BR112020000845A2 - método para normalizar dados quantitativos obtidos por amplificação de ácidos nucleicos de uma célula, organismo ou vírus - Google Patents

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Abstract

A presente invenção fornece métodos para normalização quantitativa de dados e/ou determinação de níveis de transcrição em células, organismos, vírus e similares. Os métodos podem ser usados em inúmeras aplicações, incluindo, mas não se limitando a, determinar a regulação positiva e negativa da transcrição, identificação da perturbação da transcrição, determinação da viabilidade/morte e avaliação das respostas ao tratamento com agentes (por exemplo, resistência ou sensibilidade aos fármacos).

Description

“MÉTODO PARA NORMALIZAR DADOS QUANTITATIVOS OBTIDOS POR AMPLIFICAÇÃO DE ÁCIDOS NUCLEICOS DE UMA CÉLULA, ORGANISMO OU VÍRUS” Incorporação por Referência Cruzada
[001] Este pedido reivindica prioridade do pedido de patente provisório australiano número 2017905138 depositado em 21 de dezembro de 2017, cujo conteúdo inteiro é incorporado aqui por referência cruzada. Campo técnico
[002] A presente invenção se refere geralmente ao campo da biologia molecular. Mais especificamente, a presente invenção fornece métodos para normalização quantitativa de dados e/ou determinação de níveis de transcrição em células, organismos, vírus e similares. Os métodos podem ser usados em inúmeras aplicações, incluindo, mas não se limitando a, determinar a regulação positiva e negativa da transcrição, identificação da perturbação da transcrição, determinação da viabilidade/morte e avaliação das respostas ao tratamento com agentes (por exemplo, resistência ou sensibilidade aos fármacos). Antecedentes
[003] Os avanços na biologia molecular melhoraram muito a capacidade de caracterizar células e interrogar seus genomas e transcriptomas em busca de evidências de alterações associadas a doenças e/ou estímulos externos. Por exemplo, variações específicas na sequência são encontradas em associação com doenças adquiridas ou herdadas, como câncer ou fibrose cística. Alterações na expressão do gene estão associadas aos estados da doença e à resposta aos estímulos. Além disso, a presença de uma sequência estranha pode indicar a presença de agentes infecciosos, tais como bactérias ou vírus. Os testes da Tecnologia de Amplificação de Ácidos Nucleicos (NAAT) têm ampla aplicação em todos esses campos para pesquisa básica, pesquisa clínica e diagnóstico clínico.
[004] Os métodos de amplificação in vitro de ácidos nucleicos têm aplicações amplamente difundidas nos testes NAAT. Tais métodos incluem reação em cadeia da polimerase (PCR), amplificação de deslocamento de cadeia (SDA), amplificação dependente de helicase (HDA), amplificação de recombininase polimerase (RPA), amplificação isotérmica mediada por alça (LAMP), amplificação de círculo rolante (RCA), amplificação mediada por transcrição (TMA), replicação de sequência autossustentada (3SR), amplificação baseada em sequência de ácido nucleico (NASBA). Vários tipos de PCR foram descritos, incluindo PCR quantitativo em tempo real, reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa (RT-PCR) e PCR digital. Cada uma destas estratégias de amplificação alvo requer o uso de iniciadores oligonucleotídicos. O processo de amplificação resulta na amplificação exponencial de sequências alvo que incorporam os iniciadores oligonucleotídicos nos seus terminais 5' e que contêm cópias recém-sintetizadas das sequências localizadas entre os iniciadores. Técnicas de amplificação de sinal como EzyAmp, Reação em Cadeia Ramificada ou DoC também podem ser usadas para testes NAAT.
[005] A normalização da expressão gênica (níveis de RNA) é um tópico controverso, com vários prós e contras existentes para cada uma das estratégias disponíveis. Isso inclui a normalização do tamanho da amostra, o RNA total ou o RNA ribossômico, o RNAm dos genes de limpeza e o DNA genômico.
A normalização para o mRNA de genes de manutenção requer seleção criteriosa de alvos, pois seus níveis de estabilidade e expressão podem ser afetados por condições experimentais ou ambientais. Além disso, nas bactérias, os níveis de expressão podem variar durante o ciclo de desenvolvimento bacteriano. Os níveis de RNA ribossômico (rRNA), embora abundantes e com meias-vidas mais longas, também podem alterar a expressão nas condições experimentais ou ambientais da resposta; e níveis similares de bactérias podem mudar durante o ciclo de desenvolvimento. Além disso, com o rRNA representando 80% da fração total de RNA, há um desequilíbrio significativo entre o rRNA e o mRNA, o último compreendendo apenas 2-5%. Pensa-se que o DNA genômico seja um bom candidato à normalização da expressão génica, uma vez que está sempre presente, estável e é geralmente invariável. O DNA genômico demonstrou gerar resultados mais precisos e reproduzíveis.
[006] Existem, no entanto, várias limitações do uso de DNA genômico como alvo para normalização dos níveis de RNA. A maioria dos protocolos não extrai simultaneamente o RNA e o DNA de uma amostra e, portanto, estes são extraídos separadamente, quantificados e subsequentemente amplificados separadamente em reações paralelas que tipicamente contêm, ou não transcriptase reversa, respectivamente. Como tal, existe uma grande margem de erro ao comparar esses dois protocolos muito diferentes e usar os resultados de (i) um primeiro protocolo (extração e amplificação de DNA, por exemplo, PCR) para normalizar os resultados de (ii) um segundo protocolo (extração e amplificação de RNA por, por exemplo, RT-PCR). Além disso, esses protocolos paralelos são caros, trabalhosos e demorados.
[007] Os NAATs fornecem um padrão-ouro para a análise de infecções bacterianas, devido à sua alta sensibilidade e especificidade, rápido tempo de resposta, capacidade de ser executada em vários tipos de amostra e capacidade de atingir qualquer espécie bacteriana. No entanto, para algumas aplicações específicas, os métodos atuais têm desvantagens. Em particular, eles não são adequados para distinguir entre patógenos viáveis e mortos. Por exemplo, o DNA bacteriano não é um bom marcador de viabilidade celular porque esse DNA pode sobreviver por semanas após a morte da célula. Esse fato lança luz sobre os limites dos ensaios disponíveis, com o uso não informativo de métodos de quantificação e o monitoramento ineficiente do status da infecção ou da eficácia do tratamento. A superestimação potencial da positividade também pode ocorrer.
[008] A demanda por métodos de detecção mais informativos e precisos é imperativa, especialmente quando aplicada a infecções sexualmente transmissíveis (DSTs). Novas ferramentas são necessárias com urgência, principalmente nos casos em que patógenos estão presentes, mas os pacientes são assintomáticos e/ou onde os patógenos apresentam altas taxas de resistência antimicrobiana (RAM). Para essas infecções, é necessário um teste de cura (TOC) para confirmar a depuração bem-sucedida. Essa confirmação da cura reduzirá o potencial de complicações adicionais, correlacionadas com a infecção inicial, e limitará a prevalência e a disseminação de patógenos e cepas resistentes aos fármacos. Atualmente, os métodos TOC estão limitados a ensaios NAAT, realizados em um único momento após o tratamento, e o tempo ideal pode mudar dependendo das espécies que causam as DST. Um resultado positivo pode inferir a falha do tratamento, mas também pode refletir a detecção de fragmentos de DNA e/ou RNA não viáveis.
[009] Existem várias técnicas para resolver esse problema. Os métodos para determinar a viabilidade incluem monitoramento metabólico através de novos métodos de cultura, estimulação induzida por evaporação da osmorregulação bacteriana, teste de sensibilidade a antibióticos (AST), como a tecnologia Smarticles, detecção baseada em bacteriófagos e análise pré-rRNA por meio de bacteriófagos. Embora estes tenham demonstrado algum sucesso na diferenciação de bactérias viáveis e mortas, todos os itens acima ainda dependem de procedimentos de cultura para obter um resultado. Técnicas alternativas de viabilidade afastam-se dos métodos de cultura. Por exemplo, alguns se concentram em corantes intercalantes, aplicados antes do processo de extração de DNA, por exemplo, monoazida de etídio (EMA) e monoazida de propódio (PMA). Os corantes se ligam ao DNA de fita dupla, células externas existentes ou após a infiltração do corante através das paredes quebradas das células. Isso torna o DNA de bactérias mortas resistente à subsequente amplificação por PCR. Essa abordagem tem sido amplamente aplicada em amostras clínicas, detecção de patógenos ambientais e transmitidos por alimentos, no entanto, as limitações também são evidentes e foram revisadas. Os corantes não são adequados para todos os tipos de amostras ou bactérias, com variabilidade tanto nas condições de incubação quanto nas concentrações necessárias. Foi demonstrado extensivamente que a inibição do sinal pode surgir a partir de células vivas que penetram no corante e a detecção falso-positiva pode ocorrer como consequência de uma carga bacteriana alta não viável.
[0010] A detecção de RNA é outro método com potencial para avaliar a viabilidade celular, uma vez que é menos estável que o DNA e, portanto, um reflexo mais verdadeiro da viabilidade. Esses métodos, no entanto, exigem melhorias adicionais, já que também se demonstrou que os transcritos de RNA persistem por longos períodos de tempo, após tratamento ou morte celular. Isso torna vital a seleção criteriosa dos parâmetros apropriados de transcrições e amplicons, além da capacidade de eliminar completamente o DNA contaminante das preparações de RNA. Assim, há a necessidade de mais investigação sobre estratégias precisas baseadas em RNA para quantificar bactérias viáveis.
[0011] Uma outra área de necessidade é por métodos que permitam rastrear a resistência ou sensibilidade ao fármaco. Em particular, testes rápidos de suscetibilidade antimicrobiana são urgentemente necessários para informar a terapia de cada paciente para impedir a propagação de patógenos resistentes. Além disso, esse método poderia ser usado como métodos de triagem para programas de descoberta de fármacos. A invenção aqui descrita pode gerar resultados mais informativos, diferenciando entre a presença e ausência de agentes infecciosos e, por sua vez, entre infecções não limpas e limpas. Envolve uma abordagem alternativa de analisar simultaneamente o RNA e o DNA presentes em uma única amostra de ácido nucleico total (TNA).
[0012] A invenção descrita neste documento tem aplicação nessas áreas e em outras. Ele fornece um método para normalizar o nível de transcrição ativa em uma única reação. Estudos anteriores que tentaram normalizar os níveis de RNA para DNA apresentam deficiências. Nesses estudos, os pesquisadores extraíram RNA e DNA de uma amostra, amplificaram-nas em reações paralelas separadas de RT-PCR e PCR e, em seguida, normalizaram os níveis de expressão gênica (RNA) para os níveis gerados a partir do DNA. Existem muitos problemas com essa abordagem. Em primeiro lugar, embora o RNA e o DNA possam ter se originado da mesma amostra, eles são processados de maneira diferente para extrair as duas espécies diferentes de ácido nucleico (DNA versus RNA) e, portanto, é improvável que a eficiência da extração seja igual. Da mesma forma, pode haver um viés de amostragem dessas duas amostras extraídas quando alíquotas são colocadas em tubos separados para análise. Além disso, uma vez que eles são amplificados em diferentes misturas de reação de PCR, que diferem na composição (por exemplo, pelo menos pela presença ou ausência de transcriptase reversa) e frequentemente nos perfis de termociclagem, é difícil fazer comparações significativas. A invenção a seguir supera essas limitações.
[0013] É bem sabido na técnica que é possível co-extrair simultaneamente o DNA e o RNA, que juntos são chamados de "ácido nucleico total" (TNA). Entretanto, um aspecto de um RT-PCR, que geralmente não é discutido na literatura, é que protocolos que amplificam um transcrito de RNA específico (RNA-X) em uma amostra de TNA também co-amplificam o DNA (DNA-X) de o gene a partir do qual o RNA-X alvo específico foi transcrito. O inverso também é verdadeiro, pois, em uma reação de transcriptase reversa, não é possível amplificar apenas uma sequência de DNA específica (DNA- X), se esse DNA é um gene ou sequência que é transcrita ativamente, porque o RNA transcrito (RNA -X) também co- amplificará. Em outras palavras, os produtos de amplificação de uma RT-PCR a partir de uma amostra de TNA são sempre a soma dos amplicons derivados do RNA-X e do DNA-X (RNA-X mais DNA-X), se o DNA-X for transcrito para gerar RNA-X. Como tal, não é possível normalizar um RNA-Y não relacionado específico com uma sequência genômica de DNA-X se essa sequência for transcrita.
[0014] A presente invenção procura superar uma ou mais das dificuldades existentes na técnica anterior, preparando amostras de ácido nucleico compreendendo DNA e RNA (por exemplo, TNA) e co-amplificando (i) um gene (DNA-X) e seu RNA associado produtos de transcrição (RNA-X), juntamente com uma região não relacionada do DNA (DNA-N) que não é transcrita. O DNA-N pode então ser usado para normalizar os níveis de DNA-X mais RNA-X. Além disso, é possível usar vários conjuntos de iniciadores visando vários genes ou regiões transcritos e seus transcritos associados, por exemplo, DNA-X mais RNA-X e DNA-Y mais RNA-Y podem ser normalizados para um DNA-N não transcrito. Opcionalmente, por conveniência, a razão obtida pela divisão dos dados da análise de múltiplos alvos de DNA/RNA transcritos pela de um único DNA-N não transcrito pode ser novamente dividida pelo número de conjuntos de iniciadores direcionados aos conjuntos de DNA/transcrito/Espécies de RNA. A invenção será mais esclarecida por meio dos seguintes exemplos. Sumario da invenção
[0015] A presente invenção pode envolver a co- amplificação de três espécies de ácidos nucleicos (por exemplo, simultaneamente) em uma amostra compreendendo DNA e RNA (por exemplo, de uma amostra de ácido nucleico total (TNA)). Estas espécies são (i) gene (s), (ii) transcritos expressos a partir desse (s) gene (s) e (iii) sequências de DNA não expressas (isto é, não transcritas). Juntas, a medição combinada de um gene e seus transcritos correspondentes é frequentemente referida aqui como GAT (Gene And Transcript) e a medição de DNA não transcrito é frequentemente referida aqui como NED (DNA não expresso). Os métodos da presente invenção envolvem co-amplificar essas espécies juntos ou separadamente, e usar a razão das estimativas de GAT e NED como um indicador da capacidade transcricional, que por sua vez pode ser usada para avaliar características como viabilidade celular, células morte, perturbação funcional das células resultante de um estímulo externo ou de um estado de doença e similares.
[0016] A presente invenção se refere, pelo menos em parte, às modalidades 1 a 48 listadas abaixo:
[0017] Modalidade 1. Método para normalizar dados quantitativos obtidos pela amplificação de ácidos nucleicos de uma célula, organismo ou vírus, caracterizado pelo fato de que o método compreende: i) obtenção de dados quantitativos - Da amplificação do DNA genômico de um primeiro gene e RNA transcrito a partir do primeiro gene, e - Da amplificação de uma sequência de DNA não transcrito na célula, organismo ou vírus; e (ii) usar os dados quantitativos para derivar um valor normalizado (nV) representativo das quantidades relativas de: - Os referidos transcritos genômicos de DNA e RNA do primeiro gene, para - O referido DNA genômico que não é transcrito, presente na amostra de ácido nucleico antes da referida amplificação.
[0018] Modalidade 2. O método de acordo com a modalidade 1, em que os dados quantitativos são o número da cópia do amplificador e o método compreende: - Obter um valor A (vA) representando o número total de amplicons gerado a partir da amplificação dos referidos transcritos de DNA e RNA genômico do primeiro gene, e um valor B (vB) representando o número total de amplicons gerado a partir da sequência de DNA não transcrito; - Cálculo de um valor normalizado (nV) usando a equação: vA/vB = nV ou uma forma equivalente da mesma.
[0019] Modalidade 3. O método de acordo com a modalidade 1, em que os dados quantitativos são o número da cópia do amplificador e o método compreende: - Obter um valor X (vX) que representa o número total de amplicons gerado a partir de: amplificação de transcritos de DNA e RNA genômicos do primeiro gene e amplificação de transcritos de DNA e RNA genômicos de pelo menos um gene adicional; - Obtenção de um valor B (vB) que representa o número total de amplicons gerado a partir da sequência de DNA não transcrito, - Cálculo de um valor normalizado (nV) usando a equação: vX/(vB x (X + 1)) = nV ou uma forma equivalente da mesma, em que X é o número do (s) referido (s) gene (s) adicional (ais).
[0020] Modalidade 4. O método de acordo com a modalidade 2 ou modalidade 3, em que a amplificação é a reação em cadeia da polimerase digital (dPCR).
[0021] Modalidade 5. O método de acordo com a modalidade 1, em que os dados quantitativos são o valor limiar (Ct), e o método compreende: - Obter um valor limite de ciclo CtA a partir da amplificação dos referidos transcritos genômicos de DNA e RNA do primeiro gene, - Obter um valor limiar de ciclo CtB a partir da amplificação da sequência de DNA não transcrito; e - Cálculo de um valor normalizado (nV) usando a equação: 2CtB-CtA = nV ou uma forma equivalente da mesma.
[0022] Modalidade 6. O método de acordo com a modalidade 1, em que os dados quantitativos são o valor limiar (Ct), e o método compreende: - Obter um valor limiar de ciclo CtX a partir de: amplificação dos referidos transcritos genômicos de DNA e RNA do primeiro gene e da amplificação dos transcritos genômicos de DNA e RNA de pelo menos um gene adicional; - Obter um valor limiar de ciclo CtB a partir da amplificação da sequência de DNA não transcrito; e - Cálculo de um valor normalizado (nV) usando a equação: 2CtB - CtX/(X +1) = nV ou uma forma equivalente da mesma, em que X é o número do (s) referido (s) gene (s) adicional (ais).
[0023] Modalidade 7. O método de acordo com a modalidade 5 ou da modalidade 6, em que a amplificação é uma reação quantitativa em cadeia da polimerase (qPCR).
[0024] Modalidade 8. O método de acordo com qualquer uma das modalidades de 1 a 7, em que a sequência de DNA não transcrito é DNA genômico.
[0025] Modalidade 9. O método de acordo com qualquer uma das modalidades de 1 a 8, compreendendo ainda realizar a referida amplificação dos ácidos nucleicos a partir da célula, organismo ou vírus.
[0026] Modalidade 10. O método de acordo com qualquer uma das modalidades de 1 a 9, em que os ácidos nucleicos da célula, organismo ou vírus são um extrato do total de ácidos nucleicos.
[0027] Modalidade 11. O método de acordo com qualquer uma das modalidades de 1 a 10, em que qualquer referida amplificação é conduzida usando: reação em cadeia da polimerase (PCR), reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa (RT-PCR), amplificação de deslocamento de cadeia (SDA), amplificação isotérmica mediada por alça (LAMP), amplificação de círculo rolante (RCA), amplificação de recombinase polimerase (RPA), amplificação dependente de helicase (HDA), amplificação baseada em invasão de cadeia (SIBA), amplificação mediada por transcrição (TMA), replicação autossustentada de sequência (3SR), amplificação baseada em sequência de ácido nucleico (NASBA) ou qualquer combinação dos mesmos.
[0028] Modalidade 12. O método de acordo com qualquer uma das modalidades de 1 a 11, compreendendo ainda o uso do valor normalizado (nV) para avaliar o nível de atividade transcricional na célula, organismo ou vírus.
[0029] Modalidade 13. O método de acordo com qualquer uma das modalidades de 1 a 12, compreendendo ainda:
- Obter um valor normalizado negativo da transcrição (nV-) gerado usando uma série dos referidos valores normalizados (nV) obtidos de indivíduos de uma população de células, organismos ou vírus que não possuem atividade transcricional; e - Comparar o valor normalizado (nV) obtido pela referida amplificação de ácidos nucléicos da célula, organismo ou vírus ao valor normalizado negativo para transcrição (nV-), para assim avaliar o nível de atividade transcricional na célula, organismo ou vírus.
[0030] Modalidade 14. O método de acordo com a modalidade 13, em que o valor normalizado negativo para transcrição (nV-) é um valor médio gerado a partir da referida série dos referidos valores normalizados (nV).
[0031] Modalidade 15. O método de acordo com a modalidade 13 ou da modalidade 14, em que: - O valor normalizado da transcrição negativa (nV-) é utilizado como valor base para avaliar a presença ou a ausência de atividade transcricional na célula, organismo ou vírus; e - Uma ausência de atividade transcricional é indicada quando o valor normalizado (nV) obtido pela referida amplificação de ácidos nucleicos da célula, organismo ou vírus é igual ou inferior ao valor normalizado negativo para a transcrição (nV- ); ou - A atividade transcricional é indicada quando o valor normalizado (nV) obtido pela referida amplificação de ácidos nucleicos da célula, organismo ou vírus está acima do valor normalizado negativo para a transcrição (nV-).
[0032] Modalidade 16. O método de acordo com qualquer uma das modalidades de 13 a 15, em que o referido valor normalizado negativo para transcrição (nV-): - Incorpora variação estatística na referida série de valores normalizados (nV) de indivíduos da população de células, organismos ou vírus que sabidamente não possuem atividade transcricional; e/ou - É fornecido com um intervalo de confiança de que o referido valor normalizado negativo da transcrição (nV-) é preditivo de uma presença ou ausência de atividade transcricional na célula, organismo ou vírus.
[0033] Modalidade 17. O método de acordo com a modalidade 16, em que o intervalo de confiança é superior a 90% ou superior a 95%.
[0034] Modalidade 18. O método de acordo com qualquer uma das modalidades de 13 a 17, compreendendo ainda: - Obter um valor normalizado positivo da transcrição (nV+) gerado usando uma série dos referidos valores normalizados (nV) obtidos de indivíduos de uma população de células, organismos ou vírus que possuem atividade transcricional; e - Comparar o valor normalizado (nV) obtido pela referida amplificação de ácidos nucleicos da célula, organismo ou vírus com o valor normalizado positivo para transcrição (nV+), para assim avaliar o nível de atividade transcricional na célula, organismo ou vírus.
[0035] Modalidade 19. O método de acordo com a modalidade 18, em que o valor normalizado positivo para transcrição (nV+) é um valor médio gerado a partir da referida série dos referidos valores normalizados (nV).
[0036] Modalidade 20. O método de acordo com a modalidade 18 ou a modalidade 19, em que: - O valor normalizado positivo da transcrição (nV+) é utilizado como valor base para a atividade transcricional na célula, organismo ou vírus; e - Falta ou ausência de atividade transcricional é indicada quando o valor normalizado (nV) obtido pela referida amplificação de ácidos nucleicos da célula, organismo ou vírus está abaixo do valor normalizado positivo para transcrição (nV+); ou - A atividade transcricional é indicada quando o valor normalizado (nV) obtido pela referida amplificação de ácidos nucleicos da célula, organismo ou vírus é igual ou superior ao valor normalizado positivo para transcrição (nV+).
[0037] Modalidade 21. O método de acordo com qualquer uma das modalidades de 18 a 20, caracterizado pelo fato de que o referido valor normalizado positivo para transcrição (nV+): - Incorpora variação estatística nas referidas séries de valores normalizados (nV) de indivíduos da população de células, organismos ou vírus que possuem atividade transcricional; e/ou - É fornecido com um intervalo de confiança de que o referido valor normalizado positivo para transcrição (nV+) é preditivo de uma presença ou ausência de atividade transcricional na célula, organismo ou vírus.
[0038] Modalidade 22. O método de acordo com a modalidade 21, em que o intervalo de confiança é superior a 90% ou superior a 95%.
[0039] Modalidade 23. O método de acordo com a modalidade 13, compreendendo ainda:
- Obter um valor normalizado negativo da transcrição (nV-) gerado usando uma série dos referidos valores normalizados (nV) obtidos de indivíduos de uma população de células, organismos ou vírus que não possuem atividade transcricional; - Obter um valor normalizado positivo da transcrição (nV+) gerado usando uma série dos referidos valores normalizados (nV) obtidos de indivíduos de uma população de células, organismos ou vírus que possuem atividade transcricional; e - Comparar o valor normalizado (nV) obtido pela referida amplificação de ácidos nucleicos da célula, organismo ou vírus a: (i) o valor normalizado negativo para a transcrição (nV-) e o valor normalizado positivo da transcrição (nV+), ou (ii) a um valor normalizado da transcrição combinada (nV+) intermediário ao valor normalizado negativo da transcrição (nV- ) e ao valor normalizado positivo da transcrição (nV+), para avaliar o nível de atividade transcricional na célula, organismo ou vírus. Modalidade 24. O método de acordo com a modalidade 23, em que o valor normalizado da transcrição combinada (nV) é calculado usando a equação: (nV+) + (nV-)/2 = (nV) ou uma forma equivalente da mesma.
[0040] Modalidade 25. O método de acordo com a modalidade 24, em que o referido valor normalizado da transcrição combinada (nV): - Incorpora variação estatística nas referidas séries de valor normalizado negativo para transcrição (nV-) e/ou valor normalizado positivo para transcrição negativa (nV+); e/ou
- É fornecido com um intervalo de confiança de que o referido valor normalizado da transcrição combinada (nV+) é preditivo de uma presença ou ausência de atividade transcricional na célula, organismo ou vírus.
[0041] Modalidade 26. O método de acordo com a modalidade 25, em que o intervalo de confiança é superior a 90% ou superior a 95%.
[0042] Modalidade 27. O método de acordo com qualquer uma das modalidades de 12 a 26, em que o nível de atividade transcricional na célula, organismo ou vírus é avaliado com a finalidade de determinar qualquer um ou mais dentre: - Viabilidade da célula de teste ou do organismo de teste; - Se a célula, organismo ou vírus do teste está vivo ou morto; - Perturbação transcricional dentro da célula, organismo ou vírus de teste.
[0043] Modalidade 28. O método de acordo com qualquer uma das modalidades de 1 a 11, compreendendo ainda o uso do valor normalizado (nV) para avaliar o nível de resistência aos fármacos ou sensibilidade aos fármacos na célula, organismo ou vírus, em que: - A referida célula, organismo ou vírus foi tratada com um fármaco antes da referida amplificação de ácidos nucleicos, e - O referido valor normalizado (nV) é comparado com um valor normalizado de controle (cnV) gerado usando uma série dos referidos valores normalizados (nV) obtidos de indivíduos de uma população de células, organismos ou vírus que se sabe: (i) resistente ao fármaco; ou (ii) sensível ao fármaco,
desse modo, avaliar o nível de resistência ou sensibilidade ao fármaco na célula, organismo ou vírus.
[0044] Modalidade 29. O método de acordo com qualquer uma das modalidades de 1 a 11 ou 28, compreendendo ainda: - Obter um valor normalizado sensível ao fármaco (dsV) gerado usando uma série dos referidos valores normalizados (nV) obtidos de indivíduos de uma população de células, organismos ou vírus conhecidos por serem sensíveis ao fármaco; e - Comparar o valor normalizado (nV) obtido pela referida amplificação de ácidos nucleicos da célula, organismo ou vírus com o valor normalizado sensível ao fármaco (dsV), para assim avaliar o nível de resistência ao fármaco ou sensibilidade ao fármaco ou na célula, organismo, ou vírus, em que a célula, organismo ou vírus foi tratado com um fármaco antes da referida amplificação de ácidos nucleicos.
[0045] Modalidade 30. O método de acordo com a modalidade 29, em que o valor normalizado sensível ao fármaco (dsV) é um valor médio gerado a partir da referida série dos referidos valores normalizados (nV).
[0046] Modalidade 31. O método de acordo com a modalidade 29 ou modalidade 30, em que: - O valor normalizado sensível ao fármaco (dsV) é utilizado como valor base para avaliar a presença ou ausência de resistência ou sensibilidade ao fármaco na célula, organismo ou vírus; e - A resistência ao fármaco é indicada quando o valor normalizado (nV) obtido pela referida amplificação de ácidos nucleicos da célula, organismo ou vírus está acima do valor normalizado sensível ao fármaco (dsV); ou
- A sensibilidade ao fármaco é indicada quando o valor normalizado (nV) obtido pela referida amplificação de ácidos nucleicos da célula, organismo ou vírus é igual ou inferior ao valor normalizado sensível ao fármaco (dsV).
[0047] Modalidade 32. O método de acordo com qualquer uma das modalidades de 29 a 31, em que o referido valor normalizado sensível ao fármaco (dsV): - Incorpora variação estatística na referida série de valores normalizados (nV) de indivíduos da população de células, organismos ou vírus conhecidos por serem sensíveis ao fármaco; e/ou - É fornecido com um intervalo de confiança de que o referido valor normalizado sensível ao fármaco (dsV) é preditivo de uma presença ou ausência de: (i) resistência ao fármaco na célula, organismo ou vírus; ou (ii) sensibilidade ao fármaco na célula, organismo ou vírus.
[0048] Modalidade 33. O método de acordo com a modalidade 32, em que o intervalo de confiança é superior a 90% ou superior a 95%.
[0049] Modalidade 34. O método de acordo com qualquer uma das modalidades de 1 a 11 ou 28, compreendendo ainda: - Obter um valor normalizado resistente ao fármaco (drV) gerado usando uma série dos referidos valores normalizados (nV) obtidos de indivíduos de uma população de células, organismos ou vírus conhecidos por serem resistentes ao fármaco; e - Comparar o valor normalizado (nV) obtido pela referida amplificação de ácidos nucléicos da célula, organismo ou vírus ao valor normalizado resistente ao fármaco (drV), para assim avaliar o nível de resistência aos fármacos ou sensibilidade aos fármacos ou na célula, organismo, ou vírus, em que a célula, organismo ou vírus foi tratado com um fármaco antes da referida amplificação de ácidos nucleicos.
[0050] Modalidade 35. O método de acordo com a modalidade 34, em que o valor normalizado resistente ao fármaco (drV) é um valor médio gerado a partir da referida série dos referidos valores normalizados (nV).
[0051] Modalidade 36. O método de acordo com a modalidade 34 ou modalidade 35, em que: - O valor normalizado resistente ao fármaco (drV) é utilizado como valor base para avaliar a presença ou ausência de resistência ou sensibilidade ao fármaco na célula, organismo ou vírus; e - A resistência ao fármaco é indicada quando o valor normalizado (nV) obtido pela referida amplificação de ácidos nucleicos da célula, organismo ou vírus é igual ou superior ao valor normalizado resistente ao fármaco (drV); ou - A sensibilidade ao fármaco é indicada quando o valor normalizado (nV) obtido pela referida amplificação de ácidos nucleicos da célula, organismo ou vírus está abaixo do valor normalizado resistente ao fármaco (drV).
[0052] Modalidade 37. O método de acordo com qualquer uma das modalidades de 34 a 36, em que o referido valor normalizado resistente ao fármaco (drV): - Incorpora variação estatística na referida série de valores normalizados (nV) de indivíduos da população de células, organismos ou vírus conhecidos por serem resistentes ao fármaco; e/ou
- É fornecido com um intervalo de confiança de que o referido valor normalizado resistente ao fármaco (drV) é preditivo de uma presença ou ausência de: (i) resistência ao fármaco na célula, organismo ou vírus; ou (ii) sensibilidade ao fármaco na célula, organismo ou vírus.
[0053] Modalidade 38. O método de acordo com a modalidade 37, em que o intervalo de confiança é superior a 90% ou superior a 95%.
[0054] Modalidade 39. O método de uma das modalidades 1 a 11, compreendendo ainda o uso do valor normalizado (nV) para avaliar o nível de resistência aos fármacos ou sensibilidade aos fármacos na célula, organismo ou vírus, em que: - Uma primeira população da referida célula, organismo ou vírus que foi tratada com um fármaco antes da referida amplificação de ácidos nucleicos, é usada para gerar um primeiro referido valor normalizado (nV), - Uma segunda população da referida célula, organismo ou vírus que não foi tratada com um fármaco antes da referida amplificação de ácidos nucleicos, é usada para gerar um segundo referido valor normalizado (nV), - O referido primeiro valor normalizado (nV) e o referido segundo valor normalizado (nV) são comparados para avaliar o nível de atividade transcricional na célula, organismo ou vírus com ou sem tratamento medicamentoso e, assim, avaliar o nível de resistência ao fármaco ou sensibilidade ao fármaco na célula, organismo ou vírus.
[0055] Modalidade 40. O método de acordo com a modalidade 39, em que a referida sensibilidade ao fármaco é indicada quando o referido primeiro valor normalizado (nV) é inferior ao referido segundo valor normalizado (nV).
