JP2013500706A - Rnaの正規化した定量化方法 - Google Patents
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Abstract
Description
(a)試料中のRNAの総数量、または
(b)試料中の特定のクラスのRNAの総数量
に対して正規化するための方法であって、
(i)定量化されるRNAを含有する試料を供給するステップと、
(ii)第1の核酸プローブの少なくとも末端領域が試料中のRNAの特異的な結合部位とハイブリダイズし、それによって二本鎖核酸が作出されることを可能にする条件下で、前記第1の核酸プローブを試料に加えるステップであって、前記第1の核酸プローブが、1種以上のプライマー結合部位を含み、必要に応じてプローブ結合部位を含むステップと、
(iii)試料中のRNAを逆転写するステップであって、RNAの末端領域がcDNAを合成するためのプライマーとして機能し、前記第1のプローブが鋳型として機能するステップと、
(iv)試料中のRNAの総量または試料中の特定のクラスのRNAの総量を、必要に応じて、前記RNAから転写されたDNAの領域と実質的に相補的な第2のプローブを使用して定量化するステップと、
(v)定量化されるRNAを、必要に応じて、定量化されるRNAの限定された領域(defined region)と実質的に相補的な第3のプローブを使用して定量化するステップと、
(vi)定量化されるRNAの数量と、試料中のRNAの総数量または試料中の特定のクラスのRNAの総数量との比を決定することによって、定量化されるRNAの数量を正規化するステップと
を含む方法に関する。
(a)試料中のRNAの総数量;または
(b)試料中の特定のクラスのRNAの総数量
に対する正規化であって、
(i)定量化されるRNA(A参照;mRNAと称される)を含有する試料を供給するステップと、
(ii)第1の核酸プローブの少なくとも末端領域((B)におけるアダプター核酸のポリU部分)が試料中のRNAの特異的な結合部位((B)におけるmRNAのポリA尾部)とハイブリダイズし、それによって二本鎖核酸が作出されることを可能にする条件下で、前記第1の核酸プローブ((A)においてアダプター核酸と称される)を試料に加えるステップであって、前記第1の核酸プローブ((A)および(B)においてアダプター核酸と称される)が1種以上のプライマー結合部位および1つのプローブ結合部位を含むステップと、
(iii)試料中のRNAを逆転写するステップであって、RNAの末端領域がcDNAを合成するためのプライマーとして機能し、前記第1のプローブが鋳型として機能するステップ(ステップ(A)に加えられた適切な酵素、デオキシヌクレオチド三リン酸およびバッファー、任意選択の他のプライマーおよび成分、(B)に記載のcDNA合成反応)と、
(iv)試料中のRNAの総量または試料中の特定のクラスのRNAの総量を、前記RNAから転写されたDNAの領域((C)においてアダプターcDNAと称される)と実質的に相補的な第2のプローブを使用して定量化するステップと、
(v)定量化されるRNAを、必要に応じて、定量化されるRNAの限定された領域と実質的に相補的な第3のプローブを使用して定量化するステップと、
(vi)定量化されるRNAの数量と、試料中のRNAの総数量または試料中の特定のクラスのRNAの総数量との比を決定することによって、定量化されるRNAの数量を正規化するステップと
を含む正規化のために使用することができる。
(a)試料中のRNAの総数量;または
(b)試料中の特定のクラスのRNAの総数量
に対する正規化であって、
(i)定量化されるRNA(A参照;mRNAと称される)を含有する試料を供給するステップと、
(ii)第1の核酸プローブの少なくとも末端領域((B)におけるアダプター核酸のポリU部分)が試料中のRNAの特異的な結合部位((B)におけるmRNAのポリA尾部)とハイブリダイズし、それによって二本鎖核酸が作出されることを可能にする条件下で、前記第1の核酸プローブ((A)においてアダプター核酸と称される)を試料に加えるステップであって、前記第1の核酸プローブ((A)および(B)においてアダプター核酸と称される)が1種以上のプライマー結合部位および1つのプローブ結合部位を含むステップと、
(iii)試料中のRNAを逆転写するステップであって、RNAの末端領域がcDNAを合成するためのプライマーとして機能し、前記第1のプローブが鋳型として機能するステップ(ステップ(A)に加えられた適切な酵素、デオキシヌクレオチド三リン酸およびバッファー、任意選択の他のプライマーおよび成分、(B)に記載のcDNA合成反応)と、
(iv)試料中のRNAの総量または試料中の特定のクラスのRNAの総量を、前記RNAから転写されたDNAの領域((C)においてアダプターcDNAと称される)と実質的に相補的な第2のプローブを使用して定量化するステップと、
(v)定量化されるRNAを、必要に応じて、定量化されるRNAの限定された領域と実質的に相補的な第3のプローブを使用して定量化するステップと
(vi)定量化されるRNAの数量と、試料中のRNAの総数量または試料中の特定のクラスのRNAの総数量との比を決定することによって、定量化されるRNAの数量を正規化するステップと
