CN111492434B - 核酸比值确定 - Google Patents
核酸比值确定 Download PDFInfo
- Publication number
- CN111492434B CN111492434B CN201880043163.4A CN201880043163A CN111492434B CN 111492434 B CN111492434 B CN 111492434B CN 201880043163 A CN201880043163 A CN 201880043163A CN 111492434 B CN111492434 B CN 111492434B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cell
- amplification
- organism
- drug
- virus
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims description 169
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims description 160
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims description 160
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 223
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims abstract description 140
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 131
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims abstract description 131
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims abstract description 126
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims abstract description 101
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims abstract description 101
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 claims abstract description 75
- 238000010606 normalization Methods 0.000 claims abstract description 54
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 claims abstract description 47
- 230000035899 viability Effects 0.000 claims abstract description 43
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 360
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 220
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 216
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 113
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 claims description 112
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims description 106
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 96
- 241000606161 Chlamydia Species 0.000 claims description 81
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 claims description 63
- 241000606153 Chlamydia trachomatis Species 0.000 claims description 63
- 229940038705 chlamydia trachomatis Drugs 0.000 claims description 63
- 229960004099 azithromycin Drugs 0.000 claims description 36
- MQTOSJVFKKJCRP-BICOPXKESA-N azithromycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](C)C(=O)O[C@@H]([C@@]([C@H](O)[C@@H](C)N(C)C[C@H](C)C[C@@](C)(O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@H](C[C@@H](C)O2)N(C)C)O)[C@H]1C)(C)O)CC)[C@H]1C[C@@](C)(OC)[C@@H](O)[C@H](C)O1 MQTOSJVFKKJCRP-BICOPXKESA-N 0.000 claims description 36
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 35
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 32
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 claims description 32
- JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N rifampicin Chemical compound O([C@](C1=O)(C)O/C=C/[C@@H]([C@H]([C@@H](OC(C)=O)[C@H](C)[C@H](O)[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)\C=C\C=C(C)/C(=O)NC=2C(O)=C3C([O-])=C4C)C)OC)C4=C1C3=C(O)C=2\C=N\N1CC[NH+](C)CC1 JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N 0.000 claims description 32
- 229960001225 rifampicin Drugs 0.000 claims description 32
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 20
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 18
- 238000007397 LAMP assay Methods 0.000 claims description 17
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 claims description 15
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 15
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 14
- -1 monocyclic beta-lactams Chemical class 0.000 claims description 13
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 12
- SGKRLCUYIXIAHR-AKNGSSGZSA-N (4s,4ar,5s,5ar,6r,12ar)-4-(dimethylamino)-1,5,10,11,12a-pentahydroxy-6-methyl-3,12-dioxo-4a,5,5a,6-tetrahydro-4h-tetracene-2-carboxamide Chemical compound C1=CC=C2[C@H](C)[C@@H]([C@H](O)[C@@H]3[C@](C(O)=C(C(N)=O)C(=O)[C@H]3N(C)C)(O)C3=O)C3=C(O)C2=C1O SGKRLCUYIXIAHR-AKNGSSGZSA-N 0.000 claims description 11
- 229960003722 doxycycline Drugs 0.000 claims description 11
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims description 10
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 claims description 8
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 claims description 8
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 claims description 8
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 claims description 8
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 claims description 8
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 claims description 8
- 238000005096 rolling process Methods 0.000 claims description 7
- 241000894007 species Species 0.000 claims description 7
- MYSWGUAQZAJSOK-UHFFFAOYSA-N ciprofloxacin Chemical compound C12=CC(N3CCNCC3)=C(F)C=C2C(=O)C(C(=O)O)=CN1C1CC1 MYSWGUAQZAJSOK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 230000005758 transcription activity Effects 0.000 claims description 6
- 241000233866 Fungi Species 0.000 claims description 5
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 claims description 5
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 claims description 5
- 241000203069 Archaea Species 0.000 claims description 4
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 claims description 4
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 claims description 4
- 206010018612 Gonorrhoea Diseases 0.000 claims description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 3
- 229960003405 ciprofloxacin Drugs 0.000 claims description 3
- 208000001786 gonorrhea Diseases 0.000 claims description 3
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 229930186147 Cephalosporin Natural products 0.000 claims description 2
- 102000002068 Glycopeptides Human genes 0.000 claims description 2
- 108010015899 Glycopeptides Proteins 0.000 claims description 2
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 claims description 2
- 229940126575 aminoglycoside Drugs 0.000 claims description 2
- JSVCEVCSANKFDY-SFYZADRCSA-N carbacephem Chemical compound C1CC(C)=C(C(O)=O)N2C(=O)[C@@H](NC(=O)C)[C@H]21 JSVCEVCSANKFDY-SFYZADRCSA-N 0.000 claims description 2
- 229940041011 carbapenems Drugs 0.000 claims description 2
- 229940124587 cephalosporin Drugs 0.000 claims description 2
- 150000001780 cephalosporins Chemical class 0.000 claims description 2
- 239000003120 macrolide antibiotic agent Substances 0.000 claims description 2
- 229940041033 macrolides Drugs 0.000 claims description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 2
- 150000007660 quinolones Chemical class 0.000 claims description 2
- 229940124530 sulfonamide Drugs 0.000 claims description 2
- 150000003456 sulfonamides Chemical class 0.000 claims description 2
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 claims description 2
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 claims description 2
- 229940040944 tetracyclines Drugs 0.000 claims description 2
- 241000204003 Mycoplasmatales Species 0.000 claims 1
- 230000004044 response Effects 0.000 abstract description 28
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 abstract description 5
- 230000034994 death Effects 0.000 abstract description 3
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 abstract description 3
- 230000029279 positive regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 abstract description 2
- 101150043058 DNA-N gene Proteins 0.000 description 252
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 155
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 122
- 101000639970 Homo sapiens Sodium- and chloride-dependent GABA transporter 1 Proteins 0.000 description 99
- 102100033927 Sodium- and chloride-dependent GABA transporter 1 Human genes 0.000 description 99
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 99
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 93
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 93
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 91
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 84
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 77
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 77
- 101150115693 ompA gene Proteins 0.000 description 61
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 60
- 101150090944 otomp gene Proteins 0.000 description 59
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 51
- 101001094079 Homo sapiens Sodium- and chloride-dependent GABA transporter 2 Proteins 0.000 description 50
- 102100035242 Sodium- and chloride-dependent GABA transporter 2 Human genes 0.000 description 50
- 230000008859 change Effects 0.000 description 48
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 46
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 31
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 29
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 29
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 25
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 24
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 22
- 101150064359 SLC6A1 gene Proteins 0.000 description 21
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 21
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 21
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 21
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 20
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 20
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 20
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 19
- 238000009635 antibiotic susceptibility testing Methods 0.000 description 17
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 17
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 101100202333 Mus musculus Slc6a12 gene Proteins 0.000 description 14
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 14
- 238000010240 RT-PCR analysis Methods 0.000 description 14
- 101100202340 Rattus norvegicus Slc6a13 gene Proteins 0.000 description 14
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 14
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 14
- 238000000622 liquid--liquid extraction Methods 0.000 description 13
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 13
- 238000000638 solvent extraction Methods 0.000 description 13
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 12
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 12
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 12
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 11
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 11
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 10
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 description 10
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 10
- 108020004418 ribosomal RNA Proteins 0.000 description 10
- 108091092724 Noncoding DNA Proteins 0.000 description 9
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 9
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 9
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 9
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 9
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 9
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 8
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 8
- 125000001972 isopentyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 6-carboxyfluorescein Chemical compound C12=CC=C(O)C=C2OC2=CC(O)=CC=C2C11OC(=O)C2=CC=C(C(=O)O)C=C21 BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 241000588652 Neisseria gonorrhoeae Species 0.000 description 7
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 7
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 7
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 7
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 7
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 6
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 6
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 6
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 description 6
- 239000003161 ribonuclease inhibitor Substances 0.000 description 6
- 241000204051 Mycoplasma genitalium Species 0.000 description 5
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 5
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 5
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 5
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 5
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 5
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 5
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 5
- 238000011870 unpaired t-test Methods 0.000 description 5
- 108020004566 Transfer RNA Proteins 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- YPHMISFOHDHNIV-FSZOTQKASA-N cycloheximide Chemical compound C1[C@@H](C)C[C@H](C)C(=O)[C@@H]1[C@H](O)CC1CC(=O)NC(=O)C1 YPHMISFOHDHNIV-FSZOTQKASA-N 0.000 description 4
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 4
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 4
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 4
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 4
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 4
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 4
- 108091029792 Alkylated DNA Proteins 0.000 description 3
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 3
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 3
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 3
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 3
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 3
- 108020003224 Small Nucleolar RNA Proteins 0.000 description 3
- 102000042773 Small Nucleolar RNA Human genes 0.000 description 3
- 108091027967 Small hairpin RNA Proteins 0.000 description 3
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 3
- 108091060271 Small temporal RNA Proteins 0.000 description 3
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 3
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 3
- 238000007876 drug discovery Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 3
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 3
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 3
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 3
- 108091027963 non-coding RNA Proteins 0.000 description 3
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 description 3
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 3
- DXHWIAMGTKXUEA-UHFFFAOYSA-O propidium monoazide Chemical compound C12=CC(N=[N+]=[N-])=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 DXHWIAMGTKXUEA-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 3
- 239000012925 reference material Substances 0.000 description 3
- 239000002924 silencing RNA Substances 0.000 description 3