[0056] Modalidade 41. O método de acordo com qualquer uma das modalidades de 27 a 40, em que o fármaco é um antimicrobiano.
[0057] Modalidade 42. O método de acordo com qualquer uma das modalidades de 27 a 41, em que o fármaco é um antimicrobiano de uma classe selecionada dentre: Aminoglicosídeos, ansamicinas, carbacefema, carbapenêmicos, cefalosporinas, glicopeptídeos, macrolidespenicilinas, monobactamas, polipeptídeos, quinolonas, sulfonamidas.
[0058] Modalidade 43. O método de acordo com qualquer uma das modalidades de 27 a 42, em que o fármaco é Ciprofloxacina, Azitromicina, Rifampicina ou Doxiciclina.
[0059] Modalidade 44. O método de acordo com qualquer uma das modalidades de 27 a 43, em que o primeiro gene é um gene de uma espécie de Chlamydia (por exemplo, Chlamydia trachomatis), uma espécie de Gonorrhea ou uma espécie de micoplasma (por exemplo, Mycoplasma genitralium).
[0060] Modalidade 45. O método de acordo com qualquer uma das modalidades de 1 a 44, em que o referido DNA genômico do primeiro gene e RNA transcrito a partir do primeiro gene, e a referida sequência de DNA não transcrito são co-amplificados na mesma reação.
[0061] Modalidade 46. O método de acordo com a modalidade 45, em que a referida reação compreende o uso de transcriptase reversa.
[0062] Modalidade 47. O método de acordo com qualquer uma das modalidades de 1 a 46, em que a célula é uma célula de mamífero, uma célula humana, uma célula animal, uma célula vegetal, uma célula bacteriana, uma célula hospedeira infectada por vírus ou uma célula hospedeira de infectado por bactérias.
[0063] Modalidade 48. O método de acordo com qualquer uma das modalidades de 1 a 47, em que o organismo é um mamífero, um humano, uma planta, uma bactéria, um vírus, um fungo, uma alga, um archaeon ou um protozoário.
[0064] A presente invenção também se refere, pelo menos em parte, às modalidades 1 a 23 listadas abaixo:
[0065] Modalidade 1. Método para avaliar a atividade transcricional de uma célula ou um organismo, caracterizado pelo fato de que o método compreende: - Realizar uma reação de amplificação de ácido nucleico no ácido nucleico total da célula ou organismo, em que a amplificação de ácido nucleico compreende: entrar em contato com a amostra total de ácido nucleico com um ou vários iniciadores capazes de amplificar DNA genômico de um primeiro gene e RNA transcrito a partir do primeiro gene, entrar em contato com a amostra total de ácido nucleico com um ou vários iniciadores capazes de amplificar uma região de DNA genômico não codificante que não é transcrito na célula ou no organismo; - Análise da cinética da reação de amplificação de ácidos nucleicos para derivar uma razão de: (i) os referidos transcritos genômicos de DNA e RNA do primeiro gene, para
(ii) a referida região de DNA não codificante, em que a razão é representativa da quantidade relativa de (i) e (ii) presente na amostra total de ácido nucleico antes de executar a reação de amplificação de ácido nucleico; e - Analisar a razão para avaliar a atividade transcricional da célula ou organismo, em que: uma razão de 1 indica uma ausência de atividade transcricional na célula ou organismo e uma razão maior que 1 indica que a atividade transcricional existe ou pode existir na célula ou no organismo.
[0066] Modalidade 2. O método de acordo com a modalidade 1, em que uma razão superior a: 1,5, 1,7, 1,9, 2, 2,2, 2,4, 2,5, 2,7, 2,9 ou 3, indica atividade transcricional na célula ou organismo.
[0067] Modalidade 3. O método de acordo com a modalidade 1, em que uma razão menor que: 1,5, 1,4, 1,3, 1,2 ou 1,1 indica uma ausência de atividade transcricional na célula ou organismo.
[0068] Modalidade 4. Método para avaliar a viabilidade de uma célula ou organismo, caracterizado pelo fato de que o método compreende: - Realizar uma reação de amplificação de ácido nucleico no ácido nucleico total da célula ou organismo, em que a amplificação de ácido nucleico compreende: entrar em contato com a amostra total de ácido nucleico com um ou vários iniciadores capazes de amplificar DNA genômico de um primeiro gene e RNA transcrito a partir do primeiro gene,
entrar em contato com a amostra total de ácido nucleico com um ou vários iniciadores capazes de amplificar uma região de DNA genômico não codificante que não é transcrito na célula ou no organismo; - Análise da cinética da reação de amplificação de ácidos nucleicos para derivar uma razão de: (i) os referidos transcritos genômicos de DNA e RNA do primeiro gene, para (ii) a referida região de DNA não codificante, em que a razão é representativa da quantidade relativa de (i) e (ii) presente na amostra total de ácido nucleico antes de executar a reação de amplificação de ácido nucleico; e - Analisar a razão para avaliar a atividade transcricional da célula ou organismo, em que: uma razão de 1 indica que a célula ou organismo não é viável e uma razão superior a 1 indica que a célula ou organismo é ou pode ser viável.
[0069] Modalidade 5. O método de acordo com a modalidade 4, em que uma razão superior a: 1,5, 1,7, 1,9, 2, 2,2, 2,4, 2,5, 2,7, 2,9 ou 3 indica que a célula ou organismo é viável.
[0070] Modalidade 6. O método de acordo com a modalidade 4, em que uma razão menor que: 1,5, 1,4, 1,3, 1,2 ou 1,1 indica que a célula ou organismo não é viável.
[0071] Modalidade 7. Método para determinar se uma célula ou um organismo está morto, o método compreendendo:
- Realizar uma reação de amplificação de ácido nucleico no ácido nucleico total da célula ou organismo, em que a amplificação de ácido nucleico compreende: entrar em contato com a amostra total de ácido nucleico com um ou vários iniciadores capazes de amplificar DNA genômico de um primeiro gene e RNA transcrito a partir do primeiro gene, entrar em contato com a amostra total de ácido nucleico com um ou vários iniciadores capazes de amplificar uma região de DNA genômico não codificante que não é transcrito na célula ou no organismo; - Análise da cinética da reação de amplificação de ácidos nucleicos para derivar uma razão de: (i) os referidos transcritos genômicos de DNA e RNA do primeiro gene, para (ii) a referida região de DNA não codificante, em que a razão é representativa da quantidade relativa de (i) e (ii) presente na amostra total de ácido nucleico antes de executar a reação de amplificação de ácido nucleico; e - Analisar a razão para avaliar a atividade transcricional da célula ou organismo, em que: uma razão de 1 indica que a célula ou organismo está morto e uma razão maior que 1 indica que a célula ou organismo está vivo ou pode estar vivo.
[0072] Modalidade 8. O método de acordo com a modalidade 7, em que uma razão superior a: 1,5, 1,7, 1,9, 2, 2,2, 2,4, 2,5, 2,7, 2,9 ou 3 indica que a célula ou organismo está vivo.
[0073] Modalidade 9. O método de acordo com a modalidade 7, em que uma razão menor que: 1,5, 1,4, 1,3, 1,2 ou 1,1 indica que a célula ou organismo não está vivo.
[0074] Modalidade 10. Método para detectar perturbação da transcrição dentro de uma célula, o método compreendendo: - Realizar uma reação de amplificação de ácido nucleico no ácido nucleico total da célula ou organismo, em que a amplificação de ácido nucleico compreende: entrar em contato com a amostra total de ácido nucleico com um ou vários iniciadores capazes de amplificar DNA genômico de um primeiro gene e RNA transcrito a partir do primeiro gene, entrar em contato com a amostra total de ácido nucleico com um ou vários iniciadores capazes de amplificar uma região de DNA genômico não codificante que não é transcrito na célula ou no organismo; - Análise da cinética da reação de amplificação de ácidos nucleicos para derivar uma razão de: (i) os referidos transcritos genômicos de DNA e RNA do primeiro gene, para (ii) a referida região de DNA não codificante, em que a razão é representativa da quantidade relativa de (i) e (ii) presente na amostra total de ácido nucleico antes de executar a reação de amplificação de ácido nucleico; e - Analisar a razão para avaliar a atividade transcricional da célula ou organismo, em que: uma razão de 1 indica perturbação transcricional completa na célula ou organismo, e uma razão maior que 1 indica falta de perturbação da transcrição na célula ou organismo.
[0075] Modalidade 11. O método de acordo com a modalidade 10, em que uma razão superior a: 1,5, 1,7, 1,9, 2, 2,2, 2,4, 2,5, 2,7, 2,9 ou 3, indica uma falta de perturbação da transcrição na célula ou organismo.
[0076] Modalidade 12. O método de acordo com a modalidade 10, em que uma razão inferior a: 1,5, 1,4, 1,3, 1,2 ou 1,1 indica perturbação transcricional parcial ou completa na célula ou organismo.
[0077] Modalidade 13. O método de acordo com qualquer uma das modalidades de 1 a 12, compreendendo gerar e um valor de limiar de ciclo (Ct) para: (i) referida região de DNA não codificante, e (ii) os referidos transcritos genômicos de DNA e RNA do primeiro gene; durante a referida reação de amplificação de ácido nucleico e derivando a razão comparando os referidos valores.
[0078] Modalidade 14. O método de acordo com qualquer uma das modalidades de 1 a 13, em que o método compreende: - Gerar um valor limite de ciclo ctA para os referidos transcritos de DNA e RNA genômico do primeiro gene e gerar um valor limite de ciclo CtB para a referida região de DNA não codificante, após o início da reação de amplificação de ácido nucleico; - Calcular uma alteração de dobra entre os valores de CtB e ctA usando a equação:
2CtB - CtA = 2ΔCt; e - Gerar a razão usando a equação: 2ΔCt/TR em que TR é uma razão de cópias do DNA genômico do primeiro gene para cópias da região do DNA genômico não codificante na amostra total de ácido nucleico da célula.
[0079] Modalidade 15. O método de acordo com qualquer uma das modalidades de 1 a 14, em que: - Realizar a reação de amplificação de ácido nucleico compreende ainda o contato da amostra total de ácido nucleico com um ou vários iniciadores capazes de amplificar DNA genômico de um segundo gene e RNA transcrito a partir do segundo gene, e - A cinética da reação de amplificação de ácido nucleico é analisada para derivar uma razão representativa da quantidade relativa de: (i) a referida região de DNA não codificante, para (ii) os referidos transcritos genômicos de DNA e RNA dos primeiro e segundo genes presentes na amostra total de ácido nucleico antes de realizar a reação de amplificação de ácido nucleico.
[0080] Modalidade 16. O método de acordo com a modalidade 15, em que o método compreende: - Gerar um valor limite de ciclo ctA para os referidos transcritos de DNA e RNA genômico do primeiro e segundo genes e gerar um valor limite de ciclo CtB para a referida região de DNA não codificante, após o início da reação de amplificação de ácido nucleico;
- Calcular uma alteração de dobra entre os valores de CtB e ctA usando a equação: 2CtB - CtA = 2ΔCt - Gerando a razão usando a equação 2ΔCt/TR em que TR é uma razão de cópias do DNA genômico do primeiro e segundo genes para cópias da região do DNA genômico não codificador na amostra total de ácido nucleico da célula.
[0081] Modalidade 17. O método de acordo com qualquer uma das modalidades de 1 a 16, em que a referida análise da razão compreende a comparação da razão com uma razão limiar derivada da execução do método em uma série de células ou organismos de controle negativos ou positivos e derivação de um valor médio da razão limiar indicativo de um fenótipo.
[0082] Modalidade 18. Método para detectar resistência aos fármacos ou sensibilidade aos fármacos em uma célula ou organismo, caracterizado pelo fato de que o método compreende: - Realizar uma primeira reação de amplificação de ácido nucleico no total de ácidos nucleicos obtidos a partir de uma primeira amostra da célula ou organismo que não foi tratado com o fármaco; e - Realizar uma segunda reação de amplificação de ácido nucleico no total de ácidos nucleicos obtidos a partir de uma segunda amostra da célula ou organismo que foi tratado com o fármaco; em que cada referida reação de amplificação de ácido nucleico é realizada separadamente e compreende:
entrar em contato com a amostra total de ácido nucleico com um ou vários iniciadores capazes de amplificar DNA genômico de um primeiro gene e RNA transcrito a partir do primeiro gene, entrar em contato com a amostra total de ácido nucleico com um ou vários iniciadores capazes de amplificar uma região de DNA genômico não codificante que não é transcrito na célula ou no organismo; - Analisar a cinética de cada reação de amplificação de ácido nucleico referida para derivar a primeira e a segunda proporções de: (i) os referidos transcritos genômicos de DNA e RNA do primeiro gene, para (ii) a referida região de DNA não codificante, em que a razão é representativa da quantidade relativa de (i) e (ii) presente na amostra total de ácido nucleico antes de executar a reação de amplificação de ácido nucleico; e - Comparar as razões para avaliar se a célula ou organismo tem resistência ao fármaco, em que: a resistência completa ao fármaco na célula ou organismo é indicada quando a primeira e a segunda razões são iguais, e a sensibilidade da célula ou organismo ao fármaco é indicada quando a segunda razão é menor que a primeira.
[0083] Modalidade 19. O método de acordo com a modalidade 18, em que a célula ou organismo é considerado resistente ao fármaco quando o valor da segunda razão não for maior que: 1%, 2%, 5%, 7,5%, 10%, 12%, 15% ou 20%; inferior ao valor da primeira razão.
[0084] Modalidade 20. O método de acordo com a modalidade 18, em que a célula ou organismo é considerado sensível ao fármaco quando o valor da segunda razão é pelo menos: 10%, 20%, 30%, 40% ou 50%; do que a primeira razão.
[0085] Modalidade 21. O método de acordo com qualquer uma das modalidades de 1 a 20, caracterizado pelo fato de que o método de amplificação é selecionado a partir do grupo que consiste em: reação em cadeia da polimerase (PCR), amplificação de deslocamento de cadeia (SDA), amplificação dependente de helicase (HDA), amplificação de polimerase de recombinação (RPA), amplificação isotérmica mediada por alça (LAMP), amplificação de círculo rolante (RCA), amplificação mediada por transcrição (TMA), replicação autossustentada de sequência (3SR), amplificação baseada em sequência de ácido nucleico (NASBA), cadeia de polimerase de transcrição reversa reação (RT- PCR) e qualquer combinação dos mesmos.
[0086] Modalidade 22. O método de acordo com qualquer uma das modalidades de 1 a 21, em que a célula é uma célula de mamífero, uma célula humana, uma célula vegetal, uma célula bacteriana, uma célula hospedeira infectada por vírus ou uma célula hospedeira infectada por bactérias.
[0087] Modalidade 23. O método de acordo com qualquer uma das modalidades de 1 a 21, em que o organismo é uma bactéria, um vírus, um fungo, uma alga, um archaeon ou um protozoário.
[0088] A presente invenção é geralmente compatível com os procedimentos atuais usados em laboratórios de pesquisa ou diagnóstico e pode usar os mesmos tipos de amostra, métodos de extração e métodos de amplificação. Os ácidos nucleicos (por exemplo, TNA) a serem analisados podem ser derivados de qualquer fonte adequada, como, por exemplo, células procarióticas ou eucarióticas, ou de um vírus. A presente invenção pode determinar a presença ou ausência de transcrição ativa, um aumento ou diminuição nos níveis de expressão de RNA ou níveis de expressão inalterados de RNA. Breve descrição dos desenhos
[0089] Modalidades da presente invenção serão agora descritas, apenas a título de exemplo não limitativo, com referência às Figuras 1-12 anexas, como estabelecido abaixo.
[0090] Figura 1: Esquema mostrando etapas na VITA PCR. Uma PCR de transcriptase reversa (RT-PCR) é realizada usando ácido nucleico total como molde. Este ensaio VITA PCR tem pelo menos um conjunto de iniciadores que é capaz de co-amplificar o DNA de um gene específico (DNA-X) juntamente com o RNA transcrito a partir deste gene (RNA-X). Ele também contém um conjunto de iniciadores direcionados a uma região do DNA que não é transcrita no RNA (DNA-N). Durante a etapa de transcriptase reversa, o RNA- X é copiado no cDNA-X e, em seguida, durante a termociclagem por PCR, o DNA-X, o cDNA-X e o DNA-N são amplificados. O sinal do GAT (Gene And Transcript), que mede a soma dos amplicons originários do DNA-X mais RNA-X, pode ser lido através de um único canal A dos fluoróforos, enquanto o sinal do NED (DNA não expresso), que é uma medida de amplicons do DNA-N, pode ser lida através de um segundo canal B. dos fluoróforos. A diferença nos valores do limiar do ciclo (Ct) entre o GAT e o NED em uma amostra permite uma estimativa da mudança de dobra (FC) em uma amostra observada para esses alvos, em que FC = 2Ct NED - Ct GAT = 2ΔCt. O índice VITA pode ser calculado dividindo-se a variação de dobras observada na amostra pela razão teórica (TR) prevista na ausência de transcrição ativa, assumindo que o gene e o locus NED estejam presentes em números iguais de cópias. Se um transcrito e gene são usados para medir o GAT e uma sequência de DNA é usada para medir o NED, então TR = (1 x DNA-X) dividido por (1 x DNA-Y) = 1. Se dois transcritos e genes ( X e Z) são usados para medir o GAT e uma sequência de DNA (X) é usada para medir NED, então o TR = (1 x DNA-X + 1 x DNA-Z) dividido por (1 x DNA-Y) = 2. A capacidade de medir o GAT usando mais de um gene (s) e seus transcritos permite a construção de testes que capturam uma variedade de transcritos que podem ser expressos em vários momentos do ciclo celular. O Índice VITA fornece uma medida normalizada da atividade transcricional que pode ser comparada entre amostras, independentemente da quantidade de amostra analisada. Prevê-se que as células mortas e sem RNA residual detectado tenham um índice VITA próximo de 1; e à medida que o nível de transcrição ativa aumentar, o Índice VITA aumentará correspondentemente.
[0091] Figura 2: Esquema de ensaios de acordo com modalidades da presente invenção. Figura 2A: Os métodos aqui descritos podem ser usados para determinar se células ou patógenos estão mortos ou vivos. A evidência da presença de patógenos vivos ou mortos pode, por sua vez, fornece um método para o Teste de Cura (TOC). O protocolo envolve a realização de VITA amplificando o GAT e o NED do TNA e, em seguida, usando os valores de Ct resultantes para calcular o índice VITA da amostra. Representam-se gráficos hipotéticos de amplificação. Previa-se que uma amostra sem transcrição ativa (células mortas) tivesse um índice VITA igual ou próximo a 1. Um valor limite pode ser definido usando dados empíricos para ensaios VITA PCR específicos, amplificando combinações específicas de GAT (s) e NED, presentes em tipos celulares específicos e/ou patógenos específicos. As células que estão vivas e estão em transcrição ativa terão um índice VITA acima do limite. Figura 2B: Os métodos aqui descritos podem ser usados para determinar a sensibilidade ou resistência ao fármaco. Uma amostra pode ser dividida e incubada na presença ou ausência de um ou mais fármacos. O TNA extraído após a incubação pode ser analisado por VITA PCR para obter índices de VITA para a amostra tratada e não tratada e a razão entre os índices de VITA fornece uma indicação da sensibilidade ou resistência do fármaco. Representam-se gráficos hipotéticos de amplificação. Se a amostra fosse sensível ao fármaco, seria esperado que os índices VITA da amostra na presença de fármaco fossem mais baixos do que na ausência de fármaco. Por outro lado, se a amostra fosse resistente ao fármaco, não seria de esperar que o Índice VITA da amostra na presença de fármaco fosse menor do que na ausência de fármaco e pode ser semelhante.
[0092] Figura 3: Coloração imunofluorescente de células e análise por PCR. As amostras de Chlamydia trachomatis (serovar D), crescidas em células HEp-2 foram tratadas com diferentes concentrações de Azitromicina, como descrito no Exemplo 1, Protocolo de Tratamento A (1.2.1). Especificamente, as células foram tratadas com i) Nenhum antibiótico, ou ii) abaixo da CIM (< CIM, 0,008 µg/mL), iii) na CIM (0,064 µg/mL) ou iv) acima da CIM (> CIM 0,512 µg/mL). O painel i mostra imagens representativas para a determinação da viabilidade de células não tratadas e células tratadas em cada dose de antibiótico. Essas imagens foram obtidas por coloração por imunofluorescência de células HEp-2 infectadas e analisadas com aumento de 100X com um microscópio fluorescente IN Cell Analyzer 2200 (GE Healthcare Life Sciences). O painel ii mostra a viabilidade quantificada pós-infecção (IP) medida como as unidades formadoras de inclusão por mL (IFU/mL) para cada tratamento com dose de antibiótico, em concentrações abaixo (<MIC), iguais a (MIC) ou acima da MIC (> MIC) e para células não tratadas (sem antibióticos), calculadas a partir das imagens obtidas no painel i. Os resultados foram normalizados em relação ao valor obtido para a amostra tratada em uma concentração de antibióticos acima da CIM. O painel iii mostra a análise do TNA dessas células, que foram infectadas com clamídia e amplificadas por um conjunto de iniciadores capazes de amplificar o DNA da principal porina da membrana externa (omp1) e o RNA omp1 O TNA foi amplificado por RT-PCR (para amplificar o omp1 DNA e RNA) e por PCR (para amplificar apenas o DNA omp1). O painel iii descreve a alteração de dobra, sendo a diferença (ΔCt) entre o Ct do DNA omp1 na PCR e o Ct do RNA omp1 mais o DNA omp1 no RT-PCR, calculado como 2∆Ct, para cada dose de tratamento com antibiótico, em concentrações abaixo (<MIC), igual a (MIC) ou acima da MIC (> MIC) e células não tratadas (sem antibiótico).
[0093] Figura 4: Análise de ensaios de acordo com modalidades da presente invenção. Análise dos alvos candidatos GAT e NED por amplificação de amostras de RNA ou TNA e comparação entre os resultados de PCR (somente para amplificação de DNA) e RT-PCR (para amplificação de DNA e RNA). Os painéis i e ii mostram gráficos de amplificação gerados usando potenciais iniciadores GAT (omp1), onde o modelo era apenas RNA (painel i) ou TNA (painel ii). A diferença (ΔCt) entre Ct da detecção de
DNA omp1 apenas por PCR (linhas pontilhadas) e DNA omp1 mais detecção de RNA omp1 por RT-PCR (linhas sólidas) é indicada. Os painéis iii e iv mostram gráficos de amplificação usando potenciais iniciadores NED (InfAIGR), onde o modelo era apenas RNA (painel iii) ou TNA (painel iv). As diferenças (ΔCt) entre a detecção de Ct de DNA InfAIGR apenas por PCR (linhas pontilhadas) e o DNA InfAIGR mais a detecção de RNA InfAIGR 1 (se presente) por RT-PCR (linhas sólidas) são indicadas.
[0094] Figura 5: Análise de ensaios de acordo com modalidades da presente invenção. Análise de clamídia por VITA PCR. O painel i mostra os índices de VITA para células não tratadas (sem antibióticos) e para cada dose de tratamento com antibióticos, como descrito no Exemplo 1 e representado na Figura 3, painéis i e ii. Este VITA PCR amplificou a partir de TNA e usou um gene e seus transcritos para medir GAT e uma região de DNA não transcrita para medir NED na única reação de RT-PCR. O painel i mostra os dados de RT-PCR das amostras fotografadas, quantificadas e representadas nos painéis da Figura 3 i e ii, respectivamente. O painel ii mostra a análise da clamídia por VITA PCR. Os índices de VITA para células não tratadas (sem antibióticos) e para cada dose de tratamento com antibióticos. Este VITA PCR amplificou dois amplicons de um gene e seus transcritos (2 GAT) e um NED não transcrito no mesmo RT-PCR e, portanto, possui um TR é 2 (2 GAT dividido por 1 NED).
[0095] Figura 6: Ensaio e análise de acordo com uma modalidade da presente invenção. Análise da PCR de clamídia VITA a partir de uma amostra de urina do paciente. O painel i descreve esquematicamente o processo de preparação da amostra. O painel ii mostra a análise da expressão de chalmydia da amostra de urina do paciente em comparação com amostras de referência positivas (viáveis) e negativas (não viáveis) de clamídia obtidas por métodos de cultura.
[0096] Figura 7: Ensaios e análises de acordo com modalidades da presente invenção. Análise da expressão de clamídia por VITA PCR em resposta a incubações curtas com antibióticos. O painel i descreve esquematicamente o processo de preparação da amostra, em que uma amostra de teste é não tratada (sem fármaco) ou tratada com vários antibióticos (medicamento Plus) e depois incubada por vários intervalos de tempo à temperatura ambiente ou a 37 °C com 5% de CO2. O TNA é então extraído de todas as amostras e pontos no tempo e amplificado por VITA PCR. O painel ii mostra os índices VITA obtidos por análise de TNA para cada grupo de tratamento com azitromicina (cinza escuro) e sem azitromicina (cinza claro). As razões dos índices VITA (∆VITA) mais e menos azitromicina estão indicadas acima das barras. Os índices VITA foram significativamente mais baixos após a incubação com o fármaco a 37 °C por 1 hora ou 6 horas, indicando que as amostras eram sensíveis à azitromicina e isso resultou em diminuição dos níveis de transcrição. A magnitude da razão TAVITA pode refletir a extensão da morte após a incubação por períodos específicos e sob condições específicas. O painel iii mostra os índices VITA obtidos por análise de TNA para cada grupo de tratamento com a razão dos índices VITA (∆VITA) indicados acima das barras. A diminuição do índice VITA após o tratamento com 0,128 µg/mL de azitromicina a 37 °C por 30 minutos e 1 hora indicou que as amostras eram sensíveis a esse antibiótico e isso se refletiu na diminuição dos níveis de transcrição. O painel iv mostra os índices VITA obtidos por análise de TNA para cada grupo de tratamento de cepa suscetível e resistente, quando tratados com 0,256 µg/mL de rifampicina. A diminuição do índice VITA após o tratamento com antibióticos para a cepa suscetível após 5 minutos de incubação a 37 °C indicou que as amostras eram sensíveis ao antibiótico. Paralelamente, o Índice VITA para a cepa resistente sob as mesmas condições não mudou significativamente na presença de rifampicina em qualquer ponto do tempo, indicando que as amostras eram realmente resistentes ao antibiótico. Painel v mostra os Índices VITA obtidos por análise de TNA para cada grupo de tratamento para cepa conhecida por ser suscetível e resistente, quando tratada com 0,256 µg/mL de rifampicina por 15 minutos em temperatura ambiente. Os índices VITA da cepa suscetível mostraram uma diminuição significativa no índice VITA na presença de fármaco, consistente com a sensibilidade à rifampicina; enquanto o Índice VITA para a cepa resistente, nas mesmas condições, apresentou um aumento significativo no Índice VITA, refletindo a resistência à rifampicina.
[0097] Figura 8: Ensaios e análises de acordo com modalidades da presente invenção. Análise da clamídia por VITA PCR em resposta a doses crescentes de antibiótico. O painel i descreve esquematicamente o processo de preparação da amostra, tratamento sem e com várias concentrações do mesmo antibiótico (azitromicina), incubação por 1 hora a 37 °C com fornecimento de 5% de CO2, extração de TNA de amostras não tratadas e amostras tratadas com as várias concentrações de antibióticos. O painel ii exibe os índices VITA obtidos por análise de TNA para cada dose de antibiótico e extraídos usando fenol: clorofórmio: isoamil. As diferenças estatísticas entre amostras tratadas e não tratadas estão representadas acima da comparação com os grupos. A diminuição do índice VITA após o tratamento com antibióticos indicou que as amostras eram sensíveis ao antibiótico utilizado. Os índices VITA apresentaram uma diminuição com o aumento da concentração de azitromicina (0,128 µg/mL, 0,192 µg/mL e 0,256 µg/mL, respectivamente), com essa correlação produzindo um R2 = 0,98. O painel iii exibe os índices VITA obtidos por análise de TNA para cada dose de antibiótico e extraídos usando um kit de extração baseado em coluna. As diferenças estatísticas entre amostras tratadas e não tratadas são indicadas acima dos grupos de tratamento. A diminuição do índice VITA após o tratamento com antibióticos demonstrou que as amostras eram sensíveis à azitromicina e os índices VITA correlacionados às doses de antibiótico utilizado 0,128 µg/mL, 0,192 µg/mL, 0,256 µg/mL e 0,512 µg/mL, respectivamente, produzindo R2 = 0,83.
[0098] Figura 9: Análise de ensaios de acordo com modalidades da presente invenção. Análise da clamídia por VITA PCR em resposta a uma incubação curta com vários antibióticos, usando TNA extraído de uma série de cepas previamente caracterizadas como suscetíveis e resistentes a antibióticos específicos. O painel i representa os índices VITA obtidos para cada cepa testada (cepas 1-3 e 5) após análise de TNA por VITA PCR para cada grupo de tratamento. A diminuição do Índice VITA após o tratamento com azitromicina (0,256 µg/mL) indicou que todas as cepas eram suscetíveis ao antibiótico com perturbações causadas pela transcrição. As diferenças estatísticas entre amostras tratadas e não tratadas são exibidas acima das amostras comparadas. O painel ii ilustra os índices VITA obtidos para cada cepa testada (cepas 1-3 e 5) após análise de TNA para cada grupo de tratamento. A diminuição do índice VITA após o tratamento com doxiciclina (0,256 µg/mL) indicou que todas as cepas eram suscetíveis ao antibiótico com a atividade de transcrição interrompida. As diferenças estatísticas entre amostras tratadas e não tratadas são exibidas acima das amostras comparadas. O painel iii mostra os índices VITA obtidos para cada cepa testada (cepa 1-5) após análise de TNA para cada grupo de tratamento, utilizando o antibiótico rifampicina (0,256 µg/mL). A diminuição do Índice VITA após o tratamento indicou que as cepas 1-4 são suscetíveis ao antibiótico com a atividade de transcrição interrompida. As diferenças estatísticas entre as amostras tratadas e não tratadas são exibidas acima dos grupos comparados. Os índices VITA obtidos com a cepa 5, nas amostras não tratadas e tratadas, não foram significativamente diferentes e refletiram a resistência dessa cepa em particular à rifampicina. O painel iv demonstra a razão TAVITA calculada a partir de cada réplica testada para cada cepa tratada com Rifampicina descrita no Painel iii. As células foram agrupadas de acordo com seu perfil de suscetibilidade, com células suscetíveis gerando uma razão ∆VITA maior em comparação com células resistentes.
[0099] Figura 10: Esquema de ensaios de acordo com modalidades da presente invenção. Exemplo hipotético demonstrando o processo de teste de suscetibilidade a antibióticos diretamente de uma amostra clínica, com incubação com nenhum fármaco ou na presença de azitromicina, ceftriaxona e doxiciclina e testes adicionais para Chlamydia trachomatis
(CT), Neisseria gonorrhoeae (GC) e Mycoplasma genitalium (MG) GC-dual se refere à antibioticoterapia dupla.
[00100] Figura 11: Análise de ensaios de acordo com modalidades da presente invenção. Análise VITA PCR de amostras de clamídia TNA contendo diferentes cargas viáveis do organismo. O painel i ilustra o índice VITA obtido de cada amostra contendo uma porcentagem determinada de clamídia viável no fundo da clamídia não viável. Exibindo diferenças estatísticas entre amostra não viável e amostras viáveis. O painel ii representa o valor médio de Ct para GAT1/2 e NED em cada uma das amostras testadas.
[00101] Figura 12: Análise de ensaios de acordo com modalidades da presente invenção. Análise da clamídia em amostras de TNA por um sistema VITA PCR alternativo que tem como alvo regiões mais longas para o GAT1 e GAT 2. Ele exibe os índices VITA para células não tratadas (sem tratamento) e para cada dose de tratamento com antibióticos, como no Exemplo 1 e na Figura 3 do painel i e ii. Este VITA PCR amplificou dois amplicons longos de um gene e seus transcritos (2 GAT) e um NED não transcrito na mesma reação e, portanto, possui um TR de 2.
Definições
[00102] Conforme usado neste aplicativo, a forma singular "um", "uma" e "o" incluem referências plurais, a menos que o contexto indique claramente o contrário. Por exemplo, a frase "polinucleotídeo" também inclui uma pluralidade de polinucleotídeos.
[00103] Conforme usado neste documento, o termo "compreendendo" significa "incluindo". Variações da palavra "compreender", como "compreender" e "compreender", têm significados variados correspondentes. Assim, por exemplo, um polinucleotídeo "compreendendo" uma sequência de nucleotídeos pode consistir exclusivamente nessa sequência de nucleotídeos ou pode incluir um ou mais nucleotídeos adicionais.
