MNA连接酶的装配可由存在或不存在一种或多种能结合适体的分析物指引。
本发明的另一方面提供了一种用于检测至少一个装配促进子的存在的方法，该方法包括
(a)提供至少两个或多个寡核苷酸组分，其中至少第一寡核苷酸组分和第二寡核苷酸组分在装配促进子存在的情况下自装配形成至少一个催化上有活性的具有连接酶活性的多组分核酸酶(MNA连接酶)，
(b)使两个或多个寡核苷酸组分与推测含有装配促进子的样品在允许以下的条件下接触：
(1)所述至少一个催化上有活性的MNA连接酶的自装配，和
(2)所述至少一个MNA连接酶的催化活性；并
(c)确定所述至少一个MNA连接酶催化活性的存在，其中催化活性的存在指示所述至少一个装配促进子的存在。
在一个实施方案中，所述寡核苷酸组分或装配促进子的至少一个可包含DNA或其类似物。
在一个实施方案中，所述装配促进子可以是待鉴定、待检测或待定量的靶。
在一个实施方案中，所述靶可以是核酸。
在一个优选实施方案中，所述核酸可选自包含以下的组：DNA、甲基化DNA、烷基化DNA、RNA、甲基化RNA、微小RNA、siRNA、shRNA、mRNA、tRNA、snoRNA、stRNA、smRNA、微小RNA前体(pre-microRNA)和pri-微小RNA(pri-microRNA)、其它非编码RNA、核糖体RNA、其衍生物、其扩增子或其任何组合。
在一个实施方案中，核酸的来源可选自包含以下的组：合成的、哺乳动物、人、动物、植物、真菌、细菌、病毒、古细菌来源或其任何组合。
在一个实施方案，方法可还包括扩增装配促进子的步骤。
在一个实施方案中，扩增步骤可包括以下的一个或多个：聚合酶链反应(PCR)、链置换扩增、环介导的等温扩增、滚环扩增、转录介导的扩增、自动维持序列扩增、连接酶链反应、基于核酸序列扩增或反转录聚合酶链反应(RT-PCR)。
在一个实施方案中，所述装配促进子、所述寡核苷酸组分或反应底物的至少一个或其组合可包含不只一个分子。
在一个实施方案中，方法可还包括在所述扩增期间或之后确定所述催化活性的存在。
在一个实施方案中，MNA连接酶的自装配可能需要装配促进子与所述第一和第二寡核苷酸组分的一个或两个接触。
在一个实施方案中，方法可还包括提供至少第三寡核苷酸组分，其接触第一和第二寡核苷酸组分的一个或两个的至少一部分以便自装配MNA连接酶。
在一个实施方案中，方法所述第三寡核苷酸组分可包含不只一个分子。
本发明的一方面提供了一种能形成MNA连接酶催化核心一部分的分离的核酸序列，该序列包含选自包含以下的组的序列：TGGAGGTGGGCTC(SEQ ID NO：47)、ACG(SEQ ID NO：48)、GGAGGTGGGCTC(SEQ ID NO：49)、ACGT(SEQ ID NO：50)、GGAGGTTAGCTC(SEQ ID NO：71)、ACGGCGGAGTGATTG(SEQ ID NO：72)、TGGGAGGTTAGCTC(SEQ IDNO：73)、ACGGCGGAGTGAT(SEQ ID NO：74)、ATTGGGAGGTTAGCTC(SEQ ID NO：75)、ACGGCGGAGTG(SEQ ID NO：76)、TGATTGGGAGGTTAGCTC(SEQ ID NO：77)、ACGGCGGAG(SEQ ID NO：78)、AGTGATTGGGAGGTTAGCTC(SEQ ID NO：79)、ACGGCGG(SEQ IDNO：80)、GGAGTGATTGGGAGGTTAGCTC(SEQ ID NO：81)和ACGGC(SEQ ID NO：82)。
根据本发明的另一方面，提供了一种使用级联来检测第一装配促进子的方法，该级联包含第一MNA酶的组分、第一MNA酶的底物、第二MNA酶的组分、第二MNA酶的第二装配促进子、第二MNA酶的底物、第三MNA酶的第三装配促进子、至少第三MNA酶的底物和第三MNA酶的第一部分酶，其中
所述第一装配促进子与所述第一MNA酶的组分在允许所述第一MNA酶的催化活性的条件下的缔合促进了所述第一MNA酶的催化活性，因此切割所述第一MNA酶的底物，其中
第一MNA酶底物的切割导致第四MNA酶底物的产生；并且
其中第二MNA酶装配促进子促进第二MNA酶与第二和第四MNA酶底物的装配；并且
其中第二MNA酶的催化连接酶活性产生了第三MNA酶的第二部分酶，并且其中
所述第三MNA酶的第一和第二部分酶与所述第三装配促进子在允许第三MNA酶的催化活性的条件下的缔合促进了所述第三MNA酶的催化活性，因此提供了至少第三MNA酶底物的修饰。
第一、第二或至少第三MNA酶底物或其任何组合的修饰可提供可检测的效应。
至少第三MNA底物的修饰可选自包含以下的组：核酸的切割、核酸的连接、核酸磷酸化、核酸加帽、氨基酸腺苷酰化、辅因子合成、RNA聚合、模板指导的聚合、RNA-蛋白轭合、羟醛反应、醇氧化、醛还原、嘌呤和嘧啶核苷酸的合成、烷基化、酰胺合成、尿素合成、肽键的形成、肽基-RNA的合成、酰基转移、氨酰化、碳酸酯水解、硫代磷酸烷基化、卟啉金属化、碳-碳键的形成、Pd纳米颗粒的形成、联苯异构化、酯键的形成、酰胺键的形成、DNA去糖基化、胸腺嘧啶二聚体的光逆转和氨基磷酸酯的切割。
在本发明的一个实施方案中，该方法还包含扩增级联，其中第三MNA酶的产物是第四MNA酶的底物，并且其中第二MNA酶促进第二和第三MNA酶底物的连接，因此产生了第三MNA酶的另外的第二部分酶。
根据本发明的另一个方面，提供了一种使用级联来检测第一装配促进子的方法，该级联包含第一MNA酶的组分、第一MNA酶的底物、第二MNA酶的组分、第二MNA酶的装配促进子、第二MNA酶的底物、第三MNA酶的组分和至少第三MNA酶的底物，其中
所述第一装配促进子与所述第一MNA酶的组分在允许所述第一MNA酶的催化活性的条件下的缔合促进了所述第一MNA酶的催化活性，因此切割所述第一MNA酶的底物，其中
第一MNA酶底物的切割导致第四MNA酶底物的产生；并且
其中第二MNA酶装配促进子促进第二MNA酶与第二和第四MNA酶底物的装配；并且
其中第二MNA酶的催化活性产生第三MNA酶的第三MNA酶装配促进子，并且其中
所述第三MNA酶装配促进子与所述第三MNA酶的组分在允许第三MNA酶的催化活性的条件下的缔合促进了所述第三MNA酶的催化活性，因此提供了至少第三MNA酶底物的修饰。
第一、第二或至少第三MNA酶底物或其任何组合的修饰可提供可检测的效应。
至少第三MNA底物的修饰可选自包含以下的组：核酸的切割、核酸的连接、核酸磷酸化、核酸加帽、氨基酸腺苷酰化、辅因子合成、RNA聚合、模板指导的聚合、RNA-蛋白轭合、羟醛反应、醇氧化、醛还原、嘌呤和嘧啶核苷酸的合成、烷基化、酰胺合成、尿素合成、肽键的形成、肽基-RNA的合成、酰基转移、氨酰化、碳酸酯水解、硫代磷酸烷基化、卟啉金属化、碳-碳键的形成、Pd纳米颗粒的形成、联苯异构化、酯键的形成、酰胺键的形成、DNA去糖基化、胸腺嘧啶二聚体的光逆转和氨基磷酸酯的切割。
在本发明的一个实施方案中，该方法还包含扩增级联，其中第三MNA酶的产物是第四MNA酶的底物，并且其中第二MNA酶促进第二和第四MNA酶底物的连接，因此产生第三MNA酶的另外的第三装配促进子。
根据本发明的另一方面，提供了一种使用级联来检测第一装配促进子的方法，该级联包含具有切割活性的第一MNA酶的组分、第一MNA酶的底物、具有连接酶活性的第一DNA核酶(DNA核酶连接酶)、第一DNA核酶连接酶的底物、第二装配促进子、至少第二MNA酶的底物和第二MNA酶的第一部分酶，其中
所述第一装配促进子与所述第一MNA酶的组分在允许所述第一MNA酶的催化活性的条件下的缔合促进了所述第一MNA酶的催化活性，因此提供了所述第一MNA酶底物的修饰，其中
第一MNA酶底物的修饰导致第二DNA核酶连接酶底物的产生；并且
其中第一DNA核酶连接酶与第一和第二DNA核酶连接酶底物装配；并且
其中DNA核酶连接酶的催化活性产生了第二MNA酶的第二部分酶；并且其中
所述第二MNA酶的第二部分酶与所述第二装配促进子和第二MNA酶的第一部分酶在允许第二MNA酶的催化活性的条件下的缔合促进了所述第二MNA酶的催化活性，因此提供了至少第二MNA酶底物的修饰。
所述寡核苷酸组分、装配促进子或底物的至少一个可包含DNA或其类似物。
第一装配促进子可以是待鉴定、待检测或待定量的靶。
第一或第二MNA酶底物或连接酶底物或其任何组合的修饰可提供可检测的效应。
第二MNA酶的催化活性可选自包含以下的组：核酸的切割、核酸的连接、核酸磷酸化、核酸加帽、氨基酸腺苷酰化、辅因子合成、RNA聚合、模板指导的聚合、RNA-蛋白轭合、羟醛反应、醇氧化、醛还原、嘌呤和嘧啶核苷酸的合成、烷基化、酰胺合成、尿素合成、肽键的形成、肽基-RNA的合成、酰基转移、氨酰化、碳酸酯水解、硫代磷酸烷基化、卟啉金属化、碳-碳键的形成、Pd纳米颗粒的形成、联苯异构化、酯键的形成、酰胺键的形成、DNA去糖基化、胸腺嘧啶二聚体的光逆转和氨基磷酸酯的切割。
第二MNA酶底物的修饰可以是切割。
底物的连接可提供可检测的效应。
在本发明的一个实施方案中，该方法还包含扩增级联，其中第二MNA酶的产物是第二DNA核酶连接酶底物，并且其中DNA核酶连接酶促进第一和第二DNA核酶连接酶底物的连接，因此提供了第二MNA酶的另外的第二部分酶。
DNA核酶连接酶可选自包含DNA核酶连接酶7Z81、7Z48和7Q10的组。
根据本发明的另一方面，提供了一种使用级联来检测第一装配促进子的方法，该级联包含具有切割活性的第一MNA酶的组分、第一MNA酶的底物、具有连接酶活性的第一DNA核酶(DNA核酶连接酶)、第一DNA核酶连接酶的底物、第二MNA酶的组分和至少第二MNA酶的底物，并且其中
所述第一装配促进子与所述第一MNA酶的组分在允许所述第一MNA酶的催化活性的条件下的缔合促进了所述第一MNA酶的催化活性，因此提供了所述第一MNA酶底物的修饰，其中
第一MNA酶底物的修饰导致第二DNA核酶连接酶底物的产生；并且
其中第一DNA核酶连接酶与第一和第二DNA核酶连接酶底物装配；并且
其中DNA核酶连接酶的催化活性产生了第二MNA酶的第二装配促进子；并且其中
所述第二MNA酶的第二装配促进子与所述第二MNA酶的组分在允许第二MNA酶的催化活性的条件下的缔合促进了所述第二MNA酶的催化活性，因此提供了至少第二MNA酶底物的修饰。
所述寡核苷酸组分、装配促进子或底物的至少一个可包含DNA或其类似物。
第一或第二MNA酶的底物或连接酶底物或其任何组合的修饰可提供可检测的效应。
第一装配促进子可以是待检测、待鉴定或待定量的靶。
第二MNA酶的催化活性可选自包含以下的组：核酸的切割、核酸的连接、核酸磷酸化、核酸加帽、氨基酸腺苷酰化、辅因子合成、RNA聚合、模板指导的聚合、RNA-蛋白轭合、羟醛反应、醇氧化、醛还原、嘌呤和嘧啶核苷酸的合成、烷基化、酰胺合成、尿素合成、肽键的形成、肽基-RNA的合成、酰基转移、氨酰化、碳酸酯水解、硫代磷酸烷基化、卟啉金属化、碳-碳键的形成、Pd纳米颗粒的形成、联苯异构化、酯键的形成、酰胺键的形成、DNA去糖基化、胸腺嘧啶二聚体的光逆转和氨基磷酸酯的切割。
DNA核酶连接酶可选自包含DNA核酶连接酶7Z81、7Z48和7Q10的组。
第二MNA酶底物的修饰可以是切割。
底物的连接可提供可检测的效应。
在本发明的一个实施方案中，该方法还包含扩增级联，其中第二MNA酶的产物是第二DNA核酶连接酶底物，其中DNA核酶连接酶促进第一和第二DNA核酶连接酶底物的连接，因此产生第二MNA酶的另外的第二装配促进子。
根据本发明的另一方面，提供了一种使用级联来检测第一装配促进子的方法，该级联包含具有切割活性的第一MNA酶(第一MNA酶切割子)的组分、第一可切割的MNA酶底物、具有连接酶活性的第一MNA酶(第一MNA连接酶)的组分、第一MNA连接酶装配促进子、第一MNA连接酶底物、第二MNA酶切割子的第二装配促进子、第二可切割的MNA酶的底物和第二MNA酶切割子的第一部分酶，其中
所述第一装配促进子与所述第一MNA酶切割子的组分在允许所述第一MNA酶切割子的催化活性的条件下的缔合促进了所述第一MNA酶切割子的催化活性，因此提供了所述第一可切割的MNA酶底物的修饰，其中
第一可切割的MNA酶底物的修饰导致第二MNA连接酶底物的产生；并且
其中MNA连接酶装配促进子促进第一MNA连接酶与第一和第二MNA连接酶底物的装配；并且
其中MNA连接酶的催化活性产生了第二MNA酶切割子的第二部分酶，并且其中
所述第二MNA酶切割子的第一和第二部分酶与所述第二装配促进子在允许第二MNA酶切割子的催化活性的条件下的缔合促进了所述第二MNA酶切割子的催化活性，因此提供了第二可切割的MNA酶底物的修饰。
所述寡核苷酸组分、装配促进子或底物的至少一个可包含DNA或其类似物。
第一装配促进子可以是待鉴定、待检测或待定量的靶。
第一或第二可切割MNA酶的底物或两者的修饰可提供可检测的效应。
底物的连接可提供可检测的效应。
在一个实施方案中，该方法还包含扩增级联，其中第二MNA酶的产物是第二MNA连接酶的底物，其中MNA连接酶促进第一和第二MNA连接酶底物的连接，因此产生第二MNA酶切割子的另外的第二部分酶。
根据本发明的另一方面，提供了一种使用级联来检测第一装配促进子的方法，该级联包含具有切割活性的第一MNA酶(第一MNA酶切割子)的组分、第一可切割的MNA酶底物、具有连接酶活性的第一MNA酶(第一MNA连接酶)的组分、第一MNA连接酶的装配促进子、第一MNA连接酶的底物、第二MNA酶切割子的组分和第二可切割MNA酶的底物，其中
所述第一装配促进子与所述第一MNA酶切割子的组分在允许所述第一MNA酶切割子的催化活性的条件下的缔合促进了所述第一MNA酶切割子的催化活性，因此提供了所述第一可切割的MNA酶底物的修饰，其中
第一可切割的MNA酶底物的修饰导致第二MNA连接酶底物的产生；并且
其中MNA连接酶装配促进子促进第一MNA连接酶与第一和第二MNA连接酶底物的装配；并且
其中MNA连接酶的催化活性产生了第二MNA酶切割子的第二MNA酶的装配促进子；并且其中
所述第二MNA酶装配促进子与所述第二MNA酶切割子的组分在允许第二MNA酶切割子的催化活性的条件下的缔合促进了所述第二MNA酶切割子的催化活性，因此提供了第二可切割的MNA酶底物的修饰。
所述寡核苷酸组分、装配促进子或底物的至少一个可包含DNA或其类似物。
第一或第二可切割的MNA酶底物或两者的修饰可提供可检测的效应。
底物的连接可提供可检测的效应。
第一装配促进子可以是待鉴定、待检测或待定量的靶。
在一个实施方案中，该方法还包含扩增级联，其中第二MNA酶的产物是第二MNA连接酶的底物，其中MNA连接酶促进第一和第二MNA连接酶底物的连接，因此产生第二MNA酶切割子的另外的第二MNA酶的装配促进子。
本发明的另一方面提供了至少一种寡核苷酸作为多组分核酸酶(MNA酶)的底物的应用，其中在所述底物被所述MNA酶的底物臂接合后，所述底物由所述MNA酶修饰。
本发明的另一方面提供了一种制备加入了部分DNA核酶序列的MNA酶的方法，其中所述方法包括下述步骤：
a)在所述DNA核酶的序列内选择用于分成部分催化核心序列的位置
b)将所述部分催化核心序列加入部分酶
c)检测部分酶对的催化活性来确定在所述部分酶中所述部分催化核心序列的哪种组合与活性MNA酶的形成相容。
本发明的另一方面提供了一种用于测试来自DN核A酶催化核心的部分催化核心序列的方法，所述部分催化核心序列一旦加入部分酶，就产生功能上有活性的MNA酶，其中所述方法包括
a)分开所述DNA核酶的催化核心序列
b)将得到的部分催化核心序列加入部分酶；
c)检测MNA酶的活性来确定在所述部分酶中所述部分催化核心序列的哪种组合与活性MNA酶的形成相容。
本发明的另一方面提供了一种用于鉴定DNA核酶催化核心序列内的哪个位置适合用于分成部分催化核心序列的方法，所述部分催化核心序列一旦加入部分酶，就产生功能上有活性的MNA酶，其中所述方法包括下述步骤：
a)分开来自所述DNA核酶的催化核心序列
b)将得到的部分催化核心序列加入部分酶；
c)检测MNA酶的活性来确定在所述部分酶中所述部分催化核心序列的哪种组合与活性MNA酶的形成相容。
附图简述
现在仅作为实例，并参考下面的附图来描述本发明的优选实施方案，其中
图1：一个多组分核酸(MNA酶)的一种示例性设计的描述：作为示例性公开，MNA酶包含两个寡核苷酸组分(部分酶A和部分酶B)，这两个组分在装配促进子存在的情况下自装配。当两个部分酶在装配促进子的情况下装配时，形成了能修饰(例如切割)底物的催化上有活性的MNA酶。两个组分部分酶具有(i)感应臂，与装配促进子结合，(ii)底物臂，与底物结合，和(iii)部分催化核心序列。装配促进子分子的存在提供了指引部分酶组分以高度特异的方式装配的“输入”信号，这是易于调控的。在一些实施方案中，装配促进子可以是例如存在于测试样品中的靶核酸序列。在其他实施方案中，装配促进子可以是例如包含于环境中的合成的寡核苷酸，其在可检测的实体或事件存在的情况下指引部分酶组分的自装配。装配的MNA酶对底物的修饰能提供可被检测和/或定量的“输出”信号。例如，当用荧光团(F)和猝灭剂(Q)对底物进行双标记时，活性MNA酶对底物的切割将荧光团和猝灭剂分开，导致伴随的荧光的增强。
图2：活性MNA酶的其他示例性设计。图(i)：MNA酶的一种示例性设计的描述，其中多个装配促进子组分是MNA酶形成所需的。在这一设计中，一个装配促进子组分(F1)与部分酶A和B两者的感应臂区域互补，而第二装配促进子组分(F2)仅与部分酶B(按照本图例)或仅与部分酶A互补。两个装配促进子组分一起指导能修饰(例如切割)底物的活性MNA酶的装配。图(ii)：一种示例性设计的描述，其中一个部分酶A组分和二分部分酶B组分在装配促进子存在的情况下装配，产生能修饰(例如切割)底物的活性MNA酶。在这个图中，部分酶B具有截短的感应臂(T)，截短的感应臂不足以在缺少第二组分(称为稳定臂组分(S))的情况下允许稳定的MNA酶的装配。稳定臂与装配促进子在邻近部分酶截短的感应臂位置的杂交允许活性MNA酶的装配。
本领域的技术人员应理解，截短的部分酶臂可能是下述的任一种：部分酶A感应臂、部分酶B感应臂(如图示)、部分酶A底物臂或部分酶B底物臂或其组合。
图3：在活性和无活性多组分核酸复合体存在的情况下输出信号(荧光)随时间的改变。在本实例中，第一部分酶(A)包含单组分寡核苷酸。第二部分酶(B)具有一个含有底物臂、部分催化核心和截短的感应臂(T)的组分和作为稳定臂(S)的第二组分。
含有部分酶A和B以及装配促进子的所有组分的反应(i)中观察到荧光的增强。这与该反应中活性MNA酶的装配和底物的切割一致。缺少部分酶B的稳定臂部分(反应(ii))导致信号没有随时间增强，表明该组分是该系统中活性MNA酶的装配所必需的。缺少装配促进子的对照反应(反应(iii))也没有表现出荧光随时间的增强。
这些反应代表了寡核苷酸复合体的两个交替的状态。活性MNA酶(反应(i))代表活性复合体(“启动”状态)。其中部分酶稳定臂组分(反应(ii))或装配促进子组分(反应(iii))缺失的那些反应代表无活性的MNA复合体(“关闭”状态)。照这样，MNA酶的催化活性可受各种寡核苷酸的存在或缺乏和/或受此类寡核苷酸组分具有功能活性(例如能与其他寡核苷酸组分杂交以形成稳定的MNA酶或MNA酶复合体)的能力的调控。截短臂设计为不足以允许在反应条件下稳定的MNA酶的装配，除非附有稳定臂组分。稳定臂和装配促进子可作为MNA酶活性的“启动”开关而起作用。
图4：无活性多组分核酸抑制子(MNAi)复合体(左侧)和活性MNA酶(右侧)的示例性设计的描述：当部分酶A和B与装配促进子组分和活性抑制子形成复合体时，形成MNAi复合体(左侧)。无活性的MNAi复合体能与底物相互作用，但不能催化地修饰底物。在一些实施方案中，活性抑制子可还包括不稳定或可切割的接头(由虚线箭头指示)，该接头可分开活性抑制子内的两个或多个结构域。此类结构域可包括例如，(i)活性抑制子部分，它基本上不与部分酶组分互补，并且通过破坏形成具有催化活性的MNA酶所需的二级结构来执行抑制作用，和(ii)激活装配促进子部分，该部分如果与活性抑制子部分分开，可作为装配促进子组分起作用，指导活性MNA酶的装配。
图5：各种多组分核酸复合体的催化活性的示例。所有反应包含部分酶A、部分酶B和用荧光团-猝灭剂染料对标记的底物。另外，该反应含有(i)装配促进子F1/2，(ii)包含部分F1和F2的装配促进子(其序列一起对应于装配促进子F1/2的序列)，(iii)装配促进子部分F1和含有两个连接的结构域(对应于活性抑制子部分和具有与F2相同序列的部分)的活性抑制子，或者(iv)没有装配促进子或活性抑制子。
监测荧光随时间的改变，作为活性MNA酶对底物的催化切割的量度(图5)。在含有装配促进子F1/2或装配促进子组分F1和F2的反应中荧光迅速增强，表明分别形成了活性MNA酶1和2，两者都能切割底物。相反，含有F1和活性抑制子的反应没有显示荧光随时间的增强，表明形成了无活性的MNAi复合体。在缺少装配促进子的情况下没有观察到荧光的增强。
图6.变体MNA酶设计的示例性结构。活性MNA酶复合体的一些实例显示于图A至D。这些结构都能形成催化上有活性的酶，这些酶能修饰(例如切割)底物(S)。列举的是MNA酶复合体的示意图，该复合体包括一个装配促进子F1(图A)、两个装配促进子组分F1和F2(图B和D)或三个装配促进子组分F1、F2和F3(图C)。图A包括在部分酶感应臂内具有自我互补区的感应臂。MNA酶复合体也可包括一个或多个稳定臂(sA)，如图D所示。
图7：调控MNA酶活性的示例性策略。该系统中的策略可用作(i)使用配基作为激活分子来控制MNA酶活性的方法，和/或(ii)使用适体-MNA酶来检测核酸和非核酸靶的方法。
该示例性适体-MNA酶检测策略中包括的核酸寡核苷酸包括：
a)部分酶；
b)适体-部分酶，是具有加入其一个末端的适体的部分酶；
c)装配促进子，是与适体-部分酶和部分酶两者结合促使活性MNA酶装配的寡核苷酸；
d)底物，例如报告底物；和
e)装配抑制子寡核苷酸，其与适体-部分酶在至少横跨适体序列的一部分和适体-部分酶序列的底物结合臂的一部分的区域杂交。
在缺少激活配基的情况下(左图)，装配抑制子寡核苷酸与适体-部分酶结合，因此竞争并阻抑报告底物的结合。当激活配基存在时(右图)，它与适体-部分酶的适体序列结合，阻抑装配抑制子寡核苷酸的结合，因此允许活性适体-MNA酶复合体的装配和随后的修饰，例如底物的切割(如图示)或例如底物的连接。照这样，活性的适体-MNA酶仅在能与适体-部分酶的适体部分结合的配基存在的情况下形成，并引起信号(例如荧光信号)的增强或减弱。
应理解，适体序列能与例如一个或两个部分酶的底物臂和/或感应臂的一个或多个相连。如果适体与感应臂相连，那么在缺少靶配基的情况下，装配促进子的结合可被装配抑制子寡核苷酸阻抑。
当适体-MNA酶具有切割活性时(如本图中所示)，那么修饰可通过切割双标记的报告底物、因此造成荧光团/猝灭剂染料对的分开而引起例如荧光的增强。
应理解，适体-MNA酶执行的修饰可以是除切割之外的修饰，例如两个底物的连接。在这种情况中，信号的改变可以是例如在两个可连接的底物(每个底物用荧光团/猝灭剂染料对的荧光团或猝灭剂标记)连接之后荧光的减弱。
这种适体-MNA酶的方法也可用来开发能启动和关闭MNA复合体催化活性的分子开关。可选地，该方法也可应用于核酸和非核酸靶配基的检测。
图8：由具有连接酶活性的DNA核酶和具有切割活性的MNA酶介导的切割/连接级联的实例：
如果例如oligo 1和oligo 2具有2’，3’-环状磷酸和5’-羟基末端(如所示)，那么具有连接酶活性的DNA核酶能连接第一寡核苷酸(oligo 1)与第二寡核苷酸(oligo 2)，产生具有oligo 3序列和连接处的2’-5’RNA键合的第三连接产物(LP-Oligo 3)。反过来，LP-oligo 3可被能在2’-5’RNA键合处切割的MNA酶切割产生切割产物(CP)，CP-oligo 1和CP-oligo 2，因此再生了2’，3’-环状磷酸和5’-羟基产物，这些产物可参与其他轮的连接。
如果例如oligo 1和oligo 2具有2’，3’-二醇和5’-三磷酸末端，那么具有连接酶活性的其他DNA核酶能连接第一寡核苷酸(oligo 1)与第二寡核苷酸(oligo 2)，产生具有oligo 3序列和连接处的3’-5’RNA键合的第三连接产物(LP-Oligo 3)。反过来，LP-oligo 3可被能在3’-5’RNA键合处切割的MNA酶切割产生切割产物(CP)，CP-oligo 1和CP-oligo 2，产生具有2’，3’-环状磷酸和5’-羟基的产物。
图9：使用两类核酸酶(即能切割底物的MNA酶和能连接底物的DNA核酶连接酶)的级联反应的实例。步骤(i)中，MNA酶A仅在装配促进子(例如靶核酸)存在的情况下形成，然后该MNA酶A切割MNA酶底物A，释放具有2’，3’环状磷酸末端的5’产物。步骤(ii)中，具有连接酶活性的DNA核酶B连接来自步骤(i)的5’产物A与3’连接底物B，因此产生了能作为另一个MNA酶C的部分酶组分的连接产物。步骤(iii)中，步骤(ii)的部分酶/连接产物与第二部分酶和装配促进子C装配，形成能将底物C切割成两个产物(5’产物C和3’产物C)的MNA酶C。
步骤(i)中，装配促进子(例如靶核酸)能指导第一MNA酶A的形成。MNA酶A能切割底物A，因此产生能转而用作DNA核酶连接酶B的底物的5’切割产物A。步骤(ii)中，DNA核酶连接酶B能连接步骤(i)中产生的5’切割产物A(也称为5’底物B)与另一个寡核苷酸3’连接底物B，因此产生MNA酶C的新的部分酶。步骤(iii)中，在装配促进子C存在的情况下，步骤(ii)中产生的新部分酶/连接产物与另一个部分酶一起能形成新的MNA酶C，该MNA酶C能将底物C切割成两个产物，5’产物C和3’产物C。如果该底物用例如荧光团和猝灭剂染料对标记，那么在切割底物之后能产生可检测的信号。
进一步，如果5’产物C的序列与5’产物A的序列相同，那么该产物也能作为5’底物B，则反馈扩增级联反应可被起始。该反应中，MNA酶C能不断地产生5’底物B，该5’底物B转而能被DNA核酶连接酶B连接产生用于更多MNA酶C形成的更多部分酶。这一策略提供了在允许MNA酶A装配的靶分析物起始反应之后信号扩增的反馈级联或机制。级联策略允许检测靶分析物，然后使用能连接底物的DNA核酶和能切割底物的MNA酶进行信号扩增。
图10：具有连接酶活性的MNA酶(MNA连接酶)的结构的实例。示例性MNA连接酶包含部分酶序列，该序列含有3个结构域，包括(i)与装配促进子(例如靶核酸)杂交的感应臂，(ii)构成催化核心的一部分的结构域和(iii)底物结合臂(图10A)。在装配促进子(例如靶核酸)存在的情况下，部分酶装配并形成活性MNA连接酶。这些MNA酶能连接具有2’3’环状磷酸的5’底物与具有5’羟基的3’底物(图10B)，产生含有非天然2’-5’键合的连接产物。
可选地，MNA酶能用5’底物的2’3’二醇末端和3’底物的5’-三磷酸末端连接两个底物，产生含有天然3’-5’键合的连接产物。
图11：使用具有连接酶活性的MNA酶和具有切割活性的MNA酶的反应的示例性策略。
如果A和B具有2’，3’-环状磷酸和5’-羟基末端，那么具有连接酶活性的MNA酶能连接第一寡核苷酸(A)与第二寡核苷酸(B)，产生具有连接处的2’-5’RNA键合的第三连接产物(C)。反过来，产物C可被能在2’-5’RNA键合处切割的MNA酶切割产生切割产物A和B，因此再生了2’，3’-环状磷酸和5’-羟基产物，这些产物可参与其他轮的连接。
如果A和B具有2’，3’-二醇和5’-三磷酸末端，那么具有连接酶活性的其他MNA酶能连接第一寡核苷酸(A)与第二寡核苷酸(B)，产生具有连接处的3’-5’RNA键合的第三连接产物(C)。反过来，产物C可被能在3’-5’RNA键合处切割的MNA酶切割产生切割产物A和B，产生具有2’，3’-环状磷酸和5’-羟基的产物。
图12.使用切割的MNA酶和连接的MNA酶的信号检测的策略。步骤(i)中，装配促进子(例如靶核酸)能指导第一MNA酶A的形成。该MNA酶A能切割底物A，因此产生能转而用作具有连接酶活性的MNA酶B的底物的5’切割产物A。步骤(ii)中，MNA连接酶B能连接步骤(i)中产生的5’切割产物A(也称为5’底物B)与另一个寡核苷酸3’底物B，因此产生了MNA酶C的新的部分酶。步骤(iii)中，在装配促进子C存在的情况下，步骤(ii)产生的新部分酶/连接产物与另一个部分酶一起，形成能将底物C切割成两个产物5’产物C和3’产物C的新的MNA酶C。如果该底物用例如荧光团和猝灭剂染料对标记，那么在切割底物之后能产生可检测的信号。该策略允许使用两类MNA酶来检测靶分析物，所述MNA酶即能连接底物的MNA酶(MNA连接酶)和能切割底物的MNA酶(MNA酶切割子)。
进一步，如果5’产物C的序列与5’产物A的序列相同，那么该产物也能作为5’底物B，反馈扩增级联反应可被起始。该反应中，MNA酶C能不断地产生5’底物B，该5’底物B能转而被MNA连接酶B连接产生用于更多MNA酶C形成的更多部分酶。这一策略能提供在允许MNA酶A装配的靶分析物起始反应之后反馈信号扩增的机制。
图13：使用具有连接酶活性的第二MNA酶来在活性MNA酶的“启动状态”至MNAi复合体的“关闭状态”之间转换MNA复合体的示例性策略的描述。在装配促进子组分1(AFC 1)和装配促进子组分2(AFC 2)存在的情况下，能形成能修饰(例如切割或连接)底物A的活性MNA酶A。在装配促进子3(AF3)存在的情况下，能形成具有连接酶活性的第二MNA酶B，然后第二MNA酶B能连接AFC 2与活性抑制子组分(AIC)，导致活性抑制子(AI)的形成。该AI能与MNA酶A的部分酶组分结合，导致无活性的MNAi复合体的形成。照这样，本实例中的MNA连接酶可作为关闭开关来失活MNA酶A。无活性的MNAi复合体和催化上有活性的MNA酶代表了装配组分的两个交替状态，分别称为“关闭”状态和“启动”状态。
图14：从单分子DNA核酶来构建MNA酶的一般方法的描述。
许多DNA核酶具有多个结构域的相似的基本结构。这些DNA核酶具有保守的催化结构域(催化核心)，其侧翼为特异识别底物并与底物杂交的两个非保守的底物结合结构域(“底物臂”)(上部左侧结构)。如果底物含有可被DNA核酶修饰的位点，底物结合结构域可被调整以适合任何底物。
在第一步，鉴定DNA核酶催化核心内能被分开的位置，以致催化核心的每个部分能分布于两个部分序列之间，以致两个部分核心一起构成完整的催化核心(上部右侧结构)。然后两个寡核苷酸A和B(候选部分酶)能被合成(底部左侧结构)。含有如下的寡核苷酸A可被合成：(i)一个能结合底物的底物结合臂部分，(ii)一个部分催化核心部分，和(iii)一个能与装配促进子分子结合的感应臂部分。第二寡核苷酸B可被合成，以致其含有(i)一个能结合与寡核苷酸A相同底物的底物结合臂，借此寡核苷酸B在邻近寡核苷酸A的底物的位置结合底物，(ii)一个部分催化核心部分，其含有来自完整DNA核酶催化核心、未加入寡核苷酸A的那些碱基，和(iii)一个能结合与寡核苷酸A相同装配促进子的感应臂序列，借此寡核苷酸B在邻近寡核苷酸A的装配促进子的位置结合装配促进子(底部左侧结构)。
该过程可被重复，因此产生一系列寡核苷酸对A和B，这些寡核苷酸加入部分酶的结构和结构域，但是在底物和装配促进子存在的情况下可具有或可不具有催化活性。本领域技术人员应理解相似的过程可用于能作用于至少两个底物的核酸酶。候选部分酶对(来自所述系列的寡核苷酸对A和B)可与匹配底物臂的底物和匹配感应臂的装配促进子混合(底部右侧结构)，然后测定与DNA核酶表现出的相同类型的修饰活性的存在(上部左侧结构)。能催化DNA核酶的相同类型修饰的寡核苷酸对A和B用于活性MNA酶的装配。
图15：使用切割底物的核酸酶和连接底物的酶来形成新的装配促进子的级联反应。在本图例中，寡核苷酸的5’末端用圆圈指示。步骤(1)中，MNA酶切割子在装配促进子(例如靶核酸)存在的情况下装配，然后切割MNA酶底物1，释放具有2’，3’环状磷酸末端的5’切割产物。步骤(2)中，DNA核酶连接酶(或MNA连接酶)连接来自步骤(1)的5’切割产物与3’连接底物，因此产生能作为另一个MNA酶切割子2的装配促进子的连接产物。步骤(3)中，由步骤(2)的连接形成的装配促进子指导形成将底物2切割成两个产物(具有2’，3’环状磷酸末端的5’切割产物和3’切割产物)的MNA酶切割子2的部分酶的装配。当该底物用例如荧光团和猝灭剂染料对标记时，在切割底物2之后能产生可检测的信号。该策略允许使用多种类型的核酸酶(即能连接底物的酶和能切割底物的酶)来检测靶分析物。
进一步，如果MNA酶切割子2的5’产物的序列与MNA酶切割子1的5’产物的序列相同，那么该产物也能作为连接酶的底物，反馈级联反应可被起始。该反应中，MNA酶切割子2能不断地产生连接酶的5’底物，该5’底物能转而被连接酶连接产生用于更多MNA酶切割子2形成的更多装配促进子。该策略可提供在允许MNA酶切割子1装配的装配促进子(诸如靶核酸)起始反应之后反馈信号扩增的机制。
图16：使用两类核酸酶(即能切割底物的酶和能连接底物的酶)的反馈级联反应的可能方案。在本图例中，寡核苷酸的5’末端用圆圈指示。步骤(1)中，MNA酶切割子1可仅在装配促进子(例如靶核酸)存在的情况下装配，然后可切割MNA酶底物1，释放具有2’，3’环状磷酸末端的5’切割产物和3’废物。步骤(2)中，DNA核酶连接酶(或MNA连接酶)可连接来自步骤(1)的5’切割产物与3’连接底物，因此产生能作为MNA酶切割子2的装配促进子的连接产物。步骤(3)中，由步骤(2)的连接形成的装配促进子可指导部分酶的装配，形成能将底物2切割成两个产物(具有2’，3’环状磷酸末端的5’切割产物和3’切割产物)的MNA酶切割子2。如果该底物用例如荧光团和猝灭剂染料对标记，那么在切割底物2之后能产生可检测的信号。
进一步，如果MNA酶切割子2的切割产物的任一个的序列用作MNA酶切割子3的装配促进子组分，那么这可以起始反馈级联。在这种情况中，MNA酶切割子3可具有与MNA酶切割子1不同的感应臂，但是可具有与MNA酶切割子1相同的底物。因此如果MNA酶切割子3在通过MNA酶切割子2的切割产生的装配促进子组分存在的情况下被装配，并且如果MNA酶切割子3切割底物1，那么MNA酶切割子3的5’切割产物也可作为DNA核酶连接酶(或装配的MNA连接酶)的5’底物，反馈扩增级联反应可被起始。
在该反馈级联反应中，MNA酶切割子3可不断地产生5’切割产物，该5’切割产物转而可作为用于DNA核酶连接酶(或装配的MNA连接酶)连接的底物，产生能指导更多MNA酶切割子2装配的更多装配促进子。该策略可提供在允许MNA酶切割子1装配的装配促进子(诸如靶分析物)起始反应之后反馈信号扩增的机制。该策略可允许一个或更多装配促进子(例如靶分析物)的检测，然后使用能连接底物的DNA核酶或MNA酶和能切割底物的MNA酶进行信号扩增。
定义
本文使用的某些术语将具有如下所述的意义。
术语“包含”意指“主要包括但不必仅仅包括”。此外，词“包含(comprising)”的变体(诸如“包含(comprise)”和包含(“comprises”))具有相应改变的意义。
术语“多核苷酸”、“核酸”和“寡核苷酸”可互换使用，该术语指脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸碱基的单链-或双链聚合体，或其类似物、衍生物、变体、片段或组合，包括但不限于DNA、甲基化DNA、烷基化DNA、RNA、甲基化RNA、微小RNA、siRNA、shRNA、mRNA、tRNA、snoRNA、stRNA、smRNA、微小RNA前体和pri-微小RNA、其他非编码RNA、核糖体RNA、其衍生物、其扩增子或其任意组合。作为非限制性实例，核酸的来源可选自包含以下的组：合成的、哺乳动物、人、动物、植物、真菌、细菌、病毒、古细菌来源或其任意组合。