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- SXUXMRMBWZCMEN-UHFFFAOYSA-N 2'-O-methyl uridine Natural products COC1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 SXUXMRMBWZCMEN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IDLISIVVYLGCKO-UHFFFAOYSA-N 6-carboxy-4',5'-dichloro-2',7'-dimethoxyfluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=C(C(O)=O)C=C2C21C1=CC(OC)=C(O)C(Cl)=C1OC1=C2C=C(OC)C(O)=C1Cl IDLISIVVYLGCKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101100295756 Acinetobacter baumannii (strain ATCC 19606 / DSM 30007 / JCM 6841 / CCUG 19606 / CIP 70.34 / NBRC 109757 / NCIMB 12457 / NCTC 12156 / 81) omp38 gene Proteins 0.000 description 2
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 2
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091023037 Aptamer Proteins 0.000 description 2
- 108020000946 Bacterial DNA Proteins 0.000 description 2
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 2
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 108091006146 Channels Proteins 0.000 description 2
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 2
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 2
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 2
- 108700039887 Essential Genes Proteins 0.000 description 2
- QTANTQQOYSUMLC-UHFFFAOYSA-O Ethidium cation Chemical compound C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 QTANTQQOYSUMLC-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 2
- 108091029795 Intergenic region Proteins 0.000 description 2
- 101100508198 Leptospira borgpetersenii serovar Hardjo-bovis (strain L550) infA2 gene Proteins 0.000 description 2
- 101710105759 Major outer membrane porin Proteins 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 238000002944 PCR assay Methods 0.000 description 2
- LOUPRKONTZGTKE-WZBLMQSHSA-N Quinine Chemical compound C([C@H]([C@H](C1)C=C)C2)C[N@@]1[C@@H]2[C@H](O)C1=CC=NC2=CC=C(OC)C=C21 LOUPRKONTZGTKE-WZBLMQSHSA-N 0.000 description 2
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 description 2
- 238000011530 RNeasy Mini Kit Methods 0.000 description 2
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FPIPGXGPPPQFEQ-OVSJKPMPSA-N all-trans-retinol Chemical compound OC\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C FPIPGXGPPPQFEQ-OVSJKPMPSA-N 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 101150042295 arfA gene Proteins 0.000 description 2
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000006757 chemical reactions by type Methods 0.000 description 2
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 101150094831 cysK gene Proteins 0.000 description 2
- 101150112941 cysK1 gene Proteins 0.000 description 2
- 101150029709 cysM gene Proteins 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 238000007847 digital PCR Methods 0.000 description 2
- 238000007877 drug screening Methods 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 2
- 238000001506 fluorescence spectroscopy Methods 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 2
- 101150071451 infA gene Proteins 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 2
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 101150087557 omcB gene Proteins 0.000 description 2
- 101150047779 ompB gene Proteins 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 101150031507 porB gene Proteins 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 2
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 2
- 238000012340 reverse transcriptase PCR Methods 0.000 description 2
- 101150040440 rpmB gene Proteins 0.000 description 2
- 101150081398 rpmB1 gene Proteins 0.000 description 2
- 238000001338 self-assembly Methods 0.000 description 2
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 229960000268 spectinomycin Drugs 0.000 description 2
- UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N spectinomycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](NC)[C@@H](O)[C@H]([C@@H]([C@H]1O1)O)NC)[C@]2(O)[C@H]1O[C@H](C)CC2=O UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N 0.000 description 2
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000011287 therapeutic dose Methods 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IEDVJHCEMCRBQM-UHFFFAOYSA-N trimethoprim Chemical compound COC1=C(OC)C(OC)=CC(CC=2C(=NC(N)=NC=2)N)=C1 IEDVJHCEMCRBQM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960001082 trimethoprim Drugs 0.000 description 2
- 231100000747 viability assay Toxicity 0.000 description 2
- 238000003026 viability measurement method Methods 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- GFYLSDSUCHVORB-IOSLPCCCSA-N 1-methyladenosine Chemical compound C1=NC=2C(=N)N(C)C=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O GFYLSDSUCHVORB-IOSLPCCCSA-N 0.000 description 1
- UTAIYTHAJQNQDW-KQYNXXCUSA-N 1-methylguanosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)N(C)C(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O UTAIYTHAJQNQDW-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- WJNGQIYEQLPJMN-IOSLPCCCSA-N 1-methylinosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)N(C)C=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O WJNGQIYEQLPJMN-IOSLPCCCSA-N 0.000 description 1
- UVBYMVOUBXYSFV-XUTVFYLZSA-N 1-methylpseudouridine Chemical compound O=C1NC(=O)N(C)C=C1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 UVBYMVOUBXYSFV-XUTVFYLZSA-N 0.000 description 1
- UVBYMVOUBXYSFV-UHFFFAOYSA-N 1-methylpseudouridine Natural products O=C1NC(=O)N(C)C=C1C1C(O)C(O)C(CO)O1 UVBYMVOUBXYSFV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RFCQJGFZUQFYRF-UHFFFAOYSA-N 2'-O-Methylcytidine Natural products COC1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)N=C(N)C=C1 RFCQJGFZUQFYRF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OVYNGSFVYRPRCG-UHFFFAOYSA-N 2'-O-Methylguanosine Natural products COC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC(N)=NC2=O)=C2N=C1 OVYNGSFVYRPRCG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YHRRPHCORALGKQ-FDDDBJFASA-N 2'-O-methyl-5-methyluridine Chemical compound CO[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(C)=C1 YHRRPHCORALGKQ-FDDDBJFASA-N 0.000 description 1
- RFCQJGFZUQFYRF-ZOQUXTDFSA-N 2'-O-methylcytidine Chemical compound CO[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)N=C(N)C=C1 RFCQJGFZUQFYRF-ZOQUXTDFSA-N 0.000 description 1
- OVYNGSFVYRPRCG-KQYNXXCUSA-N 2'-O-methylguanosine Chemical compound CO[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(N=C(N)NC2=O)=C2N=C1 OVYNGSFVYRPRCG-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- WGNUTGFETAXDTJ-OOJXKGFFSA-N 2'-O-methylpseudouridine Chemical compound CO[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1C1=CNC(=O)NC1=O WGNUTGFETAXDTJ-OOJXKGFFSA-N 0.000 description 1
- SXUXMRMBWZCMEN-ZOQUXTDFSA-N 2'-O-methyluridine Chemical compound CO[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 SXUXMRMBWZCMEN-ZOQUXTDFSA-N 0.000 description 1
- IQZWKGWOBPJWMX-UHFFFAOYSA-N 2-Methyladenosine Natural products C12=NC(C)=NC(N)=C2N=CN1C1OC(CO)C(O)C1O IQZWKGWOBPJWMX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HZOYZGXLSVYLNF-UHFFFAOYSA-N 2-amino-3,7-dihydropurin-6-one;1h-pyrimidine-2,4-dione Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1.O=C1NC(N)=NC2=C1NC=N2 HZOYZGXLSVYLNF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 2-deoxy-D-ribose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)CC=O ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 0.000 description 1
- IQZWKGWOBPJWMX-IOSLPCCCSA-N 2-methyladenosine Chemical compound C12=NC(C)=NC(N)=C2N=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O IQZWKGWOBPJWMX-IOSLPCCCSA-N 0.000 description 1
- VZQXUWKZDSEQRR-SDBHATRESA-N 2-methylthio-N(6)-(Delta(2)-isopentenyl)adenosine Chemical compound C12=NC(SC)=NC(NCC=C(C)C)=C2N=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O VZQXUWKZDSEQRR-SDBHATRESA-N 0.000 description 1
- GJTBSTBJLVYKAU-XVFCMESISA-N 2-thiouridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=S)NC(=O)C=C1 GJTBSTBJLVYKAU-XVFCMESISA-N 0.000 description 1
- YXNIEZJFCGTDKV-JANFQQFMSA-N 3-(3-amino-3-carboxypropyl)uridine Chemical compound O=C1N(CCC(N)C(O)=O)C(=O)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 YXNIEZJFCGTDKV-JANFQQFMSA-N 0.000 description 1
- KOLPWZCZXAMXKS-UHFFFAOYSA-N 3-methylcytosine Chemical compound CN1C(N)=CC=NC1=O KOLPWZCZXAMXKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZLOIGESWDJYCTF-UHFFFAOYSA-N 4-Thiouridine Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=S)C=C1 ZLOIGESWDJYCTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UDGUGZTYGWUUSG-UHFFFAOYSA-N 4-[4-[[2,5-dimethoxy-4-[(4-nitrophenyl)diazenyl]phenyl]diazenyl]-n-methylanilino]butanoic acid Chemical compound COC=1C=C(N=NC=2C=CC(=CC=2)N(C)CCCC(O)=O)C(OC)=CC=1N=NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 UDGUGZTYGWUUSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BCZUPRDAAVVBSO-MJXNYTJMSA-N 4-acetylcytidine Chemical compound C1=CC(C(=O)C)(N)NC(=O)N1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 BCZUPRDAAVVBSO-MJXNYTJMSA-N 0.000 description 1
- ZLOIGESWDJYCTF-XVFCMESISA-N 4-thiouridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=S)C=C1 ZLOIGESWDJYCTF-XVFCMESISA-N 0.000 description 1
- UVGCZRPOXXYZKH-QADQDURISA-N 5-(carboxyhydroxymethyl)uridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(C(O)C(O)=O)=C1 UVGCZRPOXXYZKH-QADQDURISA-N 0.000 description 1
- VKLFQTYNHLDMDP-PNHWDRBUSA-N 5-carboxymethylaminomethyl-2-thiouridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=S)NC(=O)C(CNCC(O)=O)=C1 VKLFQTYNHLDMDP-PNHWDRBUSA-N 0.000 description 1
- RJUNHHFZFRMZQQ-FDDDBJFASA-N 5-methoxyaminomethyl-2-thiouridine Chemical compound S=C1NC(=O)C(CNOC)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 RJUNHHFZFRMZQQ-FDDDBJFASA-N 0.000 description 1
- YIZYCHKPHCPKHZ-PNHWDRBUSA-N 5-methoxycarbonylmethyluridine Chemical compound O=C1NC(=O)C(CC(=O)OC)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 YIZYCHKPHCPKHZ-PNHWDRBUSA-N 0.000 description 1
- ZXIATBNUWJBBGT-JXOAFFINSA-N 5-methoxyuridine Chemical compound O=C1NC(=O)C(OC)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 ZXIATBNUWJBBGT-JXOAFFINSA-N 0.000 description 1
- SNNBPMAXGYBMHM-JXOAFFINSA-N 5-methyl-2-thiouridine Chemical compound S=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 SNNBPMAXGYBMHM-JXOAFFINSA-N 0.000 description 1
- LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 5-methylcytosine Chemical compound CC1=CNC(=O)N=C1N LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- USVMJSALORZVDV-UHFFFAOYSA-N 6-(gamma,gamma-dimethylallylamino)purine riboside Natural products C1=NC=2C(NCC=C(C)C)=NC=NC=2N1C1OC(CO)C(O)C1O USVMJSALORZVDV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000224489 Amoeba Species 0.000 description 1
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- IVRMZWNICZWHMI-UHFFFAOYSA-N Azide Chemical compound [N-]=[N+]=[N-] IVRMZWNICZWHMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004513 Bacterial RNA Proteins 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- YKFRUZQBLRDAPY-KQNSAAIESA-O CNCc1cn([C@@H]2O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]2O)c(=O)[nH]c1=O.Cn1c[n+]([C@@H]2O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]2O)c2[nH]c(N)nc(=O)c12 Chemical compound CNCc1cn([C@@H]2O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]2O)c(=O)[nH]c1=O.Cn1c[n+]([C@@H]2O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]2O)c2[nH]c(N)nc(=O)c12 YKFRUZQBLRDAPY-KQNSAAIESA-O 0.000 description 1
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 1
- 108700042132 Chlamydia trachomatis omp1 Proteins 0.000 description 1
- 101100024013 Chlamydia trachomatis ompA gene Proteins 0.000 description 1
- 235000001258 Cinchona calisaya Nutrition 0.000 description 1
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 1
- 201000003883 Cystic fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 125000003319 D-arabinosyl group Chemical group C1([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO1)* 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004435 EPR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 1
- 101000867232 Escherichia coli Heat-stable enterotoxin II Proteins 0.000 description 1
- 101150062467 GAT gene Proteins 0.000 description 1
- 108091092584 GDNA Proteins 0.000 description 1
- 206010048461 Genital infection Diseases 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 238000004566 IR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 229930010555 Inosine Natural products 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N Inosine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 229930195714 L-glutamate Natural products 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- 101710164702 Major outer membrane protein Proteins 0.000 description 1
- RSPURTUNRHNVGF-IOSLPCCCSA-N N(2),N(2)-dimethylguanosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N(C)C)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O RSPURTUNRHNVGF-IOSLPCCCSA-N 0.000 description 1
- SLEHROROQDYRAW-KQYNXXCUSA-N N(2)-methylguanosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(NC)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O SLEHROROQDYRAW-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- USVMJSALORZVDV-SDBHATRESA-N N(6)-(Delta(2)-isopentenyl)adenosine Chemical compound C1=NC=2C(NCC=C(C)C)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O USVMJSALORZVDV-SDBHATRESA-N 0.000 description 1
- VQAYFKKCNSOZKM-IOSLPCCCSA-N N(6)-methyladenosine Chemical compound C1=NC=2C(NC)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O VQAYFKKCNSOZKM-IOSLPCCCSA-N 0.000 description 1
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- VQAYFKKCNSOZKM-UHFFFAOYSA-N NSC 29409 Natural products C1=NC=2C(NC)=NC=NC=2N1C1OC(CO)C(O)C1O VQAYFKKCNSOZKM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000244206 Nematoda Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- VZQXUWKZDSEQRR-UHFFFAOYSA-N Nucleosid Natural products C12=NC(SC)=NC(NCC=C(C)C)=C2N=CN1C1OC(CO)C(O)C1O VZQXUWKZDSEQRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150063378 OMP gene Proteins 0.000 description 1
- VXRNHJSPJSJOSH-CBKNNIEOSA-N O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@]1(N1C(NC(=O)C=C1)=O)CC1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@]1(N1C(NC(=O)C=C1)=O)CC1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 VXRNHJSPJSJOSH-CBKNNIEOSA-N 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 1
- 229930185560 Pseudouridine Natural products 0.000 description 1
- PTJWIQPHWPFNBW-UHFFFAOYSA-N Pseudouridine C Natural products OC1C(O)C(CO)OC1C1=CNC(=O)NC1=O PTJWIQPHWPFNBW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- YXNIEZJFCGTDKV-UHFFFAOYSA-N X-Nucleosid Natural products O=C1N(CCC(N)C(O)=O)C(=O)C=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 YXNIEZJFCGTDKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000037919 acquired disease Diseases 0.000 description 1