[00104] Conforme usado neste documento, os termos "limite do ciclo", "valor limite do ciclo", "valor limite do ciclo", "valor limite do ciclo", "Ct" e "valor Ct" são usados de forma intercambiável e têm o mesmo significado, sendo o número de amplificação ciclos necessários para gerar uma quantidade detectável de amplicon durante uma reação de amplificação de ácido nucleico.
[00105] Como usados aqui, o termo "amplificação" quando usado no contexto de ácidos nucleicos será entendido como abrangendo qualquer reação capaz de gerar cópias de mais uma ou mais sequências modelos de ácido nucleico, a menos que claramente indicado de outra forma. Exemplos não limitativos de reações adequadas incluem reação em cadeia da polimerase (PCR), amplificação de deslocamento de cadeia (SDA), amplificação dependente de helicase (HDA), amplificação de recombininase polimerase (RPA), amplificação isotérmica mediada por alça (LAMP), amplificação de círculo rolante (RCA), amplificação mediada por transcrição (TMA), replicação de sequência autossustentada (3SR) e amplificação baseada em sequência de ácido nucleico (NASBA).
[00106] Como aqui utilizado, o termo "valor quantitativo" destina-se a abranger qualquer medição de um determinado fator por quantidade, incluindo, por exemplo, medições quantitativas de produtos de reação de amplificação (por exemplo, pelo valor de Ct, pelo número de cópias de um amplificador e similares).
[00107] Como usados aqui, o termo "pluralidade" significa mais de um. Em certos aspectos ou modalidades específicos, uma pluralidade pode significar 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46 , 47, 48, 49, 50, 51 ou mais, e qualquer número inteiro derivável nele e qualquer intervalo derivável nele.
[00108] Conforme usados aqui, o termo "sujeito" inclui qualquer animal de importância econômica, social ou de pesquisa, incluindo espécies de bovinos, equinos, ovinos, primatas, aves e roedores. Portanto, um "sujeito" pode ser um mamífero, como, por exemplo, um mamífero humano ou não humano. Também estão incluídos indivíduos de microrganismos, incluindo, mas não limitados a bactérias, vírus, fungos/leveduras, protistas e nemátodos. Um "sujeito" de acordo com a presença de invenção também inclui agentes infecciosos, como príons.
[00109] Como aqui utilizado, os termos "polinucleotídeo" e "ácido nucleico" podem ser usados de forma intercambiável e se referem a um polímero de fita simples ou dupla de bases desoxirribonucleotídicas ou ribonucleotídicas, ou análogos, derivados, variantes, fragmentos ou combinações dos mesmos, incluindo mas não limitado a DNA, DNA metilado, DNA alquilado, RNA, RNA metilado, microRNA, siRNA, shRNA, mRNA, tRNA, snoRNA, stRNA, smRNA, pré e pri-microRNA, outros RNAs não codificadores, RNA ribossômico, seus derivados, amplicons dos mesmos ou qualquer combinação dos mesmos. A título de exemplo não limitativo, a fonte de um ácido nucleico pode ser selecionada do grupo que compreende sintético, mamífero, humano, animal, vegetal, fúngico, bacteriano, viral, arcaico ou qualquer combinação dos mesmos. Os termos "polinucleotídeo" e "ácido nucleico" "oligonucleotídeo" incluem referência a qualquer sequência especificada, bem como à sequência complementar a ela, salvo indicação em contrário.
[00110] Como usados aqui, o termo "ácido nucleico total" se refere a amostras que contêm RNA e DNA.
[00111] Como usado aqui, o termo "GAT" é um acrônimo para "Gene And Transcript" e se refere à medição combinada de DNA de um gene e RNA transcrito a partir desse gene, ou de um grupo de genes e os RNAs transcritos a partir desses genes. Conforme usado aqui, o termo "NED" é um acrônimo para "DNA não expresso" e se refere à medição de DNA originário de uma região que não é transcrita para RNA.
[00112] Como usados aqui, o termo "oligonucleotídeo" se refere a um segmento de DNA ou uma molécula de ácido nucleico contendo DNA, ou RNA ou molécula contendo RNA, ou uma combinação dos mesmos. Exemplos de oligonucleotídeos incluem alvos de ácidos nucleicos; substratos, por exemplo, aqueles que podem ser modificados por uma MNAzima; iniciadores tais como os utilizados para amplificação de alvo in vitro por métodos como PCR; e componentes de MNAzimas. O termo "oligonucleotídeo" inclui referência a qualquer sequência especificada, bem como à sequência complementar, a menos que indicado de outra forma. Os oligonucleotídeos podem compreender pelo menos uma adição ou substituição, incluindo mas não se limitando ao grupo que compreende 4-acetilcitidina, 5- (carboxi-hidroxilmetil) uridina, 2'-O-metilcitidina, 5-carboximetilaminometil tiouridina, di-hidrouridina, 2'-O-metilpseudouridina, beta D- galactosilqueosina, 2'-O-metilguanosina, inosina, N6-
isopenteniladenosina, 1-metiladenosina, 1-metilpseudouridina, 1-metilguanosina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanosina, 2- metiladenosina, 2-metilguanosina, 3- metilcitidina, 5- metilcitidina, N6-metiladenosina, 7-metilguanosina, 5- metilaminometiluridina, 5-metoxiaminometil-2-tiouridina, beta D-manosilmetiluridina, 5-metoxicarbonilmetiluridina, 5- metoxiuridina, 2-metilteno- (9-beta-ribofuranosil-2- metiltiopurina-6-il) carbamoil) treonina, N - ((9-beta- ribofuranosilpurina-6-il) N-metil-carbamoil) treonina, ácido metiléster da uridina-5-oxiacético, uridina Ácido -5-oxiacético (v), wybutoxosine, pseudouridine, queosine, 2-th iocitidina, 5- metil-2-tiouridina, 2-tiouridina, 4-tiouridina, 5-metiluridina, N - ((9-beta-D-ribofuranosilpurina-6-il) carbamoil) treonina, 2'-O-metil-5 -metiluridina, 2'-O-metiluridina, wybutosina, 3- (3-amino-3-carboxipropil) uridina, beta D-arabinosil uridina, beta D-arabinosil timidina.
[00113] Como usado aqui, os termos "complementar" e "complementaridade" se referem à capacidade de nucleotídeos (por exemplo, desoxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos ou combinações dos mesmos) de hibridizar entre si por meio de emparelhamento de base de Watson-Crick ou emparelhamento de base de oscilação. As ligações podem ser formadas por meio do pareamento de bases de Watson-Crick entre as bases de adenina (A) e bases de uracil (U), entre as bases de adenina (A) e timina (T), entre as bases de citosina (C) e as bases de guanina (G). Um par de bases oscilantes é um par de bases não Watson-Crick entre dois nucleotídeos em um duplex polinucleotídico (por exemplo, guanina-uracil, inosina-uracil, inosina-adenina e inosina-citosina). Os nucleotídeos referidos como
"complementares" ou que são o "complemento" um do outro são nucleotídeos que têm a capacidade de hibridar juntos pelo emparelhamento de bases Watson-Crick ou pelo emparelhamento de bases oscilantes entre suas respectivas bases.
[00114] Como usados aqui, uma "enzima" se refere a qualquer molécula que pode catalisar uma reação química (por exemplo, amplificação de um polinucleotídeo, clivagem de um polinucleotídeo etc.)
[00115] Como usados aqui, "amplificação alvo" se refere a qualquer método que amplificou um ácido nucleico alvo incluindo, entre outros, a reação em cadeia da polimerase (PCR), amplificação de deslocamento de cadeia (SDA), amplificação dependente de helicase (HDA), Amplificação de Recombinase Polimerase (RPA), amplificação isotérmica mediada por alça (LAMP), amplificação de círculo rolante (RCA), amplificação mediada por transcrição (TMA), replicação de sequência autossustentada (3SR), amplificação baseada em sequência de ácido nucleico (NASBA) ou reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa (RT-PCR).
[00116] Como usados aqui, um "amplicon" se refere a ácido nucleico (por exemplo, DNA ou RNA, ou uma combinação dos mesmos) que é um produto de eventos de replicação ou amplificação de ácidos nucleicos naturais ou artificiais, incluindo, entre outros, PCR, RT-PCR, SDA, HDA, RPA, LAMP, RCA, TMA, 3SR ou NASBA.
[00117] Como usados aqui, os termos "enzima de ácido nucleico", "ácido nucleico catalítico", "ácido nucleico com atividade catalítica" e "enzima de ácido nucleico catalítico" são usados aqui de forma intercambiável e deve significar uma molécula ou complexo contendo DNA ou DNA, ou um RNA ou molécula ou complexo contendo RNA, ou uma combinação dos mesmos (isto é, molécula ou complexo híbrido de DNA-RNA), que pode reconhecer pelo menos um substrato e catalisar uma modificação (como ligação ou clivagem) do pelo menos um substrato . Os resíduos nucleotídicos nos ácidos nucleicos catalíticos podem incluir as bases A, C, G, T e U, bem como seus derivados e análogos. Os termos acima incluem enzimas uni-moleculares de ácido nucleico que podem compreender uma única molécula contendo DNA ou DNA (também conhecida na técnica como "enzima DNA", "desoxirribozima" ou "DNAzyme") ou uma molécula contendo RNA ou RNA (também conhecido na técnica como "ribozima") ou uma combinação dos mesmos, sendo uma molécula híbrida DNA-RNA que pode reconhecer pelo menos um substrato e catalisar uma modificação (como ligação ou clivagem) do pelo menos um substrato. Os termos acima incluem enzimas de ácido nucleico que compreendem um complexo contendo DNA ou DNA ou um complexo contendo RNA ou RNA ou uma combinação dos mesmos, sendo um complexo híbrido DNA-RNA que pode reconhecer pelo menos um substrato e catalisar uma modificação (como ligação ou clivagem) de pelo menos um substrato. Os termos "enzima de ácido nucleico", "ácido nucleico catalítico", "ácido nucleico com atividade catalítica" e "enzima de ácido nucleico catalítico" incluem, no seu significado, MNAzimas.
[00118] Conforme usado aqui, os termos "MNAzima" e "enzima de ácido nucleico multicomponente", conforme usado neste documento, têm o mesmo significado e se referem a duas ou mais sequências de oligonucleotídeos (por exemplo, partezimas) que, somente na presença de um facilitador de montagem de MNAzima (por exemplo, um alvo), formam uma enzima de ácido nucleico ativa que é capaz de modificar cataliticamente um substrato. As MNAzimas podem catalisar uma série de reações, incluindo a clivagem de um substrato, a ligação de substratos e outras modificações enzimáticas de um substrato ou substratos. MNAzimas também são conhecidos na técnica como "PlexZymes". A MNAzima só se forma quando os braços dos sensores das partes A e B hibridizam adjacentes um ao outro no facilitador da montagem. Os braços do substrato da MNAzima envolvem o substrato, cuja modificação (por exemplo, clivagem) é catalisada pelo núcleo catalítico da MNAzima, formada pela interação dos domínios catalíticos das partenzimas A e B. Clivagem de um repórter quimérico de DNA/RNA substrato. A MNAzima pode clivar o substrato entre um par de corantes fluoróforo e um inibidor, gerando sinal. Os termos "enzima de ácido nucleico de múltiplos componentes" e "MNAzima" compreendem estruturas bipartidas, compostas por duas moléculas, ou estruturas tripartidas, compostas por três moléculas de ácido nucleico ou outras estruturas multipartidas, por exemplo, aquelas formadas por quatro ou mais moléculas de ácido nucleico.
[00119] Será entendido que os termos "MNAzima" e "enzima de ácido nucleico de múltiplos componentes", conforme aqui utilizados, englobam todos os MNAzimas conhecidos e MNAzimas modificados, incluindo aqueles divulgados em qualquer um ou mais dos números de publicação de patente PCT WO/2007/041774, WO/2008/040095, WO2008/122084 e números de publicação de patentes dos EUA relacionados 2007-0231810, 2010-0136536 e 2011- 0143338 (o conteúdo de cada um desses documentos é incorporado aqui por referência na íntegra). Exemplos não limitativos de MNAzimas e MNAzimas modificados abrangidos pelos termos
"MNAzima" e "enzima de ácido nucleico multicomponente" incluem MNAzimas com atividade catalítica de clivagem (como exemplificado neste documento), MNAzimas desmontados ou parcialmente montados compreendendo um ou mais inibidores de montagem, MNAzimas compreendendo um ou mais aptâmeros ("apta- MNAzimas"), MNAzimas compreendendo um ou mais braços sensores truncados e, opcionalmente, um ou mais oligonucleotídeos estabilizadores, MNAzimas compreendendo um ou mais inibidores de atividade, proenzimas inativas de ácidos nucleicos de múltiplos componentes (MNAi) e MNAzimas com atividade catalítica de ligase ("MNAzima ligases"), cada uma das quais é descrita em detalhes em um ou mais dos documentos WO/2007/041774, WO/2008/040095, WO2008/122084, US 2007-0231810, US 2010-0136536 e/ou US 2011-
0143338.
[00120] Conforme usado neste documento, os termos "partezima", "componente partezima" e "componente enzima" se referem a um oligonucleotídeo contendo DNA ou RNA ou RNA-RNA, dois ou mais dos quais apenas na presença de uma MNAzima facilitador de montagem, conforme aqui definido, pode formar juntos uma "MNAzima". Em certas modalidades preferidas, uma ou mais partezimas componentes, e de preferência pelo menos duas, podem compreender três regiões ou domínios: um domínio "catalítico", que faz parte do catalítico núcleo que catalisa uma modificação; um domínio "braço sensor", que pode se associar e/ou se ligar a um facilitador de montagem; e um domínio "braço do substrato", que pode se associar e/ou se ligar a um substrato. Partezimas podem compreender pelo menos um componente adicional, incluindo, mas não se limitando a, um aptâmero, aqui referido como "apta-partezima". Uma partezima pode compreender vários componentes, incluindo, entre outros, um componente de partezima com um braço sensor truncado e um componente do braço estabilizador que estabiliza a estrutura do MNAzima interagindo com um facilitador de montagem ou com um substrato.
[00121] Os termos "facilitador de montagem" e "facilitador de montagem de MNAzima", conforme aqui utilizados, se referem a entidades que podem facilitar a automontagem de partes de componentes para formar uma MNAzima cataliticamente ativa por interação com os braços sensores da MNAzima. Como aqui utilizado, facilitadores de montagem podem facilitar a montagem de MNAzimas que possuem clivagem, ligase ou outras atividades enzimáticas. Em formas de realização preferidas, é necessário um facilitador de montagem para a automontagem de uma MNAzima. Um facilitador de montagem pode ser composto de uma molécula ou pode ser composto de dois ou mais "componentes do facilitador de montagem" que podem emparelhar ou se ligar aos braços sensores de um ou mais "partenzimas" de oligonucleotídeos. O facilitador de montagem pode compreender um ou mais componentes de nucleotídeo que não compartilham complementaridade de sequência com o braço/s sensor da MNAzima. O facilitador da montagem pode ser um alvo. O alvo pode ser um ácido nucleico selecionado do grupo que consiste em DNA, DNA metilado, DNA alquilado, RNA, RNA metilado, microRNA, siRNA, siRNA, shRNA, tRNA, mRNA, snoRNA, stRNA, smRNA, pré e pri-microRNA, outros RNAs não codificadores, RNA ribossômico, seus derivados, amplicons ou qualquer combinação dos mesmos. O ácido nucleico pode ser um "amplicon" e a amplificação pode compreender um ou mais dentre: PCR, RT- PCR, SDA, HDA, RPA, LAMP, RCA, TMA, 3SR, NASBA ou a reação em cadeia da ligase.
[00122] O termo "efeito detectável", conforme usados aqui, é um efeito que pode ser detectado ou quantificado como uma indicação de que a modificação do substrato/s ocorreu. A magnitude do efeito pode ser indicativa da quantidade de uma entrada, como um facilitador de montagem (por exemplo, um alvo). O efeito detectável pode ser detectado por uma variedade de métodos, incluindo espectroscopia de fluorescência, ressonância plasmônica de superfície, espectroscopia de massa, RMN, ressonância de rotação eletrônica, espectroscopia de fluorescência de polarização, dicroísmo circular, imunoensaio, cromatografia, radiometria, fotometria, cintilografia, métodos eletrônicos, eletroquímicos métodos, UV, luz visível ou espectroscopia no infravermelho, métodos enzimáticos ou qualquer combinação dos mesmos.
[00123] O termo "substrato", conforme usados aqui, inclui qualquer polímero de fita simples ou dupla de bases desoxirribonucleotídicas ou ribonucleotídicas, ou análogos, derivados, variantes, fragmentos ou combinações dos mesmos, incluindo, sem limitação, DNA, DNA metilado, DNA alquilado, RNA, RNA metilado, microRNA, siRNA, shRNA, mRNA, tRNA, snoRNA, stRNA, smRNA, pré e pri-microRNA, outros RNAs não codificadores, RNA ribossômico, seus derivados, seus amplicons ou qualquer combinação dos mesmos (incluindo polímeros mistos de desoxirribonucleotídeo e bases ribonucleotídicas), capazes de serem reconhecidas, acionadas ou modificadas por uma enzima incluindo uma enzima catalítica de ácido nucleico. Um "substrato" pode ser modificado por várias atividades enzimáticas, incluindo, mas não limitado a clivagem ou ligação. A modificação de um "substrato polinucleotídico" ou "substrato"
pode fornecer um "efeito detectável" para monitorar a atividade catalítica de uma enzima.
[00124] Um "substrato repórter", como aqui utilizado, é um substrato que é particularmente adaptado para facilitar a medição do desaparecimento de um substrato ou da aparência de um produto em conexão com uma reação catalisada. Os substratos repórteres podem estar livres em solução ou ligados (ou "amarrados"), por exemplo, a uma superfície ou a outra molécula. Um substrato repórter pode ser marcado por qualquer um de uma grande variedade de meios, incluindo, por exemplo, fluoróforos (com ou sem um ou mais componentes adicionais, como inibidores), rótulos radioativos, biotina (por exemplo, biotinilação) ou rótulos quimioluminescentes.
[00125] Os termos "sonda", conforme aqui utilizados, se referem a um oligonucleotídeo que é usado para a detecção de um ácido nucleico alvo. Exemplos não limitativos de sondas incluem sondas TaqMan; Sondas de baliza molecular; e substratos de enzimas de ácido nucleico capazes de modificação catalítica por uma enzima de ácido nucleico.
[00126] Como usados aqui, o termo "base" será entendido como tendo o mesmo significado que o termo "nucleotídeo".
[00127] Qualquer descrição dos documentos da técnica anterior, ou declarações aqui derivadas ou baseadas nesses documentos, não é uma admissão de que os documentos ou declarações derivadas fazem parte do conhecimento geral comum da técnica relevante.
[00128] Para fins de descrição, todos os documentos aqui mencionados são incorporados por referência na sua totalidade, a menos que seja indicado de outra forma.
Abreviações
[00129] As seguintes abreviações são usadas aqui e em toda a especificação: GAT: gene e transcrição NED: DNA não expresso FC: mudança de dobra TR: Relação teórica Ct: ciclo de limiar/limiar de ciclo DMEM: meio Eagle modificado de Dulbecco LLE: Extração líquido-líquido MOI: Multiplicidade de Infecção PI: Pós-infecção PT: Pós-tratamento TNA: Ácido Nucleico Total IF: imunofluorescência IFU: unidades formadoras de inclusão MIC: Concentração Inibitória Mínima TOC: Teste de cura NAAT: Tecnologia de Amplificação de Ácidos Nucleicos DST: Infecção Sexualmente Transmissível RAM: resistência antimicrobiana EMA: monoazida de etídio PMA: monoazida de propódio
MNAzima: enzima de ácido nucleico de múltiplos componentes ou enzima de ácido nucleico multipartido;
Partezima: enzima parcial contendo oligonucleotídeo;
ave; média
PCR: reação em cadeia da polimerase;
gDNA: DNA genômico dsDNA: DNA de fita dupla rc: complemento reverso
NTC: sem controle de modelo qPCR: PCR quantitativo em tempo real
R2; Coeficiente de correlação nM; Nanomolar milímetros; Millimolar µL; Microlitro dNTP; Desoxirribonucleotídeo trifosfato
NF-H2O: água livre de nuclease;
F: fluoróforo;
Q: extintor;
N = A, C, T, G ou qualquer análogo do mesmo;
N '= qualquer nucleotídeo complementar a N ou capaz de emparelhar com N;
W: A ou T;
R: A, G ou AA;
rN: qualquer base ribonucleotídica;
rR: A ou G; rY: C ou U; M: A ou C; H: A, C ou T; D: G, A ou T; JOE ou 6-JOE: 6-carboxi-4 ', 5'-dicloro-2', 7'- dimetoxifluoresceína; FAM ou 6-FAM: 6-Carboxifluoresceína.
BHQ1: Extintor de buracos negros 1 BHQ2: Extintor de buracos negros 2 RT-PCR: reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa SDA: amplificação de deslocamento de fio HDA: amplificação dependente de helicase RPA: Amplificação da Recombinase Polimerase LAMP: amplificação isotérmica mediada por alça RCA: amplificação de círculo rolante TMA: amplificação mediada por transcrição 3SR: replicação de sequência autossustentada NASBA: amplificação baseada em sequência de ácidos nucleicos IB: Iowa Black® FQ IBR: Iowa Black® RQ mRNA: RNA mensageiro
RNAt: RNA de transferência rRNA: RNA ribossômico Descrições Detalhadas
[00130] A descrição detalhada a seguir transmite modalidades exemplares da presente invenção em detalhes suficientes para permitir aos versados na técnica praticar a presente invenção. Características ou limitações das várias modalidades descritas não limitam necessariamente outras modalidades da presente invenção ou da presente invenção como um todo. Portanto, a descrição detalhada a seguir não limita o escopo da presente invenção, que é definida apenas pelas reivindicações.
[00131] A presente invenção fornece métodos capazes de detectar a presença, ausência e/ou perturbação da transcrição em células, organismos, vírus e similares. Os métodos podem ser utilizados, por exemplo, para detectar a presença ou ausência de transcrição ativa; detectar perturbação ou alteração dos níveis de transcrição em resposta a agentes ou estados de doença; detectar a ausência de transcrição ativa em amostras contendo células mortas e detritos celulares associados; e/ou para diferenciar entre células vivas e mortas. A título de exemplo não limitativo, quando um indivíduo é infectado por bactérias, os antibióticos podem ser administrados com o objetivo de eliminar a infecção. Para tais infecções, é desejável um teste de cura (TOC) para confirmar a eliminação bem-sucedida de bactérias. Os métodos anteriormente relatados para medir a viabilidade de bactérias incluem protocolos para medir o RNA bacteriano ou o DNA bacteriano. O problema com essas abordagens é que o RNA residual e/ou o DNA associado a células mortas ou detritos celulares podem persistir por um tempo considerável após a morte e a cura celular. Além disso, métodos que tentam normalizar os níveis de RNA usando DNA, por exemplo AST, requerem quantificação precisa de ácidos nucleicos extraídos.
[00132] A presente invenção fornece, entre outras coisas, métodos aprimorados para diferenciar amostras que contêm células viáveis ou patógenos submetidos à transcrição ativa e aquelas que contêm células mortas ou detritos de ácidos nucleicos. Além disso, a invenção fornece métodos aprimorados para normalizar os dados relacionados às medições de RNA expresso e que permitem a comparação entre amostras sem a necessidade de quantificar a concentração de TNA total presente em cada amostra. Uma vez que o método permite a comparação entre amostras e elucidação da regulação positiva ou negativa, os dados gerados usando esta invenção podem ser representados no formato de mapas de calor.
Índice VITA
[00133] A estratégia envolve a amplificação de genes específicos e seus transcritos de RNA que são então normalizados para uma sequência de DNA específica que se sabe não ser transcrita. Durante a RT-PCR, os iniciadores direcionados a um transcrito específico também amplificam o gene do qual foram transcritos. Uma medida de um gene e seus transcritos associados é denominada aqui como GAT (Gene And Transcript). Além disso, durante a RT-PCR, se estiverem presentes iniciadores para uma região de DNA que não é transcrita em RNA, então esse DNA também pode ser amplificado. Isso é conhecido como NED (DNA não expresso). Os protocolos de amplificação alvo para a estimativa simultânea de GAT e NED são denominados testes VITA (Viable
Transcript Analysis) e, portanto, quando a amplificação é por PCR, o método é denominado VITA PCR.
[00134] A análise do VITA PCR permite a medição dos níveis de transcrição ativa que podem ser calculados de várias maneiras. A título de exemplo, os dados podem ser usados para obter um índice VITA igual à mudança de dobra (FC) para o espécime calculado como 2ΔCt dividido pela razão teórica (TR) prevista na ausência de transcrição ativa (somente DNA residual). Por exemplo, a diferença nos valores de Ct entre GAT e NED em uma amostra permite uma estimativa do FC observado para GAT (DNA mais RNA) versus apenas DNA (NED), em que FC = 2ΔCt = 2(Ct NED - Ct GAT). O TR antecipado na ausência de transcrição ativa do GAT é igual ao número de genes amplificados no cálculo do GAT dividido pelo número de sequências amplificadas para o cálculo do NED. Assumindo que o NED é medido para uma única sequência de DNA, se GAT mede a amplificação de um único gene, TR = número de conjuntos de iniciadores para GAT dividido pelo número de conjuntos de iniciadores para NED = 1/1 = 1; se o GAT mede a amplificação de dois genes (ou regiões), o TR = 2/1 = 2, e se o GAT mede a amplificação de três genes, o TR será de 3/1 = 3 e assim por diante. Por exemplo, o índice VITA para uma amostra com um Ct (GAT) de 10 e um Ct (NED) de 13 teria um valor FC = 2ΔCt = 23 = 8, o que resultaria em um índice VITA de 8 (se TR = 1) ou um índice VITA de 4 (se TR = 2).
[00135] O Índice VITA fornece uma medida da atividade transcricional com a população de células que é válida independentemente de as células serem (i) viáveis, (ii) mortas (com ou sem depuração total de níveis residuais, mas detectados, de baixos níveis de ácidos nucleicos) ou (iii) sob algum nível de estresse metabólico devido à presença de estímulos externos, por exemplo, a presença de um composto ou fármaco.
[00136] A abordagem supera os problemas encontrados por pesquisadores anteriores que tentaram usar RNA ou DNA como um marcador da presença de células vivas. Esses estudos mostraram que, em alguns casos, o RNA e/ou o DNA podem persistir por semanas após a morte celular. O Índice VITA fornece uma medida dos níveis de transcrição ativa por cópia do gene como um método para estabelecer a presença de organismos vivos. A título de exemplo, este protocolo pode ser usado para avaliar o teste de cura (TOC) em pacientes que receberam antibióticos para tratar uma infecção bacteriana.
[00137] Além disso, o método pode medir perturbações mais sutis da atividade transcricional. Por exemplo, se as células são incubadas na presença de um composto que possui efeitos deletérios na viabilidade e/ou vitalidade celular, o impacto deste composto pode ser quantificado usando o Índice VITA. Um exemplo de aplicação em que essa medida seria útil seria quando as amostras contendo bactérias infecciosas são incubadas na presença de antibióticos e analisadas usando VITA PCR. Se as bactérias forem sensíveis ao antibiótico, o índice VITA diminuirá. Por outro lado, se as bactérias forem resistentes ao antibiótico, o índice não mudará significativamente.
Reações de amplificação
[00138] Os métodos da presente invenção podem ser aplicados a medições quantitativas de produtos decorrentes de reações de amplificação de ácidos nucleicos. Qualquer reação de amplificação de ácido nucleico capaz de gerar amplicons a partir do DNA alvo e/ou sequências de RNA alvo (por exemplo, mRNA) pode ser usada. Por exemplo, amplificações da reação em cadeia da polimerase (PCR), como PCR de transcriptase reversa (RT-PCR), PCR quantitativo (qPCR) e/ou PCR digital (dPCR) podem ser usadas. Outros exemplos não limitativos de reações de amplificação adequadas incluem amplificação de deslocamento de cadeia (SDA), amplificação isotérmica mediada por alça (LAMP), amplificação de círculo rolante (RCA), amplificação de recombinase polimerase (RPA), amplificação dependente de helicase (HDA), invasão de cadeia baseada amplificação (SIBA), amplificação mediada por transcrição (TMA), replicação de sequência autossustentada (3SR), amplificação baseada em sequência de ácido nucleico (NASBA) e combinações das mesmas.
[00139] As medições quantitativas dos produtos resultantes das reações de amplificação podem ser feitas usando quaisquer métodos adequados conhecidos na técnica. Os métodos podem ser baseados, por exemplo, no número de cópias de amplicons, no limiar do ciclo (Ct) e similares, e envolvem, por exemplo, a medição da fluorescência.
Assuntos de teste
[00140] Os métodos da presente invenção podem ser aplicados a qualquer sujeito adequado em que o grau de transcrição seja de interesse (por exemplo, como uma medida de qualquer um ou mais níveis de transcrição, perturbação da transcrição, viabilidade, morte, resposta a agentes como como fármacos e outros compostos, e assim por diante).
[00141] Em algumas modalidades, o sujeito é uma célula ou uma população de células. As células podem ser organismos unicelulares (por exemplo, bactérias, archaeon, protozoários,
algas unicelulares, fungos unicelulares, ameba unicelular). Em outras modalidades, o sujeito é um vírus.
[00142] As células e vírus analisados de acordo com os métodos da presente invenção podem ser componentes de uma amostra biológica. Exemplos não limitativos de amostras biológicas incluem sangue total ou um componente dele (por exemplo, células sanguíneas, plasma, soro), urina, saliva, linfa, líquido biliar, escarro, lágrimas, líquido cefalorraquidiano, líquido de lavagem bronquioalveolar, líquido sinovial, sêmen, líquido tumoral ascítico, leite materno e pus.
Modalidades exemplares
[00143] Em algumas modalidades, a presente invenção fornece métodos para determinar um valor normalizado da transcrição combinada (nV ±), que é preditivo de uma presença ou ausência de atividade transcricional em uma célula, organismo ou vírus (e similares). Métodos semelhantes podem ser aplicados para determinar as diferenças na atividade transcricional entre duas populações de amostras, como a população de células, organismos ou vírus que se sabe serem (i) resistentes ao fármaco e (ii) sensíveis ao fármaco.
[00144] Apenas a título de exemplo não limitativo:
[00145] nV ± pode ser calculado como um ponto médio entre o ponto crítico no teste de cauda nV+ e o ponto crítico no teste de cauda nV-, ambos com nível de confiança de 95%.
nV± = ((nV+ - 1.645 * δ+) + (nV- + 1.645 * δ-))/2
[00146] Em que:
[00147] nV+ é a média dos valores de nV obtidos de indivíduos de uma população de células, organismos ou vírus que possuem atividade transcricional.
[00148] nV- é a média dos valores de nV obtidos de indivíduos de uma população de células, organismos ou vírus que não possuem atividade transcricional.
[00149] δ + é o desvio padrão dos valores de nV obtidos de indivíduos de uma população de células, organismos ou vírus que possuem atividade transcricional e o ponto crítico.
[00150] δ- é o desvio padrão dos valores de nV obtidos de indivíduos de uma população de células, organismos ou vírus que não possuem atividade transcricional.
Exemplos
[00151] A presente invenção será agora descrita com referência aos exemplos específicos a seguir, que não devem ser interpretados como limitativos.
Exemplo 1: Geração in vitro de amostras de clamídia na presença ou ausência de antibióticos, análise de viabilidade utilizando imunofluorescência e métodos para extração de TNA a partir de amostras.
1.1 Cultura
[00152] As amostras de Chlamydia trachomatis (sorovar D, cepa UW-3/Cx) foram cultivadas em células HEp-2 e não foram tratadas (não incubadas com o antibiótico Azitromicina) para reproduzir um Controle Positivo para "bactérias vivas" ou incubadas com diferentes concentrações Azitromicina, para criar amostras que simulam bactérias mortas. (A azitromicina é o tratamento de primeira linha para infecções genitais por clamídia). As condições foram as seguintes.