を含む正規化のために使用することができる。
(a)試料中のRNAの総数量;または
(b)試料中の特定のクラスのRNAの総数量
に対する正規化であって、
(i)定量化されるRNA(A参照;mRNAと称される)を含有する試料を供給するステップと、
(ii)第1の核酸プローブの少なくとも末端領域((B)におけるアダプター核酸のポリU部分)が試料中のRNAの特異的な結合部位((B)におけるmRNAのポリA尾部)とハイブリダイズし、それによって二本鎖核酸が作出されることを可能にする条件下で、前記第1の核酸プローブ((A)においてアダプター核酸と称される)を試料に加えるステップであって、前記第1の核酸プローブ((A)および(B)においてアダプター核酸と称される)が1種以上のプライマー結合部位および1つのプローブ結合部位を含むステップと、
(iii)試料中のRNAを逆転写するステップであって、RNAの末端領域がcDNAを合成するためのプライマーとして機能し、前記第1のプローブが鋳型として機能するステップ(ステップ(A)に加えられた適切な酵素、デオキシヌクレオチド三リン酸およびバッファー、任意選択の他のプライマーおよび成分、(B)に記載のcDNA合成反応)と、
(iv)試料中のRNAの総量または試料中の特定のクラスのRNAの総量を、前記RNAから転写されたDNAの領域((C)においてアダプターcDNAと称される)と実質的に相補的な第2のプローブを使用して定量化するステップと、
(v)定量化されるRNAを、必要に応じて、定量化されるRNAの限定された領域と実質的に相補的な第3のプローブを使用して定量化するステップと
(vi)定量化されるRNAの数量と、試料中のRNAの総数量または試料中の特定のクラスのRNAの総数量との比を決定することによって、定量化されるRNAの数量を正規化するステップと
を含む正規化のために使用することができる。
(a)試料中のRNAの総数量、または
(b)試料中の特定のクラスのRNAの総数量
に対して正規化するための方法であって、
(i)定量化されるRNAを含有する試料を供給するステップと、
(ii)第1の核酸プローブの少なくとも末端領域が試料中のRNAの特異的な結合部位とハイブリダイズし、それによって二本鎖核酸が作出されることを可能にする条件下で、前記第1の核酸プローブを試料に加えるステップであって、前記第1の核酸プローブが、1種以上のプライマー結合部位を含み、必要に応じてプローブ結合部位を含むステップと、
(iii)試料中のRNAを逆転写するステップであって、RNAの末端領域がcDNAを合成するためのプライマーとして機能し、前記第1のプローブが鋳型として機能するステップと、
(iv)試料中のRNAの総量(total amount)または試料中の特定のクラスのRNAの総量を、必要に応じて、前記RNAから転写されたDNAの領域と実質的に相補的な第2のプローブを使用して定量化するステップと、
(v)定量化されるRNAを、必要に応じて、定量化されるRNAの限定された領域と実質的に相補的な第3のプローブを使用して定量化するステップと、
定量化されるRNAの数量と、試料中のRNAの総数量または試料中の特定のクラスのRNAの総数量との比を決定することによって、定量化されるRNAの数量を正規化するステップと
を含む方法を提供する。
アダプター核酸を使用したRNAの正規化された定量化およびリアルタイムPCRにおけるcDNAの検出のための方法の技術的な概念の実現。
プローブに基づくリアルタイムPCRにおけるウラシル塩基を用いたアダプターRNAまたはアダプターDNAの正確な滴定の証明。Ct値と希釈率の相関の確認。
Ct値とcDNAの合成において使用されるRNAの量の相関を実証するための、プローブに基づくリアルタイムPCRによる、実施例1において生成したcDNAの解析
酵素を不活性化した後(実施例1、表2参照:95℃で5分間)、一定数量のcDNA合成反応物を以下のリアルタイムPCRに適用した。リアルタイムPCRにおける検出を、プローブに基づく化学作用を用いて行った。表17に、プローブに基づくリアルタイムPCR反応のための構成を示す。PCR反応物を、表16からの構成成分を用いて調製した。その後、表18に示されているサイクリングを実施した。リアルタイムPCRは、Applied Biosystems 7500 Real−time PCR Systemにおいて実施した。この後、実行データを適切な計器ソフトウェアを用いて解析した。結果を表19、20および図6に示す。
mRNA:種々の種から天然に生じるようなポリアデニル化されたメッセンジャーRNAであってよい。これは、天然にポリA尾部を伴う、またはポリA尾部を伴わない任意のRNA試料であってもよく、ポリヌクレオチド尾部は、適切な方法、例えば、酵素、好ましくはポリAポリメラーゼによってin vitroで付加される。
Claims (20)
- 試料中の定量化されるRNAの数量を、
(a)前記試料中のRNAの総数量、または
(b)前記試料中の特定のクラスのRNAの総数量
に対して正規化するための方法であって、
(i)定量化されるRNAを含有する試料を供給するステップと、