- 239000011717 all-trans-retinol Substances 0.000 description 1
- 235000019169 all-trans-retinol Nutrition 0.000 description 1
- 229940058140 avita Drugs 0.000 description 1
- 150000001540 azides Chemical class 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WGDUUQDYDIIBKT-UHFFFAOYSA-N beta-Pseudouridine Natural products OC1OC(CN2C=CC(=O)NC2=O)C(O)C1O WGDUUQDYDIIBKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000941 bile Anatomy 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 125000003917 carbamoyl group Chemical group [H]N([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 108020001778 catalytic domains Proteins 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- VAAUVRVFOQPIGI-SPQHTLEESA-N ceftriaxone Chemical compound S([C@@H]1[C@@H](C(N1C=1C(O)=O)=O)NC(=O)\C(=N/OC)C=2N=C(N)SC=2)CC=1CSC1=NC(=O)C(=O)NN1C VAAUVRVFOQPIGI-SPQHTLEESA-N 0.000 description 1
- 229960004755 ceftriaxone Drugs 0.000 description 1
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- LOUPRKONTZGTKE-UHFFFAOYSA-N cinchonine Natural products C1C(C(C2)C=C)CCN2C1C(O)C1=CC=NC2=CC=C(OC)C=C21 LOUPRKONTZGTKE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002983 circular dichroism Methods 0.000 description 1
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 230000001627 detrimental effect Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- ZPTBLXKRQACLCR-XVFCMESISA-N dihydrouridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)CC1 ZPTBLXKRQACLCR-XVFCMESISA-N 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 1
- 238000002848 electrochemical method Methods 0.000 description 1
- 244000000015 environmental pathogen Species 0.000 description 1
- 230000009144 enzymatic modification Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000013213 extrapolation Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 244000078673 foodborn pathogen Species 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006658 host protein synthesis Effects 0.000 description 1
- 210000004251 human milk Anatomy 0.000 description 1
- 235000020256 human milk Nutrition 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000010185 immunofluorescence analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010569 immunofluorescence imaging Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 229960003786 inosine Drugs 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000009830 intercalation Methods 0.000 description 1
- 238000007834 ligase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006609 metabolic stress Effects 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- VIKNJXKGJWUCNN-XGXHKTLJSA-N norethisterone Chemical compound O=C1CC[C@@H]2[C@H]3CC[C@](C)([C@](CC4)(O)C#C)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 VIKNJXKGJWUCNN-XGXHKTLJSA-N 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 238000005375 photometry Methods 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- PTJWIQPHWPFNBW-GBNDHIKLSA-N pseudouridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1C1=CNC(=O)NC1=O PTJWIQPHWPFNBW-GBNDHIKLSA-N 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 229960000948 quinine Drugs 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 239000013074 reference sample Substances 0.000 description 1
- 239000013558 reference substance Substances 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-JXOAFFINSA-N ribothymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-JXOAFFINSA-N 0.000 description 1
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 1
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 210000001179 synovial fluid Anatomy 0.000 description 1
- 238000012353 t test Methods 0.000 description 1
- 238000010863 targeted diagnosis Methods 0.000 description 1
- 210000001138 tear Anatomy 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000005382 thermal cycling Methods 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
- YIZYCHKPHCPKHZ-UHFFFAOYSA-N uridine-5-acetic acid methyl ester Natural products COC(=O)Cc1cn(C2OC(CO)C(O)C2O)c(=O)[nH]c1=O YIZYCHKPHCPKHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 230000007279 water homeostasis Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
- G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
- G16B25/00—ICT specially adapted for hybridisation; ICT specially adapted for gene or protein expression
- G16B25/10—Gene or protein expression profiling; Expression-ratio estimation or normalisation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
- C12Q1/18—Testing for antimicrobial activity of a material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6851—Quantitative amplification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
-
- G—PHYSICS
- G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
- G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
- G16B40/00—ICT specially adapted for biostatistics; ICT specially adapted for bioinformatics-related machine learning or data mining, e.g. knowledge discovery or pattern finding
- G16B40/20—Supervised data analysis
-
- G—PHYSICS
- G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
- G16H—HEALTHCARE INFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR THE HANDLING OR PROCESSING OF MEDICAL OR HEALTHCARE DATA
- G16H50/00—ICT specially adapted for medical diagnosis, medical simulation or medical data mining; ICT specially adapted for detecting, monitoring or modelling epidemics or pandemics
- G16H50/20—ICT specially adapted for medical diagnosis, medical simulation or medical data mining; ICT specially adapted for detecting, monitoring or modelling epidemics or pandemics for computer-aided diagnosis, e.g. based on medical expert systems
-
- G—PHYSICS
- G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
- G16H—HEALTHCARE INFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR THE HANDLING OR PROCESSING OF MEDICAL OR HEALTHCARE DATA
- G16H50/00—ICT specially adapted for medical diagnosis, medical simulation or medical data mining; ICT specially adapted for detecting, monitoring or modelling epidemics or pandemics
- G16H50/50—ICT specially adapted for medical diagnosis, medical simulation or medical data mining; ICT specially adapted for detecting, monitoring or modelling epidemics or pandemics for simulation or modelling of medical disorders
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/106—Pharmacogenomics, i.e. genetic variability in individual responses to drugs and drug metabolism
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/26—Infectious diseases, e.g. generalised sepsis
Abstract
本发明提供用于定量数据标准化和/或确定细胞、生物体、病毒等中转录水平的方法。这些方法能够用于多种应用中,所述多种应用包括但不限于确定转录上调和下调、鉴定转录扰动、确定生存力/死亡以及评估对药剂治疗的反应(例如对药物的抗性或敏感性)。
Description
通过交叉引用并入
本申请要求2017年12月21日提交的澳大利亚临时专利申请号2017905138的优先权,其全部内容通过交叉引用并入本文。
技术领域
本发明总体上涉及分子生物学领域。更具体而言,本发明提供用于定量数据标准化和/或确定细胞、生物体、病毒等中转录水平的方法。这些方法能够用于多种应用中,所述多种应用包括但不限于确定转录上调和下调、鉴定转录扰动、确定生存力/死亡以及评估对药剂治疗的反应(例如对药物的抗性或敏感性)。
背景技术
分子生物学的进步极大地提高了表征细胞、查询其基因组和转录组的能力,以证明与疾病和/或外部刺激有关的变化。例如,发现特定的序列变异与获得性或遗传性疾病例如癌症或囊性纤维化有关。基因表达的变化与疾病状态和对刺激的反应有关。此外,外源序列的存在可以表明感染原例如细菌或病毒的存在。核酸扩增技术(NAAT)测试已在所有这些领域中广泛应用于基础研究、临床研究和临床诊断。
体外核酸扩增的方法在NAAT测试中具有广泛的应用。这些方法包括聚合酶链反应(PCR)、链置换扩增(SDA)、解旋酶依赖性扩增(HDA)、重组酶聚合酶扩增(RPA)、环介导的等温扩增(LAMP)、滚环扩增(RCA)、转录介导扩增(TMA)、自我维持序列复制(3SR)、基于核酸序列的扩增(NASBA)。已经描述了各种类型的PCR,包括定量实时PCR、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和数字PCR。这些靶扩增策略均需要使用寡核苷酸引物。扩增过程导致靶序列的指数扩增,该靶序列在其5'末端掺入了寡核苷酸引物,并且包含位于引物之间的序列的新合成拷贝。信号放大技术(例如EzyAmp、支链反应或DoC)也可以用于NAAT测试。
基因表达的标准化(RNA水平)是一个有争议的话题,每种可用策略都有各种优缺点。这些包括对样本大小、总RNA或核糖体RNA、管家基因的mRNA和基因组DNA的标准化。管家基因的mRNA标准化需要明智地选择靶标,因为它们的稳定性和表达水平可能会受到实验或环境条件的影响。此外,在细菌中,表达水平可以在细菌发育周期中变化。核糖体RNA(rRNA)的水平虽然丰富并且显示出更长的半衰期,但也会在响应实验或环境条件下改变表达;并且细菌的水平在发育周期中可能会发生变化。此外,由于rRNA占总RNA比例的80%,因此rRNA和mRNA之间存在显著的不平衡,后者仅占2%至5%。基因组DNA一直存在、稳定且通常不变,因此被认为是基因表达标准化的良好候选者。基因组DNA已显示产生更准确和可再现的结果。
但是,使用基因组DNA作为RNA水平标准化的靶标存在一些局限性。大多数方案不能同时从样品中提取RNA和DNA,因此在平行反应中分别进行分开提取、定量和随后分开扩增,通常包含或缺乏逆转录酶。因此,在比较这两种截然不同的方案并使用(i)第一种方案(DNA提取和通过例如PCR进行扩增)的结果以标准化(ii)第二方案(RNA提取和例如通过RT-PCR进行扩增)的结果时,存在很大的误差范围。此外,这种平行方案昂贵、费力且耗时。
NAAT由于其高灵敏度和特异性、快速的周转时间、对各种样品类型进行分析的能力以及针对任何细菌种类的能力,为分析细菌感染提供了黄金标准。然而,对于某些特定的应用,当前的方法具有缺点。特别是,它们不太适合区分活菌和死菌。例如,细菌DNA并不是细胞生存力的良好标志,因为这种DNA在细胞死亡后可以存活数周。这一事实揭示了可用检测方法的局限性,缺乏信息地使用定量方法,对感染状况或治疗效果的监测效率低下。可能还会高估阳性。
当务之急是需要提供更多信息和准确的检测方法,尤其是当应用于性传播感染(STI)时。迫切需要新工具,特别是对于存在病原体但患者无症状和/或病原体具有较高抗药性(AMR)的情况。对于此类感染,需要进行治愈测试(TOC)以确保成功清除。这种治愈的确认将减少与初始感染相关的进一步并发症的可能性,并将限制病原体和耐药菌株的流行和传播。目前,TOC方法仅限于在治疗后的单个时间点进行的NAAT分析,并且最佳时间可能会根据引起STI的物种而有所不同。阳性结果可能表明治疗失败,但也可能反映了对无效的DNA和/或RNA片段的检测。
有几种解决该问题的技术。确定生存力的方法包括通过新的培养方法进行代谢监测,蒸发诱导的细菌渗透调节刺激,诸如Smarticles技术之类的抗生素敏感性测试(AST),基于噬菌体的检测和比例定量rRNA分析。尽管这些方法在区分活菌和死菌方面已显示出一些成功,但上述所有方法仍依靠培养程序来获得结果。替代的生存力检测技术避免了培养方法。例如,一些重点放在在DNA提取过程之前应用的嵌入式染料,例如单叠氮化乙锭(EMA)和单叠氮化丙锭(PMA)。染料与双链DNA结合,存在于细胞外部或在染料通过细胞破壁渗透后结合。这使得死亡细菌的DNA对随后的PCR扩增具有抗性。该方法已广泛应用于临床样品、环境和食源性病原体检测,但是,局限性也很明显,并且已经过综述。染料不适用于所有类型的样品或细菌,在培养条件和所需浓度方面均存在差异。已经充分表明,染料渗透活细胞可能引起信号抑制,并且由于高的无生存力细菌负荷而可能发生假阳性检测。
RNA的检测是另一种可能评估细胞生存力的方法,因为RNA不如DNA稳定,因此能更真实地反映生存力。但是,这些方法还需要进一步改进,因为已经证明RNA转录物在处理或细胞死亡后会持续较长的时间。因此,明智地选择合适的转录物和扩增子参数以及从RNA制备物中完全消除污染的DNA的能力至关重要。因此,需要对基于RNA的精确策略进行更多研究以定量活细菌。
进一步需要的领域是允许筛选抗药性或敏感性的方法。特别是,急需进行快速的药敏试验,以告知个别患者的治疗方法,以防止耐药菌传播。此外,这种方法可以用作药物发现程序的筛选方法。本文所述的发明能够产生更有益的结果,区分存在和不存在传染原,并进而区分未清除和清除的感染。它涉及一种同时分析单个总核酸(TNA)样品中存在的RNA和DNA的替代方法。
本文中描述的发明在这些领域和其他领域中具有应用。它提供在单个反应中标准化有效转录水平的方法。先前试图将RNA水平标准化为DNA的研究存在缺陷。在此类研究中,研究人员从样本中提取了RNA和DNA,并在分开的平行RT-PCR和PCR反应中对其进行了扩增,然后将基因表达水平(RNA)标准化为从DNA产生的水平。这种方法有很多问题。首先,尽管RNA和DNA可能源自同一样品,但它们的处理方式不同,以提取两种不同的核酸(DNA与RNA),因此提取效率不可能相等。类似地,将等分试样放在分开的试管中进行分析时,这两个提取的样品可能会有采样偏差。此外,由于它们是在不同的PCR反应混合物中扩增的,所述混合物的组成不同(例如至少由于存在或不存在逆转录酶)并且通常在热循环曲线中不同,因此难以进行有意义的比较。以下发明克服了这些局限性。
在本领域中众所周知的是,可以同时共提取DNA和RNA,它们一起被称为“总核酸”(TNA)。但是,RT-PCR的一个方面(文献中通常没有讨论)是,扩增TNA样品中特定RNA转录物(RNA-X)的方案也将共同扩增从中转录特定靶RNA-X的基因的TNA样品的DNA(DNA-X)。反之亦然,在逆转录酶反应中,如果该DNA是一个有效转录的基因或序列,则不可能仅扩增特定的DNA序列(DNA-X),因为转录的RNA(RNA-X)也将共同扩增。换句话说,如果DNA-X被转录产生RNA-X,则来自TNA样品的RT-PCR的扩增产物始终是从RNA-X和DNA-X(RNA-X加上DNA-X)获得的扩增子的总和。这样,如果基因组DNA-X序列被转录,则不可能用该基因组DNA-X序列标准化该序列。
本发明试图通过制备同时包含DNA和RNA(例如TNA)的核酸样品,并共同扩增(i)一个基因(DNA-X)及其相关的RNA转录产物(RNA-X)以及不转录的DNA无关区域(DNA-N)来克服现有技术中存在的一个或多个困难。然后可以使用DNA-N标准化DNA-X加RNA-X的水平。此外,可以使用针对多个转录的基因或区域及其相关转录物的多个引物组,例如可以将DNA-X加RNA-X和DNA-Y加RNA-Y标准化为不转录的DNA-N。任选地,为方便起见,通过将来自多个转录的DNA/RNA靶标的分析数据除以单个非不转录的DNA-N所得的比值,可以再次除以靶向转录的DNA/RNA物质的组的引物组数。将通过以下实施例将进一步阐明本发明。
发明内容
本发明可涉及在同时包含DNA和RNA的样品(例如总核酸(TNA)样品)中的三种核酸物质的共扩增(例如同时)。这些物质是(i)一个或多个基因,(ii)从该基因或那些基因表达的转录物,和(iii)不表达的(即不转录的)DNA序列。一起将基因及其对应的转录物的组合测量在本文中通常称为GAT(基因和转录物),将不转录DNA的测量在本文中通常称为NED(不表达DNA)。本发明的方法涉及一起或分别共扩增这些物质,并使用GAT和NED的估计值之比作为转录能力的指标,其可进而用于评估诸如细胞生存力、细胞死亡、由于外部刺激或疾病状态导致的细胞功能紊乱等特征。
本发明至少部分地涉及下面列出的实施方案1-48:
实施方案1.一种使通过从细胞、生物或病毒中扩增核酸而获得的定量数据标准化的方法,该方法包括:
(i)从以下获得定量数据:
–对来自第一基因的基因组DNA和从第一基因转录的RNA的扩增,以及
–对细胞、生物或病毒中不转录DNA序列的扩增;和
(ii)使用定量数据以导出代表在所述扩增之前存在于核酸样品中的以下两者的相对量的标准化值(nV):
-第一基因的所述基因组DNA和RNA转录物,对于
-不转录的所述基因组DNA。
实施方案2.根据实施方案1所述的方法,其中所述定量数据为扩增子拷贝数,并且该方法包括:
-获得代表从所述第一基因的所述基因组DNA和RNA转录物的扩增产生的总扩增子数的值A(vA),以及代表从不转录DNA的序列产生的总扩增子数的值B(vB);
-使用以下公式或其等价形式计算标准化值(nV):
vA/vB=nV。
实施方案3.实施方案1所述的方法,其中所述定量数据为扩增子拷贝数,并且该方法包括:
-获得代表从以下产生的总扩增子数的值X(vX):来自第一基因的基因组DNA和RNA转录物的扩增,以及来自至少一个另外的基因的基因组DNA和RNA转录物的扩增;
-获得代表从不转录DNA序列产生的总扩增子数的值B(vB),
-使用以下公式或其等价形式计算标准化值(nV):
vX/(vB x(X+1))=nV,
其中X是所述另外的基因的数量。
实施方案4.根据实施方案2或实施方案3所述的方法,其中所述扩增是数字聚合酶链式反应(dPCR)。
实施方案5.根据实施方案1所述的方法,其中所述定量数据为阈值(Ct)并且该方法包括:
-从所述第一基因的基因组DNA和RNA转录物的扩增获得循环阈值CtA,
-从不转录DNA序列的扩增获得循环阈值CtB;和
-使用以下公式或其等价形式计算标准化值(nV):
2CtB-CtA=nV。
实施方案6.根据实施方案1所述的方法,其中所述定量数据为阈值(Ct)并且该方法包括:
–从以下获得循环阈值CtX:所述第一基因的基因组DNA和RNA转录物的扩增,和来自至少一个另外的基因的基因组DNA和RNA转录物的扩增;
-从不转录DNA序列的扩增获得循环阈值CtB;和
-使用以下公式或其等价形式计算标准化值(nV):
2CtB-CtX/(X+1)=nV,
其中X是所述另外的基因的数量。
实施方案7.根据实施方案5或实施方案6所述的方法,其中所述扩增是定量聚合酶链式反应(qPCR)。
实施方案8.根据实施方案1至7中任一项所述的方法,其中不转录DNA的序列是基因组DNA。
实施方案9.根据实施方案1至8中任一项所述的方法,其进一步包括对来自细胞、生物或病毒的核酸进行所述扩增。
实施方案10.根据实施方案1至9中任一项所述的方法,其中来自细胞、生物或病毒的核酸是总核酸的提取物。
实施方案11.根据实施方案1至10中任一项所述的方法,其中任意所述扩增是使用以下进行的:聚合酶链反应(PCR)、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、链置换扩增(SDA)、环介导的等温扩增(LAMP)、滚环扩增(RCA)、重组酶聚合酶扩增(RPA)、解旋酶依赖性扩增(HDA)、基于链侵入的扩增(SIBA)、转录物介导的扩增(TMA)、自我维持序列复制(3SR)、基于核酸序列的扩增(NASBA)或其任意组合。
实施方案12.根据实施方案1至11中任一项所述的方法,其进一步包括使用标准化值(nV)评估细胞、生物或病毒中转录活性的水平。
实施方案13.根据实施方案1至12中任一项所述的方法,其进一步包括:
-获得使用从已知不具有转录活性的细胞、生物或病毒群体的个体获得的一系列所述标准化值(nV)产生的转录阴性标准化值(nV-);和
-将通过对来自细胞、生物或病毒中的核酸的所述扩增获得的标准化值(nV)与转录阴性标准化值(nV-)进行比较,从而评估细胞、生物或病毒中转录活性的水平。
实施方案14.根据实施方案13所述的方法,其中转录阴性标准化值(nV-)是从所述一系列所述标准化值(nV)产生的平均值。
实施方案15.根据实施方案13或实施方案14所述的方法,其中:
-转录阴性标准化值(nV-)被用作评估细胞、生物或病毒中转录活性存在与否的基础值;和
-当通过对来自细胞、生物或病毒的核酸的所述扩增获得的标准化值(nV)等于或低于转录阴性标准化值(nV-)时,表明没有转录活性;或
-当通过对来自细胞、生物或病毒的核酸的所述扩增获得的标准化值(nV)高于转录阴性标准化值(nV-)时,表明有转录活性。
实施方案16.根据实施方案13至15中任一项所述的方法,其中所述转录阴性标准化值(nV-):
-纳入在一系列所述标准化值(nV)中来自已知不具有转录活性的细胞、生物或病毒群体的个体的统计变化;和/或
-提供有所述转录阴性标准化值(nV-)可预测细胞、生物或病毒中是否存在转录活性的置信区间。
实施方案17.根据实施方案16所述的方法,其中置信区间大于90%或大于95%。
实施方案18.根据权利实施方案13至17中任一项所述的方法,其进一步包括:
-获得使用从已知具有转录活性的细胞、生物或病毒群体的个体获得的一系列所述标准化值(nV)产生的转录阳性标准化值(nV+);和
-将通过对来自细胞、生物或病毒中的核酸的扩增获得的标准化值(nV)与转录阳性标准化值(nV+)进行比较,从而评估细胞、生物或病毒中转录活性的水平。
实施方案19.根据实施方案18所述的方法,其中转录阳性标准化值(nV+)是从所述一系列所述标准化值(nV)产生的平均值。
实施方案20.根据实施方案18或实施方案19所述的方法,其中:
-转录阳性标准化值(nV+)被用作细胞、生物或病毒中转录活性的基础值;和
-当通过对来自细胞、生物或病毒的核酸的所述扩增获得的标准化值(nV)低于转录阳性标准化值(nV+)时,表明没有转录活性;或
-当通过对来自细胞、生物或病毒的核酸的所述扩增获得的标准化值(nV)等于或高于转录阳性标准化值(nV+)时,表明有转录活性。
实施方案21.根据实施方案18至20中任一项所述的方法,其中所述转录阳性标准化值(nV+):
-纳入在一系列所述标准化值(nV)中来自已知具有转录活性的细胞、生物或病毒群体的个体的统计变化;和/或
-提供有所述转录阳性标准化值(nV+)可预测细胞、生物或病毒中是否存在转录活性的置信区间。
实施方案22.根据实施方案21所述的方法,其中置信区间大于90%或大于95%。
实施方案23.根据实施方案13所述的方法,其进一步包括:
-获得使用从已知不具有转录活性的细胞、生物或病毒群体的个体获得的一系列所述标准化值(nV)产生的转录阴性标准化值(nV-);
-获得使用从已知具有转录活性的细胞、生物或病毒群体的个体获得的一系列所述标准化值(nV)产生的转录阳性标准化值(nV+);和
-将通过对来自细胞、生物或病毒中的核酸的扩增获得的标准化值(nV)与以下进行比较:
(i)转录阴性标准化值(nV-)和转录阳性标准化值(nV+),或
(ii)介于转录阴性标准化值(nV-)和转录阳性标准化值(nV+)之间的合并的转录标准化值(nV+),
从而评估细胞、生物或病毒中转录活性的水平。
实施方案24.根据实施方案23所述的方法,其中使用以下公式或其等价形式计算合并的转录标准化值(nV+):
(nV+)+(nV-)/2=(nV+)。
实施方案25.根据实施方案24所述的方法,其中所述合并的转录标准化值(nV+):
-纳入在所述一系列转录阴性标准化值(nV-)和/或所述转录阳性标准化值(nV+)中的统计变化;和/或
-提供有所述合并的转录标准化值(nV+)可预测细胞、生物或病毒中是否存在转录活性的置信区间。
实施方案26.根据实施方案25所述的方法,其中置信区间大于90%或大于95%。
实施方案27.根据实施方案12至26中任一项所述的方法,其中为了确定以下中的任一项或多项而评估细胞、生物或病毒中的转录活性水平:
-测试细胞或测试生物的生存力;
-测试细胞、生物或病毒是活的还是死的;
-测试细胞、生物或病毒中的转录扰动。
实施方案28.根据实施方案1至11中任一项所述的方法,其进一步包括使用标准化值(nV)评估细胞、生物或病毒中的耐药性或药物敏感性水平,其中:
-在所述核酸扩增之前,已经用药物处理了所述细胞、生物或病毒,并且
-将所述标准化值(nV)与使用从已知具有以下性质的细胞、生物或病毒群体的个体获得的一系列所述标准化值(nV)产生的对照标准化值(cnV)进行比较;
(i)对所述药物具有耐药性;或
(i)对所述药物具有敏感性,
从而评估细胞、生物或病毒中的耐药性或药物敏感性水平。
实施方案29.根据实施方案1至11或28中任一项所述的方法,其进一步包括:
-获得使用从已知对该药物具有敏感性的细胞、生物或病毒群体的个体获得的一系列所述标准化值(nV)产生的药物敏感性标准化值(dsV);和
-将通过对来自细胞、生物或病毒中的核酸的扩增获得的标准化值(nV)与所述药物敏感性标准化值(dsV)进行比较,从而评估细胞、生物或病毒中的耐药性或药物敏感性的水平,其中在核酸的所述扩增之前已经用药物处理细胞、生物或病毒。
实施方案30.根据实施方案29所述的方法,其中药物敏感性标准化值(dsV)是从所述一系列所述标准化值(nV)产生的平均值。
实施方案31.根据实施方案29或实施方案30所述的方法,其中:
-药物敏感性标准化值(dsV)被用作评估细胞、生物或病毒中耐药性或药物敏感性存在与否的基础值;和
-当通过对来自细胞、生物或病毒的核酸的所述扩增获得的标准化值(nV)高于药物敏感性标准化值(dsV)时,表明有耐药性;或