[00153] A linhagem celular epitelial humana (HEp-2) (ATCC® CCL-23 ™) foi cultivada em meio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (Sigma-Aldrich) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS) inativado por calor (Sigma-Aldrich) ), Streptomicina 100 mg/mL (Invitrogen Corporation), Gentamicina 50 mg/mL (Life Technologies) e Glutamina 20 mM (Sigma Aldrich), incubados a 37 °C com 5% de CO2. Chlamydia trachomatis (sorovar D) foi inoculada em uma monocamada HEp-2, presente em uma placa de 6 cavidades de fundo plano (Thermo Fisher) em uma Multiplicidade de Infecção (MOI) de 1. A infecção foi completada por inoculação assistida por centrifugação a 500 g por 30 minutos a uma temperatura de 28 °C e posteriormente incubada, nas condições especificadas acima.
1.1.1 Protocolo de tratamento A
[00154] Às 4 horas pós-infecção (PI), o DMEM foi substituído pela adição de doses variáveis do antibiótico Azitromicina (Sigma Aldrich) e novamente incubado a 37 °C com 5% de CO2 até a colheita. As diferentes concentrações de antibióticos utilizadas foram: i) Nenhum antibiótico (0 µg/mL), ii) < MIC (0,008 µg/mL), iii) MIC (0,064 µg/mL) e iv)> MIC (0,512 µg/mL). A “dose de CIM” escolhida para essas experiências é um pouco maior do que a observada em laboratório usando esta cepa atual; no entanto, foi especificamente escolhido para garantir a matança reprodutível das bactérias. A dose usada também é consistente com a análise documentada da CIM na literatura. Às 44 horas PI, as células foram colhidas usando tampão de sacarose- fosfato-glutamato (SPG) (sacarose 250 mM, fosfato de sódio 10 nM e L-glutamato 5 mM). Metade do volume foi armazenado para contagens de viabilidade através de coloração imunofluorescente (ver 1.2 Coragem de viabilidade/imunofluorescência); a outra metade foi mantida para extração de TNA e/ou RNA. As amostras foram armazenadas a -80 °C até o processamento posterior. Cada condição foi cultivada em triplicado.
1.1.2 Protocolo de tratamento B
[00155] Após 4 horas de PI, o DMEM foi substituído, com adição de cicloheximida e a incubação foi continuada. Uma vez em uma fase de crescimento exponencial, 24 horas PI, o tratamento foi aplicado. Isto foi conseguido através da substituição do DMEM para cada infecção, com a adição de i) nenhum antibiótico ou ii) antibiótico em um nível superior ao CIM para a azitromicina (0,128 µg/mL). As amostras foram então colhidas por 30 minutos, 1 hora ou 6 horas após o tratamento (PT) usando tampão SPG e armazenadas a -80 °C até processamento adicional.
1.1.3 Protocolo de tratamento C
[00156] Após a infecção, não houve mudança de mídia no período de 4 horas, criando essencialmente uma população não sincronizada, que seria mais semelhante às condições in vivo. Uma vez em uma fase de crescimento exponencial, 20 horas PI, o tratamento foi aplicado. Isto foi conseguido através da substituição do DMEM de cada cavidade, com a adição de i) nenhum antibiótico ou ii) antibiótico (0,256 µg/mL de rifampicina). As amostras foram então incubadas a 37 °C com 5% de CO2 e colhidas após 5 minutos de TP; ou incubado em temperatura ambiente e colhido após 15 minutos de PT. O tampão SPG foi utilizado para a colheita e o TNA foi extraído imediatamente após. As cepas utilizadas para este protocolo de tratamento foram a cepa 1), a cepa de laboratório serovar D (UW-3/Cx), suscetível à rifampicina, e a cepa 5) o laboratório de serovar L2, criou a cepa mutante, resistente à rifampicina.
1.1.4 Protocolo de tratamento D
[00157] Após a infecção, não houve troca de mídia no período de 4 horas. Uma vez na fase de crescimento exponencial, PI de 20 ou 24 horas, as células foram tratadas com doses variadas de azitromicina alcançadas pela substituição do DMEM em cada cavidade pela adição da quantidade desejada de antibiótico. As doses de tratamento com antibiótico adicionadas à infecção foram i) nenhum antibiótico, ii) 0,128 µg/mL, iii) 0,192 µg/mL, iv) 0,256 µg/mL e v) 0,512 µg/mL. As amostras foram então incubadas a 37 °C com 5% de CO2 e colhidas em 1 hora PT, utilizando tampão SPG e armazenadas a -80 °C até processamento posterior ou extraídas imediatamente após a colheita.
1.1.5 Protocolo de tratamento E
[00158] Após a infecção, não houve troca de mídia no período de 4 horas. Uma vez em uma fase de crescimento exponencial, 20 horas PI, as células foram tratadas com uma dose única de diferentes antibióticos. Os antibióticos utilizados foram i) Azitromicina, ii) Doxiciclina e iii) Rifampicina, cada um na dose de 0,256 µg/mL. As cepas utilizadas para este protocolo de tratamento foram a cepa 1) cepa de laboratório serovar D (UW-3/Cx), cepa 2) cepa de laboratório do tipo selvagem serovar L2 (434/Bu), cepa 3) cepa mutante criada em laboratório pelo serovar L2, resistente ao trimetoprim , Cepa 4) o laboratório serovar L2 criou cepa mutante, resistente à espectinomicina e a Cepa 5) laboratório serovar L2 criou cepa mutante, resistente à rifampicina. A CIM para todos os sorovares e cada antibiótico foi predeterminada, usando procedimentos padrão documentados na literatura e listados na tabela abaixo. De acordo com a análise da CIM (Tabela 1), todas as cepas utilizadas foram suscetíveis aos antibióticos azitromicina e doxiciclina. As cepas 1, 2, 3 e 4 também são suscetíveis à rifampicina, enquanto a cepa 5 é resistente ao mesmo antibiótico. As amostras foram incubadas a 37 °C com CO2 a 5% e colhidas em 1 hora PT, utilizando tampão SPG e extraídas imediatamente. Duas réplicas biológicas foram obtidas para cada condição.
Tabela 1: Concentração inibitória mínima (CIM) dos antibióticos utilizados nos testes de suscetibilidade a antibióticos Dose de antibiótico (µg/mL) Cepa 1 Cepa 2 Cepa 3 Cepa 4 Cepa 5 Azitromicina 0,032 0,032 0,016 0,016 0,032 Doxiciclina 0,128 0,064 0,032 0,064 0,064 Rifampicina 0,008 0,004 0,004 0,004 8,192
1.1.6 Protocolo de tratamento F
[00159] Após 4 horas de PI, o DMEM foi substituído pela adição de cicloheximida (1 µg/mL) para sincronizar a infecção e interromper a produção de proteínas pela célula hospedeira. Neste momento, também foi realizada a adição de antibiótico, com metade do número de cavidades deixados sem tratamento e a outra metade tratada com uma dose alta do antibiótico Azitromicina. As células foram novamente incubadas a 37 °C com 5% de CO2 até a colheita. As diferentes condições utilizadas foram: i) Nenhum antibiótico representando “CT vivo” ou ii) antibiótico mais (0,512 µg/mL) - representando “CT morto”. Às 44 horas PI as células foram colhidas usando tampão SPG e misturadas em diferentes proporções para criar amostras com porcentagens variadas de células viáveis e não viáveis, conforme a tabela abaixo. Metade do volume foi armazenado para contagens de viabilidade através de coloração imunofluorescente (ver 1.2 Coragem de viabilidade/imunofluorescência; dados não incluídos); a outra metade foi mantida para extração do TNA. Estes foram então armazenados a -80 °C até processamento adicional.
Volume de Volume de Volume total Carga Volume amostra amostra usado na viável total (uL) "vivo" (uL) "morto" (uL) extração (uL) 0% 0 500 500 300 0,1% 0,5 499,5 500 300 0,2% 1 499 500 300 0,5% 2,5 497,5 500 300 1% 5 195 500 300 10% 50 450 500 300 20% 100 400 500 300 50% 250 250 500 300 100% 500 0 500 300
1.2 Coloração de viabilidade/imunofluorescência
[00160] As amostras colhidas para contagem de viabilidade foram diluídas em série e cultivadas em uma monocamada HEp-2 fresca, presente em uma placa de 96 cavidades de fundo plano (Nunc ™, Thermo Fisher). A infecção foi completada por inoculação assistida por centrifugação a 500 g por 30 minutos a uma temperatura de 28 °C e posteriormente incubada a 37 °C com 5% de
CO2. Cada amostra foi cultivada em triplicatas. Às 38 horas PI as culturas foram fixadas com metanol e coradas para microscopia.
[00161] A coloração por imunofluorescência direta (IF) foi realizada usando anticorpos contra CtHtrA, MOMP (Biodesign) e anticorpos secundários conjugados aos corantes Alexa fluor (Invitrogen). Também foi adicionado DAPI (4', 6-diamidino- 2- fenilindole, dilatado) (Invitrogen) para a coloração das células hospedeiras. As amostras foram examinadas com uma ampliação de 100x com o microscópio fluorescente IN Cell Analyzer 2200 (GE Healthcare Life Sciences). As células HEp-2 exibiram uma cor azul, enquanto as inclusões de clamídia foram apresentadas em verde. As unidades formadoras de inclusão (IFU mL-1) foram determinadas contando inclusões de 10 campos de visão representativos, para cada cavidade e cada diluição em série. A extrapolação do tamanho do campo de visão para o tamanho dos cavidades foi feita para calcular o número total de inclusão em um determinado cavidade. Diluições e volumes adicionados também foram contabilizados.
[00162] A imagem imunofluorescente de células tratadas como descrito no Protocolo de Tratamento A (1.1.1) é mostrada na Figura 3, painel i, e os resultados obtidos pela contagem de IFU/ml dessas imagens são mostrados na Figura 3, painel ii; com resultados normalizados para o valor obtido para células tratadas acima da CIM (> CIM). As células que não foram tratadas e tratadas com várias doses de antibiótico tiveram cada um número diferente de unidades infecciosas de clamídia.
1.3 Extração de Ácido Nucleico Total (TNA)
1.3.1 Protocolo de extração A
[00163] As amostras colhidas para extração de TNA foram descongeladas em gelo e os detritos celulares foram sedimentados a 800 g por 10 minutos a 4oC, seguidos de centrifugação do sobrenadante a 14000 rpm por 20 minutos a 4oC. O sedimento foi ressuspenso em uma mistura de digestão com proteinase K (10 mg/mL de proteinase K (Ambion), 1 mM de Tris pH 7,5, 0,5 M de EDTA, 5 M de NaCl, 10% de SDS e água livre de nuclease (Ambion) e incubado a 56 °C por Após 60 minutos da digestão, foi adicionado à mistura fenol: clorofórmio: isoamil (25: 24: 1, pH 6,5-6,9, Sigma Aldrich), agitou-se com vórtex vigorosamente e centrifugou-se por 5 minutos à velocidade máxima. de acetato de sódio (3M, pH 5,2, Sigma Aldrich) e etanol a 100% (Sigma Aldrich). Este foi novamente agitado em vórtex e incubado por 20 minutos (10 minutos em temperatura ambiente e 10 minutos a -20 °C). alta velocidade (14000 rpm) por 10 minutos, após duas etapas de lavagem com etanol a 70%, e o sedimento foi seco ao ar por 15 minutos antes da eluição em 50 µL de água, quantificado e armazenado a -80 °C.
1.3.2 Protocolo de extração B
[00164] As amostras colhidas foram descongeladas em gelo, seguidas de granulação de células a 14000 rpm por 20 min a 4 °C. Após esta etapa, as instruções do fabricante para extração simultânea de DNA e RNA foram seguidas, usando o kit de extração PuriSpin FireMonkey (RevoluGen).
1.3.3 Protocolo de extração C
[00165] As amostras colhidas foram descongeladas em gelo, seguidas de granulação de células a 14000 rpm por 20 min a 4 °C. Após esta etapa, foram seguidas as instruções do fabricante para Purificação do RNA total de células animais, com digestão adicional com DNase na coluna. A extração foi realizada com o Mini Kit RNeasy (Qiagen).
Exemplo 2: Análise de um gene e seus transcritos em células não tratadas e tratadas em um ensaio de dois cavidades
[00166] O exemplo a seguir estima níveis de DNA e GAT em amostras de TNA extraídas de células HEp-2 infectadas com Chlamydia trachomatis (sorovar D). O TNA foi extraído de células que não foram incubadas com antibiótico (células viáveis e não tratadas) e de células incubadas com antibiótico em uma concentração oito vezes abaixo da CIM (<CIM), na CIM (CIM) ou 8 vezes maior que a MIC (> MIC), conforme descrito no exemplo 1 (1.1.1 Protocolo de tratamento A). O DNA e o RNA da clamídia foram amplificados usando iniciadores direcionados ao gene omp1 e seus transcritos. Os níveis de GAT foram estimados por RT-PCR em que o gene omp1 e seus transcritos (DNA mais RNA) foram amplificados. Os níveis apenas do gene omp1 (apenas DNA) foram medidos em uma PCR separada que carecia de transcriptase reversa.
2.1 Oligonucleotídeos de enzimas
[00167] Partezimas foram projetadas para se agruparem em MNAzimas ativas quando se ligavam a amplicons gerados pela amplificação do gene omp1 ou dos transcritos omp1. Uma vez montado, o MNAzima poderia clivar o substrato repórter Sub2-FB. As sequências da Partezima A e Partezima B estão listadas abaixo, de 5' a 3'. Bases em negrito hibridam com o alvo, bases sublinhadas fazem parte do núcleo catalítico na MNAzima montada e bases em itálico se referem à sequência que hibrida com o substrato.
SEQ ID NO: 1 Partezima A omp1_A4/2-P
TGGTCTCGAGCATTGAACGAACAACGAGAGGAAACCTT/3Phos/ SEQ ID NO: 2 Partezima B omp1_B5/2-P TGCCCAGGGAGGCTAGCTCATGTTCTCGATTAAGGCTG/3Phos/
2.2 Substrato Repórter
[00168] No exemplo atual, o substrato foi marcado com uma fração 6-FAM na extremidade 5' (indicado por um "F" no nome do substrato abaixo) e uma fração IABkFQ na extremidade 3' (indicada por um "IB" no nome do substrato abaixo). A clivagem do substrato foi monitorada a 516 nm (comprimento de onda de emissão da FAM) com excitação a 492 nm (comprimento de onda de excitação da FAM). O substrato repórter para este exemplo é mostrado abaixo com a sequência 5' a 3'. As bases em minúsculas representam RNA e as bases em minúsculas representam DNA.
SEQ ID NO: 3 Sub2-FB AAGGTTTCCTCguCCCTGGGCA
2.3 Iniciadores de PCR para amplificação do gene omp1 e transcritos
[00169] A amplificação in vitro do modelo de TNA extraído de células infectadas com Chlamydia trachomatis foi realizada usando os iniciadores listados abaixo. Os iniciadores Para Frente e Reverse foram utilizados para amplificar o DNA no gene omp1 por PCR, e o DNA e o RNA no gene omp1 e os transcritos por RT-PCR. Todas as sequências são gravadas de 5’ a 3'.
SEQ ID NO: 4 Iniciador direto 5omp1:
CTTCTTCCTGGGACGAACG SEQ ID NO: 5 Iniciador reverso 3omp1:
TGGCCTGAGGAATGTCTTGC
2.4 Preparação do TNA
[00170] RNA e DNA (TNA) foram co-extraídos de Chlamydia trachomatis (sorovar D) que foi cultivado em células HEp-2 como no exemplo 1 (1.1 Cultura e 1.1.1 Protocolo de Tratamento A). A extração foi realizada como uma técnica de extração líquido- líquido (LLE), usando fenol: clorofórmio: isoamil, também descrito no exemplo 1 (extração com 1,3 ácido nucleico total (TNA), 1.3.1 Protocolo de extração A).
2.5 misturas de PCR e RT-PCR
[00171] As misturas de PCR e RT-PCR continham 40 nM de iniciador 5', 200 nM de iniciador 3', 200 nM de partezima A, 200 nM de partezima B, 200 nM de Sub2-FB, 1x SensiFAST Probe No-ROX Mix (Bioline ), MgCl2 8 mM (Bioline) e água livre de nuclease (Ambion) em um volume total de 20 µL. Além disso, as misturas de RT-PCR continham 0,2 U/µL de Inibidor de RNase RiboSafe (Bioline) e 0,2 µL de Transcriptase Reversa (Bioline). As reações foram realizadas em triplicado em um termociclador BioRad® CFX96, usando os mesmos parâmetros de ciclagem: 48 °C por 10 minutos, 95 °C por 2 min, 10 ciclos de 95 °C por 5 segundos e 61 °C por 30 segundos (menos 0,5 °C por ciclo) e 30 ciclos de 95 °C por 5 segundos e 52 °C por 50 segundos. As misturas de RT-PCR e PCR continham 5 µL de gabarito de TNA (diluição 1/100) ou nenhum gabarito (dH2O).
2.6 Resultados
[00172] O DNA e o RNA da clamídia (GAT), ou apenas o DNA, foram amplificados por RT-PCR e PCR, respectivamente, usando TNA extraído de células viáveis não tratadas e de células incubadas com antibiótico em concentrações abaixo (<MIC), igual a (MIC) ou acima da MIC (> MIC). A Tabela 2 mostra os valores do ciclo limiar (Ct) medidos para cada tipo de reação e amostra. O ΔCt foi calculado como as diferenças entre os valores de Ct para a PCR (somente DNA) e RT-PCR (GAT) obtidos a partir de gráficos de amplificação. Por sua vez, a variação de dobra (proporção do número de cópias de RNA mais DNA (GAT) versus DNA, o que teoricamente levaria a esses valores de ΔCt, foi estimada em 2ΔCt e plotada no painel da Figura 3. iii. Os resultados foram comparados viabilidade em cada população celular (Figura 3 painel ii).
Tabela 2: Resultados da análise por PCR e RT-PCR de TNA de amostras tratadas e não tratadas Limiar (Ct) A: somente B: DNA OmpI Mudança ∆Ct DNA OmpI de amplificador de dobra Amostra (CtA - amplificação de RT-PCR e 2ΔCt CtB) por PCR RNA omp1 Sem 11,42 10,33 1,10 2,14 antibiótico < MIC 13,96 12,76 1,19 2,29 MIC 21,88 21,42 0,47 1,38 > MIC 21,84 21,47 0,37 1,29 Sem TNA No Ct
[00173] Teoricamente, se as células não fossem mais infectadas com clamídia, não seriam detectáveis transcrições ou apenas níveis residuais muito baixos de transcrições ou seus fragmentos. Da mesma forma, apenas baixos níveis residuais de
DNA genômico, ou fragmentos disso, seriam detectáveis, no entanto, pode-se prever que a quantidade de DNA detectada seja maior que a quantidade de RNA, uma vez que o DNA é inerentemente mais estável que o RNA.
[00174] A análise dos resultados mostra que, quando amostras de TNA, extraídas de amostras não tratadas ou de amostras tratadas abaixo da CIM, foram amplificadas, o valor de Ct para a RT-PCR observado foi menor do que o observado para a PCR (Tabela 2), consistente com o ativo transcrição nestas amostras. Para reações usando TNA de cultura tratada no nível MIC ou acima, os valores de Δ Ct foram mais baixos (Tabela 2), consistentes com pouca ou nenhuma transcrição.
[00175] Estudos anteriores mostraram que a detecção de DNA ou RNA por segundo não é uma medida confiável de depuração de Chlamydia trachomatis. Os dados deste exemplo demonstram que as proporções da dobra variam entre o DNA (medido por PCR) e o GAT (DNA mais RNA, medido por RT-PCR) tem uma tendência semelhante à medida da viabilidade (PI) para não tratados e tratados células, como evidenciado pela comparação do gráfico nas figuras 3, painéis ii e iii. Embora este exemplo demonstre a utilidade de examinar as proporções de RNA e DNA, este experimento não exemplifica a invenção, pois o único alvo de DNA ainda é expresso em ambas as reações. Como tal, a determinação do DNA/RNA versus DNA requer apenas duas reações paralelas realizadas com e sem transcriptase reversa. Isso dificulta a comparação direta dos resultados. Como tal, uma abordagem mais preferida usaria um método de acordo com a invenção, em que diferentes subpopulações de ácidos nucleicos (DNA somente versus
DNA mais RNA) poderiam ser co-amplificadas em um único VITA RT- PCR.
Exemplo 3: Triagem de destinos GAT e NED
[00176] O exemplo a seguir demonstra os métodos de triagem de alvos apropriados para os ensaios GAT e NED. Os ácidos nucleicos foram extraídos de células HEp-2 infectadas com Chlamydia trachomatis (serovar D). TNA e RNA foram extraídos de células viáveis colhidas às 24h PI. Os ácidos nucleicos foram então amplificados usando pares de iniciadores direcionados ao gene selecionado e seus transcritos (GAT), ou apenas um gene não transcrito (NED). A adequação de cada alvo foi determinada por comparação da (i) detecção de RNA por RT-PCR no RNA total, em que tanto o gene quanto seus transcritos seriam detectados e (ii) detecção de DNA por PCR em que apenas o gene DNA seria detectado. Neste experimento, seria previsto que o Ct do GAT exibisse uma diferença entre as duas reações, enquanto o Ct do NED não deveria exibir diferença.
3.1 Oligonucleotídeos de enzimas
[00177] Partezimas foram projetadas para se agruparem em MNAzimas ativas quando se ligavam a amplicons gerados pela amplificação do gene omp1 ou dos transcritos omp1. Uma vez montada, a MNAzima poderia clivar o substrato repórter Sub102 (20) -FB. Um segundo par de partezimas foi projetado para se agrupar em uma MNAzimas ativa quando ligado a amplicons gerados pela amplificação de uma região de DNA não transcrita, denominada infA_IGR, fornecendo assim uma medida de NED. Uma vez montado, esse MNAzima poderia clivar o substrato repórter Sub72-A1B. As sequências da Partezima A e Partezima B para cada MNAzima estão listadas abaixo, de 5’ a 3'. Bases em negrito hibridam com o alvo, bases sublinhadas fazem parte do núcleo catalítico na MNAzima montada e bases em itálico se referem à sequência que hibrida com o substrato.
SEQ ID NO: 6 Partezima A para GAT omp1_A4/102-P TGGTCTCGAGCATTGAACGAACAACGAGGGACGTCGA/3Phos/ SEQ ID NO: 7 Partezima B para GAT omp1_B5/102 (20) -P CGGTAGAGGAGGCTAGCTCATGTTCTCGATTAAGGCTG/3Phos/ SEQ ID NO: 8 Partezima A para NED CTinfAIGR_A4/72-P TCGACTAAACAGAAAATGTCAAAACAACGAGAGGCGTGAT/3Phos/ SEQ ID NO: 9 Partezima B para NED CTinfAIGR_B5/72-P CTGGGAGGAGAGGCTAGCTCAACTTGTCAAAAAACAGAAGG/3Phos/
3.2 Substrato Repórter
[00178] No exemplo atual, foram utilizados dois substratos repórter diferentes, cada um marcado com fluoróforos distintos. O sub102 (20) -FB foi rotulado no final da extremidade 5 com 6-FAM e com IABkFQ na extremidade 3, e sua clivagem foi monitorada a 516 nm com excitação a 492 nm. Sub72-A1B foi marcado com ATTO ™ Rho101 na extremidade 5’ e com IAbRQSp na extremidade 3', e sua clivagem foi monitorada a 609nm com excitação a 592 nm. Os substratos repórteres para este exemplo são mostrados abaixo com a sequência 5’ a 3'. As bases em minúsculas representam RNA e as bases em minúsculas representam DNA.
SEQ ID NO: 10 para GAT Sub102 (20) -FB TCGACGTCCCguCCTCTACCG SEQ ID NO: 11 para NED Sub72-A1B
ATCACGCCTCguCTCCTCCCAG
3.3 Iniciadores de PCR para amplificação GAT e NED
[00179] A amplificação in vitro do modelo de TNA e RNA extraído de células infectadas com Chlamydia trachomatis foi realizada usando os iniciadores listados abaixo. Os iniciadores Para Frente e Reverse foram utilizados para amplificar uma região do gene e transcritos omp1 (GAT) e do DNA infA_IGR (NED) por PCR e RT-PCR. Todas as sequências são gravadas de 5’ a 3'.
SEQ ID NO: 4 Iniciador direto para GAT 5omp1:
CTTCTTCCTGGGACGAACG SEQ ID NO: 5 Iniciador reverso para GAT 3omp1:
TGGCCTGAGGAATGTCTTGC SEQ ID NO: 12 Iniciador para frente para NED 5CTinfAIGR_2
GAGAGAGTGATTATATCGACTAA SEQ ID NO: 13 Iniciador reverso para NED 3CTinfAIGR_1
CAAGAGAGAATGTCAAAAGATAC
3.4 Preparação de TNA e RNA
[00180] Os ácidos nucleicos foram extraídos de Chlamydia trachomatis (serovar D) que foi cultivado em células HEp-2, como descrito no exemplo 1 (1.1 Cultura). Às 4 horas PI, o DMEM foi substituído por cicloheximida, para sincronizar a infecção e interromper a síntese de proteínas pelo hospedeiro. As células foram novamente incubadas a 37 °C com 5% de CO2 até serem colhidas 24 horas após a infecção, na fase de crescimento exponencial da bactéria.
[00181] A extração de TNA foi realizada como uma técnica LLE, usando fenol: clorofórmio: isoamil, também descrito no exemplo 1 (extração com 1,3 ácido nucleico total (TNA) 1.3, 1.3.1 Protocolo de extração A). com a seguinte modificação; a etapa de granulação de detritos celulares não foi realizada durante a extração das amostras neste exemplo.
[00182] A extração do RNA foi realizada usando o RNeasy Mini Kit (Qiagen), conforme definido no exemplo 1 (extração de 1,3 ácido nucleico total (TNA), 1.3.3 Protocolo de extração C) e seguindo as instruções do fabricante para a purificação do RNA total de células animais com adicional digestão com DNase na coluna.
3.5 misturas de PCR e RT-PCR
[00183] As misturas de PCR e RT-PCR continham 40 nM de 5'iniciador, 200 nM de 3'iniciador, 200 nM de partezima A, 200 nM de partezima B, 200 nM de Sub2-FB para GAT e 200 nM de Sub72- A1B para NED, 1x mistura SensiFAST Probe No-ROX (Bioline), MgCl2 8 mM (Bioline) e água livre de nuclease (Ambion) em um volume total de 20 µL. Além disso, as misturas de RT-PCR continham 0,2 U/µL de Inibidor de RNase RiboSafe (Bioline) e 0,2 µL de Transcriptase Reversa (Bioline). As reações foram realizadas em um termociclador BioRad® CFX96 usando os mesmos parâmetros de ciclagem: 48 °C por 10 minutos, 95 °C por 2 minutos, 10 ciclos de 95 °C por 5 segundos e 61 °C por 30 segundos (menos 0,5 °C por ciclo) e 30 ciclos de 95 °C por 5 segundos e 52 °C por 50 segundos. As misturas de RT-PCR e PCR continham 5 µL de molde TNA ou RNA (diluição 1/100) ou nenhum molde (dH2O).
3.6 Resultados
[00184] O DNA e o RNA da clamídia, ou apenas o DNA, foram amplificados por RT-PCR e PCR, respectivamente, em amostras de RNA e TNA, colhidas a partir de células não tratadas viáveis às 24 horas PI. A Tabela 3A indica os tipos de amplicons e a origem das reações realizadas. A Tabela 3B mostra os valores do ciclo limiar (Ct) medidos para cada tipo de reação e amostra. O ΔCt foi calculado como as diferenças entre os valores de Ct para a PCR (somente DNA) e RT-PCR (DNA e RNA) obtidos a partir de gráficos de amplificação (Figura 4).
Tabela 3A: Tipos e origens potenciais de amplificadores Espécies de ácidos nucléicos com potencial Amostra para gerar amplicons PCR RT-PCR RNA DNA RNA - transcritos omp1 contaminante DNA contaminante (gene Omp 1 (gene omp1) Omp1) GAT TNA DNA genômico DNA e RNA genômico - gene omp1 - gene omp1 e transcrição omp1 RNA DNA DNA contaminante contaminante (DNA infAIGR) InfAIG (DNA infAIGR)
NED TNA DNA genômico DNA genômico DNA infAIG DNA infAIG Tabela 3B: Valores-limite da análise por PCR e RT-PCR de amostras de TNA e RNA Limiar (Ct) ∆Ct
Somente PCR – RT-PCR DNA e RNA Amostra DNA (RT-PCR) (PCR) RNA 19,85 7,09 12,76 Omp 1 Sem RNA Sem Ct Sem Ct GAT TNA 17,36 12,44 4,92 Sem TNA Sem Ct Sem Ct RNA 20,12 19,29 0,83 Sem RNA Sem Ct Sem Ct InfAIG NED TNA 18,31 18,36 -0,05 Sem TNA Sem Ct Sem Ct
[00185] Os resultados usando os iniciadores candidatos GAT e TNA (Tabela 3 B) sugerem que os iniciadores omp1 são capazes de amplificar o DNA omp1 e o RNA omp1 (Figura 4 painel i e ii) e, assim, se enquadram nos critérios de adequação como iniciadores GAT. Além disso, uma vez que o Ct para a RT-PCR está 4,92 ciclos à frente do Ct da PCR, isso sugere que há muitas cópias de RNA por cópia do gene de DNA omp1 na amostra de TNA. Isso também é suportado pelos resultados usando os iniciadores omp1 no RNA (Figura 4, painel i), onde houve uma grande diferença de Ct de 11,51 entre os resultados de RT-PCR e PCR, refletindo forte amplificação do RNA omp1 em amostras de RNA purificado e apenas um Ct muito tardio detectado para a PCR que é provavelmente devido a pequenas quantidades de DNA contaminante na preparação de RNA.
[00186] Os resultados utilizando os iniciadores candidatos NED e TNA (Tabela 3 B) sugerem que os iniciadores InfAIGR são capazes de amplificar a sequência de DNA intergênico infA (Figura 4 painel iv). Além disso, uma vez que o Ct para a RT-PCR, a PCR é muito semelhante (ΔCt -0,05), isso demonstra que esses iniciadores NED não amplificam a sequência de RNA adicional no TNA, consistente com a falta de transcrição de RNA associada a esta sequência. Como tal, esses iniciadores atendem aos critérios de adequação como iniciadores NED. Isso também é suportado pelos resultados usando os iniciadores InfAIGR no RNA (Figura 4 painel iii), onde apenas os valores tardios de Ct são gerados, que são semelhantes para PCR e RT-PCR e, como antes, provavelmente representam meramente amplicons gerados a partir de DNA contaminante. na preparação de RNA.
[00187] Este exemplo fornece um método que é adequado para rastrear sequências candidatas para uso como iniciadores GAT ou para uso como iniciadores NED. Além disso, o exemplo mostra evidências de contaminação do DNA em uma preparação purificada de RNA, apesar de realizar procedimento adicional de digestão com DNase durante a extração. A observação destaca a necessidade de métodos aprimorados, como o VITA PCR, pois é provável que o DNA contaminante seja a fonte de pelo menos alguns falsos positivos observados quando a amplificação do RNA é usada como uma medida da viabilidade celular em amostras, incluindo amostras clínicas. Estudos anteriores mostraram que a detecção de RNA (ou DNA) por segundo não é uma medida confiável de depuração de Chlamydia trachomatis Exemplo 4 - Análise de GAT e NED em células não tratadas e tratadas por VITA PCR.
[00188] O exemplo a seguir estima os níveis de NED e GAT em amostras de TNA extraídas de células HEp-2 infectadas com Chlamydia trachomatis (sorovar D). O TNA foi extraído de células que não foram incubadas com antibiótico (células viáveis e não tratadas) e de células incubadas com antibiótico em uma concentração oito vezes abaixo da CIM (<CIM), na CIM (CIM) ou 8 vezes maior que a MIC (> MIC), como descrito no exemplo 1, Protocolo de Tratamento A (1.1.1). O DNA e o RNA da clamídia (GAT) foram amplificados por RT-PCR usando iniciadores direcionados ao gene omp1 e seus transcritos. Apenas o DNA da clamídia (NED) foi co-amplificado na mesma RT-PCR usando iniciadores direcionados a uma região de DNA genômico, designada infAIGR, que não é transcrita. Os valores de Ct para GAT e NED foram determinados.