(ii)第1の核酸プローブの少なくとも末端領域が前記試料中のRNAの特異的な結合部位とハイブリダイズし、それによって二本鎖核酸が作出されることを可能にする条件下で、前記第1の核酸プローブを前記試料に加えるステップであって、前記第1の核酸プローブが、1種以上のプライマー結合部位を含み、必要に応じてプローブ結合部位を含むステップと、
(iii)前記試料中の前記RNAを逆転写するステップであって、前記RNAの末端領域がcDNAを合成するためのプライマーとして機能し、前記第1のプローブが鋳型として機能するステップと、
(iv)前記試料中のRNAの総量または前記試料中の前記特定のクラスのRNAの総量を、必要に応じて、前記RNAから転写されたDNAの領域と実質的に相補的な第2のプローブを使用して定量化するステップと、
(v)前記定量化されるRNAを、必要に応じて、前記定量化されるRNAの限定された領域と実質的に相補的な第3のプローブを使用して定量化するステップと、
(vi)前記定量化されるRNAの数量と、前記試料中のRNAの総数量または前記試料中の前記特定のクラスのRNAの総数量との比を決定することによって、前記定量化されるRNAの数量を正規化するステップと
を含む方法。 - 前記定量化されるRNAが、mRNA、rRNA、tRNA、nRNA、siRNA、snRNA、snoRNA、scaRNA、マイクロRNA、dsRNA、リボザイム、リボスイッチおよびウイルスRNAからなる群から選択されるRNAであり、前記特定のクラスのRNAが、mRNA、rRNA、tRNA、nRNA、siRNA、snRNA、snoRNA、scaRNA、マイクロRNA、dsRNA、リボザイム、リボスイッチおよびウイルスRNAからなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記定量化されるRNAがmRNAであり、前記特定のクラスのRNAがmRNAである、請求項2に記載の方法。
- 前記特異的な結合部位がポリA配列またはポリA尾部である、請求項3に記載の方法。
- 前記逆転写ステップの後に、RNアーゼを、RNAの消化を可能にする条件下で前記試料に加える、請求項1から4までのいずれか一項に記載の方法。
- 前記RNアーゼが、RNアーゼA、RNアーゼH、RNアーゼI、RNアーゼT、および逆転写酵素のRNアーゼ活性からなる群から選択される、請求項5に記載の方法。
- 前記第1の核酸プローブが、dTヌクレオチドがdUヌクレオチドに置き換えられているDNAであり、RNAの総量または特定のクラスのRNAの総量を定量化する前に、前記試料を、ウラシルと糖との間のN−グリコシル結合(N−glycosylic bond)の加水分解を可能にする条件下で、ウラシルDNAグリコシラーゼと一緒にインキュベートするステップが実施される、請求項1から6までのいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1の核酸プローブの3’末端が遮断されている、請求項1から7までのいずれか一項に記載の方法。
- 定量化が、定量的リアルタイムPCRを含む、請求項1から8までのいずれか一項に記載の方法。
- 前記定量化が、定量的リアルタイム逆転写PCRを含む、請求項9に記載の方法。
- 逆転写と定量化が同じ反応容器内で実施される、請求項9または10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記逆転写酵素が、前記定量化ステップの間に増幅のためにも使用されるポリメラーゼである、請求項11に記載の方法。
- 定量的リアルタイムPCRにおいて選択的プライマーまたはランダムプライマーが使用される、請求項1から12までのいずれか一項に記載の方法。
- 前記第2の核酸プローブおよび第3の核酸プローブが、1種以上の蛍光色素で標識され、前記定量化ステップが、前記試料中の蛍光シグナルを検出することを含む、請求項1から13までのいずれか一項に記載の方法。
- 遺伝子発現レベルを正規化するための、請求項1から14までのいずれか一項に記載の方法。
- さらに予め定量化されたRNAを前記試料に加え、前記定量化ステップにおいて前記予め定量化されたRNAの数量を決定する、請求項1から15までのいずれか一項に記載の方法。
- 前記予め定量化されたRNAがmRNAである、請求項16に記載の方法。
- 請求項1から17までのいずれか一項に記載の方法を実施するためのキットであって、
(i)前記試料中のRNAの限定された領域または特定のクラスのRNAと実質的に相補的な第1の核酸プローブであって、1種以上のプライマー結合部位および1つのプローブ結合部位を含む第1の核酸プローブと、
(ii)前記第1の核酸プローブの前記プローブ結合部位と実質的に相補的な第2の核酸プローブと
を含むキット。 - 特異的な核酸の数量を参照核酸の数量に対して正規化するための、請求項1から17までのいずれか一項に記載の方法または請求項18に記載のキットの使用。
- 遺伝子発現解析のための、請求項1から17までのいずれか一項に記載の方法または請求項18に記載のキットの使用。
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