术语“寡核苷酸”一般指一段DNA或含有DNA的核酸分子、或RNA或含有RNA的分子或其组合。寡核苷酸的实例包括核酸靶；底物，例如可被DNA核酶或具有切割、连接或其他酶活性的DNA核酶或MNA酶修饰的底物；引物，诸如用于通过诸如PCR的方法进行体外靶扩增的引物；和核酸复合体的组分，包括但不限于装配促进子和装配抑制子、激活子、活性抑制子和/或底物，在某些实施方案中，该组分可包含如本文定义的寡核苷酸。本文所用的部分酶也可包含寡核苷酸。
“置换子”或“置换寡核苷酸”是能与包含至少一个单链区域和至少一个双链区域的第一寡核苷酸内的单链区域通过至少一个其他寡核苷酸的互补而结合的寡核苷酸；其中置换寡核苷酸能引起其他寡核苷酸与第一寡核苷酸在至少一个双链区域内通过分支迁移的过程而解离。分支迁移过程中，其他寡核苷酸和第一寡核苷酸之间的互补区域被分开，并且被置换子寡核苷酸和第一寡核苷酸之间互补的至少一个区域所置换，因此导致其他寡核苷酸的置换。置换寡核苷酸需要包含与其他寡核苷酸在双链区内的一个或多个区域序列相同的至少一个区域。分支迁移的过程可导致新的双链区域在置换子寡核苷酸和第一寡核苷酸之间形成，并且伴随释放其他寡核苷酸，使其变成单链。
术语“多核苷酸”、“核酸”和“寡核苷酸”包括对任何特定序列以及与其互补的序列的引用，除非另外指明。寡核苷酸可包含至少一个添加或取代，包括但不限于包含以下的组：LNA亚磷酰胺、4-乙酰胞苷、5-(羧基羟基甲基)尿苷、2′-O-甲基胞苷、5-羧甲基氨甲基硫代尿苷、二氢尿苷、2′-O-甲基假尿苷、β-D-半乳糖Q核苷、2′-O-甲基鸟苷、肌苷、N6-异戊烯基腺苷、1-甲基腺苷、1-甲基假尿苷、1-甲基鸟苷、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鸟苷、2-甲基腺苷、2-甲基鸟苷、3-甲基胞苷、5-甲基胞苷、N6-甲基腺苷、7-甲基鸟苷、5-甲基氨甲基尿苷、5-甲氧基氨甲基-2-硫代尿苷、β-D-甘露糖苷甲基尿苷、5-甲氧基羧甲基尿苷、5-甲氧基尿苷、2-甲基硫代-N6-异戊烯基腺苷、N-((9-β-呋喃核糖基-2-甲基硫代嘌呤-6-基)氨甲酰基)苏氨酸、N-((9-β-呋喃核糖基嘌呤-6-基)N-甲基-氨甲酰基)苏氨酸、尿苷-5-氧乙酸甲酯、尿苷-5-氧乙酸(v)、wybutoxosine、假尿苷、Q核苷、2-硫代胞苷、5-甲基-2-硫代尿苷、2-硫代尿苷、4-硫代尿苷、5-甲基尿苷、N-((9-β-D-呋喃核糖基嘌呤-6-基)氨甲酰基)苏氨酸、2′-O-甲基-5-甲基尿苷、2′-O-甲基尿苷、怀丁苷、3-(3-氨基-3-羧丙基)尿苷、β-D-阿糖尿苷和β-D-阿糖胸苷。
当与本发明的核酸或核苷酸相关使用时，术语“衍生物”包括任何功能上等同的核酸或核苷酸，包括整体产生(例如通过重组方法)或合成后添加(例如通过化学方法)的任何融合分子。此类融合体可包含具有RNA或DNA添加到其上或与多肽(例如嘌呤霉素或其它多肽)、小分子(例如补骨脂素)或抗体轭合的本发明的寡核苷酸。
当与核酸或核苷酸相关使用时，术语“类似物”包括具有与DNA或RNA分子或残基相关并且能与DNA或RNA残基或其类似物形成氢键(即能与DNA或RNA残基或其类似物退火形成碱基对)的物理结构的化合物，但是此类成键不是所述化合物包含在术语“类似物”中所必需的。此类类似物可具有与和它们结构上相关的核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸残基不同的化学和生物特性。甲基化、碘化、溴化或生物素化的残基是类似物的实例。含有包括以下的核苷酸类似物的活性DNA核酶已有描述：脱氧肌苷、C-5-咪唑(immidazole)脱氧尿苷、3-(氨基丙炔基)-7-脱氮-dATP、2’-O-甲基RNA、2’O-甲基帽(Warashina等，1999；Cairns等，2003；Schubert等，2004；Sidorov等，2004)。其他类似物也能与DNA核酶和MNA酶的催化活性相容。具有催化活性的核酸的改变，例如通过一个碱基被另一个碱基取代、通过碱基被类似物取代，或糖组分或磷酸二酯骨架的改变，对熟练的技术人员而言是已知的。例如，改变可在合成过程中进行，或者在合成之后通过特定碱基的修饰来进行。加入诸如碱基改变或碱基类似物的改变的催化核酸的经验测试允许评估改变的序列或特定的类似物对催化活性的影响。碱基A、C、G、T和U的类似物在本领域为已知，亚型列于表1。
表1：本文有用的核苷酸类似物的实例
  缩写   名称
  ac4c   4-乙酰胞苷
  chm5u   5-(羧基羟基甲基)尿苷
  Cm   2′-O-甲基胞苷
  Cmnm5s2u   5-羧甲基氨甲基硫代尿苷
  D   二氢尿苷
  Fm   2′-O-甲基假尿苷
  Galq   β，D-半乳糖Q核苷
  Gm   2′-O-甲基鸟苷
  1   肌苷
  i6a   N6-异戊烯基腺苷
  缩写   名称
  m1a   1-甲基腺苷
  m1f   1-甲基假尿苷
  m1g   1-甲基鸟苷
  Ml1   1-甲基肌苷
  m22g   2，2-二甲基鸟苷
  m2a   2-甲基腺苷
  m2g   2-甲基鸟苷
  m3c   3-甲基胞苷
  m5c   5-甲基胞苷
  m6a   N6-甲基腺苷
  m7g   7-甲基鸟苷
  mam5u   5-甲基氨甲基尿苷
  mam5s2u   5-甲氧基氨甲基-2-硫代尿苷
  Manq   β，D-甘露糖苷甲基尿苷
  mcm5s2u   5-甲氧基羧甲基尿苷
  Mo5u   5-甲氧基尿苷
  Ms2i6a   2-甲基硫代-N6-异戊烯基腺苷
  Ms2t6a   N-((9-β-呋喃核糖基-2-甲基硫代嘌呤-6-基)氨甲酰基)苏氨酸
  Mt6a   N-((9-β-呋喃核糖基嘌呤-6-基)N-甲基-氨甲酰基)苏氨酸
  Mv   尿苷-5-氧乙酸甲酯
  o5u   尿苷-5-氧乙酸(v)
  缩写   名称
  Osyw   Wybutoxosine
  P   假尿苷
  Q   Q核苷
  s2c   2-硫代胞苷
  s2t   5-甲基-2-硫代尿苷
  s2u   2-硫代尿苷
  s4u   4-硫代尿苷
  T   5-甲基尿苷
  t6a   N-((9-β-D-呋喃核糖基嘌呤-6-基)氨甲酰基)苏氨酸
  Tm   2′-O-甲基-5-甲基尿苷
  Um   2′-O-甲基尿苷
  Yw   怀丁苷
  X   3-(3-氨基-3-羧丙基)尿苷，(acp3)u
  AraU   β-D-阿糖尿苷
  AraT   B-D-阿糖胸苷
术语“核酸酶”、“催化核酸”、“具有催化活性的核酸”和“催化核酸酶”在本文互换使用，并且将意指DNA或含有DNA的分子或复合体、或RNA或含有RNA的分子或复合体，或其组合，是DNA-RNA杂交分子或复合体，其能识别至少一个底物并催化至少一个底物的修饰(诸如连接或切割)。催化核酸中的核苷酸残基可包括碱基A、C、G、T和U，以及其衍生物和类似物。上述术语包括单分子核酸酶，其可包含单个DNA或含有DNA的分子(本领域也称为“DNA酶”、“脱氧核酶”或“DNA核酶”)、或RNA或含有RNA的分子(本领域也称为“RNA酶”、或“核酶”)，或其组合，是DNA-RNA杂交分子，其能识别至少一个底物并催化至少一个底物的修饰(诸如连接或切割)。上述术语包括核酸酶，其包含DNA或含有DNA的复合体、或RNA或含有RNA的复合体，或其组合，是DNA-RNA杂交复合体，其能识别至少一个底物并催化至少一个底物的修饰(诸如连接或切割)。术语“核酸酶”、“催化核酸”、“具有催化活性的核酸”和“催化核酸酶”包括在其有意义的MNA酶中。
如本文所用的术语“MNA酶”或“多组分核酸酶”指两种或多种寡核苷酸序列(例如部分酶)，其仅在MNA酶装配促进子(例如靶)存在的情况下形成能催化修饰底物的活性核酸酶。MNA酶能催化许多反应，包括底物的切割，底物的连接和一种底物或多种底物的其他酶修饰。包含部分酶A和部分酶B并具有切割活性的示例性MNA酶描述于图1。具有内切核酸酶或切割活性的MNA酶也称为“MNA酶切割子”。参考图1，部分酶A和B每个与装配促进子结合(例如通过Watson-Crick碱基配对)。当部分酶A和B的感应臂在装配促进子上彼此邻近杂交时，才能形成MNA酶。MNA酶的底物臂接合底物，底物的修饰(例如切割)由MNA酶的催化核心催化，通过部分酶A和B的催化结构域的相互作用形成MNA酶。DNA/RNA嵌合报告底物的切割示例于附图中。MNA酶在荧光团和猝灭剂染料对之间切割底物，因此产生信号。术语“多组分核酸酶”和“MNA酶”在本文可互换使用，并且包含主要由两个分子组成的二分结构，或主要由三个核酸分子组成的三分结构，或例如由四个或更多核酸分子形成的其他多分结构。术语“MNA酶复合体”指由具有其底物的至少一个的装配MNA酶形成的复合体。MNA酶或MNA酶复合体可包含适体，分别称为适体-MNA酶或适体-MNA酶复合体。
如本文所用的术语“MNA连接酶”指具有连接酶活性的MNA酶，其包含两个或多个寡核苷酸序列(例如部分酶)，这些序列只有在MNA酶装配促进子(本文也称为连接酶装配促进子或装配促进子(例如靶))存在的情况下形成能连接两个底物的活性核酸酶。具有连接酶活性的示例性MNA酶示例于图10。MNA连接酶连接两个底物。如本文所用的术语“MNA连接酶”包含主要由两个分子组成的二分结构，或主要由三个核酸分子组成的三分结构，或例如由四个或更多核酸分子形成的其他多分结构。
如本文所用的术语“连接”意指连接两个或多个分子。例如，“连接酶”是催化两个或多个底物分子之间键的形成(连接)以形成新分子的酶。术语“连接”或“连接酶活性”指连接两个或多个底物分子。
如本文所用，术语“部分酶”、“组分部分酶”、“部分酶组分”和“组分寡核苷酸”指含有DNA或含有RNA或含有DNA-RNA的寡核苷酸，其两个或多个只有在如本文定义的MNA酶装配促进子存在的情况下能一起形成“MNA酶”。在某些优选实施方案中，一种或多种组分部分酶和优选地至少两种部分酶可包含3个区域或结构域：形成催化修饰的催化核心的一部分的“催化”结构域；能缔合和/或结合装配促进子的“感应臂”结构域；和能缔合和/或与底物结合的“底物臂”结构域。这些区域或结构域的示图显示于图1和图10。部分酶可包含至少一个其他组分，包括但不限于适体，本文称为“适体-部分酶”。
主要由不只2个分子组成的MNA酶的实例图示于图2(ii)。部分酶可包含多个组分，包括但不限于，具有截短感应臂和通过与装配促进子(如图2(ii)所述)或与底物相互作用来稳定MNA酶结构的稳定臂组分的部分酶组分。
术语“核酸复合体”指催化上有活性或无活性的复合体，其包含选自包含但不限于以下组的两个或多个组分：DNA核酶、部分酶、装配促进子、底物、和其他MNA组分，包括稳定臂、活性抑制子、装配抑制子和其组分或部分。
如本文所用，术语“核酸复合体”包括多组分核酸复合体(MNA复合体)。另外，术语“核酸复合体”包括与至少一个底物复合的单分子核酸酶，例如与底物结合的具有切割活性的DNA核酶，或与其两个所需底物的至少一个结合的DNA核酶连接酶。术语“核酸酶复合体”指DNA核酶复合体或MNA酶复合体。术语“DNA核酶复合体”包括具有至少一个底物的DNA核酶，例如与底物结合的具有切割活性的DNA核酶，或与其两个所需底物的至少一个结合的DNA核酶连接酶。
术语“多组分核酸复合体”或“MNA复合体”指包含选择包含但不限于以下组的两个或多个组分的复合体：部分酶、装配促进子、底物、和的其他MNA组分，包括稳定臂、活性抑制子、装配抑制子和其组分或部分。在一些实施方案中，MNA复合体包含活性MNA酶。在其他实施方案中，MNA复合体是诸如MNAi复合体的无活性复合体，在本文也可称为多组分核酸抑制子(MNAi)复合体或MNAi复合体。在其他实施方案中，MNA复合体是无活性的MNA复合体，其可能缺少MNA酶的装配和/或催化所需的一个或多个组分，这些组分包括但不限于装配促进子、部分酶或其组分。在另一个实施方案中，MNA复合体包含在装配抑制子存在或不存在的情况下适体-MNA酶的组分。
如本文所用，引用“形成能作为核酸酶起作用的核酸复合体”指提供与底物复合的核酸酶的形成所需的组分，以便该酶能修饰底物。如本文所用的“允许作为核酸酶起作用的核酸复合体的形成”和“允许核酸复合体作为核酸酶起作用”指当组分允许与其底物复合的核酸酶的形成以便该酶能修饰底物时发生的过程。
如本文所用的术语“调控子”是能增强或减弱MNA复合体的催化活性的实体。调控子可以是激活或启动MNA酶活性的“激活子”。在一些实施方案中，调控子是能关闭或抑制MNA酶或MNA酶复合体的活性的“抑制子”，包括但不限于“装配抑制子”或“活性抑制子”。
如本文所用的术语“装配促进子分子”、“装配促进子”、“MNA酶装配促进子分子”、“促进子”和“MNA酶装配促进子”指能通过与MNA酶的感应臂相互作用来促进组分部分酶的自装配以便形成催化上有活性的MNA酶的实体。如本文所用，装配促进子能促进具有切割、连接酶或其他酶活性的MNA酶的装配。术语“连接酶装配促进子”指促进具有连接酶活性的MNA酶的装配的装配促进子。具有连接酶活性的MNA酶的装配促进子也可称为上述任何其他的术语。在优选实施方案中，装配促进子是MNA酶的自装配所需的。装配促进子可包含一个分子，或者可包含两个或多个可与一个或多个寡核苷酸“部分酶”的感应臂成对或结合的“装配促进子组分”。装配促进子部分可包含于其他组分内，例如包含于活性抑制子分子内，其中装配促进子以不能促进活性MNA酶的装配的状态存在，直至通过例如切割从组分释放。装配促进子可包含一个(例如图1，图2(ii))或多个分子(例如图2(i)，图4-6)。
装配促进子可以是靶。靶可以是选自由以下组成的组的核酸：DNA、甲基化DNA、烷基化DNA、RNA、甲基化RNA、微小RNA、siRNA、shRNA、tRNA、mRNA、snoRNA、stRNA、smRNA、微小RNA前提和pri-微小RNA、其他非编码RNA、核糖体RNA、其衍生物、扩增子或其任意组合。核酸可被扩增。扩增可包含以下的一种或多种：聚合酶链反应(PCR)、链置换扩增、环介导的等温扩增、滚环扩增、转录介导的扩增、自动维持序列扩增、连接酶链反应、基于核酸序列的扩增或反转录聚合酶链反应(RT-PCR)。
如本文所用的“激活子”是引起MNA酶的激活的任何MNA结构或调控寡核苷酸组分、任何“配基”、“靶”或“事件”。激活子寡核苷酸包括但不限于装配促进子或装配促进子组分；置换子寡核苷酸；部分酶或其组分，例如具有感应或底物臂的截短的组分，和部分酶稳定臂组分。
在其他实施方案中，激活子可通过去除执行抑制作用的寡核苷酸来激活MNA酶。能通过这种机制来激活的寡核苷酸的实例包括能置换(去除)抑制组分或其一部分(包括但不限于“活性抑制子”或“装配抑制子”)的调控子寡核苷酸。
如本文所用的术语“靶”包括寻求通过使用特定的核酸酶(诸如MNA酶)、带有或不带有额外的扩增步骤和/或级联的方法被检测、鉴定或定量的任何天然或合成的实体、成分或分析物。因此靶包括需要灵敏的检测、鉴定和/或定量方法的最广泛的可检测实体、成分或分析物。一些示例性的靶包括但不限于核酸、蛋白质、多肽、肽、糖蛋白、脂类、脂蛋白、完整的有机体、细胞、病毒、细菌、古细菌、酵母、真菌、抗体、代谢物、病原体、毒素、污染物、毒物、小分子、聚合体、金属离子、金属盐、朊病毒或其任何衍生物、部分或组合。其他靶也涵盖用于本文使用。应理解，靶也可以是装配促进子或激活子。
如本文所用，术语“可检测的事件”包括MNA酶或MNA酶复合体和/或无活性的MNA复合体(例如MNAi复合体或在装配抑制子存在的情况下包含适体-MNA酶的组分的复合体)的微环境的改变。改变可以是例如物理操作、温度的改变，pH、盐浓度、电荷、磁荷的改变、一种或多种分析物、阴离子、阳离子、螯合物浓度的改变，或MNA或调控子组分浓度的改变，或其任意组合。还应理解，引用“浓度的改变”包括浓度的增加或降低，并且也包括在MNA复合体的微环境中先前缺少或以不可检测浓度存在的实体(包括一个或多个MNA复合体的任何组分，例如装配促进子或装配促进子组分)的出现，包括一个或多个MNA复合体(包括MNA酶和适体-MNA酶、MNA酶复合体和适体-MNA酶复合体和/或无活性的MNA复合体)的一个或多个组分。
代表可检测事件的实体也可用作MNA酶的催化活性的“激活子”或“抑制子”，因为微环境的改变可用来操作MNA复合体的催化活性。因此，这些实体允许MNA酶的催化活性被“启动”或“关闭”，例如通过促进从无活性的MNA复合体向活性MNA酶的转换，反之亦然。在一些实施方案中，事件或实体促进MNA酶的装配和激活。在一些实施方案中，事件或实体促进MNA酶的解装配和失活。在其他实施方案中，事件或实体可指导无活性的MNA复合体的装配或解装配。在优选实施方案中，MNA酶催化活性的激活和失活的过程是可逆转的。
可选地，由于能促进MNA复合体组分的解装配或仅催化上有活性的MNA酶的形成所需的那些分子亚型的装配的微环境的组成，多组分核酸复合体可以是无活性的。在一些实施方案中，激活子装配促进子组分是在无活性的MNA复合体和/或MNA酶的微环境中发生的反应的产物。
“可检测效应”或“输出”信号是能被检测或定量作为底物修饰发生的指示的效应。效应的强度可指示诸如装配促进子(例如靶)的输入的量。可检测效应可通过多种方法来检测，包括荧光光谱术、表面等离阵子共振、质谱学、NMR、电子自旋共振、偏振荧光光谱术、圆二色性、免疫测定、层析、放射分析、光度测定法、闪烁照相术、电子方法、UV、可见光或红外光谱法、酶学方法或其任意组合。
“激活子”装配促进子或装配促进子部分是能用来控制活性MNA酶的装配或促进从无活性的多组分核酸复合体向活性MNA酶的转换的分子。所述多组分核酸复合体可以是由于活性抑制子的存在而催化上无活性的，诸如MNAi复合体。
术语“活性抑制子”指能与MNA复合体的一种或多种组分结合并指导催化上无活性的“MNAi”复合体(例如图4，图5(iii)，图13)的装配的任何实体。活性抑制子对催化活性的抑制是由基本上不与部分酶互补的“活性抑制子部分”(也称为“活性抑制子组分”或“活性抑制子结构域”)介导的。在优选实施方案中，活性抑制子可包含几个不同的功能结构域，例如包括但不限于选自活性抑制子结构域、装配促进子结构域、底物结构域和/或报告结构域的任意组合的功能结构域。此类不同的功能结构域可以或可以不与活性抑制子中的几种不同的结构结构域一致。相应地，在一些实施方案中，活性抑制子可包含基本上不与部分酶组分互补并且通过破坏形成催化上有活性的MNA酶所需的二级结构来执行抑制作用的活性抑制子结构域。活性抑制子的存在驱动能与底物相互作用但不能催化上修饰底物的无活性的MNAi复合体的装配。在一些实施方案中，活性抑制子可包含装配促进子结构域。
在一些实施方案中，活性抑制子可还包括可位于活性抑制子内两个或多个结构域(例如活性抑制子结构域和激活子装配促进子结构域)之间的不稳定或可切割的接头或底物。底物或接头位点处的切割可允许活性抑制子部分与激活子装配促进子部分分开，激活子装配促进子部分然后作为装配促进子组分起作用，并指导活性MNA酶的装配。
在一些实施方案中，诸如活性抑制子的MNA组分可与其他实体轭合。在一些实施方案中，组分(例如活性抑制子)可与和射频磁场偶联的金纳米颗粒轭合，以便允许杂交的远程电子控制。该方法中，射频磁场作为天线起作用，使特定寡核苷酸的可逆转热变性成为可能，同时保持周围分子相对不受影响。在一些实施方案中，组分(例如活性抑制子)可用生物素标记，以便促进组分的捕获和物理分离。
如本文所用，“装配抑制子”是通过互补地与活性MNA酶或MNA酶复合体的必需组分结合(例如通过与部分酶组分或装配促进子或底物结合)来抑制MNA酶或MNA酶复合体的装配的组分。装配抑制子序列与至少第一MNA酶或MNA酶复合体组分的结合导致装配抑制子和所述第一组分之间竞争结合第二MNA酶或MNA酶复合体组分。例如，装配抑制子能与部分酶底物臂(结合底物)或部分酶感应臂(结合装配促进子)结合。当装配抑制子与底物臂互补(并结合)时，装配抑制子竞争(并阻抑)底物与部分酶的结合(图7)，因此阻抑MNA酶复合体的形成。当装配抑制子与感应臂互补(并结合)时，装配抑制子竞争(并阻抑)装配促进子与部分酶的结合，因此阻抑活性MNA酶的形成。以这种方式，装配抑制子阻抑MNA酶和/或MNA酶复合体的装配。装配抑制子分子可用来控制MNA酶和MNA酶复合体的装配，并且进一步允许开发用于检测非核酸和核酸分析物的策略。
如本文所用的术语“底物”和“底物分子”包括能被包括核酸酶的酶识别、作用或修饰的任何分子。底物的修饰提供了监测MNA系统活性的“输出”信号。在特定的实施方案中，一个或多个底物可被酶识别和修饰。在其他实施方案中，一个或多个底物可被具有催化活性的核酸识别和修饰。在优选实施方案中，一个底物或多个底物可被MNA酶识别和修饰。一个底物或多个底物的修饰可通过修饰反应的产物的出现或增加、或通过反应中修饰的底物的消失或减少来测定。应理解，当在需要两个或多个底物的反应(诸如连接反应)的上下文中使用时，底物的引用可指两个或多个底物的至少一个。
一个底物或多个底物可被各种酶活性修饰，包括但不限于切割或连接。如本文所用，底物可包括易于酶切的“可切割的底物”，或易于酶连接的“可连接底物”或“连接酶底物”。
如本文所用的“报告底物”是特别适合用来促进底物的消失或与催化反应相关的产物的出现的测定的一个底物(或多个底物)。报告底物可游离于溶液中或与例如表面或与另一个分子结合(或粘连)。报告底物可被多种方法的任何一种标记，这些方法包括例如荧光团(具有或不具有一种或多种其他组分，诸如猝灭剂)、放射性标记、生物素(例如生物素化)或化学发光标记。
如本文所用，“同属底物”是例如报告底物的底物，该底物能被多种MNA酶识别和催化作用，每个MNA酶能识别不同的装配促进子。此类底物的应用促进了使用结构上相关的MNA酶(所有MNA酶识别通用的同属底物)检测、鉴定或定量许多装配促进子的单独测定的开发。这些同属底物的每个能被独立地用一种或多种标记所标记。在优选实施方案中，独立地可检测的标记被用来标记一个或多个同属底物，以便允许产生用于使用MNA酶独立地或同时检测多种装配促进子的方便的系统。在一些实施方案中，使用MNA酶或DNA核酶连接酶，MNA酶切割的底物能被重构，并且因此再循环。在一些实施方案中，MNA酶切割或连接的底物能被进一步用作其他MNA酶或DNA核酶的组分或调控子。
术语“产物”指由底物的酶修饰而产生的新分子。如本文所用，术语“切割产物”指酶的切割或内切核酸酶活性而产生的新分子。术语“连接产物”指酶连接底物而产生的新分子。
如本文所用的术语“MNAi”复合体指处于催化上无活性状态的MNA复合体，其中催化活性被如本文定义的“活性抑制子”抑制。在优选实施方案中，由于活性抑制子寡核苷酸的结合，MNAi复合体可以是催化上无活性的，如图4所示，图4显示了MNAi复合体的示例性设计。当部分酶A、部分酶B、装配促进子和活性抑制子缔合形成能结合底物但不能修饰底物的无活性的复合体时，能形成MNAi复合体。
如本文所用，“适体”可包含能识别一个或多个配基的结构。例如，由于适体更高水平的结构(诸如三维结合结构域或口袋)，识别可以具有高度的特异性。因此适体能结合蛋白质、多肽、肽或核酸、糖蛋白、脂类、脂蛋白、细胞、病毒、细菌、古细菌、真菌、抗体、代谢物、病原体、毒素、污染物、毒物、完整的有机体、小分子、聚合体、金属离子、金属盐、朊病毒或其任何衍生物、部分或组合、或任何其他实体。本文中优选的适体可包含短的单链DNA或RNA寡聚体，其可通过重复的吸附、恢复和再扩增过程从合成核酸的复合体库中分离。本文中其他优选的适体可包含能识别一种或多种配基的蛋白质、多肽、肽或phylomer或其组合。因此适体可针对几乎任何靶产生，范围从诸如氨基酸或抗生素的小分子到蛋白质和核酸结构。适体可用来将分子开关构建入含有装配抑制子的MNA复合体。激活子配基的存在能启动MNA酶的活性，去除激活子配基能关闭MNA酶的活性。进一步，适体能用来促进核酸和非核酸配基的检测。配基的检测能进一步用来触发扩增级联。
如本文所用，术语“级联”指以连续阶段发生的任何连续的过程或操作，其中每个阶段的发生一般取决于前面阶段的发生。如本文所用，级联可以是“线性级联”，其中阶段(或反应步骤)在一个方向发生，并且每个阶段(或步骤)的发生取决于前面的阶段或步骤的发生。如本文所用，术语“反馈级联”或“反馈扩增级联”指以连续阶段发生的任何连续的过程或操作，其中每个阶段的发生一般取决于前面阶段的发生，并且其中前面阶段的发生一般取决于随后阶段发生的过程或操作。在反馈级联中，任何前面阶段的产物能作为任何随后阶段的组分或底物，而任何随后阶段的产物能作为任何前面阶段的组分或底物。级联可涉及经由去除活性抑制子或其组分的影响的MNAi复合体的激活。
因此级联可包括但不限于酶促级联或任何其他信号转导级联。在一些实施方案中，级联可包含产生于MNA酶的催化活性的信号的扩增。在一些实施方案中，级联可包含产生于具有切割活性的MNA酶的催化活性的信号的扩增。在一些实施方案中，级联可包含产生于具有连接酶活性的MNA酶的催化活性的信号的扩增。在一些实施方案中，级联可包含产生于具有连接酶活性的DNA核酶或MNA酶和具有切割活性的DNA核酶和MNA酶的催化活性的信号的扩增。在优选实施方案中，此类扩增级联可涉及重复的因此周期性的信号扩增，其中第一核酸酶的催化活性产生第二核酸酶的底物修饰所需的分子，第二核酸酶可转而产生一个或多个其他核酸酶的底物修饰所需的分子。在一些实施方案中，产生的所需的分子可包括但不限于部分酶、例如DNA核酶的核酸酶、装配促进子、装配促进子组分、底物、稳定臂、其组分或部分或其组合。在一些实施方案中，级联可因此涉及累积效应的产生，因此通过产生可被检测的水平的信号而检测低丰度的靶。在其他实施方案中，可采用不只两个催化阶段。级联可以是线性的。在优选实施方案中，级联可以是指数的。在优选实施方案中，级联可以是反馈扩增级联。
以下缩写在本文和整个说明书中使用：
MNA：多组分核酸；
MNA复合体：多组分核酸复合体；MNA酶：多组分核酸酶；
MNAi：多组分核酸抑制子；
DNA核酶：脱氧核糖核酸酶；
PCR：聚合酶链反应；
RT-PCR：反转录酶聚合酶链反应；
LNA：闭锁核酸；
PNA：肽核酸；
An：分析物或靶；
F：荧光团；
Q：猝灭剂；
FAM或6-FAM：6-羧基荧光素
BHQ1：黑洞猝灭剂1
BHQ2：黑洞猝灭剂2
shRNA：短发夹RNA
siRNA：短干扰RNA
mRNA：信使RNA
tRNA：转移RNA
snoRNA：小核仁RNA
stRNA：小短暂RNA
smRNA：小调控RNA
微小RNA前体：前体微小RNA
pri-微小RNA：初级微小RNA
GTP：鸟苷5’-三磷酸
CTP：胞嘧啶5’-三磷酸
dATP：脱氧腺苷5’-三磷酸
ATP：腺苷5’-三磷酸
LP：连接产物
CP：切割产物
oligo：寡核苷酸
示例性实施方案的详述
首先应理解，本文提供的图和实例是为了例证，而不是为了限制本发明及其各种实施方案。
根据本发明，提供了利用多组分核酸(MNA)复合体的方法。MNA复合体可以是具有诸如连接酶或切割活性的修饰活性的活性酶(MNA酶)。进一步，本发明涉及也可包括一个或多个DNA核酶的级联。本发明还涉及使用这些级联用于诸如靶的装配促进子的鉴定、检测和定量的方法。
1.包括MNA酶和无活性MNA复合体的MNA复合体
多组分核酸酶(本文也称为“MNA酶”)和其抑制子详细描述于同时待待的2006年10月6日提交的美国申请序列号11/544,926和2007年4月5日提交的11/697,021和同时待决的国际申请PCT/AU2006/001473和PCT/AU2007/001517，其内容都通过引用并入本文。MNA酶能从两个或多个寡核苷酸组分(本文也称为部分酶)自装配。部分酶寡核苷酸在MNA酶装配促进子存在的情况下自装配形成MNA酶。因此MNA酶是催化上有活性的核酸酶。在一些实施方案中，MNA酶的存在能被检测，并且指示靶的存在，因为只有在靶存在的情况下才能形成MNA酶，其中靶包含装配促进子。基于上文概述的基本原理的多种测定提供于本文。包含能形成MNA酶的寡核苷酸的组合物和各种序列的MNA酶也提供于本文。在一些实施方案中，寡核苷酸组分、装配促进子、活性抑制子或底物的至少一个可包含能与激活子或靶结合的适体。
本发明描述了核酸酶和复合体的新方法和应用。本发明提供了能用来形成具有连接酶活性的MNA酶的寡核苷酸组分，其能用来以一步形式或核酸酶级联反应检测分析物。
具有连接酶活性或其他催化修饰活性的另外的MNA酶可用来通过产生能指导新的活性MNA酶或MNA酶复合体的形成或促进缺少催化活性的可选结构的装配的新组分来操作其他MNA酶的活性。
具有连接酶活性或其他催化活性的MNA酶能产生核酸酶或核酸酶复合体的新组分，诸如新的MNA酶或MNA酶复合体组分(例如装配促进子、部分酶、底物、稳定臂)或DNA核酶复合体组分(例如活性DNA核酶或DNA核酶底物)。
可选地，MNA酶可用来指导无活性的MNA复合体的形成，包括MNAi复合体。MNAi复合体包含在合适的条件下能装配成活性MNA酶、但是当与“活性抑制子”装配时导致催化上无活性的复合体的形成的寡核苷酸组分。此类无活性的MNA复合体在本文定义为“MNAi”复合体，此类无活性可产生于活性抑制子抑制作用的发挥。MNAi复合体能通过部分酶组分的底物臂与底物相互作用，但是不能催化地修饰底物。活性抑制子能加入其他实体以便通过物理方法促进去除，这些其他实体包括但不限于诸如附着核酸、纳米颗粒、微颗粒、蛋白质、抗体、RNA、DNA、核酸类似物、生物素基团、糖蛋白、脂蛋白、肽、核酸、闭锁核酸、肽-核酸嵌合体、射频部分或其任意组合的实体。MNAi复合体代表“关闭”状态，而转换成MNA酶代表“启动”状态。
本发明描述了MNA连接酶及其作为用于从活性MNA酶转变为无活性的MNAi复合体的机制的应用(图13)。MNA连接酶可用来连接活性抑制子组分与装配促进子组分，以便产生活性抑制子。当活性抑制子结合并替换活性MNA酶的装配促进子组分时，复合体转变成无活性的MNAi复合体。
其他MNA复合体可包含MNA酶的一些或所有组分，但是催化上没有活性，因为一些所需组分没有缔合而形成活性MNA酶或因为微环境与MNA酶的催化活性不相容。一旦出现特定的事件，催化活性可被激活，例如包括但不限于激活子组分(例如装配促进子)的存在、或包括但不限于温度、波长、压力、盐浓度、去污剂、阳离子或任何其他参数改变的参数改变。在一些实施方案中，一种核酸酶(诸如存在于微环境的MNA酶)的催化活性能产生用于新的核酸酶或核酸酶复合体的新的激活子，其可包括但不限于装配促进子或部分酶。
在优选实施方案中，MNA酶是基于一种或多种DNA核酶和/或核酶。DNA核酶和/或核酶已知能对至少一个底物进行催化修饰，其中该修饰可选自包含以下的组：核酸的切割、核酸的连接、核酸磷酸化、核酸加帽、氨基酸腺苷酰化、辅因子合成、RNA聚合、模板指导的聚合、RNA-蛋白轭合、羟醛反应、醇氧化、醛还原、嘌呤和嘧啶核苷酸的合成、烷基化、酰胺合成、尿素合成、肽键的形成、肽基-RNA的合成、酰基转移、氨酰化、碳酸酯水解、硫代磷酸烷基化、卟啉金属化、碳-碳键的形成、Pd纳米颗粒的形成、联苯异构化、酯键的形成、酰胺键的形成、DNA去糖基化、胸腺嘧啶二聚体的光逆转或氨基磷酸酯的切割。
MNA酶的更优选的部分酶组分是基于特定的DNA核酶结构。具有切割活性的MNA酶的目前优选的结构是基于切割的DNA核酶，包括10:23和8:17DNA核酶。具有连接酶活性的MNA酶的目前优选的结构是基于连接底物并产生2’5’键合的DNA核酶连接酶，诸如“7Z81”和“7Z48”和7Q10DNA核酶，以及连接底物并产生3’-5’键合的DNA核酶连接酶，诸如9DB1连接酶。在各种实施方案中，MNA酶和无活性的MNA复合体包含核糖核苷酸碱基和脱氧核糖核苷酸碱基两者之一或两者。在更优选的实施方案中，MNA酶和无活性的MNA复合体至少部分基于DNA核酶的结构。在其他优选的实施方案中，MNA酶和无活性的MNA复合体包含至少一些脱氧核糖核苷酸碱基或其类似物。在更优选的实施方案中，装配到MNA酶的部分酶的催化核心部分包含一个或多个脱氧核糖核苷酸碱基或其类似物。在更优选的实施方案中，一个或多个脱氧核糖核苷酸碱基或其类似物参与MNA酶对底物的催化。在其他实施方案中，催化核心内的至少一个脱氧核糖核苷酸碱基或其类似物改进了MNA酶的催化活性。在其他实施方案中，在MNA酶的催化核心内严格需要至少一个脱氧核糖核苷酸碱基或其类似物，以使催化以相对于没有脱氧核糖核苷酸碱基存在的可比较的MNA酶的速率可测定的速率发生。
本发明公开了能从两个或多个寡核苷酸组分(本文也称为部分酶)自装配的MNA连接酶。部分酶寡核苷酸在至少一个MNA连接酶装配促进子存在的情况下自装配以便形成MNA连接酶。MNA连接酶因此是催化上有活性的核酸连接酶。
包含第一部分酶和第二部分酶的具有连接酶活性的示例性MNA酶描述于图10。参考图10，第一部分酶和第二部分酶每个与装配促进子结合(例如通过Watson-Crick碱基配对)。只有当第一部分酶和第二部分酶的感应臂(i)在装配促进子上彼此邻近地杂交时，才能形成MNA连接酶。MNA酶的底物臂(iii)接合底物，底物的修饰(连接)是由MNA连接酶的催化核心催化，所述催化核心通过第一部分酶和第二部分酶的催化结构域(ii)的相互作用而形成的。两个核酸底物的连接示例于附图中。
在一些实施方案中，具有连接酶活性的MNA酶的存在可被检测，并且指示靶的存在，因为只有在靶存在的情况下才能形成MNA连接酶，其中靶包含装配促进子。基于上文概述的基本原理的多种测定提供于本文。包含能形成MNA连接酶的寡核苷酸的组合物和各种序列的MNA连接酶也提供于本文。
例如，MNA连接酶的结构是基于一种或多种DNA核酶连接酶。更优选的是那些基于特定DNA核酶连接酶结构的MNA连接酶结构。目前优选的结构是基于包括7Q10、7Z81、7Z48和9DB1DNA核酶连接酶的DNA核酶连接酶。
诸如靶核酸的装配促进子可使用具有连接酶活性的MNA酶来检测。在一个方案中，靶核酸的供给是导致具有连接酶活性的MNA酶形成的起始步骤。参考图12，起始靶核酸将是装配促进子B，而装配促进子A将是包含的用来驱动MNA酶A的装配的合成分子。然后MNA酶A将具有单一的在反应中产生具有2’3’环状磷酸末端的5’可连接底物B的目的，然后该底物被加入到使用具有连接酶活性的MNA酶B来检测靶装配促进子B的反应中。该方法能提供用于产生具有特定末端(诸如2’3’环状磷酸)的底物的实用方法，这些底物合成费用高，并且相对不稳定。进一步，参考图12，MNA酶A部分酶和装配促进子A能被具有切割活性的DNA核酶替换，这些具有切割活性的DNA核酶存在于单独的预备反应中用于可连接底物的产生，或者DNA核酶可存在于与具有连接酶活性的MNA酶相同的反应混合物中。实施例11说明使用MNA酶和DNA核酶的组合的切割和连接能在单个反应混合物中进行。
如本文提供，MNA酶和无活性的MNA复合体可含有本领域技术人员熟知的一种或多种取代，诸如类似物、衍生物、修饰或改变的碱基、核糖核苷酸、糖或磷酸骨架的改变、各种缺失、插入、取代、重复或其他修饰或这些的任意组合。此类修饰、取代、缺失、插入等可在感应和/或底物臂和/或催化核心部分发生，以便该分子保持催化活性。结合底物或装配促进子的臂的取代和修饰可以是很好耐受的，并且事实上是允许分子改造成不同底物/装配促进子的基础。例如，感应臂的修饰将允许改造成不同的装配促进子，而底物臂的修饰将允许改造成不同的底物。多种底物(例如同属底物)的分析允许同时监测多种“可检测的效应”或“输出”信号，作为响应于输入事件或实体(例如，装配促进子的提供)而存在多种活性MNA酶的装配的指示，然后这些MNA酶能修饰多种底物。