-当通过对来自细胞、生物或病毒的核酸的所述扩增获得的标准化值(nV)等于或低于药物敏感性标准化值(dsV)时,表明有药物敏感性。
实施方案32.根据实施方案29至31中任一项所述的方法,其中所述药物敏感性标准化值(dsV):
-纳入在一系列所述标准化值(nV)中来自已知对该药物具有敏感性的细胞、生物或病毒群体的个体的统计变化;和/或
-提供有所述药物敏感性标准化值(dsV)可预测细胞、生物或病毒中是否存在以下性质的置信区间:
(i)细胞、生物、病毒中对该药物具有耐药性;或
(ii)细胞、生物、病毒中对该药物具有敏感性。
实施方案33.根据实施方案32所述的方法,其中置信区间大于90%或大于95%。
实施方案34.根据实施方案1至11或28中任一项所述的方法,其进一步包括:
-获得使用从已知对该药物具有耐药性的细胞、生物或病毒群体的个体获得的一系列所述标准化值(nV)产生的耐药性标准化值(drV);和
-将通过对来自细胞、生物或病毒中的核酸的扩增获得的标准化值(nV)与所述耐药性标准化值(drV)进行比较,从而评估细胞、生物或病毒中的耐药性或药物敏感性的水平,其中在核酸的所述扩增之前已经用药物处理细胞、生物或病毒。
实施方案35.根据实施方案34所述的方法,其中耐药性标准化值(drV)是从所述一系列所述标准化值(nV)产生的平均值。
实施方案36.根据实施方案34或实施方案35所述的方法,其中:
-耐药性标准化值(drV)被用作评估细胞、生物或病毒中耐药性或药物敏感性存在与否的基础值;和
-当通过对来自细胞、生物或病毒的核酸的所述扩增获得的标准化值(nV)等于或高于耐药性标准化值(drV)时,表明有耐药性;或
-当通过对来自细胞、生物或病毒的核酸的所述扩增获得的标准化值(nV)低于耐药性标准化值(drV)时,表明有药物敏感性。
实施方案37.根据实施方案34至36中任一项所述的方法,其中所述耐药性标准化值(drV):
-纳入在一系列所述标准化值(nV)中来自已知对该药物具有耐药性的细胞、生物或病毒群体的个体的统计变化;和/或
-提供有所述耐药性标准化值(drV)可预测细胞、生物或病毒中是否存在以下性质的置信区间:
(i)细胞、生物、病毒中对该药物具有耐药性;或
(ii)细胞、生物、病毒中对该药物具有敏感性。
实施方案38.根据实施方案37所述的方法,其中置信区间大于90%或大于95%。
实施方案39.根据实施方案1至11之一所述的方法,其进一步包括使用标准化值(nV)评估细胞、生物或病毒中的耐药性或药物敏感性水平,其中:
-在所述核酸扩增之前已经用药物处理过的所述细胞、生物或病毒的第一群体,用于产生所述第一标准化值(nV),
-在所述核酸扩增之前没有用药物处理过的所述细胞、生物或病毒的第二群体,用于产生所述第二标准化值(nV),
-将所述第一标准化值(nV)或所述第二标准化值(nV)进行比较,以评估在有或者没有药物处理的情况下细胞、生物或病毒中的转录活性水平,从而评估细胞、生物或病毒中的耐药性或药物敏感性水平。
实施方案40.根据实施方案39所述的方法,其中当所述第一标准化值(nV)低于所述第二标准化值(nV)表示具有所述药物敏感性。
实施方案41.根据实施方案27至40中任一项所述的方法,其中该药物是抗微生物药物。
实施方案42.根据实施方案27至41中任一项所述的方法,其中该药物是选自以下类别的抗微生物药物:氨基糖苷类、安沙霉素类、碳头孢烯类、碳青霉烯类、头孢菌素类、糖肽类、大环内酯类青霉素类、单环β-内酰胺类、多肽类、喹诺酮类、磺酰胺类、四环素类。
实施方案43.根据实施方案27至42中任一项所述的方法,其中该药物是环丙沙星、阿奇霉素、利福平或强力霉素。
实施方案44.根据实施方案27至43中任一项所述的方法,其中第一个基因是来自衣原体(Chlamydia)种(例如沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis))、淋病(Gonorrhea)种或支原体(mycoplasma)种(例如生殖支原体(Mycoplasmagenitralium))的基因。
实施方案45.根据实施方案1至44中任一项所述的方法,其中所述第一基因的基因组DNA和从所述第一基因转录的RNA以及所述不转录DNA的序列在同一反应中共同扩增。
实施方案46.根据实施方案45所述的方法,其中所述反应包括使用逆转录酶。
实施方案47.根据实施方案1至46中任一项所述的方法,其中细胞是哺乳动物细胞、人细胞、动物细胞、植物细胞、细菌细胞、被病毒感染的宿主细胞或被细菌感染的宿主细胞。
实施方案48.根据实施方案1至47中任一项所述的方法,其中生物是哺乳动物、人、植物、细菌、病毒、真菌、藻类、古细菌或原生动物。
本发明还至少部分地涉及下面列出的实施方案1-23:
实施方案1.一种评估细胞或生物转录活性的方法,该方法包括:
-对来自细胞或生物体的总核酸进行核酸扩增反应,其中所述核酸扩增包括:
使总核酸样品与一个或多个能够扩增第一基因的基因组DNA和第一基因转录的RNA的引物接触,
使总核酸样品与一种或多种能够扩增细胞或生物中不转录的非编码基因组DNA区域的引物接触;
-分析核酸扩增反应的动力学,以导出(i)与(ii)的比值:
(i)第一基因的所述基因组DNA和RNA转录物,
(ii)所述非编码DNA区域,
其中该比值代表在进行核酸扩增反应之前总核酸样品内存在的(i)和(ii)的相对量;和
-分析该比值以评估细胞或生物的转录活性,其中:
比值为1表示细胞或生物中没有转录活性,并且
比值大于1表示细胞或生物中有或者可能有转录活性。
实施方案2.根据实施方案1所述的方法,其中比值大于1.5、1.7、1.9、2、2.2、2.4、2.5、2.7、2.9或3表示细胞或生物中有转录活性。
实施方案3.根据实施方案1所述的方法,其中比值小于1.5、1.4、1.3、1.2或1.1表示细胞或生物中没有转录活性。
实施方案4.一种评估细胞或生物生存力的方法,该方法包括:
-对细胞或生物体的总核酸进行核酸扩增反应,其中所述核酸扩增包括:
使总核酸样品与一个或多个能够扩增第一基因的基因组DNA和第一基因转录的RNA的引物接触,
使总核酸样品与一种或多种能够扩增细胞或生物中不转录的非编码基因组DNA区域的引物接触;
-分析核酸扩增反应的动力学,以导出(i)与(ii)的比值:
(i)第一基因的所述基因组DNA和RNA转录物,
(ii)所述非编码DNA区域,
其中该比值代表在进行核酸扩增反应之前总核酸样品内存在的(i)和(ii)的相对量;和
-分析该比值以评估细胞或生物的转录活性,其中:
比值为1表示细胞或生物没有生存力,和
比值大于1表示细胞或生物有或者可能有生存力。
实施方案5.根据实施方案4所述的方法,其中比值大于1.5、1.7、1.9、2、2.2、2.4、2.5、2.7、2.9或3表示细胞或生物有生存力。
实施方案6.根据实施方案4所述的方法,其中比值小于1.5、1.4、1.3、1.2或1.1表示细胞或生物没有生存力。
实施方案7.一种确定细胞或生物是否是死的的方法,该方法包括:
-对来自细胞或生物体的总核酸进行核酸扩增反应,其中所述核酸扩增包括:
使总核酸样品与一个或多个能够扩增第一基因的基因组DNA和第一基因转录的RNA的引物接触,
使总核酸样品与一种或多种能够扩增细胞或生物中不转录的非编码基因组DNA区域的引物接触;
-分析核酸扩增反应的动力学,以导出(i)与(ii)的比值:
(i)第一基因的所述基因组DNA和RNA转录物,
(ii)所述非编码DNA区域,
其中该比值代表在进行核酸扩增反应之前总核酸样品内存在的(i)和(ii)的相对量;和
-分析该比值以评估细胞或生物的转录活性,其中:
比值为1表示细胞活生物是死的,和
比值大于1表示细胞活生物是或者可能是活的。
实施方案8.根据实施方案7所述的方法,其中比值大于1.5、1.7、1.9、2、2.2、2.4、2.5、2.7、2.9或3表示细胞或生物是活的。
实施方案9.根据实施方案7所述的方法,其中比值小于1.5、1.4、1.3、1.2或1.1表示细胞或生物不是活的。
实施方案10.一种检测细胞中转录扰动的方法,该方法包括:
-对来自细胞或生物体的总核酸进行核酸扩增反应,其中所述核酸扩增包括:
使总核酸样品与一个或多个能够扩增第一基因的基因组DNA和第一基因转录的RNA的引物接触,
使总核酸样品与一种或多种能够扩增细胞或生物中不转录的非编码基因组DNA区域的引物接触;
-分析核酸扩增反应的动力学,以导出(i)与(ii)的比值:
(i)第一基因的所述基因组DNA和RNA转录物,
(ii)所述非编码DNA区域,
其中该比值代表在进行核酸扩增反应之前总核酸样品内存在的(i)和(ii)的相对量;和
-分析该比值以评估细胞或生物的转录活性,其中:
比值为1表示细胞或生物中完全的转录扰动,并且
比值大于1表示细胞或生物中没有转录扰动。
实施方案11.根据实施方案10所述的方法,其中比值大于1.5、1.7、1.9、2、2.2、2.4、2.5、2.7、2.9或3表示细胞或生物中没有转录扰动。
实施方案12.根据实施方案10所述的方法,其中比值小于1.5、1.4、1.3、1.2或1.1表示细胞或生物中有部分或完全的转录扰动。
实施方案13.根据实施方案1至12中任一项所述的方法,其包括在所述核酸扩增反应过程中产生以下的循环阈值(Ct):
(i)所述非编码DNA区域,和
(ii)第一基因的所述基因组DNA和RNA转录物;
并且通过比较所述值导出比值。
实施方案14.根据实施方案1至13中任一项所述的方法,其中该方法包括:
-在核酸扩增反应开始之后,为所述第一基因的所述基因组DNA和RNA转录物产生循环阈值ctA,并为所述非编码DNA区域产生循环阈值CtB;
-使用以下公式计算CtB和ctA值之间的倍数改变:
2CtB-CtA=2ΔCt;和
-使用以下公式生成比值:
2ΔCt/TR
其中TR是细胞的总核酸样品中第一基因的基因组DNA的拷贝与非编码基因组DNA的区域的拷贝的比值。
实施方案15.根据实施方案1至14中任一项所述的方法,其中:
-进行核酸扩增反应进一步包括使总核酸样品与一个或多个能够扩增第二基因的基因组DNA和第二基因转录的RNA的引物接触,和
-分析核酸扩增反应的动力学以导出代表(i)与(ii)的相对量的比值:
(i)所述非编码DNA区域,和
(ii)在进行核酸扩增反应之前,存在于总核酸样品中的第一和第二基因的所述基因组DNA和RNA转录物。
实施方案16.根据实施方案15所述的方法,其中该方法包括:
-在核酸扩增反应开始之后,为所述第一和第二基因的所述基因组DNA和RNA转录物产生循环阈值ctA,并为所述非编码DNA区域产生循环阈值CtB;
-使用以下公式计算CtB和ctA值之间的倍数改变:
2CtB-CtA=2ΔCt
-使用以下公式生成比值
2ΔCt/TR
其中TR是细胞的总核酸样品中第一和第二基因的基因组DNA的拷贝与非编码基因组DNA的区域的拷贝的比值。
实施方案17.根据实施方案1至16中任一项所述的方法,其中所述分析比值包括将该比值与对一系列阴性活阳性对照细胞或生物所进行的方法导出的阈值比值进行比较并导出代表表型的平均阈值比值。
实施方案18.一种检测细胞或生物的耐药性或药物敏感性的方法,该方法包括:
-对从未经过所述药物处理的细胞或生物的第一样品获得的总核酸进行第一核酸扩增反应;和
-对从未经过所述药物处理的细胞或生物的第二样品获得的总核酸进行第二核酸扩增反应;
其中每个所述核酸扩增反应分开进行,并且包括:
使总核酸样品与一个或多个能够扩增第一基因的基因组DNA和第一基因转录的RNA的引物接触,
使总核酸样品与一种或多种能够扩增细胞或生物中不转录的非编码基因组DNA区域的引物接触;
-分析每个所述核酸扩增反应的动力学,以导出(i)与(ii)的第一和第二比值:
(i)第一基因的所述基因组DNA和RNA转录物,
(ii)所述非编码DNA区域,
其中该比值代表在进行核酸扩增反应之前总核酸样品中存在的(i)和(ii)的相对量;和
-比较所述比值以评估细胞或生物是否对药物具有耐药性,其中:
当第一和第二比值相等时表示细胞或生物中的完全的耐药性,和
当第二比值低于第一比值时,表明细胞或生物对药物的敏感性。
实施方案19.根据实施方案18所述的方法,其中当第二比值比第一比值低不超过1%、2%、5%、7.5%、10%、12%、15%或20%时,细胞或生物被视为对药物具有耐药性。
实施方案20.根据实施方案18所述的方法,其中当第二比值比第一比值[大]至少10%、20%、30%、40%或50%时,细胞或生物被视为对药物具有敏感性。
实施方案21.根据实施方案1至20中任一项所述的方法,其中扩增方法选自聚合酶链反应(PCR)、链置换扩增(SDA)、解旋酶依赖性扩增(HDA)、重组酶聚合酶扩增(RPA)、环介导的等温扩增(LAMP)、滚环扩增(RCA)、转录介导扩增(TMA)、自我维持序列复制(3SR)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)及其任何组合。
实施方案22.根据实施方案1至21中任一项所述的方法,其中细胞是哺乳动物细胞、人细胞、植物细胞、细菌细胞、被病毒感染的宿主细胞或被细菌感染的宿主细胞。
实施方案23.根据实施方案1至21中任一项所述的方法,其中生物是细菌、病毒、真菌、藻类、古细菌或原生动物。
本发明通常与研究或诊断实验室中使用的当前程序兼容,并且可以使用相同的样品类型、提取方法和扩增方法。待分析的核酸(例如TNA)可以源自任何合适的来源,例如原核或真核细胞,或来自病毒。本发明可以确定有效转录的存在与否,RNA表达水平的升高或降低或RNA表达水平的不变。
附图说明
现在将参考下面阐述的附图1-12,仅通过非限制性示例来描述本发明的实施方案。
图1:显示VITA PCR中的步骤的示意图。使用总核酸作为模板进行逆转录酶PCR(RT-PCR)。该VITA PCR测定法具有至少一组引物,其能够共扩增特定基因的DNA(DNA-X)和从该基因转录的RNA(RNA-X)。它还包含一组针对不转录成RNA的DNA区域(DNA-N)的引物。在逆转录酶步骤中,将RNA-X复制到cDNA-X中,然后在PCR热循环中将DNA-X、cDNA-X和DNA-N全部扩增。可以通过单个荧光基团通道A读取来自GAT(基因和转录物)的信号(其测量源自DNA-X和RNA-X的扩增子总数),而可以通过第二个荧光基团通道B读取来自NED(不表达DNA)的信号(其测量的是来自DNA-N的扩增子)。样品中GAT和NED之间的循环阈值(Ct)值之差允许估计样品中针对这些靶标观察到的倍数改变(FC),其中FC=2Ct NED-Ct GAT=2ΔCt。假设基因和NED基因座的拷贝数相等,则可以通过将样品中观察到的倍数改变除以不存在有效转录时所预期的理论比值(TR),来计算VITA指数。如果使用一个转录物和基因来测量GAT,并且使用一个DNA序列来测量NED,则TR=(1x DNA-X)除以(1x DNA-Y)=1。如果使用两个转录物和基因(X和Z)来测量GAT,并且使用一个DNA序列(X)来测量NED,则TR=(1x DNA-X+1x DNA-Z)除以(1x DNA-Y)=1。使用一个以上的基因及其转录物测量GAT的能力允许建立测试,以捕获可在细胞周期内不同时间表达的一系列转录物。VITA索引提供了转录活性的标准化量度,可以在样品之间进行比较,而与分析的样品量无关。死的且没有残留RNA的细胞的VITA指数有望接近1;随着有效转录水平的提高,VITA指数也会相应提高。
图2:根据本发明的实施方案的测定的示意图。图2A:此处所述的方法可用于确定细胞或病原体是死的还是活的。死的或活的病原体存在的证据反过来可以提供一种治愈测试(TOC)的方法。该方案包括进行VITA PCR,从TNA扩增GAT和NED,然后使用所得的Ct值计算样品的VITA指数。描绘了假想的扩增曲线。没有有效转录的样品(死细胞)的VITA指数有望达到或接近1。可以使用用于特定VITA PCR分析的经验数据设置阈值,以扩增存在于特定细胞类型和/或特定病原体中的特定GAT和NED组合。活的并正在进行有效转录的细胞的VITA指数将高于阈值。图2B:此处所述的方法可以用于确定药物敏感性或耐药性。样品可以在存在或不存在一种或多种药物的情况下进行拆分和孵育。孵育后提取的TNA可以通过VITAPCR进行分析,以获得处理过和未处理样品的VITA指数,VITA指数之间的比值表明了药物的敏感性或耐药性。描绘了假想的扩增曲线。如果样品对药物敏感,则在存在药物的情况下,样品的VITA指数应低于在不存在药物的情况下。相反,如果样品对药物耐受,则在存在药物的情况下,样品的VITA指数不应低于在不存在药物的情况下而是可能相似。
图3:细胞的免疫荧光染色和PCR分析。如实施例1、处理方案A(1.2.1)中所述,用不同浓度的阿奇霉素处理在HEp-2细胞中生长的沙眼衣原体(血清型D)样品。具体而言,对细胞进行以下处理:i)无抗生素,或ii)低于MIC(<MIC,0.008μg/mL),iii)MIC(0.064μg/mL)或iv)高于MIC(>MIC 0.512μg/mL)。图i显示用于确定未处理的细胞和以每种抗生素剂量处理的细胞的生存力的代表性图像。这些图像是通过对感染的HEp-2细胞进行免疫荧光染色获得的,并使用荧光显微镜IN Cell Analyzer 2200(GE Healthcare Life Sciences)以100倍放大率进行分析。图ii显示了以每毫升包含物形成单位(IFU/mL)的形式测量的每种抗生素剂量处理(在低于(<MIC)、等于(MIC)或高于MIC(>MIC)的浓度)以及未处理的细胞(无抗生素)的定量感染后生存力(PI),其根据图i中获得的图像进行计算。将结果相对于在高于MIC的抗生素浓度下处理的样品获得的值进行标准化。图iii显示来自这些细胞的TNA的分析,它们被衣原体感染,并用一组能够同时扩增主要外膜孔蛋白(omp1)DNA和omp1 RNA的引物扩增。通过RT-PCR(扩增omp1 DNA和RNA)和PCR(仅扩增omp1 DNA)扩增TNA。图iii描绘了倍数改变,即每种抗生素处理剂量(在浓度低于(<MIC)、等于(MIC)或高于MIC(>MIC))以及未处理的细胞(无抗生素)的PCR中omp1 DNA的Ct与RT-PCR中omp1 RNA加上omp1 DNA的Ct之差(ΔCt),以2ΔCt计算。
图4:根据本发明的实施方案的测定的分析。通过扩增RNA或TNA样品分析候选GAT和NED靶标,并比较PCR(仅扩增DNA)和RT-PCR(扩增DNA和RNA)的结果。图i和ii显示使用潜在的GAT引物(omp1)生成的扩增图,其中模板是仅RNA(图i)或TNA(图ii)。显示了仅通过PCR检测的omp1 DNA的Ct(虚线)与通过RT-PCR检测的omp1 DNA加omp1 RNA的Ct(实线)之间的差(ΔCt)。图iii和iv显示使用潜在的NED引物(InfAIGR)的扩增图,其中模板是仅RNA(图iii)或TNA(图iv)。显示了仅通过PCR检测的InfAIGRDNA的Ct(虚线)与通过RT-PCR检测的InfAIGR DNA加InfAIGR 1RNA(如果存在)的Ct(实线)之间的差(ΔCt)。
图5:根据本发明的实施方案的测定的分析。通过VITA PCR分析衣原体。图i显示如实施例1所述和图3的图i和ii所示的未处理细胞(无抗生素)和每种抗生素处理剂量的VITA指数。此VITA PCR从TNA扩增而来,并在单个RT-PCR反应中使用一个基因及其转录物来测量GAT并使用一个不转录DNA区域来测量NED。图i显示在图3的图i和ii中分别成像、定量和描绘的来自样品的RT-PCR数据。图ii显示通过VITA PCR分析衣原体。未处理细胞(无抗生素)和每种抗生素治疗剂量的VITA指数。该VITA PCR在同一RT-PCR中扩增了一个基因的两个扩增子及其转录物(2GAT)和一个不转录NED,因此TR为2(2GAT除以1NED)。
图6:根据本发明的一个实施方案的测定法和分析。从患者尿液样本中分析衣原体VITA PCR。图i示意性地描述了样品制备的过程。图ii显示了与通过培养方法获得的阳性(活菌)和阴性(非活菌)衣原体参考样品相比,来自患者尿液样本中衣原体表达的分析。
图7:根据本发明的实施方案的测定和分析。通过VITA PCR对应答抗生素的短时间孵育的衣原体表达进行分析。图i示意性地描述了样品制备的过程,其中测试样品未经处理(无药物)或用各种抗生素(加药物)处理,然后在室温下或在37℃下5%CO2孵育各种时间间隔。然后从所有样品和时间点提取TNA,并通过VITA PCR扩增。图ii显示通过对每个处理组使用(深灰色)和不使用(浅灰色)阿奇霉素的TNA进行分析而获得的VITA指数。条形上方显示了VITA指数(ΔVITA)加上和减去阿奇霉素的比值。与该药物在37℃下孵育1小时或6小时后,VITA指数显著降低,表明样品对阿奇霉素敏感,这导致转录水平降低。ΔVITA比值的大小可能反映特定时间和特定条件下孵育后的杀死程度。图iii显示了通过每个处理组的TNA分析获得的VITA指数,柱上方显示了VITA指数的比值(ΔVITA)。在37℃下用0.128μg/mL的阿奇霉素处理30分钟和1小时后,VITA指数下降,表明样品对这种抗生素敏感,这反映为转录水平降低。图iv显示了用0.256μg/mL的利福平处理时,药物敏感菌株和耐药菌株的每个处理组的TNA分析获得的VITA指数。在37℃下孵育5分钟后,对药物敏感菌株进行抗生素处理后,VITA指数下降,表明样品对抗生素敏感。除此之外,在存在利福平的情况下,在相同条件下抗性菌株的VITA指数在任何时间点均没有显著变化,表明样品确实对抗生素具有耐药性。图v显示了用0.256μg/mL的利福平室温处理15分钟时,已知药物敏感菌株和耐药菌株的每个处理组的TNA分析获得的VITA指数。有药物存在时,药物敏感菌株的VITA指数显示VITA指数显著下降,这与对利福平的敏感性一致;在相同条件下,抗性菌株的VITA指数显示VITA指数显著提高,反映了对利福平的耐药性。
图8:根据本发明的实施方案的测定和分析。通过VITA PCR对应答递增剂量的抗生素的衣原体进行分析。图i示意性地描述了样品制备的过程,其中不使用和用不同浓度的相同抗生素(阿奇霉素)处理,在37℃、5%CO2供应下孵育1小时,从未经处理的样品中提取TNA以及用不同浓度的抗生素处理过的样品。图ii显示了通过对每种剂量的抗生素并使用苯酚:氯仿:异戊基提取进行TNA分析而获得的VITA指数。在比较组上显示了处理后的样品与未处理的样品之间的统计差异。抗生素处理后VITA指数下降表明样品对所用抗生素敏感。VITA指数显示随着阿奇霉素浓度的增加而降低(分别为0.128μg/mL、0.192μg/mL和0.256μg/mL),这种相关性得到R2=0.98。图iii显示了通过对每种剂量的抗生素并使用基于柱的提取试剂盒提取进行TNA分析而获得的VITA指数。在处理组上显示了处理后的样品与未处理的样品之间的统计差异。抗生素治疗后VITA指数的下降表明样品对阿奇霉素敏感,VITA指数分别与所用抗生素剂量0.128μg/mL、0.192μg/mL、0.256μg/mL和0.512μg/mL相关,得到R2=0.83。
图9:根据本发明的实施方案的测定的分析。应答各种抗生素的短暂孵育,使用从一系列以前表征为对特定抗生素敏感和耐药的菌株中提取的TNA,通过VITA PCR分析衣原体。图i描绘了对于每个处理组通过VITA PCR分析TNA之后,针对所测试的每种菌株(菌株1-3和5)获得的VITA指数。用阿奇霉素(0.256μg/mL)处理后,VITA指数下降表明所有菌株均对抗生素敏感,并引起转录破坏。在比较样品上显示了处理后的样品与未处理的样品之间的统计差异。图ii示例了对于每个处理组分析TNA之后,针对所测试的每种菌株(菌株1-3和5)获得的VITA指数。用强力霉素(0.256μg/mL)处理后,VITA指数下降表明所有菌株均对抗生素敏感,并引起转录活性遭到破坏。在比较样品上显示了处理后的样品与未处理的样品之间的统计差异。图iii显示了对于每个处理组使用抗生素利福平(0.256μg/mL)分析TNA之后,针对所测试的每种菌株(菌株1-5)获得的VITA指数。处理后VITA指数下降表明菌株1-4均对抗生素敏感,并引起转录活性遭到破坏。在比较组上显示了处理后的样品与未处理的样品之间的统计差异。在未处理和已处理的样品中,用菌株5获得的VITA指数均无显著差异,反映了该特定菌株对利福平的耐药性。图iv显示了根据图iii中所述的利福平处理的每种菌株的每个重复试验计算出的ΔVITA比值。根据细胞的药物敏感性谱将细胞分组,与抗性细胞相比,药物敏感细胞产生更大的ΔVITA比值。
图10:根据本发明的实施方案的测定的示意图。假设实例展示了直接从临床标本中进行抗生素敏感性测试的过程,可以在不使用药物的情况下或在阿奇霉素、头孢曲松和强力霉素的存在下进行孵育,并进一步测试沙眼衣原体(CT)、淋病奈瑟氏球菌(Neisseriagonorrhoeae)(GC)和生殖道支原体(Mycoplasmagenitalium)(MG)GC-dual与双重抗生素治疗有关。
图11:根据本发明的实施方案的测定的分析。衣原体TNA样品的VITA PCR分析,其中包含不同数量的活的生物。图i说明了从每个样品中获得的VITA指数,所述样品在没有生存力的衣原体的背景中含有确定百分比的活的衣原体。显示没有生存力的样品和活的样品之间的统计学差异。图ii描述了每个测试样品中GAT1/2和NED的平均Ct值。
图12:根据本发明的实施方案的测定的分析。通过另一种VITAPCR系统分析TNA样品中的衣原体,该系统针对GAT1和GAT 2的更长区域。它显示根据实施例1和图3的图i和ii所示的未处理细胞(无处理)和每种抗生素处理剂量的VITA指数。该VITA PCR在同一反应中扩增了一个基因的两个长扩增子及其转录物(2GAT)和一个不转录NED,因此TR为2。
具体实施方式
定义
除非上下文另外明确指出,否则本申请中使用的单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数引用。例如,短语“多核苷酸”也包括多个多核苷酸。
如本文所用,术语“包含(comprising)”是指“包括(including)”。单词“包含(comprising)”的变形,例如“包含(comprise)”和“包含(comprises)”,具有相应变化的含义。因此,例如,“包含”核苷酸序列的多核苷酸可以仅由该核苷酸序列组成或可以包括一个或多个另外的核苷酸。
如本文所用,术语“循环阈值”、“循环阈值的值”、“阈值循环”、“阈值循环的值”、“Ct”和“Ct值”可互换使用并且具有相同的含义,即在核酸扩增反应中产生可检测量的扩增子所需的扩增循环数。
如本文所用,除非另外明确指出,否则当在核酸的上下文中使用时,术语“扩增”应理解为涵盖能够产生一个或多个核酸模板序列的拷贝的任何反应。合适的反应的非限制性实例包括聚合酶链反应(PCR)、链置换扩增(SDA)、解旋酶依赖性扩增(HDA)、重组酶聚合酶扩增(RPA)、环介导的等温扩增(LAMP)、滚环扩增(RCA)、转录介导扩增(TMA)、自我维持序列复制(3SR)以及基于和核酸序列的扩增(NASBA)。
如本文所使用的,术语“定量值”旨在涵盖给定因子的数量的任何量度,包括例如扩增反应产物的定量量度(例如,通过Ct值、通过扩增子拷贝数等)。
如本文所用,术语“多个”是指多于一个。在某些具体方面或实施方案中,多个可以是指2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51个或更多个,以及其中可导出的任何整数,以及其中可导出的任何范围。
如本文所用,术语“受试者”包括具有经济、社会或研究重要性的任何动物,包括牛、马、羊、灵长类、禽和啮齿类物种。因此,“受试者”可以是哺乳动物,例如人或非人哺乳动物。还包括微生物受试者,包括但不限于细菌、病毒、真菌/酵母、原生生物和线虫。根据本发明的“受试者”还包括传染原,例如病毒。
如本文所用,术语“多核苷酸”和“核酸”可以互换使用,并且是指脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸碱基或其类似物、衍生物、变体、片段或组合的单链或双链聚合物,包括但不限于DNA、甲基化DNA、烷基化DNA、RNA、甲基化RNA、微RNA、siRNA、shRNA、mRNA、tRNA、snoRNA、stRNA、smRNA、pre-微RNA和pri-微RNA,其他非编码RNA、核糖体RNA及其衍生物、其扩增子或其任何组合。作为非限制性实例,核酸的来源可以选自包括合成的、哺乳动物的、人的、动物的、植物的、真菌的、细菌的、病毒的、古细菌的或其任何组合的组。除非另有说明,否则术语“多核苷酸”和“核酸”、“寡核苷酸”包括提及任何指定的序列以及与其互补的序列。
如本文所用,术语“总核酸”是指含有RNA和DNA的样品。
如本文所用,术语“GAT”是“基因和转录物(Gene And Transcript)”的首字母缩写,并且是指来自一个基因的DNA和从该基因转录的RNA或一组基因的DNA和从那些基因转录的RNA的组合测量。如本文所用,术语“NED”是“不表达DNA(Non-expressed DNA)”的首字母缩写,并且是指源自未转录成RNA的区域的DNA的测量。
如本文所用,术语“寡核苷酸”是指DNA或含DNA的核酸分子或RNA或含RNA的分子或其组合的片段。寡核苷酸的实例包括核酸靶标;寡核苷酸;底物,例如可以被MNA酶修饰的底物;引物,例如用于通过PCR等方法进行体外靶标扩增的引物;和MNA酶的组分。除非另有说明,否则术语“寡核苷酸”包括提及任何指定的序列以及与其互补的序列。寡核苷酸可包含至少一个添加或取代,包括但不限于包括4-乙酰基胞苷、5-(羧基羟基甲基)尿苷、2'-O-甲基胞苷、5-羧甲基氨基甲基硫代尿苷、二氢尿苷、2'-O-甲基伪尿苷、βD-半乳糖基肌苷、2'-O-甲基鸟苷、肌苷、N6-异戊烯基腺苷、1-甲基腺苷、1-甲基伪尿苷、1-甲基鸟苷、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鸟苷、2-甲基腺苷、2-甲基鸟苷、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-甲基腺苷、7-甲基鸟苷、5-甲基氨基甲基尿苷、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿苷、βD-甘露糖基甲基尿苷、5-甲氧基羰基甲基尿苷、5-甲氧基尿苷、2-甲基硫代-N6-异戊烯基腺苷、N-((9-β-呋喃核糖基-2-甲基硫嘌呤-6-基)氨基甲酰基)苏氨酸、N-(((9-β-呋喃核糖基嘌呤-6-基)N-甲基氨基甲酰基)苏氨酸、尿苷-5-氧乙酸甲酯、尿苷-5-氧乙酸(v)、维丁氧嘧啶、假尿苷、奎宁、2-碘胞苷、5-甲基-2-硫尿苷、2-硫尿苷、4-硫尿苷、5-甲基尿苷、N-((9-β-D-呋喃呋喃糖基嘌呤-6-基)氨基甲酰基)苏氨酸、2'-O-甲基-5-甲基尿苷、2'-O-甲基尿苷,怀丁苷、3-(3-氨基-3-羧丙基)尿苷、βD-阿拉伯糖基尿苷、βD-阿拉伯糖基胸苷的组。
如本文所用,术语“互补的”和“互补性”是指核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或其组合)经由Watson-Crick碱基配对或摆动碱基配对彼此杂交的能力。可以通过腺嘌呤(A)碱基和尿嘧啶(U)碱基之间、腺嘌呤(A)碱基和胸腺嘧啶(T)碱基之间、胞嘧啶(C)碱基和鸟嘌呤(G)碱基之间的沃森-克里克碱基配对来形成键。摆动碱基对是多核苷酸双链体(例如鸟嘌呤-尿嘧啶、肌苷-尿嘧啶、肌苷-腺嘌呤和肌苷-胞嘧啶)中两个核苷酸之间的非沃森-克里克碱基对。称为“互补”或彼此为“互补”的核苷酸是具有通过沃森-克里克碱基对或通过其各自碱基之间的摆动碱基对杂交在一起的能力的核苷酸。
如本文所用,“酶”是指可以催化化学反应(例如,多核苷酸的扩增、多核苷酸的裂解等)的任何分子。
如本文所用,“靶标扩增”是指扩增靶标核酸的任何方法,包括但不限于聚合酶链反应(PCR)、链置换扩增(SDA)、解旋酶依赖性扩增(HDA)、重组酶聚合酶扩增(RPA)、环介导的等温扩增(LAMP)、滚环扩增(RCA)、转录介导扩增(TMA)、自我维持序列复制(3SR)、基于核酸序列的扩增(NASBA)或逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)。
如本文所用,“扩增子”是指天然或人工核酸扩增或复制事件的产物的核酸(例如DNA或RNA或其组合),包括但不限于PCR、RT-PCR、SDA、HDA、RPA、LAMP、RCA、TMA、3SR或NASBA。
如本文所用,术语“核酸酶”、“催化核酸”、“具有催化活性的核酸”和“催化核酸酶”在本文中可互换使用,并且是指可识别至少一种底物并催化至少一种底物的修饰(例如连接或裂解)的DNA或含DNA的分子或复合物,或包含RNA或RNA的分子或复合物或其组合(即DNA-RNA杂合分子或复合物)。催化核酸中的核苷酸残基可以包括碱基A、C、G、T和U,以及其衍生物和类似物。上面的术语包括单分子核酸酶,其可以包含可识别至少一种底物并催化至少一种底物的修饰(例如连接或裂解)的单个DNA或含DNA的分子(本领域中也称为“DNA酶”、“脱氧核糖酶”或“DNA酶”)或RNA或含RNA的分子(本领域中也称为“核酶”)或其组合(DNA-RNA杂合分子)。上面的术语包括核酸酶,其包含可识别至少一种底物并催化至少一种底物的修饰(例如连接或裂解)的单个DNA或含DNA的复合物或RNA或含RNA的复合物或其组合(DNA-RNA杂合复合物)。术语“核酸酶”、“催化核酸”、“具有催化活性的核酸”和“催化核酸酶”在其含义内包括MNA酶。
如本文所用,术语“MNA酶”和“多组分核酸酶”具有相同的含义,并且是指两个或多个寡核苷酸序列(例如,部分酶(partzyme)),它们仅在存在MNA酶组装促进剂(例如靶标),形成能够催化修饰底物的活性核酸酶。MNA酶可催化一系列反应,包括底物的裂解、底物的连接和一种或多种底物的其他酶修饰。MNA酶在本领域中也称为“PlexZyme”。仅当部分酶A和B的传感器臂在组装促进剂上彼此相邻杂交时,才会形成MNA酶。MNA酶的底物臂与底物结合,其修饰(例如裂解)由MNA酶的催化核心催化,该核心由部分酶A和B的催化域相互作用而形成。DNA/RNA嵌合报告底物的裂解。MNA酶可以在荧光团和淬灭染料对之间裂解底物,从而产生信号。术语“多组分核酸酶”和“MNA酶”包括由两个分子组成的二分结构,或由三个核酸分子组成的三分结构,或其他多分结构,例如由四个或更多个核酸分子形成的那些。