4.1 Oligonucleotídeos de enzimas
[00189] Partezimas foram projetadas para se agruparem em MNAzimas ativos quando se ligavam a amplicons gerados pela amplificação do gene omp1 e dos transcritos omp1. Uma vez montado, esse MNAzima poderia clivar o substrato repórter Sub2- FB. Um segundo par de partezimas foi projetado para se reunir em MNAzimas ativas quando ligado a amplicons gerados pela amplificação de uma região não transcrita, denominada infA_IGR. Uma vez montado, esse MNAzima poderia clivar o substrato repórter Sub72-A1B. As sequências da Partezima A e Partezima B estão listadas abaixo, de 5’ a 3'. Bases em negrito hibridam com o alvo, bases sublinhadas fazem parte do núcleo catalítico na MNAzima montada e bases em itálico se referem à sequência que hibrida com o substrato.
SEQ ID NO: 1 Partezima A para GAT omp1_A4/2-P TGGTCTCGAGCATTGAACGAACAACGAGAGGAAACCTT/3Phos/ SEQ ID NO: 2 Partezima B para GAT omp1_B5/2-P
TGCCCAGGGAGGCTAGCTCATGTTCTCGATTAAGGCTG/3Phos/ SEQ ID NO: 8 Partezima A para NED CTinfAIGR_A4/72-P TCGACTAAACAGAAAATGTCAAAACAACGAGAGGCGTGAT/3Phos/ SEQ ID NO: 9 Partezima B para NED CTinfAIGR_B5/72-P CTGGGAGGAGAGGCTAGCTCAACTTGTCAAAAAACAGAAGG/3Phos/
4.2 Substratos repórteres
[00190] No exemplo atual, foram utilizados dois substratos repórter diferentes, cada um marcado com fluoróforos distintos. Sub2-FB foi rotulado na extremidade 5’ com 6-FAM e IABkFQ na extremidade 3', e sua clivagem foi monitorada a 516 nm com excitação a 492 nm. Sub72-A1B foi marcado com ATTO™ Rho101 na extremidade 5’ e com IAbRQSp na extremidade 3', e sua clivagem A1B foi monitorada a 609nm com excitação a 592 nm. O substrato repórter para este exemplo é mostrado abaixo com a sequência 5’ a 3'. As bases em minúsculas representam RNA e as bases em minúsculas representam DNA.
SEQ ID NO: 3 Sub2-FB para GAT AAGGTTTCCTCguCCCTGGGCA SEQ ID NO: 11 Sub72-A1B para NED ATCACGCCTCguCTCCTCCCAG
4.3 Iniciadores de PCR para amplificação do gene omp1 e transcritos
[00191] A amplificação in vitro do modelo de TNA extraído de células infectadas com Chlamydia trachomatis foi realizada usando os iniciadores listados abaixo. Os iniciadores Para Frente e Reverse foram utilizados para amplificar RNA omp1 e DNA
(GAT) e inf2_AGR DNA (NED) por RT-PCR. Todas as sequências são gravadas de 5’ a 3'.
SEQ ID NO: 4 Iniciador direto para GAT 5omp1:
CTTCTTCCTGGGACGAACG SEQ ID NO: 5 Iniciador reverso para GAT 3omp1:
TGGCCTGAGGAATGTCTTGC SEQ ID NO: 12 Iniciador para frente para NED 5CTinfAIGR_2
GAGAGAGTGATTATATCGACTAA SEQ ID NO: 13 Iniciador reverso para NED 3CTinfAIGR_1
CAAGAGAGAATGTCAAAAGATAC
4.4 Preparação de TNA
[00192] RNA e DNA (TNA) foram co-extraídos de Chlamydia trachomatis (sorovar D) que foi cultivado em células HEp-2 como no exemplo 1 (1.1 Cultura, 1.1.1 Protocolo de Tratamento A). A extração foi realizada como uma técnica LLE, usando fenol: clorofórmio: isoamil, também descrito no exemplo 1 (extração com 1,3 ácido nucleico total (TNA), 1.3.1 Protocolo de extração A).
4.5 Componentes da reação
[00193] Todas as reações continham 40 nM de cada iniciador Para Frente, 200 nM de cada iniciador reverso, 200 nM de cada partezima A, 200 nM de cada partezima B, 200 nM de cada substrato, 1x SensiFAST Probe No-ROX Mix (Bioline), 2 mM MgCl2 (Bioline), 0,2 U/µL de Inibidor de RNase RiboSafe (Bioline), 0,2 µL de enzima Transcriptase Reversa (Bioline) e água livre de nuclease (Ambion) em um volume total de 20 µL. Todas as reações foram realizadas em triplicado em um termociclador BioRad®
CFX96. Os parâmetros de ciclagem foram 48°C por 10 minutos, 95 °C por 2 minutos, 10 ciclos de 95 °C por 5 segundos e 61 °C por 30 segundos (com uma diminuição de 0,5 °C na temperatura por ciclo) e 30 ciclos de 95 °C por 5 segundos e 52 °C por 50 segundos. As reações continham 5 µL de modelo TNA (diluição 1/100) ou nenhum alvo (dH2O).
4.6 Resultados
[00194] O DNA e o RNA da clamídia (GAT), ou apenas o DNA (NED), foram co-amplificados em RT-PCR único a partir de TNA extraído de células viáveis não tratadas e de células incubadas com antibiótico em concentrações abaixo (<MIC), igual a (MIC) ou acima do MIC (> MIC) (Figura 5 painel i). A Tabela 4 mostra os valores do ciclo de limiar (Ct) medidos para o GAT ou NED em cada amostra. O ΔCt foi calculado como as diferenças entre os valores de Ct dos sinais NED e GAT. Por sua vez, a mudança de dobra (razão de GAT para NED) que teoricamente levaria a esses valores de ΔCt foi estimada em 2ΔCt (Tabela 4) e os índices de VITA foram plotados no painel da Figura 5 i. Os resultados foram então comparados com a viabilidade em cada população celular (Figura 3 painéis i e ii).
Tabela 4: Resultados da análise de TNA por VITA PCR (duplex RT-PCR) de amostras tratadas e não tratadas Limiar (Ct)
FC ∆Ct Amostra GAT NED = 2∆Ct Índice VITA NED - GAT Sem 10,68 12,08 1,40 2,63 2,63 antibiótico
< MIC 12,86 14,33 1,47 2,77 2,77 MIC 21,81 22,38 0,58 1,49 1,49 > MIC 21,87 22,47 0,60 1,51 1,51 Sem TNA Sem Sem Ct Ct
[00195] Teoricamente, se as células não fossem mais infectadas com clamídia, apenas níveis residuais muito baixos de transcritos ou seus fragmentos seriam detectáveis. Da mesma forma, apenas baixos níveis residuais de DNA genômico, ou fragmentos disso, seriam detectáveis. Prevê-se que a quantidade de DNA detectada seja maior que a quantidade de RNA, uma vez que o DNA é inerentemente mais estável que o RNA. A análise dos resultados mostra que quando as amostras de TNA, extraídas de amostras que não foram tratadas ou tratadas abaixo da CIM, foram amplificadas, o valor de Ct para o GAT foi menor que o NED (Tabela 4) consistente com a transcrição ativa. Para GAT e NED de TNA tratados com o nível MIC ou acima, as diferenças no valor de Ct eram pequenas (Tabela 4), indicando pouca ou nenhuma transcrição. A mudança de dobra e os índices VITA foram calculados para os quatro tipos de amostra. Como apenas um único gene e seus transcritos foram usados para calcular o GAT, e apenas uma única região não transcrita foi usada para calcular o NED, a mudança de dobra e os índices VITA são iguais (Tabela 4).
[00196] Estudos anteriores mostraram que a detecção de DNA ou RNA por segundo não é uma medida confiável de depuração de Chlamydia trachomatis. Os dados deste exemplo demonstram que os índices VITA se correlacionam com a medida de viabilidade (PI) para células não tratadas e tratadas, como evidenciado pela comparação do gráfico nas figuras 5, painel i e na figura 3, painéis i e ii. Este exemplo demonstra que o GAT e o NED podem ser medidos em uma única reação e os resultados podem ser usados para calcular os índices VITA que se correlacionam com a viabilidade observada das células e a resposta à presença de antibióticos. O exemplo fornece um método rápido útil para a detecção de viabilidade, neste caso a viabilidade da clamídia. Além disso, poderia fornecer a base para um Teste de Cura (TOC) em amostras de pacientes, determinando se uma infecção foi ou não eliminada.
Exemplo 5 - Utilização de duas regiões dentro de um gene e transcritos correspondentes para medir GAT por VITA PCR usando TNA de células não tratadas e tratadas.
[00197] O exemplo a seguir estima os níveis de NED e GAT em amostras de TNA extraídas de células HEp-2 infectadas com Chlamydia trachomatis (sorovar D). O TNA foi extraído de células que não foram incubadas com antibiótico (células viáveis e não tratadas) e de células incubadas com antibiótico em uma concentração oito vezes abaixo da CIM (<CIM), na CIM (CIM) ou 8 vezes maior que a MIC (> MIC), como descrito no exemplo 1, Protocolo de Tratamento A (1.2.1). O DNA e o RNA da clamídia (GAT) foram amplificados por RT-PCR usando iniciadores direcionados a dois locais diferentes do gene omp1 e seus transcritos (GAT1/2). Somente o DNA da clamídia (NED) foi co- amplificado na mesma RT-PCR usando iniciadores direcionados a uma região de DNA genômico, designada infAIGR (região intergênica infA), que não é transcrita. Os valores de Ct para GAT1/2 e NED foram obtidos.
5.1 Oligonucleotídeos de enzimas
[00198] As partezimas foram projetadas para se agruparem em duas MNAzimas ativas quando se ligavam a amplicons gerados pela amplificação do gene omp1 ou dos transcritos omp1. Estas duas MNAzimas foram capazes de se ligar a dois amplicons diferentes derivados da amplificação de duas regiões separadas de omp1 (uma região GAT1 e GAT2). Uma vez montados, os dois MNAzimas poderiam clivar o mesmo substrato repórter Sub2-FB. Um terceiro par de partezimas foi projetado para se agrupar em uma MNAzima ativa quando ligado a amplicons gerados pela amplificação de uma região de DNA não transcrita, denominada infA_IGR, fornecendo assim uma medida de NED. Uma vez montado, esse MNAzima poderia clivar o substrato repórter Sub72-A1B. As sequências da parte enzima A e da parte B para cada MNAzima estão listadas abaixo, de 5’ a 3'. Bases em negrito hibridam com o alvo, bases sublinhadas fazem parte do núcleo catalítico na MNAzima montada e bases em itálico se referem à sequência que hibrida com o substrato.
SEQ ID NO: 1 Partezima A para GAT1 omp1_A4/2-P TGGTCTCGAGCATTGAACGAACAACGAGAGGAAACCTT/3Phos/ SEQ ID NO: 2 Partezima B para GAT1 omp1_B5/2-P TGCCCAGGGAGGCTAGCTCATGTTCTCGATTAAGGCTG/3Phos/ SEQ ID NO: 14 Partezima A para GAT2 CTomp1_A4/2-P TTGCACCACTTGGTGTGACGACAACGAGAGGAAACCTT/3phos/ SEQ ID NO: 15 Partezima B para GAT2 CTomp1_B5/2-P TGCCCAGGGAGGCTAGCTCTATCAGCATGCGTGTGGGTT/3phos/ SEQ ID NO: 8 Partezima A para NED CTinfAIGR_A4/72-P TCGACTAAACAGAAAATGTCAAAACAACGAGAGGCGTGAT/3Phos/
SEQ ID NO: 9 Partezima B para NED CTinfAIGR_B5/72-P CTGGGAGGAGAGGCTAGCTCAACTTGTCAAAAAACAGAAGG/3Phos/
5.2 Substratos repórteres
[00199] No exemplo atual, foram utilizados dois substratos repórter diferentes, cada um marcado com fluoróforos distintos, como no exemplo 4 (4.2 substratos Reporter).
5.3 Iniciadores de PCR para amplificação de GAT1, GAT2 e
NED
[00200] A amplificação in vitro do modelo de TNA extraído de células infectadas com Chlamydia trachomatis foi realizada usando os iniciadores listados abaixo. Os iniciadores para Frente e Reverso foram utilizados para amplificar duas regiões do gene omp1 e transcritos (GAT1 e GAT2) e o DNA infA_IGR (NED) por RT-PCR. Todas as sequências são gravadas de 5’ a 3'.
SEQ ID NO: 4 Iniciador direto para GAT1 5omp1
CTTCTTCCTGGGACGAACG SEQ ID NO: 5 Iniciador reverso para GAT1 3omp1
TGGCCTGAGGAATGTCTTGC SEQ ID NO: 16 Iniciador direto para GAT2 5CTomp1_1
TTTCGGCGGAGATCCTTGCGATCC SEQ ID NO: 17 Iniciador reverso para GAT2 3CTomp1_2
CGAAAACAAAGTCACCGTAGTAACC SEQ ID NO: 12 Iniciador para frente para NED 5CTinfAIGR_2
GAGAGAGTGATTATATCGACTAA SEQ ID NO: 13 Iniciador reverso para NED 3CTinfAIGR_1
CAAGAGAGAATGTCAAAAGATAC
5.4 Preparação do TNA
[00201] RNA e DNA (TNA) foram co-extraídos de Chlamydia trachomatis (sorovar D) que foram obtidos por métodos in vitro, cultivados em células HEp-2, conforme descrito no exemplo 1 (1.1 Cultura, 1.1.1 Protocolo de tratamento A). A extração foi realizada como uma técnica LLE, usando fenol: clorofórmio: isoamil, também descrito no exemplo 1 (extração com 1,3 ácido nucleico total (TNA), 1.3.1 Protocolo de extração A).
5.5 Componentes da reação
[00202] Todas as reações continham 40 nM de cada iniciador Para Frente, 200 nM de cada iniciador reverso, 200 nM de cada partezima A, 200 nM de cada partezima B, 400 nM de cada substrato SEQ ID NO 3 e 200 nM de substrato SEQ ID NO 11, 1x SensiFAST Probe No-ROX Mix (Bioline), 2 mM MgCl2 (Bioline), 0,2 U/µL de inibidor de RNase RiboSafe (Bioline), 0,2 µL de enzima da transcriptase reversa (Bioline) e água livre de nuclease (Ambion) em um volume total de 20 µL. Todas as reações foram realizadas em triplicado em um termociclador BioRad® CFX96. Os parâmetros de ciclagem foram 48 ° C por 10 minutos, 95 ° C por 2 minutos, 10 ciclos de 95 ° C por 5 segundos e 61 °C por 30 segundos (com uma diminuição de 0,5 ° C na temperatura por ciclo) e 30 ciclos de 95 ° C por 5 segundos e 52 ° C por 50 segundos. As reações continham 5 µL de modelo TNA (diluição 1/100) ou nenhum alvo (Dh2O).
5.6 Resultados
[00203] O DNA e o RNA da clamídia de 2 regiões do gene e transcritos omp1 (GAT1 e GAT2) e uma região NED foram co-
amplificados em RT-PCR único a partir de TNA extraído de células não tratáveis viáveis e de células incubadas com antibiótico nas concentrações abaixo ( <MIC), igual a (MIC) ou acima do MIC (> MIC) (Figura 5 painel ii). A Tabela 5 mostra os valores do ciclo limiar (Ct) medidos para NED e para os sinais combinados de GAT1 e GAT2 (GAT1/2), em cada amostra. O ΔCt foi calculado como as diferenças entre os valores de Ct do NED e GAT1/2. Por sua vez, a mudança de dobra (razão de GAT para NED) que teoricamente levaria a esses valores de ΔCt foi estimada em 2ΔCt e mostrada na Tabela 5. Os índices VITA foram calculados dividindo o CF pelo TR, neste caso 2. O os resultados foram então comparados com a viabilidade em cada população celular.
Tabela 5: Resultados da análise triplex de RT-PCR de TNA de amostras tratadas e não tratadas Limiar (Ct) TR Índice Amostra GAT1/2 NED ∆Ct FC 2xGAT/1xNED VITA Sem 2 9,23 11,71 2,48 5,57 2,79 Antibiótico < MIC 11,30 14,17 2,87 7,32 2 3,66 MIC 20,83 22,15 1,32 2,49 2 1,25 > MIC 20,83 22,16 1,33 2,52 2 1,26 Sem Sem TNA Sem Ct Ct
[00204] A análise dos resultados mostra que quando as amostras de TNA, extraídas de amostras não tratadas ou tratadas abaixo da CIM, foram amplificadas, o valor de Ct para GAT1/2 foi menor que o NED (Tabela 5) consistente com a transcrição ativa.
Para GAT1/2 e NED de TNA tratados com o nível MIC ou acima, as diferenças no valor de Ct foram pequenas (Tabela 5) indicando pouca ou nenhuma transcrição. A mudança de dobra e os índices VITA foram calculados para os quatro tipos de amostra. Como dois genes e seus transcritos foram usados para calcular o GAT1/2, e apenas uma única região não transcrita foi usada para calcular o NED, a alteração da dobra é dividida pelo TR para calcular os índices VITA (Tabela 5).
[00205] A capacidade de incorporar múltiplos conjuntos de iniciadores capazes de amplificar o DNA e seus transcritos de RNA associados é de fato altamente desejável, pois genes específicos só podem ser expressos durante certos estágios no ciclo de desenvolvimento de, por exemplo, bactérias. Um ensaio contendo múltiplos genes expressos, de preferência em altos níveis sob diferentes condições, pode garantir que a expressão seja consistentemente detectável em condições desesperadas.
Exemplo 6 - Uso de VITA PCR em amostras clínicas
[00206] O exemplo a seguir estima os níveis de GAT em relação ao NED em uma amostra clínica. A amostra de urina foi obtida de um paciente sintomático com falhas sucessivas no tratamento do antibiótico azitromicina de primeira linha. O TNA foi extraído da amostra e testado juntamente com o material de referência extraído das células HEp-2 infectadas com Chlamydia trachomatis (sorovar D) confirmado como vivo/viável (referência positiva) ou morto (referência negativa). O DNA e o RNA da clamídia foram amplificados por RT-PCR usando iniciadores direcionados a dois locais diferentes do gene omp1 e seus transcritos para medir o GAT. Outra região do DNA da clamídia foi co-amplificada na mesma RT-PCR usando iniciadores direcionados a uma região do DNA genômico que não é transcrita para medir o NED. Os níveis de GAT e NED foram determinados e utilizados para o cálculo dos índices VITA.
6.1 Análise VITA PCR de GAT1, GAT2 e NED
[00207] Os oligonucleotídeos de partícula, substratos Reporter e iniciadores de PCR utilizados para amplificação e detecção de GAT1, GAT2 e NED foram como no exemplo 5 (5,1, 5,2 e 5,3, respectivamente).
6.2 Preparação do TNA Amostra clínica:
[00208] RNA e DNA (TNA) foram co-extraídos de uma amostra clínica de urina, que foi obtida de um paciente com falha sucessiva do tratamento para tratamento com antibióticos de primeira linha. Um total de 8mL de urina foi sedimentado, seguido pela extração de ácidos nucléicos, realizada usando o kit de extração FireMonkey PuriSpin, conforme descrito no exemplo 1 (extração do ácido nucleico total 1.3 (TNA) 1.3, extração do ácido nucleico total (TNA) 1.3), 1.3.2 Protocolo de extração B) instruções para a extração simultânea de DNA e RNA.
Material de referência:
[00209] O RNA e o DNA (TNA) foram co-extraídos de Chlamydia trachomatis (sorovar D), obtidos por métodos in vitro, cultivados em células HEp-2, tratados com alta dose de antibiótico azitromicina (0,512 µL/mL) e confirmados para estar “morto” ou não tratado e confirmado como “vivo”, como descrito no exemplo 1. O status de viabilidade dessas amostras de referência foi confirmado por coloração por imunofluorescência.
A extração foi realizada como uma técnica de extração líquido- líquido (LLE), usando fenol: clorofórmio: isoamil, também descrito no exemplo 1, (extração com 1,3 ácido nucleico total (TNA), 1.3.1 Protocolo de extração A)
6.3 Componentes da reação
[00210] As condições de RT-PCR utilizadas foram as descritas no Exemplo 5 (5.5) com as seguintes modificações; Foram adicionados 0,1 µL da enzima Transcriptase Reversa (Bioline) em um volume total de reação de 10 µL, que continha 2,5 µL de TNA extraído da amostra clínica (pura), 2,5 µL de cada amostra de referência de TNA (diluição 1/100) ou nenhuma alvo (dH2O).
6.4 Resultados
[00211] DNA e RNA da clamídia de 2 regiões do gene e transcritos omp1 (GAT1 e GAT2) e uma região NED foram co- amplificados e detectados em RT-PCR único de TNA extraído de uma amostra clínica de urina (Figura 6, painel i). A amplificação da amostra clínica foi comparada com amostras de referência derivadas de culturas de clamídia, “CT Vivo” (amostras não tratadas) ou “CT Morto” (tratadas com altas doses de azitromicina) (Figura 6 painel II). O ∆Ct foi calculado como as diferenças entre os valores de Ct dos sinais NED e GAT1/2. Por sua vez, a mudança de dobra (diferença entre o GAT1/2 e o NED) que teoricamente levaria a esses valores de ∆Ct foi estimada em 2∆Ct e mostrada na Tabela 6.
[00212] Seria previsto que a amostra clínica, derivada de um paciente sintomático, contivesse bactérias viáveis. Por sua vez, isso resultaria em um índice VITA semelhante entre a amostra clínica e a referência da CT viva (positiva), uma vez que ambas conteriam níveis mais altos de transcrição presente.
[00213] A análise dos resultados mostra que quando a amostra clínica, extraída da urina, foi amplificada, o valor de Ct para GAT1/2 foi menor que o NED (Tabela 6). Isso é consistente com a transcrição ativa e semelhante ao observado na amostra de referência, CT Vivo (positivo) (Tabela 6). Para todas as três amostras de referência de CT morto (negativo 1-3), os valores de Ct para GAT1/2 e NED foram mais semelhantes (Tabela 6). O ∆Ct, a variação de dobras e o índice VITA foram calculados para todas as amostras (Tabela 6). Como dois genes e seus transcritos foram usados para calcular o GAT1/2, e apenas uma única região não transcrita foi usada para calcular o NED, a mudança de dobra é o dobro da dos índices VITA (Tabela 6). A comparação dos índices de VITA da amostra clínica e da CT Vivo não demonstrou diferença, correlacionando-se com a detecção de uma população viável (Figura 6, painel ii). Ao contrário, a comparação dos índices de VITA da amostra clínica e das amostras de CT Morto demonstrou uma diferença nos índices de VITA. Estes foram mais elevados para a amostra clínica do que para as amostras de CT Morto (Figura 6 painel ii) consistentes com atividade transcricional reduzida ou inexistente nas amostras de CT Morto que foram tratadas com altas doses de azitromicina e confirmadas como não viáveis.
[00214] Os dados deste exemplo demonstraram que o GAT1/2 e o NED podem ser medidos em uma única reação e os resultados usados para calcular os índices de VITA. A comparação entre os índices VITA da amostra clínica e os do material de referência demonstrou uma apuração precisa da viabilidade das células na amostra clínica. Isso indica o desempenho positivo da tecnologia em amostras clínicas e sua aplicabilidade em um ambiente clínico. A capacidade de diferenciar células mortas e vivas pode ter aplicação para determinar se um paciente eliminou uma infecção com sucesso ou não após o tratamento com antibióticos. Os testes podem fornecer um diagnóstico inicial ou um "Teste de cura".
Tabela 6: Resultados de uma análise triplex de RT-PCR de TNA de uma amostra clínica em comparação com o material de referência Limiar (Ct) ∆Ct TR Índice Amostra GAT1/2 NED NED - FC 2xGAT/1xNED
VITA
GAT Amostra 2 14,33 16,56 2,23 4,86 2,34 clínica Positivo 2 (CT 9,16 11,44 2,28 4,68 2,43 vivo) Negativo 2 1 (CT 1 20,96 21,83 0,88 1,83 0,92 morto) Negativo 2 2 (CT 1 22,38 23,73 1,35 2,55 1,27 Morto) Negativo 3 (CT 1 21,72 22,95 1,23 2,35 2 1,17 Morto) Sem TNA Sem Ct Sem Ct
Exemplo 7 - Teste de suscetibilidade a antibióticos usando
VITA PCR
[00215] O exemplo a seguir estima a alteração dos níveis de GAT nas amostras de TNA, extraídas de células HEp-2 infectadas com Chlamydia trachomatis (sorovar D). O TNA foi extraído das células, que em uma fase de crescimento exponencial, 24 horas após a infecção, foram tratadas com antibiótico na CIM ou não tratadas (controle), como descrito no exemplo 1, Tratamento B (1.1.2). O DNA e o RNA da clamídia foram amplificados por RT- PCR usando iniciadores direcionados a dois locais diferentes do gene omp1 e seus transcritos para medir o GAT. Outra região do DNA da clamídia foi co-amplificada na mesma RT-PCR usando iniciadores direcionados a uma região do DNA genômico que não é transcrita para medir o NED. Os níveis de GAT e NED foram estimados e utilizados para o cálculo do Índice VITA.
7.1 Análise VITA PCR de GAT1, GAT2 e NED
[00216] Os oligonucleotídeos de partícula, substratos Reporter e iniciadores de PCR utilizados para amplificação e detecção de GAT1, GAT2 e NED foram como no exemplo 5 (5,1, 5,2 e 5,3, respectivamente). As condições da reação de RT-PCR utilizadas foram as descritas no Exemplo 5 (5.5). Estas reações continham 5 µL de modelo TNA (diluição 1/1000) ou nenhum alvo (dH2O).
7.2 Preparação do TNA
[00217] RNA e DNA (TNA) foram co-extraídos de Chlamydia trachomatis (sorovar D) que foi cultivado em células HEp-2, como descrito no exemplo 1 (1.1 Cultura, 1.1.2 Protocolo de Tratamento B). A extração foi realizada como uma técnica LLE, utilizando fenol: clorofórmio: isoamil, também descrito no exemplo 1 (extração com 1,3 ácido nucleico total (TNA), 1.3.1 Protocolo de extração A) com a seguinte modificação; a etapa de granulação de detritos celulares não foi realizada durante a extração das amostras neste exemplo.
7.3 Resultados
[00218] O DNA e o RNA da clamídia de 2 regiões do gene e transcritos omp1 (GAT1 e GAT2) e uma região NED foram co- amplificados e detectados em RT-PCR único de TNA extraído de culturas de clamídia. Essas culturas foram tratadas com antibiótico ou deixadas sem tratamento (controle) em uma fase de crescimento exponencial e colhidas 1 e 6 horas após o tratamento (Figura 7, painel i). A Tabela 4 mostra os valores do ciclo limiar (Ct) medidos para o GAT1/2 e o NED em cada amostra. O ∆Ct foi calculado como as diferenças entre os valores de Ct dos sinais NED e GAT1/2. Por sua vez, a mudança de dobra (diferença entre o GAT1/2 e o NED) que teoricamente levaria a esses valores de ∆Ct foi estimada em 2∆Ct e mostrada na Tabela 7. Os resultados foram então comparados entre as reações sem tratamento (controle) e aqueles tratados com antibiótico em cada momento (Figura 7 painel ii).
[00219] Seria previsto que as células suscetíveis ao tratamento com antibióticos tivessem uma diminuição nos níveis de transcrição, já que se previa a presença de antibióticos para interromper o funcionamento normal das células. Por sua vez, isso resultaria em uma diminuição no Índice VITA dessas células em comparação ao controle (células não tratadas).
[00220] A análise dos resultados mostra que quando as amostras de TNA, extraídas de grupos não tratados e tratados,
foram amplificadas, o valor de Ct para GAT1/2 foi menor que o NED (Tabela 7). Isso é consistente com a transcrição ativa nas quatro amostras. A variação de dobra e os índices VITA foram calculados para as amostras e diferentes momentos após o tratamento (Tabela 7). Como dois genes e seus transcritos foram usados para calcular o GAT1/2, e apenas uma única região não transcrita foi usada para calcular o NED, então a alteração de dobra é o dobro da dos índices VITA (Tabela 7). A comparação dos índices de VITA das amostras não tratadas e tratadas, em ambos os momentos, demonstrou uma diferença nos índices de VITA para as amostras tratadas, sendo menor que as amostras não tratadas (Figura 7 painel ii) consistente com a menor atividade transcricional na presença de antibiótico. A razão TAVITA é calculada dividindo o índice VITA (sem antibiótico) pelo índice VITA por antibiótico.
[00221] Os dados deste exemplo demonstram que o GAT1/2 e o NED podem ser medidos em uma única reação e os resultados usados para calcular os índices de VITA. A comparação entre os índices VITA de células tratadas e não tratadas, calculada como razão ∆VITA, demonstrou uma resposta à presença de antibiótico. Isso indica suscetibilidade a antibióticos das células. Além disso, mostra que essa suscetibilidade pode ser verificada em vários momentos, incluindo 1 hora ou 6 horas após o tratamento.
Tabela 7: Resultados de uma análise triplex de RT-PCR de TNA de amostras tratadas e não tratadas, colhidas em diferentes momentos após o tratamento (PT) Limiar (Ct) Índice ∆VITA Amostra GAT1/2 NED ∆Ct FC VITA A/B
A. Nenhum 1 12,95 18,39 5,44 43,51 21,76 antibiótico hora 3,77 B. Mais PT 11,76 15,29 3,53 11,55 5,78 Antibiótico A. Nenhum 6 10,88 16,81 5,93 60,83 30,41 antibiótico horas 2,12 B. Mais PT 12,69 17,53 4,84 28,71 14,35 Antibiótico Exemplo 8 - Teste de sensibilidade a antibióticos com Azitromicina usando VITA PCR com menor tempo de incubação
[00222] O exemplo a seguir estima a alteração dos níveis de GAT em relação ao NED em amostras de TNA extraídas de células HEp-2 que foram infectadas com Chlamydia trachomatis (sorovar D). O TNA foi extraído das células, que foram tratadas com antibiótico na CIM ou não tratadas (controle), 24 horas após a infecção, enquanto em fase de crescimento exponencial. O tratamento foi como descrito no exemplo 1, Tratamento B (1.1.2) usando Azitromicina (0,128 µg/mL). Para obter uma medida GAT, o DNA e o RNA da clamídia foram amplificados por RT-PCR usando iniciadores direcionados a dois locais diferentes do gene omp1 e seus transcritos. Para medir o NED, outra região do DNA de Chlamydia foi co-amplificada na mesma RT-PCR usando iniciadores direcionados a uma região de DNA genômico que não é transcrita. Os níveis de GAT e NED foram estimados e utilizados para o cálculo do Índice VITA. Além disso, os índices VITA de amostras tratadas e não tratadas foram utilizados para calcular a razão TAVITA.
8.1 Análise VITA PCR de GAT1, GAT2 e NED
[00223] Os oligonucleotídeos de partícula, substratos Reporter e iniciadores de PCR utilizados para amplificação e detecção de GAT1, GAT2 e NED foram como no exemplo 5 (5,1, 5,2 e 5,3, respectivamente). As condições de RT-PCR utilizadas foram as descritas no Exemplo 5 (5.5) e as reações continham 5 µL de molde TNA (diluição 1/1000) ou nenhum alvo (dH2O).
8.2 Preparação do TNA
[00224] RNA e DNA (TNA) foram co-extraídos de Chlamydia trachomatis (sorovar D) que foi cultivado em células HEp-2, como descrito no exemplo 1 (1.1 Cultura, 1.1.2 Protocolo de Tratamento B). A extração foi realizada como uma técnica LLE, utilizando fenol: clorofórmio: isoamil, também descrito no exemplo 1 (extração com 1,3 ácido nucleico total (TNA), 1.3.1 Protocolo de extração A) com a seguinte modificação; a etapa de granulação de detritos celulares não foi realizada durante a extração das amostras neste exemplo.
8.3 Resultados
[00225] O DNA e o RNA da clamídia de 2 regiões do gene e dos transcritos omp (GAT1 e GAT2) e uma região NED foram co- amplificados e detectados em RT-PCR único de TNA extraído de culturas de clamídia. Essas culturas foram tratadas com antibiótico ou deixadas sem tratamento (controle) em uma fase de crescimento exponencial e colhidas 30 minutos ou 1 hora após o tratamento com 0,128 µg/mL de azitromicina (Figura 7, painel i). A Tabela 8 mostra os valores do ciclo limiar (Ct) medidos para o GAT1/2 e o NED em cada amostra. O ∆Ct foi calculado como as diferenças entre os valores de Ct dos sinais NED e GAT1/2. Por sua vez, a mudança de dobra (diferença entre o GAT1/2 e o NED)
que teoricamente levaria a esses valores de ∆Ct foi estimada em 2∆Ct e mostrada na Tabela 8. Os resultados foram comparados entre as reações sem tratamento (controle) e aqueles tratados com antibiótico em cada momento (Figura 7 painel iii).