在某些优选实施方案中，本发明想到具有催化活性的MNA酶，这些MNA酶包含脱氧核糖核苷酸，或通过某种修饰/取代等衍生自此类分子。作为一般原则，用例如核糖核苷酸对整个分子的替换将使分子没有活性，因为其活性取决于某些关键的脱氧核糖核苷酸。以对应的模式，核酶中的一些核糖核苷酸可用脱氧核糖核苷酸取代，但用例如脱氧核糖核苷酸对整个分子的替换将使该分子没有活性。
熟练的技术人员将理解，具有切割、连接或其他酶活性的MNA酶和无活性的MNA复合体包含脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或甚至两者。包含至少一个并且更优选地所有脱氧核糖核苷酸组分寡核苷酸的那些MNA酶和无活性的MNA复合物是目前优选的。还优选的是那些在部分酶的部分催化核心的至少一个内包含至少一个脱氧核糖核苷酸碱基或其类似物的MNA酶和无活性MNA复合体。甚至更优选的是那些其中此类碱基是具有切割、连接酶或其他酶活性的MNA酶的催化活性所需的实施方案。
在某些实施方案中，MNA复合体的至少一个组分可包含可在某些条件下形成发夹结构的自身互补区域。在一个实施方案中，自身互补区域可位于一个或两个部分酶的感应臂内。在另一个实施方案中，自身互补区域可位于一个或两个部分酶的底物臂内。在另一个实施方案中，一个或多个自身互补区域可存在于装配促进子、装配抑制子、或活性抑制子组分、或其任意组合内。在其他实施方案中，MNA复合体能结合可含有自身互补区域的底物。
在任一个前述方面中，至少一个底物的催化修饰选自由以下组成的组：核酸的切割、核酸的连接、核酸磷酸化、核酸加帽、氨基酸腺苷酰化、辅因子合成、RNA聚合、模板指导的聚合、RNA-蛋白轭合、羟醛反应、醇氧化、醛还原、嘌呤和嘧啶核苷酸的合成、烷基化、酰胺合成、尿素合成、肽键的形成、肽基-RNA的合成、酰基转移、氨酰化、碳酸酯水解、硫代磷酸烷基化、卟啉金属化、碳-碳键的形成、Pd纳米颗粒的形成、联苯异构化、酯键的形成、酰胺键的形成、DNA去糖基化、胸腺嘧啶二聚体的光逆转和氨基磷酸酯的切割。
熟练的技术人员还将理解，包含DNA的MNA酶具有优于单分子或多分体核酶的优势，例如在稳定性和易于使用方面。还应理解，在一些实施方案中，MNA酶提供了优于只能识别作为靶和底物两者起作用的一个分子的单分子核酸酶(例如DNA核酶)的优势。进一步，例如切割的催化修饰能破坏DNA核酶的靶/底物，因此靶不能用于另一轮的识别。相反单个MNA酶(例如具有切割活性的MNA酶)能识别至少两个分子，即至少一个装配促进子和至少一个底物。因此装配促进子(例如存在于样品中的靶核酸)在反应中不能被催化地修饰，并且保持可用于另外一轮的MNA酶对底物的修饰。进一步，能作用于两个底物的单个MNA酶(例如具有连接酶活性的MNA酶)能识别至少三个分子，即至少一个装配促进子和至少两个底物。MNA酶的这些特性使它们适用于要求组分能“读”“输入”信号(例如检测装配促进子的存在)和“写”“输出”信号(例如产生指示底物的酶修饰的可检测的信号)、或者产生能用作新的输入信号的新产物(例如新的装配促进子或组分)的系统或过程。此类过程包括级联反应、逻辑门(logic gate)和其他过程。MNA酶因此能提供用于信息转导的机制，例如以便接收输入信号并响应为适当的输出应答。
2.用于调控MNA复合体的装配和解装配的方法及其用途的应用。
MNA酶的装配和解装配可通过改变微环境来控制。此类改变的实例包括但不限于温度、二价阳离子类型和浓度、盐浓度、pH、添加剂和装配必需的关键组分是否存在和/或活性MNA酶的活性。
催化上有活性的MNA酶的装配能以依赖于温度的方式被调控。在一个实施方案中，催化上有活性的MNA酶的装配能以依赖于pH的方式被调控。在一个实施方案中，催化上有活性的MNA酶的装配能以依赖于是否存在二价阳离子或螯合剂的模式被调控。在一个实施方案中，催化上有活性的MNA酶的装配能以依赖于盐的方式被调控。在一个实施方案中，催化上有活性的MNA酶的装配能以依赖于离子浓度的方式被调控。
装配的MNA酶代表“启动”状态，而解装配的MNA复合体组分代表“关闭”状态。MNA复合体的装配和解装配能被温度控制。将温度转变为在与MNA酶或MNA酶复合体的装配和催化活性相容的范围内的温度能诱导“启动”状态。相反，将温度转变为超出与MNA酶或MNA酶复合体的装配和/或催化活性相容的范围的温度能诱导“关闭”状态。MNA复合体组分的解链温度能被调整，以便只允许在限制温度范围内装配。特别用于本发明这一方面的寡核苷酸包括但不限于稳定臂组分、具有截短的感应臂的部分酶组分和装配促进子组分和/或调控子寡核苷酸。MNA复合体提供极大的灵活性，其中基本设计的组分(图1)被进一步分成更小的组分亚基或部分(图2)，其序列能根据解链温度、序列组成和具有或缺少与其他组分寡核苷酸的互补性来调整。参考图2，本领域的技术人员应理解，截短的部分酶臂可以是以下的任一种：部分酶A感应臂、部分酶B感应臂、部分酶A底物臂、部分酶B底物臂或其任意组合。
参考图6，显示了活性MNA酶复合体的其他示例性设计。具有如图6示例的结构的MNA酶复合体也能用来以不同于切割的方式来修饰底物，例如MNA酶结构也能连接底物。
MNA酶对温度的敏感性能被开发用来构建热感应器和变阻器。如果组分寡核苷酸装配(杂交)和/或催化活性的温度过高或过低，那么MNA酶底物将不被修饰(例如切割或连接)。如果温度容许MNA酶的活性，那么底物将被修饰，并且信号将被产生。从与MNA酶活性不相容的温度变为与MNA酶活性相容的温度的温度升高或降低将通过MNA酶修饰底物之后产生的信号检测。MNA酶因此能提供能检测温度改变的装置。本领域的技术人员将理解，本发明中使用MNA酶用于温度感应的简单装置可应用在许多产业，包括例如制药、食品和农业产业。
在其他实施方案中，磁力能调控阳离子的浓度，并且因此提供了用于调控MNA活性启动和关闭的开关。带正电荷的阳离子是一些MNA酶的催化活性所需的。通过物理地分离带负电的MNA寡核苷酸(例如部分酶、装配促进子和底物或其组分)与带正电的阳离子(例如Mg2+)，磁力能可选地使MNA酶的活性关闭。然后，通过允许MNA寡核苷酸和阳离子变回接触状态，MNA酶的活性能被转变回启动状态。
在一些实施方案中，使用在与活性相容范围内的pH能诱导有活性的“启动”状态(MNA酶)。相反，使用超出与活性相容的范围的pH能诱导“关闭”状态。通过诱导不稳定序列的水解，pH可进一步用来控制MNA复合体的活性，因此产生或破坏MNA酶的新组分和/或无活性的MNA复合体。
MNA复合体的任何组分的存在或不存在能提供“启动”或“关闭”开关。改变例如寡核苷酸序列、解链温度和/或浓度能获得更精细的调控。能装配为MNA复合体的组分(例如两部分装配促进子和/或两部分部分酶组分(例如具有截短的感应结构域和稳定臂))设计的广范围将灵活性引入系统，这允许调整(精细调控)与杂交以及由此MNA复合体装配相容的条件。进一步，MNA复合体内特定寡核苷酸结合的杂交强度和严格性受许多因子的影响，这些因子包括但不限于盐浓度、阳离子浓度、温度和添加剂(例如DMSO)的存在或不存在。因此，影响杂交的实体能提供控制MNA酶和/或无活性MNA复合体的装配和解装配的工具。
组分的物理操作能例如通过开发附着部分作为分子“钩”的物理特性和/或通过开发寡核苷酸的内在特性(例如负电荷或序列互补性)来获得。在另一个实施方案中，附着部分允许寡核苷酸被选择地捕获，例如使用生物素基团。在另一个实施方案中，该部分含有射频磁场辐射，以便促进杂交的远程电子控制。该方法能设计用来通过MNA复合体内特定寡核苷酸的靶向热变性而允许选择地去除组分分子，因此允许酶活性的激活或抑制，取决于组分分子本身是激活子还是抑制子序列。例如，MNAi复合体中的活性抑制子能被选择性地变性，允许转换为活性MNA酶状态。
其他策略能用来去除激活子或抑制子分子的影响，因此促进活性MNA酶和无活性的MNA复合体(诸如MNAi复合体)的装配或解装配。例如，在单链末端两个寡核苷酸之间的杂交能造成DNA分支迁移和双链核酸区域的解链。通过分支迁移使核酸的双链区域解链的过程也能在不位于核酸双链体末端的单链区域起始。例如分支迁移可在位于两个双链区域之间的单链区域起始。在一个实施方案中，通过分支迁移起作用的诸如置换子寡核苷酸的调控子寡核苷酸，活性抑制子能从MNAi复合体去除。在另一个实施方案中，通过分支迁移起作用的诸如置换子寡核苷酸的调控子寡核苷酸，连接酶底物能从具有连接酶活性的MNA复合体去除。
在其他实施方案中，互补寡核苷酸能用来超越，因此“关闭”或关掉寡核苷酸组分，这些组分本身可包含活性MNA酶或MNA酶复合体或无活性的MNA复合体。该方法抑制的组分可包含MNA酶或无活性的MNA复合体的激活子或抑制子组分。
代替的示例性策略设计用来使用具有连接酶活性的第二MNA酶(或具有连接酶活性的DNA核酶)来促进MNA复合体在活性MNA酶的“启动状态”向MNAi复合体的“关闭状态”之间转变。参考图13，在装配促进子组分1(AFC 1)和装配促进子组分2(AFC 2)存在的条件下，能形成能修饰(例如切割或连接)底物A的活性MNA酶A。在装配促进子组分3(AF3)存在的情况下，能形成具有连接酶活性的第二MNA酶B，该MNA酶B然后能连接AFC 2和活性抑制子组分(AIC)，引起活性抑制子(AI)的形成。该AI能与MNA酶A的部分酶组分结合，导致无活性的MNAi A复合体的形成。因此，本实施例中的MNA连接酶能作为关闭开关操作来失活MNA酶A。可选地，DNA核酶连接酶能替换MNA酶B(MNA连接酶)，并且能作为关闭开关操作来失活MNA酶A。无活性的MNAi复合体和催化上有活性的MNA酶将代表装配组分的两个交替状态，即分别为“关闭”状态和“启动”状态。熟练的技术人员将认识到，本文提供的各种方法一般能被用来在单个反应或测定中调控单个MNA复合体或多个MNA复合体的装配或活性。
3.组合物作为分子开关的应用
本领域技术人员将认识到并理解，本发明可等同于生物“开关”，其应用涵盖于本文。启动和关闭MNA酶活性的机制的示例性实例列于下表2。
表2.活性和无活性MNA状态和在两种状态之间转变的机制
这样，多组分核酸复合体的任何组分的存在或不存在能提供“激活子”或“启动”开关，或者能提供抑制子或“关闭”开关。
在一些实施方案中，稳定臂的存在或增加能提供“启动”开关。在一个实施方案中，例如通过底物的切割，反应过程中可包含例如另一个MNA复合体组分的系统中能产生新的稳定臂。在其他实施方案中，稳定臂的缺少、修饰或去除能提供“关闭”开关。
在一些实施方案中，装配促进子或其组分的存在能提供“启动”开关。在一些实施方案中，通过MNA复合体组分的MNA酶的切割能产生新的装配促进子，例如通过底物的切割，包括但不限于在被切割修饰之前能作为另一个MNA复合体组分(诸如活性抑制子)的那些底物。在一些实施方案中，装配促进子能提供特定的在序列内编码的“输入”信号系统。在一些实施方案中，装配促进子能被识别或“读出”。在一些实施方案中，部分酶感应臂能“读出”装配促进子序列，包括一个或多个单碱基不同的那些序列。在其他实施方案中，装配促进子或其组分的缺少或去除能提供“关闭”开关。
在一些实施方案中，MNA复合体的组分可通过反应环境中存在的组分的连接而产生。在一些实施方案中，部分酶是通过寡核苷酸的连接产生的，因此产生能缔合以便形成例如活性MNA酶的新的部分酶组分。在一些实施方案中，装配促进子是通过寡核苷酸的连接产生的，因此产生能促进MNA复合体装配的新的装配促进子组分。在一些实施方案中，底物或其他核酸酶或其组分可通过组分的连接产生。
活性和失活状态之间的转换能提供用于产生分子开关的机制，所述开关能通过活性和无活性构象的交替而被调控。此类分子开关可例如应用于控制核酸复制级联，或自主治疗、诊断和计算分子装置的调控。
本发明提供了包含用于自装配MNAi复合体的组分(在一个或多个MNA酶装配促进子分子存在的情况下自装配)和一个或多个装配抑制子分子的组合物，以便形成催化上无活性的MNAi复合体。
通过参考附图可更好地理解本发明的各方面。图1描述了使用装配促进子来装配MNA酶的基本方法的实例。更具体地，部分酶A和部分酶B显示于图1，每个部分酶包含(i)感应臂部分，(ii)底物臂部分，和(iii)催化核心部分。在装配促进子存在的情况下，部分酶A和部分酶B的感应臂部分能与装配促进子的互补部分(例如DNA或RNA靶序列)杂交和碱基配对。一旦以这种方式接触装配促进子，MNA酶自装配形成能修饰被底物臂结合的底物的催化核心。优选地，MNA酶的存在通过其催化活性的检测或测定来检测。装配的MNA酶的底物臂能通过底物臂和底物上互补序列的相互作用来接合底物(例如显示于图1的报告底物)。一旦底物这样与底物臂接合，催化核心能促进底物的修饰(例如切割)，由此底物可被直接或间接测定或检测。使用各种方法，MNA酶能被可选地装配(启动)和解装配(关闭)。
部分酶感应臂、部分酶底物臂、装配促进子和底物的一个或多个可包含至少两个分子。在一个实施方案中，包括例如部分酶感应臂、部分酶底物臂、装配促进子、活性抑制子和底物的MNA复合体的一个或多个组分可还包含至少一个适体。
装配促进子可包含合成的寡核苷酸，这些寡核苷酸被加到混合物中以便驱动MNA复合物的装配。
参考图2，显示了活性MNA复合体的其他示例性设计。一种MNA酶复合体的示例性结构描述于图(i)，其中需要多个装配促进子组分用于MNA酶的形成。该设计中，装配促进子的一个组分(F1)与部分酶A和B的感应臂区域互补，然而第二装配促进子组分(F2)仅与部分酶B(按照图2(i))或仅与部分酶A互补。两个装配促进子组分一起指导能修饰(例如切割)底物的活性MNA酶的装配。图(ii)描述了MNA酶复合体的示例性设计，其中在装配促进子存在的情况下部分酶A与二分部分酶B组分的装配产生能修饰(例如切割)底物的活性MNA酶。该设计中，部分酶B具有在缺少第二组分(在本文称为稳定臂组分(S))的情况下不足以允许稳定的MNA酶的装配的截短的感应臂(T)。然而，当稳定臂组分与装配促进子在邻近部分酶的截短感应臂结合的位置杂交时，这允许装配成活性的MNA酶。
在装配促进子存在的情况下，通过部分酶A、部分酶B组分与截短感应臂和稳定臂组分的装配形成的活性MNA酶代表“启动”状态。部分酶、部分酶稳定臂组分或装配促进子组分的删除、去除或修饰可导致催化上有活性的“关闭”状态。因此，MNA酶的催化活性可通过各种寡核苷酸的存在或不存在和/或通过此类寡核苷酸组分功能上有活性(例如能与其他寡核苷酸组分杂交形成稳定的MNA复合体)的能力而被调控。截短臂设计为在反应条件下不足以允许稳定的MNA酶的装配，除非伴随有稳定臂组分。部分酶、稳定臂组分和装配促进子因此能作为MNA酶活性的“启动”开关起作用。
图3示例的反应代表MNA复合体的两个可选状态。活性MNA酶(反应(i))代表“启动”状态。其中部分酶稳定臂组分(反应(ii))或装配促进子组分(反应(iii))被删去的那些反应是代表“关闭”状态的无活性的MNA复合体。因此，MNA酶的催化活性能由是否存在各种寡核苷酸和/或由此类寡核苷酸组分功能上有活性(例如能与其他寡核苷酸组分杂交形成稳定的MNA复合体)的能力来调控。截短臂设计为在反应条件下不足以允许稳定的MNA酶的装配，除非伴随有稳定臂组分。稳定臂和装配促进子能作为MNA酶活性的“启动”开关起作用。
本领域的技术人员应理解，截短的部分酶臂可以是以下的任一个：部分酶A感应臂、部分酶B感应臂(如图2(ii)和图3(i)所示)、部分酶A底物臂、或部分酶B底物或其任意组合。
本领域的技术人员将认识到，MNA酶能用在用于产生分子感应器、分子开关和/或调控子或自动催化自我复制级联和其他重复过程的增殖子的策略中。应用领域包括但不限于医学、兽医、农业、食品技术、成像和反生物恐怖主义应用。
参考图4，当部分酶A和B与装配促进子和活性抑制子复合时，形成MNAi复合体(左侧)。无活性的MNAi复合体能与底物相互作用，但不能催化地修饰底物。在一些实施方案中，活性抑制子可还包括可分开活性抑制子内两个或多个结构域的不稳定或可切割的接头。此类结构域可包括例如，(i)基本上不与部分酶组分互补并通过破坏形成催化上有活性的MNA酶所需的二级结构来执行抑制作用的抑制子部分和(ii)如果与抑制子部分分离可作为其他装配促进子组分起作用并指导活性MNA酶的装配的激活子部分。
参考图4，在活性抑制子修饰之后，活性MNA酶复合体(右侧)可源自MNAi复合体的组分，所述修饰例如切割或两分分子并分离(i)活性抑制子部分和(ii)激活子装配促进子部分。然后释放的激活子装配促进子部分能作为第二装配促进子组分起作用，这与第一装配促进子组分一致，能指导部分酶组分A和B装配成能催化修饰底物的活性MNA酶。
相反，通过连接或相连活性抑制子部分(i)与激活子装配促进子部分(ii)因此产生活性抑制子，活性MNA酶复合体(图4的右侧)能被转变为无活性的MNAi复合体(图4的左侧)。
无活性的MNAi复合体和催化上有活性的MNA酶代表装配组分的两个交替状态，即分别为“关闭”状态和“启动”状态。
参考图13，描述了使用具有连接酶活性的第二MNA酶，将MNA复合体从活性MNA酶的“启动状态”转变为MNAi复合体的“关闭状态”的示例性策略。在装配促进子组分1(AFC 1)和装配促进子组分2(AFC 2)存在的情况下，能形成能修饰(例如切割或连接)底物A的活性MNA酶A。在装配促进子3(AF3)存在的情况下，能形成具有连接酶活性的第二MNA酶B，然后该MNA酶B能连接AFC 2与活性抑制子组分(AIC)，导致活性抑制子(AI)的形成。该AI能与MNA酶A的部分酶组分结合，导致无活性的MNAi A复合体的形成。因此，本实施例中的MNA连接酶能作为关闭开关起作用以便失活MNA酶A。无活性的MNAi复合体和催化上有活性的MNA酶代表装配组分的两个交替状态，即分别为“关闭”状态和“启动”状态。
4.使用不可溶和固相支持物的方法
还应理解，一般而言，无论是否是多重的，方法适用于溶液或与不可溶支持物或固相支持物组合，任何MNA复合体组分的一个或多个(包括底物或其部分)可附着于支持物上。进一步，存在于MNA酶级联的其他酶或其组分(包括具有例如切割和/或连接酶活性的DNA核酶)可附着到不可溶支持物或固相支持物上。相应地，DNA核酶、部分酶组分、底物、装配抑制子、装配促进子或装配促进子组分、稳定臂和/或抑制子(诸如活性抑制子或装配抑制子)的至少一个可被结合、附着或粘连。进一步，部分酶组分、一个或多个底物、装配抑制子、装配促进子或装配促进子组分、稳定臂和/或抑制子(诸如活性抑制子或装配抑制子)的至少一个的一部分可被结合、附着或粘连。
本发明的实施方案包含不可溶的支持物。作为实例，不可溶支持物可以是以“芯片”(还称为阵列或微阵列)的形式，其一般包含多种偶联、粘连或附着到芯片上的寡核苷酸。在特定实施方案中，寡核苷酸包含核酸。
在特定实施方案中，多种寡核苷酸可包含MNA复合体的多个组分或其部分，其包括但不限于底物、和/或部分酶、和/或装配促进子、和/或装配抑制子和/或活性抑制子和/或其任意组合。在特定实施方案中，多种寡核苷酸可包含与结构域互补的多种寡核苷酸，所述结构域包含在包含MNA复合体的多个组分或其部分的任一组分内和/或附着于其上。在特定实施方案中，MNA复合体的多个组分或其部分可包含具有不只一个功能结构域的寡核苷酸，其可包含底物、和/或部分酶、和/或装配促进子、和/或装配抑制子和/或活性抑制子和/或其任意组合。
通过本领域已知的任何合适的方法(例如通过移液管、喷墨打印、接触打印或光刻法)，多种寡核苷酸可置于固相支持物(例如芯片、珠、盘或阵列)上。固相支持物可包含至少一个元件，每个元件包含至少一个核酸寡核苷酸。该至少一个元件可包含多种相同序列的寡核苷酸。包含固相支持物的元件的数目可以是任意数字，并且其中多个元件被置于固相支持物上，元件可以相同或可变的距离或其组合彼此间隔。在一些实施方案中，元件可被随机放置，然后确定每个元件的各自位置。元件的大小和形状将取决于本发明的特定应用，不同大小和形状的元件可组合到单个固相支持物上。固相支持物的表面可以是基本上平的，或者可具有诸如凹坑或突出的特征，并且该元件可置于凹坑内或突出上。此类凹坑可提供元件浸入其中的溶液库，或者此类突出可促进元件的干燥。例如，元件可被置于96孔板的每个孔内。在一些实施方案中，固相支持物可包括独特的标识，诸如标注、射频标签、诸如微处理器的整合装置、条码或其他标记，以便鉴定每个元件。独特的标识可另外地或可选地在阵列表面包含凹坑或突出。此外，独特的标识能提供芯片正确的定向或鉴定。独特的标识可通过数据捕获装置或通过光学扫描器或检测器而被读出。
5.底物系统
根据本发明还提供了同属报告底物系统，其通过允许容易的设计改变以便产生识别不同装配促进子的新的MNA酶和无活性的MNA复合体，允许迅速的系统开发。如本文讨论，部分酶的底物臂部分和催化核心部分可保持不改变，而是只改变新的装配促进子所需的一种或多种部分酶的感应臂部分。提供了同属底物序列，因此相同的底物能被加入系统用于各种多样的应用。进一步，相同的底物能被加入本文各种实施方案的方法中，包括其中底物游离于溶液或被粘连或附着到支持物的测定。一系列同属底物可被用在多重反应中，允许多个装配促进子的同时检测。
在一些情况中，具有内切酶或切割活性的MNA酶或DNA核酶切割的底物可使用DNA核酶连接酶或MNA连接酶被重构并且因此再循环。如果DNA核酶或MNA酶切割子能切割DNA或MNA连接酶连接而产生的连接，那么具有连接酶活性的DNA核酶或MNA酶连接的底物可被再循环作为具有切割活性的DNA核酶或MNA酶的底物。可选地，具有切割活性的MNA酶可在不在两个可连接底物连接处的连接产物内的位点切割，条件是该位点满足切割位点的要求。
如下文更详细地描述，在某些实施方案中，MNA复合体具有能利用通用或同属底物的优势特性。此类底物以目前优选的构型显示于图1，其中具有切割活性的MNA酶的底物包含可检测部分和猝灭剂部分。猝灭剂部分适合减弱或消除来自底物的可检测部分的可检测的信号，直至底物被MNA酶切割。例如，猝灭剂部分可包含“黑洞猝灭剂1”(BHQ1)或“黑洞猝灭剂2”(BHQ2)。
因此，MNA酶在可检测部分和猝灭剂部分之间切割底物，允许两部分在溶液中分开，因此允许随着猝灭剂部分远离或有效地从可检测部分的局部环境去除，可检测信号出现或增强。
进一步，如图10所示，具有连接酶活性的MNA酶的底物能设计为使一个底物包含可检测部分并且一个底物包含猝灭剂部分。当底物连接到连接产物内因此使可检测和猝灭剂部分接近时，猝灭剂部分适合用来减弱或消除来自可检测部分的可检测信号。例如，猝灭剂部分可包含“黑洞猝灭剂1”(BHQ1)或“黑洞猝灭剂2”(BHQ2)。进一步，具有连接酶活性的MNA酶或具有连接酶活性的DNA核酶能连接底物，使一个底物的可检测部分与第二底物的猝灭剂部分邻近，因此允许可检测信号的减弱。
在另一个实施例中，如果5’连接底物和3’连接底物每个分别用荧光团或猝灭剂染料标记(或反之亦然)，那么连接将导致荧光的减弱，这能作为靶分析物存在的指示。
在可选的形式中，如果5’连接底物例如用可检测部分(例如荧光团)标记，而3’连接底物被附着到分离的位置(例如诸如芯片或珠的固相支持物上)，那么在靶分析物存在的情况下，连接将导致信号在分离位置出现。
通过MNA酶的组分部分酶的设计，能使用同属或通用底物。通过只改变部分酶的感应臂，而保持底物臂不改变，多个装配促进子的每个特异的多种MNA酶或无活性的MNA复合体可被设计，其全部利用通用的同属底物以便产生输出信号。熟练的技术人员将理解这在消除需要定做或独特底物以便响应于每个输入事件或实体方面提供了优势。每个新的装配促进子的检测只要求一个或多个感应臂部分的一种或多种改变；而底物臂部分和催化核心部分可保持不变。因此，MNA酶切割子的单个底物(例如报告底物)或MNA连接酶的单对可连接底物可用于使用MNA酶检测单个装配促进子或其他输入事件，和/或使用改变的MNA酶在一系列系统中检测多个装配促进子。多个同属可切割报告底物或同属可连接底物对允许在一个系统内对多个MNA酶的多重监测。
在一些实例中，一个混合物中具有不同感应臂和至少一个底物臂相同的不同的MNA酶是有用的。例如，参考图16示例的反馈级联，MNA酶切割子3可具有与MNA切割子1不同的感应臂，但是它可具有与MNA酶切割子1的部分酶的一个底物臂相同序列的一个底物臂(在一个部分酶上)，该MNA酶切割子1与底物1上的那部分序列(此处为底物的5’部分)相互作用，底物1随后由连接酶连接。因此不是切割底物1，MNA酶切割子3将切割另一个底物(称作底物3)，与可切割底物1相比，该底物的5’部分与底物1序列相同，但是在3’末端具有不同的部分(或反之亦然)。底物3的切割位点将位于可切割底物1和3之间共有的序列和不同的序列的连接处。在这种情况中，当MNA酶切割子3在由MNA酶切割子2的切割产生的装配促进子组分存在的情况下装配时，并且如果MNA酶切割子3切割底物3，那么MNA酶切割子3的5’切割产物也能作为DNA核酶连接酶(或装配的MNA连接酶)的5’底物，并且反馈扩增级联反应能被起始。
进一步，底物可加入其他实体，诸如标记的核酸、纳米颗粒、微颗粒、蛋白质、抗体、RNA、DNA、核酸类似物、生物素基团、糖蛋白、脂蛋白、肽核酸、闭锁核酸、肽-核酸嵌合体、射频磁场部分或其任意组合。
底物能被MNA酶修饰，因此提供“可检测效应”或“输出”信号。在检测过程中，MNA酶的底物修饰可涉及例如核酸的切割、核酸的连接、核酸磷酸化、核酸加帽、氨基酸腺苷酰化、辅因子合成、RNA聚合、模板指导的聚合、RNA-蛋白轭合、羟醛反应、醇氧化、醛还原、嘌呤和嘧啶核苷酸的合成、烷基化、酰胺合成、尿素合成、肽键的形成、肽基-RNA的合成、酰基转移、氨酰化、碳酸酯水解、硫代磷酸烷基化、卟啉金属化、碳-碳键的形成、Pd纳米颗粒的形成、联苯异构化、酯键的形成、酰胺键的形成、DNA去糖基化、胸腺嘧啶二聚体的光逆转或氨基磷酸酯的切割。
作为MNA酶的底物修饰的结果，可产生可检测的效应，并且因此效应的强度可指示输入信号的量。可检测效应可通过多种方法来检测，包括荧光光谱学、表面等离阵子共振、质谱学、NMR、电子自旋共振、偏振荧光光谱学、圆二色性、免疫测定、层析、放射分析、光度测定法、闪烁照相术、电子方法、UV、可见光或红外光谱学、酶促方法或任何组合的UV、可见光或红外光谱学、酶促方法或其任意组合。
方法可还包含定量输出信号或可检测效应的强度。在一个实施方案中，方法可还包含从定量的输出信号来确定输入事件的强度。
例如通过确定可检测效应或输出信号的存在来确定催化活性可以允许定量催化活性的方式进行。在一个实施方案中，可检测事件的强度可从定量的催化活性来确定。
几个组已经报道用比色读数来检测核酸靶和其他分析物(Elghanian等，1997，Mirkin等，1996，和Liu和Lu，2004)。该策略涉及几批金纳米颗粒的制备，每批具有附着于其表面的特定的DNA寡核苷酸序列。然后通过加入与附着于金颗粒的序列互补的“桥接寡核苷酸”，金颗粒能被聚集。颗粒的聚集导致伴随的颜色从红到蓝的改变(Mirkin等，1996)。桥接寡核苷酸内包含DNA核酶的底物序列能提供用于逆转金颗粒聚集的机制(Liu和Lu，2004)。通过加入铅的依赖于铅的DNA核酶的激活造成桥接寡核苷酸的切割、金颗粒的解离和颜色从蓝到红的改变。
使用这一原理和具有内切酶或连接酶活性的MNA酶，能开发用于监测改变的简单的检测器。温度或其它实体或事件的改变能激活MNA酶，该MNA酶能修饰桥接寡核苷酸，造成纳米颗粒的解离(在切割子的情况中)或缔合(在连接酶的情况中)和颜色的改变。
6.方法的优化
熟练的技术人员将容易理解，本文描述的方法可使用多种实验参数来优化。优化的特定实验参数和此类优化的水平将取决于采用的特定方法和/或待检测的特定事件。此类参数包括但不限于时间、温度、盐浓度、去污剂、阳离子和包括但不限于二甲基亚砜(DMSO)的其他试剂、和核酸的长度、互补性、GC含量和解链温度(Tm)。此类方法可执行的温度可以在约20℃至约96℃、约20℃至约75℃、约20℃至约60℃或约20℃至约55℃的范围内。温度可以是恒定的，或者可以在与MNA复合体的装配和/或MNA酶的催化活性相容的一个温度和与MNA复合体的装配和/或MNA酶的催化活性不相容的一个温度之间周期变化。
另外地或可选地，参数和/或微环境的改变可用来触发MNA复合体从无活性到活性状态的激活。因此，微环境中的参数可包含如本文定义的“激活子”，包括但不限于诸如温度、波长、盐浓度、去污剂、阳离子和结构和调控子组分(包括但不限于装配促进子或装配促进子组分、部分酶或部分酶组分、底物、装配抑制子、活性抑制子和激活子寡核苷酸组分)浓度的改变的事件。相应地，参数和/或微环境的此类优化可被进行以便实现MNA复合体作为级联反应或分子开关的元件的应用。
在一个优选实施方案中，用于使用MNA复合体来实践方法的优化的反应提供于本文。在该优化的反应中，催化活性的激活(在一些情况中可通过级联中一种或多种核酸酶)比未优化的反应增加了达10％、20％或30％。更优选的反应条件改进催化活性至少35％或40％，优选地达50％或更多。在更优选的实施方案中，优化的反应在催化活性的激活上增加了超过50％，并且可达66％、75％或甚至100％。在更优选的实施方案中，完全优化的反应方法将提供100％、200％或甚至300％或更多的催化活性激活的增加。其他优选的反应条件与用未优化的反应条件实践的方法相比，能提高催化活性的激活达1000％或更多。本文提供的用于优化方法的高度优选的反应条件是包含某些二价阳离子。多数核酸酶的催化活性能以依赖于浓度的方式被二价阳离子的浓度影响。优选的优化反应被优化了Ba2+、Sr2+、Mg2+、Ca2+、Ni2+、Co2+、Mn2+、Zn2+和Pb2+的一种或多种。
7.使用适体的方法
参考图7，示例了方法，其中激活子配基可用来“启动”或“关闭”适体-MNA酶的活性。如示例，在缺少激活子的情况下，该方法使用装配抑制子来阻抑适体-MNA酶的活性。这些方法使用可包含能识别一个或多个配基的核酸、蛋白质、多肽、phylomer、肽或其组合的适体。适体可结合例如蛋白质、多肽、肽或核酸、糖蛋白、脂类、脂蛋白、细胞、病毒、细菌、古细菌、真菌、抗体、代谢物、病原体、毒素、污染物、毒物、完整有机体、小分子、聚合体、金属离子、金属盐、朊病毒或其任何衍生物、部分或组合、或任何其他实体(Lee等，2004)。
本文中优选的适体可包含短单链DNA或RNA寡聚体，其能通过吸附、回收和再扩增的重复过程从合成核酸的复合体库中分离。其他优选的适体可包含能识别一个或多个配基的蛋白质、多肽、肽或phylomer或其组合。可产生能识别和结合几乎任何靶的适体，靶的范围从诸如氨基酸或抗生素的小分子至蛋白质和核酸结构。在优选实施方案，适体包括例如优选地通过进化和选择技术产生的核酸结合分子。优选地，适体可包含DNA或RNA分子、或两者的组合，包括但不限于按照例如上文表1的核苷酸类似物。
MNA复合体的至少一个组分可包含至少一个适体或其部分，其中所述适体或其部分结合选自包含以下的配基：核酸、多肽、肽、完整有机体、蛋白质、糖蛋白、脂类、脂蛋白、细胞、病毒、细菌、古细菌、真菌、抗体、代谢物、病原体、毒素、污染物、毒物、小分子、聚合体、金属离子、金属盐、朊病毒或其任何衍生物、部分或组合、或任何其他实体。
例如具有切割或连接酶活性的适体-MNA酶可加入一个或多个适体。因此适体-MNA酶的装配可受是否存在一种或多种结合适体并引起装配抑制子解离的分析物的指导。
本领域技术人员将理解一个或多个适体可加入一个或多个装配促进子分子的末端和/或活性抑制子。进一步，应理解，多个适体可被加入部分酶寡核苷酸组分的一个或多个。更进一步，应理解，适体也能被加入部分酶寡核苷酸组分的至少一个。图7示例的策略中的装配促进子可包含DNA、RNA、LNA、PNA或含有一个或多个核苷酸碱基类似物的序列。本领域技术人员将理解，可能识别两个分子，例如一个作为装配促进子的靶核酸和一个结合适体的配基。
在图7所示的策略中，适体序列被以其中活性适体-MNA酶仅在激活子存在下形成的构型加入部分酶(适体-部分酶)的末端。
本领域技术人员还将理解，一个或多个适体可被加入任一寡核苷酸组分，包括部分酶、装配促进子、活性抑制子或底物。进一步，适体能被加入这些寡核苷酸的任一个的任一末端。
图7示例的策略能被用来(i)提供一种使用配基作为激活子分子来控制适体-MNA酶的活性的方法，和/或(ii)提供一种用于使用适体-MNA酶来检测非核酸和核酸靶的方法。进一步，适体-MNA酶可以是设计用来检测许多配基靶的级联反应中的第一核酸酶。一种方案所需的用于适体-MNA酶检测策略的核酸寡核苷酸包括：
a)部分酶；
b)适体-部分酶，具有加入其一个末端的适体的部分酶；
c)装配促进子，结合适体-部分酶和部分酶促使活性MNA酶装配的寡核苷酸；
d)底物，例如报告底物；和
e)装配抑制子寡核苷酸，在横跨适体序列的至少一部分和适体-部分酶序列的底物结合臂的一部分的区域与适体-部分酶杂交。
在缺少激活子配基的情况下(图7；左图)，装配抑制子寡核苷酸与适体-部分酶结合，因此竞争并阻抑报告底物的结合。当激活子配基存在时(图7；右图)，其结合适体-部分酶的适体序列，阻抑装配抑制子寡核苷酸的结合，因此允许活性适体-MNA酶复合体的装配和随后的修饰，例如底物的切割(如图7所示)或底物的连接。因此，活性适体-MNA酶复合体只能在能结合适体-部分酶的适体部分的激活子或配基存在的情况下形成并引起荧光信号的产生。
在图7所示的适体-MNA酶方案的进一步的实施方案中，该系统能被用来同时检测核酸和非核酸分子的组合。作为实例，适体-MNA酶可被用来检测以下的存在：(i)作为装配促进子起作用并指导适体-MNA复合体形成的核酸靶，和(ii)能置换装配抑制子寡核苷酸并允许活性适体-MNA酶复合体的装配和随后的底物修饰的靶激活子配基(例如蛋白质或小分子)。
在使用具有连接酶活性的适体-MNA酶的另一个策略中，至少两个可连接底物可以存在于反应中，其中一个可以用荧光团标记，而另一个可以用猝灭剂标记。当激活子配基存在时，它将与适体-部分酶的适体序列结合，阻抑装配抑制子寡核苷酸的结合，因此允许底物的结合和连接。因此，适体-MNA酶复合体只能在能结合适体的激活子存在的情况下形成并引起荧光信号的减弱。
在一些实施方案中，使用核酸或非核酸靶激活子配基作为开关机制能获得对MNA酶活性的调控。在其他实施方案中，装配抑制子分子通过其他方式被操纵以便调控活性。例如，能通过几种策略去除装配抑制子，包括选择性热变性或使用竞争结合的寡核苷酸和/或使用分支迁移来置换MNA复合体的寡核苷酸组分的置换子寡核苷酸的方法。
本领域技术人员将理解，具有修饰活性(例如切割或连接活性)的适体-MNA酶的适体序列能附着于部分酶A或部分酶B或两者。在上文的方案中，装配抑制子寡核苷酸结合适体的一部分和部分酶的至少一个的底物臂。
本领域技术人员还将理解，适体-MNA酶的适体序列能被附着于部分酶A或部分酶B的至少一个或两者的感应臂上。在该实施方案中，装配抑制子寡核苷酸将结合适体和感应臂部分。在缺少激活子配基的情况下，装配抑制子寡核苷酸与适体-部分酶结合，因此竞争并阻抑装配促进子或装配促进子组分的结合。当激活子配基存在时，其将与适体-部分酶的适体序列结合，阻抑装配抑制子寡核苷酸的结合，因此允许装配促进子或装配促进子组分的结合和指导能修饰(例如切割或连接)一个或多个底物的活性适体-MNA酶的装配。因此，适体-MNA酶只能在能结合适体的激活子存在的情况下形成，并引起荧光信号的改变，例如荧光的增强或减弱。
当适体-MNA酶具有如图7所示的切割活性时，那么修饰能通过导致荧光团/猝灭剂染料对分离的双标记报告底物的切割而引起例如荧光的增强。
应理解，适体-MNA酶进行的修饰可以是除切割外的修饰，例如两个底物的连接。在这种情况中，信号改变可以是例如在两个可连接底物(每个底物用荧光团/猝灭剂染料对的荧光团或猝灭剂标记)连接之后荧光的减弱。