应当理解,本文所用的术语“MNA酶”和“多组分核酸酶”涵盖所有已知的MNA酶和修饰的MNA酶,包括公开于PCT专利公开号WO/2007/041774、WO/2008/040095、WO2008/122084以及相关的美国专利公开号2007-0231810、2010-0136536和2011-0143338(这些文件中每个文件的内容均通过引用整体并入本文)中的一篇或更多篇中的那些。术语“MNA酶”和“多组分核酸酶”所涵盖的MNA酶和修饰的MNA酶的非限制性实例包括具有裂解催化活性的MNA酶(如本文所示),包含一种或多种组装抑制剂的MNA酶的分解或部分组装的MNA酶,包含一种或多种适体的MNA酶(“适体-MNA酶”),包含一个或多个截短的传感器臂和任选地一种或多种稳定寡核苷酸的MNA酶,包含一种或多种活性抑制剂的MNA酶,多组分核酸非活性酶(MNAi)和具有连接酶催化活性的MNA酶(“MNA酶连接酶”),在WO/2007/041774、WO/2008/040095、WO2008/122084、US 2007-0231810、US 2010-0136536和/或US 2011-0143338中的一篇或更多篇中详细记载了其中的每一种。
如本文所用,术语“部分酶”、“组分部分酶”和“部分酶组分”是指含DNA或含RNA或含DNA-RNA的寡核苷酸,其中两个或更多个仅在存在如本文所定义的MNA酶组装促进剂的情况下,能够一起形成“MNA酶”。在某些优选的实施方案中,一种或多种(优选至少两种)组分部分酶可包含三个区域或结构域:形成催化修饰的催化核心的一部分的“催化”结构域;可以与组装促进剂缔合和/或结合的“传感器臂”结构域;和可以与底物缔合和/或结合的“底物臂”结构域。部分酶可以包含至少一种另外的组分,包括但不限于适体,在本文中称为“适体-部分酶”。部分酶可以包括多种组分,包括但不限于具有截短的传感器臂的一部分酶组分和通过与组装促进剂或底物相互作用来稳定MNA酶结构的稳定臂组分。
如本文所用,术语“组装促进剂”和“MNA酶组装促进剂”是指可通过与MNA酶的传感器臂相互作用而促进组分部分酶的自组装以形成催化活性的MNA酶的实体。如本文所用,组装促进剂可以促进具有裂解、连接酶或其他酶活性的MNA酶的组装。在优选的实施方案中,MNA酶的自组装需要组装促进剂。组装促进剂可以由一个分子组成,或者可以由可以与一种或多种寡核苷酸“部分酶”的传感器臂配对或结合的两个或多个“组装促进剂组分”组成。组装促进剂可以包含一种或多种核苷酸组分,其不与MNA酶的传感器臂共享序列互补性。组装促进剂可为靶标。靶可以是选自以下的核酸:DNA、甲基化DNA、烷基化DNA、RNA、甲基化RNA、微RNA、siRNA、shRNA、tRNA、mRNA、snoRNA、stRNA、smRNA、pre-微RNA和pri-微RNA、其他非编码RNA、核糖体RNA,其衍生物,扩增子或其任何组合。核酸可以是“扩增子”并且扩增可包含以下一种或多种:PCR、RT-PCR、SDA、HDA、RPA、LAMP、RCA、TMA、3SR、NASBA或连接酶链反应。
如本文所用,术语“可检测的效果”是可以被检测或定量为已发生底物修饰的指示的效果。效果的大小可以指示诸如组装促进剂(例如靶标)的输入量。可以通过多种方法来检测可检测的效果,包括荧光光谱法、表面等离子体共振、质谱法、NMR、电子自旋共振、极化荧光光谱法、圆二色性、免疫测定法、色谱法、放射线法、光度法、闪烁显像法、电子方法、电化学方法、UV、可见光或红外光谱、酶促方法或其任何组合。
本文所用的术语“底物”包括脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸碱基或其类似物,衍生物,变体,片段或组合的任何单链或双链聚合物,包括但不限于DNA、甲基化DNA、烷基化DNA、RNA、甲基化的RNA、微RNA、siRNA、shRNA、mRNA、tRNA、snoRNA、stRNA、smRNA、pre-微RNA和pri-微RNA、其他非编码RNA、核糖体RNA,其衍生物,其扩增子或其任何组合(包括脱氧核糖核苷酸的混合聚合物和核糖核苷酸碱基),能够被包括催化核酸酶在内的酶识别、作用或修饰。“底物”可以通过各种酶活性来修饰,包括但不限于裂解或连接。“多核苷酸底物”或“底物”的修饰可以提供用于监测酶催化活性的“可检测的作用”。
如本文所用,“报告底物”是特别适于促进与催化反应有关的底物消失或产物外观的测量的底物。报告底物可以在溶液中自由或结合(或“束缚(tether)”)在例如表面或另一分子上。报告底物可以通过多种手段中的任何一种来标记,包括例如荧光团(具有或不具有一种或多种其他组分,例如猝灭剂)、放射性标记、生物素(例如生物素化)或化学发光标记。
如本文所用,术语“探针”是指用于检测靶核酸的寡核苷酸。探针的非限制性实例包括TaqMan探针;分子信标探针;以及能够被核酸酶催化修饰的核酸酶底物。
如本文所用,术语“碱基”将被理解为具有与术语“核苷酸”相同的含义。
本文中对现有技术文件的任何描述,或本文中衍生自或基于这些文件的声明,均不承认该文件或衍生的声明是相关技术的公知常识的一部分。
为了描述的目的,除非另外说明,否则本文所指的所有文件均通过引用全文并入本文。
缩写
在本文中和在整个说明书中使用以下缩写:
GAT:基因和转录物(Gene And Transcript)
NED:不表达的DNA(Non-Expressed DNA)
FC:倍数改变
TR:理论比值
Ct:阈值循环/循环阈值
DMEM:Dulbecco的改良Eagle培养基
LLE:液液提取
MOI:感染复数
PI:感染后
PT:处理后
TNA:总核酸
IF:免疫荧光
IFU:包涵体形成单位
MIC:最低抑菌浓度
TOC:治愈测试
NAAT:核酸扩增技术
STI:性传播感染
AMR:抗菌素耐药性
EMA:单叠氮化乙锭
PMA:单叠氮化丙锭
MNA酶:多组分核酸酶或多部分核酸酶;
部分酶:含有部分酶的寡核苷酸;
ave;平均
PCR:聚合酶链反应;
gDNA:基因组DNA
dsDNA:双链DNA
rc:反向互补
NTC:无模板对照
qPCR:实时定量PCR
R2;相关系数
nM;纳摩尔
mM;毫摩尔
μL;微升
dNTP;脱氧核糖核苷酸三磷酸
NF-H2O:无核酸酶的水;
F:荧光团;
Q:淬灭剂;
N=A、C、T、G或其任何类似物;
N’=与N互补或能与N碱基配对的任何核苷酸;
W:A或T;
R:A、G或AA;
rN:任何核糖核苷酸碱基;
rR:A或G;
rY:C或U;
M:A或C;
H:A、C或T;
D:G、A或T;
JOE或6-JOE:6-羧基-4',5'-二氯-2',7'-二甲氧基荧光素;
FAM或6-FAM:6-羧基荧光素
BHQ1:黑洞猝灭剂1
BHQ2:黑洞猝灭剂2
RT-PCR:逆转录聚合酶链反应
SDA:链置换扩增
HDA:解旋酶依赖性扩增
RPA:重组酶聚合酶扩增
LAMP:环介导的等温扩增
RCA:滚环扩增
TMA:转录介导的扩增
3SR:自我维持序列复制
NASBA:基于核酸序列的扩增
IB:IowaFQ
IBR:IowaRQ
mRNA:信使RNA
tRNA:转运RNA
rRNA:核糖体RNA
详述
以下详述足够详细地传达了本发明的示例性实施方式,以使本领域普通技术人员能够实践本发明。所描述的各种实施例方案的特征或限制并不必然限制本发明的其他实施方案或整个本发明。因此,以下详述不限制本发明的范围,本发明的范围仅由权利要求书限定。
本发明提供了能够检测细胞、生物、病毒等中转录的存在、不存在和/或干扰的方法。所述方法可用于例如检测有效转录的存在或不存在;检测对试剂或疾病状态有反应的转录水平的扰动或变化;检测含有死亡细胞和相关细胞碎片的样品中是否没有有效转录;和/或区分活细胞和死细胞。作为非限制性实例,当受试者感染细菌时,可以施用抗生素以清除感染。对于此类感染,进行治愈测试(TOC)以确保成功清除细菌是期望的。先前报道的用于测量细菌生存力的方法包括用于测量细菌RNA或细菌DNA的方案。这些方法的问题在于,与死细胞或细胞碎片相关的残留RNA和/或DNA在细胞死亡和治愈后可能会持续相当长的时间。此外,尝试使用DNA标准化RNA水平的方法(例如AST)要求对提取的核酸进行准确定量。
除其他事项外,本发明提供了用于区分含有经历有效转录的活细胞或病原体的标本和含有死细胞或核酸碎片的标本的改进方法。此外,本发明提供了用于标准化与表达的RNA的测量有关的数据的改进方法,该方法允许样品间比较,而无需定量每个样品中存在的总TNA的浓度。因为该方法允许样品间比较和阐明上调或下调,所以使用本发明产生的数据可以以热图的形式表示。
Vita指数
该策略涉及扩增特定基因及其RNA转录物,然后将针对已知不转录的特定DNA序列进行标准化。在RT-PCR过程中,靶向特定转录物的引物也会扩增从其转录的基因。基因及其相关转录物的量度在本文中称为GAT(基因和转录物,Gene And Transcript)。此外,在RT-PCR过程中,如果存在未转录成RNA的DNA区域的引物,则该DNA也只能被扩增。这被称为NED(不表达的DNA,Non-Expressed DNA)。用于同时估算GAT和NED的靶标扩增方案称为VITA(可行转录分析,Viable Transcript Analysis)测试,因此,当通过PCR进行扩增时,该方法称为VITA PCR。
VITA PCR的分析可以测量有效转录水平,可以通过各种方式进行计算。举例来说,该数据可用于获得VITA指数,该指数等于样品的倍数改变(FC),该倍数计算为2ΔCt除以在没有有效转录的情况下(仅残留DNA)预期的理论比值(TR)。例如,样本中GAT和NED之间Ct值的差异可以估算GAT(DNA加RNA)与仅DNA(NED)的FC,其中FC=2ΔCt=2(Ct NED–Ct GAT)。在没有从GAT有效转录的情况下,预期的TR等于计算GAT时扩增的基因数除以扩增后的序列数,从而计算出NED。假设测量单个DNA序列的NED,那么如果GAT测量单个基因的扩增,则TR=GAT引物组的数量除以NED引物组的数量=1/1=1;如果GAT测量两个基因(或区域)的扩增,则TR=2/1=2,如果GAT测量三个基因的扩增,则TR将为3/1=3,依此类推。例如,对于Ct(GAT)为10和Ct(NED)为13的样品,其VITA指数的FC值=2ΔCt=23=8,这将得到VITA指数为8(如果TR=1)或VITA指数4(如果TR=2)。
VITA指数提供了一种与细胞群体有关的转录活性的量度,无论细胞是(i)存活、(ii)死亡(有或没有完全清除残留但已检测到的低水平核酸)还是(iii)由于外部刺激例如化合物或药物的存在而在一定程度的代谢压力下,该指数均是有效的。
该方法克服了以前的研究人员遇到的问题,以前的研究人员试图使用RNA或DNA作为活细胞存在的标志物。这些研究已经表明,在某些情况下,RNA和/或DNA可以在细胞死亡后持续数周。VITA指数提供了一种测量每个基因拷贝的活性转录水平的方法,可用来确定是否存在活的生物。举例来说,该方案可用于评估已接受抗生素治疗细菌感染的患者的治愈测试(TOC)。
此外,该方法可以测量转录活性的更多细微扰动。例如,如果在存在对细胞生存力和/或生活力具有有害影响的化合物的情况下孵育细胞,则可以使用VITA指数定量该化合物的影响。该测量将有用的一个应用示例是在抗生素存在下孵育含有感染性细菌的标本并使用VITA PCR进行分析的情况。如果细菌对抗生素敏感,则VITA指数会降低。相反,如果细菌对抗生素具有耐药性,则该指数不会发生明显变化。
扩增反应
本发明的方法可以应用于对核酸扩增反应产生的产物进行定量测量。可以使用能够从靶DNA和/或靶RNA(例如mRNA)序列产生扩增子的任何核酸扩增反应。例如,可以使用聚合酶链反应(PCR)扩增,例如逆转录酶PCR(RT-PCR)、定量PCR(qPCR)和/或数字PCR(dPCR)。合适的扩增反应的其他非限制性实例包括链置换扩增(SDA)、环介导的等温扩增(LAMP)、滚环扩增(RCA)、重组酶聚合酶扩增(RPA)、解旋酶依赖性扩增(HDA)、基于链侵入的扩增(SIBA)、转录物介导的扩增(TMA)、自我维持序列复制(3SR)、基于核酸序列的扩增(NASBA)及其组合。
可以使用本领域已知的任何合适方法对扩增反应产生的产物进行定量测量。该方法可以例如基于扩增子拷贝数、循环阈值(Ct)等,并且例如涉及测量荧光。
测试受试者
本发明的方法可以应用于其中感兴趣的转录程度的任何合适的受试者(例如,作为对转录水平、转录的扰动、生存力、死亡、对试剂如药物和其他化合物等的反应中的任何一个或多个的量度)。
在一些实施方案中,受试者是细胞或细胞群。这些细胞可以是单细胞生物(例如细菌、古细菌、原生动物、单细胞藻类、单细胞真菌、单细胞变形虫)。在其他实施方案中,受试者是病毒。
根据本发明的方法分析的细胞和病毒可以是生物样品的组分。生物样品的非限制性实例包括全血或其组分(例如血细胞、血浆、血清)、尿液、唾液、淋巴液、胆汁、痰、眼泪、脑脊液、支气管肺泡灌洗液、滑液、精液、腹水、母乳和脓液。
示例性实施方案
在一些实施方案中,本发明提供了确定组合转录标准化值(nV±)的方法,其预测细胞、生物或病毒(等等)中转录活性的存在或不存在。可以应用类似的方法来确定两个样品群体之间的转录活性差异,例如已知对(i)对药物具有耐药性和(ii)对药物敏感的细胞、生物或病毒的群体。
仅作为非限制性实例:
可以将nV±计算为nV+的左尾检验的临界点和nV-的右尾检验的临界点之间的中点,两者的置信度均为95%。
nV±=((nV+-1.645*δ+)+(nV-+1.645*δ-))/2
其中:
nV+是获得自已知具有转录活性的细胞、生物或病毒群体的个体的nV值的平均值。
nV-是获得自已知不具有转录活性的细胞、生物或病毒群体的个体的nV值的平均值。
δ+是获得自已知具有转录活性和临界点的细胞、生物或病毒群体的个体的nV值的标准偏差。
δ-是获得自已知不具有转录活性的细胞、生物或病毒群体的个体的nV值的标准偏差。
实施例
现在将参考以下具体实施例描述本发明,这些具体实施例不应以任何方式构成限制。
实施例1:在存在或不存在抗生素的情况下体外产生衣原体样品,使用免疫荧光分析生存力,以及从样品中提取TNA的方法。
1.1培养
沙眼衣原体(血清型D,实验室菌株UW-3/Cx)样品在HEp-2细胞中生长,未经处理(未与抗生素阿奇霉素一起孵育)以产生“活细菌”的阳性对照,或用阿奇霉素不同浓度孵育以制备可模拟死亡细菌的样品。(阿奇霉素是衣原体生殖器感染的一线治疗)。条件如下:
人上皮细胞系(HEp-2)(CCL-23TM)在补充了10%热灭活胎牛血清(FBS)(Sigma-Aldrich)、100mg/mL链霉素(Invitrogen Corporation)、50mg/mL庆大霉素(LifeTechnologies)和20mM谷氨酰胺(Sigma Aldrich)的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)(Sigma-Aldrich)中生长,其在37℃与5%CO2孵育。将沙眼衣原体(血清型D)以为1的感染复数(MOI)接种在HEp-2单层上,该单层存在于平底6孔板(Thermo Fisher)上。通过在28℃的温度下以500g离心辅助接种30分钟来完成感染,然后在上述条件下孵育。
1.1.1处理方案A
感染后(PI)4小时,用各种剂量的抗生素阿奇霉素(Sigma Aldrich)替换DMEM,然后在37℃与5%CO2孵育直到收获。使用的不同抗生素浓度为:i)无抗生素(0μg/mL),ii)<MIC(0.008μg/mL),iii)MIC(0.064μg/mL)和iv)>MIC(0.512μg/mL)。为这些实验选择的“MIC剂量”比使用当前菌株在实验室中观察到的略高;但是,特别选择了这种方法以确保可再现地杀死细菌。使用的剂量也与文献中记载的MIC分析一致。感染后44小时,使用蔗糖-磷酸-谷氨酸盐(SPG)缓冲液(250mM蔗糖、10nM磷酸钠和5mM L-谷氨酸盐)收获细胞。保留一半体积用于通过免疫荧光染色生存力计数(参见1.2生存力/免疫荧光染色);保留另一半体积用于提取TNA和/或RNA。样品储存在-80℃,直到进一步处理。每种条件一式三份培养。
1.1.2处理方案B
感染后4小时后,加入D-环己酰亚胺替换DMEM,并继续孵育。一旦处于指数生长期,即感染后24小时,就进行处理。通过为每种感染更换DMEM,并添加i)无抗生素或ii)抗生素含量高于阿奇霉素的MIC(0.128μg/mL),来实现。然后,使用SPG缓冲液在处理后(PT)的30分钟、1小时或6小时内收集样品,并在-80℃下保存直至进一步处理。
1.1.3处理方案C
感染后,在4小时的时间点培养基没有变化,基本上形成了不同步的群体,这与体内条件更为相似。一旦处于指数生长期,即感染后20小时,就进行处理。通过为每个孔更换DMEM,并添加i)无抗生素或ii)抗生素(0.256μg/mL的利福平),来实现。然后将样品在37℃和5%CO2中孵育,处理后5分钟后收集;或在室温下孵育,处理后15分钟后收获。使用SPG缓冲液收获,然后立即提取TNA。用于该治疗方案的菌株为:菌株1)对利福平敏感的血清型D实验室菌株(UW-3/Cx),和菌株5)对利福平具有耐药性的实验室产生的突变菌株血清型L2。
1.1.4处理方案D
感染后,在4小时的时间点培养基没有变化。一旦进入指数生长期,即感染后20或24小时,即可通过用添加所需量的抗生素替换每个孔中的DMEM的不同剂量的阿奇霉素来处理细胞。添加到感染中的抗生素治疗剂量为:i)无抗生素,ii)0.128μg/mL,iii)0.192μg/mL,iv)0.256μg/mL和v)0.512μg/mL。然后将样品在37℃和5%CO2中温育,并使用SPG缓冲液在处理后1小时收获,并保存在-80℃直至进一步处理或收获后立即提取。
1.1.5处理方案E
感染后,在4小时的时间点培养基没有变化。一旦进入指数生长期,即感染后20小时,就用单剂量的不同抗生素处理细胞。使用的抗生素为i)阿奇霉素,ii)强力霉素和iii)利福平,剂量均为0.256μg/mL。用于该处理方案的菌株为:菌株1)血清型D实验室菌株(UW-3/Cx),菌株2)血清型L2野生型菌株(434/Bu),菌株3)对甲氧苄啶具有耐药性的实验室产生的突变菌株血清型L2,菌株4)对壮观霉素具有耐药性的实验室产生的突变菌株血清型L2和菌株5)对利福平具有耐药性的实验室产生的突变菌株血清型L2。使用文献中记录并在下表中列出的标准程序,预先确定所有血清型和每种抗生素的MIC。根据MIC分析(表1),所有使用的菌株均对阿奇霉素和强力霉素抗生素敏感。菌株1、2、3和4也对利福平敏感,而菌株5对相同的抗生素具有耐药性。然后将样品在37℃和5%CO2中温育,并使用SPG缓冲液在处理后1小时收获,并立即提取。对于每种条件,获得了两个生物学重复。
表1:用于抗生素药敏试验的抗生素的最低抑菌浓度(MIC)
1.1.6处理方案F
感染后4小时,用添加的环己酰亚胺(1μg/mL)代替DMEM,以同步感染并阻止宿主细胞产生蛋白质。在这一时间点,还添加了抗生素,其中一半的孔未处理,另一半的孔则用高剂量的抗生素阿奇霉素处理。再次将细胞在37℃和5%CO2下孵育,直到收获。使用的不同条件是:i)无抗生素代表“活的CT”或ii)加抗生素(0.512μg/mL)–代表“死的CT”。感染后44小时,使用SPG缓冲液收获细胞,并以不同比例混合以产生具有可变百分比的存活细胞和非存活细胞的样品,如下表所示。保留一半体积用于通过免疫荧光染色生存力计数(参见1.2生存力/免疫荧光染色;数据未包括);保留另一半体积用于提取TNA。然后将这些储存在-80℃,直到进一步处理。
1.2生存力/免疫荧光染色
连续收获用于生存力计数的样品,进行稀释并在新鲜的HEp-2单层上培养,该单层存在于平底96孔板(NuncTM,Thermo Fisher)上。通过在28℃的温度下以500g离心辅助接种30分钟来完成感染,然后在37℃和5%CO2下孵育。每种样品一式三份培养。感染后38小时,用甲醇固定培养物,并进行显微镜染色。
使用针对CtHtrA,MOMP(Biodesign)的抗体和与Alexa荧光染料偶联的二抗(Invitrogen)进行直接免疫荧光(IF)染色。还添加了DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚,Dilactate)(Invitrogen)用于宿主细胞染色。用荧光显微镜IN CellAnalyzer 2200(GEHealthcare Life Sciences)以100倍的放大倍率检查样本。HEp-2细胞呈蓝色,衣原体包涵体呈绿色。通过对10个代表性视野中每个孔和每个系列稀释液的包涵体进行计数,确定包涵体形成单位(IFU mL-1)。进行视野大小到孔大小的外推,以计算给定孔中包含的总数。稀释液和添加量也考虑在内。
按照处理方案A(1.1.1)所述处理的细胞的免疫荧光成像显示在图3的图i中,通过从这些图像中计算IFU/ml获得的结果显示在图3的图ii中;结果针对高于MIC(>MIC)的细胞所获得的值进行标准化。未经处理和用不同剂量的抗生素处理过的细胞,其衣原体的感染单位数不同。
1.3总核酸(TNA)提取
1.3.1提取方案A
将收集用于TNA提取的样品在冰上解冻,并在4℃下以800g沉淀细胞碎片10分钟,然后在4℃下以14000rpm离心上清液20分钟。将沉淀重新悬浮在蛋白酶K消化混合物(10mg/mL蛋白酶K(Ambion)、1mM Tris pH7.5、0.5M EDTA、5M NaCl、10%SDS和无核酸酶的水(Ambion)中,并在56℃下孵育60分钟。消化后,将苯酚:氯仿:异戊基(25:24:1,pH 6.5-6.9,Sigma Aldrich)添加到混合物中,剧烈涡旋并以最大速度离心5分钟。上层相通过添加乙酸钠(3M,pH5.2,Sigma Aldrich)和100%乙醇(Sigma Aldrich)来保持。再次涡旋振荡并孵育20分钟(室温10分钟,-20℃10分钟)。然后在使用70%乙醇的两个洗涤步骤之后,将TNA以高速(14000rpm)沉淀10分钟。然后将沉淀空气干燥15分钟,然后在50μL水中洗脱。定量洗脱液,并保存在-80℃。
1.3.2提取方案B
将收集的样品在冰上融化,然后在4℃下以14000rpm离心沉淀细胞20分钟。此步骤后,使用PuriSpin FireMonkey提取试剂盒(RevoluGen)遵循了制造商对DNA和RNA的同时提取的说明。
1.3.3提取方案C
将收集的样品在冰上融化,然后在4℃下以14000rpm离心沉淀细胞20分钟。此步骤后,遵循制造商从动物细胞中纯化总RNA的说明,并进行了额外的柱上DNase消化。使用RNeasy Mini Kit(Qiagen)进行提取。
实施例2:在两孔测定中分析未处理和已处理细胞中的基因及其转录物
以下实施例估计了从感染了沙眼衣原体(血清型D)的HEp-2细胞提取的TNA样品中DNA和GAT的水平。从未与抗生素孵育的细胞(未经处理的活细胞)以及与抗生素孵育的细胞中提取TNA,抗生素浓度比MIC低8倍(<MIC)、在MIC(MIC)或比MIC高8倍(>MIC),如实施例1(1.1.1处理方案A)所述。衣原体DNA和RNA使用靶向omp1基因及其转录物的引物进行扩增。通过RT-PCR估计GAT的水平,其中扩增了omp1基因及其转录物(DNA加RNA)。仅在缺少逆转录酶的单独PCR中测量了omp1基因的水平(仅DNA)。
2.1部分酶寡核苷酸
当部分酶与omp1基因或omp1转录物扩增产生的扩增子结合时,它们被设计成可组装成活性MNA酶。组装后,MNA酶可裂解报告底物Sub2-FB。下面列出了部分酶A和部分酶B的从5'到3'的序列。粗体的碱基与靶标杂交,加下划线的碱基形成组装的MNA酶中催化核心的一部分,斜体的碱基是指与底物杂交的序列。
SEQ ID NO:1 部分酶A omp1_A4/2-P
SEQ ID NO:2 部分酶B omp1_B5/2-P
2.2报告底物
在当前实施例中,底物在5'端用6-FAM部分标记(在下面的底物名称中用“F”表示),在3'端用IABkFQ淬灭剂部分标记(在下面的底物名称中用“IB”表示)。在516nm(FAM发射波长)和492nm(FAM激发波长)的激发下监测底物的裂解。下面以5'至3'的顺序显示此实施例的报告底物。小写字母表示RNA,大写字母表示DNA。
SEQ ID NO:3 Sub2-FB
AAGGTTTCCTCguCCCTGGGCA
2.3用于扩增omp1基因和转录物的PCR引物
使用下面列出的引物对从沙眼衣原体感染的细胞中提取的TNA模板进行体外扩增。正向和反向引物用于通过PCR扩增omp1基因内的DNA,并通过RT-PCR扩增omp1基因内的DNA和RNA以及转录物。所有序列都以5'至3'书写。
SEQ ID NO:4 正向引物5omp1:
CTTCTTCCTGGGACGAACG
SEQ ID NO:5 反向引物3omp1:
TGGCCTGAGGAATGTCTTGC
2.4制备TNA
从已经按照实施例1在HEp-2细胞中培养的沙眼衣原体(血清型D)中共提取RNA和DNA(TNA)(1.1培养和1.1.1处理方案A)。使用苯酚:氯仿:异戊基,以液-液提取(LLE)技术进行提取,实施例1中也进行了描述(1.3总核酸(TNA)提取,1.3.1提取方案A)。
2.5 PCR和RT-PCR混合物
PCR和RT-PCR混合物均包含40nM的5'引物、200nM的3'引物、200nM的部分酶A、200nM的部分酶B、200nM的Sub2-FB、1x SensiFAST探针No-ROX混合物(Bioline)、8mM MgCl2(Bioline)和无核酸酶的水(Ambion),总体积为20μL。此外,RT-PCR混合物还包含0.2U/μLRiboSafe RNase抑制剂(Bioline)和0.2μL逆转录酶(Bioline)。使用相同的循环参数,在CFX96热循环仪上进行一式三份反应:48℃10分钟,95℃2分钟,10个循环的95℃5秒和61℃30秒(每个循环减0.5℃),和30个循环的95℃5秒和52℃50秒。RT-PCR和PCR混合物含有5μL TNA模板(1/100稀释)或不含模板(dH2O)。
2.6结果
使用提取自未处理的活细胞和用浓度低于(<MIC)、等于(MIC)或高于MIC浓度(>MIC)的抗生素孵育的细胞的TNA分别通过RT-PCR和PCR扩增衣原体DNA和RNA(GAT)或仅DNA。表2显示了针对每种反应类型和样品测得的阈值循环(Ct)值。将ΔCt计算为从扩增图获得的PCR(仅DNA)和RT-PCR(GAT)的Ct值之间的差异。进而,将理论上导致那些ΔCt值的倍数改变(RNA加DNA(GAT)的拷贝数与仅DNA的比值)估计为2ΔCt,并绘制在图3的图iii中。然后将结果与每个细胞群体中的生存力进行比较(图3的图ii)。
表2:处理过的和未处理过的样品中TNA的PCR和RT-PCR分析结果
/>
从理论上讲,如果细胞不再被衣原体感染,则无法检测到任何转录物或仅残留极低水平的转录物或其片段。类似地,只有低残留水平的基因组DNA或其片段可以被检测到,但是,由于DNA固有地比RNA稳定,因此可以预期检测到的DNA量要大于RNA量。
结果分析表明,从未处理样品或在低于MIC的样品中提取的TNA样品被扩增后,观察到的RT-PCR的Ct值低于PCR观察到的Ct值(表2),与在这些样品中有效转录一致。对于使用来自MIC水平或更高水平的培养物的TNA进行的反应,ΔCt值较低(表2),与极少转录或无转录一致。
先前的研究已经表明,检测DNA或RNA本身并不是清除沙眼衣原体的可靠测量。此实施例中的数据表明,如通过比较图3的图ii和iii中的图所证明,DNA(通过PCR测量)和GAT(DNA加RNA,通过RT-PCR测量)之间的倍数改变比与未经处理和已处理的细胞生存力的(PI)相似。尽管该实施例证明了检查RNA和DNA比值的实用性,但是该实验并未举例说明本发明,因为在两个反应中仍仅表达DNA靶标。因此,DNA/RNA相对于DNA的测定仅需要在有和没有逆转录酶的情况下进行两个平行反应。这使得直接比较结果更加困难。这样,更优选的方法将使用根据本发明的方法,其中可以在单个VITA RT-PCR中共扩增不同的核酸亚群(仅DNA相对于DNA加RNA)。
实施例3:筛选GAT和NED靶标
以下实施例说明了筛选适合GAT和NED分析的靶标的方法。从感染了沙眼衣原体(血清型D)的HEp-2细胞中提取核酸。从感染后24h收获的活细胞中提取TNA和RNA。然后使用靶向所选基因及其转录物(GAT)或仅不转录基因(NED)的引物对扩增核酸。通过比较(i)通过RT-PCR在总RNA中检测RNA(其中将同时检测基因及其转录物)和(ii)通过PCR检测DNA(其中仅基因DNA将被检测到)来确定每个靶标的适用性。在这些实验中,可以预测GAT的Ct在两个反应之间都显示出差异,而NED的Ct应该没有显示出差异。
3.1部分酶寡核苷酸
当部分酶与omp1基因或omp1转录物扩增产生的扩增子结合时,它们被设计成可组装成活性MNA酶。组装后,MNA酶可裂解报告底物Sub102(20)-FB。当与通过标记为infA_IGR的不转录的DNA区域的扩增而产生的扩增子结合时,第二对部分酶被设计为组装成活性MNA酶,从而提供了NED的量度。组装后,该MNA酶可裂解报告底物Sub72-A1B。下面列出了每种MNA酶的部分酶A和部分酶B的从5'到3'的序列。粗体的碱基与靶标杂交,加下划线的碱基形成组装的MNA酶中催化核心的一部分,斜体的碱基是指与底物杂交的序列。
SEQ ID NO:6 GAT omp1_A4/102-P的部分酶A
SEQ ID NO:7 GAT omp1_B5/102(20)-P的部分酶B
SEQ ID NO:8 NED CTinfAIGR_A4/72-P的部分酶A
SEQ ID NO:9 NED CTinfAIGR_B5/72-P的部分酶B
3.2报告底物
在当前实施例中,使用了两种不同的报告底物,每种底物均标记有不同的荧光团。Sub102(20)-FB在5'末端标记有6-FAM,在3'末端标记有IABkFQ,并在516nm处监测其裂解,并在492nm处激发。Sub72-A1B在5'末端标记有ATTOTMRho101,在3'末端标记有IAbRQSp,并在609nm激发下592nm处监测其裂解。下面以5'至3'的顺序显示此实施例的报告底物。小写字母表示RNA,大写字母表示DNA。
SEQ ID NO:10 GAT Sub102(20)-FB
TCGACGTCCCguCCTCTACCG
SEQ ID NO:11 NED Sub72-A1B
ATCACGCCTCguCTCCTCCCAG
3.3用于扩增GAT和NED的PCR引物
使用下面列出的引物对从沙眼衣原体感染的细胞中提取的TNA和RNA模板进行体外扩增。正向和反向引物用于通过PCR和RT-PCR扩增omp1基因和转录物(GAT)和infA_IGRDNA(NED)的区域。所有序列都以5'至3'书写。
SEQ ID NO:4 GAT 5omp1的正向引物:
CTTCTTCCTGGGACGAACG
SEQ ID NO:5 GAT 3omp1的反向引物:
TGGCCTGAGGAATGTCTTGC
SEQ ID NO:12 NED 5CTinfAIGR_2的正向引物
GAGAGAGTGATTATATCGACTAA
SEQ ID NO:13 NED 3CTinfAIGR_1的反向引物
CAAGAGAGAATGTCAAAAGATAC
3.4制备TNA和RNA
如实施例1中所述(1.1培养),从已经在HEp-2细胞中培养的沙眼衣原体(血清型D)中提取核酸。感染后4小时,用环己酰亚胺代替DMEM,以使感染同步并阻止宿主的蛋白质合成。再次将细胞在37℃和5%CO2中孵育,直到感染后24h在细菌的指数生长期收获。
TNA的提取使用酚:氯仿:异戊基以LLE技术进行,也如实施例1所述(1.3总核酸(TNA)提取,1.3.1提取方案A),经过以下修改;在该实施例中,在样品提取期间未进行细胞碎片沉淀步骤。
使用RNeasy Mini Kit(Qiagen)进行RNA提取,如实施例1中所定义(1.3总核酸(TNA)提取,1.3.3提取方案C),并按照制造商的说明从动物细胞中纯化总RNA,并进行其他柱上DNase消化。
3.5 PCR和RT-PCR混合物
PCR和RT-PCR混合物均包含40nM的5'引物、200nM的3'引物、200nM的部分酶A、200nM的部分酶B、GAT为200nM的Sub2-FB并且NED为200nM的Sub72-A1B、1x SensiFAST探针No-ROX混合物(Bioline)、8mM MgCl2(Bioline)和无核酸酶的水(Ambion),总体积为20μL。此外,RT-PCR混合物还包含0.2U/μL RiboSafe RNase抑制剂(Bioline)和0.2μL逆转录酶(Bioline)。使用相同的循环参数,热循环仪上进行反应:48℃10分钟,95℃2分钟,10个循环的95℃5秒和61℃30秒(每个循环减0.5℃),和30个循环的95℃5秒和52℃50秒。RT-PCR和PCR混合物含有5TNAμL TNA或RNA模板(1/100稀释)或不含模板(dH2O)。
3.6结果
通过RT-PCR和PCR分别在感染后24小时从存活的未处理细胞中收获的RNA和TNA样品中扩增衣原体DNA和RNA或仅扩增DNA。表3A表示扩增子类型和来自进行的反应的来源。表3B显示了针对每种反应类型和样品测得的阈值循环(Ct)值。将ΔCt计算为从扩增图获得的PCR(仅DNA)和RT-PCR(DNA和RNA)的Ct值之间的差异(图4)。
表3A:可能的扩增子类型和来源
表3B:TNA和RNA样品的PCR和RT-PCR分析的阈值
/>
使用候选GAT引物和TNA的结果(表3B)表明omp1引物能够扩增omp1 DNA和omp1RNA(图4中的i和ii),因此符合适用于GAT引物的标准。此外,由于RT-PCR的Ct比PCR的Ct提前4.92个循环,因此这表明TNA样品中每个omp1 DNA基因拷贝有许多RNA拷贝。对RNA使用omp1引物的结果也支持了这一点(图4的图i),其中RT-PCR和PCR结果之间的Ct差异为11.51,这反映了纯化的RNA样品中omp1 RNA的强烈扩增,并且仅PCR检测到非常晚的Ct,这很可能是由于RNA制备中的少量污染DNA。