Tabela 8: Resultados de uma análise triplex de RT-PCR de TNA de amostras tratadas e não tratadas, colhidas em diferentes momentos após o tratamento (PT) Limiar (Ct) Mudança ∆VITA Índice Amostra GAT1/2 NED ∆Ct de Razão
VITA dobra A/B A. Nenhum 30 14,14 22,18 8,04 263,20 133,44 antibiótico min 1,4 B. Plus PT 14,00 21,55 7,55 187,40 94 Antibiótico A. Nenhum 1 14,18 22,11 7,93 243,88 121,67 antibiótico hora 2,5 B. Plus PT 13,79 20,41 6,62 98,36 49,20 Antibiótico
[00226] A análise dos resultados mostra que quando as amostras de TNA, extraídas de grupos não tratados e tratados, foram amplificadas, o valor de Ct para GAT1/2 foi menor que o NED (Tabela 8), indicando que havia transcrição ativa em todas as amostras. A mudança de dobra e os índices VITA foram calculados para todas as amostras em todos os momentos após o tratamento (Tabela 8). Como dois genes e seus transcritos foram usados para calcular o GAT1/2, e apenas uma única região não transcrita foi usada para calcular o NED, a mudança de dobra é o dobro da dos índices VITA (Tabela 8). A comparação dos índices de VITA, entre as amostras não tratadas e tratadas em cada momento, demonstrou uma diferença nos índices de VITA (Figura 7, painel iii). Isso é consistente com uma interrupção na atividade de transcrição de células na presença de antibiótico. A razão TAVITA é calculada dividindo o índice VITA (sem antibiótico) pelo índice VITA por antibiótico.
[00227] Como no exemplo 7, os dados deste exemplo demonstram que o GAT1/2 e o NED podem ser medidos em uma única reação e os resultados usados para calcular os índices de VITA. Foi detectada uma resposta à presença de antibiótico através da comparação entre os índices VITA das células tratadas e não tratadas e calculada como a razão TAVITA. Isso reflete a suscetibilidade a antibióticos das células. Além disso, demonstra que a suscetibilidade pode ser estabelecida em vários momentos, incluindo 30 minutos ou 1 hora após o tratamento antibiótico com Azitromicina.
Exemplo 9 - Teste de suscetibilidade a antibióticos com rifampicina VITA PCR e menor tempo de incubação
[00228] O exemplo a seguir estima a alteração dos níveis de GAT em relação ao NED em amostras de TNA extraídas de células HEp-2 que foram infectadas com a cepa 1 de Chlamydia trachomatis e a cepa 5 (cepa de laboratório serovar D e cepa de serovar L2 resistentes à rifampicina, respectivamente). O TNA foi extraído das células, que foram tratadas com o antibiótico Rifampicin a uma concentração de 0,256 µg/mL, ou não tratadas (controle), 20 horas após a infecção, durante uma fase de crescimento exponencial. O tratamento foi como descrito no exemplo 1, Tratamento C (1.1.3). Para obter uma medida GAT, o DNA e o RNA da clamídia foram amplificados por RT-PCR usando iniciadores direcionados a dois locais diferentes do gene omp1 e seus transcritos. Para medir o NED, outra região do DNA de Chlamydia foi co-amplificada na mesma RT-PCR usando iniciadores direcionados a uma região de DNA genômico que não é transcrita. Os níveis de GAT e NED foram estimados e utilizados para o cálculo do Índice VITA. Além disso, os índices VITA de amostras tratadas e não tratadas foram utilizados para calcular a razão TAVITA.
9.1 Análise VITA PCR de GAT1, GAT2 e NED
[00229] As partezimas foram projetadas para se agruparem em duas MNAzimas ativas quando se ligavam a amplicons gerados pela amplificação do gene omp1 ou dos transcritos omp1. Estas duas MNAzimas foram capazes de se ligar a dois amplicons diferentes derivados da amplificação de duas regiões separadas de omp1 (uma região GAT1 e GAT2). Uma vez montadas, ambas as MNAzimas poderiam clivar o mesmo substrato repórter Sub102 (20) -FB. Um terceiro par de partezimas foi projetado para se reunir em uma MNAzimas ativa quando ligado a amplicons gerados pela amplificação de uma região de DNA não transcrita, denominada infA_IGR, fornecendo assim uma medida de NED. Uma vez montado, esse MNAzima poderia clivar o substrato repórter Sub72-A1B. As sequências da Partezima A e Partezima B para cada MNAzima estão listadas abaixo, de 5’ a 3'. Bases em negrito hibridam com o alvo, bases sublinhadas fazem parte do núcleo catalítico na MNAzima montada e bases em itálico se referem à sequência que hibrida com o substrato.
SEQ ID NO: 18 Partezima A para GAT1 CTomp1T_3A4/102-P ATTGAACGACATGTTCTCGATTAAACAACGAGGGACGTCGA/3Phos/
SEQ ID NO: 19 Partezima B para GAT1 CTomp1T_3B5/102-P CGGTAGAGGAGGCTAGCTGGCTGCTTTTACTTGCAAGACA/3Phos/ SEQ ID NO: 20 Partezima A para GAT2 CTomp1L_A4/102-P CTTGCACCACTTGGTGTGACGACAACGAGGGACGTCGA/3phos/ SEQ ID NO: 21 Partezima B para GAT2 CTomp1L_B5/102-P CGGTAGAGGAGGCTAGCTCTATCAGCATGCGTGTGGGTTA/3phos/ SEQ ID NO: 8 Partezima A para NED CTinfAIGR_A4/72-P TCGACTAAACAGAAAATGTCAAAACAACGAGAGGCGTGAT/3Phos/ SEQ ID NO: 9 Partezima B para NED CTinfAIGR_B5/72-P CTGGGAGGAGAGGCTAGCTCAACTTGTCAAAAAACAGAAGG/3Phos/
9.2 Substratos repórteres
[00230] No exemplo atual, foram utilizados dois substratos repórter diferentes, cada um marcado com fluoróforos distintos. O sub102 (20) -FB foi rotulado no final da extremidade 5 com 6-FAM e com IABkFQ na extremidade 3, e sua clivagem foi monitorada a 516 nm com excitação a 492 nm. Sub72-A1B foi marcado com ATTO ™ Rho101 na extremidade 5’ e com IAbRQSp na extremidade 3', e sua clivagem foi monitorada a 609nm com excitação a 592 nm. Os substratos repórteres para este exemplo são mostrados abaixo com a sequência 5’ a 3'. As bases em minúsculas representam RNA e as bases em minúsculas representam DNA.
SEQ ID NO: 10 para GAT1 e GAT2 Sub102 (20) -FB TCGACGTCCCguCCTCTACCG SEQ ID NO: 11 para NED Sub72-A1B ATCACGCCTCguCTCCTCCCAG
9.3 iniciadores de PCR para amplificação de GAT1, GAT2 e
NED
[00231] A amplificação in vitro do modelo de TNA extraído de células infectadas com Chlamydia trachomatis foi realizada usando os iniciadores listados abaixo. Os iniciadores para Frente e Reverso foram utilizados para amplificar duas regiões do gene omp1 e transcritos (GAT1 e GAT2) e o DNA infA_IGR (NED) por RT-PCR. Todas as sequências são gravadas de 5’ a 3'.
SEQ ID NO: 4 Iniciador direto para GAT1 5omp1
CTTCTTCCTGGGGAGAACG SEQ ID NO: 22 Iniciador reverso para GAT1 3omp1_2
CAATTAATGGCCTGAGGAATGTC SEQ ID NO: 16 Iniciador direto para GAT2 5CTomp1_1
TTTCGGCGGAGATCCTTGCGATCC SEQ ID NO: 17 Iniciador reverso para GAT2 3CTomp1_2
CGAAAACAAAGTCACCGTAGTAACC SEQ ID NO: 12 Iniciador para frente para NED 5CTinfAIGR_2
GAGAGAGTGATTATATCGACTAA SEQ ID NO: 23 Iniciador reverso para NED 3CTinfAIGR_3
GCAAAAACTCAAGAGAGAATGTC
9.4 Preparação do TNA
[00232] RNA e DNA (TNA) foram co-extraídos de Chlamydia trachomatis (sorovar D) que foi cultivado em células HEp-2, como descrito no exemplo 1 (1.1 Cultura, 1.1.3 Protocolo de Tratamento C). A extração foi realizada usando o kit de extração FireMonkey
PuriSpin, conforme definido no exemplo 1 (extração de 1,3 ácido nucleico total (TNA), 1.3.2 Protocolo de extração B) e seguindo as instruções do fabricante para extração simultânea de DNA e RNA.
9.5 Componentes da reação
[00233] Todas as reações continham 40 nM de cada iniciador Para Frente, 200 nM de cada iniciador reverso, 200 nM de cada partezima A, 200 nM de cada partezima B, 400 nM de substrato SEQ ID NO 10 e 200 nm de substrato SEQ ID NO 11, 1x Mistura SensiFAST Probe No-ROX (Bioline), MgCl2 2 mM (Bioline), 0,2 U/µL de inibidor da RNase RiboSafe (Bioline), 0,2 µL de enzima da transcriptase reversa (Bioline) e água livre de nuclease (Ambion) em um volume total de 20 µL. Todas as reações foram realizadas em triplicado em um termociclador BioRad® CFX96. Os parâmetros de ciclagem foram 48°C por 10 minutos, 95 °C por 2 minutos, 10 ciclos de 95 °C por 5 segundos e 61 °C por 30 segundos (com uma diminuição de 0,5 °C na temperatura por ciclo) e 30 ciclos de 95 °C por 5 segundos e 52 °C por 50. segundos. As reações continham 5 µL de gabarito de TNA (diluição de 1/1000) ou nenhum alvo (dH2O).
9.6 Resultados
[00234] O DNA e o RNA da clamídia de 2 regiões do gene e transcritos omp1 (GAT1 e GAT2) e uma região NED foram co- amplificados e detectados em RT-PCR único de TNA extraído de culturas de clamídia. Essas culturas foram tratadas com antibiótico ou deixadas sem tratamento (controle) em uma fase de crescimento exponencial. Eles foram incubados por 5 minutos a 37 °C (Figura 7 painel iv) ou 15 minutos em temperatura ambiente
(Figura 7 painel v). O antibiótico utilizado no tratamento foi a rifampicina, na concentração de 0,256 µg/mL, equivalente a 32 vezes mais que a CIM para cepas suscetíveis e 32 vezes menor que a CIM para cepas resistentes. A Tabela 9 mostra os valores do ciclo limiar (Ct) medidos para o GAT1/2 e o NED em cada amostra. O ∆Ct foi calculado como as diferenças entre os valores de Ct dos sinais NED e GAT1/2. Por sua vez, a mudança de dobra (diferença entre o GAT1/2 e o NED) que teoricamente levaria a esses valores de ∆Ct foi estimada em 2∆Ct e mostrada na Tabela 9. Os resultados foram então comparados entre as reações sem tratamento (controle) e aqueles tratados com antibiótico em cada momento (Figura 7 painel iv e v).
Tabela 9: Resultados de uma análise triplex de RT-PCR de TNA de amostras tratadas e não tratadas, colhidas em diferentes momentos após o tratamento (PT) 5min com incubação a 37 °C com 5% de CO2 e 15 minutos com incubação à temperatura ambiente.
Limiar (Ct) ∆VI valor Mudan Índi TA p GAT ∆C Amostra NED ça de ce Rat 1/2 t dobra VITA io A/B incubação PT Deforma A, < 5min de ção Nenhum 13, 18, 4, 1,9 0,000 17,81 8,91 suscetí antibió 96 11 16 0 1 vel tico ****
(cepa B, Mais 15, 18, 3, 1) Antibió 9,37 4,69 07 30 23 tico A, Tensão Nenhum 14, 19, 4, 11,9 23,86 resiste antibió 75 32 58 1 1,0 0,257 nte tico 7 3 (cepa B, Mais 14, 18, 4, 11,1 5) Antibió 22,37 28 76 48 8 tico A, Deforma Nenhum 14, 18, 3, ção 15,91 7,95 antibió 93 92 99 <0,00 suscetí 1,8 tico 01 15 min de incubação PT À temperatura ambiente vel 0 B, Mais **** (cepa 15, 18, 3, Antibió 8,82 4,41 1) 34 48 14 tico A, Tensão Nenhum 14, 19, 4, 10,3 20,65 resiste antibió 82 19 37 3 0,9 N/A nte tico 1 (cepa B, Mais 14, 19, 4, 11,4 5) Antibió 22,81 55 06 51 1 tico
[00235] A análise dos resultados mostra que quando as amostras de TNA, extraídas de grupos não tratados e tratados, foram amplificadas, o valor de Ct para GAT1/2 foi menor que o NED (Tabela 9), indicando que havia transcrição ativa em todas as amostras. A mudança de dobra e os índices VITA foram calculados para todas as amostras em todos os momentos após o tratamento (Tabela 9). Como dois genes e seus transcritos foram usados para calcular o GAT1/2, e apenas uma única região não transcrita foi usada para calcular o NED, então a mudança de dobra é o dobro da dos índices VITA (Tabela 9). As reduções nos índices de VITA, entre as amostras não tratadas e tratadas, foram analisadas pelo teste t não pareado, em cada momento e condição de incubação.
[00236] Os resultados mostraram uma diminuição significativa nos índices de VITA da cepa suscetível 1 (Tabela 9, p <0,0001) após 5 minutos de incubação com Rifampicina a 37 °C (Figura 7 painel iv). Isto é consistente com uma interrupção na atividade de transcrição de células na presença de antibiótico e confirma o perfil de suscetibilidade desse sorovar particular. Em contraste, o Índice VITA da cepa resistente (cepa 5) não demonstrou uma diferença significativa entre amostras tratadas e não tratadas nessas mesmas condições (Tabela 9, Figura 7 painel iv) confirmando o perfil resistente desse sorovar em particular. Em uma experiência paralela, foi observada uma diminuição nos índices de VITA de réplicas da cepa suscetível 1 (Tabela 9, p <0,0001) após 15 minutos de incubação com Rifampicina à temperatura ambiente (Figura 7 painel v). O índice VITA da cepa resistente 5 não diminuiu na presença de rifamicina nas mesmas condições e de fato mostrou um pequeno aumento.
[00237] Os dados deste exemplo demonstram que o GAT1/2 e o NED podem ser medidos em uma única reação e os resultados usados para calcular os índices de VITA. Foi detectada uma resposta à presença de antibiótico através da comparação entre os índices VITA das células tratadas e não tratadas e calculada como a razão TAVITA. Isso pode ser usado para refletir com precisão os perfis de suscetibilidade ou resistência a antibióticos das células e demonstra ainda que a suscetibilidade pode ser estabelecida após curtos tempos de incubação. A diferenciação entre suscetibilidade e resistência a antibióticos pode ser detectada 5 minutos após o tratamento com antibióticos. Também foi demonstrado que a necessidade de incubação a 37 °C estável não é necessária, com a incubação à temperatura ambiente distinguindo corretamente os organismos suscetíveis e resistentes.
Exemplo 10: Teste de suscetibilidade a antibióticos usando VITA PCR - resposta dependente da dose usando o Protocolo de Extração A
[00238] O exemplo a seguir estima a alteração do GAT em relação ao NED em amostras de TNA, extraídas de células HEp-2 que foram infectadas com Chlamydia trachomatis (sorovar D). O TNA foi extraído de células que não foram tratadas (controle) ou tratadas com antibiótico (azitromicina) em doses variadas; especificamente, em uma concentração quatro vezes a MIC (0,128 µg/mL), seis vezes a MIC (0,192 µg/mL) e oito vezes a MIC (0,256 µg/mL). O antibiótico foi adicionado 24 horas após a infecção quando as células estavam na fase de crescimento exponencial, como descrito no exemplo 1, Tratamento D (1.1.4). Para medir o GAT, o DNA e o RNA da clamídia foram amplificados por RT-PCR usando iniciadores direcionados a dois locais diferentes do gene omp1 e de seus transcritos. Para medir o NED, uma outra região do DNA da clamídia foi co-amplificada na mesma RT-PCR usando iniciadores direcionados a uma região do DNA genômico que não é transcrita. Os níveis de GAT e NED foram estimados e utilizados para o cálculo dos índices VITA. Além disso, os índices VITA de amostras tratadas e não tratadas foram utilizados para calcular a razão TAVITA.
10.1 Análise VITA PCR de GAT1, GAT2 e NED
[00239] Os oligonucleotídeos de partícula, substratos Reporter e iniciadores de PCR utilizados para amplificação e detecção de GAT1, GAT2 e NED foram como no exemplo 5 (5,1, 5,2 e 5,3, respectivamente). As condições de RT-PCR utilizadas foram as descritas no Exemplo 5 (5.5) e as reações continham 5 µL de molde TNA (diluição 1/1000) ou nenhum alvo (dH2O).
10.2 Preparação do TNA
[00240] RNA e DNA (TNA) foram co-extraídos de Chlamydia trachomatis (sorovar D) que foi cultivado em células HEp-2, como descrito no exemplo 1 (1.1 Cultura, 1.1.4 Protocolo de Tratamento D). A extração foi realizada como uma técnica LLE, utilizando fenol: clorofórmio: isoamil, também descrito no exemplo 1 (extração com 1,3 ácido nucleico total (TNA), 1.3.1 Protocolo de extração A) com a seguinte modificação; a etapa de granulação de detritos celulares não foi realizada durante a extração das amostras neste exemplo.
10.3 Resultados
[00241] O DNA e o RNA da clamídia de 2 regiões do gene e transcritos omp1 (GAT1 e GAT2) e uma região NED foram co- amplificados e detectados em uma única RT-PCR usando TNA extraído de culturas de clamídia. Essas culturas foram tratadas com doses seriais de antibiótico ou deixadas sem tratamento (controle) durante a fase de crescimento exponencial e colhidas após uma incubação de 1 hora (Figura 8 painel i). A Tabela 10 mostra os valores do ciclo limite (Ct) medidos para o GAT1/2 e o NED em cada amostra. O ∆Ct foi calculado como as diferenças entre os valores de Ct dos sinais NED e GAT1/2. Por sua vez, a mudança de dobra (diferença entre o GAT1/2 e o NED) que teoricamente levaria a esses valores de wasCt foi estimada em 2∆Ct e mostrada na Tabela
10. Os resultados foram comparados entre as reações sem tratamento (controle) e aqueles tratados com as diferentes doses de antibiótico (Figura 8 painel ii).
Tabela 10: Resultados de uma análise triplex de RT-PCR de TNA de amostras não tratadas e amostras tratadas com doses seriadas de antibiótico, colhidas 1 hora após o tratamento Limiar (Ct)
TR 2xGA Índi Amostra GAT1 ∆VITA Ratio NED ∆Ct FC T/ ce /2 controle/tratado 1xNE VITA
D A, Nenhum 12,3 20, 7,9 249, 124, 2 antibiót 0 26 6 58 87 ico B, Mais dose de 12,3 19, 7,4 178, 89,2 A/B1 2 antibiót 8 86 8 53 8 ,4 ico 1 C, Mais 12,6 19, 7,1 141, 70,7 A/C1 2 dose de 3 77 4 37 4 ,8 antibiót ico 2 D, Mais dose de 12,2 18, 5,8 57,8 28,9 A/D4 2 antibiót 0 05 5 1 1 ,3 ico 3
[00242] Foi previsto que as células suscetíveis ao tratamento com antibióticos teriam uma diminuição nos níveis de transcrição na presença de antibióticos, pois seria esperado que isso prejudicasse o funcionamento normal das células. Além disso, previu-se que doses mais altas de antibiótico levariam a uma maior interrupção do funcionamento normal e, consequentemente, a níveis de transcrição. Este exemplo foi realizado para demonstrar isso e estabelecer se a diminuição dos índices VITA das células tratadas se correlaciona com a dose de antibiótico utilizado.
[00243] A análise dos resultados mostra que quando as amostras de TNA, extraídas dos grupos não tratados e tratados, foram amplificadas, os valores de Ct para GAT1/2 foram menores que o NED (Tabela 10), consistente com a transcrição ativa nas quatro amostras. A variação de dobra e os índices VITA foram calculados para cada amostra (Tabela 10). Como duas regiões genéticas e de transcrição foram usadas para calcular o GAT1/2, e apenas uma única região não transcrita foi usada para calcular o NED, então a mudança de dobra é o dobro da dos índices VITA (Tabela 10). A comparação dos índices de VITA das amostras não tratadas e tratadas demonstrou uma diferença (Figura 8 painel ii). A diferença foi significativa para não tratado (sem fármaco) e tratado (dose 1 do fármaco mais) (p = 0,0005, usando um teste t não pareado). Para todas as amostras tratadas, sendo não apenas inferiores às amostras não tratadas, elas também foram sequencialmente mais baixas quanto maior a dose de antibiótico usado durante a incubação (Figura 8 painel ii). Nesta experiência, houve uma correlação entre a dose e a diminuição dos índices VITA (R2 = 0,9775, Figura 8 painel ii). Isso é consistente com uma diminuição da atividade transcricional na presença de antibiótico, e quanto maior a dose de antibiótico administrada, maior a interrupção da atividade transcricional. A Razão TAVITA é calculada dividindo o Índice VITA (sem antibiótico) pelo Índice VITA de amostras tratadas com cada dose de antibiótico (mais dose antibiótica1, dose 2 e dose 3, Tabela 10, Figura 8, painel ii).
[00244] Os dados deste exemplo demonstram que o GAT1/2 e o NED podem ser medidos em uma única reação e os resultados usados para calcular os índices de VITA. A comparação entre os índices VITA de células tratadas e não tratadas, calculada como Razão TAVITA, demonstrou uma resposta à presença de antibiótico. Essa resposta aos antibióticos também foi maior quando doses serialmente mais altas de antibióticos foram usadas, indicando uma resposta dependente da dose. Isso demonstrou ainda a capacidade de usar os índices VITA para examinar se as células são suscetíveis a um antibiótico e que uma incubação de 1 hora pode ser suficiente para determinar isso. A resposta a um fármaco de maneira dependente da dose pode ser aplicada em programas de descoberta ou rastreamento de fármacos Exemplo 11 - Teste de suscetibilidade a antibióticos usando VITA PCR - resposta dependente da dose usando o Protocolo de Extração B
[00245] O exemplo a seguir estima a alteração do GAT em relação ao NED em amostras de TNA, extraídas de células HEp-2 que foram infectadas com Chlamydia trachomatis (sorovar D). O TNA foi extraído de células que não foram tratadas (controle) ou tratadas com o antibiótico azitromicina em doses variadas; especificamente, em uma concentração quatro vezes a MIC (0,128 µg/mL), seis vezes a MIC (0,192 µg/mL), oito vezes a MIC (0,256 µg/mL) e dezesseis vezes a MIC (0,512 µg/mL). O antibiótico foi adicionado 20 horas após a infecção quando as células estavam na fase de crescimento exponencial, como descrito no exemplo 1, Tratamento D (1.1.4). Para medir o GAT, o DNA e o RNA da clamídia foram amplificados por RT-PCR usando iniciadores direcionados a dois locais diferentes do gene omp1 e seus transcritos. Para medir o NED, outra região do DNA de Chlamydia foi co-amplificada na mesma RT-PCR usando iniciadores direcionados a uma região de DNA genômico que não é transcrita. Os níveis de GAT e NED foram estimados e utilizados para o cálculo dos índices VITA. Além disso, os índices VITA de amostras tratadas e não tratadas foram utilizados para calcular a razão TAVITA.
11.1 Análise VITA PCR de GAT1, GAT2 e NED
[00246] Os oligonucleotídeos de partícula, substratos Reporter e iniciadores de PCR utilizados para amplificação e detecção de GAT1, GAT2 e NED foram como no exemplo 9 (9.1, 9.2 e 9.3, respectivamente). As condições de RT-PCR utilizadas foram as descritas no Exemplo 9 (9.5) e as reações continham 5 µL de molde TNA (diluição 1/1000) ou nenhum alvo (dH2O).
11.2 Preparação do TNA
[00247] RNA e DNA (TNA) foram co-extraídos de Chlamydia trachomatis (sorovar D) que foi cultivado em células HEp-2, como descrito no exemplo 1 (1.1 Cultura, 1.1.4 Protocolo de Tratamento D). A extração foi realizada usando o kit de extração FireMonkey PuriSpin, conforme definido no exemplo 1 (extração de 1,3 ácido nucleico total (TNA), 1.3.2 Protocolo de extração B) e seguindo as instruções do fabricante para extração simultânea de DNA e RNA.
11.3 Resultados
[00248] A co-amplificação do DNA e RNA da clamídia a partir de 2 regiões (GAT1 e GAT2) e uma região NED foram monitoradas em uma única RT-PCR usando TNA extraído de culturas de clamídia. Essas culturas foram tratadas com doses seriais de antibiótico ou deixadas sem tratamento (controle) durante a fase de crescimento exponencial e colhidas 1 hora após o tratamento (Figura 8, painel i). A Tabela 11 mostra os valores do ciclo limiar (Ct) medidos para o GAT1/2 e o NED em cada amostra. O ∆Ct foi calculado como as diferenças entre os valores de Ct dos sinais NED e GAT1/2. Por sua vez, a mudança de dobra (diferença entre o GAT1/2 e o NED) que teoricamente levaria a esses valores de ∆Ct foi estimada em 2∆Ct e mostrada na Tabela 11. Os resultados foram então comparados entre reações sem tratamento (controle) e aqueles tratados com as diferentes doses de antibiótico (Figura 8 painel iii).
Tabela 11: Resultados de uma análise triplex de RT-PCR de TNA de amostras não tratadas e amostras tratadas com doses seriadas de antibiótico, com 1 h de incubação após o tratamento Limiar (Ct) Amostra TR Índice ∆VITA GAT1/2 NED ∆Ct FC 2xGAT/ VITA Ratio
1xNED A, Nenhum 15,71 19,25 3,54 11,66 2 5,83 antibiótico B, Mais dose de A/B 16,08 19,24 3,16 8,94 2 4,47 antibiótico 1,30 1 C, Mais dose de A/C 16,01 19,07 3,06 8,36 2 4,18 antibiótico 1,39 2 D, Mais dose de A/D 16,37 19,35 2,98 7,91 2 3,95 antibiótico 1,47 3 E, Mais dose de A/E 16,56 19,31 2,74 6,70 2 3,35 antibiótico 1,74 4
[00249] Do mesmo modo como descrito no exemplo 10, espera- se que as células suscetíveis ao tratamento com antibióticos tenham uma redução nos níveis de transcrição, pois a presença de antibiótico seria antecipada para interromper o funcionamento normal das células. Prevê-se que a interrupção causada possa se correlacionar com a dose de antibiótico e, como tal, é provável que quanto maior a dose de antibiótico, maior a interrupção do funcionamento normal, níveis de transcrição e índices VITA resultantes.
[00250] A análise dos resultados mostra que quando as amostras de TNA, extraídas de grupos não tratados e tratados, foram amplificadas, o valor de Ct para GAT1/2 foi menor que o NED (Tabela 11). Isso é consistente com a transcrição ativa em todas as amostras.
A variação de dobra e os índices VITA foram calculados para as amostras (Tabela 11). A mudança de dobra é o dobro dos índices VITA (Tabela 11), uma vez que dois genes e regiões de transcrição correspondentes foram usados para calcular o GAT1/2, e apenas uma única região não transcrita foi usada para calcular o NED.
A comparação dos índices de VITA, da amostra não tratada (sem fármaco) e da amostra tratada (mais a dose 1 do fármaco), demonstrou uma diferença significativa (Figura 8, painel iii, p <0,05 gerado usando um teste t não pareado). Todas as demais amostras tratadas também foram diferentes das não tratadas (Figura 8, painel iii). As amostras tratadas exibiram índices VITA inferiores às amostras não tratadas.
Além disso, à medida que a dose de tratamento aumentou, os índices de VITA diminuíram (Figura 8 painel iii). Isso é consistente com uma diminuição da atividade transcricional na presença de antibiótico e é ainda mais evidente que quanto mais antibiótico usado, maior a interrupção da atividade transcricional.
Essa tendência também gerou uma correlação linear (R2 = 0,8325) entre o Índice VITA e a dose de antibiótico (Figura 8 painel iii, Tabela 11). A Razão TAVITA é calculada dividindo o Índice VITA (sem antibiótico) pelo Índice VITA de amostras tratadas com cada dose de antibiótico (mais dose1, dose 2, dose 3 e dose 4). A razão TAVITA apresentou um aumento no valor correlacionado com o aumento na dose de antibiótico (Tabela 11).
[00251] Os dados deste exemplo elucidam ainda mais que o GAT1/2 e o NED podem ser medidos em uma única reação e os resultados usados para calcular os índices de VITA. A comparação entre os índices VITA de células tratadas e não tratadas, calculada como Razão TAVITA, demonstrou uma resposta à presença de antibiótico. A resposta aos antibióticos foi linearmente correlacionada com a dose utilizada no tratamento, indicando uma resposta dependente da dose. Isso foi independente do método de extração usado para obter as amostras de TNA. Isso estabeleceu ainda, como visto no exemplo 10, a capacidade de usar os índices VITA para examinar se as células são suscetíveis ou resistentes a um antibiótico e se uma incubação de 1 hora é suficiente. A capacidade do VITA PCR para monitorar a resposta a um fármaco de maneira dependente da dose pode ser aplicada em programas de descoberta ou rastreamento de fármacos.
Exemplo 12 - Teste de sensibilidade a antibióticos com Azitromicina e Doxiciclina usando VITA PCR
[00252] O exemplo a seguir analisa a suscetibilidade de bactérias a um determinado fármaco, estimando a alteração dos níveis de GAT em relação ao NED em amostras de TNA. Estes foram então comparados entre amostras tratadas com antibiótico e não tratadas (controle). Foram obtidas amostras de células HEp-2 que foram infectadas com diferentes cepas de Chlamydia trachomatis, conhecidas por serem suscetíveis aos dois fármacos testados, Azitromicina e Doxiciclina. O TNA foi extraído das células, que foram tratadas com uma dose única de antibiótico (0,256 µg/mL) ou não tratadas (controle) 20 horas após a infecção, enquanto em fase de crescimento exponencial e incubadas por uma hora após o tratamento. O tratamento foi como descrito no exemplo 1,
Tratamento E (1.1.5). Para obter uma medida GAT, o DNA e o RNA da clamídia foram amplificados por RT-PCR usando iniciadores direcionados a dois locais diferentes do gene omp1 e seus transcritos. Para medir o NED, outra região do DNA de Chlamydia foi co-amplificada na mesma RT-PCR usando iniciadores direcionados a uma região de DNA genômico que não é transcrita. Os níveis de GAT e NED foram estimados e utilizados para o cálculo do Índice VITA. Além disso, os índices VITA de amostras tratadas e não tratadas foram utilizados para calcular a razão TAVITA.
12.1 Análise VITA PCR de GAT1, GAT2 e NED
[00253] Os oligonucleotídeos de partícula, substratos Reporter e iniciadores de PCR utilizados para amplificação e detecção de GAT1, GAT2 e NED foram como no exemplo 9 (9.1, 9.2 e 9.3, respectivamente). As condições de RT-PCR utilizadas foram as descritas no Exemplo 9 (9.5) e as reações continham 5 µL de molde TNA (diluição 1/1000) ou nenhum alvo (dH2O).
12.2 Preparação do TNA
[00254] RNA e DNA (TNA) foram co-extraídos de diferentes cepas de Chlamydia trachomatis, que foram cultivadas em células HEp-2, como descrito no exemplo 1 (1.1 Cultura, 1.1.5 Protocolo de Tratamento E). A extração foi realizada usando o kit de extração FireMonkey PuriSpin, conforme definido no exemplo 1 (extração de 1,3 ácido nucleico total (TNA), 1.3.2 Protocolo de extração B) e seguindo as instruções do fabricante para extração simultânea de DNA e RNA.