该适体-MNA酶方法也可用来开发靶检测方法或能打开和关闭MNA复合体的催化活性的分子开关。进一步，适体-MNA酶方法可包括线性核酸酶级联或反馈核酸酶扩增级联的第一步。适体-MNA酶也可应用于同时检测诸如装配促进子的核酸靶和诸如能结合适体的非核酸靶配基的非核酸靶配基。
8.级联
级联是以连续阶段发生的过程或操作的任何连续，其中每一阶段的发生一般取决于前面阶段的发生。在线性级联中，阶段(或反应步骤)以一个方向发生，并且每一阶段(或步骤)的发生取决于前面阶段或步骤的发生。在反馈级联或反馈扩增级联中，存在以连续阶段发生的过程或操作的连续，其中每一阶段的发生一般取决于前面阶段的发生，并且其中前面阶段的发生进一步取决于在随后阶段发生的过程或操作。在反馈级联中，任一前面阶段的产物能作为任一随后阶段的组分或底物，并且任一随后阶段的产物能作为任一前面阶段的组分或底物。
因此级联可包括但不限于酶促级联或任何其他信号转导级联。在一些实施方案中，级联可包含产生于MNA酶的催化活性的信号的扩增。在一些实施方案中，级联可包含产生于具有切割活性的MNA酶的催化活性的信号的扩增。在一些实施方案中，级联可包含产生于具有连接酶活性的MNA酶的催化活性的信号的扩增。在一些实施方案中，级联可包含产生于具有连接酶活性的DNA核酶或MNA酶和具有切割活性的DNA核酶或MNA酶的催化活性的信号的扩增。在优选实施方案中，此类扩增级联可涉及重复的、因此循环的信号扩增，其中第一核酸酶的催化活性产生第二核酸酶的底物修饰所需的分子，这然后产生一个或多个其他核酸酶的底物修饰所需的分子。在一些实施方案中，所需的分子可包括但不限于部分酶、核酸酶(例如DNA核酶)、装配促进子、装配促进子组分、底物、稳定臂、其部分或组分或其组合。在一些实施方案中，级联可因此涉及累积效应的产生，因此通过产生达到可检测水平的信号来检测低丰度的靶。级联可被用来扩增信号，例如在其中输入事件是低强度的应用中，例如当靶处于低丰度并且否则可能不能提供可检测的输出信号时。在其他实施方案中，可采用超过两个催化阶段。级联可以是线性的。在优选实施方案中，级联可以是指数的。
在线性级联(例如，如图9、12、15所示)，级联中的每个步骤采用核酸酶，其一些或所有可进行多次周转，因此在级联的一个或多个步骤中，单个核酸酶(例如DNA核酶或MNA酶)可进行多次切割或连接或其他修饰。多次周转可促进级联中一个或多个步骤的扩增，导致在检测步骤期间检测信号的扩增。
进一步，线性级联的延伸可导致反馈扩增级联。如果例如第三核酸酶的产物序列与第一核酸酶的产物序列相同，那么第三核酸酶的所述产物也可作为允许第二核酸复合体作为第二核酸酶起作用的分子，反馈扩增级联可被起始。该反应中，第三核酸酶将一直产生然后能作为允许第二核酸复合体作为第二核酸酶起作用的分子，因此允许能允许第三核酸复合体作为第三核酸酶起作用的第二核酸酶产生更多产物。可以想象，该策略能提供用于在能允许第一核酸酶装配的装配促进子(例如靶分析物)起始反应之后的反馈信号扩增的机制。该策略能允许检测装配促进子(例如靶分析物)，然后使用例如能连接底物的DNA核酶(或MNA酶)和能切割底物的MNA酶进行信号扩增。一个可能的反馈级联示例于图16。该方案的其他改变描述于整个说明书。
本领域技术人员将理解，本文所述的方法可用来执行如本文定义的级联。本领域技术人员也将理解，基于图9、12、15和16的其他策略可涉及通过包括例如切割或连接的各种方法至少一个MNA酶对至少一个底物的修饰。不像诸如聚合酶链反应或连接酶链反应的靶扩增技术，线性和反馈核酸酶(DNA核酶和MNA酶)级联允许以不要求蛋白酶来促进过程的形式的扩增。这提供了优于这些常用的靶扩增方案的一个主要优势。进一步，使用几个寡核苷酸组分(诸如稳定臂组分或装配促进子组分)来控制和调控MNA酶的催化活性的能力允许MNA酶的装配受微环境的条件和组分的严密调节。本领域技术人员将理解，本文所述的级联可由如本文定义的活性MNA酶或适体-MNA酶的形成来起始。
用在MNA酶级联反应的其他工具是使用置换子寡核苷酸。置换子寡核苷酸能结合具有单链和双链区域的DNA复合体内的单链区域。当置换子结合寡核苷酸(例如Oligo 1)的单链区域时，其能置换双链区域内与Oligo 1互补的一条或多条链(例如cOligo 1)，条件是置换子的序列与双链区域内的cOligo 1序列相同。这能导致新的双链结构在置换子寡核苷酸和Oligo之间1形成，并且能引起cOligo 1作为单链寡核苷酸释放。
该策略能用于MNA酶的级联反应。例如，与MNA连接酶结合的连接产物在由部分酶的底物臂和底物之间的互补形成的双链区域之间有几个不成对的碱基(单链区域)。如果与底物互补的置换子寡核苷酸(Oligo 1)与底物的单链区域结合，其能通过分支迁移置换互补的部分酶感应臂(例如cOligo 1a和cOligo 1b)，并使部分酶与连接产物分开。因此，这能增加连接酶的周转。该过程将导致包含置换子和连接产物的双链分子。然而，如果连接产物是反应随后步骤所需的，例如如果其作为随后的MNA酶的装配促进子，那么有必要将连接产物与置换子分开。如果置换子寡核苷酸比连接产物短，那么这将导致在由置换子寡核苷酸和连接产物形成的双链体末端的单链区域。在下一步骤中，部分酶感应臂能结合这些单链区域并通过分支迁移去除置换子寡核苷酸，因此导致部分酶(本实例中其本身将作为置换子寡核苷酸起作用)和连接产物(现作为装配促进子起作用)装配的新的MNA酶。
策略的许多改变用在级联中。例如，参考图4(左图)，置换子能用来通过与活性抑制子的活性抑制子结构域结合来去除活性抑制子，并通过分支迁移置换活性抑制子，以致部分酶感应臂变为单链，因此可用于结合装配促进子组分。
MNA酶级联反应能应用于多种生物技术应用，特别用于诊断，以及诸如医学、兽医、农业、食品技术、成像和反生物恐怖主义应用的其他领域。MNA酶级联反应能允许检测蛋白质和核酸用于疾病诊断，如果其能促进信号扩增则特别如此。催化核酸和/或级联反应能用于除诊断外的其他应用，例如计算分析领域和纳米级装置的生物分子工程和可用于治疗的分子开关。
MNA酶在用于各种级联中提供了优于DNA核酶的优势。DNA核酶只能识别既是其靶又是底物的一个分子。尽管DNA核酶的靶/底物可被认为提供“输入”，而酶产物(修饰的靶/底物)可被认为“输出”，DNA核酶在级联中转导更多复合过程的能力是有限的，因为输入和输出都只是同一靶底物分子的交替(修饰和未修饰)形式。进一步，催化修饰(例如切割)能破坏DNA核酶的靶/底物，因此靶不能用于另一轮的识别。相反，单个MNA酶(例如具有切割活性的MNA酶)能识别至少两个分子(即至少一个装配促进子和至少一个底物)。存在于样品中的装配促进子(例如靶核酸)将不能在反应中被催化地修饰，并且将保持可用于其他轮的MNA酶对底物的修饰。进一步，能作用于两个底物的单个MNA酶(例如具有连接酶活性的MNA酶)能识别至少三个分子，即至少一个装配促进子和至少两个底物。MNA酶复合体的这些特性使他们用于诸如级联反应的过程，该级联反应可涉及输入(例如允许核酸复合体作为核酸酶起作用的分子)和输出(例如产生并允许随后的核酸复合体作为核酸酶起作用的分子)。进一步，MNA酶复合体的这些特性使它们非常适合用在需要多个组分能“读”(识别)“输入”信号(例如可以是靶装配促进子或MNA复合体组分的分子)和“写”“输出”信号(例如识别输入并作用于分子以便提供输出，例如识别输入并修饰底物以便产生用于随后步骤的新的反应产物)的过程。MNA酶和MNA酶复合体的特性用于一步过程(例如靶检测)，并且也用于例如采用级联、逻辑门和其他过程的系统。MNA酶复合体提供了用于复杂信息转导以便接收输入信号并以适当的输出信号作出响应的机制。如整个本说明书强调，DNA核酶仍可用于级联。一些实例包括由前面的核酸酶(诸如MNA酶)产生的DNA核酶或DNA核酶复合体的底物。MNA连接酶特别用于制备例如新的DNA核酶。因此通过例如MNA酶的连接或切割产生的一个核酸酶的“输出”信息能通过产生新的DNA核酶或底物而提供下一个核酸酶复合体的“输入”，新的DNA核酶或底物能参与用于随后和/或前面反应阶段的DNA核酶复合体的形成。
用于使用MNA酶和具有连接酶活性的核酸酶以设计用于靶检测的形式产生线性级联的示例性机制描述于图9。该图还描述了用于靶检测的一般方法。该方法依赖于具有连接酶活性的DNA核酶(DNA核酶连接酶)来控制来自一个其他MNA酶的催化活性的产物的至少一个的一个MNA酶的部分酶的装配。
图9的策略使用具有切割活性的MNA酶和具有连接酶活性的DNA核酶的组合。在步骤(i)中，例如靶核酸的装配促进子能指导第一MNA酶A的形成。MNA酶A能切割底物A，因此产生5’切割产物A，5’切割产物A能转而用作DNA核酶连接酶B的底物。在步骤(ii)中，DNA核酶连接酶B能连接步骤(i)中产生的5’切割产物A(也称作5’底物B)与另一个寡核苷酸(3’连接底物B)，因此产生MNA酶C的新的部分酶。在步骤(iii)中，步骤(ii)中产生的新的部分酶/连接产物与另一个部分酶一起，在能将底物C切割为两个产物(5’产物C和3’产物C)的装配促进子C存在的情况下能形成新的MNA酶C。如果该底物例如用荧光团和猝灭剂染料对标记，那么在切割底物C之后能产生可检测的信号。该级联提供了在由允许MNA酶A装配的装配促进子(例如靶分析物)起始反应之后用于信号扩增的机制。以该线性级联的形式，每一步骤采用核酸酶，其一些或所有可经受多次周转，因此单个核酸酶(例如DNA核酶或MNA酶)能在级联的一个或多个步骤中进行多次切割、连接或其他修饰。多次周转可促进级联的一个或多个步骤的扩增，导致在一个或多个步骤期间检测信号的扩增。
以设计用于靶检测的形式产生MNA酶级联的另一个机制描述于图12。该图还描述了用于靶检测的一般方法。该方法依赖于具有连接酶和切割活性的MNA酶的组合。MNA连接酶控制来自一个其他MNA酶切割子的催化活性的产物的至少一个的一个MNA酶切割子的部分酶的装配。
在步骤(i)中，例如靶核酸的装配促进子A能指导第一MNA酶A的形成。MNA酶A能切割底物A，因此产生5’切割产物A，5’切割产物A能转而用作具有连接酶活性的MNA酶B的底物。在步骤(ii)中，MNA连接酶B(在装配促进子B存在的情况下由MNA酶B的部分酶组分形成)能连接步骤(i)中产生的5’切割产物A(也称作5’底物B)与另一个寡核苷酸(3’底物B)，因此产生MNA酶C的新的部分酶。在步骤(iii)中，步骤(ii)中产生的新的部分酶/连接产物与另一个部分酶一起，在能将底物C切割为两个产物(5’产物C和3’产物C)的装配促进子C存在的情况下能形成新的MNA酶C。如果该底物例如用荧光团和猝灭剂染料对标记，那么在切割底物C之后能产生可检测的信号。
进一步，在图9和12的上下文中，如果5’产物C的序列与5’产物A的序列相同，那么该产物也能作为5’底物B，反馈扩增级联能起始。该反应中，MNA酶C将一直产生5’底物B，然后5’底物B能被核酸酶连接酶(图9的DNA核酶B或图12的MNA酶B)连接以便产生用于更多MNA酶C形成的更多部分酶。该策略能提供在允许MNA酶A的装配的装配促进子(例如靶分析物)起始反应之后反馈信号扩增的机制。这些反馈级联策略能允许检测装配促进子，然后使用多种类型的核酸酶(例如DNA核酶连接酶或MNA连接酶与能切割底物的MNA酶(MNA酶切割子)的组合)进行信号扩增。应认识到，这种反馈级联能与整个说明书描述的其他策略组合使用。应理解，存在能应用于遵循与图9和12所述相似策略的级联的许多改变。例如，连接酶能用来产生作为例如具有切割、连接酶或其他酶活性的另一个MNA酶的装配促进子的连接产物。
遵循与图9和12相似策略的一个可能的级联的实例将是其中两个或多个MNA酶响应于不同的装配促进子(例如靶)，并且能用于反应中，其中每个MNA酶催化的每个修饰反应提供可用来参与随后反应的不同的修饰产物(例如切割或连接产物)。作为实例，参考图9和12的级联，响应于不同装配促进子(例如靶)的两个或多个初始MNA酶能被用来提供不同的修饰产物，这些修饰产物能参与形成能在下一步反应中作为具有连接酶活性的核酸酶起作用的对应数量的MNA连接酶复合体。然后核酸连接酶能产生用于MNA酶C反应的各种元件，诸如装配促进子C、部分酶A、B或其组分。因此例如，由一个初始MNA酶的产物驱动的一个连接酶反应能产生MNA酶C的装配促进子C，而由另一个初始MNA酶的产物驱动的另一个连接酶反应能产生MNA酶C的部分酶。在该实例中，测定可被安排为只有当两个都存在来驱动两个连接酶反应并因此产生装配促进子和部分酶两者时，则MNA酶C被装配并催化上有活性。这将是用于检测多个靶的机制。只有在需要数量的靶存在的情况下，MNA酶C的所有需要的元件才可用来修饰底物C。该实例中，反应混合物的增加的元件将根据由于初始靶的识别而产生的MNA酶C元件的数目来调整。因此，例如，如果两个靶被监测并且这转而又驱动导致装配促进子C和MNA酶C的部分酶A产生的反应，则只有MNA酶C的组分部分酶B和底物C将需要存在以便允许MNA酶C复合体的形成以及反应第三步的进行。
相似地，一个或多个装配促进子(例如靶)可被检测，并且供给许多不同的元件到一个随后(例如连接)的步骤。例如，参考图9，一个初始反应能提供5’连接酶底物，而另一个初始反应能产生3’连接酶底物。可选地，在与图12相似的另一个实例中，一个初始MNA酶切割子能产生MNA酶B的5’连接酶底物，而一个初始MNA连接酶能产生MNA连接酶B的部分酶。只有当两个产物都可用来参与MNA酶复合体的形成时，连接酶底物将被修饰，并且级联反应继续。应理解，该策略中使用的不同装配促进子(例如靶)可包含不同分子或在一个分子内包含不同序列，或组合。例如，一个分子内三个不同的SNP能被三个不同的MNA酶检测。
应理解，该策略存在许多其他变化。使用多个靶来为反应提供都是反应进行所需的多种不同元件的一般构思可应用于许多反应和级联。检测的靶的数目可变化，例如可检测两个或多个靶。这将应用于级联的一个或多个步骤。这也能通过为级联的下一步骤提供一个或多个组分而直接应用，或通过允许级联中之后的反应发生而间接应用，或其各种组合。因此例如，由一个靶指导的一个MNA酶能提供下一反应所需的分子，而由另一个靶指导的另一个MNA酶能提供下一或其他随后的反应所需的产物。显而易见，其他变化也可适用。显而易见，该策略也能应用于影响如上文所述的不同修饰(例如切割或连接)的酶。此外，响应于各种数目的靶的可变数目的核酸酶产生的产物的各种组合是可能的，其包括但不限于部分酶、装配促进子和其他MNA复合体组分。响应于许多靶的许多核酸酶可产生其他核酸酶或核酸酶复合体的一个或多个组分，或者可产生其他核酸酶或核酸酶复合体的所有组分。
使用能切割底物的核酸酶和能连接底物的核酸酶的级联反应的另一个实例示于图15。该实例中，连接的过程导致新的装配促进子的产生。在步骤(1)中，只有在装配促进子(例如靶核酸)存在的情况下，MNA酶切割子1才能装配，然后切割MNA酶底物1，释放具有2’，3’环状磷酸末端的5’切割产物。在步骤(2)中，DNA核酶连接酶(或MNA连接酶)连接来自步骤(1)的5’切割产物与3’连接底物，因此产生能作为另一个MNA酶切割子2的装配促进子的连接产物。在步骤(3)中，在步骤(2)通过连接形成的装配促进子指导形成能将底物2切割为两个产物(具有2’，3’环状磷酸末端的5’切割产物和3’切割产物)的MNA酶切割子2的部分酶的装配。如果该底物例如用荧光团和猝灭剂染料对标记，那么在切割底物2之后能产生可检测的信号。与图9和12所示的级联的线性形式相似，图15的级联的每一步骤采用核酸酶，其一些或所有可经受多次周转，因此单个核酸酶(例如DNA核酶或MNA酶)可在级联的一个或多个步骤执行多次切割或连接或其他修饰。多次周转可促进在级联的一个或多个步骤的扩增，导致在一个或多个步骤期间检测信号的扩增。
进一步，图15所示的线性级联的延伸可导致反馈扩增级联。如果MNA酶切割子2的5’切割产物序列与MNA酶切割子1的5’切割产物序列相同，那么MNA酶切割子2的5’切割产物也可作为DNA核酶连接酶(或MNA连接酶)的5’底物，反馈扩增级联反应可被起始。该反应中，MNA酶切割子2将一直产生5’切割产物，5’切割产物能转而作为DNA核酶连接酶(或MNA连接酶)连接的底物，因此允许能指导更多MNA酶切割子2装配的更多装配促进子的产生。据设想，该策略能提供用于在能允许MNA酶切割子1装配的装配促进子(例如靶分析物)起始反应之后的反馈信号扩增的机制。该策略能允许检测装配促进子(例如靶分析物)，然后使用能连接底物的DNA核酶(或MNA酶)和能切割底物的MNA酶进行信号扩增。该方案的其他改变描述于整个说明书。
用于使用两类核酸酶(即能切割底物的核酸酶和能连接底物的核酸酶)来产生反馈级联反应的另一个示例性方法示于图16。图16只是该一般策略的许多变化之一。在步骤(1)中，只有在装配促进子(例如靶核酸)存在的情况下，MNA酶切割子1才能装配，然后切割MNA酶底物1，释放具有2’，3’环状磷酸末端的5’切割产物和3’废物。在步骤(2)中，DNA核酶连接酶(或MNA连接酶)连接来自步骤(1)的5’切割产物与3’连接底物，因此产生能作为MNA酶切割子2的装配促进子的连接产物。在步骤(3)中，步骤(2)的连接形成的装配促进子指导部分酶的装配，形成能将底物2切割为两个产物(具有2’，3’环状磷酸末端的5’切割产物和3’切割产物)的MNA酶切割子2。如果该底物例如用荧光团和猝灭剂染料对标记，则在切割底物2之后能产生可检测的信号。进一步，如果MNA酶切割子2的一个切割产物的序列用作MNA酶切割子3的装配促进子组分，这能促进反馈级联。在这种情况中，MNA酶切割子3可具有与MNA酶切割子1不同的感应臂，但是将需要与MNA酶切割子1至少一个底物臂相同，以便提供至少相同的5’连接底物来参与步骤(ii)的连接酶反应。(在图16中，假设是与MNA酶切割子1相同的底物(底物1)，那么MNA酶切割子1和3的底物臂将相同。)在步骤4中，MNA酶切割子3能在由MNA酶切割子2的切割产生的装配促进子组分存在的情况下装配。进一步，MNA酶切割子3能切割底物，并产生与MNA酶切割子1切割底物1产生的5’切割产物相同的5’切割产物。然后，该产物也能作为DNA(或MNA)连接酶的5’底物，并且反馈扩增级联反应能被起始。该反应中，MNA酶切割子3将一直产生5’切割产物，5’切割产物能转而作为DNA(或MNA)连接酶连接的底物，以便产生能指导更多MNA酶切割子2装配的更多装配促进子。然后MNA酶切割子2能产生更多MNA酶切割子3的更多装配促进子组分，反馈级联将被产生。该策略能提供用于在指导MNA酶切割子1装配的装配促进子(例如靶分析物)起始反应之后的反馈信号扩增的机制。该策略将允许检测装配促进子(例如靶分析物)，然后使用能连接底物的DNA核酶(或MNA酶)和能切割底物的MNA酶进行信号扩增。
应理解，尽管许多上述实施例指使用5’切割产物作为随后反应的连接底物，也可能使用3’切割产物作为随后反应的连接底物，或两者。另外，5’或3’切割产物或两者可用作随后或前面核酸酶复合体的组分。还应理解，取决于使用的连接酶，可连接底物可具有不同的末端。例如，除了2’3’环状磷酸和5’羟基末端，它们可具有例如2’3’二醇末端和5’三磷酸末端(参见表4)。具有切割活性的MNA酶可基于待切割的键合而被选择。
在说明书中本实施例和其他实施例的进一步的改变中，具有连接酶活性的DNA核酶(或MNA酶)能连接片段，形成能切割底物2以便产生另一个MNA酶的装配促进子或其他组分的DNA核酶(在图16中标记为MNA酶切割子3)。因此，该改变中，MNA酶切割子2能用DNA核酶切割子替换。在另一个示例性策略中，DNA(或MNA)连接酶能连接片段，并产生能与存在于反应中的另一个部分酶和装配促进子缔合的新的部分酶，因此形成能切割底物2以便产生MNA酶3的装配促进子组分的MNA酶切割子2。该方案的其他改变是可能的，描述于说明书的其他地方。
技术人员将理解，许多可选的MNA酶复合体是可能的，并且可用在级联中。这些设计的几个示于图6，其中活性MNA酶复合体的一些实例显示于图A至D。这些结构都能形成能修饰(例如切割)底物(S)的催化上有活性的酶。例证包含MNA酶的方案，其包括一个装配促进子F1(图A)、两个装配促进子组分F1和F2(图B和D)或三个装配促进子组分F1、F2和F3(图3)。显示于图A的实例包括在部分酶感应臂内具有自身互补区域的感应臂。MNA酶也可包括如图D所示的一个或多个稳定臂。一个图中的改变可被用于与另一个图中的改变组合。
技术人员将理解许多级联示例于整个说明书。还应理解，级联天然是模块化的，因此级联的多种改变是可能的。下文表3提供了可能的改变的非穷尽列表。技术人员将意识到其他改变是可能的，并且包括在本发明的范围内。
表3.使用MNA酶的组合或MNA酶和DNA核酶的组合的一些可能的级联。
*步骤能在单个反应容器中相继进行，各种步骤能被组合或所有步骤能在具有一个或多个室的单个反应容器中进行。每个改变可包含其他步骤，包括反馈到级联其他部分的步骤。
本文所述和图中例证的实施例的反应中所使用的级联反应的组成组分元件、步骤或阶段选择的流程图显示于方案1。非限制性流程图显示了用在级联反应中的各种组分元件的模块化。
所有反应可使用核酸酶的组合，即多种MNA酶或MNA酶和DNA核酶的混合物。这些酶的修饰涉及各种数目的切割和/或连接步骤的组合。在每种情况中，一步的产物作为随后步骤的酶或酶组分的底物。切割的核酸酶能用来产生例如用于连接的新底物或新MNA酶的新的装配促进子组分。连接的核酸酶能用来产生例如用于DNA核酶或MNA酶的下一步切割的新底物。进一步，连接的核酸酶能用来产生例如新的DNA核酶或MNA酶的新组分，诸如装配促进子、新的部分酶或新的稳定臂。本领域技术人员将理解，使用核酸酶组合的试验存在大量的改变，并且得到的产物能用于核酸酶级联。例如，在表3所列的一些改变中，其中核酸酶指示为切割子，可能用连接酶将其替换(或反之亦然)。用在许多此类级联反应的许多单个步骤示例于实施例中，并概述于方案1。
对本领域技术人员显而易见，单个核酸酶产生的多个产物能用来允许一个或多个核酸复合体作为一个或多个随后步骤中的一个或多个核酸酶起作用。
在表3的一些步骤中，其中一个反应的产物指示为用作随后反应中核酸酶复合体的特定组分，可能用另一类型的组分替换该组分。例如，在表3的步骤1中，MNA酶能产生用作核酸酶复合体的装配的装配促进子而不是底物的产物。
对本领域技术人员显而易见，例如荧光信号的信号能在其中催化修饰发生的步骤产生。例如，荧光信号能在其中存在DNA核酶或MNA酶的切割的任一步骤产生，这能分离荧光团猝灭剂染料对，引起荧光的增强。进一步，荧光信号能在其中存在例如DNA核酶或MNA酶的连接的任一步骤产生，能使荧光团猝灭剂染料对紧密接近，引起荧光的减弱。进一步，荧光信号能在级联反应内的多个步骤产生。
在级联反应的所有这些实施例中，存在以连续阶段发生的过程或操作的连续，其中每个阶段的发生一般取决于前面阶段的发生。进一步，在其中描述了反馈级联的实施例中，将存在以连续阶段发生的过程或操作的连续，其中每个阶段的发生一般取决于前面阶段的发生，并且其中至少一个前面阶段的发生一般取决于在随后阶段发生的过程或操作。反馈级联中，任一前面阶段的产物可作为任一随后阶段的组分或底物，并且任一随后阶段的产物可作为任一前面阶段的组分或底物。
在一个或多个MNA酶组分存在的情况下，级联可由核酸靶(DNA/RNA)起始，或者在一个或多个适体-MNA酶组分存在的情况下，级联可由其他靶分析物(蛋白质、小分子等)起始。由于反应只能在靶分析物存在的情况下起始，这能提供用于检测和/或鉴定靶分析物的技术。该方法基于核酸复合体的失活和激活状态之间的转换。与诸如PCR或连接酶链反应的靶扩增技术不同，涉及使用MNA酶的扩增的级联不需要蛋白酶来促进该过程。进一步，使用几个寡核苷酸组分(诸如稳定臂组分或装配促进子组分)来控制和调控MNA酶的催化活性的能力允许MNA酶的装配受微环境的条件和组分的严密调控。
关于由非核酸靶分析物起始的级联，适体是有用的。适体是DNA、RNA或肽序列，由于其高水平的结构(例如3-D结合结构域或口袋)，能以高亲和力和特异性识别一个或多个配基。许多适体结合配基的能力在体外进化，所述配基包括例如核酸、蛋白质、朊病毒、小有机化合物和/或完整有机体。“适体酶”是上文所述的具有包含适体和核酸酶序列的序列的序列，例如附着于DNA核酶或核酶的适体。适体-MNA酶是具有附着于适体-MNA复合体的一个组分的适体的MNA酶。例如，适体可附着于部分酶、装配促进子、MNA酶底物或MNA复合体的任一其他组分。非核酸靶分析物与适体的缔合可促进核酸酶的活性。因此，例如作为级联的第一步，级联可由与适体-MNA酶缔合的非核酸靶分析物起始。此外，在级联中，该级联中的核酸酶催化的反应产物可与存在于核酸酶而不是起始MNA酶或适体-MNA酶的组分上的适体缔合，因此促进该核酸酶的活性。
MNA酶和/或适体-MNA酶介导的扩增级联可应用于许多生物技术应用，特别用在诊断学上，以及其他医学、兽医、农业、食品技术、成像和反生物恐怖主义应用。这些可通过促进信号扩增而允许检测用于疾病诊断的蛋白质、核酸或其他分子。催化核酸和/或级联反应能用于除诊断外的应用，例如用在计算分析领域和纳米级装置的生物分子工程和可用于治疗的开关。
9.通过去除或产生诸如活性抑制子或装配促进子的组分而允许在MNA复合体的活性和无活性状态之间转换的方法。
活性MNA酶和无活性MNA复合体之间的转换(或反之亦然)能通过提供或去除MNA复合体组分来获得，所述MNA复合体组分包括但不限于一个或多个活性抑制子、装配促进子、装配抑制子、部分酶或稳定臂、或其部分。在一些实施方案中，活性抑制子可还包括不稳定或可切割的接头或底物，其位于活性抑制子内的两个或多个结构域之间，例如活性抑制子结构域和激活子装配促进子结构域。接头位点的切割可允许活性抑制子结构域与激活子装配抑制子结构域分开，然后其可作为装配促进子组分起作用并指导活性MNA酶的装配。接头的切割可通过几种方法获得，包括但不限于MNA酶的切割、蛋白酶切割、或由pH和/或温度改变诱导的水解。
可选地，利用涉及分支迁移的过程和/或与组分寡核苷酸的互补性，可选择地去除装配抑制子和/或装配促进子。通过互补起作用的调控子寡核苷酸可通过改变其结合的寡核苷酸的二级结构而达到此目的。在一些实施方案中，这可导致交替的构象，其中激活子序列现在能与其他组分装配形成活性MNA酶。作为实例，此类调控子寡核苷酸可引起限制激活子分子处于非功能构象的分子内结构(诸如发夹)的破坏。
可选的示例性策略设计为使用具有连接酶活性的第二MNA酶(或具有连接酶活性的DNA核酶)来促进MNA复合体在活性MNA酶的“启动状态”和MNAi复合体的“关闭状态”之间的转变。参考图13，在装配促进子组分1(AFC 1)和装配促进子组分2(AFC 2)存在的情况下，能形成能修饰(例如切割或连接)底物A的活性MNA酶A。在装配促进子3(AF3)存在的情况下，能形成具有连接酶活性的第二MNA酶B，然后能连接AFC2与活性抑制子组分(AIC)，引起活性抑制子(AI)的形成。该AI能与MNA酶A的部分酶组分结合，导致无活性的MNAi A复合体的形成。因此，本实施例中的MNA连接酶能作为关闭开关起作用来失活MNA酶A。可选地，DNA核酶连接酶能替换MNA连接酶，并用来作为关闭开关起作用失活MNA酶A。无活性的MNAi复合体和催化上有活性的MNA酶将代表装配组分的两个交替状态，即分别为“关闭”状态和“启动”状态。
10.试剂盒
本发明还提供了用于实践本文公开的方法的试剂盒。用于执行本发明的方法的试剂盒一般含有执行方法的所有必需试剂。试剂盒一般可包含含有第一核酸复合体(例如MNA复合体)的至少第一容器，其中第一核酸酶的形成需要添加推测含有待检测、待鉴定和/或待定量的靶的样品。酶的形成可导致适合参与随后反应的例如底物的组分的产生。在随后的反应中，组分允许其他核酸复合体作为核酸酶起作用。还提供了允许其他核酸复合体形成的试剂，所述其他核酸复合体在前面反应的核酸酶产生的组分接触该复合体时形成核酸酶复合体。
在某些实施方案中，能允许活性核酸酶复合体形成的每个核酸复合体组分可存在于相同或不同的容器。在其他实施方案中，能允许活性核酸酶复合体形成的每个核酸复合体组分可存在于不同的容器。例如，在一个实施方案中，试剂盒可包含不同容器中每个核酸复合体的一个或多个所需组分。
应理解，不是所有核酸复合体的所有组分需要在试剂盒中，因为它们可作为级联反应的一部分而产生。还涵盖允许多重反应的组分。
在其他实施方案中，具有例如切割或连接酶活性的其他核酸酶复合体的组分也可形成本发明的试剂盒的一部分。在其他实施方案中，本发明的试剂盒可包括DNA核酶或其部分。
本发明的试剂盒一般还将包含一个或多个其他容器，含有例如洗涤试剂和/或本发明方法的执行所需的其他试剂。
在本发明的上下文中，区室化的试剂盒包括其中试剂包含在不同容器中的任何试剂盒，并且可包括小的玻璃容器、塑料容器或塑料条或纸条。此类容器可允许试剂从一个区室向另一个区室的有效转移，同时避免样品和试剂的交叉污染，并且允许将每个容器的试剂或溶液以定量的模式从一个区室加到另一个区室。此类试剂盒还可包括将接受测试样品的容器、含有试验中使用的试剂的容器、含有洗涤试剂的容器和含有检测试剂的容器。本发明的试剂盒一般还将包括使用试剂盒组分来执行适当方法的说明书。本发明的试剂盒和方法可与自动分析设备和系统(例如包括但不限于实时PCR机)一起使用。
为了对不同的靶或事件进行检测、鉴定或定量的应用，本发明的单个试剂盒可适用，或者可选地可能需要例如含有特异于每个靶的试剂的不同的试剂盒。本发明的方法和试剂盒应用于其中需要检测、鉴定或定量任何实体或事件的任何情况。
11.制备MNA酶的方法
本发明还提供了用于从单分子DNA核酶来构建MNA酶的方法。
已知DNA核酶和/或核酶能催化修饰至少一个底物，其中修饰可选自包含以下的组：核酸的切割、核酸的连接、核酸磷酸化、核酸加帽、氨基酸腺苷酰化、辅因子合成、RNA聚合、模板指导的聚合、RNA-蛋白轭合、羟醛反应、醇氧化、醛还原、嘌呤和嘧啶核苷酸的合成、烷基化、酰胺合成、尿素合成、肽键的形成、肽基-RNA的合成、酰基转移、氨酰化、碳酸酯水解、硫代磷酸烷基化、卟啉金属化、碳-碳键的形成、Pd纳米颗粒的形成、联苯异构化、酯键的形成、酰胺键的形成、DNA去糖基化、胸腺嘧啶二聚体的光逆转和氨基磷酸酯的切割。
本文描述的制备MNA酶的方法适用于多种核酸酶，诸如上文的核酸酶，包括但不限于Hobartner和Silverman(2007)描述的核酸酶和下表列出的核酸酶。
表4：可用来形成MNA酶的一些单分子核酸酶。
  催化的反应   特定的核酸酶(&主要组成)  底物要求  产物
  切割   锤头核酶(RNA)  NU*X3’-5’RNA键合  2’3’环状磷酸和5’羟基
  10:23DNA核酶(DNA)  R*Y3’-5’RNA键合  2’3’环状磷酸和5’羟基
  8:17DNA核酶(DNA)  A*G3’-5’RNA键合  2’3’环状磷酸和5’羟基
  7Q10DNA核酶(DNA)  UA*GR2’-5’RNA键合  2’3’环状磷酸和5’羟基
  7Z81DNA核酶(DNA)  UA*GR2’-5’RNA键合  2’3’环状磷酸和5’羟基
  连接   7Q10DNA核酶(DNA)  UA*GR2’3’环状磷酸和5’羟基  2’-5’RNA键合
  7Z81DNA核酶  UA*GR  2’-5’RNA键合
  (DNA)   2’3’环状磷酸和5’羟基
  9DB1DNA核酶(DNA)   D*RA2’3’二醇和5’-三磷酸   3’-5’RNA键合
技术人员将理解，许多DNA核酶具有相似的具有多个结构域的基本结构。这些DNA核酶具有保守的催化结构域(催化核心)，侧翼为特异识别和杂交底物的两个非保守的底物-结合结构域(“底物臂”)。底物结合结构域能根据任何底物来调整，条件是该底物含有能被DNA核酶修饰的位点。包括锤头核酶、10:23和8:17DNA核酶、“7Z81”、“7Z48”和“7Q10”连接酶、“UV1C”胸腺嘧啶二聚体光逆转DNA核酶和“DAB22”碳-碳键形成DNA核酶的几种催化核酸具有多个结构域的类似基本结构。
参考图14，示例了用于从单分子DNA核酶构建MNA酶的方法(上部左侧结构)，其中在第一步中，鉴定了能被分开的DNA核酶催化核心内的位置，以便催化核心的每个部分能分布于两个部分序列之间，以便两个部分核心一起构成整个催化核心(上部右侧结构)。然后两个寡核苷酸A和B(候选部分酶)能被合成(下部左侧结构)。含有以下的寡核苷酸A能被合成：(i)一个能结合底物的底物结合臂部分，(ii)一个部分催化核心部分，和(iii)一个能结合装配促进子分子的感应臂部分。第二寡核苷酸B能被合成，以便其含有(i)一个能结合与寡核苷酸A相同底物的底物结合臂，其中寡核苷酸B在邻近寡核苷酸A的位置结合底物，(ii)一个含有来自完整DNA核酶催化核心并且没有加入寡核苷酸A的那些碱基的部分催化核心部分和(iii)一个能结合与寡核苷酸A相同的装配促进子的感应臂序列，其中寡核苷酸B在邻近寡核苷酸A的位置结合装配促进子。该过程能被重复，因此制备一系列成对的寡核苷酸A和B，其加入部分酶的结构和结构域，但是在底物和装配促进子存在的情况下可具有或可不具有催化活性。
然后，一些或所有候选部分酶对(来自系列的成对寡核苷酸A和B)能在与部分酶的感应臂部分互补的装配促进子和与部分酶的底物臂部分互补的底物存在的情况下孵育。孵育在与部分催化核心序列来源的DNA核酶修饰底物相容的条件下进行。能进行与部分序列来源的DNA核酶相同类型的底物修饰(例如切割)的成对寡核苷酸A和B可用作能装配成MNA酶和MNA酶复合体的部分酶(底部右侧结构)。部分催化核心的序列适合加入新MNA酶的其他部分酶。能合成根据新的底物(通过改变每个部分酶的底物结合结构域)和/或新的装配促进子(通过改变每个部分酶的感应结合结构域)调整的新的部分酶。
用于构建作用于第一和第二底物的MNA酶(例如从单分子核酸酶开始的MNA连接酶(例如DNA核酶连接酶))的方法需要相似的步骤，其中第一步中，鉴定了能被分开的DNA核酶催化核心内的位置，以便催化核心的每个部分部分能分布于两个部分序列之间，以便两个部分核心一起构成整个催化核心。然后两个寡核苷酸A和B(候选部分酶)能被合成。含有以下的寡核苷酸A能被合成：(i)一个能结合第一底物的底物结合臂部分，(ii)一个部分催化核心部分，和(iii)一个能结合装配促进子分子的感应臂部分。第二寡核苷酸B能被合成，以便其含有(i)一个能结合第二底物的底物结合臂，(ii)一个含有来自完整DNA核酶催化核心并且没有加入寡核苷酸A的那些碱基的部分催化核心部分和(iii)一个能结合与寡核苷酸A相同的装配促进子的感应臂序列，其中寡核苷酸B在邻近寡核苷酸A的位置结合装配促进子。该过程能被重复，因此制备一系列成对的寡核苷酸A和B，其加入部分酶的结构和结构域，但是在底物和装配促进子存在的情况下可具有或可不具有催化活性。
然后，一些或所有候选部分酶对(来自系列的成对寡核苷酸A和B)能在与部分酶的感应臂部分互补的装配促进子和与部分酶的底物臂部分互补的两个底物存在的情况下孵育。孵育在与部分催化核心序列来源的DNA核酶修饰(例如连接)底物相容的条件下进行。能进行与部分序列来源的DNA核酶相同类型的底物修饰(例如连接)的成对寡核苷酸A和B可用作能装配成MNA酶和MNA酶复合体的部分酶。部分催化核心的序列适合加入其他MNA酶的其他部分酶。能合成根据新的底物(通过改变每个部分酶的底物结合结构域)和/或新的装配促进子(通过改变每个部分酶的感应器结合结构域)调整的新的部分酶。
进一步，相似的方法可用来检查来自能被加入组分部分酶而分开DNA核酶催化核心的部分序列对改变的耐受性。例如，能进行对加入部分酶的部分催化核心的修饰，作为实例其包括插入、缺失、可选DNA碱基的取代或DNA类似物(诸如核糖核苷酸、肌苷或其他类似碱基)的取代。然后可如上测定含有一个或多个修饰的候选部分酶对，来确定它们是否含有适合加入能装配成催化上有活性的MNA酶的部分酶的一对部分催化核心序列。