使用候选NED引物和TNA的结果(表3B)表明InfAIGR引物能够扩增infA基因间DNA序列(图4的图iv)。此外,由于RT-PCR的Ct与PCR非常相似(ΔCt-0.05),这表明这些NED引物不会扩增TNA中的其他RNA序列,这与缺少与该序列相关的RNA转录一致。这样,这些引物符合适用于NED引物的标准。对RNA使用InfAIGR引物的结果也证明了这一点(图4的图iii),其中仅生成晚的Ct值,这对于PCR和RT-PCR而言是相似的,并且像以前一样,可能仅表示由于RNA制备物中污染的DNA而生成的扩增子。
该实施例提供适合于筛选用作GAT引物或用作NED引物的候选序列的方法。此外,该实施例显示了在纯化的RNA制备物中存在污染的DNA的证据,尽管在提取过程中执行了额外的DNase消化程序。观察结果突出显示了对改进方法的需要,例如VITA PCR,因为当将RNA扩增用作标本(包括临床标本)中细胞生存力的量度时,很可能污染的DNA是至少观察到一些假阳性的来源。先前的研究已经表明,检测DNA(或RNA)本身并不是清除沙眼衣原体的可靠测量。
实施例4-通过VITA PCR分析未处理和处理过的细胞中的GAT和NED。
以下实施例估计了从感染了沙眼衣原体(血清型D)的HEp-2细胞提取的TNA样品中NED和GAT的水平。从未与抗生素孵育的细胞(未经处理的活细胞)以及与抗生素孵育的细胞中提取TNA,抗生素浓度比MIC低8倍(<MIC)、在MIC(MIC)或比MIC高8倍(>MIC),如实施例1处理方案A(1.1.1)所述。衣原体DNA和RNA(GAT)使用靶向omp1基因及其转录物的引物通过RT-PCR进行扩增。使用靶向不转录的基因组DNA区域(称为infAIGR)的引物,在同一RT-PCR中共扩增衣原体DNA(NED)。确定了GAT和NED的Ct值。
4.1部分酶寡核苷酸
当部分酶与omp1基因和omp1转录物扩增产生的扩增子结合时,它们被设计成可组装成活性MNA酶。组装后,该MNA酶可裂解报告底物Sub2-FB。当与通过标记为infA_IGR的不转录区域的扩增而产生的扩增子结合时,第二对部分酶被设计为组装成活性MNA酶。组装后,该MNA酶可裂解报告底物Sub72-A1B。下面列出了部分酶A和部分酶B的从5'到3'的序列。粗体的碱基与靶标杂交,加下划线的碱基形成组装的MNA酶中催化核心的一部分,斜体的碱基是指与底物杂交的序列。
SEQ ID NO:1 GAT omp1_A4/2-P的部分酶A
SEQ ID NO:2 GAT omp1_B5/2-P的部分酶B
SEQ ID NO:8 NED CTinfAIGR_A4/72-P的部分酶A
/>
SEQ ID NO:9 NED CTinfAIGR_B5/72-P的部分酶B
4.2报告底物
在当前实施例中,使用了两种不同的报告底物,每种底物均标记有不同的荧光团。Sub2-FB在5'末端标记有6-FAM,在3'末端标记有IABkFQ,并在516nm处监测其裂解,并在492nm处激发。Sub72-A1B在5'末端标记有ATTOTMRho101,在3'末端标记有IAbRQSp,并在609nm激发下592nm处监测其裂解A1B。下面以5'至3'的顺序显示此实施例的报告底物。小写字母表示RNA,大写字母表示DNA。
SEQ ID NO:3 GAT Sub2-FB
AAGGTTTCCTCguCCCTGGGCA
SEQ ID NO:11 NED Sub72-A1B
ATCACGCCTCguCTCCTCCCAG
4.3用于扩增omp1基因和转录物的PCR引物
使用下面列出的引物对从沙眼衣原体感染的细胞中提取的TNA模板进行体外扩增。正向和反向引物用于通过RT-PCR扩增omp1 RNA和DNA(GAT)和inf_AGR DNA(NED)。所有序列都以5'至3'书写。
SEQ ID NO:4 GAT 5omp1的正向引物:
CTTCTTCCTGGGACGAACG
SEQ ID NO:5 GAT 3omp1的反向引物:
TGGCCTGAGGAATGTCTTGC
SEQ ID NO:12 NED 5CTinfAIGR_2的正向引物
GAGAGAGTGATTATATCGACTAA
SEQ ID NO:13 NED 3CTinfAIGR_1的反向引物
CAAGAGAGAATGTCAAAAGATAC
4.4制备TNA
从已经按照实施例1(1.1培养,1.1.1处理方案A)在HEp-2细胞中培养的沙眼衣原体(血清型D)中共提取RNA和DNA(TNA)。使用苯酚:氯仿:异戊基,以LLE技术进行提取,实施例1中也进行了描述(1.3总核酸(TNA)提取,1.3.1提取方案A)。
4.5反应组分
所有反应均包含40nM每个正向引物、200nM每个反向引物、200nM每个部分酶A、200nM每个部分酶B、200nM每个底物、1x SensiFAST Probe No-ROXMix(Bioline)、2mMMgCl2(Bioline)、0.2U/μL RiboSafe RNase抑制剂(Bioline)、0.2μL逆转录酶(Bioline)和无核酸酶水(Ambion),总体积为20μL。所有反应均一式三份在CFX96热循环仪上进行。循环参数为48℃10分钟,95℃2分钟,10个循环的95℃5秒和61℃30秒(每个循环下降0.5℃),和30个循环的95℃5秒和52℃50秒。反应含有5μL TNA模板(1/100稀释)或不含靶标(dH2O)。
4.6结果
在单个RT-PCR中共扩增衣原体DNA和RNA(GAT)或仅使用DNA(NED)和提取自未处理的活细胞和用浓度低于(<MIC)、等于(MIC)或高于MIC浓度(>MIC)的抗生素孵育的细胞的TNA。表4显示了每个样品中GAT或NED的阈值循环(Ct)值。将ΔCt计算为NED和GAT信号的Ct值之间的差。进而,理论上会导致这些ΔCt值的倍数改变(GAT与NED的比率)估计为2ΔCt(表4),VITA指数绘制在图5的图i中。然后将结果与每个细胞群体中的生存力进行比较(图3的图i和ii)。
表4:处理过的和未处理过的样品中TNA的VITA PCR(双链体RT-PCR)分析结果
从理论上讲,如果细胞不再被衣原体感染,则仅可检测到残留极低水平的转录物或其片段。类似地,仅可检测低残留水平的基因组DNA或其片段。可以预期检测到的DNA量将大于RNA量,因为DNA本质上比RNA稳定。结果分析表明,当从未经处理或低于MIC的样品中提取的TNA样品被扩增时,GAT的Ct值低于NED(表4),与有效转录一致。对于以MIC或更高水平处理的TNA的GAT和NED,Ct值的差异很小(表4),表明转录很少或没有转录。计算了四种样品类型的倍数改变和VITA指数。由于仅使用单个基因及其转录物来计算GAT,并且仅使用单个不转录的区域来计算NED,因此倍数改变和VITA指数相等(表4)。
先前的研究已经表明,检测DNA或RNA本身并不是清除沙眼衣原体的可靠测量。该实施例的数据表明,VITA指数与未处理和已处理细胞的生存力(PI)量度相关,如通过比较图5的图i和图3的图i和ii中的图所证明的。该实施例证实了可以在单个反应中测量GAT和NED,并且该结果可以用于计算与观察到的细胞生存力和对抗生素的存在相关的VITA指数。该实施例提供了用于检测生存力(在这种情况下为衣原体生存力)的快速方法。此外,它可以通过确定是否清除感染来为患者标本的治愈测试(TOC)提供基础。
实施例5–基因中的两个区域和相应的转录物,通过VITA PCR,使用来自未处理和处理过的细胞的TNA来测量GAT的用途。
以下实施例估计了从感染了沙眼衣原体(血清型D)的HEp-2细胞提取的TNA样品中NED和GAT的水平。从未与抗生素孵育的细胞(未经处理的活细胞)以及与抗生素孵育的细胞中提取TNA,抗生素浓度比MIC低8倍(<MIC)、在MIC(MIC)或比MIC高8倍(>MIC),如实施例1处理方案A(1.2.1)所述。衣原体DNA和RNA(GAT)使用靶向omp1基因及其转录物的两个不同区域的引物通过RT-PCR进行扩增(GAT1/2)。使用靶向不转录的基因组DNA区域(称为infAIGR(infA基因间区域))的引物,在同一RT-PCR中共扩增衣原体DNA(NED)。获得了GAT1/2和NED的Ct值。
5.1部分酶寡核苷酸
当部分酶与omp1基因或omp1转录物扩增产生的扩增子结合时,它们被设计成可组装成两个活性MNA酶。这两个MNA酶能够结合通过扩增omp1的两个独立区域(GAT1和GAT2区域)而衍生的两个不同的扩增子。组装后,这两个MNA酶可裂解同一报告底物Sub2-FB。当与通过标记为infA_IGR的不转录的DNA区域的扩增而产生的扩增子结合时,第三对部分酶被设计为组装成活性MNA酶,从而提供了NED的量度。组装后,该MNA酶可裂解报告底物Sub72-A1B。下面列出了每种MNA酶的部分酶A和部分酶B的从5'到3'的序列。粗体的碱基与靶标杂交,加下划线的碱基形成组装的MNA酶中催化核心的一部分,斜体的碱基是指与底物杂交的序列。
SEQ ID NO:1 GAT1 omp1_A4/2-P的部分酶A
SEQ ID NO:2 GAT1 omp1_B5/2-P的部分酶B
SEQ ID NO:14GAT2 CTomp1_A4/2-P的部分酶A
SEQ ID NO:15 GAT2 CTomp1_B5/2-P的部分酶B
SEQ ID NO:8 NED CTinfAIGR_A4/72-P的部分酶A
SEQ ID NO:9 NED CTinfAIGR_B5/72-P的部分酶B
5.2报告底物
在当前实施例中,使用了两种不同的报告底物,每种底物均标记有不同的荧光团,如实施例4所示(4.2报告底物)。
5.3用于扩增GAT1、GAT2和NED的PCR引物
使用下面列出的引物对从沙眼衣原体感染的细胞中提取的TNA模板进行体外扩增。正向和反向引物用于通过RT-PCR扩增omp1基因和转录物(GAT1和GAT2)和infA_IGR DNA(NED)的两个区域。所有序列都以5'至3'书写。
SEQ ID NO:4 GAT1 5omp1的正向引物
CTTCTTCCTGGGACGAACG
SEQ ID NO:5 GAT1 3omp1的反向引物
TGGCCTGAGGAATGTCTTGC
SEQ ID NO:16 GAT2 5CTomp1_1的正向引物
TTTCGGCGGAGATCCTTGCGATCC
SEQ ID NO:17 GAT2 3CTomp1_2的反向引物
CGAAAACAAAGTCACCGTAGTAACC
SEQ ID NO:12 NED 5CTinfAIGR_2的正向引物
GAGAGAGTGATTATATCGACTAA
SEQ ID NO:13 NED 3CTinfAIGR_1的反向引物
CAAGAGAGAATGTCAAAAGATAC
5.4制备TNA
从已经按照实施例1(1.1培养,1.1.1处理方案A)通过体外方法获得、在HEp-2细胞中培养的沙眼衣原体(血清型D)中共提取RNA和DNA(TNA)。使用苯酚:氯仿:异戊基,以LLE技术进行提取,实施例1中也进行了描述(1.3总核酸(TNA)提取,1.3.1提取方案A)。
5.5反应组分
所有反应均包含40nM每个正向引物、200nM每个反向引物、200nM每个部分酶A、200nM每个部分酶B、400nM每个底物SEQ ID NO 3和200mM底物SEQ ID NO 11、1x SensiFASTProbe No-ROX Mix(Bioline)、2mM MgCl2(Bioline)、0.2U/μL RiboSafe RNase抑制剂(Bioline)、0.2μL逆转录酶(Bioline)和无核酸酶水(Ambion),总体积为20μL。所有反应均一式三份在CFX96热循环仪上进行。循环参数为48℃10分钟,95℃2分钟,10个循环的95℃5秒和61℃30秒(每个循环下降0.5℃),和30个循环的95℃5秒和52℃50秒。反应含有5μL TNA模板(1/100稀释)或不含靶标(dH2O)。
5.6结果
在单个RT-PCR中共扩增衣原体的DNA和RNA来自omp1基因和转录物的两个区域(GAT1和GAT2)以及一个NED区域和提取自未处理的活细胞和用浓度低于(<MIC)、等于(MIC)或高于MIC浓度(>MIC)的抗生素孵育的细胞的TNA(图5的图ii)。表5显示了每个样品中针对NED以及来自GAT1和GAT2(GAT1/2)的组合信号测得的阈值周期(Ct)值。将ΔCt计算为NED和GAT1/2的Ct值之间的差。进而,理论上会导致这些ΔCt值的倍数改变(GAT与NED的比值)估计为2ΔCt,如表5所示。VITA指数是用FC除以TR(在这种情况下为2)得出的。然后将结果与每个细胞群体中的生存力进行比较。
表5:处理过的和未处理过的样品中TNA的三重RT-PCR分析结果
结果分析表明,当从未经处理或低于MIC的处理过的样品中提取的TNA样品被扩增时,GAT1/2的Ct值低于NED(表5),与有效转录一致。对于以MIC或更高水平处理的TNA的GAT1/2和NED,Ct值的差异很小(表5),表明转录很少或没有转录。计算了四种样品类型的倍数改变和VITA指数。由于两个基因及其转录物用于计算GAT1/2,并且仅使用单个不转录的区域来计算NED,因此倍数改变除以TR即可计算出VITA指数(表5)。
实际上,非常需要能够扩增DNA及其相关的RNA转录物的多种引物组,因为特定的基因可能仅在例如细菌发育周期的某些阶段表达。包含多个基因表达的测定法,优选在不同条件下以高水平表达,可以确保在各种(desperate)条件下始终可检测到表达。
实施例6–VITA PCR在临床表本方面的用途
以下实施例估算了临床样品中GAT相对于NED的水平。尿液样品取自有症状的患者,对所述患者的一线抗生素阿奇霉素连续治疗失败。从样品中提取TNA,并与从感染了沙眼衣原体(血清型D)的HEp-2细胞中提取的参考物质一起进行检测,这些参考物质被证实是活的/有活力的(阳性参考)或死的(阴性参考)。衣原体DNA和RNA使用靶向omp1基因及其转录物的两个不同区域的引物通过RT-PCR进行扩增以测量GAT。衣原体DNA的另一个区域在同一RT-PCR中使用靶向不转录的基因组DNA区域的引物共扩增以测量NED。确定了GAT和NED的水平,并用于计算VITA指数。
6.1 GAT1、GAT2和NED的VITA PCR分析
用于扩增和检测GAT1、GAT2和NED的部分酶寡核苷酸,报道基因底物和PCR引物根据实施例5(分别为5.1、5.2和5.3)。
6.2制备TNA
临床样品:
从尿液临床标本中共提取RNA和DNA(TNA),该标本取自用一线抗生素治疗连续治疗失败的患者。沉淀总共8毫升尿液,然后按照实施例1中所述使用FireMonkey PuriSpin提取试剂盒进行核酸提取(1.3总核酸(TNA)提取,1.3.2提取方案B),遵循制造商的同时提取DNA和RNA的说明。
参考材料:
如实施例1所述,从通过体外方法获得的沙眼衣原体(血清型D)中共提取RNA和DNA(TNA),在HEp-2细胞中培养,细胞用大剂量阿奇霉素抗生素(0.512μL/mL)处理并确认为“死的”或是未处理并确认为“活的”。这些参考样品的生存力状态已通过免疫荧光染色得到了证实。使用苯酚:氯仿:异戊基,以液-液提取(LLE)技术进行提取,实施例1中也进行了描述(1.3总核酸(TNA)提取,1.3.1提取方案A)。
6.3反应组分
所用的RT-PCR条件如实施例5(5.5)所述,但有以下修改:添加0.1μL逆转录酶(Bioline),反应总体积为10μL,其中包含2.5μL从临床样品中提取的TNA(纯净)、2.5μL每个参考TNA样品(1/100稀释)或无靶标(dH2O)。
6.4结果
来自omp1基因和转录物(GAT1和GAT2)的2个区域以及一个NED区域的衣原体DNA和RNA在单个RT-PCR中从尿液临床样品中提取的TNA进行了共扩增和检测(图6的图i)。将临床样品的扩增与来自衣原体培养物的参考样品(“活的CT”(未处理的样品)或“死的CT”(用大剂量阿奇霉素治疗)进行了比较(图6的图ii)。将ΔCt计算为NED和GAT1/2信号的Ct值之间的差。进而,理论上会导致这ΔCt值的倍数改变(GAT1/2与NED之间的差异)估计为2ΔCt,如表6所示。
可以预计,来自有症状患者的临床样品将包含活菌。进而,这有望在临床样品和活的CT参考(阳性)之间产生相似的VITA指数,因为两者都包含更高水平的转录物。
结果分析表明,当从尿液中提取的临床样品进行扩增时,GAT1/2的Ct值低于NED(表6)。这与有效转录是一致的,并且与参考样品活的CT(阳性)观察到的相似(表6)。对于所有三个死的CT参考样品(阴性1-3),GAT1/2和NED的Ct值都更相似(表6)。计算所有样品的ΔCt、倍数改变和VITA指数(表6)。由于两个基因及其转录物来计算GAT1/2,并且仅使用单个不转录的区域来计算NED,因此倍数改变是VITA指数的两倍(表6)。临床样品和活的CT的VITA指数的比较显示无差异,与检测到活的群体相关(图6的图ii)。相反,比较临床样品和死的CT样品的VITA指数,表明VITA指数存在差异。对于临床样品,这些比死的CT样品更高(图6的图ii),这与已经用高剂量阿奇霉素治疗并证实没有活力的死的CT样品中的转录活性降低或没有转录活性一致。
该实施例的数据表明,可以在一个反应中测量GAT1/2和NED,并将其结果用于计算VITA指数。临床样品和参考材料的VITA指数之间的比较证明了临床样品中细胞生存力的准确要求。这表明该技术在临床标本上具有积极的作用,并在临床环境中具有适用性。区分死的细胞和活的细胞的能力可用于确定患者在用抗生素治疗后是否已成功清除感染。这些测试可以提供初步诊断或“治愈测试”。
表6:与参考材料相比,临床样品中TNA的三重RT-PCR分析结果
实施例7-使用VITA PCR的抗生素敏感性测试
以下实施例估计了从感染了沙眼衣原体(血清型D)的HEp-2细胞提取的TNA样品中GAT水平的变化。如实施例1,处理B(1.1.2)中所述,从细胞中提取TNA,该细胞在感染后24小时处于指数生长期,用抗生素以MIC处理或未处理(对照)。衣原体DNA和RNA使用靶向omp1基因及其转录物的两个不同区域的引物通过RT-PCR进行扩增以测量GAT。衣原体DNA的另一个区域在同一RT-PCR中使用靶向不转录的基因组DNA区域的引物共扩增以测量NED。估计了GAT和NED的水平,并用于计算VITA指数。
7.1 GAT1、GAT2和NED的VITA PCR分析
用于扩增和检测GAT1、GAT2和NED的部分酶寡核苷酸,报道基因底物和PCR引物根据实施例5(分别为5.1、5.2和5.3)。所用的RT-PCR反应条件如实施例5(5.5)中所述。这些反应含有5μL TNA模板(1/1000稀释)或不含靶标(dH2O)。
7.2制备TNA
如实施例1(1.1培养,1.1.2处理方案B)所述,已经在HEp-2细胞中培养的沙眼衣原体(血清型D)中共提取RNA和DNA(TNA)。提取使用酚:氯仿:异戊基以LLE技术进行,也如实施例1所述(1.3总核酸(TNA)提取,1.3.1提取方案A)经过以下修改;在该实施例中,在样品提取期间未进行细胞碎片沉淀步骤。
7.3结果
来自omp1基因和转录物(GAT1和GAT2)的2个区域以及一个NED区域的衣原体DNA和RNA在单个RT-PCR中从衣原体培养物中提取的TNA进行了共扩增和检测。这些培养物在指数生长期用抗生素处理或未经处理(对照),并在处理后1和6小时收获(图7的图i)。表4显示了每个样品中GAT1/2和NED的阈值循环(Ct)值。将ΔCt计算为NED和GAT1/2信号的Ct值之间的差。进而,理论上会导致这ΔCt值的倍数改变(GAT1/2与NED之间的差异)估计为2ΔCt,如表7所示。然后在每个时间点比较未处理的反应(对照)和抗生素处理后的结果(图7的图ii)。
可以预计,对抗生素处理敏感的细胞的转录水平会降低,因为预期存在抗生素会破坏细胞的正常功能。进而,与对照(未处理的细胞)相比,这将导致这些细胞的VITA指数降低。
结果分析表明,从未处理组和处理组中提取的TNA样品经过扩增后,GAT1/2的Ct值低于NED(表7)。这与所有四种样品中的有效转录一致。计算样品和处理后不同时间点的倍数改变和VITA指数(表7)。由于两个基因及其转录物来计算GAT1/2,并且仅使用单个不转录的区域来计算NED,因此倍数改变是VITA指数的两倍(表7)。在两个时间点,未处理样品和已处理样品的VITA指数比较表明,已处理样品的VITA指数有所不同,低于未处理样品(图7的图ii),这与存在抗生素时转录活性降低有关。ΔVITA比值是通过将VITA指数(不含抗生素)除以VITA指数与抗生素得出的。
该实施例的数据表明,可以在一个反应中测量GAT1/2和NED,并将其结果用于计算VITA指数。经处理和未处理的细胞的VITA指数之间的比较,以ΔVITA比值计算,表明对抗生素的存在有反应。这表明细胞对抗生素的敏感性。此外,它表明可以在包括治疗后1小时或6小时在内的各个时间点确定这种敏感性。
表7:在处理后(PT)的不同时间点收获的来自处理过的样品和未处理的样品的TNA的三重RT-PCR分析结果
实施例8-使用具有较短孵育时间的VITA PCR用阿奇霉素进行抗生素敏感性试验
以下实施例估计了从已经感染了沙眼衣原体(血清型D)的HEp-2细胞提取的TNA样品GAT相对于NED水平的变化。从感染后24小时处于指数生长期的细胞中提取TNA,该细胞已经用MIC的抗生素处理过,或未进行处理(对照)。如实施例1、处理B(1.1.2)所述,使用阿奇霉素(0.128μg/mL)进行处理。为了获得GAT的测量,衣原体DNA和RNA使用靶向omp1基因及其转录物的两个不同区域的引物通过RT-PCR进行扩增。为了测量NED,衣原体DNA的另一个区域在同一RT-PCR中使用靶向不转录的基因组DNA区域的引物共扩增。估计了GAT和NED的水平,并用于计算VITA指数。除此之外,还使用已处理和未处理样品的VITA指数来计算ΔVITA比值。
8.1 GAT1、GAT2和NED的VITA PCR分析
用于扩增和检测GAT1、GAT2和NED的部分酶寡核苷酸,报道基因底物和PCR引物根据实施例5(分别为5.1、5.2和5.3)。如实施例5(5.5)所述使用RT-PCR条件,反应含有5μLTNA模板(1/1000稀释)或不含靶标(dH2O)。
8.2制备TNA
如实施例1(1.1培养,1.1.2处理方案B)所述,已经在HEp-2细胞中培养的沙眼衣原体(血清型D)中共提取RNA和DNA(TNA)。提取使用酚:氯仿:异戊基以LLE技术进行,也如实施例1所述(1.3总核酸(TNA)提取,1.3.1提取方案A)经过以下修改;在该实施例中,在样品提取期间未进行细胞碎片沉淀步骤。
8.3结果
来自omp基因和转录物(GAT1和GAT2)的2个区域以及一个NED区域的衣原体DNA和RNA在单个RT-PCR中从衣原体培养物中提取的TNA进行了共扩增和检测。这些培养物在指数生长期用抗生素处理或未经处理(对照),并在用0.128μg/mL的阿奇霉素处理后30min或6小时收获(图7的图i)。表8显示了每个样品中GAT1/2和NED的阈值循环(Ct)值。将ΔCt计算为NED和GAT1/2信号的Ct值之间的差。进而,理论上会导致这ΔCt值的倍数变化(GAT1/2与NED之间的差异)估计为2ΔCt,如表8所示。然后在每个时间点比较未处理的反应(对照)和抗生素处理后的结果(图7的图iii)。
表8:在处理后(PT)的不同时间点采集的来自处理过的样品和未处理的样品的TNA的三重RT-PCR分析结果
结果分析表明,从未处理组和处理组中提取的TNA样品经过扩增后,GAT1/2的Ct值低于NED(表8),表明在所有样品中存在有效转录。计算所有样品在处理后所有时间点的倍数改变和VITA指数(表8)。由于两个基因及其转录物来计算GAT1/2,并且仅使用单个不转录的区域来计算NED,因此倍数变化是VITA指数的翻倍(表8)。在每个时间点,未处理样品和处理样品之间的VITA指数比较表明,VITA指数存在差异(图7的图iii)。这与在抗生素存在下细胞转录活性的破坏一致。ΔVITA比值是通过将VITA指数(不含抗生素)除以VITA指数与抗生素得出的。
根据实施例7,该实施例的数据表明,可以在一个反应中测量GAT1/2和NED,并将其结果用于计算VITA指数。通过比较处理后和未处理细胞的VITA指数,检测出对抗生素存在的反应,并计算为ΔVITA比值。这反映细胞对抗生素的敏感性。它进一步证明可以在不同时间点建立敏感性,包括在用阿奇霉素抗生素治疗后30分钟或1小时。
实施例9-使用VITAPCR用利福平和较短孵育时间进行抗生素敏感性试验
以下实施例估计了从已经感染了沙眼衣原体菌株1和菌株5(血清型D)实验室菌株和对利福平具有耐药性的血清型L2菌株的HEp-2细胞提取的TNA样品GAT相对于NED水平的变化。从感染后20小时处于指数生长期的细胞中提取TNA,该细胞已经用浓度为0.256μg/mL的抗生素利福平处理过,或未进行处理(对照)。如实施例1、处理C(1.1.3)所述进行处理。为了获得测量GAT,衣原体DNA和RNA使用靶向omp1基因及其转录物的两个不同区域的引物通过RT-PCR进行扩增。为了测量NED,衣原体DNA的另一个区域在同一RT-PCR中使用靶向不转录的基因组DNA区域的引物共扩增。估计了GAT和NED的水平,并用于计算VITA指数。除此之外,还使用已处理和未处理样品的VITA指数来计算ΔVITA比值。
9.1 GAT1、GAT2和NED的VITA PCR分析
当部分酶与omp1基因或omp1转录物扩增产生的扩增子结合时,它们被设计成可组装成两个活性MNA酶。这两个MNA酶能够结合通过扩增omp1的两个独立区域(GAT1和GAT2区域)而衍生的两个不同的扩增子。组装后,两个MNA酶可裂解同一报告底物Sub102(20)-FB。当与通过标记为infA_IGR的不转录的DNA区域的扩增而产生的扩增子结合时,第三对部分酶被设计为组装成活性MNA酶,从而提供了NED的量度。组装后,该MNA酶可裂解报告底物Sub72-A1B。下面列出了每种MNA酶的部分酶A和部分酶B的从5'到3'的序列。粗体的碱基与靶标杂交,加下划线的碱基形成组装的MNA酶中催化核心的一部分,斜体的碱基是指与底物杂交的序列。
SEQ ID NO:18 GAT1 CTomp1T_3A4/102-P的部分酶A
SEQ ID NO:19 GAT1 CTomp1T_3B5/102-P的部分酶B
SEQ ID NO:20 GAT2 CTomp1L_A4/102-P的部分酶A
SEQ ID NO:21 GAT2 CTomp1L_B5/102-P的部分酶B
SEQ ID NO:8 NED CTinfAIGR_A4/72-P的部分酶A
SEQ ID NO:9 NED CTinfAIGR_B5/72-P的部分酶B
9.2报告底物
在当前实施例中,使用了两种不同的报告底物,每种底物均标记有不同的荧光团。Sub102(20)-FB在5'末端标记有6-FAM,在3'末端标记有IABkFQ,并在516nm处监测其裂解,并在492nm处激发。Sub72-A1B在5'末端标记有ATTOTMRho101,在3'末端标记有IAbRQSp,并在609nm激发下592nm处监测其裂解。下面以5'至3'的顺序显示此实施例的报告底物。小写字母表示RNA,大写字母表示DNA。
SEQ ID NO:10 GAT1和GAT2 Sub102(20)-FB
TCGACGTCCCguCCTCTACCG
SEQ ID NO:11 NED Sub72-A1B
ATCACGCCTCguCTCCTCCCAG
9.3用于扩增GAT1、GAT2和NED的PCR引物
使用下面列出的引物对从沙眼衣原体感染的细胞中提取的TNA模板进行体外扩增。正向和反向引物用于通过RT-PCR扩增omp1基因和转录物(GAT1和GAT2)和infA_IGR DNA(NED)的两个区域。所有序列都以5'至3'书写。
SEQ ID NO:4 GAT1 5omp1的正向引物
CTTCTTCCTGGGACGAACG
SEQ ID NO:22 GAT1 3omp1_2的反向引物
CAATTAATGGCCTGAGGAATGTC
SEQ ID NO:16 GAT2 5CTomp1_1的正向引物
TTTCGGCGGAGATCCTTGCGATCC
SEQ ID NO:17 GAT2 3CTomp1_2的反向引物
CGAAAACAAAGTCACCGTAGTAACC
SEQ ID NO:12 NED 5CTinfAIGR_2的正向引物
GAGAGAGTGATTATATCGACTAA
SEQ ID NO:23 NED 3CTinfAIGR_3的反向引物
GCAAAAACTCAAGAGAGAATGTC
9.4制备TNA
如实施例1(1.1培养,1.1.3处理方案C)所述,已经在HEp-2细胞中培养的沙眼衣原体(血清型D)中共提取RNA和DNA(TNA)。按照实施例1中定义使用FireMonkey PuriSpin提取试剂盒进行提取(1.3总核酸(TNA)提取,1.3.2提取方案B)并遵照制造商同时提取DNA和RNA的说明。
9.5反应组分
所有反应均包含40nM每个正向引物、200nM每个反向引物、200nM每个部分酶A、200nM每个部分酶B、400nM底物SEQ ID NO 10和200nM底物SEQ ID NO 11、1x SensiFASTProbe No-ROX Mix(Bioline)、2mM MgCl2(Bioline)、0.2U/μL RiboSafe RNase抑制剂(Bioline)、0.2μL逆转录酶(Bioline)和无核酸酶水(Ambion),总体积为20μL。所有反应均一式三份在CFX96热循环仪上进行。循环参数为48℃10分钟,95℃2分钟,10个循环的95℃5秒和61℃30秒(每个循环下降0.5℃),和30个循环的95℃5秒和52℃50秒。反应含有5μL TNA模板(1/1000稀释)或不含靶标(dH2O)。
9.6结果
来自omp1基因和转录物(GAT1和GAT2)的2个区域以及一个NED区域的衣原体DNA和RNA在单个RT-PCR中从衣原体培养物中提取的TNA进行了共扩增和检测。在指数生长期这些培养物用抗生素处理或不进行处理(对照)。将它们在37℃下孵育5分钟(图7的图iv)或在室温下孵育15分钟(图7的图v)。用于治疗的抗生素为利福平,浓度为0.256μg/mL,相当于敏感性菌株的MIC的32倍,耐药性菌株的MIC的32倍。表9显示了每个样品中GAT1/2和NED的阈值循环(Ct)值。将ΔCt计算为NED和GAT1/2信号的Ct值之间的差。进而,理论上会导致这ΔCt值的倍数改变(GAT1/2与NED之间的差异)估计为2ΔCt,如表9所示。然后在每个时间点比较未处理的反应(对照)和抗生素处理后的结果(图7的图iv和v)。
表9:来自处理和未处理样品的TNA的三重RT-PCR分析结果,分别在处理后(PT)的不同时间点:在37℃,5%CO2下孵育5分钟和在室温下孵育15分钟收获。
/>
结果分析表明,从未处理组和处理组中提取的TNA样品经过扩增后,GAT1/2的Ct值低于NED(表9),表明在所有样品中存在有效转录。计算所有样品在处理后所有时间点的倍数改变和VITA指数(表9)。由于两个基因及其转录物来计算GAT1/2,并且仅使用单个不转录的区域来计算NED,因此倍数变化是VITA指数的翻倍(表9)。在每个时间点和孵育条件下,使用未配对的t检验分析未处理样品和已处理样品之间VITA指数的下降。
结果显示,在37℃与利福平孵育5分钟后,敏感性菌株1的VITA指数显著降低(表9,p<0.0001)(图7的图iv)。这与在抗生素存在下细胞转录活性的破坏一致并证实了该特定血清型的敏感性谱。相反,在这些相同条件下,耐药性菌株(5号菌株)的VITA指数未显示已处理样品与未处理样品之间的显著差异(表9,图7的图iv),证实了该特定血清型的耐药性谱。在平行实验中,在37℃室温与利福平孵育15分钟观察到敏感性菌株1的重复的VITA指数显著降低(表9,p<0.0001)(图7的图v)。在相同条件下,在存在利福平的情况下,耐药性菌株5的VITA指数没有降低,实际上显示出很小的增加。
该实施例的数据表明,可以在一个反应中测量GAT1/2和NED,并将其结果用于计算VITA指数。通过比较处理后和未处理细胞的VITA指数,检测出对抗生素存在的反应,并计算为ΔVITA比值。这可用于准确反映细胞的抗生素敏感性或耐药性,并进一步证明可以在较短的温育时间后建立敏感性。最早在抗生素处理后5分钟即可检测出对抗生素的敏感性和对抗生素的耐药性。还证明了在37℃的稳定温度下培养的必要性不是必需的,而在室温下培养可以正确地区分敏感性和耐药菌。
实施例10:使用VITA PCR进行抗生素敏感性测试–使用提取方案A进行剂量依赖性反应
以下实施例估计了从已经感染了沙眼衣原体(血清型D)的HEp-2细胞提取的TNA样品GAT相对于NED的变化。从未经处理(对照)或用不同剂量的抗生素(阿奇霉素)处理的细胞中提取TNA;具体来说,浓度为MIC的四倍(0.128μg/mL)、MIC的六倍(0.192μg/mL)和MIC的八倍(0.256μg/mL)。如实施例1、处理D(1.1.4)中所述,当细胞处于指数生长期时,在感染后24小时加入抗生素。为了测量GAT,衣原体DNA和RNA使用靶向omp1基因及其转录物的两个不同区域的引物通过RT-PCR进行扩增。为了测量NED,衣原体DNA的另一个区域在同一RT-PCR中使用靶向不转录的基因组DNA区域的引物共扩增。估计了GAT和NED的水平,并用于计算VITA指数。除此之外,还使用已处理和未处理样品的VITA指数来计算ΔVITA比值。
10.1 GAT1、GAT2和NED的VITA PCR分析
用于扩增和检测GAT1、GAT2和NED的部分酶寡核苷酸,报道基因底物和PCR引物根据实施例5(分别为5.1、5.2和5.3)。如实施例5(5.5)所述使用RT-PCR条件,反应含有5μLTNA模板(1/1000稀释)或不含靶标(dH2O)。
10.2制备TNA
如实施例1(1.1培养,1.1.4处理方案D)所述,已经在HEp-2细胞中培养的沙眼衣原体(血清型D)中共提取RNA和DNA(TNA)。提取使用酚:氯仿:异戊基以LLE技术进行,也如实施例1所述(1.3总核酸(TNA)提取,1.3.1提取方案A)经过以下修改;在该实施例中,在样品提取期间未进行细胞碎片沉淀步骤。
10.3结果