12.3 Resultados
[00255] O DNA e o RNA da clamídia de 2 regiões GAT e uma região NED foram co-amplificados e detectados em RT-PCR único de TNA extraído de culturas de clamídia. Estas culturas foram tratadas com antibiótico ou deixadas sem tratamento (controle) em uma fase de crescimento exponencial e colhidas 1 hora após o tratamento. As Tabelas 12a e 12b exibem os valores do ciclo limiar (Ct) para cada amostra (tratada ou não tratada) de cada cepa e antibiótico individual utilizados no tratamento, nomeadamente Azitromicina e Doxiciclina, respectivamente. O ∆Ct foi calculado como as diferenças entre os valores de Ct dos sinais NED e GAT1/2. Por sua vez, a mudança de dobra (diferença entre o GAT1/2 e o NED) que teoricamente levaria a esses valores de ∆Ct foi estimada em 2∆Ct e mostrada na Tabela 12a e 12b. Os resultados foram comparados entre as reações sem tratamento (controle) e as tratadas com antibiótico para cada cepa. Os antibióticos testados foram Azitromicina (Tabela 12a, Figura 9, painel i) e Doxiciclina (Tabela 12b, Figura 9, painel ii).
[00256] Como todas as cepas testadas foram previamente caracterizadas como suscetíveis aos dois antibióticos usados neste exemplo, seria esperada uma diferença entre os índices VITA de amostras tratadas e não tratadas. Prevê-se que o índice VITA das amostras tratadas seja inferior às amostras não tratadas, uma vez que a presença de antibiótico causaria uma interrupção da atividade transcricional normal das células. Posteriormente, todas as amostras indicaram que estavam vivas e transcrevendo ativamente, independentemente do tratamento. Isso foi observado a partir da amplificação de amostras de TNA, extraídas de grupos não tratados e tratados, que apresentaram valores de Ct mais baixos para GAT1/2 do que o NED, independentemente do antibiótico utilizado (Tabela 12a e 12b).
[00257] A variação de dobra e os índices VITA foram calculados para todas as amostras em todos os momentos após o tratamento, para cada um dos fármacos utilizados (Tabela 12a e 12b). A comparação dos índices de VITA, entre as amostras não tratadas e tratadas em cada momento, demonstrou uma diferença significativa, com os índices de VITA para amostras tratadas inferiores aos não tratados, para todas as cepas e antibióticos testados (p <0,01 usando um teste t não pareado para cada Tabela 12a e 12b, Figura 9, painel ie ii). Isso é consistente com os resultados previstos, evidenciando a suscetibilidade da cepa aos fármacos utilizados no tratamento e resultando na interrupção da atividade transcricional. A razão TAVITA, calculada dividindo o índice VITA (sem antibiótico) pelo índice VITA com antibiótico, também apresentou resultados semelhantes entre cada cepa testada com o mesmo antibiótico e também entre antibióticos (Tabela 12a e 12b).
[00258] Esta experiência, pelos resultados obtidos, demonstra que o GAT1/2 e o NED podem ser medidos em uma única reação, e os resultados usados para calcular os índices VITA e as razões ∆VITA. As respostas individuais obtidas de cada cepa testada foram consistentes com a susceptibilidade prevista para ambos os antibióticos utilizados, obtida através da análise dos índices VITA de tratados versus não tratados. Isso destacou ainda a capacidade de utilizar os índices VITA para examinar a suscetibilidade a antibióticos das células com uma incubação curta na presença e na ausência do fármaco de interesse.
Tabela 12a: Resultados de uma análise triplex de RT-PCR de TNA de amostras tratadas e não tratadas, colhidas uma hora após o tratamento (PT) com Azitromicina.
Limiar médio (Ct) T ∆VIT R Índic A GAT1/ Valor Amostra NED ∆Ct FC e Rati 2 P VITA o A/B A, Nenhum 19,2 3,5 11,6 antibióti 15,71 2 5,83 5 4 6 0,007 Cep co 1,47 3 a 1 B, Mais 19,3 2,9 ** Antibióti 16,37 7,91 2 3,95 5 8 co A, Nenhum 19,0 3,6 12,1 antibióti 15,43 2 6,05 3 0 0 0,000 Cep co 1,42 5 a 2 B, Mais 19,4 3,0 *** Antibióti 16,33 8,53 2 4,27 3 9 co A, Nenhum 21,3 3,9 14,8 antibióti 17,48 2 7,44 8 0 8 0,000 Cep co 1,31 8 a 3 B, Mais 21,3 3,5 11,3 *** Antibióti 17,85 2 5,66 5 0 3 co
A, Nenhum 21,0 3,8 14,2 antibióti 17,24 2 7,14 8 4 9 0,000 Cep co 1,30 6 a 5 B, Mais 21,1 3,4 11,0 *** Antibióti 17,69 2 5,50 5 6 0 co Tabela 12b: Resultados de uma análise triplex de RT-PCR de TNA de amostras tratadas e não tratadas, colhidas 1 hora após o tratamento (TP) com doxiciclina.
Limiar médio (Ct) T ∆VIT R Índic A GAT Valor Amostra NED ∆Ct FC e Rati 1/2 p VITA o A/B A, Nenhum 18,1 21,2 3,0 antibióti 8,25 2 4,13 7 2 5 <0,000 Cep co 1,48 1 a 1 B, Mais 18,8 21,3 2,4 **** Antibióti 5,59 2 2,80 7 5 8 co A, Nenhum 15,6 18,8 3,2 antibióti 9,71 2 4,86 1 9 8 Cep co 0,008 1,24 a 2 B, Mais *** 16,2 19,1 2,9 Antibióti 7,84 2 3,92 2 9 7 co
A, Nenhum 17,4 21,3 3,9 14,8 antibióti 2 7,44 8 8 0 8 < Cep co 1,32 0,0001 a 3 B, Mais 17,1 20,6 3,5 11,2 **** Antibióti 2 5,64 3 2 0 7 co A, Nenhum 17,2 21,0 3,8 14,2 antibióti 2 7,14 4 8 4 9 < Cep co 1,43 0,0001 a 5 B, Mais 18,2 21,5 3,3 10,0 **** Antibióti 2 5,01 1 3 3 2 co Exemplo 13: Teste de sensibilidade a antibióticos com rifampicina usando VITA PCR usando cepas resistentes e suscetíveis
[00259] O exemplo a seguir analisa a suscetibilidade de bactérias a um determinado fármaco, estimando a alteração dos níveis de GAT em relação ao NED em amostras de TNA. Estes foram então comparados entre amostras tratadas com antibiótico e não tratadas (controle). Amostras foram obtidas de células HEp-2 que foram infectadas com diferentes cepas de Chlamydia trachomatis, previamente caracterizadas em cultura como suscetíveis ao fármaco Rifampicina (total de quatro cepas: serovar D, cepa de laboratório (cepa 1), serovar L2, Wild Cepa de laboratório do tipo (cepa 2), serovar L2, cepa resistente a trimetoprim (cepa 3) e serovar L2, cepa resistente a espectinomicina (cepa 4)); ou resistente à rifampicina (serovar L2, cepa resistente à rifampicina (cepa 5)). O TNA foi extraído das células, que foram tratadas com uma alta dose de antibiótico ou não tratadas
(controle), 20 horas após a infecção, enquanto em uma fase de crescimento exponencial. O tratamento foi como descrito no exemplo 1, Tratamento E (1.1.5), usando uma concentração única de Rifampicina (0,256 µg/mL), equivalente a 32 vezes maior que a CIM de trens suscetíveis e 32 vezes abaixo da CIM da cepa resistente. Para obter uma medida GAT, o DNA e o RNA da clamídia foram amplificados por RT-PCR usando iniciadores direcionados a dois locais diferentes do gene omp1 e seus transcritos. Para medir o NED, outra região do DNA de Chlamydia foi co-amplificada na mesma RT-PCR usando iniciadores direcionados a uma região de DNA genômico que não é transcrita. Os níveis de GAT e NED foram estimados e utilizados para o cálculo do Índice VITA. Além disso, os índices VITA de amostras tratadas e não tratadas foram utilizados para calcular o ∆VITA.
13.1 Análise VITA PCR de GAT1, GAT2 e NED
[00260] Os oligonucleotídeos de partícula, substratos Reporter e iniciadores de PCR utilizados para amplificação e detecção de GAT1, GAT2 e NED foram como no exemplo 9 (9.1, 9.2 e 9.3, respectivamente). As condições de RT-PCR utilizadas foram as descritas no Exemplo 9 (9.5) e as reações continham 5 µL de molde TNA (diluição 1/1000) ou nenhum alvo (dH2O).
13.2 Preparação do TNA
[00261] RNA e DNA (TNA) foram co-extraídos de todas as diferentes cepas de Chlamydia trachomatis (cepas 1, 2, 3, 4 e 5) que foram cultivadas em células HEp-2, como descrito no exemplo 1 (1.1 Cultura, 1.1.5 Protocolo de tratamento E). A extração foi realizada usando o kit de extração FireMonkey PuriSpin, conforme definido no exemplo 1 (extração de 1,3 ácido nucleico total
(TNA), 1.3.2 Protocolo de extração B) e seguindo as instruções do fabricante para extração simultânea de DNA e RNA.
13.3 Resultados
[00262] O DNA e o RNA da clamídia de 2 regiões GAT e uma região NED foram co-amplificados e detectados em RT-PCR único de TNA extraído de culturas de clamídia. Essas culturas foram tratadas com antibiótico (rifampicina) ou deixadas sem tratamento (controle) durante a fase de crescimento exponencial e colhidas uma hora após o tratamento. A Tabela 13 exibe os valores do ciclo de limiar (Ct) para os componentes em cada amostra, para cada cepa individual. O ∆Ct foi calculado como as diferenças entre os valores de Ct dos sinais NED e GAT1/2. Por sua vez, a mudança de dobra (diferença entre o GAT1/2 e o NED) que teoricamente levaria a esses valores de ∆Ct foi estimada em 2∆Ct e mostrada na Tabela 13. Os resultados foram comparados entre as reações sem tratamento (controle) e aquelas tratado com antibiótico para cada cepa (Figura 9 painel iii); e os resultados foram comparados para cepas suscetíveis versus resistentes. A mudança de dobra e os índices VITA foram calculados para todas as amostras uma hora após o tratamento (Tabela 13).
[00263] A comparação dos índices de VITA, entre as amostras não tratadas e tratadas, apresentou uma diferença significativa nos índices de VITA para as cepas 1 a 4 (p <0,0001, usando um teste t não pareado, Tabela 13). Isso é consistente com uma interrupção na atividade de transcrição de células suscetíveis ao antibiótico usado para tratamento e visível na Figura 9 do painel iii. A comparação dos índices VITA para a cepa 5, entre amostras não tratadas e tratadas, não mostrou diferença significativa, com os índices VITA sendo semelhantes
(Figura 9, painel iii, Tabela 13). Isso é indicativo de resistência ao antibiótico rifampicina quando incubado a 37 °C por 1 h, consistente com pouca ou nenhuma interrupção na transcrição dessa cepa.
[00264] A razão TAVITA é calculada dividindo o índice VITA (sem antibiótico) pelo índice VITA por antibiótico. A razão TAVITA foi significativamente menor para a cepa 5, a cepa resistente (Tabela 13), demonstrando ainda a menor quantidade de diferença entre as amostras tratadas e não tratadas. A razão TAVITA para todas as outras linhagens foi em todos os casos > 2,93 (Tabela 13). A representação gráfica da razão TAVITA demonstra visualmente a diferença entre a razão TAVITA de cepas suscetíveis e resistentes (Figura 9 painel iv). Essas diferenças também foram determinadas como estatisticamente diferentes (p <0,0001, teste t de Welch não pareado). Um valor limiar ∆VITA de 1,63 permitiu distinguir cepas suscetíveis e resistentes com 95% de confiança (Figura 9, painel iv).
[00265] Os resultados desta experiência demonstram que o GAT1/2 e o NED podem ser medidos em uma única reação, e os resultados usados para calcular os índices de VITA. Paralelamente, a comparação entre os índices de VITA de células tratadas e não tratadas, calculada como Razão VITA, correlacionou-se ainda mais com uma resposta ou falta dela com a presença de antibiótico. As respostas individuais obtidas de cada cepa testada foram consistentes com a suscetibilidade prevista ao antibiótico utilizado, enquanto a falta de resposta foi associada ao perfil de resistência da cepa testada. Isso destacou ainda a capacidade de utilizar os índices VITA para examinar a suscetibilidade a antibióticos ou a resistência das células com uma incubação curta na presença e na ausência do fármaco de interesse.
Tabela 13: Resultados de uma análise triplex de RT-PCR de TNA de amostras tratadas e não tratadas, com antibiótico Rifampicin, colhidas 1 hora após o tratamento (PT) com comparação entre cepas suscetíveis e resistentes.
Limiar médio (Ct) ∆VIT Cep T VITA A GAT1/ Valor a Amostra NED ∆Ct FC R Inde Rati 2 P x o A/B A, Nenhum 21,2 3,0 antibióti 18,17 8,25 2 4,13 2 5 <0,000 co 1 3,54 1 B, Mais 21,5 1,2 **** Antibióti 20,32 2,33 2 1,17 4 2 co A, Nenhum 18,8 3,2 antibióti 15,61 9,71 2 4,86 9 8 <0,000 co 2 2,93 1 B, Mais 19,2 1,7 **** Antibióti 17,49 3,31 2 1,66 2 3 co A, Nenhum <0,000 21,3 14,8 3 antibióti 17,48 3,9 2 7,44 4,70 1 8 8 co ****
B, Mais 20,4 1,6 Antibióti 18,81 3,16 2 1,58 7 6 co A, Nenhum 20,5 4,3 19,7 4 antibióti 16,24 2 9,86 4 0 2 <0,000 co 5,86 1 B, Mais 20,4 1,7 **** Antibióti 18,66 3,37 2 1,68 1 5 co A, Nenhum 21,0 3,8 14,2 5 antibióti 17,24 2 7,14 8 4 9 co 1,06 0,1813 B, Mais 21,1 3,7 13,4 Antibióti 17,41 2 6,71 6 5 2 co Sem Sem Sem TNA Ct Ct Exemplo 14 - Teste de sensibilidade a antibióticos exemplificativo usando VITA PCR
[00266] O exemplo a seguir descreve um processo, ilustrado na Figura 10, que pode ser usado como uma tela geral para infecções, incluindo infecções sexualmente transmissíveis e sua resistência a antibióticos/status suscetível. Uma amostra clínica pode ser coletada de um paciente com suspeita de infecção sexualmente transmissível como Neisseria gonorrhea (GC), Chlamydia trachomatis (CT) ou Mycoplasma genitalium (MG). A amostra pode ser dividida em subamostras, uma das quais não é incubada com nenhum antibiótico, enquanto a outra pode ser incubada na presença de uma variedade de antibióticos usados no tratamento de um ou mais GC, CT e MG. Após a incubação, o ácido nucleico total pode ser analisado em um ensaio VITAPCR multiplex com iniciadores direcionados ao GAT e NED específicos para GC e/ou CT e/ou MG. O sinal positivo de GAT e NED para um organismo específico pode permitir o diagnóstico de uma IST e a comparação de índices de VITA na presença ou ausência de fármacos pode revelar qual terapia ou terapias podem ser usadas para tratar o paciente.
[00267] Além disso, pode-se analisar uma grande série de amostras e estabelecer índices limiares de VITA para cada organismo no ensaio. Esse valor limite poderia então ser usado como uma ferramenta para diagnosticar essas infecções sexualmente transmissíveis e/ou fornecer um método para o Teste de Cura após o tratamento com um antibiótico apropriado. Além disso, a análise de uma grande série de amostras na presença ou ausência de cada antibiótico pode permitir a determinação de um limiar de razão ΔVITA capaz de distinguir a sensibilidade ou resistência de cada organismo a cada antibiótico. O ΔVITA Ratio Threshold poderia então ser usado como uma ferramenta para prever a resposta a antibióticos específicos em um formato que não exigiria mais uma subamostra da amostra ou amostra para servir como um comparador de controle não tratado. Além disso, como o exemplo 7 mostrou que a sensibilidade e a resistência podem ser determinadas após apenas 5 minutos de incubação, o acoplamento da incubação ao protocolo de amplificação rápida pode torná-lo adequado como um teste rápido no ponto de atendimento. Finalmente, como o exemplo 7 também demonstrou que a incubação com o fármaco pode ser realizada à temperatura ambiente, esse teste não deve exigir equipamento adicional além do necessário para extração e amplificação.
Exemplo 15 - Uso de VITA PCR em diferentes cargas de material viável
[00268] O exemplo a seguir estima os níveis de NED e GAT em amostras com cargas variáveis de bactérias viáveis a mortas. O TNA foi extraído de células HEp-2 infectadas com Chlamydia trachomatis (sorovar D), não tratadas (Alive CT) ou tratadas com uma dose alta de 0,512 ug/ml por 40 horas do antibiótico azitromicina (Dead CT). Na colheita, estes foram misturados em diferentes proporções para obter diferentes cargas viáveis de 0%, 0,1%, 0,2%, 0,5%, 1%, 10%, 20%, 50% e 100%, conforme descrito no exemplo 1, Tratamento F ( 1.1.6) O DNA e o RNA da clamídia foram amplificados por RT-PCR usando iniciadores direcionados a dois locais diferentes do gene omp1 e seus transcritos para medir o GAT. Outra região do DNA da clamídia foi co-amplificada na mesma RT-PCR usando iniciadores direcionados a uma região do DNA genômico que não é transcrita para medir o NED. Os níveis de GAT e NED foram estimados e utilizados para o cálculo do Índice VITA.
15.1 Análise VITA PCR de GAT1, GAT2 e NED
[00269] Os oligonucleotídeos de partícula, substratos Reporter e iniciadores de PCR utilizados para amplificação e detecção de GAT1, GAT2 e NED foram como no exemplo 9 (9.1, 9.2 e 9.3, respectivamente). O iniciador reverso para NED (SEQ ID NO 23) foi substituído neste exemplo pelo seguinte.
SEQ ID NO: 13 Iniciador reverso para NED 3CTinfAIGR_1
CAAGAGAGAATGTCAAAAGATAC
[00270] As condições de RT-PCR utilizadas foram as descritas no Exemplo 9 (9.5) e as reações continham 5 µL de molde TNA (diluição 1/100) ou nenhum alvo (dH2O).
15.2 Preparação do TNA
[00271] RNA e DNA (TNA) foram co-extraídos de Chlamydia trachomatis (sorovar D) que havia sido cultivado em células HEp- 2, como descrito no exemplo 1 (1.1 Culture, 1.1.6 Treatment Protocol F). A extração foi realizada usando o kit de extração FireMonkey PuriSpin, conforme definido no exemplo 1 (extração de 1,3 ácido nucleico total (TNA), 1.3.2 Protocolo de extração B) e seguindo as instruções do fabricante para extração simultânea de DNA e RNA.
15.3 Resultados
[00272] O DNA e o RNA da clamídia (GAT), ou apenas o DNA (NED), foram co-amplificados em RT-PCR único de TNA extraído de uma mistura de células viáveis não tratadas (Alive CT) e células tratadas com uma alta dose de antibiótico (Dead CT ) para gerar cargas variáveis de clamídia viável. A Tabela 14 mostra os valores do ciclo de limiar (Ct) medidos para cada carga de viabilidade, usando GAT1 ou GAT1/2 na reação. O ΔCt foi calculado como as diferenças entre os valores de Ct dos sinais NED e GAT. Por sua vez, a mudança de dobra (razão de GAT para NED) que teoricamente levaria a esses valores de ΔCt foi estimada em 2ΔCt e plotada na Tabela 15 e os índices VITA foram plotados na Figura 11 no painel i. Os resultados foram então comparados com a porcentagem de viabilidade em cada mistura.
[00273] A análise de viabilidade, através de infecciosidade e coloração imunofluorescente, foi realizada para confirmar a precisão da carga em cada amostra misturada. Isso confirmou visualmente o aumento das inclusões de clamídia à medida que a porcentagem de viabilidade aumentou (dados não incluídos).
[00274] Teoricamente, baixas cargas de células viáveis teriam níveis mais baixos de transcritos detectáveis em um fundo de DNA genômico derivado de células não viáveis. Se o DNA não for degradado durante o tratamento, pode-se prever que a quantidade de DNA detectada seja maior que a quantidade de RNA, uma vez que o DNA é inerentemente mais estável que o RNA. Em amostras com altas cargas de células viáveis, espera-se que quantidades maiores de transcrições estejam presentes.
[00275] A análise dos resultados mostrou que quando o TNA extraído de uma amostra de carga viável a 0% foi amplificado, o valor de ΔCt para GAT e NED era pequeno (Tabela 14), indicando pouca ou nenhuma transcrição ativa. Para todas as amostras com carga viável de 0,2% ou mais, o valor de Ct para GAT foi menor que o NED (Tabela 14) consistente com a transcrição ativa. A mudança de dobra e os índices VITA foram calculados para todas as cargas viáveis (Tabela 14). Os índices VITA foram significativamente diferentes para a amostra com 0% de carga viável em comparação com aqueles com 0,2% ou mais de carga viável (Figura 11 painel i, Tabela 14, p <0,05). Não foram observadas diferenças significativas entre misturas contendo cargas viáveis superiores a 0,2% (Tabela 14, p> 0,05). Também foram testadas cargas de viabilidade de 0,1% e o Índice VITA mostrou-se significativamente diferente do Índice VITA de 0% de cargas viáveis, mas também foi significativamente diferente de cargas viáveis superiores a 0,2% (dados não mostrados).
[00276] Como esperado, as diferentes cargas viáveis também levaram a uma diferença nos valores de Ct para as reações GAT e NED, pois os valores de Ct se correlacionariam com cópias cromossômicas de Chlamydia trachomatis em cada mistura. Como as células, da TC morta, foram incubadas com o fármaco por 40 horas, isso sugere que pode haver não apenas uma interrupção na transcrição ativa do RNA, mas também na replicação ativa da bactéria, afetando a concentração de DNA. Também é provável que houve degradação do DNA e do RNA durante esse período. Como tal, cargas mais altas de bactérias viáveis apresentaram valores mais baixos de Ct (detecção anterior) do que cargas de viabilidade mais baixas (detecção em ciclos de PCR posteriores) (Figura 11 painel ii). Isso também se correlaciona com a análise da viabilidade clamídia das misturas (Figura 11, painel i).
[00277] Os dados deste exemplo demonstram que os índices VITA se correlacionam com a medida de populações viáveis e não viáveis, como evidenciado pela diferenciação entre populações viáveis com carga tão baixa quanto 0,1% e populações não viáveis. Este exemplo demonstra que o GAT e o NED podem ser medidos em uma única reação e os resultados podem ser usados para calcular os índices VITA que se correlacionam com a viabilidade observada, tão baixa quanto 0,1% da carga viável e sua distinção de populações não viáveis. Finalmente, este exemplo demonstra uma grande vantagem do VITA PCR, pois não é necessário quantificar a quantidade de TNA que é adicionada ao VITA PCR, pois o método determina a razão de GAT para NED, independentemente da quantidade de material de partida. A evidência para isso é o fato de que nenhuma diferença significativa é observada entre cargas viáveis, na ampla faixa investigada neste exemplo.
Tabela 14: Resultados de uma análise Triplex RT-PCR de TNA de amostras contendo diferentes cargas de viabilidade Limiar (Ct)
TR Amostra 2xGAT Índice % GAT1/2 NED ∆Ct FC Valor p to VITA viável 1xNED 0% 21,45 22,80 1,35 2,55 2 1,27 0,0035 0,2% 19,16 21,77 2,60 6,08 2 3,04 ** 0,5% 17,76 20,26 2,50 5,66 2 2,83 1% 17,06 19,52 2,47 5,53 2 2,76 0,1911 10% 13,44 16,13 2,69 6,47 2 3,23 20% 12,28 14,85 2,57 5,95 2 2,98 50% 11,25 13,72 2,47 5,53 2 2,76 100% 10,24 12,66 2,42 5,36 2 2,68 Sem Sem TNA Sem Ct Ct Exemplo 16 - Influência do tamanho do amplicon e outros parâmetros de RT-PCR nos índices VITA
[00278] O exemplo a seguir estima os níveis de NED e GAT em amostras de TNA extraídas de células HEp-2 infectadas com Chlamydia trachomatis (sorovar D). O TNA foi extraído de células que não foram incubadas com antibiótico (células viáveis e não tratadas) e de células incubadas com antibiótico em uma concentração oito vezes abaixo da CIM (<CIM), na CIM (CIM) ou 8 vezes maior que a MIC (> MIC), como descrito no exemplo 1, Protocolo de Tratamento A (1.2.1). O DNA e o RNA da clamídia (GAT) foram amplificados por RT-PCR usando iniciadores direcionados a dois locais diferentes do gene omp1 e seus transcritos (GAT1/2). Os dois pares de iniciadores usados para amplificar os dois alvos omp1 GAT nesta experiência (seção 16.3 SEQ ID NO4 e 24; SEQ ID NO 16 e 25) geraram amplicons mais longos do que aqueles gerados usando os dois pares de iniciadores GAT usados nos exemplos anteriores, incluindo o exemplo 5 (seção 5.3 SEQ ID NO 4 e 5, SEQ ID NO 16 e 17). Os amplicons resultantes tinham 215 pb e 311 pb de comprimento para GAT1 e GAT2, respectivamente. Apenas o DNA da clamídia (NED) foi co- amplificado na mesma mistura de RT-PCR utilizando iniciadores destinados a uma região do DNA genômico designada por InfA_IGR que não é transcrita. Os valores de Ct de GAT1/2 e NED foram estimados para a RT-PCR para todos os tratamentos.
16.1 Análise VITA PCR de GAT1, GAT2 e NED
[00279] As partezimas foram projetadas para se agruparem em duas MNAzimas ativas quando se ligavam a amplicons gerados pela amplificação do gene omp1 ou dos transcritos omp1. Estas duas MNAzimas foram capazes de se ligar a dois amplicons diferentes derivados da amplificação de duas regiões separadas de omp1 (uma região GAT1 e GAT2). Uma vez montadas, ambas as MNAzimas poderiam clivar o mesmo substrato repórter Sub102 (20) -FB. Um terceiro par de partezimas foi projetado para se reunir em uma MNAzimas ativa quando ligado a amplicons gerados pela amplificação de uma região de DNA não transcrita, denominada infA_IGR, fornecendo assim uma medida de NED. Uma vez montado, esse MNAzima poderia clivar o substrato repórter Sub72-A1B. As sequências da Partezima A e Partezima B para cada MNAzima estão listadas abaixo, de 5’ a 3'. Bases em negrito hibridam com o alvo, bases sublinhadas fazem parte do núcleo catalítico na
MNAzima montada e bases em itálico se referem à sequência que hibrida com o substrato.
SEQ ID NO: 6 Partezima A para GAT1 omp1_A4/102-P TGGTCTCGAGCATTGAACGAACAACGAGGGACGTCGA/3Phos/ SEQ ID NO: 7 Partezima B para GAT1 omp1_B5/102-P CGGTAGAGGAGGCTAGCTCATGTTCTCGATTAAGGCTG/3Phos/ SEQ ID NO: 20 Partezima A para GAT2 CTomp1L_A4/102-P CTTGCACCACTTGGTGTGACGACAACGAGGGACGTCGA/3phos/ SEQ ID NO: 21 Partezima B para GAT2 CTomp1L_B5/102-P CGGTAGAGGAGGCTAGCTCTATCAGCATGCGTGTGGGTTA/3phos/ SEQ ID NO: 8 Partezima A para NED CTinfAIGR_A4/72-P TCGACTAAACAGAAAATGTCAAAACAACGAGAGGCGTGAT/3Phos/ SEQ ID NO: 9 Partezima B para NED CTinfAIGR_B5/72-P CTGGGAGGAGAGGCTAGCTCAACTTGTCAAAAAACAGAAGG/3Phos/
16.2 Substratos repórteres
[00280] No exemplo atual, foram utilizados dois substratos repórter diferentes, cada um marcado com fluoróforos distintos. O sub102 (20) -FB foi rotulado no final da extremidade 5 com 6-FAM e com IABkFQ na extremidade 3, e sua clivagem foi monitorada a 516 nm com excitação a 492 nm. Sub72-A1B foi marcado com ATTO ™ Rho101 na extremidade 5’ e com IAbRQSp na extremidade 3', e sua clivagem foi monitorada a 609nm com excitação a 592 nm. Os substratos repórteres para este exemplo são mostrados abaixo com a sequência 5’ a 3'. As bases em minúsculas representam RNA e as bases em minúsculas representam DNA.
SEQ ID NO: 10 para GAT1 e GAT2 Sub102 (20) -FB TCGACGTCCCguCCTCTACCG SEQ ID NO: 11 para NED Sub72-A1B ATCACGCCTCguCTCCTCCCAG
16.3 Iniciadores de PCR para amplificação de GAT1, GAT2 e
NED
[00281] A amplificação in vitro do modelo de TNA extraído de células infectadas com Chlamydia trachomatis foi realizada usando os iniciadores listados abaixo. Os iniciadores Para Frente e Reverse foram utilizados para amplificar duas regiões do gene omp1 e transcritos (GAT1 e GAT2) e o DNA infA_IGR (NED) por RT-PCR. Todas as sequências são gravadas de 5’ a 3'.
SEQ ID NO: 4 Iniciador direto para GAT1 5omp1
CTTCTTCCTGGGACGAACG SEQ ID NO: 24 Iniciador reverso para GAT1 3omp1_2Lhp3
GAGCTATAATTAGCTCTCTTTGTGCTC SEQ ID NO: 16 Iniciador direto para GAT2 5CTomp1_1
TTTCGGCGGAGATCCTTGCGATCC SEQ ID NO: 25 Iniciador reverso para GAT2 3CTomp1_6
GATATCCACTGGTGGCTCCTAA SEQ ID NO: 12 Iniciador direto para NED 5CTInfAIGR_2
GAGAGAGTGATTATATCGACTAA SEQ ID NO: 23 Iniciador reverso para NED 3CTinfAIGR_3
GCAAAAACTCAAGAGAGAATGTC
16.4 Preparação do TNA
[00282] RNA e DNA (TNA) foram co-extraídos de Chlamydia trachomatis (sorovar D) que foram obtidos por métodos in vitro, cultivados em células HEp-2, conforme descrito no exemplo 1 (1.1 Cultura, 1.1.1 Protocolo de tratamento A). A extração foi realizada como uma técnica LLE, usando fenol: clorofórmio: isoamil, também descrito no exemplo 1 (extração com 1,3 ácido nucleico total (TNA)).
16.5 Componentes da reação
[00283] Todas as reações continham 40 nM de cada iniciador Para Frente, 200 nM de cada iniciador reverso, 200 nM de cada partezima A, 200 nM de cada partezima B, 400 nm de substrato SEQ ID NO 10, 200 nM de substrato SEQ ID NO 11, 1x Sonda SensiFAST Mistura No-ROX em uma etapa (Bioline), MgCl2 2 mM (Bioline), 0,2 U/µL de inibidor de RNase RiboSafe (Bioline), 0,2 µL de enzima da transcriptase reversa (Bioline) e água livre de nuclease (Ambion), em um volume total de 20 µL. Todas as reações foram realizadas em triplicado em um termociclador BioRad® CFX96. Os parâmetros de ciclagem foram 48 ° C por 10 minutos, 95 ° C por 2 minutos, 10 ciclos de 95 ° C por 5 segundos e 61 ° C por 30 segundos (com uma diminuição de 0,5 ° C na temperatura por ciclo) e 30 ciclos de 95 ° C por 5 segundos e 52 ° C por 50 segundos. As reações continham 5 µL de gabarito de TNA (diluição de 1/1000) ou nenhum alvo (dH2O).
16.6 Resultados
[00284] O DNA e o RNA da clamídia de 2 regiões dentro do gene e transcritos omp (GAT1 e GAT2) e uma região NED foram co- amplificados em RT-PCR único a partir de TNA extraído de células não tratadas viáveis e de células incubadas com antibiótico nas concentrações abaixo ( <MIC), igual a (MIC) ou acima de MIC (> MIC). A Tabela 15 mostra os valores do ciclo de limiar (Ct) medidos para NED e para os sinais combinados de GAT1 e GAT2 (GAT1/2), em cada amostra. O ΔCt foi calculado como as diferenças entre os valores de Ct do NED e GAT1/2. Por sua vez, a mudança de dobra (razão de GAT para NED) que teoricamente levaria a esses valores de ΔCt foi estimada em 2ΔCt e mostrada na Tabela 15. Os índices VITA foram calculados dividindo o FC pelo TR. Os resultados foram então comparados com a viabilidade em cada população celular.