现在参考下述特定的实施例将详细地进一步描述本发明，这些实施例不应以任何方式解释为限制本发明的范围。
实施例
实施例1：其中部分酶B包含两个分子的MNA酶的实例
MNA酶基本设计的许多改变涵盖于本发明。本实施例中，MNA酶在来自部分酶A的装配促进子和含有两个组分(即一个具有截短感应臂的部分酶组分和作为稳定臂起作用的一个组分)的部分酶B存在的情况下装配。MNA酶的装配通过部分酶感应臂和装配促进子序列的Watson-Crick碱基识别发生。在下文实施例中，证明了截短臂和稳定臂的使用。
本实施例中使用的MNA酶的检测策略示例于图2(图(ii))和图3(i)。
该策略所需的寡核苷酸的实例描述于下文：
a)部分酶A；
b)部分酶B，其包含含有底物臂、部分催化核心和截短感应臂的第一组分；和与装配促进子杂交的邻近部分酶的截短感应臂的第二稳定臂组分。该稳定臂设计为当部分酶的截短感应臂与装配促进子杂交时促进MNA酶的装配；和
c)底物，例如报告底物。
可选地，用于本策略的寡核苷酸是部分酶B；部分酶A，其包含含有底物臂、部分催化核心和截短感应臂的第一组分和能在邻近部分酶的截短感应臂处与装配促进子杂交的第二稳定臂组分。
活性MNA酶的装配也需要装配促进子的存在。
1.1.部分酶寡核苷酸和稳定臂
本实施例中，部分酶B的截短感应臂长度只有5个核苷酸。部分酶A和两个部分酶B组分的序列显示于下文(5’至3’)。在下文的序列中，黑体的碱基与装配促进子杂交，加下划线的碱基形成装配的MNA酶的催化核心的一部分，斜体的碱基与底物杂交。“-P”表示寡核苷酸的3’磷酸化。
SEQ ID NO：1部分酶A4XdA4/2-P：
ACAACGA
SEQ ID NO：2部分酶B5组分1XdB5/2-P：
GGCTAGCT
SEQ ID NO：3部分酶B稳定臂组分XdS-P：
1.2.报告底物
本实施例使用的报告底物是SubBi-2，其5’末端用6-FAM部分末端标记，3’末端用BHQ1部分末端标记，称为SubBi-2-FB。以490nm(FAM激发波长)的激发在520nm(FAM发射波长)监测SubBi-2-FB的切割。SubBi-2-FB的序列列在下文(5’至3’)；小写字母的碱基代表RNA，大写字母的碱基代表DNA。
SEQ ID NO：4SubBi-2-FB：
AAGGTTTCCTCguCCCTGGGCA
1.3.装配促进子分子
用作装配促进子的合成寡核苷酸的序列如下(5’至3’)。该装配促进子与部分酶B的感应臂完全匹配。没有核酸酶的水代替靶用作“无靶”对照。
SEQ ID NO：5装配促进子Xd-T：TGCCCCCTCACCCTCACGAAGGTATACAGACAGATGGACATCCAGTTGGTGA
1.4反应条件
装配促进子的检测通过由催化上有活性的MNA酶对报告底物的切割引起的荧光信号的增强来测量。通过加入底物来起始反应，所有反应的总体积是50μL。反应在55℃下FLUOstar OPTIMA(BMG Biotech)上进行。每2秒读出每个反应的荧光，共持续5分钟。所有反应含有200nMSubB1-2-FB、200nM XdA4/2-P、200nM XdB5/2-P、1xPCR Buffer II(Applied Biosystem)和25mM MgCl2。此外，反应含有表5所列的寡核苷酸。
表5.MNA酶反应中的其他试剂。
  反应   装配促进子   稳定臂
 (i)   200nM Xd-T   200nM XdS-P
 (ii)   200nM Xd-T   无稳定臂
 (iii)   无装配促进子(水对照)   200nM XdS-P
1.5结果：在部分酶和装配促进子存在的情况下活性MNA酶的装配
当装配促进子和部分酶稳定臂组分都包括在反应中(反应(i)：图3)时，活性MNA酶装配并切割底物，导致荧光随时间的增强。相反，在缺少装配促进子的情况下(反应(iii)：图3)荧光没有增强。进一步，显示稳定臂的存在对活性MNA酶或MNA酶复合体的形成是必需的。含有包括装配促进子的所有反应组分但缺少稳定臂组分的反应随时间没有荧光的增强(反应(ii)：图3)。因此，部分酶B感应臂的5个碱基不足以形成稳定的MNA酶或MNA酶复合体，但是，显示稳定臂组分的存在能补偿部分酶感应臂的短长度(截短)，并允许在严格温度条件下(本实施例中55℃)稳定MNA酶的形成。因此，稳定臂组分是使用具有截短感应臂的部分酶的系统中活性MNA酶的装配必需寡核苷酸。
进一步，当针对部分酶A感应臂具有单个核苷酸错配的可选装配促进子包括在含有部分酶A和部分酶B的两个组分的反应中时，荧光信号不随时间增强(数据未显示)。
本实施例证明实验条件下MNA酶只能在完全匹配的装配促进子存在的情况下形成。本领域的技术人员将理解，活性MNA酶和无活性多组分核酸复合体之间的转换可通过提供完全匹配或错配的装配促进子来调控。进一步，本实施例证明了包含含有截短感应臂的第一分子和第二稳定臂分子的两个组分部分酶的应用。该系统中对稳定臂分子存在的要求提供了能调控MNA酶装配的另一个工具。
含有多个寡核苷酸组分的MNA复合体提供了很好的灵活性，其序列可根据解链温度、序列组成和其与其他组分寡核苷酸的互补性或其缺少来调整。包括但不限于具有截短臂、稳定臂和装配促进子组分的部分酶组分的更短序列特别用于本发明的这一方面。尽管本实施例使用具有切割活性的MNA酶，应理解MNA酶或MNA酶复合体的相似的结构设计可用于引起除切割外修饰的MNA酶，例如能连接的MNA酶。
实施例2：使用具有连接酶活性的MNA酶检测靶分析物
能修饰至少两个底物的MNA酶(诸如具有连接酶活性的MNA酶)的实施例可用于检测核酸靶。具有连接酶活性的MNA酶能由包含来自例如分别如实施例7和9中例证的7Q10 DNA核酶或7Z81 DNA核酶的活性部分催化核心对的两个部分酶装配。部分酶可具有与能作为活性MNA连接酶的装配促进子的靶核酸互补的感应臂。底物臂可与含有具有适当末端的可连接序列的两个底物分子互补(例如，表4)。
如果5’连接底物和3’连接底物每个分别用荧光团和猝灭剂染料标记(或反之亦然)，那么连接可导致可作为靶核酸存在的指示的荧光的减弱。在可选形式中，如果5’连接底物用例如荧光团的可检测部分标记，而3’连接底物附着于分离的位置(例如芯片上)，那么在靶核酸存在时连接能导致在分离位置信号的出现。
如果MNA酶是具有连接酶活性并含有能特异结合靶配基的适体序列的适体-MNA酶，则该策略也能用于检测其他配基。
进一步，在靶分析物存在时MNA酶连接两个底物能构成级联反应的第一步。
实施例3：促进和抑制活性MNA酶或MNAi复合体装配的机制
MNA酶主要由部分酶组成，在一个或多个装配促进子存在时，部分酶装配形成活性酶(例如图1、2、4(右图)和图5(i和ii))。结合部分酶感应臂的装配促进子可以是靶分析物，或者可以是加入到反应混合物中以驱动MNA酶装配的合成的核酸分子。除了其有助于活性MNA酶装配的能力外，当与“活性抑制子”分子杂交时，部分酶能装配成无活性、非催化的MNAi复合体(图4(左图)和图5(iii)。测试各种可选寡核苷酸序列调控活性MNA酶或无活性MNAi复合体装配的能力。
本实施例中(描述于图4和5)，在以下存在时检查MNA酶的装配：(i)单个分子(装配促进子F1/2)，或(ii)两个分子(装配促进子组分F1和装配促进子组分F2)，其序列一起包含存在于促进子F1/2的序列。促进子F2结合一个部分酶的整个感应臂，并且重叠地结合第二部分酶感应臂的4个碱基对。在另一个反应中，测试具有包括促进子F2的序列以及其他活性抑制子结构域的序列的“活性抑制子”分子其驱动向无活性的MNAi复合体装配的反应的能力。
3.1部分酶寡核苷酸
部分酶A和部分酶B的序列显示于下文(5’至3’)。在下文的序列中，黑体的碱基与装配促进子杂交，加下划线的碱基形成装配的MNA酶的催化核心的一部分，斜体的碱基与底物杂交。“-P”表示寡核苷酸的3’磷酸化。
SEQ ID NO 6：部分酶A RO5A4/2-P： ACAACGA
SEQ ID NO 7：部分酶B RO5B5/2-P： GGCTAGCT
3.2报告底物
本实施例的报告底物是SubBi-2-FB，其5’至3’的序列如下文所示。SubBi-2-FB的5’末端用6-FAM部分末端标记，3’末端用BHQ1部分末端标记。以485nm(FAM激发波长)的激发在530nm(FAM发射波长)监测SubBi-2-FB的切割。小写字母的碱基代表RNA，大写字母的碱基代表DNA。
SEQ ID NO：4SubBi-2-FB：AAGGTTTCCTCguCCCTGGGCA
3.3调节寡核苷酸
本实施例中测试几个分子其调控MNA酶和/或MNAi复合体装配的能力。构成装配促进子F2的序列也包含在促进子F1/2和活性抑制子的序列内，并且为黑体和加下划线。
SEQ ID NO 8：装配促进子F1/2：GCAAGTGGGAAGGTGTAATCCGTCT
SEQ ID NO：9装配促进子F1：GCAAGTGGGAAGGTGTAATCCGTCT
SEQ ID NO：10装配促进子F2：
SEQ ID  NO：11活性抑制子分子：AAGGTTTCCTCGTCCCTGGGCA
3.4反应组分和监测MNA酶活性
对MNA酶活性的实时监测在BMG LabTech FluoStar荧光计上以50μL的总反应体积进行。反应在55℃下等温地监测4分钟。通过注入荧光底物SubBi-2-FB(10μl 1M的溶液)到含有如下的反应混合物中来起始反应：1x PCR BufferII(Applied Biosystems)、25mM MgCl2、200nM部分酶A RO5A4/2-P、200nM部分酶B RO5B5/2-P和(i)400nM装配促进子F1/2或(ii)400nM装配促进子组分F1和400nM装配促进子组分F2或(iii)400nM活性抑制子和400nM装配促进子组分F1，或(iv)没有装配促进子。
3.5结果：
使用各种调节或结构组分寡核苷酸的组合的结果显示于图5。指示高水平MNA酶切割活性的荧光信号的迅速增强可见于含有装配促进子F1/2(图5(i))或装配促进子组分F1和F2(图5(ii))的反应中。缺少促进子时没有观察到荧光随时间的增强(图5(iv))。这证明装配促进子不需要总是完整的寡核苷酸，而是可以分为在部分酶的一个感应臂上彼此邻近排列的多个更短的促进子组分。
在含有活性抑制子和促进子F1的反应中没有观察到荧光信号随时间的增强(图5(iii))。因为活性抑制子分子包括促进子F2的序列，那么与促进子F2邻近的其他非互补的抑制序列是驱动无活性MNAi复合体装配的元件。MNAi复合体能与底物结合，但是不能催化地修饰底物。因此，在MNAi复合体存在时底物不被切割，荧光不随时间增强(图5(iii))。含有装配促进子组分F1和F2的反应(图5(ii))与含有装配促进子F1和活性抑制子(加入F2序列)的反应(图5(iii))的比较证明活性抑制子内抑制结构域的存在能提供通过驱动无活性MNAi复合体的装配并阻止活性MNA酶的形成来调控酶活性的工具。
因此，设计为在装配促进子F1/2存在时形成的MNA酶产生荧光。本实施例证明装配促进子F1/2能被分为两个部分(装配促进子组分F1和F2)，并且保持指导催化上有活性的MNA酶装配的能力。两个装配促进子组分一起能稳定活性MNA酶的形成并产生荧光，条件是它们在部分酶感应臂上彼此邻近地结合。在相同反应条件下进行的随后的实验证明，在只有装配促进子组分F2存在时，没有观察到荧光随时间的增强(数据未显示)。因此，本实施例证明部分酶装配成活性MNA酶可要求多组分装配促进子的存在。当需要多组分装配促进子时，是否存在一个或多个这些组分可用来控制活性MNA酶的装配，因此启动和关闭它们。
进一步发现，活性抑制子分子能通过与部分酶杂交并破坏酶活性所需的部分酶感应臂上两个装配促进子组分连接处的二级结构来阻止MNA酶的装配(参见图4和5作为实例)。本领域的技术人员应理解，抑制分子能设计为与部分酶A或B杂交和与部分酶的感应臂或底物臂杂交。
包括活性抑制子、部分酶稳定臂组分和装配促进子或其组分的分子可用来调控活性MNA酶和无活性MNAi复合体的装配。激活(MNA酶)和失活(MNAi复合体)状态之间的转换能提供用于产生能通过活性和无活性构象之间的交替而被调控的分子开关的机制。此类分子开关可应用于控制核酸复制级联或调控自主治疗、诊断和计算分子级装置。能用来诱导特定寡核苷酸组分解离的各种方案讨论于整个文件。
实施例4：MNA酶检测包括诸如腺苷5’-三磷酸的小分子的非核酸分析物的应用
适体是从随机序列寡核苷酸的大库体外进化的、能以高亲和力和特异性结合靶分析物的单链DNA或RNA分子。根据其特异地结合许多类型分析物(包括蛋白质、碳水化合物、脂类、核苷酸、完整细胞和病毒)的能力来选择适体。本实施例中，适体序列被以其中仅在激活子配基存在时形成活性适体-MNA酶的构型加入部分酶(适体-部分酶)的末端。存在几种方式达到此目的，包括用在以下实施例中的策略，示于图7。
包括于本示例性适体-MNA酶检测策略的核酸寡核苷酸示于图7，并包括：
a)部分酶；
b)适体-部分酶，具有加入一个其末端的适体的部分酶；
c)装配促进子，与适体-部分酶和部分酶结合，使活性MNA酶装配；
d)底物，例如报告底物；和
e)装配抑制子寡核苷酸，与适体-部分酶在横跨适体序列的至少一部分和部分酶序列的底物结合臂的一部分的区域杂交。
在缺少激活子配基时(图7，图(i))，装配抑制子寡核苷酸与适体-部分酶结合，因此阻止其与底物结合。在存在激活子配基时(图7，图(ii))，激活子配基能与适体-部分酶的适体序列相互作用，因此阻止装配抑制子的结合，并允许活性适体-MNA酶装配，然后结合并切割底物。因此适体-MNA酶仅在存在激活子配基时形成并引起荧光信号的产生。
使用小分子ATP的检测证明了该策略。本实施例中使用的27个核苷酸的长适体序列先前报道为高度特异地结合ATP和dATP(Achenbach，等2005，Huizenga和Szostak，1995)。
4.1部分酶寡核苷酸、装配促进子和和抑制寡核苷酸
本实施例中，ATP适体序列与部分酶的底物臂相邻，以便产生适体-部分酶分子(图7)。适体-部分酶和另一个部分酶的感应臂设计为与包括在反应中的合成的装配促进子结合，以便当靶或调节分析物存在时驱动MNA酶的装配。适体-部分酶AtpA2/1和部分酶AtpB3/1的序列显示于下文(5’至3’)。在下文的序列中，黑体的碱基与装配促进子杂交，加下划线的碱基形成装配的MNA酶的催化核心的一部分，斜体的碱基与底物杂交。此外，部分酶AtpA2/1中纯文本的碱基表示能与ATP或dATP结合的DNA适体序列。
SEQ ID NO：12适体-部分酶A2AtpA2/1： CGGTCGAA CCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGGT
SEQ ID NO：13部分酶B3AtpB3/1： CCGAGC
装配促进子的序列如下显示(5’至3’)。
SEQ ID NO：14装配促进子AtpC/1：GTACACGGTACAGACCGTGCAGTGTACGTT
“装配抑制子”寡核苷酸的序列如下显示(5’至3’)。
SEQ ID NO：15装配抑制子AtpR/1：CCAGGTACTCACTATTT
4.2报告底物
通过双标记核酸报告底物的切割来监测适体-MNA酶的活性。本实施例的报告底物是SubBi-1-FB，其5’至3’的序列如下。小写字母的碱基代表RNA，大写字母的碱基代表DNA。加下划线的碱基表示5’末端6-FAM部分和3’末端BHQ1部分的位置。由于SubBi-1-FB在FAM和BHQ1之间核糖核苷酸的切割引起的荧光的改变用490nm的激发(FAM激发波长)在520nm(FAM发射波长)监测。
SEQ ID NO：16SubBi-1-FB：ACTCACTATaGGAAGAGATG
4.3靶或调节分析物和控制分子
用于本实施例的激活子配基是腺苷5’-三磷酸(ATP)和脱氧腺苷5’-三磷酸(dATP)。鸟苷5’-三磷酸(GTP)和胞嘧啶5’-三磷酸(CTP)用作阴性对照分子。所有分子购自Bioline。没有核酸酶的水用作没有分析物的对照。
4.4反应条件
通过由催化上有活性的适体-MNA酶对报告底物的切割引起的荧光信号的增强来测量激活子配基的存在。通过加入底物来起始反应，所有反应的总体积是50μL。在底物注入之前，所有反应在60℃预孵育5分钟(以便减少二级结构)。反应于47℃在FLUOstar OPTIMA(BMG Biotech)上进行。每3秒读每个反应的荧光，共持续10分钟。每个反应含有终浓度200nM AtpA2/1、200nM AtpB3/1、200nM AtpC/1、200nM AtpR/1、200nMSubBi-1-FB、25mM MgCl2、50mM Tris HCl pH 7.5和2mM ATP或dATP或GTP或CTP或没有分析物(水对照)。
4.5结果：SubBi-1-FB报告底物的检测和切割
在缺少ATP或dATP时，观察到不随时间增强的低水平的荧光，证明在ATP存在时，装配抑制子阻止活性适体-MNA酶复合体的装配。在ATP或dATP存在时，荧光信号更高并且随时间增强。这表明抑制子寡核苷酸被dATP和ATP替换，形成活性适体-MNA酶。适体-MNA的装配依赖于配基。在GTP或CTP存在时，观察到不随时间增强的低水平的荧光。在GTP或CTP存在时观察到的荧光类似于在缺少ATP或dATP时(即没有配基的水对照)观察到的荧光。本实施例证明MNA酶能与适体偶联，用于在高度特异于靶分析物的方法中检测分析物。本实施例进一步证明装配抑制子分子能用来控制适体-MNA酶的装配，并且例如ATP的分子能作为该系统的激活子配基或分子调控子。
本领域的技术人员将理解，该策略的设计是灵活的。适体可加入例如含有部分催化核心序列的两个部分酶的任一个的任一末端(5’或3’)。因此，装配抑制子能结合适体区域和底物臂(结合底物)或感应臂(结合装配促进子)。在前面的设计中(图7和本实施例)，抑制子阻抑底物的结合。在后面的设计中，抑制子将阻止装配促进子与适体-部分酶的结合，因此将阻止活性MNA酶的装配。
文献包含能检测许多类型分析物的许多适体的序列。这些包括蛋白质、碳水化合物、脂类、朊病毒、核苷酸、完整细胞和病毒。所有这些类型分析物的适体能与部分酶相连，检测多种分子。与分析物结合适体(或适体-部分酶)和MNA酶切割报告底物相容的反应条件(缓冲液、温度、二价阳离子浓度等)可通过经验测试来确定。
MNA酶的活性可通过去除或增加装配抑制子来调控。改变寡核苷酸序列、解链温度和或浓度能获得更精细的调控。MNA内装配抑制子的杂交受许多因素的影响，包括但不限于盐浓度、阳离子浓度、温度和是否存在添加剂(例如DMSO)。因此影响杂交的实体能提供控制MNA酶的装配和解装配的工具。
可通过组分的物理操作来去除装配促进子，其可例如通过开发作为分子“钩”的附着部分的物理特性和/或通过开发寡核苷酸的内在特性(例如负电荷或序列互补性)来获得。
MNA酶和适体-MNA酶可用于检测包括核酸靶和/或非核酸配基的靶分析物。进一步，它们能被用来以直接检测形式来检测分析物(如本实施例所证明)，或者它们能用在核酸酶级联反应中。在一个实施方案中，MNA酶和/或适体-MNA酶能促进级联的第一步。在一个实施方案中，核酸级联可使用能通过例如切割和/或连接来修饰一个或多个底物的MNA酶的组合，或MNA酶和DNA核酶的组合。
实施例5：使用具有连接酶活性的核酸酶和具有切割活性的核酸酶的级联反应
用于包含在级联反应中的反应和/或开发两个核酸酶的催化活性的分子开关列于图8。一个反应可由DNA核酶连接酶介导，该酶能连接具有2’，3’-环状磷酸的5’底物和具有5’羟基的3’底物，形成在两个底物连接处具有非天然2’-5’键合的连接产物。此类DNA核酶连接酶的实例是本领域已知的(参见概要表4)。其他反应可由MNA酶切割子介导，其可使用连接产物作为底物，并且能在连接产生的非天然2’-5’键合处切割连接产物。切割能产生两个切割产物：具有2’，3’-环状磷酸末端的5’产物和具有5’-羟基末端的3’产物。一个或两个切割产物能转而作为DNA核酶连接酶的一个或多个底物。
可选地，反应可由DNA核酶连接酶介导，该酶能连接具有2’，3’-二醇的5’底物和具有5’-三磷酸末端的3’底物，形成在两个底物的连接处具有天然3’-5’键合的连接产物。此类DNA核酶连接酶的实例是本领域已知的(参见概要表4)。其他反应可由MNA酶切割子介导，其可使用连接产物作为底物，并且能在连接产生的天然3’-5’键合处切割连接产物。切割能产生两个切割产物：具有2’，3’-环状磷酸末端的5’产物和具有5’-羟基末端的3’产物。一个或两个切割产物能转而作为能连接此末端的DNA核酶连接酶的一个或多个底物。
可选地，具有切割活性的MNA酶可在连接产物内并且不处于两个可连接底物连接处的位点切割，条件是该位点满足切割位点的要求。
在优选的形式(图8)，DNA核酶连接酶可连接第一寡核苷酸(oligo 1)与第二寡核苷酸(oligo 2)，产生第三连接产物(LP)寡核苷酸(oligo 3)，条件是oligo 1和oligo 2具有2’，3’-环状磷酸和5’-羟基末端。然后，LP-oligo3可被MNA酶切割为切割产物(CP)，CP-oligo 1和CP-oligo 2，因此再生了具有2’，3’-环状磷酸和5’-羟基末端、能参与其他轮连接的寡核苷酸。
在多重形式中，每个具有2’，3’-环状磷酸和5’-羟基末端的几个寡核苷酸(例如四个寡核苷酸)能由一系列DNA核酶连接酶连接为16个新的独特的LP序列(即寡核苷酸1、2、3和4的每种组合)。然后，一系列MNA酶能切割LP-oligo 1直至LP-oligo 16恢复成为组分寡核苷酸，现称为CP-oligo 1、CP-oligo 2、CP-oligo 3和CP-oligo 4。可选地，具有切割活性的MNA酶可在LP内并且不处于两个可连接底物连接处的位点切割，条件是该位点满足切割位点的要求。这种情况下，能产生、改组和/或重排寡核苷酸序列的复杂混合物。
一套MNA酶可使用图8中不变的装配促进子(如所示)，和/或MNA酶可使用来自前一轮连接的LP序列作为其装配促进子。因此，寡核苷酸的连接产生的新的信息(输入)数据可被MNA酶识别“读”。然后，MNA酶可切割“写”来产生新的输出产物和/或信息。其中MNA酶能读输入LP然后将其切割成CP-oligo(不同于最初在起始分子库中的寡核苷酸)的系统可用来重写或重新编码新的输出序列。
在一些实施方案中，DNA核酶的连接可例如通过制备新的装配促进子或其组分来“写”输入数据。MNA酶可通过使用部分酶感应臂询问装配促进子内编码的信息来“读”数据。然后MNA酶能“写”数据，例如新序列(例如切割产物)，因此产生然后能被DNA核酶连接酶“读”的新输出数据(例如通过确定MNA切割产物作为DNA核酶连接酶的连接底物的适合性)。
在其他实施方案中，MNA酶的切割能例如通过产生新的可连接产物来“写”输入数据。DNA核酶连接酶能通过使用底物结合臂询问底物内编码的信息来“读”数据。然后DNA核酶连接酶能例如通过制备新的连接产物序列来“写”数据。新的连接产物可作为形成活性MNA酶切割子所必需的组分，例如其可作为新的装配促进子或其组分。因此连接产物能提供然后能被MNA酶切割子“读”的新的输出数据(通过确定DNA核酶连接产物作为MNA酶切割子的装配促进子或装配促进子组分的适合性)。
因此，该MNA/DNA核酶连接酶级联能形成自动机器。根据确定的程序，此类装置能将一种形式的信息转变为另一种形式。在这种情况中，该程序将被MNA和DNA核酶连接酶的底物臂和/或感应臂编码和指导。
使用DNA和蛋白酶(限制性核酸内切酶和连接酶)，Benenson等，2001开发了能解决计算问题的自动机器。限制性核酸内切酶切割双链DNA，而蛋白连接酶连接级联反应中的切割产物。蛋白酶作为“硬件”，DNA编码“软件”。通过选择适当的DNA软件序列来程序化输入和自动机器。自动机器通过限制性核酸内切酶的切割、杂交和连接循环的级联来进行，产生编码自动机器的最终状态的可检测的输出分子，因此产生计算结果(Benenson等，2001)。
DNA核酶连接酶/MNA酶级联能以相似的模式用于Benenson等(2001)使用的级联，因此提供了能解决计算问题的装置。不同于Benenson的装置，DNA核酶连接酶/MNA酶级联不需要蛋白酶来获得同样的结果。尽管Benenson的装置由双链DNA程序化，DNA核酶连接酶/MNA酶级联将由各种序列编码，包括例如起始输入寡核苷酸、MNA酶的底物臂和/或感应臂和DNA核酶连接酶的底物臂。
在另一个实施方案中，DNA核酶连接酶/MNA酶级联也可用来“改组”寡核苷酸序列，作为构建和/或增加分子库多样性的方法。
在一些实施方案中，DNA核酶连接酶能用来产生或破坏MNA酶和/或无活性MNA的组分。作为实例，DNA连接酶能连接“活性抑制子”与“装配促进子组分”，导致MNAi复合体的装配(“关闭”状态)。可选地，DNA核酶连接酶能连接感应臂或底物臂与部分酶组分通过促进装配产生MNA酶的“启动”开关。在另一个实施方案中，DNA核酶连接酶可与用允许寡核苷酸被选择地捕获的部分标记的序列相连，例如使用生物素基团，或者部分可含有射频磁场辐射以便有助于杂交的远程电子控制。该方法可允许选择性地去除允许酶活性激活或抑制的组分分子。例如，活性抑制子可选择性地从MNAi复合体变性，导致转换为活性MNA酶状态。
应理解，本实施例中使用的DNA核酶连接酶(如图8所示)能被MNA连接酶(如图11所示)替换。
实施例6：开发多个核酸酶活性的反应示例，本实施例中特别是切割核酸底物的MNA酶和连接核酸底物的DNA核酶，其中由一类核酸酶产生的切割或连接产物形成参与下一个核酸酶反应的新底物或酶组分。
本实施例中使用的策略示于图9。本实施例证明(i)使用靶核酸来指导能切割底物(MNA酶底物A)的MNA酶(MNA酶A)的形成，因此产生能转而用作具有连接酶活性的DNA核酶B的底物的5’切割产物；(ii)使用DNA核酶连接酶B连接步骤(i)中产生的5’切割产物与另一个寡核苷酸连接底物，因此产生新的部分酶；和(iii)使用步骤(ii)中产生的新的部分酶/连接产物来形成能切割底物(MNA酶底物C)新的MNA酶(MNA酶C)。本实施例中，用荧光团和猝灭剂染料对标记MNA酶底物C允许对反应的荧光监测。
先前报道本实施例中使用的DNA核酶连接酶B通过由2’，3’-环状磷酸和5’-羟基基团形成2’-5’磷酸二酯键合来连接RNA(Prior等，2004)。除了要求具有2’，3’-环状磷酸末端的5’底物，本实施例中使用的DNA核酶连接酶还要求连接处特定的序列基序，即ua*g(A或G)(其中小写字母表示RNA碱基，大写字母表示RNA或DNA碱基，*表示连接位点)。
在第一步中，在靶核酸存在时形成MNA酶A，该酶用来切割MNA酶底物A(preSub5)，因此产生具有2’，3’-环状磷酸末端的切割片段。在第二步中，然后DNA核酶连接酶被用来连接5’产物A(preSub5切割片段)与另一个寡核苷酸连接底物(preSub3)。在第三步中，连接产物作为新的部分酶起作用，其与第二部分酶和装配促进子一起能形成MNA酶C，并切割荧光标记的底物C(SubBi-2-FB)。
6.1 DNA核酶连接酶B
作为DNA核酶连接酶的DNA寡核苷酸序列列于下文。
SEQ ID NO：17DNA核酶连接酶7Z81-10/10：
CCTCTCGTTGACGGCGGAGTGATTGGGAGGTTAGCTCTAGTGAGTGC
6.2部分酶寡核苷酸
以下序列中，黑体的碱基与靶核酸序列杂交，加下划线的碱基形成装配的MNA酶的催化核心的一部分，斜体的碱基与底物杂交。
以下是形成MNA酶A组分的部分酶序列：
SEQ ID NO：18部分酶A2/MNA酶A miR20A2/1：
CGGTCGAA
SEQ ID NO：19部分酶B3/MNA酶A miR20B3/1：
CCGAGC
以下序列对应于与连接产物/部分酶缔合形成MNA酶C组分的部分酶。
SEQ ID NO：20部分酶B5/MNA酶C STB5/2(21)：
GGCTAGCT
6.3 MNA酶底物A(MNA酶4的底物)
以下序列中，小写字母的碱基代表RNA，大写字母碱基代表DNA。
SEQ ID NO：21preSub5：
CTGTAGCACTCACTAuaGGAAGAGATG
6.4 DNA核酶连接酶底物
以下序列中，小写字母的碱基代表RNA，大写字母碱基代表DNA。具有以下序列和5’羟基基团的3’DNA核酶连接酶底物被合成：
SEQ ID NO：22preSub3：
gGAACAACGAGAGGAAACCTT
6.5 MNA酶底物C(MNA酶C的荧光报告底物)
本实施例中使用的报告底物是SubBi-2。本实施例中，SubBi-2的5’末端用6-FAM部分末端标记，3’末端用BHQ1部分末端标记，称为SubBi-2-FB。以490nm(FAM激发波长)的激发在520nm(FAM发射波长)监测SubBi-2-FB的切割。SubBi-2-FB的序列列于下文(5’至3’)；小写字母的碱基代表RNA，大写字母的碱基代表DNA。
SEQ ID NO：4SubBi-2-FB：AAGGTTTCCTCguCCCTGGGCA
6.6 MNA酶4的靶序列
MNA酶A识别的靶序列是与人微小RNA miR-20RNA序列同源的合成的DNA寡核苷酸。其具有以下序列：
SEQ ID NO：23D-20靶(MNA酶A的靶)：
TAAAGTGCTTATAGTGCAGGTA
6.7 MNA酶C的装配促进子
MNA酶C形成所需的装配促进子是具有以下序列的合成的DNA寡核苷酸：
SEQ ID NO：24MNA酶C的装配促进子：
CGACGACCACTCCGACGACAGTCCTATAGTGAGTGCTACAG
6.8反应条件
反应如下文所述以三个连续步骤(i)、(ii)和(iii)在三个单独的管中进行。
(i)MNA酶A切割preSub5产生具有所需2’，3’-环状磷酸末端的5’切割产物/连接底物在40℃下在总反应体积为100μl中进行1小时。反应含有500nM preSub5、50mM Tris HCl(pH 9.0，25℃)、25mM MgCl2和：
a)MNA酶A的部分酶(100nM miR20A2/1和100nM miR20B3/1)和100nM D-20靶；或
b)没有其他寡核苷酸(没有切割的对照)
(ii)连接在40℃下在总反应体积为25μl中进行2小时。反应含有10μl前面切割反应的混合物(i-a)或(i-b)、200nM preSub3、150mM NaCl、2mM KCl、50mM Tris HCl(pH 9.0，于25℃)和40mM MgCl2和：
a)200nM DNA核酶连接酶7Z81-10/10，或
b)没有其他寡核苷酸(没有连接的对照)
(iii)由于由连接形成的部分酶介导的MNA酶的切割的终点荧光检测等温地在55℃下在Cepheid Smartcycler上进行45分钟。通过加入荧光标记的底物SubBi-2-FB来起始反应。反应含有10μl前面连接反应的混合物、200nM部分酶STB5/2(21)、200nM MNA酶C的装配促进子、50mMTris HCl(pH 9.0，于25℃)、25mM MgCl2和200nM底物SubBi-2-FB，于总反应体积25μl。
对含有以下寡核苷酸试剂的反应，随时间监测由于MNA酶底物C(SubBi-2-FB)的切割引起的荧光增强(表6)。
表6.随时间监测的MNA酶底物C(SubBi-2-FB)切割引起的荧光的增强。
  步骤(i)   步骤(ii)  步骤(iii)   结果
  反应1(测试i-a、ii-a)   *底物A*MNA酶A部分酶*靶   *来自步骤(i)的10ul*连接酶底物*DNA核酶连接酶  *来自步骤(ii)的10ul*MNA酶C的部分酶B*底物C*装配促进子C   观察到荧光随时间增强
  反应2(对照(i-b，ii-a-没有MNA酶A)   *底物A   *来自步骤(i)的10μl*连接酶底物*DNA核酶连接酶  *来自步骤(ii)的10μl*MNA酶C的部分酶B*底物C*装配促进子C   没有观察到荧光随时间增强
  反应3(对照(i-a，ii-b)-没有DNA核酶连接酶)   *底物A*MNA酶A部分酶*靶   *来自步骤(i)的10μl*连接酶底物  *来自步骤(ii)的10μl*MNA酶C的部分酶B*底物C*装配促进子C   没有观察到荧光随时间增强
测量反应1、2和3的步骤(iii)荧光随时间的增强(表6)。含有步骤(i)、(ii)和(iii)的所有寡核苷酸反应组分的反应1显示了荧光随时间的增强。相反，缺少步骤(i)的MNA酶A寡核苷酸部分酶组分和MNA酶A的靶序列的反应2没有显示荧光随时间的增强。相似地，缺少步骤(ii)所需的DNA核酶连接酶寡核苷酸的反应3没有显示荧光随时间的增强。这些反应一起表明以下事件发生在反应1中。
首先，在特定靶(D-20)存在时MNA酶A切割MNA酶底物A产生两个片段，其中一个片段是具有2’，3’-环状磷酸末端的序列为CTGTAGCACTCACTAua(SEQ ID NO：40)的5’片段。第二，该5’片段与存在于步骤(ii)的反应混合物中的第二寡核苷酸连接酶底物连接，这导致序列为CTGTAGCACTCACTAuagGAACAACGAGAGGAAACCTT(SEQ ID NO：51)的新的寡核苷酸(连接产物)的形成(其中大写字母代表DNA碱基，小写字母代表RNA碱基)。然后该连接产物作为MNA酶C的部分酶组分起作用。该新产生的部分酶在装配促进子存在时与第二部分酶缔合产生MNA酶C。MNA酶C切割MNA酶底物C(SubBi-2-FB)导致荧光团/猝灭剂染料对分开，因此引起荧光的增强。
“没有MNA酶A切割”的对照(反应2)说明具有2’，3’-环状磷酸末端的5’片段的切割和产生对随后的连接和形成MNA酶C所需的一个部分酶是必需的。“没有连接”的对照(反应3)说明具有2’，3’-环状磷酸末端的5’切割产物与第二3’连接酶底物的连接对MNA酶C的一个组分的形成是必需的。
本实施例中说明的策略允许检测级联反应中的靶分析物，该级联反应使用两类核酸酶，即能连接底物的DNA核酶(DNA核酶连接酶)和能切割底物的MNA酶(MNA酶切割子)。级联中每个酶促步骤的多次周转能允许信号的扩增。
本实施例中说明和图9所示的级联策略可扩展并用来产生反馈扩增级联。如果5’切割产物C的序列与5’切割产物A相同，那么该产物也能作为5’底物B，反馈级联反应能被起始。该反应中，MNA酶切割子C将一直产生5’底物B，该产物然后由DNA核酶连接酶B连接产生用于更多MNA酶切割子C形成的更多部分酶。该策略能提供用于在能指导MNA酶切割子A装配的装配促进子(例如靶分析物)起始反应之后进行反馈扩增的机制。该策略将允许检测靶分析物，然后通过使用两种类型核酸酶(即能连接底物的DNA核酶(DNA核酶连接酶)和能切割底物的MNA酶(MNA酶切割子))的反馈级联进行信号扩增。
本领域的技术人员将理解，该基本级联策略存在许多变体。作为实例，DNA核酶B能被用来产生作为可具有例如切割、连接或其他酶活性的另一个MNA酶的装配促进子的连接产物。进一步的改变包括于整个说明书。
实施例7.允许具有连接酶活性的MNA酶的形成的序列和条件以及以用于级联反应中的形式来测试这些具有连接酶活性的MNA酶。
本实施例中DNA核酶连接酶7Q10用作产生候选MNA连接酶部分酶序列的基础。如图10所示，每个连接酶部分酶包含三个序列结构域，包括(i)与装配促进子(例如靶核酸)杂交的感应臂，(ii)构成催化核心一部分的结构域和(iii)底物结合臂。部分核心序列设计为加入7Q10 DNA核酶连接酶的催化区域部分，先前报道该DNA核酶连接酶通过从2’，3’-环状磷酸和5’-羟基基团形成2’-5’磷酸二酯键合来连接RNA(Flynn-Charlebois等，2003)。