来自omp1基因和转录物(GAT1和GAT2)的2个区域以及一个NED区域的衣原体DNA和RNA在单个RT-PCR使用从衣原体培养物中提取的TNA进行了共扩增和检测。这些培养物在指数生长期过程中用连续剂量的抗生素处理或未经处理(对照),并在孵育1小时后收获(图8的图i)。表10显示了每个样品中GAT1/2和NED的阈值循环(Ct)值。将ΔCt计算为NED和GAT1/2信号的Ct值之间的差。进而,理论上会导致这ΔCt值的倍数改变(GAT1/2与NED之间的差异)估计为2ΔCt,如表10所示。然后比较不同剂量抗生素下未处理的反应(对照)和抗生素处理后的结果(图8的图ii)。
表10:在处理后1小时收获的未处理样品和经连续剂量抗生素处理的样品中TNA的三重RT-PCR分析结果
预计在存在抗生素情况下对抗生素处理敏感的细胞的转录水平会降低,因为预期这会破坏细胞的正常功能。此外,据预测,较高剂量的抗生素将导致对正常功能的更大破坏,并因此导致转录水平的更大破坏。进行该实施例以证明这一点,并确定所处理细胞的VITA指数的降低是否与所用抗生素的剂量有关。
结果分析表明,从未处理组和处理组中提取的TNA样品经过扩增后,GAT1/2的Ct值低于NED(表10),这与在所有四种样品中的有效转录一致。计算每种样品的倍数改变和VITA指数(表10)。由于两个基因转录物区域用来计算GAT1/2,并且仅使用单个不转录的区域来计算NED,因此倍数变化是VITA指数的翻倍(表10)。未处理样品和处理样品的VITA指数比较表明存在差异(图8的图ii)。对于未处理(无药物)和经处理(加药物剂量1)而言,差异是显著的(p=0.0005,使用不配对t检验)。对于所有处理的样品,不仅比未处理的样品要低,而且在孵育过程中使用的抗生素剂量越高,它们的顺序也就越低(图8的图ii)。在该实验中,剂量与VITA指数的降低之间存在相关性(R2=0.9775,图8的图ii)。这与存在抗生素的情况下转录活性的降低是一致的,并且所给予的抗生素剂量越高,观察到的对转录活性的破坏就越大。ΔVITA比值是通过将VITA指数(无抗生素)除以用每种抗生素剂量(加抗生素剂量1、剂量2和剂量3,表10,图8的图ii)处理的样品的VITA指数得出的。
该实施例的数据表明,可以在一个反应中测量GAT1/2和NED,并将其结果用于计算VITA指数。经处理和未处理的细胞的VITA指数之间的比较,以ΔVITA比值计算,表明对抗生素的存在有反应。当连续使用更高剂量的抗生素时,对抗生素的反应也更大,表明剂量依赖性反应。这进一步证明了使用VITA指数检查细胞是否对抗生素敏感的能力,并且经过1小时的孵育就足以确定这种情况。对药物的剂量依赖性反应可以在药物发现或药物筛选程序中找到应用。
实施例11-使用VITA PCR进行抗生素敏感性测试–使用提取方案B进行剂量依赖性反应
以下实施例估计了从已经感染了沙眼衣原体(血清型D)的HEp-2细胞提取的TNA样品GAT相对于NED的变化。从未经处理(对照)或用不同剂量的抗生素阿奇霉素处理的细胞中提取TNA;具体来说,浓度为MIC的四倍(0.128μg/mL)、MIC的六倍(0.192μg/mL)、MIC的八倍(0.256μg/mL)和MIC的十六倍(0.512μg/mL)。如实施例1、处理D(1.1.4)中所述,当细胞处于指数生长期时,在感染后20小时加入抗生素。为了测量GAT,衣原体DNA和RNA使用靶向omp1基因及其转录物的两个不同区域的引物通过RT-PCR进行扩增。为了测量NED,衣原体DNA的另一个区域在同一RT-PCR中使用靶向不转录的基因组DNA区域的引物共扩增。估计了GAT和NED的水平,并用于计算VITA指数。除此之外,还使用已处理和未处理样品的VITA指数来计算ΔVITA比值。
11.1 GAT1、GAT2和NED的VITA PCR分析
用于扩增和检测GAT1、GAT2和NED的部分酶寡核苷酸,报道基因底物和PCR引物根据实施例9(分别为9.1、9.2和9.3)。如实施例9(9.5)所述使用RT-PCR条件,反应含有5μLTNA模板(1/1000稀释)或不含靶标(dH2O)。
11.2制备TNA
如实施例1(1.1培养,1.1.4处理方案D)所述,已经在HEp-2细胞中培养的沙眼衣原体(血清型D)中共提取RNA和DNA(TNA)。按照实施例1中定义使用FireMonkey PuriSpin提取试剂盒进行提取(1.3总核酸(TNA)提取,1.3.2提取方案B)并遵照制造商同时提取DNA和RNA的说明。
11.3结果
使用从衣原体培养物中提取的TNA,在单个RT-PCR中监测来自2个区域(GAT1和GAT2)以及一个NED区域的衣原体DNA和RNA的共扩增。这些培养物在指数生长期过程中用连续剂量的抗生素处理或未经处理(对照),并在处理后1小时后收获(图8的图i)。表11显示了每个样品中GAT1/2和NED的阈值循环(Ct)值。将ΔCt计算为NED和GAT1/2信号的Ct值之间的差。进而,理论上会导致这ΔCt值的倍数改变(GAT1/2与NED之间的差异)估计为2ΔCt,如表11所示。然后比较不同剂量抗生素下未处理的反应(对照)和抗生素处理后的结果(图8的图iii)。
表11:在处理后1小时孵育的未处理样品和经连续剂量抗生素处理的样品中TNA的三重RT-PCR分析结果
以如实施例10中所述的相同的方式预计对抗生素处理敏感的细胞转录水平会降低,因为预期存在抗生素会破坏细胞的正常功能。预计引起的破坏可能与抗生素的剂量有关,因此,抗生素剂量越高,对正常功能、转录水平和产生的VITA指数的破坏就越大。
结果分析表明,从未处理组和处理组中提取的TNA样品经过扩增后,GAT1/2的Ct值低于NED(表11)。这与所有样品中的有效转录一致。计算样品的倍数改变和VITA指数(表11)。倍数改变是VITA指数的两倍(表11),因为使用了两个基因和相应的转录区来计算GAT1/2,并且仅使用单个不转录的区域来计算NED。未经处理(无药物)和经处理样品(加药物剂量1)的VITA指数比较显示出显著差异(图8,图iii,使用未配对t检验生成的p<0.05)。所有剩余的处理过的样品也与未处理过的样品不同(图8,图iii)。处理过的样品显示的VITA指数低于未处理过的样品。此外,随着处理剂量的增加,VITA指数降低(图8的图iii)。这与存在抗生素的情况下转录活性的降低是一致的并且进一步证明,使用的抗生素越多,观察到的对转录活性的破坏就越大。这种趋势还在VITA指数和抗生素剂量之间产生了线性相关性(R2=0.8325)(图8的图iii,表11)。ΔVITA比值是通过将VITA指数(无抗生素)除以用每种抗生素剂量(加抗生素剂量1、剂量3、剂量3和剂量4)处理的样品的VITA指数得出的。ΔVITA比值显示出与抗生素剂量增加相关的值增加(表11)。
该实施例的数据进一步表明,可以在一个反应中测量GAT1/2和NED,并将其结果用于计算VITA指数。经处理和未处理的细胞的VITA指数之间的比较,以ΔVITA比值计算,表明对抗生素的存在有反应。对抗生素的反应与用于处理的剂量呈线性相关,表明剂量依赖性反应。这与用于获得TNA样品的提取方法无关。如在实施例10中所见,这进一步证明了使用VITA指数检查细胞是否对抗生素敏感或具有耐药性的能力,并且经过1小时的孵育就足够了。VITAPCR检测对药物的剂量依赖性反应的能力可以在药物发现或药物筛选程序中找到应用。
实施例12-使用VITA PCR用阿奇霉素和强力霉素进行抗生素敏感性测试
以下实施例通过估计TNA样品中GAT相对于NED的改变来分析细菌对特定药物的敏感性。然后将这些样品在用抗生素处理和未处理(对照)的样品之间进行比较。从已经感染了不同沙眼衣原体菌株的HEp-2细胞获得样品,已知该菌株对阿奇霉素和强力霉素都敏感。在感染后20小时处于指数生长期时从已经用单剂量抗生素(0.256μg/mL)处理过的细胞中,或者未处理(对照)的细胞中提取TNA,并在处理后孵育一小时。如实施例1、处理E(1.1.5)所述进行处理。为了获得测量GAT,衣原体DNA和RNA使用靶向omp1基因及其转录物的两个不同区域的引物通过RT-PCR进行扩增。为了测量NED,衣原体DNA的另一个区域在同一RT-PCR中使用靶向不转录的基因组DNA区域的引物共扩增。估计了GAT和NED的水平,并用于计算VITA指数。除此之外,还使用已处理和未处理样品的VITA指数来计算ΔVITA比值。
12.1 GAT1、GAT2和NED的VITA PCR分析
用于扩增和检测GAT1、GAT2和NED的部分酶寡核苷酸,报道基因底物和PCR引物根据实施例9(分别为9.1、9.2和9.3)。如实施例9(9.5)所述使用RT-PCR条件,反应含有5μLTNA模板(1/1000稀释)或不含靶标(dH2O)。
12.2制备TNA
如实施例1(1.1培养,1.1.5处理方案E)所述,已经在HEp-2细胞中培养的不同沙眼衣原体菌株中共提取RNA和DNA(TNA)。按照实施例1中定义使用FireMonkey PuriSpin提取试剂盒进行提取(1.3总核酸(TNA)提取,1.3.2提取方案B)并遵照制造商同时提取DNA和RNA的说明。
12.3结果
来自2个GAT区域以及一个NED区域的衣原体DNA和RNA在单个RT-PCR中从衣原体培养物中提取的TNA进行了共扩增和检测。这些培养物在指数生长期用抗生素处理或未经处理(对照),并在处理后1小时收获。表12a和12b显示了每种样品(处理或未处理)的每种个体菌株的阈值循环(Ct)值,并且用于处理的抗生素分别是阿奇霉素和强力霉素。将ΔCt计算为NED和GAT1/2信号的Ct值之间的差。进而,理论上会导致这ΔCt值的倍数变化(GAT1/2与NED之间的差异)估计为2ΔCt,如表12a和12b所示。然后比较每种菌株的未处理的反应(对照)和抗生素处理后的结果。所测试的抗生素是阿奇霉素(表12a,图9的图i)和强力霉素(表12b,图9的图ii)。
由于先前测试的所有菌株均已表征为对本实施例中使用的两种抗生素均敏感,因此可以预期处理后和未处理样品的VITA指数之间会有差异。预计处理后样品的VITA指数将低于未处理样品,因为抗生素的存在会导致细胞正常转录活性的破坏。随后,所有样品均表明它们是活的并且有效转录,而与处理无关。从未经处理和处理过的组中提取的TNA样品的扩增可观察到这一点,其显示出GAT1/2的Ct值低于NED,与所使用的抗生素无关(表12a和12b)。
针对所使用的每种药物计算所有样品在处理后所有时间点的倍数改变和VITA指数(表12a和12b)。在每个时间点,未处理样品和已处理样品之间的VITA指数比较显示出显著差异,对于所有测试的菌株和抗生素,处理后样品的VITA指数均低于未处理样品(对于每个样品,未配对t检验的p<0.01组;表12a和12b,图9,图i和ii)。这与预计的结果一致,证明该菌株对用于处理的药物具有敏感性,并导致转录活性的破坏。通过将VITA指数(不含抗生素)除以VITA指数(含抗生素)而计算出的ΔVITA比值,在使用相同抗生素测试的每个菌株之间以及在抗生素之间也显示出相似的结果(表12a和12b)。
由结果所获得的该实验表明,可以在一个反应中测量GAT1/2和NED,并将其结果用于计算VITA指数和ΔVITA比值。从每种测试菌株获得的个体反应与其通过分析经处理与未经处理的VITA指数获得的两种抗生素的预期敏感性一致。这进一步突出了利用VITA指数在有或没有目标药物存在的情况下经过短时间孵育来检查细胞的抗生素敏感性的能力。
表12a:在用阿奇霉素处理后(PT)一小时收获的来自处理过的样品和未处理的样品的TNA的三重RT-PCR分析结果
表12b:在用强力霉素处理后(PT)1小时收获的来自处理过的样品和未处理的样品的TNA的三重RT-PCR分析结果
/>
实施例13:使用耐药性和敏感性菌株使用利福平使用VITA PCR进行抗生素敏感性测试
以下实施例通过估计TNA样品中GAT相对于NED的改变来分析细菌对特定药物的敏感性。然后将这些样品在用抗生素处理和未处理(对照)的样品之间进行比较。从感染了不同沙眼衣原体菌株的HEp-2细胞获得样品,这些菌株以前在培养中表征为对药物利福平敏感(总共四个菌株:血清型D,实验室菌株(菌株1),血清型L2,野生型实验室菌株(菌株2),血清型L2,甲氧苄啶抗性菌株(菌株3)和血清型L2,壮观霉素抗性菌株(菌株4));或对利福平有耐药性(血清型L2,对利福平有耐药性的菌株(菌株5))。从感染后20小时处于指数生长期的细胞中提取TNA,该细胞已经用MIC的抗生素处理过,或未进行处理(对照)。如实施例1,处理E(1.1.5)中所述进行处理,使用单一浓度的利福平(0.256μg/mL),相当于敏感菌株的MIC的32倍,比耐药性菌株的MIC低32倍。为了获得测量GAT,衣原体DNA和RNA使用靶向omp1基因及其转录物的两个不同区域的引物通过RT-PCR进行扩增。为了测量NED,衣原体DNA的另一个区域在同一RT-PCR中使用靶向不转录的基因组DNA区域的引物共扩增。估计了GAT和NED的水平,并用于计算VITA指数。除此之外,还使用已处理和未处理样品的VITA来计算ΔVITA。
13.1 GAT1、GAT2和NED的VITA PCR分析
用于扩增和检测GAT1、GAT2和NED的部分酶寡核苷酸,报道基因底物和PCR引物根据实施例9(分别为9.1、9.2和9.3)。如实施例9(9.5)所述使用RT-PCR条件,反应含有5μLTNA模板(1/1000稀释)或不含靶标(dH2O)。
13.2制备TNA
如实施例1(1.1培养,1.1.5处理方案E)所述,已经在HEp-2细胞中培养的所有不同沙眼衣原体菌株(菌株1、2、3、4和5)中共提取RNA和DNA(TNA)。按照实施例1中定义使用FireMonkey PuriSpin提取试剂盒进行提取(1.3总核酸(TNA)提取,1.3.2提取方案B)并遵照制造商同时提取DNA和RNA的说明。
13.3结果
来自2个GAT区域以及一个NED区域的衣原体DNA和RNA在单个RT-PCR中从衣原体培养物中提取的TNA进行了共扩增和检测。这些培养物在指数生长期过程中用抗生素处理(利福平)或未经处理(对照),并在处理后1小时收获。表13显示了每个样品中每个个体菌株的组分的阈值循环(Ct)值。将ΔCt计算为NED和GAT1/2信号的Ct值之间的差。进而,理论上会导致这ΔCt值的倍数改变(GAT1/2与NED之间的差异)估计为2ΔCt,如表13所示。比较了每种菌株的无处理反应(对照)和用抗生素处理的结果(图9,图iii);并比较了敏感性菌株和耐药性菌株的结果。计算所有样品在处理后一小时的倍数改变和VITA指数(表13)。
未处理样品和处理样品之间的VITA指数比较显示,菌株1-4的VITA指数存在显著差异(p<0.0001,使用不配对t检验,表13)。这与破坏对用于处理的抗生素敏感的细胞的转录活性是一致的,并且在图9的图iii中可见。在未处理样品和处理样品之间比较菌株5的VITA指数没有显著差异,VITA指数相似(图9,图iii,表13)。这表明在37℃下孵育1h对抗生素利福平具有耐药性,这与对该菌株的转录几乎没有干扰或没有干扰有关。
ΔVITA比值是通过将VITA指数(不含抗生素)除以VITA指数与抗生素得出的。菌株5(抗性菌株)的ΔVITA比值显著降低(表13),进一步表明已处理样品与未处理样品之间的差异减少了。在所有情况下,所有其他菌株的ΔVITA比值均>2.93(表13)。ΔVITA比值的图形直观地显示了敏感性菌株和耐药性菌株的ΔVITA比值之间的差异(图9的图iv)。这些差异也被确定为具有统计学差异(p<0.0001,未配对的韦尔奇t检验)。ΔVITA的阈值为1.63,可以95%的置信度区分敏感菌株和耐药菌株(图9,图iv)。
该实验的结果表明,可以在一个反应中测量GAT1/2和NED,并将其结果用于计算VITA指数。除此之外,经处理和未处理的细胞的VITA指数之间的比较,以ΔVITA比值计算,进一步与是否存在对抗生素的反应有关。从每个测试菌株获得的个体反应与其对所用抗生素的预期敏感性一致,而缺乏反应则与测试菌株的耐药性有关。这进一步突出了利用VITA指数在有或没有目标药物存在的情况下经过短时间孵育来检查细胞的抗生素敏感性或耐药性的能力。
表13:处理后(PT)1小时后收获的,使用抗生素利福平的处理过的和未处理过的样品中TNA的三重RT-PCR分析结果,并比较了敏感性菌株和耐药性菌株。
/>
实施例14-使用VITA PCR的示例性抗生素敏感性测试
以下实施例描述了一个如图10所示的方法,该方法可以用作感染的一般筛选,包括性传播感染及其抗生素耐药性/敏感性状态。可以从怀疑患有性传播感染(例如淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhea)(GC),沙眼衣原体(CT)或生殖道支原体(Mycoplasmagenitalium)(MG))的患者中获取临床标本。可以将标本分为多个子样品,其中一个不与任何抗生素一起孵育,而另一个可以在用于治疗GC、CT和MG中的一种或多种的一系列抗生素存在下进行孵育。孵育后,可以使用针对GC和/或CT和/或MG的靶向GAT和NED的引物在多重VITAPCR分析中分析总核酸。特定生物的GAT和NED阳性信号可以诊断STI,在有无药物存在下比较VITA指数可以揭示哪种疗法可以用于治疗患者。
此外,可以分析大量样品并为测定中的每种生物建立阈值VITA指数。然后该阈值可以用作诊断这些性传播感染的工具和/或提供一种在用适当的抗生素治疗后进行治愈测试的方法。此外,在存在或不存在每种抗生素的情况下对大量样品进行分析可以确定能够区分每种生物对每种抗生素的敏感性或抗耐药性的ΔVITA比值阈值。然后可以将ΔVITA比值阈值用作预测对特定抗生素反应的工具,其形式将不再需要样本或样品的子样品作为未经处理的对照比较物。此外,由于实施例7已经表明,在短短5分钟的孵育后就可以确定敏感性和耐药性,因此将孵育与快速扩增方案结合起来可以使其适合作为快速即时检验。最终,由于实施例7还证明了与药物的孵育可以在室温下进行,因此这种测试应不需要提取和扩增所需的额外设备。
实施例15–VITA PCR在不同负荷的活材料方面的用途
以下实施例估计了对死的细菌具有可变活菌负荷的样品中NED和GAT的水平。从感染了沙眼衣原体(血清D)的HEp-2细胞中提取TNA,要么未经处理(活的CT),要么用高剂量0.512ug/ml的抗生素阿奇霉素处理40小时(死的CT)。如实施例1中所述,在收获后,将它们以不同比例混合以获得0%、0.1%、0.2%、0.5%、1%、10%、20%、50%和100%的不同活负荷(处理F(1.1.6)。衣原体DNA和RNA使用靶向omp1基因及其转录物的两个不同区域的引物通过RT-PCR进行扩增以测量GAT。衣原体DNA的另一个区域在同一RT-PCR中使用靶向不转录的基因组DNA区域的引物共扩增以测量NED。估计了GAT和NED的水平,并用于计算VITA指数。
15.1 GAT1、GAT2和NED的VITA PCR分析
用于扩增和检测GAT1、GAT2和NED的部分酶寡核苷酸,报道基因底物和PCR引物根据实施例9(分别为9.1、9.2和9.3)。在本实施例中,将NED的反向引物(SEQ ID NO 23)替换为以下引物。
SEQ ID NO:13 NED 3CTinfAIGR_1的反向引物
CAAGAGAGAATGTCAAAAGATAC
如实施例9(9.5)所述使用RT-PCR条件,反应含有5μL TNA模板(1/100稀释)或不含靶标(dH2O)。
15.2制备TNA
如实施例1(1.1培养,1.1.6处理方案F)所述,已经在HEp-2细胞中培养的沙眼衣原体(血清型D)中共提取RNA和DNA(TNA)。按照实施例1中定义使用FireMonkey PuriSpin提取试剂盒进行提取(1.3总核酸(TNA)提取,1.3.2提取方案B)并遵照制造商同时提取DNA和RNA的说明。
15.3结果
衣原体DNA和RNA(GAT)或仅DNA(NED)在单个RT-PCR中从TNA共同扩增,该TNA提取自活的未处理细胞(活的CT)和高剂量抗生素处理的细胞(死的CT)的混合物,以产生可变负荷的活衣原体。表14显示了在反应中使用GAT1或GAT1/2为每个活负荷测得的阈值循环(Ct)值。将ΔCt计算为NED和GAT信号的Ct值之间的差。进而,理论上会导致这些ΔCt值的倍数改变(GAT与NED的比率)估计为2ΔCt并且绘制在表15中,VITA指数绘制在图11的图i中。然后将结果与每种混合物中生存力的百分比进行比较。
通过感染性和免疫荧光染色进行生存力分析,以确认每个混合样品中负荷的准确性。这可视化证实了衣原体包涵体随生存力百分比的增加而增加(数据未包括在内)。
从理论上讲,低负荷的活细胞在来自非活细胞的基因组DNA背景中可检测到较低水平的转录物。如果在处理过程中DNA没有降解,则可以预期检测到的DNA量将大于RNA量,因为DNA本质上比RNA稳定。在具有大量活细胞的样品中,预期会有更大量的转录物。
结果分析表明,当扩增从0%活的样品中提取的TNA时,GAT和NED的ΔCt值很小(表14),表明有效转录很少或没有有效转录。对于具有0.2%或更高的活负荷的所有样品,GAT的Ct值均低于NED(表14),与有效转录一致。计算所有活负荷的倍数改变和VITA指数(表14)。活负荷为0%的样品的VITA指数与活负荷为0.2%或更高的样品的VITA指数显著不同(图11的图i,表14,p<0.05)。在活负荷大于0.2%的混合物之间未观察到显著差异(表14,p>0.05)。还测试了0.1%的生存力负荷,发现VITA指数与0%生存力负荷的VITA指数显著不同,但对于大于0.2%的生存力负荷也显著不同(数据未显示)。
正如预期的,不同的活负荷也导致GAT和NED反应的Ct值不同,因为Ct值与每种混合物中沙眼衣原体的染色体拷贝相关。由于来自死的CT的细胞与药物孵育40小时,这表明RNA的有效转录可能不仅停止了,而且细菌的主动复制也停止了,从而影响了DNA的浓度。在这段时间内,DNA和RNA都有可能降解。因此,较高的活菌负荷(较早检测)比较低的活菌负荷(在较晚的PCR循环中检测)显示较低的Ct值(图11的图ii)。这也与来自混合物的衣原体生存力分析相关(图11的图i)。
该实施例中的数据表明,VITA指数与有生存力的群体和无生存力的群体的度量值相关,这可以通过低负荷(仅0.1%)的有生存力的群体与无生存力的群体之间的差异来证明。该实施例证实了可以在单个反应中测量GAT和NED,并且该结果可以用于计算与观察到的生存力(低至0.1%的活负荷,并且与无生存力的群体区别开来)相关的VITA指数。最后,该实施例证明了VITA PCR的主要优点在于,不必定量添加到VITA PCR中的TNA的量,因为该方法确定了GAT与NED的比例,而与起始原料的量无关。对此的证据是,在该实施例中研究的广泛范围内,没有观察到活负荷之间的显著差异。
表14:包含不同生存力负荷的样品的TNA的三重RT-PCR分析结果
实施例16–扩增子大小和其他RT-PCR参数对VITA指数的影响
以下实施例估计了从感染了沙眼衣原体(血清型D)的HEp-2细胞提取的TNA样品中NED和GAT的水平。从未与抗生素孵育的细胞(未经处理的活细胞)以及与抗生素孵育的细胞中提取TNA,抗生素浓度比MIC低8倍(<MIC)、在MIC(MIC)或比MIC高8倍(>MIC),如实施例1处理方案A(1.2.1)所述。衣原体DNA和RNA(GAT)使用靶向omp1基因及其转录物的两个不同区域的引物通过RT-PCR进行扩增(GAT1/2)。在本实验中,用于扩增两个omp1 GAT靶标的两个引物对(第16.3节SEQ ID NO4和24;SEQ ID NO 16和25)产生的扩增子比使用在先前实施例(包括实施例5)中使用的两个GAT引物对产生的扩增子更长(第5.3节SEQ ID NO 4和5,SEQID NO 16和17)。对于GAT1和GAT2,所得的扩增子分别长215bp和311bp。使用靶向不转录的基因组DNA区域(称为infAIGR)的引物,在同一RT-PCR混合物中共扩增衣原体DNA(NED)。估计所有处理的RT-PCR的GAT1/2和NED的Ct值。
16.1 GAT1、GAT2和NED的VITA PCR分析
当部分酶与omp1基因或omp1转录物扩增产生的扩增子结合时,它们被设计成可组装成两个活性MNA酶。这两个MNA酶能够结合通过扩增omp1的两个独立区域(GAT1和GAT2区域)而衍生的两个不同的扩增子。组装后,两个MNA酶可裂解同一报告底物Sub102(20)-FB。当与通过标记为infA_IGR的不转录的DNA区域的扩增而产生的扩增子结合时,第三对部分酶被设计为组装成活性MNA酶,从而提供了NED的量度。组装后,该MNA酶可裂解报告底物Sub72-A1B。下面列出了每种MNA酶的部分酶A和部分酶B的从5'到3'的序列。粗体的碱基与靶标杂交,加下划线的碱基形成组装的MNA酶中催化核心的一部分,斜体的碱基是指与底物杂交的序列。
SEQ ID NO:6 GAT1 omp1_A4/102-P的部分酶A
SEQ ID NO:7 GAT1 omp1_B5/102-P的部分酶B
SEQ ID NO:20 GAT2 CTomp1L_A4/102-P的部分酶A
SEQ ID NO:21 GAT2 CTomp1L_B5/102-P的部分酶B
SEQ ID NO:8 NED CTinfAIGR_A4/72-P的部分酶A
SEQ ID NO:9 NED CTinfAIGR_B5/72-P的部分酶B
16.2报告底物
在当前实施例中,使用了两种不同的报告底物,每种底物均标记有不同的荧光团。Sub102(20)-FB在5'末端标记有6-FAM,在3'末端标记有IABkFQ,并在516nm处监测其裂解,并在492nm处激发。Sub72-A1B在5'末端标记有ATTOTMRho101,在3'末端标记有IAbRQSp,并在609nm激发下592nm处监测其裂解。下面以5'至3'的顺序显示此实施例的报告底物。小写字母表示RNA,大写字母表示DNA。
SEQ ID NO:10 GAT1和GAT2 Sub102(20)-FB
TCGACGTCCCguCCTCTACCG
SEQ ID NO:11 NED Sub72-A1B
ATCACGCCTCguCTCCTCCCAG
16.3用于扩增GAT1、GAT2和NED的PCR引物
使用下面列出的引物对从沙眼衣原体感染的细胞中提取的TNA模板进行体外扩增。正向和反向引物用于通过RT-PCR扩增omp1基因和转录物(GAT1和GAT2)和infA_IGR DNA(NED)的两个区域。所有序列都以5'至3'书写。
SEQ ID NO:4 GAT1 5omp1的正向引物
CTTCTTCCTGGGACGAACG
SEQ ID NO:24 GAT1 3omp1_2Lhp3的反向引物
GAGCTATAATTAGCTCTCTTTGTGCTC
SEQ ID NO:16 GAT2 5CTomp1_1的正向引物
TTTCGGCGGAGATCCTTGCGATCC
SEQ ID NO:25 GAT2 3CTomp1_6的反向引物
GATATCCACTGGTGGCTCCTAA
SEQ ID NO:12 NED 5CTInfAIGR_2的正向引物
GAGAGAGTGATTATATCGACTAA
SEQ ID NO:23 NED 3CTinfAIGR_3的反向引物
GCAAAAACTCAAGAGAGAATGTC
16.4制备TNA
从已经按照实施例1(1.1培养,1.1.1处理方案A)通过体外方法获得、在HEp-2细胞中培养的沙眼衣原体(血清型D)中共提取RNA和DNA(TNA)。使用苯酚:氯仿:异戊基,以LLE技术进行提取,实施例1中也进行了描述(1.3总核酸(TNA)提取)。
16.5反应组分
所有反应均包含40nM每个正向引物、200nM每个反向引物、200nM每个部分酶A、200nM每个部分酶B、400nM底物SEQ ID NO 10和200nM底物SEQ ID NO 11、1x SensiFASTProbe No-ROX Mix One-Step(Bioline)、2mM MgCl2(Bioline)、0.2U/μL RiboSafe RNase抑制剂(Bioline)、0.2μL逆转录酶(Bioline)和无核酸酶水(Ambion),总体积为20μL。所有反应均一式三份在CFX96热循环仪上进行。循环参数为48℃10分钟,95℃2分钟,10个循环的95℃5秒和61℃30秒(每个循环下降0.5℃),和30个循环的95℃5秒和52℃50秒。反应含有5μL TNA模板(1/1000稀释)或不含靶标(dH2O)。
16.6结果
在单个RT-PCR中共扩增衣原体的DNA和RNA来自omp基因和转录物的两个区域(GAT1和GAT2)以及一个NED区域和提取自未处理的活细胞和用浓度低于(<MIC)、等于(MIC)或高于MIC浓度(>MIC)的抗生素孵育的细胞的TNA(图5的图ii)。表15显示了每个样品中针对NED以及来自GAT1和GAT2(GAT1/2)的组合信号测得的阈值周期(Ct)值。将ΔCt计算为NED和GAT1/2的Ct值之间的差。进而,理论上会导致这些ΔCt值的倍数改变(GAT与NED的比值)估计为2ΔCt,如表15所示。VITA指数是用FC除以TR得出的。然后将结果与每个细胞群体中的生存力进行比较。
在本实施例中使用的引物对产生比在先前实施例中观察到的更长的扩增子。对于GAT1和GAT2,扩增子长度分别215bp和311bp。可以预期使用更长的扩增子来提供有关生物生存力的更准确和更严格的估计,因为这些引物组将扩增较少的与死细胞相关的短的残留片段,或由于存在抗生素而使表达降低的细胞。因此,对于GAT使用较长或较短的扩增子将有望改变每个测试样品(未处理或用不同剂量的抗生素处理)获得的VITA指数的绝对值,但不会改变细胞之间的相关性,如通过免疫荧光染色(图3的图i和ii)或可以通过检查VITA指数得出的信息(表15,图12)测得的生存力。
表15:使用引物对扩增来自已处理和未处理样品的TNA的三重RT-PCR分析结果,从而为GAT1和GAT2产生长的扩增子长度
结果分析表明,当从未经处理或低于MIC的处理过的样品中提取的TNA样品被扩增时,GAT1/2的Ct值低于NED(表15),与两种样品类型的有效转录一致。对于以MIC或更高水平处理TNA的GAT1/2和NED,Ct值的差异非常小(<1)(表15),表明DNA没有被有效转录。计算了四种样品类型的倍数改变和VITA指数(表15)。由于两个基因及其转录物用于计算GAT1/2,并且仅使用单个不转录的区域来计算NED,因此倍数改变除以TR即可计算出VITA指数(表15)。数据表明,与用于检测的较短的扩增子相比,长的GAT扩增子可转化为较低的VITA指数(图12)(如实施例5所示)(图5的图ii)。这表明生成较长扩增子的GAT引物检测到的部分降解的转录片段较少。
该实施例的结果证实了可以在单个反应中测量GAT和NED,并且该结果可以用于计算与观察到的细胞生存力相关的VITA指数。它进一步显示了有活力和无活力样品之间的VITA指数差异,其中VITA指数低于用GAT1和GAT2短扩增子观察到的指数。尽管在此实施例中使用了不同的参数,但还是准确地确定了有生存力的细胞和无生存力的细胞之间的最终区别,所有样品观察到的趋势与具有较短GAT1和GAT2扩增子的VITA指数相比。
实施例17–使用VITA PCR对淋病奈瑟氏球菌进行示例性治愈测试和抗生素药敏试验
以下实施例描述了针对淋病奈瑟氏球菌(GC)的靶向诊断用的GAT和NED、TOC和AST的测定法。该测定法将估计TNA样品中GAT相对NED的变化。为了测量GAT,淋病球菌DNA和RNA可通过RT-PCR使用靶向基因和其转录物或多个基因和其转录物位置的引物进行扩增。为了测量NED,淋病球菌DNA的另一个区域将在同一RT-PCR反应中使用靶向不转录的基因组DNA区域的引物共扩增。可以按照实施例3筛选潜在的GAT和NED靶标。将估计GAT和NED的水平,并用于计算VITA指数。所产生的VITA指数将可以确定任何给定样品(例如尿液、阴道拭子、直肠拭子或咽喉拭子)中生物的活力生存力。除此之外,通过将样品分开并在存在或不存在所需药物或多种药物的情况下孵育,该样品还可用于抗生素药敏试验。将针对每个条件估计GAT和NED的水平,并用于计算VITA指数。除此之外,将使用已处理和未处理样品的VITA指数来计算ΔVITA,最终确定生物的敏感性或耐药性。这将有助于指导治疗,在症状首次出现时给予最佳选择抗生素。
在以下部分(17.1、17.2和17.3)中列出了潜在的靶基因以及MNA酶的相应序列、报告底物和用于扩增的引物对。报告底物与如实例14(图10)所示的针对沙眼衣原体的GAT和NED分析所测试的底物不同,可以将所有靶标多重化。还可以进一步包括其他靶生物(实施例14,图10)。这将允许在单一反应中两种生物的识别,确认感染状态并进行抗生素敏感性测试。
17.1用于VITA PCR分析的GAT1、GAT2和NED的候选靶标
当部分酶与通过扩增不同基因(ompA或cysK基因或转录物)而产生的扩增子结合时,它们被设计成可组装成两个活性MNA酶。这两个MNA酶倍设计成能够结合通过扩增代表GAT1和GAT2的两个独立基因而衍生的两个不同的扩增子。组装后,两个MNA酶可裂解同一报告底物Sub97(20)-JB。当与通过标记为infA_IGR的不转录的DNA区域的扩增而产生的扩增子结合时,第三对部分酶已经被设计为组装成活性MNA酶,从而提供了NED用于测量。组装后,该MNA酶将可裂解报告底物Sub84(20)-CB。下面列出了每种MNA酶的部分酶A和部分酶B的从5'到3'的序列。粗体的碱基与靶标杂交,加下划线的碱基形成组装的MNA酶中催化核心的一部分,斜体的碱基是指与底物杂交的序列。
SEQ ID NO:26GAT1 NGompA_3A4/97-P的部分酶A
SEQ ID NO:27GAT1 NGompA_3B5/97-P的部分酶B
SEQ ID NO:28 GAT2 NGcysK_3A4/97-P的部分酶A
SEQ ID NO:29 GAT2 NGcysK_3B5/97-P的部分酶B
SEQ ID NO:30 NED NG1109IGR_A4/84-P的部分酶A
SEQ ID NO:31 NED NG1109IGR_B5/84-P的部分酶B
17.2报告底物
在当前实施例中,用不同荧光团标记的两种不同的报告底物在并入上面列出的部分酶/MNA酶的系统中的检测中将是有用的。这些底物是Sub97(20)-JB(其在5'末端标记有5-JOEN和在3'末端标记有IABkFQ,其在529nm激发并在555nm监测其裂解)和Sub84(20)-CB(其在5'末端标记有5Cy5和在3'末端标记有IAbRQSp,其在529nm激发并在555nm监测其裂解)。这些报告底物如下所示,序列为5'至3',其中小写字母表示RNA,大写字母表示DNA。