[00285] Os pares de iniciadores utilizados neste exemplo geraram amplificadores mais longos do que os observados nos exemplos anteriores. Os comprimentos dos amplificadores foram de 215 pb e 311 pb para GAT1 e GAT2, respectivamente. Pode-se esperar que o uso de amplicons mais longos forneça uma estimativa mais precisa e rigorosa da viabilidade do organismo em questão, porque esses conjuntos de iniciadores amplificarão menos fragmentos residuais curtos associados a células mortas ou células onde a expressão é diminuída pela presença de um antibiótico. Espera-se, portanto, que o uso de amplicons mais longos ou mais curtos para o GAT altere os valores absolutos obtidos para os índices VITA para cada uma das amostras testadas (não tratadas ou tratadas com doses diferentes de antibiótico), mas não se espera que altere a correlação entre células viabilidade medida por coloração imunofluorescente (Figura 3, painéis i e ii) ou as informações que podem ser inferidas pelo exame dos índices VITA (Tabela 15, Figura 12) Tabela 15: Resultados da análise triplex de RT-PCR de TNA de amostras tratadas e não tratadas, amplificadas usando pares de iniciadores, criando comprimentos de amplicons longos para GAT1 e GAT2 Limiar (Ct) TR Índice Amostra GAT1/2 NED ∆Ct FC 2xGAT/1xNED VITA Sem 19,20 20,65 1,45 2,73 2 1,37 Antibiotico < MIC 21,06 22,67 1,61 3,05 2 1,53 MIC 30,54 30,82 0,28 1,21 2 0,61 - > MIC 29,21 29,21 0,80 2 0,40 0,33 Sem Sem TNA Sem Ct Ct
[00286] A análise dos resultados mostra que quando as amostras de TNA extraídas de amostras não tratadas ou tratadas abaixo da CIM foram amplificadas, o valor de Ct para GAT1/2 foi menor que o NED (Tabela 15), consistente com a transcrição ativa nos dois tipos de amostra. Para GAT1/2 e NED de TNA tratados no nível MIC ou acima, as diferenças no valor de Ct foram muito baixas (<1) (Tabela 15) indicando que o DNA não está sendo transcrito ativamente. A mudança de dobra e os índices VITA foram calculados para os quatro tipos de amostra (Tabela 15). Como dois genes e seus transcritos foram usados para calcular o GAT1/2, e apenas uma única região não transcrita foi usada para calcular o NED, a alteração da dobra é dividida pelo TR para calcular os índices VITA (Tabela 15). Os dados demonstram que os amplicons longos do GAT são traduzidos em índices VITA mais baixos (Figura 12) comparativamente aos amplicons mais curtos usados para detecção, como visto no exemplo 5 (Figura 5 painel ii). Isso indica que menos fragmentos de transcrição parcialmente degradados estão sendo detectados pelos iniciadores do GAT que geram amplicons mais longos.
[00287] Os resultados deste exemplo demonstram que o GAT e o NED podem ser medidos em uma única reação e os resultados usados para calcular os índices de VITA que se correlacionam com a viabilidade observada das células. Além disso, exibe diferenças nos índices VITA entre amostras viáveis e não viáveis, sendo os índices VITA inferiores aos observados com amplicons curtos para GAT1 e GAT2. Apesar dos diferentes parâmetros usados neste exemplo, a distinção final entre células viáveis e não viáveis é chamada com precisão, com tendências semelhantes observadas para todas as amostras comparativamente aos índices VITA com amplicons mais curtos para GAT1 e GAT2.
Exemplo 17 - Teste exemplar de cura e sensibilidade a antibióticos para Neisseria gonorrhoeae usando VITA PCR
[00288] O exemplo a seguir descreve um ensaio direcionado ao GAT e NED usado para diagnóstico, TOC e AST para Neisseria gonorrhoeae (GC). O ensaio estimaria a alteração do GAT em relação ao NED nas amostras de TNA. Para medir o GAT, o DNA e o RNA das gonorreias seriam amplificados por RT-PCR usando iniciadores direcionados para locais de um gene e seus transcritos ou múltiplos genes e seus transcritos. Para medir o NED, outra região do DNA das gonorreias seria co-amplificada na mesma reação de RT-PCR usando pares de iniciadores visando uma região do DNA genômico que não é transcrita. As metas potenciais de GAT e NED podem ser rastreadas como no exemplo 3. Os níveis de GAT e NED seriam estimados e usados para calcular os índices
VITA. Os índices de VITA gerados permitiriam a determinação da viabilidade do organismo em qualquer amostra (por exemplo, urina, zaragatoa vaginal, zaragatoa retal ou zaragatoa). Além disso, a amostra também pode ser usada para testes de suscetibilidade a antibióticos, dividindo a amostra e incubando- a na presença e na ausência de um fármaco desejado ou de vários fármacos. Os níveis de GAT e NED seriam estimados e usados para calcular os índices VITA para cada condição. Além disso, os índices VITA de amostras tratadas e não tratadas seriam usados para calcular o TAVITA, determinando finalmente o perfil de suscetibilidade ou resistência do organismo. Isso ajudaria na orientação da terapia, com a melhor escolha de antibiótico na primeira apresentação dos sintomas.
[00289] Os genes alvo potenciais e as respectivas sequências de MNAzimas, substratos repórteres e pares de iniciadores utilizados para sua amplificação estão listados nas seções a seguir (17.1, 17.2 e 17.3). Os substratos repórteres são diferentes daqueles testados para os ensaios GAT e NED visando Chlamydia trachomatis, permitindo o potencial de multiplexar todos os alvos juntos, conforme incorporado no exemplo 14, Figura 10. Outros organismos-alvo também podem ser incluídos (exemplo 14, Figura 10). Isso permitiria a identificação, confirmação do status de infecção e teste de suscetibilidade a antibióticos, em uma única reação para ambos os organismos.
17.1 Alvos candidatos para análise de GAT1, GAT2 e NED para
VITA PCR
[00290] Partezimas foram projetadas para se agruparem em dois MNAzimas ativos quando se ligam a amplicons gerados pela amplificação de genes diferentes, o gene ou transcritos ompA ou cysK. Essas duas MNAzimas são projetadas para se ligar a dois amplicons diferentes derivados da amplificação dos dois genes separados, representando GAT1 e GAT2, respectivamente. Uma vez montadas, ambas as MNAzimas poderiam clivar o mesmo substrato repórter Sub97 (20) -JB. Um terceiro par de partezimas foi projetado para se reunir em um MNAzima ativo quando ligado a amplicons gerados pela amplificação de uma região de DNA não transcrita, denominada IGR1109, que é candidata à medição de NED. Uma vez montada, esta MNAzima seria capaz de clivar o substrato repórter Sub84 (20) -CB. As sequências da parte enzima A e da parte B para cada MNAzima estão listadas abaixo, de 5’ a 3'. Bases em negrito hibridam com o alvo, bases sublinhadas fazem parte do núcleo catalítico na MNAzima montada e bases em itálico se referem à sequência que hibrida com o substrato.
SEQ ID NO: 26 Partezima A para GAT1 NGompA_3A4/97-P GGTTGCCTACTATCTGCAGAACAACGAGAGGACTAGG/3Phos/ SEQ ID NO: 27 Partezima B para GAT1 NGompA_3B5/97-P GACGTGAGGAGGCTAGCTCGCGCGGCGTGGCGGCT/3Phos/ SEQ ID NO: 28 Partezima A para GAT2 NGcysK_3A4/97-P ACGACAGCATTGCCAAAGTGACAACGAGAGGACTAGG/3Phos/ SEQ ID NO: 29 Partezima B para GAT2 NGcysK_3B5/97-P GACGTGAGGAGGCTAGCTCCGAACGAAGCGGCTTTTG/3Phos/ SEQ ID NO: 30 Partezima A para NED NG1109IGR_A4/84-P TGCTTTTGCTGTGAAAAAGGGACAACGAGAGGGTCGAG/3Phos/ SEQ GGACGAGGGAGGCTAGCTCTGAAATTGCCAACAATCCTG/3Phos/
ID NO: 31 Partezima B para NED NG1109IGR_B5/84-P
17.2 Substratos repórteres
[00291] No exemplo atual, dois substratos repórter diferentes, marcados com fluoróforos distintos, seriam úteis na detecção em sistemas que incorporam as partenzimas/MNAzima listadas acima. Esses substratos são marcados na extremidade Sub97 (20) -JB na extremidade 5’ com 5-JOEN e IABkFQ na extremidade 3', cuja clivagem pode ser monitorada a 555 nm com excitação a 529 nm e Sub84 (20) - CB marcado com 5Cy5 na extremidade 5’ e com IAbRQSp na extremidade 3', cuja clivagem poderia ser monitorada a 668 nm com excitação a 648 nm. Esses substratos repórter são mostrados abaixo com a sequência 5’ a 3', onde as bases em minúsculas representam o RNA e as bases em maiúsculas representam o DNA.
SEQ ID NO: 32 para GAT1 e GAT2 Sub97 (20) -JB CCTAGTCCTCguCCTCACGTC SEQ ID NO: 33 para NED Sub84 (20) -CB CTCGACCCTCguCCCTCGTCC
17.3 Iniciadores de PCR para amplificação de GAT1, GAT2 e
NED
[00292] A amplificação de TNA pode ser realizada usando os iniciadores listados abaixo. Os iniciadores Para Frente e Reverse são projetados para amplificar dois genes e transcritos separados, ompA e cysK (GAT1 e GAT2), bem como o DNA IGR1109 (NED) por RT-PCR. Todas as sequências são gravadas de 5’ a 3'.
SEQ ID NO: 34 Iniciador direto para GAT1 5NGompA_1
CGGCACGCAAATCGAAATCC
SEQ ID NO: 35 Iniciador reverso para GAT1 3NGompA_L1
TGCGCGCGGCCTTCAACC SEQ ID NO: 36 Iniciador direto para GAT2 5NGcysK_3W3g
CTTGGTGGACGCTCATGCA SEQ ID NO: 37 Iniciador reverso para GAT2 3NGcysK_2W3a
GCCTTCTTTTTCCGCCATTACA SEQ ID NO: 38 Iniciador para frente para NED 5NG1109IGR_1
GTTTTCACGCCTGCTTTTGC SEQ ID NO: 39 Iniciador reverso para NED 3NG1109IGR_1
GACGCTCAAAACGCGGACGA
[00293] Os iniciadores para GAT para genes candidatos adicionais, incluindo porB e rpmB, podem ser rastreados usando o método descrito no exemplo 3.
Exemplo 18 - Influência da eficiência, sensibilidade, inclusividade e especificidade da amplificação nos índices VITA
[00294] O exemplo a seguir discute parâmetros que podem influenciar ainda mais os valores absolutos observados para os índices VITA obtidos para um ensaio multiplexado específico. As eficiências de amplificação dos ensaios GAT e NED incluídos na análise VITA PCR devem idealmente ser altas e iguais para GAT e NED. As eficiências de amplificação de GAT1, GAT2 e NED direcionadas a Chlamydia trachomatis, usadas em vários exemplos, incluindo o Exemplo 5, foram estimadas usando sequências alvo sintéticas diluídas em série e consideradas semelhantes entre si, com eficiência próxima a 100%, com R2 > 0,998 (dados não mostrados). Quando todos os componentes da reação são eficientes e comparáveis entre si, os índices VITA obtidos demonstraram permitir uma diferenciação precisa entre células viáveis e não viáveis, como evidenciado no exemplo 5 (figura 5 painel ii).
[00295] Outro fator importante é o comprimento dos amplicons gerados por amplificação com os iniciadores GAT e NED. Como mostrado anteriormente (exemplo 16), os sistemas VITA PCR que geram amplicons mais longos podem ter valores mais baixos observados para os índices VITA, em comparação com os sistemas que geram amplicons mais curtos. No entanto, embora os valores absolutos dos índices VITA possam mudar, a correlação entre os valores observados e a viabilidade é mantida.
[00296] Os fatores que afetam o poder do VITA PCR de fornecer uma ferramenta versátil para pesquisas básicas e investigações clínicas incluem a sensibilidade, a inclusão e a especificidade. A sensibilidade afeta a capacidade de detectar o alvo, especificamente no limite inferior de detecção, como <10 cópias. A inclusão se relacionaria à capacidade de detectar todas as cepas e sorovares, dentro da mesma espécie de organismo, com a mesma eficiência. A especificidade estaria relacionada à detecção do alvo, sendo específica apenas ao organismo de interesse. A detecção de “fora do alvo”, mas espécies relacionadas, pode causar aumento dos índices de VITA, não refletindo a viabilidade da célula, organismo ou vírus de interesse.
[00297] Também foi discutido que o alvo usado para o GAT e o NED deve ser escolhido com cuidado. O exemplo 3 mostra um método para determinar se uma sequência específica atende aos critérios, isto é, o GAT deve ter como alvo a região de DNA que é expressa, enquanto os iniciadores NED devem ter como alvo uma região que não é expressa. Os exemplos neste documento mostraram que é possível usar mais de um GAT em um VITA PCR específico. Isso é de fato altamente desejável, uma vez que genes específicos só podem ser expressos durante certos estágios do ciclo de desenvolvimento de, por exemplo, bactérias. Um ensaio contendo múltiplos genes expressos, preferencialmente em altos níveis sob diferentes condições, pode garantir que a expressão seja consistentemente detectável em várias condições.
[00298] Finalmente, prevê-se que a escolha dos alvos do GAT seja dependente do organismo e do antibiótico sob investigação. Por exemplo, estudos de outros grupos mostraram que os transcritos de Neisseria gonorrhoeae porB e rpmB são altamente expressos e alteram os níveis de expressão em resposta ao antibiótico ciprofloxacino. O gene Chlamydia trachomatis omp1 e seus transcritos demonstraram (exemplo 9) serem adequados para discriminar resistência ou suscetibilidade à rifampicina e capazes de refletir a viabilidade do organismo.

Claims (47)

REIVINDICAÇÕES
1. Método para normalizar dados quantitativos obtidos por amplificação de ácidos nucleicos de uma célula, organismo ou vírus, o método caracterizado pelo fato de que compreende: i) obter dados quantitativos - a partir da amplificação do DNA genômico de um primeiro gene e RNA transcrito a partir do primeiro gene, e - a partir da amplificação de uma sequência de DNA não transcrita na célula, organismo ou vírus; e (ii) usar os dados quantitativos para derivar um valor normalizado (nV) representativo das quantidades relativas de: - os referidos transcritos genômicos de DNA e RNA do primeiro gene, para - o referido DNA genômico que não é transcrito, presente na amostra de ácido nucleico antes da referida amplificação; em que o referido DNA genômico do primeiro gene e RNA transcrito a partir do primeiro gene e a referida sequência de DNA não transcrito são co-amplificados na mesma reação.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os dados quantitativos são o número de cópias do amplicon e o método compreende: - obter um valor A (vA) representando o número total de amplicons gerado a partir da amplificação dos referidos transcritos de DNA e RNA genômico do primeiro gene, e um valor B (vB) representando o número total de amplicons gerado a partir da sequência de DNA não transcrito; - calcular um valor normalizado (nV) usando a equação: vA/vB = nV ou uma forma equivalente do mesmo.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os dados quantitativos são o número de cópias do amplicon e o método compreende: - obter um valor X (vX) que representa o número total de amplicons gerado a partir de: amplificação de transcritos de DNA e RNA genômicos a partir do primeiro gene e amplificação de transcritos de DNA e RNA genômicos de pelo menos um gene adicional; - obter um valor B (vB) que representa o número total de amplicons gerado a partir da sequência de DNA não transcrito, - calcular um valor normalizado (nV) usando a equação: vX/(vB x (X + 1)) = nV ou uma forma equivalente do mesmo, em que X é o número do(s) referido(s) gene(s) adicional(ais).
4. Método, de acordo com a reivindicação 2 ou a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a amplificação é reação em cadeia da polimerase digital (dPCR).
5. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os dados quantitativos são o valor limite (Ct), e o método compreende:
- obter um valor limiar de ciclo CtA a partir da amplificação dos referidos transcritos genômicos de DNA e RNA do primeiro gene, - obter um valor limiar de ciclo CtB a partir da amplificação da sequência de DNA não transcrito; e - calcular um valor normalizado (nV) usando a equação: 2CtB - CtA = nV ou uma forma equivalente da mesma.
6. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os dados quantitativos são o valor limite (Ct), e o método compreende: - obter um valor limiar de ciclo CtX a partir da amplificação dos referidos transcritos genômicos de DNA e RNA do primeiro gene e da amplificação dos transcritos genômicos de DNA e RNA de pelo menos um gene adicional; - obter um valor limiar de ciclo CtB a partir da amplificação da sequência de DNA não transcrito; e - calcular um valor normalizado (nV) usando a equação: 2CtB - CtX/(X + 1) = nV ou uma forma equivalente da mesma, em que X é o número do(s) referido(s) gene(s) adicional(ais).
7. Método, de acordo com a reivindicação 5 ou a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a amplificação é reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR).
8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a sequência de DNA não transcrito é DNA genômico.
9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 8, caracterizado pelo fato de que ainda compreende a realização da referida amplificação dos ácidos nucleicos a partir da célula, organismo ou vírus.
10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 9, caracterizado pelo fato de que os ácidos nucleicos da célula, organismo ou vírus são um extrato dos ácidos nucleicos totais.
11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 10, caracterizado pelo fato de que qualquer referida amplificação é conduzida usando: reação em cadeia da polimerase (PCR), reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa (RT-PCR), amplificação de deslocamento de cadeia (SDA), amplificação isotérmica mediada por alça (LAMP), amplificação de círculo rolante (RCA), amplificação de polimerase recombinase (RPA), amplificação dependente de helicase (HDA), amplificação baseada em invasão de cadeia (SIBA), amplificação mediada por transcrição (TMA), replicação de sequência auto-sustentada (3SR), amplificação baseada em sequência de ácido nucleico (NASBA), ou qualquer combinação dos mesmos.
12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 11, caracterizado pelo fato de que ainda compreende o uso do valor normalizado (nV) para avaliar o nível de atividade transcricional na célula, organismo ou vírus.
13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 12, caracterizado pelo fato de que ainda compreende: - obter um valor normalizado negativo da transcrição (nV-) gerado usando uma série dos referidos valores normalizados (nV) obtidos a partir de indivíduos de uma população de células, organismos ou vírus que não possuem atividade transcricional; e - comparar o valor normalizado (nV) obtido pela referida amplificação de ácidos nucléicos da célula, organismo ou vírus ao valor normalizado negativo para transcrição (nV-), para assim avaliar o nível de atividade transcricional na célula, organismo ou vírus.
14. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o valor normalizado negativo para transcrição (nV-) é um valor médio gerado a partir da referida série dos referidos valores normalizados (nV).
15. Método, de acordo com a reivindicação 13 ou a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que: - o valor normalizado da transcrição negativa (nV-) é utilizado como valor base para avaliar a presença ou a ausência de atividade transcricional na célula, organismo ou vírus; e - uma ausência de atividade transcricional é indicada quando o valor normalizado (nV) obtido pela referida amplificação de ácidos nucleicos da célula, organismo ou vírus é igual ou inferior ao valor normalizado negativo para a transcrição (nV- ); ou - a atividade transcricional é indicada quando o valor normalizado (nV) obtido pela referida amplificação de ácidos nucleicos da célula, organismo ou vírus está acima do valor normalizado negativo para a transcrição (nV-).
16. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 13 a 15, caracterizado pelo fato de que o referido valor normalizado negativo para transcrição (nV-): - incorpora variação estatística na referida série de valores normalizados (nV) a partir de indivíduos da população de células, organismos ou vírus que sabidamente não possuem atividade transcricional; e/ou - é fornecido com um intervalo de confiança de que o referido valor normalizado negativo da transcrição (nV-) é preditivo de uma presença ou ausência de atividade transcricional na célula, organismo ou vírus.
17. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o intervalo de confiança é superior a 90% ou superior a 95%.
18. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 13 a 17, caracterizado pelo fato de que ainda compreende: - obter um valor normalizado positivo da transcrição (nV+) gerado usando uma série dos referidos valores normalizados (nV) obtidos a partir de indivíduos de uma população de células, organismos ou vírus que possuem atividade transcricional; e - comparar o valor normalizado (nV) obtido pela referida amplificação de ácidos nucleicos da célula, organismo ou vírus com o valor normalizado positivo para transcrição (nV+), para assim avaliar o nível de atividade transcricional na célula, organismo ou vírus.
19. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o valor normalizado positivo da transcrição (nV+) é um valor médio gerado a partir da referida série dos referidos valores normalizados (nV).
20. Método, de acordo com a reivindicação 18 ou reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que: - o valor normalizado positivo da transcrição (nV+) é utilizado como valor base para a atividade transcricional na célula, organismo ou vírus; e - uma falta ou ausência de atividade transcricional é indicada quando o valor normalizado (nV) obtido pela referida amplificação de ácidos nucleicos da célula, organismo ou vírus está abaixo do valor normalizado positivo para transcrição (nV+); ou - a atividade transcricional é indicada quando o valor normalizado (nV) obtido pela referida amplificação de ácidos nucleicos da célula, organismo ou vírus é igual ou superior ao valor normalizado positivo para transcrição (nV+).
21. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 18 a 20, caracterizado pelo fato de que o referido valor normalizado positivo para transcrição (nV+): - incorpora variação estatística nas referidas séries de valores normalizados (nV) a partir de indivíduos da população de células, organismos ou vírus que possuem atividade transcricional; e/ou - é fornecido com um intervalo de confiança de que o referido valor normalizado positivo para transcrição (nV+) é preditivo de uma presença ou ausência de atividade transcricional na célula, organismo ou vírus.
22. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o intervalo de confiança é superior a 90% ou superior a 95%.
23. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que ainda compreende: - obter um valor normalizado negativo da transcrição (nV-) gerado usando uma série dos referidos valores normalizados (nV) obtidos de indivíduos de uma população de células, organismos ou vírus que não possuem atividade transcricional; - obter um valor normalizado positivo da transcrição (nV+) gerado usando uma série dos referidos valores normalizados (nV) obtidos de indivíduos de uma população de células, organismos ou vírus que possuem atividade transcricional; e - comparar o valor normalizado (nV) obtido pela referida amplificação de ácidos nucleicos da célula, organismo ou vírus a: (i) o valor normalizado negativo para a transcrição (nV-) e o valor normalizado positivo da transcrição (nV+), ou (ii) a um valor normalizado da transcrição combinada (nV+) intermediário ao valor normalizado negativo da transcrição (nV- ) e ao valor normalizado positivo da transcrição (nV+), para dessa forma avaliar o nível de atividade transcricional na célula, organismo ou vírus.
24. Método, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que o valor normalizado da transcrição combinada (nV±) é calculado usando a equação: (nV+) + (nV-)/2 = (nV±) ou uma forma equivalente da mesma.
25. Método, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que o referido valor normalizado da transcrição combinada (nV±): - incorpora variação estatística nas referidas séries de valor normalizado negativo para transcrição (nV-) e/ou valor normalizado positivo para transcrição negativa (nV+); e/ou - é fornecido com um intervalo de confiança de que o referido valor normalizado da transcrição combinada (nV±) é preditivo de uma presença ou ausência de atividade transcricional na célula, organismo ou vírus.
26. Método, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que o intervalo de confiança é superior a 90% ou superior a 95%.
27. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 12 a 26, caracterizado pelo fato de que o nível de atividade transcricional na célula, organismo ou vírus é avaliado com a finalidade de determinar qualquer um ou mais dentre: - viabilidade da célula de teste ou do organismo de teste; - se a célula, organismo ou vírus do teste está vivo ou morto; - perturbação transcricional dentro da célula, organismo ou vírus de teste.
28. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 11, caracterizado pelo fato de que ainda compreende o uso do valor normalizado (nV) para avaliar o nível de resistência ao fármaco ou sensibilidade ao fármaco na célula, organismo ou vírus, em que: - a referida célula, organismo ou vírus foi tratada com um fármaco antes da referida amplificação de ácidos nucleicos, e - o referido valor normalizado (nV) é comparado com um valor normalizado de controle (cnV) gerado usando uma série dos referidos valores normalizados (nV) obtidos a partir de indivíduos de uma população de células, organismos ou vírus que se sabe ser: (i) resistente ao fármaco; ou (ii) sensível ao fármaco, para, desse modo, avaliar o nível de resistência ou sensibilidade ao fármaco na célula, organismo ou vírus.
29. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 11 ou 28, caracterizado pelo fato de que ainda compreende: - obter um valor normalizado sensível ao fármaco (dsV) gerado usando uma série dos referidos valores normalizados (nV) obtidos a partir de indivíduos de uma população de células, organismos ou vírus conhecidos por serem sensíveis ao fármaco; e - comparar o valor normalizado (nV) obtido pela referida amplificação de ácidos nucleicos da célula, organismo ou vírus com o valor normalizado sensível ao fármaco (dsV), para assim avaliar o nível de resistência ao fármaco ou sensibilidade ao fármaco ou na célula, organismo, ou vírus, em que a célula,
organismo ou vírus tenha sido tratado com um fármaco antes da referida amplificação de ácidos nucleicos.
30. Método, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que o valor normalizado sensível ao fármaco (dsV) é um valor médio gerado a partir da referida série dos referidos valores normalizados (nV).
31. Método, de acordo com a reivindicação 29 ou a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que: - o valor normalizado sensível ao fármaco (dsV) é utilizado como valor base para avaliar a presença ou ausência de resistência ou sensibilidade ao fármaco na célula, organismo ou vírus; e - a resistência ao fármaco é indicada quando o valor normalizado (nV) obtido pela referida amplificação de ácidos nucleicos da célula, organismo ou vírus está acima do valor normalizado sensível ao fármaco (dsV); ou - a sensibilidade ao fármaco é indicada quando o valor normalizado (nV) obtido pela referida amplificação de ácidos nucleicos da célula, organismo ou vírus é igual ou inferior ao valor normalizado sensível ao fármaco (dsV).
32. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 29 a 31, caracterizado pelo fato de que o referido valor normalizado sensível à fármaco (dsV): - incorpora variação estatística na referida série de valores normalizados (nV) a partir de indivíduos da população de células, organismos ou vírus conhecidos por serem sensíveis ao fármaco; e/ou
- é fornecido com um intervalo de confiança de que o referido valor normalizado sensível ao fármaco (dsV) é preditivo de uma presença ou ausência de: (i) resistência ao fármaco na célula, organismo ou vírus; ou (ii) sensibilidade ao fármaco na célula, organismo ou vírus.
33. Método, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que o intervalo de confiança é superior a 90% ou superior a 95%.
34. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 11 ou 28, caracterizado pelo fato de que ainda compreende: - obter um valor normalizado resistente ao fármaco (drV) gerado usando uma série dos referidos valores normalizados (nV) obtidos a partir de indivíduos de uma população de células, organismos ou vírus conhecidos por serem resistentes ao fármaco; e - comparar o valor normalizado (nV) obtido pela referida amplificação de ácidos nucléicos da célula, organismo ou vírus ao valor normalizado resistente ao fármaco (drV), para assim avaliar o nível de resistência ao fármaco ou sensibilidade ao fármaco ou na célula, organismo, ou vírus, em que a célula, organismo ou vírus foi tratado com um fármaco antes da referida amplificação de ácidos nucleicos.
35. Método, de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que o valor normalizado resistente ao fármaco (drV) é um valor médio gerado a partir da referida série dos referidos valores normalizados (nV).
36. Método, de acordo com a reivindicação 34 ou a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que:
- o valor normalizado resistente ao fármaco (drV) é utilizado como valor base para avaliar a presença ou ausência de resistência ou sensibilidade ao fármaco na célula, organismo ou vírus; e - a resistência ao fármaco é indicada quando o valor normalizado (nV) obtido pela referida amplificação de ácidos nucleicos da célula, organismo ou vírus é igual ou superior ao valor normalizado resistente ao fármaco (drV); ou - a sensibilidade ao fármaco é indicada quando o valor normalizado (nV) obtido pela referida amplificação de ácidos nucleicos da célula, organismo ou vírus está abaixo do valor normalizado resistente ao fármaco (drV).
37. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 34 a 36, caracterizado pelo fato de que o referido valor normalizado resistente a fármacos (drV): - incorpora variação estatística na referida série de valores normalizados (nV) de indivíduos da população de células, organismos ou vírus conhecidos por serem resistentes ao fármaco; e/ou - é fornecido com um intervalo de confiança de que o referido valor normalizado resistente a fármacos (drV) é preditivo de uma presença ou ausência de: (i) resistência ao fármaco na célula, organismo ou vírus; ou (ii) sensibilidade ao fármaco na célula, organismo ou vírus.
38. Método, de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que o intervalo de confiança é superior a 90% ou superior a 95%.
39. Método, de acordo com uma das reivindicações de 1 a 11, caracterizado pelo fato de que ainda compreende o uso do valor normalizado (nV) para avaliar o nível de resistência ao fármaco ou sensibilidade ao fármaco na célula, organismo ou vírus, em que: - uma primeira população da referida célula, organismo ou vírus que foi tratada com um fármaco antes da referida amplificação de ácidos nucleicos, é usada para gerar um primeiro referido valor normalizado (nV), - uma segunda população da referida célula, organismo ou vírus que não foi tratada com um fármaco antes da referida amplificação de ácidos nucleicos, é usada para gerar um segundo referido valor normalizado (nV), - o referido primeiro valor normalizado (nV) e o referido segundo valor normalizado (nV) são comparados para avaliar o nível de atividade transcricional na célula, organismo ou vírus com ou sem tratamento com fármacos e, assim, avaliar o nível de resistência ao fármaco ou sensibilidade ao fármaco na célula, organismo ou vírus.
40. Método, de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que a referida sensibilidade ao fármaco é indicada quando o referido primeiro valor normalizado (nV) é inferior ao referido segundo valor normalizado (nV).
41. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 28 a 40, caracterizado pelo fato de que o fármaco é um antimicrobiano.
42. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 28 a 41, caracterizado pelo fato de que o fármaco é um antimicrobiano de uma classe selecionada dentre: Aminoglicosídeos, ansamicinas, carbacefema, carbapenêmicos, cefalosporinas, glicopeptídeos, macrolidespenicilinas, monobactams, polipeptídeos, quinolonas, sulfonamidas, tetraciclinas.
43. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 28 a 42, caracterizado pelo fato de que o fármaco é Ciprofloxacina, Azitromicina, Rifampicina ou Doxiciclina.
44. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 28 a 43, caracterizado pelo fato de que o primeiro gene é um gene de uma espécie de Chlamydia (por exemplo, Chlamydia trachomatis), uma espécie de Gonorrhea ou uma espécie de micoplasma (por exemplo, Mycoplasma genitralium).
45. Método, de acordo com a reivindicação 44, caracterizado pelo fato de que a referida reação compreende o uso de transcriptase reversa.
46. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 45, caracterizado pelo fato de que a célula é uma célula de mamífero, uma célula humana, uma célula animal, uma célula vegetal, uma célula bacteriana, uma célula hospedeira infectada por vírus ou uma célula hospedeira infectada por bactérias.
47. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 46, caracterizado pelo fato de que o organismo é um mamífero, um humano, uma planta, uma bactéria, um vírus, um fungo, uma alga, um archaeon ou um protozoário.
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Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6258543B1 (en) * 1996-05-02 2001-07-10 Xtrana, Inc. Quantitation of RNA transcripts using genomic DNA as the internal amplification competitor
ATE335843T1 (de) * 1996-05-02 2006-09-15 Applera Corp Quantifizierung von rna-transkripten mittels genomischer dna als internen standard der amplifizierungsreaktion
EP1418241A1 (en) * 2002-11-08 2004-05-12 PrimaGen Holding B.V. Method for quantifying a ratio between at least two nucleic acid sequences
US8021846B2 (en) * 2008-03-12 2011-09-20 Medical Diagnostic Laboratories, Llc Method for determining azole resistance in Candida glabrata
EP2280081A1 (en) * 2009-07-31 2011-02-02 Qiagen GmbH Method of normalized quantification of RNA
WO2011109901A1 (en) * 2010-03-10 2011-09-15 The Governors Of The University Of Alberta Detection and quantification of viable bacteria in a sample using rpos mrna
US20130095489A1 (en) * 2010-05-04 2013-04-18 Centers For Disease Control And Prevention Process for detection of multidrug resistant tuberculosis using real-time pcr and high resolution melt analysis
EP2721173A1 (en) * 2011-06-14 2014-04-23 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for determining the expression level of a gene of interest including correction of rt-qpcr data for genomic dna-derived signals

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