多步试验用来评估候选部分酶序列组合的酶活性。一般策略列于图12，也能形成信号扩增技术的基础。在第一步，在装配促进子A存在时形成MNA酶A，该酶用来切割MNA酶底物A，因此产生具有2’，3’-环状磷酸末端的5’切割产物A。在第二步，在装配促进子B存在时具有连接酶活性的活性MNA酶B装配，然后连接5’产物A(5’底物B)和3’底物B。在第三步，连接产物B作为新的部分酶起作用，该部分酶与另一个部分酶和装配促进子C一起能形成MNA酶C，然后切割可例如被荧光标记的底物C。测定几个连接酶部分酶对的催化活性。
7.1加入对应于具有连接酶活性的DNA核酶(7Q10)的不完整催化核心序列的结构域的部分酶寡核苷酸。
本实验，第二步的一系列部分酶对都用设计为与装配促进子(AFMzLB)杂交的感应臂和用设计为与两个底物序列5LsubB和3LsubB杂交的底物臂来合成。本实验中使用的部分酶对的序列列于下文(5’至3’)。加下划线的碱基形成装配的候选MNA酶的催化核心的一部分，黑体的碱基(感应结构域)与装配促进子杂交，斜体的碱基(底物结构域)与底物杂交。
SEQ ID NO：25 Split 1部分酶A-RO5LS1A：
GGCTC
SEQ ID NO：26Split 1部分酶B-RO5LS1B：
ACGTGGAGGTG
SEQ ID NO：27Split 2部分酶A-RO5LS2A：
GGGCTC
SEQ ID NO：28Split 2部分酶B-RO5LS2B：
ACGTGGAGGT
SEQ ID NO：29Split 3部分酶A-RO5LS3A：
TGGGCTC
SEQ ID NO：30Split 3部分酶B-RO5LS3B：
ACGTGGAGG
SEQ ID NO：31Split 4部分酶A-RO5LS4A：
TGGAGGTGGGCTC
SEQ ID NO：32Split 4部分酶B-RO5LS4B：
ACG
SEQ ID NO：33Split 5部分酶A-RO5LS5A：
GGAGGTGGGCTC
SEQ ID NO：34Split 5部分酶B-RO5LS5B：
ACGT
SEQ ID NO：35Split 6部分酶A-RO5LS6A：
GTGGAGGTGGGCTC
SEQ ID NO：36Split 6部分酶B-RO5LS6B：
AC
SEQ ID NO：37Split 7部分酶A-RO5LS7A：
GAGGTGGGCTC
SEQ ID NO：38Split 7部分酶B-RO5LS7B：
ACGTG
7.2控制具有连接酶活性的DNA核酶。
具有设计为与底物序列5LsubB和3LsubB杂交的底物臂的DNA核酶连接酶7Q10在本实验中使用，其序列列于下文(5’至3’)。加下划线的碱基形成催化核心，斜体的碱基与底物杂交。
SEQ ID NO：39DNA核酶连接酶-7Q10-10/10：
ACGTGGAGGTGGGCTC
7.3MNA酶底物A(MNA酶4的底物)
以下序列中，小写字母的碱基代表RNA，大写字母的碱基代表DNA。
SEQ ID NO：21SubA/Pre5LSubB：
CTGTAGCACTCACTAuaGGAAGAGATG
7.4用于连接的3’底物B
本实验中使用的用于连接的3’底物序列列于下文(5’至3’)。该寡核苷酸具有5’羟基基团。小写字母的碱基代表RNA，大写字母的碱基代表DNA。
SEQ ID NO：22连接酶3’底物B-3LSubB：
gGAACAACGAGAGGAAACCTT
7.5MNA酶C的底物(用于检测的荧光报告底物C)
本实施例中使用的报告底物是SubBi-2。本实施例中，SubBi-2的5’末端用6-FAM部分末端标记，3’末端用BHQ1部分末端标记，称为SubBi-2-FB。以490nm(FAM激发波长)的激发在520nm(FAM发射波长)监测SubBi-2-FB的切割。SubBi-2-FB的序列列于下文(5’至3’)；小写字母的碱基代表RNA，大写字母的碱基代表DNA。
SEQ ID NO：4SubBi-2-FB：AAGGTTTCCTCguCCCTGGGCA
7.6装配促进子
MNA酶A感应结构域识别的装配促进子A是具有以下序列的合成的DNA寡核苷酸：
SEQ ID NO：42AF-MzCA：
CGTCGTGAGATGAGGAAGAGATGGATGGGCAC
MNA酶B感应结构域识别的装配促进子B是具有以下序列的合成的DNA寡核苷酸：
SEQ ID NO：43AF-MzLB：
AAGGTGTAATCCGTCTCCACAGACAAGGCCAGGACTCGTTTG
MNA酶C感应结构域识别的装配促进子C是具有以下序列的合成的DNA寡核苷酸：
SEQ ID NO：24AF-MzCC：
CGACGACCACTCCGACGACAGTCCTATAGTGAGTGCTACAG
7.7具有切割活性的MNA酶部分酶
MNA酶A的部分酶用以下序列来合成：
SEQ ID NO：45部分酶A/MNA酶A-4SyntA2/1(16)：
GTGCCCATCCATCTCCGGTCGAAATAGTGAGT
SEQ ID NO：46部分酶B/MNA酶A-4SyntB3/1(16)：
CATCTCTTCTCCGAGCTTCCTCATCTCACGACG
MNA酶C的一个部分酶用以下序列来合成：
SEQ ID NO：20部分酶B/MNA酶C-STB5/2(21)
TGCCCAGGGAGGCTAGCTCTGTCGTCGGAGTGGTCGTCG
7.8连接酶活性的检测
7.8.1反应条件
反应如下文所述以三个连续步骤(i)、(ii)和(iii)在三个单独的管中进行。
(i)MNA酶A切割SubA/pre5LSubB产生具有所需2’，3’-环状磷酸末端的5’连接酶底物(5LSubB)在40℃下进行1小时。反应含有100nM部分酶4SyntA2/1(16)、100nM部分酶4SyntB3/1(16)、100nM装配促进子AF-MzCA、500nM SubA/Pre5LSubB、50mM Tris HCl(pH 9.0，于25℃)和50mM MgCl2。
(ii)连接在40℃下在总反应体积为25μl中进行2小时。反应含有10μl来自步骤(i)的前面切割反应的混合物、200nM 3LSubB、200nMAF-MzLB、150mM NaCl、2mM KCl、50mM Tris HCl(pH 9.0，于25℃)和40mM MgCl2和：
a)200nM对照DNA核酶连接酶7Q10-10/10，或
b)各自200nM的Split 1部分酶A和B(RO5LS 1A和RO5LS1B)，或
c)各自200nM的Split 2部分酶A和B(RO5LS2A和RO5LS2B)，或
d)各自200nM的Split 3部分酶A和B(RO5LS3A和RO5LS3B)，或
e)各自200nM的Split 4部分酶A和B(RO5LS4A和RO5LS4B)，或
f)各自200nM的Split 5部分酶A和B(RO5LS5A和RO5LS5B)，或
g)各自200nM的Split 6部分酶A和B(RO5LS6A和RO5LS6B)，或
h)各自200nM的Split 7部分酶A和B(RO5LS7A和RO5LS7B)，或
i)各自200nM的Split 2部分酶A(RO5LS2A)和Split 4部分酶B(RO5LS4B)。
其他“没有5’连接底物”的对照反应缺少10μl来自步骤(i)的切割反应混合物。该反应混合物含有200nM 3LSubB、各自200nM的Split 4部分酶A和B(RO5LS4A和RO5LS4B)、150mM NaCl、2mM KCl、50mM TrisHCl(pH 9.0，于25℃)、40mM MgCl2、200nM AF-MzLB和200nMSubA/Pre5LsubB
(iii)步骤(ii)的连接形成的部分酶介导的MNA酶C的切割引起的荧光检测等温地在55℃下在Cepheid Smartcycler上进行达3.5小时，以5分钟的间隔作为数据收集点。通过加入荧光标记的底物SubBi-2-FB来起始反应。反应含有10μl前面连接反应的混合物(ii-a或ii-b或ii-c或ii-d或ii-e或ii-f或ii-g或ii-h或ii-i或“没有连接底物”的对照)、200nM MNA酶C的部分酶B(STB5/2(21))、200nM MNA酶C的装配促进子(AF-MzCC)、50mM Tris HCl(pH 9.0，于25℃)、25mM MgCl2和200nM底物SubBi-2-FB，于总反应体积25μl。随反应时间监测MNA酶底物C(SubBi-2-FB)的切割引起的荧光的增强。
7.8.2结果
a)对照反应
DNA核酶连接酶反应的正对照(步骤i、ii-a和iii)显示荧光随时间的增强。该反应确认了MNA酶A能形成并切割SubA/Pre5LsubB，产生具有使其适合用作DNA核酶连接酶底物的2’，3’-环状磷酸的产物(5LsubB)。5LsubB的序列为CTGTAGCACTCACTAua(SEQ ID NO：40)，其中大写字母代表DNA碱基，小写字母代表RNA碱基。该对照反应证明单分子DNA核酶连接酶7Q10-10/10连接5LsubB和3LsubB，并形成新的寡核苷酸(连接产物)，其序列为CTGTAGCACTCACTAuagGAACAACGAGAGGAAACCTT(SEQ ID NO：51)(其中大写字母代表DNA碱基，小写字母代表RNA碱基)。然后该连接产物作为切割底物C(SubBi-2-FB)的MNA酶C的部分酶组分起作用，导致荧光的增强。荧光的这种增强作为连接酶活性的替代标记。
“没有5’连接底物”的对照反应(仅步骤ii和iii)不显示荧光随时间的增强。这证明如果SubA/Pre5LsubB不被MNA酶A切割产生5LsubB，那么没有适当的5’连接底物可用于与3LSubB连接。因此不产生MNA酶C的部分酶，并且没有观察到荧光的增强。
b)当使用可具有或可不具有形成功能性MNA连接酶的能力的候选部分酶对时，设计用来测试连接酶活性存在的反应。
加入步骤i和iii以及步骤ii-e(Split 4)或ii-f(Split 5)的反应显示了荧光随时间的增强。在这些位置分离DNA核酶连接酶7Q10的催化核心，然后在装配促进子存在时重新装配部分酶中的部分核心，在这些反应条件下这产生了活性MNA连接酶。
加入步骤i和iii以及步骤ii-b(Split 1)或ii-c(Split 2)或ii-d(Split 3)或ii-g(Split 6)或ii-h(Split 7)或ii-i(Split 2/4)的反应在通过MNA酶C的切割监测35分钟后，没有显示荧光的增强。这证明在这些位置分离DNA核酶连接酶7Q10的催化核心，然后重新装配部分核心与装配促进子，在这些反应条件下这不产生可检测的MNA连接酶活性。
本实施例产生了能用来装配MNA复合体的许多部分酶序列，取决于特定序列及其组合，这些MNA复合体无活性或具有各种水平的酶活性。测试的候选部分酶序列的一般设计概述于表7。
表7.测试的部分酶序列的一般设计。
包括如上文所述具有等同于Split 4或Split 5的split的实例的活性MNA酶将具有广泛的应用。作为实例，MNA连接酶可用来检测靶分析物。MNA连接酶可设计为只有在存在诸如RNA或DNA靶序列(装配促进子)的分析物时装配。如果5’连接底物和3’连接底物每个分别用荧光团和猝灭剂染料标记(或反之亦然)，那么连接将导致可作为靶分析物存在的指示的荧光的减弱。在可选形式中，如果5’连接底物用例如荧光团的可检测部分标记，3’连接底物连接到不同的位置(例如芯片或珠上)，那么在靶分析物存在时，连接将导致在不同位置处信号的出现。
本实施例中用来测定连接酶活性的策略示于图12。一旦鉴定了活性部分酶，那么相同的级联反应可用来检测例如靶分析物的装配促进子的存在。允许检测的级联反应使用两类核酸酶，即能连接底物的MNA酶和能切割底物的MNA酶。级联中每个酶促步骤的多次周转可允许信号的扩增。
本实施例中证明以及图12所示的级联可被扩展并用来产生反馈扩增级联。如果5’切割产物C的序列与5’切割产物A的序列相同，那么该产物也能作为5’底物B，反馈级联反应可被起始。该反应中，MNA酶切割子C能一直产生5’底物B，然后该底物被MNA连接酶B连接，产生用于形成更多MNA酶切割子C的更多部分酶。该策略可提供用于在能指导MNA酶切割子A装配的靶分析物起始反应之后反馈扩增的机制。该策略将允许检测靶分析物，然后使用两类MNA酶(即MNA连接酶和MNA酶切割子)通过反馈级联进行信号扩增。
进一步，本实施例也可作为其中起始步骤导致具有连接酶活性的MNA酶形成的反应的实例，在这种情况中，参考图12，起始靶核酸将是装配促进子B(AF-MzLB)，装配促进子A(AF-MzCA)是包括其中以驱动MNA酶A装配的合成分子。然后MNA酶A将具有在反应中产生具有2’3’环状磷酸末端的5’可连接底物B的唯一目的，然后将该底物加入到反应中，使用具有连接酶活性的MNA酶B来检测靶装配促进子B。这能提供产生合成很昂贵并且相对不稳定的具有2’3’环状磷酸末端的底物的实践方法。进一步，MNA酶A部分酶和装配促进子A能被具有切割活性的DNA核酶替换，该酶存在于用于产生可连接底物的单独的初步反应中，或者该DNA核酶可存在于与具有连接酶活性的MNA酶相同的反应混合物中。实施例11证明，使用MNA酶和DNA核酶组合的切割和连接可在单个反应混合物中进行。
本领域的技术人员将理解，该基本级联策略存在许多变体。作为实例，MNA酶B可用来产生作为具有切割、连接或其他酶促活性的另一个MNA酶的装配促进子的连接产物。在另一个实施例中，MNA酶C能通过除切割外的方法修饰底物。其他实施方案包括于整个说明书。
实施例8：使用具有连接酶活性的第二MNA酶来在活性MNA酶的“启动状态”和MNAi复合体的“关闭状态”之间转换MNA复合体的示例性策略。
图13示例了使用具有连接酶活性的第二MNA酶来在活性MNA酶的“启动状态”和MNAi复合体的“关闭状态”之间转换MNA复合体的示例性策略。该策略中，在装配促进子组分1(AFC 1)和装配促进子组分2(AFC 2)存在时，能形成能修饰(例如切割或连接)底物A的活性MNA酶A。在例如可包含一个或多个组分的装配促进子3(AF3)存在时，能形成具有连接酶活性的第二MNA酶B，然后该酶能连接AFC 2与活性抑制子组分(AIC)，引起活性抑制子(AI)的形成。该AI能与MNA酶A的部分酶组分结合，导致无活性的MNAi A复合体的形成。因此，本实施例中的MNA连接酶可作为关闭开关来失活MNA酶A。无活性的MNAi复合体和催化上有活性的MNA酶将代表装配组分的两种交替的状态，即分别是“关闭”状态和“启动”状态。
实施例9.允许具有连接酶活性的MNA酶形成的序列和条件，以及以信号扩增级联中使用的形式来测试这些具有连接酶活性的MNA酶。
本实施例中，DNA核酶连接酶7Z81用作产生候选MNA连接酶部分酶序列的基础。如图10所示，每个连接酶部分酶包含三个序列结构域，包括(i)与装配促进子(例如靶核酸)杂交的感应臂，(ii)构成催化核心的一部分的结构域和(iii)底物结合臂。部分核心序列设计为加入7Z81DNA核酶连接酶的催化区域部分，先前报道该酶通过从2’，3’-环状磷酸和5’-羟基基团形成2’-5’磷酸二酯键合来连接RNA(Prior等，2004)。
多步测定用来评估候选部分酶序列组合的酶活性。一般策略列于图12，并且也能形成信号扩增技术的基础。在第一步，在装配促进子A存在时形成MNA酶A，该酶用来切割MNA酶底物A，因此产生具有2’，3’-环状磷酸末端的5’切割产物A。在第二步，在装配促进子B存在时，具有连接酶活性的MNA酶B装配，然后连接5’产物A(5’底物B)与3’底物B。在第三步，连接的产物B作为新的部分酶起作用，其与另一个部分酶和装配促进子C一起能形成MNA酶C，然后切割可例如被荧光标记的底物C。几个候选连接酶部分酶对的催化活性被测定。
9.1加入对应于具有连接酶活性的DNA核酶(7Z81)的不完整催化核心序列的结构域的部分酶寡核苷酸。
本实验中，第二步的一系列部分酶对都用设计为与装配促进子(AFMzLB)杂交的感应臂和用设计为与两个底物序列5LsubB和3LsubB杂交的底物臂来合成。本实验中使用的部分酶对的序列列于下文(5’至3’)。加下划线的碱基形成装配的候选MNA酶的催化核心的一部分，黑体的碱基(感应结构域)与装配促进子杂交，斜体的碱基(底物结构域)与底物杂交。
SEQ ID NO：55 Split 1部分酶A-RO5S1A：
GGAGGTTAGCTC
SEQ ID NO：56 Split 1部分酶B-RO5S1B：
ACGGCGGAGTGATTG
SEQ ID NO：57 Split 2部分酶A-RO5S2A：
TGGGAGGTTAGCTC
SEQ ID NO：58 Split 2部分酶B-RO5S2B：
ACGGCGGAGTGAT
SEQ ID NO：59 Split 3部分酶A-RO5S3A：
ATTGGGAGGTTAGCTC
SEQ ID NO：60 Split 3部分酶B-RO5S3B：
ACGGCGGAGTG
SEQ ID NO：61 Split 4部分酶A-RO5S4A：
TGATTGGGAGGTTAGCTC
SEQ ID NO：62 Split 4部分酶B-RO5S4B：
ACGGCGGAG
SEQ ID NO：63 Split 5部分酶A-RO5S5A：
AGTGATTGGGAGGTTAGCTCT
SEQ ID NO：64 Split 5部分酶B-RO5S5B：
ACGGCGG
SEQ ID NO：65 Split 6部分酶A-RO5S6A：
GGAGTGATTGGGAGGTTAGC TC
SEQ ID NO：66 Split 6部分酶B-RO5S6B：
ACGGC
9.2具有连接酶活性的对照DNA核酶
先前报道本实施例中使用的DNA核酶连接酶使用具有2’，3’-环状磷酸的5’连接底物和具有5’-羟基基团的3’连接底物来连接RNA并形成2’-5’磷酸二酯键合(Prior等，2004)。除了需要底物上特定的末端，本实施例中使用的DNA核酶连接酶还需要在连接处特定的序列基序。
本实验中使用具有设计为与底物序列5LsubB和3LSubB杂交的底物臂的DNA核酶连接酶7Z81，其序列列于下文(5’至3’)。加下划线的碱基形成催化核心，斜体的碱基与底物杂交。
SEQ ID NO：17DNA核酶连接酶-7Z81-10/10：
ACGGCGGAGTGATTGGGAGGTTAGCTC
9.3MNA酶底物A(MNA酶A的底物)
底物A(Pre5LSubB2-FB)的序列如下。其内部地用6-FAM部分标记5’核糖碱基，用BHQ1部分标记3’核糖碱基(加下划线的碱基)。小写字母碱基代表RNA，大写字母碱基代表DNA。
SEQ ID NO：67底物A-Pre5LSubB2-FB：
CTGTAGCACTCACTAuaGGAAGAGATGAG
9.4用于连接的3’底物B
本实验中使用的用于连接的3’底物序列列于下文(5’至3’)。该寡核苷酸具有5’羟基基团。小写字母的碱基代表RNA，大写字母的碱基代表DNA。
SEQ ID NO：22连接酶3’底物B-3LSubB：
gGAACAACGAGAGGAAACCTT
9.5MNA酶C的底物(用于检测的荧光报告底物C)
本实施例中使用的报告底物是SubBi-2。本实施例中，SubBi-2的5’末端用Quasar 670部分末端标记，3’末端用BHQ2部分末端标记，称为SubBi-2-Q6B2。用635nm的激发在665nm监测SubBi-2-Q6B2的切割。SubBi-2-Q6B2的序列列于下文(5’至3’)；小写字母的碱基代表RNA和大写字母的碱基代表DNA。
SEQ ID NO：4SubBi-2-Q6B2：AAGGTTTCCTCguCCCTGGGCA
9.6装配促进子
MNA酶A的感应结构域识别的装配促进子A是具有以下序列的合成的DNA寡核苷酸：
SEQ ID NO：68AF-MzCA2：
GCCATTGTCGAACACCTGCTGGATGACCAGC
MNA酶B的感应结构域识别的装配促进子B是具有以下序列的合成的DNA寡核苷酸：
SEQ ID NO：43AF-MzLB：
AAGGTGTAATCCGTCTCCACAGACAAGGCCAGGACTCGTTTG
MNA酶C的感应结构域识别的装配促进子C是具有以下序列的合成的DNA寡核苷酸：
SEQ ID NO：24AF-MzCC：
CGACGACCACTCCGACGACAGTCCTATAGTGAGTGCTACAG
9.7具有切割活性的MNA酶的部分酶
用以下序列来合成MNA酶A的部分酶：
SEQ ID NO：69部分酶A/MNA酶1-RO4A2/1(11)；
CGGTCGAAA
SEQ ID NO：70部分酶B/MNA酶1-RO4B3/1(12)：
CCGAGC
用以下序列来合成MNA酶C的一个部分酶：
SEQ ID NO：20部分酶B/MNA酶C-STB5/2(21)
TGCCCAGGGAGGCTAGCTCTGTCGTCGGAGTGGTCGTCG
9.8连接酶活性的检测
9.8.1反应条件
反应如下文所述以三个连续步骤(i)、(ii)和(iii)在三个单独的管中进行。
(i)MNA酶A切割Pre5LSubB2-FB产生具有所需2’，3’-环状磷酸末端的5’连接底物(5LSubB)在40℃下进行1小时。反应含有50nM部分酶RO4A2/1(11)、50nM部分酶RO4B3/1(12)、100nM装配促进子AF-MzCA2、1000nM Pre5LSubB2-FB、50mM Tris HCl(pH 9.0，于25℃)和40mM MgCl2。
(ii)连接在40℃下在总反应体积为25μl中进行2小时。反应含有10μl来自步骤(i)的切割反应的混合物、1000nM 3LSubB、500nMAF-MzLB、150mM NaCl、2mM KCl、50mM Tris HCl(pH 9.0，于25℃)和40mM MgCl2和或者：
a)500nM对照DNA核酶连接酶7Z81-10/10，或
b)各自500nM的Split 1部分酶A和B(RO5S1A和RO5S1B)，或
c)各自500nM的Split 2部分酶A和B(RO5S2A和RO5S2B)，或
d)各自500nM的Split 3部分酶A和B(RO5S3A和RO5S3B)，或
e)各自500nM的Split 4部分酶A和B(RO5S4A和RO5S4B)，或
f)各自500nM的Split 5部分酶A和B(RO5S5A和RO5S5B)，或
g)各自500nM的Split 6部分酶A和B(RO5S6A和RO5S6B)，或
h)没有DNA核酶或部分酶(没有连接酶的对照)
(iii)由于由步骤(ii)的连接形成的部分酶介导的MNA酶C的切割的荧光检测等温地在55℃下在Cepheid Smartcycler上进行2小时，以72秒的间隔作为数据收集点。通过加入荧光标记的底物SubBi-2-Q6B2来起始反应。反应含有10μl前面连接反应的混合物(ii-a或ii-b或ii-c或ii-d或ii-e或ii-f或ii-g或ii-h、500nM MNA酶C(STB5/2(21))的部分酶B、100nM MNA酶C(AF-MzCC)的装配促进子、PCRII Buffer(AppliedBiosystems)、50mM MgCl2和1000nM底物SubBi-2-Q6B2，于总反应体积25μl中。随时间监测每个反应中由于MNA酶底物C(SubBi-2-Q6B2)的切割引起的荧光的增强。
9.8.2结果
a)对照反应
DNA核酶连接酶反应的正对照(步骤i、ii-a和iii)显示荧光随时间的增强。依赖于MNA酶C的形成的连接酶产生的信号以任意荧光单位测量。荧光的总体改变(最终的荧光减去初始荧光)和反应达到完成的时间(荧光信号的平台)显示于表8。对照DNA核酶反应中观察到的这种荧光的改变确认了级联反应的步骤被成功完成。该反应中，MNA酶A形成并切割Pre5LSubB2-FB产生具有使其适合用作DNA核酶连接酶的底物的2’，3’-环状磷酸的产物(5LSubB)。切割产物5LSubB的序列为CTGTAGCACTCACTAua(SEQ ID NO：40)，其中大写字母代表DNA碱基，小写字母代表RNA碱基。该对照反应证明单分子DNA核酶连接酶7Z81-10/10连接5LSubB和3LSubB，并形成新的寡核苷酸(连接产物)，其序列为CTGTAGCACTCACTAuagGAACAACGAGAGGAAACCTT(SEQID NO：51)(其中大写字母代表DNA碱基，小写字母代表RNA碱基)。然后该连接产物作为切割底物C(SubBi-2-Q6B2)导致荧光增强的MNA酶C的部分酶组分起作用。这种荧光的增强作为连接酶活性的替代标志。
没有连接酶的对照反应(步骤i、ii-h和iii)显示荧光随时间不显著的增强(表8)。这证明如果不存在连接酶，5LSubB不能与3LSubB连接。因此，不产生MNA酶C的部分酶，并且观察不到荧光的增强。
b)当使用可具有或可不具有形成功能性MNA连接酶能力的候选部分酶对时，设计来测试连接酶活性存在的反应。
加入步骤i和iii以及步骤ii-b(Split 1)、ii-c(Split 2)、ii-d(Split 3)、ii-e(Split 4)、ii-f(Split 5)和ii-g(Split 6)的反应显示了荧光随时间的增强。通过任意荧光单位的改变来测量每个候选部分酶对连接底物的能力。荧光的总体改变(最终的荧光减去初始荧光)和反应达到完成的时间(荧光信号的平台)显示于表8。在那些位置分离DNA核酶连接酶7Z81的催化核心(表9)，然后在装配促进子存在时重新装配部分酶的部分核心，在这些反应条件下产生了活性MNA连接酶。
表8.各种部分酶的荧光随时间的改变。
本实施例产生了能用来装配MNA酶的许多部分酶序列，取决于特定的序列及其组合这些MNA酶具有各种水平的活性。测试的候选部分酶序列的一般设计概述于表9。
表9.测试的部分酶序列的一般设计。
包括如上文所述实例的活性MNA酶，特别是具有等同于Split 5的分配的MNA酶将具有广泛的应用。作为实例，MNA连接酶可用来检测靶分析物。MNA连接酶可设计为只有在存在诸如RNA或DNA靶序列(装配促进子)的分析物时装配。作为实例，如果5’连接底物和3’连接底物每个分别用荧光团或猝灭剂染料标记(或反之亦然)，那么连接将导致可作为靶分析物存在的指示的荧光的减弱。在可选形式中，如果5’连接底物用例如荧光团的可检测部分标记，3’连接底物连接到不同的位置(例如芯片或珠上)，那么在靶分析物存在时，连接将导致在不同位置处信号的出现。
本实施例中用来测定连接酶活性的测量的策略(如图12所示)构成了可用来产生反馈信号扩增级联的线性级联。如果5’产物C的序列与5’产物A的序列相同，那么该产物也能作为5’底物B，反馈级联反应可被起始。该反应中，MNA酶C能一直产生5’底物B，然后该底物被MNA连接酶B连接，产生用于形成更多MNA酶C的更多部分酶。该策略可提供用于在能指导MNA酶A装配的装配促进子(例如靶分析物)起始反应之后反馈扩增的机制。该策略可允许检测装配促进子(例如靶分析物)，然后使用两类MNA酶(即能连接底物的MNA酶(MNA连接酶)和能切割底物的MNA酶(MNA酶切割子))进行信号扩增。
本领域的技术人员将理解，该基本策略存在许多变体。作为实例，MNA酶B可用来产生作为具有切割、连接或其他酶促活性的另一个MNA酶的装配促进子的连接产物。在另一个实施例中，MNA酶C能通过除切割外的方法修饰底物。其他实施方案包括于整个说明书。
实施例10.用于从DNA核酶构建MNA酶的一般方法
体外进化技术促进了许多DNA核酶的发现和开发(综述见Emillson和Breaker，2002)。已发现体外进化的DNA核酶具有催化包括以下的许多反应的能力：核酸的切割、核酸的连接、卟啉金属化、碳-碳键的形成、DNA磷酸化、酯键、酰胺键、DNA去糖基化、胸腺嘧啶二聚体的光逆转和氨基磷酸酯的切割(综述见Silverman，2007)。
许多DNA核酶具有多个结构域的相似的基本结构。这些DNA核酶包含保守的催化结构域(催化核心)，侧翼为两个非保守的特异识别并杂交底物(例如，对DNA核酶切割子或作用于一个底物的酶)或至少两个底物(例如，对DNA核酶连接酶或作用于至少两个底物的酶)的底物结合结构域(“臂”)。底物结合结构域可根据任何底物来调整，条件是一个或多个底物含有能被DNA核酶修饰的位点。本实施例描述了用于基于任何已知的DNA核酶来构建新的MNA酶的一般策略。该一般策略示于图14。
首先描述了用于从具有修饰活性(例如切割活性)的DNA核酶衍生MNA酶的方法。在第一步，鉴定了DNA核酶催化核心内可将其分开的位置，以便催化核心的每个部分部分可分布于两个序列之间，以便两个部分核心一起构成完整的催化核心。然后含有以下的寡核苷酸A可被合成：(i)一个能结合底物的底物结合臂部分，(ii)一个部分催化核心部分，和(iii)一个能结合装配促进子分子的感应臂部分。合成第二寡核苷酸B，以便其含有(i)一个能结合与寡核苷酸A相同底物的底物结合臂部分，其中寡核苷酸B在临近寡核苷酸A的位置结合底物，(ii)一个部分催化核心部分，其含有来自不加入寡核苷酸A的完整DNA核酶催化核心的那些碱基和(iii)一个能结合与寡核苷酸A相同的装配促进子的感应臂部分，其中寡核苷酸B在临近寡核苷酸A的位置结合装配促进子。这一过程可被重复，因此制备一系列成对的寡核苷酸A和B，其加入部分酶的结构和结构域，但是在底物和装配促进子存在时可具有或可不具有催化活性。
然后，一些或所有候选部分酶对(来自系列的成对的寡核苷酸A和B)可在与部分酶的感应臂部分互补的装配促进子和与部分酶的底物臂部分互补的底物存在时孵育。孵育在与部分催化核心序列来源的DNA核酶修饰底物相容的条件下进行。能与部分序列来源的DNA核酶进行相同类型的底物修饰的成对的寡核苷酸A和B用作能装配为MNA酶的部分酶。部分催化核心的序列适合用于加入其他部分酶。能合成根据新底物(通过改变每个部分酶的底物结合结构域)和/或新装配促进子(通过改变每个部分酶的感应结合结构域)调整的新的部分酶。
用于从单分子核酸酶(例如DNA核酶连接酶)构建作用于两个底物的MNA酶的方法要求相似的步骤，其中在第一步，鉴定了DNA核酶催化核心内能将其分开的位置，以便催化核心的每个部分部分能分布于两个部分序列之间，以便两个部分核心一起构成完整的催化核心。然后两个寡核苷酸A和B(候选部分酶)可被合成。含有以下的寡核苷酸A可被合成：(i)一个能结合第一底物(例如可连接底物)的底物结合臂部分，(ii)一个部分催化核心部分，和(iii)一个能结合装配促进子分子的感应臂部分。可合成第二寡核苷酸B，以便其含有(i)一个能结合第二底物(例如可连接底物)的底物结合臂，(ii)一个部分催化核心部分，其含有来自不加入寡核苷酸A的完整DNA核酶催化核心的那些碱基和(iii)一个能结合与寡核苷酸A相同的装配促进子的感应臂序列，其中寡核苷酸B在临近寡核苷酸A的位置结合装配促进子。这一过程可被重复，因此制备一系列成对的寡核苷酸A和B，其加入部分酶的结构和结构域，但是在底物和装配促进子存在时可具有或可不具有催化活性。
然后，一些或所有候选部分酶对(来自系列的成对的寡核苷酸A和B)可在与部分酶的感应臂部分互补的装配促进子和与部分酶的底物臂部分互补的底物(例如可连接底物)存在时孵育。孵育在与部分催化核心序列来源的DNA核酶修饰底物(例如通过连接)相容的条件下进行。能与部分序列来源的DNA核酶进行相同类型的底物修饰(例如连接)的成对的寡核苷酸A和B用作能装配为MNA酶的部分酶。部分催化核心的序列适合用于加入其他部分酶。能合成根据新底物(通过改变每个部分酶的底物结合结构域)和/或新装配促进子(通过改变每个部分酶的感应结合结构域)调整的新的部分酶。
使用该方法来鉴定适合用于加入能形成活性MNA酶的部分酶的部分催化核心的特定实施例证明了两个具有连接酶活性的DNA核酶(实施例7和9)和一个具有切割活性的DNA核酶(实施例14)。
进一步，相似的方法可用来检查对来自能加入组分部分酶的分开的DNA核酶催化核心的部分序列改变的耐受性。例如，可进行加入部分酶的部分催化核心的修饰，作为实例其包括插入、缺失、用替代DNA碱基的取代、或用DNA碱基类似物(诸如核糖核苷酸、肌苷碱基或其他类似物)的取代。然后含有一个或多个修饰的候选部分酶对可如上文进行测定，以便确定它们是否适合作为能装配为催化上有活性的MNA酶的部分酶。
实施例11.开发多种核酸酶活性的级联反应
本实施例中使用的策略列于图9，并且也可形成信号扩增技术的基础。该特定实施例中，反应以两步进行。在第一步(图9(i)和(ii))，在装配促进子(例如靶核酸)存在时形成MNA酶A，并用来切割底物(MNA酶底物A)，因此产生具有2’，3’-环状磷酸末端的5’切割产物。同时DNA核酶连接酶用来连接5’切割产物与另一个寡核苷酸连接底物B，因此产生能作为新的MNA酶组分(例如部分酶)起作用的连接产物。在第二部(图9(iii))，第一步产生的部分酶连接产物参与形成能切割底物(MNA酶底物C)的新的MNA酶(MNA酶C)。本实施例中，用荧光团和猝灭剂染料对标记MNA酶底物C允许对反应进行荧光监测。
11.1MNA酶A的部分酶
在第一步，在装配促进子(AF-MzCA2)存在时形成MNA酶A，并用来切割MNA酶底物A(Pre5LSubB2-FB)。MNA酶A部分酶(RO4A2/1(11)和RO4B3/1(12))的序列列于下文。加下划线的碱基形成催化核心的一部分，黑体的碱基与装配促进子杂交，斜体的碱基与底物杂交。
SEQ ID NO：69部分酶A/MNA酶A-RO4A2/1(11)；
CGGTCGAA
SEQ ID NO：70部分酶B/MNA酶A-RO4B3/1(12)：
CCGAGC
11.2具有连接酶活性的DNA核酶
先前报道本实施例中使用的DNA核酶连接酶通过从2’，3’-环状磷酸和5’-羟基基团形成2’-5’磷酸二酯键合来连接RNA(Prior等，2004)。除了需要具有2’，3’-环状磷酸末端的5’底物外，本实施例中使用的DNA核酶连接酶还要求连接处特定的序列基序。
在第一步，本实验中使用具有设计为与底物序列5LsubB和3LsubB杂交的底物臂的DNA核酶连接酶7Z81(7Z81-10/10)，其序列列于下文(5’至3’)。加下划线的碱基形成催化核心，斜体的碱基与底物杂交。
SEQ ID NO：17DNA核酶连接酶-7Z81-10/10：
ACGGCGGAGTGATTGGGAGGTTAGCTC
11.3MNA酶C的部分酶
在第二步，连接产物作为新的部分酶起作用，其与部分酶B(STB5/2(21))和装配促进子(AF-MzCC)一起形成MNA酶C，并切割荧光标记的底物C(SubBi-2-Q6B2)。具有与连接产物相同序列的对照部分酶A(LS817A4/2)也与部分酶B(STB5/2(21)形成MNA酶C。以下序列对应于形成MNA酶C的一部分的部分酶。加下划线的碱基形成催化核心的一部分，黑体的碱基与装配促进子杂交，斜体的碱基与底物杂交。
SEQ ID NO：20部分酶B/MNA酶C-STB5/2(21)
GGCTAGCT
SEQ ID NO：84部分酶A/MNA酶C-LS817A4/2
ACAACGA
11.4MNA酶底物A(MNA酶切割子A的底物)
MNA酶底物A被MNA酶切割子A切割。然后得到的5’片段(表示为5LsubB)通过DNA核酶连接酶与3LsubB连接。底物A(Pre5LSubB2-FB)的序列如下。其内部地用6-FAM部分标记5’核糖碱基，用BHQ1部分标记3’核糖碱基(加下划线的碱基)。小写字母的碱基代表RNA和大写字母的碱基代表DNA。
SEQ ID NO：67底物A-Pre5LSubB2-FB：
CTGTAGCACTCACTAuaGGAAGAGATGAG
11.5DNA核酶连接酶底物B
本实验中使用的用于连接的3’底物的序列列于下文(5’至3’)。该寡核苷酸具有5’羟基基团。小写字母的碱基代表RNA，大写字母的碱基代表DNA。
SEQ ID NO：22连接酶3’底物B-3LSubB：
gGAACAACGAGAGGAAACCTT
11.6MNA酶C的底物(用于检测的荧光报告底物C)
本实施例中使用的报告底物是SubBi-2。本实施例中，SubBi-2的5’末端用Quasar 670部分末端标记，3’末端用BHQ2部分末端标记，称为SubBi-2-Q6B2。用635nm的激发在665nm监测SubBi-2-Q6B2的切割。SubBi-2-Q6B2的序列列于下文(5’至3’)；小写字母的碱基代表RNA，大写字母的碱基代表DNA。
SEQ ID NO：4SubBi-2-Q6B2：AAGGTTTCCTCguCCCTGGGCA
11.7装配促进子
由MNA酶A感应结构域识别的装配促进子A是具有以下序列的合成的DNA寡核苷酸：
SEQ ID NO：68AF-MzCA2：
GCCATTGTCGAACACCTGCTGGATGACCAGC
由MNA酶C感应结构域识别的装配促进子C是具有以下序列的合成的DNA寡核苷酸：
SEQ ID NO：24AF-MzCC：
CGACGACCACTCCGACGACAGTCCTATAGTGAGTGCTACAG
11.8反应条件
反应如下文所述以两个连续步骤1和2在两个单独的管中进行。
(1)MNA酶A切割Pre5LSubB2-FB产生具有所需2’，3’-环状磷酸末端的5’切割产物/连接底物(5LSubB)，和通过DNA核酶连接酶该片段与3LsubB连接在45℃下以总反应体积50μl进行2小时。反应含有70mM TrisHCl(pH 9.0，于25℃)、50mM MgCl2、150mM NaCl、2mM KCl、40nMRO4B3/1(12)、40nM RO4A2/1(11)、200nM Pre5LSubB2-FB和：
a)40nM AF-MzCA2、200nM DNA连接酶7Z81-10/10和100nM3LSubB；或
b)40nM AF-MzCA2和100nM 3LSubB；或
c)40nM AF-MzCA2和200nM DNA连接酶7Z81-10/10；或
d)200nM DNA连接酶7Z81-10/10和100nM 3LSubB；或
e)仅100nM 3LSubB；或
f)仅200nM DNA连接酶7Z81-10/10
(2)产生于MNA酶C的切割的荧光检测等温地在55℃下在CepheidSmartcycler上进行1小时。通过加入荧光标记的底物SubBi-2-Q6B2来起始反应。反应含有10μl一种前面连接反应的混合物(1-a或1-b或1-c或1-d或1-e或1-f)和200nM部分酶B(STB5/2(21))和200nM MNA酶C的装配促进子(AF-MzCC)和200nM底物SubBi-2-Q6B2，于总反应体积25μl中。还包括正对照反应(1-g)，其中200nM MNA酶C(LS817A4/2)的对照部分酶A也加入到10μl反应(1-f)中。
11.9结果
对含有以下寡核苷酸试剂的反应随时间监测由MNA酶底物C(SubBi-2-Q6B2)的切割引起的荧光的增强(表10)。
表10.随时间监测的由MNA酶底物C(SubBi-2-Q6B2)的切割引起的荧光的增强。
  步骤1   步骤2   结果
  反应1(测试1-a)   *MNA酶A部分酶*底物A*装配促进子A(靶)*DNA核酶连接酶*连接酶底物B   *来自步骤1的10μl*MNA酶C部分酶B*装配促进子C*底物C   观察到荧光随时间的增强，反应在15分钟内完成。
  反应2(1-b对照-没有DNA核酶连接酶)   *MNA酶A部分酶*底物A*装配促进子A(靶)*连接酶底物B   *来自步骤1的10μl*MNA酶C部分酶B*装配促进子C*底物C   没有观察到荧光随时间的增强
  反应3(1-c对照-没有   *MNA酶A部分酶   *来自步骤1的10μl   没有观察到荧光随时间的增强
  3’连接酶底物B) *底物A*装配促进子A(靶)*DNA核酶连接酶   *MNA酶C部分酶B*装配促进子C*底物C
  反应4(1-d对照-没有装配促进子A)   *MNA酶A部分酶*底物A*DNA核酶连接酶*连接酶底物B   *来自步骤1的10μl*MNA酶C部分酶B*装配促进子C*底物C   观察到荧光随时间最小的增强
  反应5(1-e对照-没有DNA核酶连接酶和没有装配促进子A)   *MNA酶A部分酶*底物A*连接酶底物B   *来自步骤1的10μl*MNA酶C部分酶B*装配促进子C*底物C   没有观察到荧光随时间的增强
  反应6(1-f对照-没有连接酶底物B和没有装配促进子A)   *MNA酶A部分酶*底物A*DNA核酶连接酶   *来自步骤1的10μl*MNA酶C部分酶B*装配促进子C*底物C   没有观察到荧光随时间的增强
  反应7(具有MNA酶C部分酶ALS817A4/2的1-g   *MNA酶A部分酶*底物A   *来自步骤1的10μl*MNA酶C部分酶B   观察到荧光随时间的增强，反应在不到1分钟内完成
 正对照) *DNA核酶连接酶 *装配促进子C*底物C*MNA酶C部分酶A LS817A4/2
随时间测量反应1至7的步骤(2)的荧光水平(表10)。含有步骤(1)和(2)所有寡核苷酸反应组分的反应1(1-a)显示了荧光随时间的增强。该反应中观察到的荧光改变大于484个任意单位，导致从时间0的大约46到在监测荧光1小时后的超过530的增加。
相反，缺少步骤(1)的DNA核酶连接酶(7Z81-10/10)寡核苷酸的反应2(1-b)没有显示荧光随时间的增强。缺少连接酶底物B(3LSubB)但含有步骤(1)的DNA核酶连接酶的反应3(1-c)没有显示荧光随时间的增强。缺少步骤(1)的装配促进子A(AF-MzCA2)的反应4(1-d)显示随时间荧光的最小增强，在1小时荧光监测期间高于观察到的背景漂移大约40个任意单位。缺少步骤(1)的装配促进子A和DNA核酶连接酶的反应5(1-e)没有显示荧光随时间的增强。缺少连接酶底物B和装配促进子A的反应6(1-f)没有显示荧光随时间的增强。反应7(1-g)是含有对照MNA酶C部分酶A(LS817A4/2)的正对照，显示了荧光随时间的增强，其中反应在不到1分钟内完成。这些反应一起表明以下事件发生在反应1(1-a)中。
首先，在特定靶装配促进子A(AF-MzCA2)存在时MNA酶A切割底物A(Pre5LSubB2-FB)，产生两个片段，其中一个片段是具有2’，3’-环状磷酸末端的5’片段5LSubB(CTGTAGCACTCACTAua)(SEQ ID NO：40)。第二，5LSubB与存在于步骤(1)的反应混合物中的第二DNA核酶寡核苷酸连接酶底物B(3LSubB)连接，这导致新的寡核苷酸(连接产物)的形成，其序列为CTGTAGCACTCACTAuagGAACAACGAGAGGAAACCTT(SEQID NO：51)(其中大写字母代表DNA碱基，小写字母代表RNA碱基)。然后该连接产物作为MNA酶C的部分酶。该新连接的部分酶A与MNA酶C的部分酶B和装配促进子C缔合产生MNA酶C。MNA酶C切割MNA酶底物C(SubBi-2-Q6B2)，导致荧光团/猝灭剂染料对的分离，因此引起荧光的增强。
“无连接”对照(反应2(1-b)和3(1-c))证明具有2’，3’-环状磷酸末端的5’切割片段(5LSubB)与第二连接酶底物B(3LSubB)的连接对MNA酶C的部分酶组分的形成是必需的。
“无装配促进子A(AF-MzCA2)”的对照(反应4(1-d)、5(1-e)和6(1-f))证明MNA酶A对MNA酶底物A (Pre5LSubB2-FB)的切割以及具有2’，3’-环状磷酸末端的5’片段的产生对随后的连接和形成MNA酶C的装配和活性所需的部分酶是必需的。
本实施例中的级联反应允许检测装配促进子(在本实施例中，靶核酸序列)的存在。允许检测的级联反应使用两类核酸酶，即能连接底物的DNA核酶和能切割底物的MNA酶。级联中每个酶促步骤的多次周转可允许信号的扩增。
本实施例中证明以及图9示例的级联可扩展，并用来产生反馈扩增级联。如果5’切割产物C的序列与5’切割产物A的序列相同，那么该产物也可作为5’底物B，反馈级联反应可被起始。该反应中，MNA酶切割子C可一直产生5’底物B，该底物然后由DNA核酶连接酶B连接产生用于更多MNA酶切割子C形成的更多部分酶。该策略可提供用于在由能指导MNA酶切割子A装配的靶分析物起始反应后反馈扩增的机制。该策略可允许检测靶分析物，然后使用两类核酸酶(即DNA核酶连接酶和MNA酶切割子)通过反馈级联进行信号扩增。
进一步，对本领域的技术人员显而易见的是，DNA核酶连接酶能连接两个片段，产生用于该级联的几个可能的酶、酶组分或底物，其包括但不限于，a)第二MNA酶的部分酶(例如本实施例中所示的MNA酶切割子，图9中标记为MNA酶C)；或b)实施例12所述、图15中标记为MNA酶切割子2的第二MNA酶的新的装配促进子；或c)能修饰一个或多个底物(例如通过切割、连接等)的新的DNA核酶或适合被MNA酶或DNA核酶修饰的底物。进一步，对本领域的技术人员显而易见的是，具有连接酶活性的DNA核酶可用具有连接酶活性的MNA酶替换，如实施例7和9所证明。该策略是通用的，可作为第一和第二步的连续级联或作为反馈级联反应进行，其中步骤2(图9(iii))产生步骤1的组分(图9(i)和(ii))。另外，步骤2(图9(iii))可产生用于进一步的随后反应的组分。
实施例12：开发多种核酸酶活性的级联反应的实施例
本实施例中使用的一般策略列于图15，并且也可形成信号扩增技术的基础。在第一步，在装配促进子(例如靶核酸)存在时形成MNA酶(MNA酶切割子1)，并用来切割底物(MNA酶底物1)，因此产生具有2’，3’-环状磷酸末端的5’切割产物。在第二步，DNA核酶连接酶用来连接步骤1产生的切割产物与另一个寡核苷酸连接底物，因此产生作为装配促进子起作用的连接产物。在第三步，步骤2产生的装配促进子连接产物参与形成能切割底物(MNA酶底物2)的新的MNA酶(MNA酶切割子2)。本实施例中，用荧光团和猝灭剂染料对标记MNA酶底物2允许对反应进行荧光监测。
12.1MNA酶切割子1的部分酶
在第一步，在装配促进子(AF-MzCA2)存在时形成MNA酶切割子1，并用来切割MNA酶底物1(Pre5LSubB2-FB)。MNA酶切割子1部分酶(RO4A2/1(11)和RO4B3/1(12))的序列列于下文。加下划线的碱基形成催化核心的一部分，黑体的碱基与装配促进子杂交，斜体的碱基与底物杂交。
SEQ ID NO：69部分酶A/MNA酶1-RO4A2/1(11)；
CGGTCGAA
SEQ ID NO：70部分酶B/MNA酶1-RO4B3/1(12)：
CCGAGC
12.2具有连接酶活性的DNA核酶
先前报道，本实施例中使用的DNA核酶连接酶从2’，3’-环状磷酸和5’-羟基基团通过形成2’-5’磷酸二酯键合来连接RNA(Prior等，2004)。除了要求具有2’，3’-环状磷酸末端的5’底物外，本实施例中使用的DNA核酶连接酶还要求连接处特定的序列基序。
在第二步，本实验中使用具有设计为与底物序列5LSubB和3LSubB杂交的底物臂的DNA核酶连接酶7Z81(7Z81-10/10)，其序列列于下文(5’至3’)。加下划线的碱基形成催化核心，斜体的碱基与底物杂交。
SEQ ID NO：17DNA核酶连接酶-7Z81-10/10：
ACGGCGGAGTGATTGGGAGGTTAGCTC
12.3MNA酶切割子2的部分酶
在第三步，连接产物作为新的装配促进子起作用，其与一对部分酶一起能形成MNA酶切割子3，并切割荧光标记的底物3(SubBi-3-TxB2)。以下序列对应于形成MNA酶切割子2组分的部分酶。加下划线的碱基形成催化核心的一部分，黑体的碱基与装配促进子杂交，斜体的碱基与底物杂交。
SEQ ID NO：85部分酶A/MNA酶2-LIGFACA5/3：
TACAACGA
SEQ ID NO：86部分酶B/MNA酶2-LIGFACB6/3：
GGCTAGC
12.4MNA酶底物1(MNA酶切割子1的底物)
MNA酶底物1被MNA酶切割子1切割。然后得到的表示为5LSubB的5’片段通过DNA核酶连接酶与3LsubB连接。底物1(Pre5LSubB2-FB)的序列如下。其内部地用6-FAM部分标记5’核糖碱基，用BHQ1部分标记3’核糖碱基(加下划线的碱基)。小写字母的碱基代表RNA，大写字母的碱基代表DNA。
SEQ ID NO：67底物1-Pre5LSubB2-FB：
CTGTAGCACTCACTAuaGGAAGAGATGAG
12.5DNA核酶连接酶底物
本实验中使用的用于连接的3’底物序列列于下文(5’至3’)。该寡核苷酸具有5’羟基基团。小写字母的碱基代表RNA，大写字母的碱基代表DNA。
SEQ ID NO：22连接酶3’底物-3LSubB：
gGAACAACGAGAGGAAACCTT
12.6MNA酶底物2(MNA酶切割子2的荧光报告底物)
本实施例中使用的报告底物是SubBi-3。本实施例中，SubBi-3的5’末端用得克萨斯红(Texas Red)部分末端标记，3’末端用BHQ2部分末端标记，称为SubBi-3-TxB2。用585nm(TxB2激发波长)的激发在610nm(TxB2发射波长)处监测SubBi-3-TxB2的切割。SubBi-3-TxB2的序列列于下文(5’至3’)；小写字母的碱基代表RNA，大写字母的碱基代表DNA。
SEQ ID NO：87SubBi-3-TxB2：CAGCACAACCguCACCAACCG
12.7MNA酶切割子1的装配促进子序列
由MNA酶切割子1感应结构域识别的装配促进子是具有如下序列的合成的DNA寡核苷酸：
SEQ ID NO：68AF-MzCA2：
GCCATTGTCGAACACCTGCTGGATGACCAGC
12.8反应条件
反应如下文所述以三个连续步骤(i)、(ii)和(iii)在三个单独的管中进行。
(i)MNA酶切割子1切割Pre5LSubB2-FB产生具有所需2’，3’-环状磷酸末端的5’切割产物/连接底物(5LSubB)在40℃下于总反应体积100μl中进行66分钟。反应含有50mM Tris HCl(pH 9.0，于25℃)、50mM MgCl2、150mM NaCl、2mM KCl、50nM RO4B3/1(12)、50nM RO4A2/1(11)和：
a)1000nM Pre5LSubB2-FB、50nM AF-MzCA2；或
b)1000nM Pre5LSubB2-FB；或
c)50nM AF-MzCA2。
(ii)连接在40℃下在总反应体积为50μl中进行2小时。反应含有25μl前面切割反应的混合物(i-a)或(i-b)或(i-c)、500nM 3LSubB，于终浓度为150mM NaCl、2mM KCl、50mM Tris HCl(pH 9.0，于25℃)和50mMMgCl2的反应中，和：
a)500nM DNA核酶连接酶7Z81-10/10，或
b)没有DNA核酶连接酶(无连接对照)
(iii)在由切割产物Pre5LSubB2-FB(5LSubB)和连接底物(3LSubB)的连接形成的装配促进子存在时MNA酶切割子2的部分酶的装配产生的MNA酶的切割引起的荧光检测等温地在50℃下在Cepheid Smartcycler上进行2小时。通过加入荧光标记的底物SubBi-3-TxB2来起始反应。重复反应含有10μl一种前面连接反应的混合物((i-a/ii-a)或(i-a/ii-b)或(i-b/ii-a)或(i-b/ii-b)或(i-c/ii-a)或(i-c/ii-b))和MNA酶切割子2的200nM部分酶A(LIGFACA5/3)和200nM部分酶B(LIGFACB6/3)和400nM底物SubBi-3-TxB2，于总反应体积25μl中。
12.9结果
随时间监测含有以下寡核苷酸试剂的反应中由MNA酶底物2(SubBi-3-TxB2)的切割引起的荧光的增强(表11)。
表11.随时间监测的由MNA酶底物2(SubBi-3-TxB2)的切割引起的荧光的增强
 步骤(i)   步骤(ii)  步骤(iii)   结果
  反应1(测试i-a/ii-a)  *MNA酶1部分酶*底物1*装配促进子1(靶)   *来自步骤(i)的25μl*连接底物*DNA核酶连接酶  *来自步骤(ii)的10μl*MNA酶2部分酶*底物2   观察到荧光随时间的增强
  反应2(对照i-a/ii-b-没有DNA核酶连接酶)  *MNA酶1部分酶*底物1*装配促进子   *来自步骤(i)的25μl*连接酶底物  *来自步骤(ii)的10μl*MNA酶2部分酶   没有观察到荧光随时间的增强
 1(靶) *底物2
  反应3(对照i-b/ii-a-没有装配促进子1(靶))  *MNA酶1部分酶*底物1   *来自步骤(i)的25μl*连接底物*DNA核酶连接酶  *来自步骤(ii)的10μl*MNA酶2部分酶*底物2   没有观察到荧光随时间的增强
  反应4(对照i-b/ii-b-没有装配促进子1(靶)和没有DNA核酶连接酶)  *MNA酶1部分酶*底物1   *来自步骤(i)的25μl*连接底物  *来自步骤(ii)的10μl*MNA酶2部分酶*底物2   没有观察到荧光随时间的增强
  反应5(对照i-c/ii-a-没有底物1)  *MNA酶1部分酶*装配促进子1(靶)   *来自步骤(i)的25μl*连接酶底物*DNA核酶连接酶  *来自步骤(ii)的10μl*MNA酶2部分酶*底物2   没有观察到荧光随时间的增强
  反应6(对照i-c/ii-b-没有底物1和没有DNA核酶连接酶)  *MNA酶1部分酶*装配促进子1(靶)   *来自步骤(i)的25μl*连接酶底物  *来自步骤(ii)的10μl*MNA酶2部分酶*底物2   没有观察到荧光随时间的增强
随时间测量反应1、2、3、4、5和6的步骤(iii)的荧光水平(重复进行两次)(表10)。含有步骤(i)、(ii)和(iii)的所有寡核苷酸反应组分的反应1(i-a/ii-a)显示了荧光随时间的增强。该反应中观察到的荧光改变大于900个任意单位，导致从时间0的大约180到2小时后超过1100的增加。
相反，反应2、3、4、5和6没有显示高于背景漂移的荧光随时间增强，在2小时荧光监测期间观察到背景漂移大约50个任意单位。因此，缺少步骤(ii)的连接酶DNA核酶寡核苷酸的反应2(i-a/ii-b)没有显示荧光随时间的增强。缺少装配促进子1(AF-MzCA2)但含有来自步骤(ii)的DNA核酶连接酶的反应3(i-b/ii-a)没有显示荧光随时间的增强。缺少装配促进子1(AF-MzCA2)和来自步骤(ii)的DNA核酶连接酶的反应4(i-b/ii-b)没有显示荧光随时间的增强。缺少底物1(Pre5LSubB2-FB)但含有来自步骤(ii)的DNA核酶连接酶的反应5(i-c/ii-a)没有显示荧光随时间的增强。缺少底物1(Pre5LSubB2-FB)和DNA核酶连接酶的反应6(i-c/ii-b)没有显示荧光随时间的增强。这些反应一起表明以下事件发生在反应1中。
首先，在特定装配促进子1(AF-MzCA2)存在时MNA酶切割子1切割底物1(Pre5LSubB2-FB)，产生两个片段，其中一个片段是具有2’，3’-环状磷酸末端的5’片段5LSubB(CTGTAGCACTCACTAua)(SEQ ID NO：40)。第二，5LSubB与存在于步骤(ii)的反应混合物中的第二DNA核酶寡核苷酸连接酶底物(3LSubB)连接，这导致新的寡核苷酸(连接产物)的形成，其序列为CTGTAGCACTCACTAuagGAACAACGAGAGGAAACCTT(SEQID NO：51)(其中大写字母代表DNA碱基，小写字母代表RNA碱基)。然后该连接产物作为MNA酶切割子2的装配促进子。该新连接的装配促进子与部分酶缔合产生MNA酶切割子2。MNA酶切割子2切割MNA酶底物2(SubBi-3-TxB2)，导致荧光团/猝灭剂染料对的分离，因此引起荧光的增强。
“无连接”对照(反应2、4和6)证明具有2’，3’-环状磷酸末端的5’切割片段(5LSubB)与第二连接酶底物B(3LSubB)的连接对MNA酶切割子2的装配促进子组分的形成是必需的。
“无装配促进子(AF-MzCA2)”的对照(反应3和4)证明MNA酶切割子1对底物1(Pre5LSubB2-FB)的切割以及具有2’，3’-环状磷酸末端的5’片段(5LSubB)的产生对随后的连接和形成MNA酶切割子2的装配所需的装配促进子是必需的。
本实施例中证明的策略可用来产生反馈信号扩增级联。如果MNA酶切割子2的切割产生与MNA酶切割子1产生的相同的5’切割产物，那么该切割产物也可被连接形成转而作为另一个新的MNA酶组分(例如部分酶、装配促进子或底物)用于其他MNA酶切割子2复合体装配的连接产物。
进一步，对本领域的技术人员显而易见的是，DNA核酶连接酶能连接两个片段，产生用于该级联的几个可能的酶或酶组分，其包括但不限于，a)第二MNA酶切割子的新的装配促进子(如本实施例中所示)；或b)第二MNA酶的新的部分酶，如实施例6、7、9和11所示，或c)能修饰一个或多个底物(例如通过切割、连接等)的新的DNA核酶。进一步，对本领域的技术人员显而易见的是，具有连接酶活性的DNA核酶可用具有连接酶活性的MNA酶替换，如实施例7和9所证明。该策略是通用的，可作为第一、第二和第三步的连续级联或作为反馈级联反应进行，其中步骤3产生步骤2的组分，步骤2产生步骤3的组分。另外，步骤3可产生用于进一步的随后反应的组分。
实施例13：具有可能反馈的级联反应
反馈扩增级联的一个改变的图例代表示于图16。涉及MNA酶切割、DNA核酶连接和MNA酶切割的级联的起始步骤示于图15，并证明于实施例6、7、9、11和12。本实施例中所述以及示于图16的方案扩展了实施例6、7、9、11和12中级联的策略，并且描述了反馈扩增级联的策略。
如图16所示，在第一步，MNA酶切割子1仅在装配促进子(例如靶核酸)存在时装配，然后切割MNA酶底物1来释放具有2’，3’环状磷酸末端的5’切割产物。在第二步，DNA核酶连接酶(或装配的MNA连接酶)能连接来自第一步的5’切割产物和3’连接底物产生能作为另一个MNA酶切割子2的装配促进子的连接产物。在第三步，第二步的连接形成的装配促进子能指导能形成能将底物2切割为两个产物(具有2’，3’环状磷酸末端的5’切割产物和3’切割产物)的MNA酶切割子2的部分酶的装配。如果该底物例如用荧光团和猝灭剂染料对标记，那么在切割底物2之后能产生可检测的信号。
进一步，如果MNA酶切割子2的任一切割产物的序列用作MNA酶切割子3的装配促进子组分，那么这将起始反馈级联。在这种情况中，MNA酶切割子3可具有与MNA酶切割子1不同的感应臂，但是可具有与MNA酶切割子1相同的底物臂。因此如果MNA酶切割子3在由MNA酶切割子2的切割产生的装配促进子组分存在时装配，并且如果MNA酶切割子3切割底物1，那么MNA酶切割子3的5’切割产物也可作为DNA核酶连接酶(或装配的MNA连接酶)的5’底物，反馈扩增级联反应可被起始。该反应中，MNA酶切割子3将一直产生能转而作为用于DNA核酶连接酶(或装配的MNA连接酶)连接的5’切割产物，以便产生能指导更多MNA酶切割子2装配的更多装配促进子。该策略能提供用于在由允许MNA酶切割子1装配的装配促进子(例如靶分析物)起始反应之后反馈信号扩增的机制。该策略可允许检测一个或多个装配促进子(例如靶分析物)，然后使用能连接底物的DNA核酶或MNA酶和能切割底物的MNA酶进行信号扩增。
在进一步的改变中，具有连接酶活性的DNA核酶(或MNA酶)能连接片段以形成能切割底物2的DNA核酶，以便产生MNA酶3的装配促进子组分。因此，该改变中，MNA酶切割子2可用第二步的连接产生的DNA核酶切割子替换。
对本领域的技术人员将显而易见的是，信号可由底物1和/或底物2的切割产生，条件是底物例如用荧光团猝灭剂染料对标记。在这种情况中，切割将导致荧光的增强。进一步，如果每个片段用荧光团或猝灭剂标记，那么在连接底物与MNA酶切割子1和/或MNA酶切割子3的5’产物连接之后，将可能测量荧光的改变。在这种情况中，连接将导致溶液中或其中例如一个可连接底物与固相支持物连接的测定中特定位置处荧光的改变。
由MNA酶或DNA核酶在步骤2或步骤3通过切割产生的装配促进子组分可以是多种设计的任一种。作为实例，这些装配促进子组分能类似于装配促进子和/或部分酶感应臂的任意构型，如图6所示。
在其中MNA酶切割子2的产物可作为MNA酶切割子3的装配促进子组分的反馈级联策略的另一个改变中，MNA酶切割子3可具有修饰的结构。该变体中，MNA酶切割子3可具有与MNA酶切割子1不同的感应臂，但是其可具有与MNA酶切割子1的部分酶序列相同的MNA酶3的一个底物臂(在一个部分酶上)，该MNA酶切割子1与底物1上的该部分序列(底物的5’部分)相互作用，然后由连接酶连接。因此，MNA酶切割子3将切割5’部分与可切割底物1具有相同序列但3’末端具有与可切割底物1不同部分(或反之亦然)的底物(可切割底物3)。底物3的切割位点将位于可切割底物1和3共同和不同的序列的连接处。在这种情况中，当MNA酶切割子3在由MNA酶切割子2的切割产生的装配促进子组分存在的情况下装配时，并且如果MNA酶切割子3切割底物3时，那么MNA酶切割子3的5’切割产物也可作为DNA核酶连接酶(或装配的MNA连接酶)的5’底物，反馈扩增级联反应可被起始。该反应中，MNA酶切割子3将一直产生转而可作为用于DNA核酶连接酶(或装配的MNA连接酶)连接的底物的5’切割产物，以便产生例如能指导更多MNA酶切割子2装配的装配促进子的更多组分。该策略能提供用于在由允许MNA酶切割子1装配的装配促进子(例如靶分析物)起始反应之后反馈信号扩增的机制。该策略可允许检测装配促进子(例如靶分析物)，然后使用能连接底物的DNA核酶或MNA酶和能切割底物的MNA酶进行信号扩增。
本领域的技术人员还应理解，级联中使用的核酸酶能产生可用在随后反应中的不同组分，诸如在反馈情况中。作为实例，参考图16，MNA酶切割子2能产生MNA酶切割子3的稳定臂，而不是装配促进子组分，如图示。在另一个改变中，MNA酶切割子2能被能产生例如MNA酶切割子3的部分酶或装配促进子或DNA核酶切割子的MNA连接酶替换，不同于其中MNA酶切割子2产生装配促进子组分的图16所示。
在另一个变体策略中，DNA(或MNA)连接酶能连接片段并产生能与反应中存在的另一个部分酶和装配促进子缔合的新的部分酶，因此形成能切割底物2的MNA酶切割子2，以便产生MNA酶3的装配促进子组分。
描述的改变也可适当用于整个说明书的其他级联中。说明书中其他地方描述的其他改变也可应用于此。
包括反馈级联的核酸酶级联允许在检测靶分析物之后信号的产生。级联中第一MNA酶可以是MNA酶或适体-MNA酶，因此MNA酶系统能设计用于检测核酸靶和非核酸分析物，例如蛋白质或脂类。
进一步，反馈级联可进一步扩增输出或可检测信号。使用核酸酶的信号扩增级联具有优于例如实时PCR的靶扩增和检测技术的优势。尽管靶扩增技术是广泛用于研究和/或临床诊断的有力的工具，但每个技术具有内在的缺点。这些技术都需要使用蛋白酶(例如DNA聚合酶、RNA聚合酶、反转录酶和/或连接酶)。包括蛋白酶增加了试剂制造的复杂性和成本，缩短了含有试剂的试剂盒的保存期限。其他相关的技术挑战包括引起假阳性信号的来自前面反应的复制子(靶扩增子)的污染，和/或由引物序列的复制(引物-二聚体)引起的背景信号或由不依赖于靶的连接引起的背景。
实施例14：测试含有来自10:23催化核心的变体部分催化核心序列的一系列部分酶对的MNA酶活性
可制备加入来自多种体外进化的DNA核酶的部分序列的多组分核酸酶(MNA酶)。基于来自8:17和10:23DNA核酶的部分序列的活性MNA酶已被证明。进一步，基于8:17和10:23DNA核酶的几种可选部分酶的设计已显示具有或缺少切割活性(PCT/AU2006/001473，Johnson&JohnsonResearch Pty Limited)。本实施例鉴定了基于来自能切割底物的10:23DNA核酶的部分催化核心序列的活性和无活性的部分酶序列。进一步，本实施例提供了鉴定分离催化核心序列的最优位置所需步骤的一般程序，以便部分催化核心序列加入部分酶，产生功能上有活性的MNA酶。
已知或体外进化的其他DNA核酶可经受本实施例和实施例7和9中所述的相似的分析。因此这些实施例提供了本领域技术人员可用来鉴定活性MNA酶的部分催化核心序列的方法，该MNA酶能执行许多功能，包括切割(本实施例)或连接(实施例7和9)，或其他体外进化的功能，包括但不限于核酸磷酸化、核酸加帽、氨基酸腺苷酰化、辅因子合成、RNA聚合、模板指导的聚合、RNA-蛋白轭合、羟醛反应、醇氧化、醛还原、嘌呤和嘧啶核苷酸的合成、烷基化、酰胺合成、尿素合成、肽键的形成、肽基-RNA的合成、酰基转移、氨酰化、碳酸酯水解、硫代磷酸烷基化、卟啉金属化、碳-碳键的形成、Pd纳米颗粒的形成、联苯异构化、酯键的形成、酰胺键的形成、DNA去糖基化、胸腺嘧啶二聚体的光逆转和氨基磷酸酯的切割。
14.1部分酶寡核苷酸
本实施例的方法用来研究10:23催化核心序列内的哪些位置适合用来分为部分催化核心序列，这些序列一旦加入部分酶，就形成功能上有活性的MNA酶。10:23序列在各种位点分开，然后两个部分序列被加入设计为在靶(人RPLPO基因)存在时切割底物的一系列部分酶对。被测试的每个部分酶对的部分催化核心显示于表12，参考10:23DNA核酶的完整催化核心序列(Santoro和Joyce，1997)。
表12：在10:23DNA核酶和一系列变体部分酶对中的碱基和位置，其中位于核心的位置1至15的碱基不同地分布于两个部分酶A和B之间。
所有序列是从5’到3’书写。MNA酶的设计和部分酶的命名鉴定了DNA核酶和核心内分开的位置。例如，设计6是来自10:23的具有部分酶A4和部分酶B5设计(A4:B5)的MNA酶，其中核心在位置8的T和位置9的A之间分开(T8-A9)。
本实验中，一系列部分酶对都用设计为与人RPLPO基因的外显子5杂交的感应臂和用针对底物SubBi-2的底物臂来合成。本实验中使用的部分酶对通过Sigma-Proligo来合成，其序列列于下文(5’至3’)。加下划线的碱基形成装配的MNA酶的催化核心的一部分，黑体的碱基与核酸靶杂交，斜体的碱基与底物杂交。“-P”表示寡核苷酸的3’磷酸化。
RPLPO部分酶对A4:B5
SEQ ID NO：6RO5A4/2-P
ACAACGA
SEQ ID NO：88RO5B5(16)/2-P
GGCTAGCT
RPLPO部分酶对A5:B6
SEQ ID NO：89RO5A5/2(22)-P
TACAACGA
SEQ ID NO：90RO5B6(16)/2-P
GGCTAGC
RPLPO部分酶对A6:B7
SEQ ID NO：91RO5A6(22)/2-P
ACGA
SEQ ID NO：92RO5B7(16)/2-P
GGCTAGCTACA
RPLPO部分酶对A7:B8
SEQ ID NO：93RO5A7(22)/2-P
CAACGA
SEQ ID NO：94RO5B8(16)/2-P
GGCTAGCTA
RPLPO部分酶对A8:B9
SEQ ID NO：95RO5A8(22)/2-P
CTACAACGA
SEQ ID NO：96RO5B9(16)/2-P
GGCTAG
RPLPO部分酶对A9:B10
SEQ ID NO：97RO5A9(22)/2-P
GCTACAACGA
SEQ ID NO：98RO5B10(16)/2-P
GGCTA
14.2.报告底物
本实施例的报告底物是具有如下5’至3’序列的SubBi-2。本实施例中，SubBi-2的5’末端用6-FAM部分末端标记，3’末端用BHQ1部分末端标记，并称为SubBi-2-FB。用485nm(FAM激发波长)的激发在530nm(FAM发射波长)处监测SubBi-2-FB的切割。小写字母的碱基代表RNA，大写字母的碱基代表DNA。
SEQ ID NO：4SubBi-2-FB
AAGGTTTCCTCguCCCTGGGCA
14.3.用于扩增人RPLPO基因外显子5的PCR引物
引物5’至3’的序列如下显示。
SEQ ID NO：995’引物5RO5/2
GCTACCCAACTGTTGCATC
SEQ ID NO：1003’引物3RO5/2
AGCAGCCACAAAGGCAGA
14.4.靶模板
从K562细胞提取的人基因组DNA用作PCR反应的模板。
14.5.反应条件
靶序列的实时扩增和部分酶对催化活性的检测在25μl反应循环下在ABI 7700热循环仪(Applied Biosystems)上进行。循环参数是95℃持续7分钟，10个循环的95℃持续15秒和65℃持续30秒(每个循环温度下降1℃)，和最后50个循环的95℃持续15秒和50℃持续30秒。每个反应含有0.04μM 5RO5/2和0.2μM 3RO5/2、10mM MgCl2、50μM每种dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)、1x Immobuffer(Bioline)、0.2μM SubBi-2-FB、1x Rox参考染料(Invitrogen)、10个单位Rnasin(Progema)和1个单位Immolase聚合酶(Bioline)和100ng基因组DNA。此外，每个反应含有一对部分酶，0.2μM部分酶A和0.2μM部分酶B(RPLPO部分酶对A4:B5或A5:B6或A6:B7或A7:B8或A8:B9或A9:B10)。
14.6.结果
使用实时MNA酶-PCR的方法，检测6个RPLPO部分酶对中3个的催化活性。部分酶对A4:B5和A5:B6显示高水平的催化活性，允许在22个循环后检测靶(表13)。A7:B8部分酶对也是有活性的，尽管活性低于A4:B5和A5:B6。在本实验条件下，没有检测到部分酶对A6:B7、A8:B9或A9:B10的催化活性。
表13：使用各种部分酶对获得的阈值循环(Ct)值
  核心分离(参见上表，本实施例)   Ct   解释
  A4:B5(T8-A9)   19.3   这些部分酶中部分催化核心序列的这种组合与活性MNA酶的形成相容。
  A5:B6(C7-T8)   21.6   这些部分酶中部分催化核心序列的这种组合与活性MNA酶的形成相容。
  A6:B7(A11-A12)   在50个循环没有信号   这些部分酶中部分催化核心序列的这种组合在这些实验条件下不与活性MNA酶的形成相容。
  A7:B8(A9-C10)   31.7   这些部分酶中部分催化核心序列的这种组合与活性MNA酶的形成相容。
  A8:B9(G6-C7)   在50个循环没有信号   这些部分酶中部分催化核心序列的这种组合在这些实验条件下不与活性MNA酶的形成相容。
  A9:B10(A5-G6)   在50个循环没有信号   这些部分酶中部分催化核心序列的这种组合在这些实验条件下不与活性MNA酶的形成相容。
当阈值荧光水平设定为0.2，并且减去循环1和14之间的基线背景荧光时，Ct值是来自三个重复反应的平均。
本实施例证明存在分离10:23DNA核酶的催化核心的几种方式，以便当部分核心序列加入部分酶时，它们能形成催化上有活性的MNA酶。本实施例还证明当加入部分酶时不是所有的部分核心序列形成活性MNA酶。本实施例中证明的方法可用来鉴定适合用于加入能装配为活性MNA酶的部分酶的部分核心序列。
专利和专利公布
PCT国际公布第WO 99/50452号
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<213>人工序列
 
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<213>人工序列
 
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gtgcccatcc atctccggtc gaaatagtga gt            32
 
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ctcatctctt ctccgagcgt gttcgacaat ggc      33
 
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ggagtgattg ggaggttagc tc                      22
 
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acggc                                          5
 
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<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸
 
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ctgtagcact cactatagga acaacgagag gaaacctt     38
 
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<213>人工序列
 
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<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸
 
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aaggtttcct ctcgttgttc ctacaacgag gttgtgctg    39
 
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<220>
<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸
 
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<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸
 
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cagcacaacc gucaccaacc g                       21
 
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<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸
 
<220>
<221>磷酸化
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<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸
 
<220>
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<213>人工序列
 
<220>
<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸
 
<220>
<221>磷酸化
<222>(37)..(37)
 
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<213>人工序列
 
<220>
<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸
 
<220>
<221>磷酸化
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<213>人工序列
 
<220>
<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸
 
<220>
<221>磷酸化
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<220>
<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸
 
<220>
<221>磷酸化
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<220>
<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸
 
<220>
<221>磷酸化
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<213>人工序列
 
<220>
<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸
 
<220>
<221>磷酸化
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<400>97
caaacgagtc ctggccttgt  ctgctacaac gagaggaaac ctt    43
 
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<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸
 
<220>
<221>磷酸化
<222>(31)..(31)
 
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tgcccaggga ggctagtgga gacggattac a    31
 
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<220>
<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸
 
<400>99
gctacccaac tgttgcatc                  19
 
<210>100
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸
 
<400>100
agcagccaca aaggcaga                   18
 
<210>101
<211>5
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸
 
<400>101
ggctc                                  5
 
<210>102
<211>6
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<220>
<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸
 
<400>102
gggctc                                6
 
<210>103
<211>7
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸
 
<400>103
tgggctc                               7
 
<210>104
<211>9
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸
 
<400>104
acgtggagg                             9
 
<210>105
<211>2
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸
 
<400>105
ac                                    2
 
<210>106
<211>5
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸
 
<400>106
acgtg                                 5

Claims (41)

1.一种用于检测至少一个靶的存在的方法，其包括
(a)提供至少第一核酸复合体的至少两个或多个寡核苷酸组分和至少两个底物，其中至少第一寡核苷酸组分和第二寡核苷酸组分只在靶存在下自装配形成包含具有连接酶活性的催化上有活性的多组分核酸酶(MNA连接酶)的至少第一核酸酶，其中所述第一寡核苷酸组分和所述第二寡核苷酸组分各自都包含能缔合形成所述MNA连接酶的完整催化核心的部分催化核心，
(b)使所述两个或多个寡核苷酸组分和至少两个底物与推测含有所述至少一个靶的样品在允许如下的条件下接触：
(1)所述至少一个催化上有活性的MNA连接酶的自装配，和
(2)所述至少一个MNA连接酶的催化活性；并
(c)确定所述至少一个MNA连接酶的催化活性的存在，其中所述催化活性的存在指示所述至少一个靶的存在。
2.一种用于检测靶的方法，其包括
a)提供包含需要与所述靶缔合以促进形成第一核酸酶的组分的第一核酸复合体，其中所述第一核酸复合体还包含至少一个底物，并
b)提供能与第一核酸酶催化的连接或切割反应产物缔合的第二核酸复合体的至少一个组分
并形成能作为第二核酸酶起作用的第二核酸复合体
其中所述第一核酸酶催化的连接或切割反应产物与第二核酸复合体的组分能够形成能作为第二核酸酶起作用的第二核酸复合体
其中所述核酸酶的至少一个具有连接酶活性，并且所述核酸酶的至少一个是多组分核酸酶(MNA酶)，其中所述MNA酶包含第一寡核苷酸组分和第二寡核苷酸组分，所述第一寡核苷酸组分和第二寡核苷酸组分各自都包含能缔合形成所述MNA酶的完整催化核心的部分催化核心，其中所述方法包括：
i)使推测含有靶的样品与所述第一核酸复合体接触，其中所述靶与所述第一核酸复合体缔合以促进形成所述第一核酸酶，并
ii)使第一核酸酶催化的连接或切割反应产物与所述第二核酸复合体的至少一个组分接触，因此允许作为所述第二核酸酶起作用的第二核酸复合体的形成，并且
其中(i)所述第一核酸酶的活性或(ii)所述第一和第二核酸酶两者的活性指示所述靶的存在。
3.如权利要求2所述的方法，其还包括
提供能与所述第一或第二核酸酶或两者催化的反应产物缔合的第三核酸复合体的至少一个组分
并形成能作为第三核酸酶起作用的第三核酸复合体，其中所述方法包括
使所述第一或第二核酸酶或两者催化的反应产物与所述第三核酸复合体的至少一个组分接触，因此允许作为所述第三核酸酶起作用的第三核酸复合体的形成，并且
其中所述第一、第二或第三核酸酶或其任意组合的活性指示所述靶的存在。
4.如权利要求3所述的方法，其还包括
提供能与所述第一、第二、或第三核酸酶的至少一个的产物缔合的至少一个其他核酸复合体的至少一个组分
并形成能作为至少一个其他核酸酶起作用的至少一个其他核酸复合体，其中所述方法包括
使所述第一、第二或第三核酸酶催化的反应产物与所述至少一个其他核酸复合体的至少一个组分接触，因此允许作为所述至少一个其他核酸酶起作用的至少一个其他核酸复合体的形成，并且
其中所述第一、第二、第三或至少一个其他核酸酶或其任意组合的活性指示所述靶的存在。
5.如权利要求1-4任一项所述的方法，其中所述核酸酶的至少一个具有切割活性。
6.如权利要求1-4任一项所述的方法，其中至少所述第二核酸酶具有连接酶活性。
7.如权利要求1-4任一项所述的方法，其中所述第一核酸酶是多组分核酸酶(MNA酶)。
8.如权利要求1-4任一项所述的方法，其中所述核酸酶的至少一个是DNA核酶。
9.如权利要求1-4任一项所述的方法，其中所述核酸酶的任一个催化的反应产物选自由装配促进子、部分酶、底物、DNA核酶、稳定臂或其组分组成的组。
10.如权利要求1-4任一项所述的方法，其中所述靶是核酸。
11.如权利要求1-4任一项所述的方法，其中所述组分的至少一个还包含至少一个适体，并且其中所述方法还包括提供所述第一核酸复合体的至少一个装配促进子和至少一个装配抑制子，其中所述靶与所述适体缔合，允许所述第一核酸复合体作为第一核酸酶起作用。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述靶是非核酸靶。
13.如权利要求1-4任一项所述的方法，其中所述核酸酶的至少一个或其任何组合催化的反应产物与之前的核酸复合体的至少一个的至少一个组分缔合，因此允许形成作为另外的所述之前的核酸酶起作用的所述之前的核酸复合体的另外至少一个。
14.一种使用级联来检测第一装配促进子的方法，其包括
a)提供第一多组分核酸酶(MNA酶)的组分、第一MNA酶的至少一个底物、DNA核酶连接酶、DNA核酶连接酶的第一底物、第二装配促进子、第二多组分核酸酶(MNA酶)的底物和第二MNA酶的第一部分酶，其中所述方法包括：
b)使待检测的所述第一装配促进子与所述第一MNA酶的所述组分在允许所述第一MNA酶的催化活性的条件下缔合，从而允许所述第一MNA酶的底物的修饰，其中所述第一MNA酶修饰所述第一MNA酶的底物的催化活性仅在存在所述第一装配促进子的情况下存在，其中：
所述第一MNA酶的组分各自都包含能缔合形成所述第一MNA酶的完整催化核心的部分催化核心；
所述第一MNA酶的底物的修饰导致所述DNA核酶连接酶的第二底物的产生；
所述DNA核酶连接酶与所述DNA核酶连接酶的第一和第二底物装配；
所述DNA核酶连接酶的催化活性产生所述第二MNA酶的第二部分酶；以及
所述第二MNA酶的第一部分酶和第二部分酶各自都包含能缔合形成所述第二MNA酶的完整催化核心的部分催化核心，并且其中：
所述第二MNA酶的第二部分酶与所述第二装配促进子和所述第二MNA酶的第一部分酶在允许所述第二MNA酶的催化活性的条件下的缔合促进了所述第二MNA酶的催化活性，从而允许所述第二MNA酶的底物的修饰，其中(i)所述第一MNA酶的底物的修饰；(ii)所述第一MNA酶的底物和所述DNA核酶连接酶的第一底物两者的修饰；或(iii)所述第一MNA酶的底物，所述DNA核酶连接酶的第一底物以及所述第二MNA酶的底物三者的修饰指示所述第一装配促进子的存在。
15.一种使用级联来检测第一装配促进子的方法，其包括
a)提供第一多组分核酸酶(MNA酶)的组分、第一MNA酶的至少一个底物、DNA核酶连接酶、所述DNA核酶连接酶的第一底物、第二多组分核酸酶(MNA酶)的底物和第二MNA酶的第一和第二部分酶，并且其中所述方法包括：
b)使待检测的所述第一装配促进子与所述第一MNA酶的组分在允许所述第一MNA酶的催化活性的条件下缔合，从而允许所述第一MNA酶的底物的修饰，其中所述第一MNA酶修饰所述第一MNA酶的底物的催化活性仅在存在所述第一装配促进子的情况下存在，其中
所述第一MNA酶的组分各自都包含能缔合形成所述第一MNA酶的完整催化核心的部分催化核心；
所述第一MNA酶的底物的修饰导致所述DNA核酶连接酶的第二底物的产生；
所述DNA核酶连接酶与所述DNA核酶连接酶的第一和第二底物装配；
所述DNA核酶连接酶的催化活性产生所述第二MNA酶的第二装配促进子，
所述第二MNA酶的第一部分酶和第二部分酶各自都包含能缔合形成所述第二MNA酶的完整催化核心的部分催化核心，并且
其中所述第二装配促进子与所述第二MNA酶的第一和第二部分酶在允许所述第二MNA酶的催化活性的条件下的缔合促进了所述第二MNA酶的催化活性，从而允许所述第二MNA酶的底物的修饰，其中(i)所述第一MNA酶的底物的修饰；(ii)所述第一MNA酶的底物和所述DNA核酶连接酶的第一底物两者的修饰；或(iii)所述第一MNA酶的底物，所述DNA核酶连接酶的第一底物以及所述第二MNA酶的底物三者的修饰指示所述第一装配促进子的存在。
16.如权利要求14所述的方法，其中所述第二多组分核酸酶(MNA酶)催化的反应产物是允许第三核酸酶的功能所需的组分。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述第三核酸酶催化的反应产物是参与所述第二多组分核酸酶(MNA酶)或所述DNA核酶连接酶或两者催化的反应的组分。
18.一种使用级联来检测第一装配促进子的方法，其包括
a)提供：第一多组分核酸酶(MNA酶)的组分；第一MNA酶的底物；第二多组分核酸酶(MNA酶)的组分，其中所述第二MNA酶具有连接酶活性；所述第二MNA酶的装配促进子；所述第二MNA酶的第一底物；第三多组分核酸酶(MNA酶)的装配促进子；所述第三MNA酶的底物和所述第三MNA酶的第一部分酶，其中，
所述第一MNA酶的组分各自都包含能缔合形成所述第一MNA酶的完整催化核心的部分催化核心；
所述第二MNA酶的组分各自都包含能缔合形成所述第二MNA酶的完整催化核心的部分催化核心；并且其中所述方法包括：
b)使待检测的所述第一装配促进子与所述第一MNA酶的所述组分在允许所述第一MNA酶的催化活性的条件下缔合，从而允许所述第一MNA酶的底物的修饰，其中所述第一MNA酶修饰所述第一MNA酶的底物的催化活性仅在存在所述第一装配促进子的情况下存在，其中
所述第一MNA酶的底物的修饰导致第二MNA酶的第二底物的产生；并且
其中所述第二MNA酶的装配促进子促进所述第二MNA酶的组分与所述第二MNA酶的第一底物和所述第二MNA酶的所述第二底物的装配；并且
其中所述第二MNA酶的催化连接酶活性产生所述第三MNA酶的第二部分酶，并且所述第三MNA酶的第一部分酶和第二部分酶各自都包含能缔合形成所述第三MNA酶的完整催化核心的部分催化核心，并且其中：
所述第三MNA酶的所述第一和第二部分酶与所述第三装配促进子在允许所述第三MNA酶的催化活性的条件下的缔合促进了所述第三MNA酶的催化活性，从而允许所述第三MNA酶的底物的修饰，并且其中(i)所述第一MNA酶的底物的修饰；(ii)所述第一MNA酶的底物以及所述第二MNA酶的第一底物和第二底物三者的修饰；或(iii)所述第一MNA酶的底物，所述第二MNA酶的第二底物以及所述第三MNA酶的底物三者的修饰指示所述第一装配促进子的存在。
19.一种使用级联来检测第一装配促进子的方法，其包括
a)提供：第一多组分核酸酶(MNA酶)的组分；所述第一MNA酶的底物；第二多组分核酸酶(MNA酶)的组分，其中所述第二MNA酶具有连接酶活性；所述第二MNA酶的第二装配促进子；所述第二MNA酶的第一底物；第三多组分核酸酶(MNA酶)的第一和第二部分酶和所述第三MNA酶的底物，其中，
所述第一MNA酶的组分各自都包含能缔合形成所述第一MNA酶的完整催化核心的部分催化核心；
所述第二MNA酶的组分各自都包含能缔合形成所述第二MNA酶的完整催化核心的部分催化核心；并且其中所述方法包括：
b)使待检测的所述第一装配促进子与所述第一MNA酶的组分在允许所述第一MNA酶的催化活性的条件下缔合，从而允许所述第一MNA酶的底物的修饰，其中所述第一MNA酶修饰所述第一MNA酶的底物的催化活性仅在存在所述第一装配促进子的情况下存在，其中：
所述第一MNA酶的底物的修饰导致所述第二MNA酶的第二底物的产生；并且
其中所述第二MNA酶的装配促进子促进所述第二MNA酶的组分与所述第二MNA酶的第一底物和所述第二MNA酶的第二底物的装配；并且
其中所述第二MNA酶的催化连接酶活性产生所述第三MNA酶的第三装配促进子，并且所述第三MNA酶的第一部分酶和第二部分酶各自都包含能缔合形成所述第三MNA酶的完整催化核心的部分催化核心，并且其中：
所述第三MNA酶的所述第一和第二部分酶与所述第三装配促进子在允许所述第三MNA酶的催化活性的条件下的缔合促进了所述第三MNA酶的催化活性，从而允许所述第三MNA酶的底物的修饰，其中(i)所述第一MNA酶的底物的修饰；(ii)所述第一MNA酶的底物以及所述第二MNA酶的第二底物二者的修饰；或(iii)所述第一MNA酶的底物，所述第二MNA酶的第一底物和第二底物以及所述第三MNA酶的底物四者的修饰指示所述第一装配促进子的存在。
20.如权利要求18所述的方法，其中所述第三多组分核酸酶(MNA酶)催化的反应产物是允许第四核酸酶功能所需的组分。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述第四核酸酶催化的反应产物是参与所述第二或第三多组分核酸酶(MNA酶)或两者催化的反应的组分。
22.如权利要求14-21任一项所述的方法，其中所述底物的任一个或其组合的修饰提供可检测的效应。
23.如权利要求14-21任一项所述的方法，其中至少一个底物的修饰选自核酸的切割和核酸的连接。
24.如权利要求14-21任一项所述的方法，其中所述第一装配促进子是待鉴定、待检测或待定量的靶。
25.如权利要求14-17任一项所述的方法，其中所述DNA核酶连接酶选自由DNA核酶连接酶7Z81、7Z48、7Q10和9DB1组成的组。
26.如权利要求14所述的方法，其中所述第二多组分核酸酶(MNA酶)的产物是所述DNA核酶连接酶的第二底物，并且其中所述DNA核酶连接酶促进所述DNA核酶连接酶的第一底物和第二底物的连接，因此产生所述第二MNA酶的另外的第二部分酶。
27.如权利要求15所述的方法，其中所述第二多组分核酸酶(MNA酶)的产物是所述DNA核酶连接酶的第二底物，并且其中所述DNA核酶连接酶促进所述DNA核酶连接酶的第一底物和第二底物的连接，因此产生所述第二MNA酶的另外的第二装配促进子。
28.如权利要求18所述的方法，其中所述第三多组分核酸酶(MNA酶)的产物是所述第二多组分核酸酶(MNA酶)的第二底物，并且其中所述第二多组分核酸酶(MNA酶)促进所述第二MNA酶的第一底物和第二底物的连接，因此产生所述第三MNA酶的另外的第二部分酶。
29.如权利要求19所述的方法，其中所述第三多组分核酸酶(MNA酶)的产物是所述第二多组分核酸酶(MNA酶)的第二底物，并且其中所述第二多组分核酸酶(MNA酶)促进所述第二MNA酶的第一底物和第二底物的连接，因此产生所述第三MNA酶的另外的第三装配促进子。
30.一对分离核酸作为催化核心序列加入具有连接酶活性的多组分核酸酶(MNA连接酶)的部分酶对的应用，其中所述核酸对选自由以下组成的组：TGGAGGTGGGCTC(SEQ ID NO:47)和ACG(SEQ ID NO:48)，GGAGGTGGGCTC(SEQ ID NO:49)和ACGT(SEQ ID NO:50)，GGAGGTTAGCTC(SEQ ID NO:71)和ACGGCGGAGTGATTG(SEQ IDNO:72)，TGGGAGGTTAGCTC(SEQ ID NO:73)和ACGGCGGAGTGAT(SEQ ID NO:74)，ATTGGGAGGTTAGCTC(SEQ ID NO:75)和ACGGCGGAGTG(SEQ ID NO:76)，TGATTGGGAGGTTAGCTC(SEQ IDNO:77)和ACGGCGGAG(SEQ ID NO:78)，AGTGATTGGGAGGTTAGCTC(SEQ ID NO:79)和ACGGCGG(SEQ IDNO:80)，GGAGTGATTGGGAGGTTAGCTC(SEQ ID NO:81)和ACGGC(SEQ ID NO:82)。
31.一种具有连接酶活性的多组分核酸酶(MNA连接酶)，其包含作为催化核心序列加入部分酶对的一对分离核酸，其中所述核酸对选自由以下组成的组：TGGAGGTGGGCTC(SEQ ID NO:47)和ACG(SEQ ID NO:48)，GGAGGTGGGCTC(SEQ ID NO:49)和ACGT(SEQ ID NO:50)，GGAGGTTAGCTC(SEQ ID NO:71)和ACGGCGGAGTGATTG(SEQ IDNO:72)，TGGGAGGTTAGCTC(SEQ ID NO:73)和ACGGCGGAGTGAT(SEQ ID NO:74)，ATTGGGAGGTTAGCTC(SEQ ID NO:75)和ACGGCGGAGTG(SEQ ID NO:76)，TGATTGGGAGGTTAGCTC(SEQID NO:77)和ACGGCGGAG(SEQ ID NO:78)，AGTGATTGGGAGGTTAGCTC(SEQ ID NO:79)和ACGGCGG(SEQ IDNO:80)，GGAGTGATTGGGAGGTTAGCTC(SEQ ID NO:81)和ACGGC(SEQ ID NO:82)。
32.一种具有连接酶活性的多组分核酸酶(MNA连接酶)连接两个底物的应用，其中在所述两个底物被所述MNA连接酶的底物臂接合后，所述两个底物由所述MNA连接酶连接形成产物，并且其中所述MNA连接酶的第一寡核苷酸组分和第二寡核苷酸组分各自都包含能缔合形成所述MNA连接酶的完整催化核心的部分催化核心。
33.如权利要求32所述的应用，其中所述产物与至少一个核酸复合体的组分缔合。
34.如权利要求32所述的应用，其中所述产物选自由装配促进子、部分酶、底物、DNA核酶、稳定臂、活性抑制子、装配抑制子、及其组分组成的组。
35.如权利要求32-34中任一项所述的应用，其中所述产物能参与级联。
36.如权利要求32所述的应用，其中至少一个底物是核酸酶催化的反应产物。
37.一种用于检测多个靶的方法，其包括：
a)提供多个第一核酸复合体，其每个包含需要与所述多个靶之一缔合以促进多个第一核酸酶形成的组分，其中所述多个第一核酸复合体的每个还包含至少一个底物，并且
b)提供多个第二核酸复合体的每个的至少一个组分，其能与所述多个第一核酸酶催化的多个反应产物缔合并形成能作为多个第二核酸酶起作用的多个第二核酸复合体，其中所述核酸酶的至少一个具有连接酶活性，并且所述核酸酶的至少一个是多组分核酸酶(MNA酶)，并且所述MNA酶的组分各自都包含能缔合形成所述MNA酶的完整催化核心的部分催化核心，并且其中所述方法包括：
i)使推测含有所述多个靶的样品与所述多个第一核酸复合体接触，其中所述多个靶与所述多个第一核酸复合体缔合以促进所述多个第一核酸酶的形成，并且
ii)使所述多个第一核酸酶催化的多个反应产物与所述多个第二核酸复合体的每个的至少一个组分接触，因此允许作为所述多个第二核酸酶起作用的多个所述第二核酸复合体的形成，并且
其中所述第一或第二或两者的多个核酸酶的活性指示所述多个靶的存在。
38.如权利要求37所述的方法，其中所述多个第一或第二核酸酶的任一个催化的反应产物的至少一个是允许至少一个其他核酸酶的功能所需的组分。
39.如权利要求37或38所述的方法，其中所述核酸酶的任一个催化的反应产物的至少一个与之前的核酸复合体的任一个的组分缔合，因此允许所述核酸复合体的至少一个作为另外的核酸酶起作用。
40.至少两个寡核苷酸作为具有连接酶活性的多组分核酸酶(MNA连接酶)底物的应用，其中在所述底物被MNA连接酶的底物臂接合后，所述底物被所述MNA连接酶修饰，其中所述MNA连接酶的第一寡核苷酸组分和第二寡核苷酸组分各自都包含能缔合形成所述MNA连接酶的完整催化核心的部分催化核心。
41.一种用于检测至少两个靶的方法，其中所述方法包括：
a)提供至少两个核酸复合体，其每个包含需要与所述靶的至少一个缔合以促进至少两个核酸酶复合体形成的组分，并且
b)使推测含有所述至少两个靶的样品与所述至少两个核酸复合体接触，其中所述靶与所述核酸复合体缔合以促进所述核酸酶复合体的形成，并且其中每个核酸酶复合体的活性产生的至少一个产物是其他核酸酶复合体形成所需的，并且
其中所述其他核酸酶复合体的活性指示所述至少两个靶的存在，并且其中所述核酸酶复合体的至少一个具有连接酶活性，
所述核酸酶复合体的至少一个是多组分核酸酶(MNA酶)复合体，并且
所述MNA酶复合体的第一寡核苷酸组分和第二寡核苷酸组分各自都包含能缔合形成所述MNA酶复合体的完整催化核心的部分催化核心。
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