SEQ ID NO:32 GAT1和GAT2 Sub97(20)-JB
CCTAGTCCTCguCCTCACGTC
SEQ ID NO:33 NED Sub84(20)-CB
CTCGACCCTCguCCCTCGTCC
17.3用于扩增GAT1、GAT2和NED的PCR引物
可以使用下面列出的引物进行TNA的扩增。正向和反向引物设计用于通过RT-PCR扩增两个独立的基因和转录物,ompA和cysK(GAT1和GAT2)以及IGR1109 DNA(NED)。所有序列都以5'至3'书写。
SEQ ID NO:34 GAT1 5NGompA_1的正向引物
CGGCACGCAAATCGAAATCC
SEQ ID NO:35 GAT1 3NGompA_L1的反向引物
TGCGCGCGGCCTTCAACC
SEQ ID NO:36 GAT25NGcysK_3W3g的正向引物
CTTGGTGGACGCTCATGCA
SEQ ID NO:37 GAT23NGcysK_2W3a的反向引物
GCCTTCTTTTTCCGCCATTACA
SEQ ID NO:38 NED 5NG1109IGR_1的正向引物
GTTTTCACGCCTGCTTTTGC
SEQ ID NO:39 NED 3NG1109IGR_1的反向引物
GACGCTCAAAACGCGGACGA
可以使用实施例3中概述的方法筛选包括porB和rpmB在内的其他候选基因的GAT引物。
实施例18–扩增效率、灵敏度、包容性(inclusivity)和特异性对VITA指数的影响
以下实施例讨论了可以进一步影响为特定多重分析获得的VITA指数观察到的绝对值的参数。理想情况下,VITA PCR分析中包括的GAT和NED分析的扩增效率应很高,并且与GAT和NED相等。使用连续稀释的合成靶序列评估了在多个实施例(包括实施例5)中使用的靶向沙眼衣原体的GAT1、GAT2和NED的扩增效率,发现它们彼此相似,效率接近100%,R2>0.998(数据未显示)。当反应的所有组分均有效且彼此可比时,已显示获得的VITA指数可准确区分有生存力的细胞和无生存力的细胞,如实施例5所示(图5的图ii)。
另一个重要因素是用GAT和NED引物扩增产生的扩增子的长度。如前所示(实施例16),与生成较短扩增子的系统相比,生成较长扩增子的VITA PCR系统可能具有较低的VITA指数观测值。但是,尽管VITA指数的绝对值可以更改,但可以维持观测值与生存力之间的相关性。
影响VITA PCR为基础研究和临床研究提供通用工具的能力的因素包括灵敏度、包容性和特异性。灵敏度会影响检测靶标的能力,特别是在检测下限(例如<10个拷贝)时。包容性将涉及以相同的效率检测同一生物中所有菌株和血清型的能力。特异性将与仅对目标生物具有特异性的靶标的检测有关。检测到“脱靶”但相关的物质,可能会导致VITA指数升高,但不能反映目标细胞、生物或病毒的生存力。
还已经讨论了必须仔细选择用于GAT和NED的靶标。实施例3显示了一种确定特定序列是否满足标准的方法,即GAT必须靶向表达的DNA区域,而NED引物必须靶向不表达的区域。本文中的实施例表明,在特定的VITA PCR中可以使用多个GAT。实际上,这是非常合乎需要的,因为特定基因只能在例如细菌发育周期的某些阶段表达。包含多个基因表达的测定法,优选在不同条件下以高水平表达,可以确保在各种条件下始终可检测到表达。
最后,预计GAT靶标的选择取决于所研究的生物和抗生素。例如,其他小组的研究表明淋病奈瑟氏球菌的porB和rpmB转录物高度表达,并且响应抗生素环丙沙星而表达水平发生变化。已经显示出沙眼衣原体omp1基因及其转录物(实施例9)适于区分对利福平的耐药性或敏感性,并能够反映该生物的生存力。
Claims (47)
1.一种使通过从细胞、生物或病毒中扩增核酸而获得的定量数据标准化的方法,所述方法包括:
(i)从以下获得定量数据:
- 对来自第一基因的基因组DNA和从第一基因转录的RNA的扩增,和
- 对细胞、生物或病毒中不转录DNA的序列的扩增;和
(ii)使用所述定量数据以导出代表在所述扩增之前存在于核酸样品中的以下两者的相对量的标准化值nV:
- 所述第一基因的所述基因组DNA和RNA转录物,对于
- 不转录的所述基因组DNA;
其中来自所述第一基因的所述基因组DNA和从所述第一基因转录的RNA,以及所述不转录DNA的序列在同一反应中共同扩增,其中所述扩增是聚合酶链反应、逆转录聚合酶链反应、链置换扩增、环介导的等温扩增、滚环扩增、重组酶聚合酶扩增、解旋酶依赖性扩增、基于链侵入的扩增、转录物介导的扩增、自我维持序列复制、基于核酸序列的扩增或其任意组合。
2.根据权利要求1所述的方法,其中所述定量数据为扩增子拷贝数,并且所述方法包括:
- 获得代表从所述第一基因的所述基因组DNA和RNA转录物的扩增产生的总扩增子数的值vA以及代表从不转录DNA的序列产生的总扩增子数的值vB;
- 使用以下公式或其等价形式计算标准化值nV:
vA/vB = nV。
3.根据权利要求1所述的方法,其中所述定量数据为扩增子拷贝数,并且所述方法包括:
- 获得代表从以下产生的总扩增子数的值vX:来自所述第一基因的基因组DNA和RNA转录物的扩增,以及来自至少一个另外的基因的基因组DNA和RNA转录物的扩增;
- 获得代表从不转录DNA序列产生的总扩增子数的值vB,
- 使用以下公式或其等价形式计算标准化值nV:
vX / (vB × (X+1)) = nV,
其中X是所述另外的基因的数量。
4.根据权利要求2或3所述的方法,其中所述扩增是数字聚合酶链式反应。
5.根据权利要求1所述的方法,其中所述定量数据为阈值Ct并且所述方法包括:
- 从所述第一基因的所述基因组DNA和RNA转录物的扩增获得循环阈值CtA,
- 从不转录DNA序列的扩增获得循环阈值CtB;和
- 使用以下公式或其等价形式计算标准化值nV:
2CtB - CtA = nV。
6.根据权利要求1所述的方法,其中所述定量数据为阈值Ct并且所述方法包括:
- 从以下获得循环阈值CtX:所述第一基因的所述基因组DNA和RNA转录物的扩增,以及来自至少一个另外的基因的基因组DNA和RNA转录物的扩增;
- 从不转录DNA序列的扩增获得循环阈值CtB;和
- 使用以下公式或其等价形式计算标准化值nV:
2CtB - CtX/ (X +1) = nV,
其中X是所述另外的基因的数量。
7.根据权利要求5或6所述的方法,其中所述扩增是定量聚合酶链式反应。
8.根据权利要求1-3、5-6中任一项所述的方法,其中不转录DNA的序列是基因组DNA。
9.根据权利要求1-3、5-6中任一项所述的方法,其进一步包括对来自所述细胞、生物或病毒的核酸进行所述扩增。
10.根据权利要求1-3、5-6中任一项所述的方法,其中来自所述细胞、生物或病毒的核酸是总核酸的提取物。
11.根据权利要求1-3、5-6中任一项所述的方法,其进一步包括使用所述标准化值nV以评估所述细胞、生物或病毒中转录活性的水平。
12. 根据权利要求1-3、5-6中任一项所述的方法,其进一步包括:
- 获得使用从已知不具有转录活性的细胞、生物或病毒群体的个体获得的一系列所述标准化值nV产生的转录阴性标准化值nV-;和
- 将通过对来自细胞、生物或病毒中的核酸的所述扩增获得的标准化值nV与转录阴性标准化值nV-进行比较,从而评估细胞、生物或病毒中转录活性的水平。
13.根据权利要求12所述的方法,其中转录阴性标准化值nV-是从所述一系列所述标准化值nV产生的平均值。
14. 根据权利要求12所述的方法,其中:
- 转录阴性标准化值nV-被用作用于评估细胞、生物或病毒中转录活性存在与否的基础值;和
- 当通过对来自细胞、生物或病毒的核酸的所述扩增而获得的标准化值nV等于或低于转录阴性标准化值nV-时,表明没有转录活性;或
- 当通过对来自细胞、生物或病毒的核酸的所述扩增而获得的标准化值nV高于转录阴性标准化值nV-时,表明有转录活性。
15. 根据权利要求12所述的方法,其中所述转录阴性标准化值nV-:
- 纳入在所述一系列标准化值nV中来自已知不具有转录活性的细胞、生物或病毒群体的个体的统计变化;和/或
- 提供有所述转录阴性标准化值nV-可预测细胞、生物或病毒中是否存在转录活性的置信区间。
16.根据权利要求15所述的方法,其中所述置信区间大于90%或大于95%。
17. 根据权利要求12所述的方法,其进一步包括:
- 获得使用从已知具有转录活性的细胞、生物或病毒群体的个体获得的一系列所述标准化值nV产生的转录阳性标准化值nV+;和
- 将通过对来自细胞、生物或病毒的核酸的所述扩增获得的标准化值nV与所述转录阳性标准化值nV+进行比较,从而评估细胞、生物或病毒中转录活性的水平。
18.根据权利要求17所述的方法,其中所述转录阳性标准化值nV+是从所述一系列所述标准化值nV产生的平均值。
19. 根据权利要求17所述的方法,其中:
- 所述转录阳性标准化值nV+被用作细胞、生物或病毒中转录活性的基础值;和
- 当通过对来自细胞、生物或病毒的核酸的所述扩增获得的标准化值nV低于所述转录阳性标准化值nV+时,表明缺少或没有转录活性;或
- 当通过对来自细胞、生物或病毒的核酸的所述扩增获得的标准化值nV等于或高于所述转录阳性标准化值nV+时,表明有转录活性。
20. 根据权利要求17所述的方法,其中所述转录阳性标准化值nV+:
- 纳入在所述一系列标准化值nV中来自已知具有转录活性的细胞、生物或病毒群体的个体的统计变化;和/或
- 提供有所述转录阳性标准化值nV+可预测细胞、生物或病毒中是否存在转录活性的置信区间。
21.根据权利要求20所述的方法,其中所述置信区间大于90%或大于95%。
22.根据权利要求12所述的方法,其进一步包括:
- 获得使用从已知不具有转录活性的细胞、生物或病毒群体的个体获得的一系列所述标准化值nV产生的转录阴性标准化值nV-;
- 获得使用从已知具有转录活性的细胞、生物或病毒群体的个体获得的一系列所述标准化值nV产生的转录阳性标准化值nV+;和
- 将通过对来自细胞、生物或病毒中的核酸的所述扩增获得的标准化值nV与以下进行比较:
(i)所述转录阴性标准化值nV-和所述转录阳性标准化值nV+,或
(ii)介于所述转录阴性标准化值nV-和所述转录阳性标准化值nV+之间的合并的转录标准化值nV + ,
从而评估细胞、生物或病毒中转录活性的水平。
23.根据权利要求22所述的方法,其中使用以下公式或其等价形式计算合并的转录标准化值nV + :
nV+ + nV- / 2 = nV + 。
24.根据权利要求23所述的方法,其中所述合并的转录标准化值nV + :
- 纳入在所述一系列转录阴性标准化值nV-和/或所述转录阳性标准化值nV+中的统计变化;和/或
- 提供有所述合并的转录标准化值nV + 可预测细胞、生物或病毒中是否存在转录活性的置信区间。
25.根据权利要求24所述的方法,其中所述置信区间大于90%或大于95%。
26.根据权利要求11所述的方法,其中为了确定以下中的任一项或多项而评估细胞、生物或病毒中的转录活性水平:
- 测试细胞或测试生物的生存力;
- 测试细胞、生物或病毒是活的还是死的;
- 测试细胞、生物或病毒中的转录扰动。
27. 根据权利要求1-3、5-6中任一项所述的方法,其进一步包括使用标准化值nV评估细胞、生物或病毒中的耐药性或药物敏感性的水平,其中:
- 在所述核酸扩增之前已经用药物处理了所述细胞、生物或病毒,并且
- 将所述标准化值nV与使用从已知具有以下性质的细胞、生物或病毒群体的个体获得的一系列所述标准化值nV产生的对照标准化值cnV进行比较:
(i)对所述药物具有耐药性;或
(i)对所述药物具有敏感性,
从而评估细胞、生物或病毒中的耐药性或药物敏感性的水平。
28. 根据权利要求27所述的方法,其进一步包括:
- 获得使用从已知对所述药物具有敏感性的细胞、生物或病毒群体的个体获得的一系列所述标准化值nV产生的药物敏感性标准化值dsV;和
- 将通过对来自细胞、生物或病毒的核酸的所述扩增获得的标准化值nV与所述药物敏感性标准化值dsV进行比较,从而评估细胞、生物或病毒中的耐药性或药物敏感性的水平,其中在核酸的所述扩增之前已经用药物处理细胞、生物或病毒。
29.根据权利要求28所述的方法,其中药物敏感性标准化值dsV是从所述一系列所述标准化值nV产生的平均值。
30. 根据权利要求28或29所述的方法,其中:
- 药物敏感性标准化值dsV被用作评估细胞、生物或病毒中耐药性或药物敏感性存在与否的基础值;并且
- 当通过对来自细胞、生物或病毒的核酸的所述扩增获得的标准化值nV高于药物敏感性标准化值dsV时,表明有耐药性;或
- 当通过对来自细胞、生物或病毒的核酸的所述扩增获得的标准化值nV等于或低于药物敏感性标准化值dsV时,表明有药物敏感性。
31. 根据权利要求28或29所述的方法,其中所述药物敏感性标准化值dsV:
- 纳入在所述一系列标准化值nV中来自已知对该药物具有敏感性的细胞、生物或病毒群体的个体的统计变化;和/或
- 提供有所述药物敏感性标准化值dsV可预测是否存在以下性质的置信区间:
(i)细胞、生物、病毒中对该药物具有耐药性;或
(ii)细胞、生物、病毒中对该药物具有敏感性。
32.根据权利要求31所述的方法,其中所述置信区间大于90%或大于95%。
33. 根据权利要求27所述的方法,其进一步包括:
- 获得使用从已知对所述药物具有耐药性的细胞、生物或病毒群体的个体获得的一系列所述标准化值nV产生的耐药性标准化值drV;和
- 将通过对来自细胞、生物或病毒的核酸的所述扩增获得的标准化值nV与所述耐药性标准化值drV进行比较,从而评估细胞、生物或病毒中的耐药性或药物敏感性的水平,其中在核酸的所述扩增之前已经用药物处理细胞、生物或病毒。
34.根据权利要求33所述的方法,其中所述耐药性标准化值drV是从所述一系列所述标准化值nV产生的平均值。
35. 根据权利要求33或34所述的方法,其中:
- 耐药性标准化值drV被用作评估细胞、生物或病毒中耐药性或药物敏感性存在与否的基础值;并且
- 当通过对来自细胞、生物或病毒的核酸的所述扩增获得的标准化值nV等于或高于所述耐药性标准化值drV时,表明有耐药性;或
- 当通过对来自细胞、生物或病毒的核酸的所述扩增获得的标准化值nV低于所述耐药性标准化值drV时,表明有药物敏感性。
36. 根据权利要求33或34所述的方法,其中所述耐药性标准化值drV:
- 纳入在所述一系列标准化值nV中来自已知对该药物具有耐药性的细胞、生物或病毒群体的个体的统计变化;和/或
- 提供有所述耐药性标准化值drV可预测是否存在以下性质的置信区间:
(i)细胞、生物、病毒中对该药物具有耐药性;或
(ii)细胞、生物、病毒中对该药物具有敏感性。
37.根据权利要求36所述的方法,其中所述置信区间大于90%或大于95%。
38.根据权利要求1-3、5-6中任一项所述的方法,其进一步包括使用标准化值nV评估细胞、生物或病毒中的耐药性或药物敏感性水平,其中:
- 在所述核酸扩增之前已经用药物处理过的所述细胞、生物或病毒的第一群体用于产生第一所述标准化值nV,
- 在所述核酸扩增之前没有用药物处理过的所述细胞、生物或病毒的第二群体用于产生第二所述标准化值nV,
- 将所述第一标准化值nV或所述第二标准化值nV进行比较,以评估在有或者没有药物处理的情况下细胞、生物或病毒中的转录活性水平,从而评估细胞、生物或病毒中的耐药性或药物敏感性水平。
39.根据权利要求38所述的方法,其中当所述第一标准化值nV低于所述第二标准化值nV时表示具有所述药物敏感性。
40.根据权利要求27所述的方法,其中该药物是抗微生物药物。
41.根据权利要求27所述的方法,其中该药物是选自以下类别的抗微生物药物:氨基糖苷类、安沙霉素类、碳头孢烯类、碳青霉烯类、头孢菌素类、糖肽类、大环内酯类青霉素类、单环β-内酰胺类、多肽类、喹诺酮类、磺酰胺类、四环素类。
42.根据权利要求27所述的方法,其中该药物是环丙沙星、阿奇霉素、利福平或强力霉素。
43.根据权利要求27所述的方法,其中第一个基因是来自衣原体种、淋病种或支原体种的基因。
44.根据权利要求43所述的方法,其中所述衣原体种为沙眼衣原体,所述支原体种为生殖支原体。
45.根据权利要求43或44所述的方法,其中所述反应包括使用逆转录酶。
46.根据权利要求1-3、5-6中任一项所述的方法,其中所述细胞是哺乳动物细胞、人细胞、动物细胞、植物细胞、细菌细胞、被病毒感染的宿主细胞或被细菌感染的宿主细胞。
47.根据权利要求1-3、5-6中任一项所述的方法,其中所述生物是哺乳动物、人、植物、细菌、病毒、真菌、藻类、古细菌或原生动物。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
AU2017905138 | 2017-12-21 | ||
AU2017905138A AU2017905138A0 (en) | 2017-12-21 | Nucleic acid ratio determination | |
PCT/AU2018/051406 WO2019119072A1 (en) | 2017-12-21 | 2018-12-21 | Nucleic acid ratio determination |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN111492434A CN111492434A (zh) | 2020-08-04 |
CN111492434B true CN111492434B (zh) | 2024-04-19 |
Family
ID=66992472
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201880043163.4A Active CN111492434B (zh) | 2017-12-21 | 2018-12-21 | 核酸比值确定 |
Country Status (11)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP3685385A4 (zh) |
JP (1) | JP7355652B2 (zh) |
KR (1) | KR20200101269A (zh) |
CN (1) | CN111492434B (zh) |
AU (1) | AU2018390995B2 (zh) |
BR (1) | BR112020000845A2 (zh) |
CA (1) | CA3066287A1 (zh) |
IL (1) | IL271510A (zh) |
MX (1) | MX2020006590A (zh) |
SG (1) | SG11201912883WA (zh) |
WO (1) | WO2019119072A1 (zh) |
Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2001020041A1 (en) * | 1999-09-17 | 2001-03-22 | Xtrana, Inc. | Quantitation of rna transcripts using genomic dna as the internal amplification competitor |
EP1418241A1 (en) * | 2002-11-08 | 2004-05-12 | PrimaGen Holding B.V. | Method for quantifying a ratio between at least two nucleic acid sequences |
EP0910666B1 (en) * | 1996-05-02 | 2006-08-09 | Applera Corporation | Quantitation of rna transcripts using genomic dna as the internal amplification competitor |
WO2011109901A1 (en) * | 2010-03-10 | 2011-09-15 | The Governors Of The University Of Alberta | Detection and quantification of viable bacteria in a sample using rpos mrna |
WO2011140237A2 (en) * | 2010-05-04 | 2011-11-10 | The Government Of The Usa Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, Centers For Disease Control And Prevention | Process for detection of multidrug resistant tuberculosis using real-time pcr and high resolution melt analysis |
WO2012171997A1 (en) * | 2011-06-14 | 2012-12-20 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Methods for determining the expression level of a gene of interest including correction of rt-qpcr data for genomic dna-derived signals |
JP2013500706A (ja) * | 2009-07-31 | 2013-01-10 | キアゲン ゲーエムベーハー | Rnaの正規化した定量化方法 |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US8021846B2 (en) * | 2008-03-12 | 2011-09-20 | Medical Diagnostic Laboratories, Llc | Method for determining azole resistance in Candida glabrata |
-
2018
- 2018-12-21 WO PCT/AU2018/051406 patent/WO2019119072A1/en active Search and Examination
- 2018-12-21 CN CN201880043163.4A patent/CN111492434B/zh active Active
- 2018-12-21 BR BR112020000845-1A patent/BR112020000845A2/pt unknown
- 2018-12-21 JP JP2019566887A patent/JP7355652B2/ja active Active
- 2018-12-21 SG SG11201912883WA patent/SG11201912883WA/en unknown
- 2018-12-21 AU AU2018390995A patent/AU2018390995B2/en active Active
- 2018-12-21 CA CA3066287A patent/CA3066287A1/en active Pending
- 2018-12-21 KR KR1020197038255A patent/KR20200101269A/ko unknown
- 2018-12-21 EP EP18891196.0A patent/EP3685385A4/en active Pending
- 2018-12-21 MX MX2020006590A patent/MX2020006590A/es unknown
-
2019
- 2019-12-17 IL IL271510A patent/IL271510A/en unknown
Patent Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0910666B1 (en) * | 1996-05-02 | 2006-08-09 | Applera Corporation | Quantitation of rna transcripts using genomic dna as the internal amplification competitor |
WO2001020041A1 (en) * | 1999-09-17 | 2001-03-22 | Xtrana, Inc. | Quantitation of rna transcripts using genomic dna as the internal amplification competitor |
EP1418241A1 (en) * | 2002-11-08 | 2004-05-12 | PrimaGen Holding B.V. | Method for quantifying a ratio between at least two nucleic acid sequences |
JP2013500706A (ja) * | 2009-07-31 | 2013-01-10 | キアゲン ゲーエムベーハー | Rnaの正規化した定量化方法 |
WO2011109901A1 (en) * | 2010-03-10 | 2011-09-15 | The Governors Of The University Of Alberta | Detection and quantification of viable bacteria in a sample using rpos mrna |
WO2011140237A2 (en) * | 2010-05-04 | 2011-11-10 | The Government Of The Usa Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, Centers For Disease Control And Prevention | Process for detection of multidrug resistant tuberculosis using real-time pcr and high resolution melt analysis |
WO2012171997A1 (en) * | 2011-06-14 | 2012-12-20 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Methods for determining the expression level of a gene of interest including correction of rt-qpcr data for genomic dna-derived signals |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
Correction of RT–qPCR data for genomic DNA-derived signals with ValidPrime;Henrik Laurell 等;Nucleic Acids Research;20120401;第40卷(第7期);第1-10页 * |
Normalization using ploidy and genomic DNA copy number allows absolute quantification of transcripts, proteins and metabolites in cells;Hiroshi Shimada 等;Plant Methods;20101229;第6卷(第1期);第1-9页 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
AU2018390995B2 (en) | 2023-11-23 |
BR112020000845A2 (pt) | 2020-07-21 |
JP2021507674A (ja) | 2021-02-25 |
CA3066287A1 (en) | 2019-06-27 |
IL271510A (en) | 2020-02-27 |
RU2020102949A (ru) | 2022-01-21 |
MX2020006590A (es) | 2020-09-09 |
JP7355652B2 (ja) | 2023-10-03 |
EP3685385A1 (en) | 2020-07-29 |
EP3685385A4 (en) | 2021-09-22 |
CN111492434A (zh) | 2020-08-04 |
SG11201912883WA (en) | 2020-01-30 |
WO2019119072A1 (en) | 2019-06-27 |
AU2018390995A1 (en) | 2019-12-19 |
KR20200101269A (ko) | 2020-08-27 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EP3074539B1 (en) | Method for detecting and characterising a microorganism | |
EP3271484B1 (en) | Methods and compositions for detecting bacterial nucleic acid and diagnosing bacterial vaginosis | |
WO2023025259A1 (zh) | 检测微小rna的方法和试剂盒 | |
CN114457174B (zh) | 一种检测尿道病原体感染的多重荧光定量探针法pcr试剂盒 | |
EP2585615B1 (en) | Highly sensitive method for detection of a target nucleic acid in a sample | |
JP7389111B2 (ja) | 細菌の核酸を検出し、細菌性膣炎を診断するための組成物および方法 | |
CA2972475C (en) | Methods and compositions for diagnosing bacterial vaginosis | |
US20200199651A1 (en) | Nucleic acid ratio determination | |
CN111492434B (zh) | 核酸比值确定 | |
EP1869218A2 (en) | Nucleic acid detection | |
US9593384B2 (en) | Metronidazole resistance in trichomonas vaginalis and single nucleotide polymorphisms | |
RU2803339C2 (ru) | Определение соотношения нуклеиновых кислот | |
US20050244813A1 (en) | Detection of human papillomavirus e6 mrna | |
JP2023518217A (ja) | 標的核酸を検出するためのループプライマー及びループ・デ・ループ方法 | |
Ruthig et al. | Fast quantitative PCR, locked nucleic acid probes and reduced volume reactions are effective tools for detecting Batrachochytrium dendrobatidis DNA | |
WO2013049822A2 (en) | Diagnostic method for determining animals persistently infected (pi) with bovine viral diarrhea virus (bvdv) | |
Nauwelaers et al. | Development of a real-time multiplex RSV detection assay for difficult respiratory samples, using ultrasone waves and MNAzyme technology | |
EP4310195A1 (en) | Method for nucleic acid detection using signal-mediated amplification of rna technology and rna aptamers | |
US20160160266A1 (en) | Washing-free template-ready pcr detection method for rna | |
CN116949142A (zh) | 一种用于rna靶标检测的扩增方法及试剂盒应用 | |
WO2023196494A1 (en) | Methods of treating dimorphic fungal diseases | |
CN117757990A (zh) | 一种呼吸道腺病毒分型核酸检测引物组合、试剂盒及检测方法 | |
Erlandsson et al. | The Microbial Detection Array Combined with Random Phi29-Amplification | |
AU2014400858A1 (en) | Methods of detecting Trichomonas vaginalis |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant |