JP2010500044A5

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Publication number: JP2010500044A5
Application number: JP2009524183A
Authority: JP
Filing date: 2007-08-13
Publication date: 2013-11-14
Anticipated expiration: 2027-08-13

Claims

酵素反応におけるサンプル中のｃＤＮＡの合成のための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）ポリアデニル化活性を有する第１の酵素、逆転写酵素活性を有する第２の酵素、緩衝液、少なくとも１つのリボヌクレオチド、少なくとも１つのデオキシリボヌクレオチド、ポリ−（Ｔ）ホモポリマー部分を含むアンカーオリゴヌクレオチドを同時に準備する工程、
（ｂ）リボ核酸を含むサンプルを添加する工程、および
（ｃ）該第１の酵素および該第２の酵素が活性を示すように選択された１つまたは複数の温度工程において工程（ａ）および（ｂ）の作用因子（ａｇｅｎｔ）をインキュベートする工程
を含む、方法。
前記サンプルが、原核生物ＲＮＡ、真核生物ＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ、古細菌ＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、非ポリアデニル化ＲＮＡ、およびｒＲＮＡ、ならびにその混合物を含む群から選択されるリボ核酸を含む、請求項１に記載の方法。
前記アンカーオリゴヌクレオチドが、６ヌクレオチド長と１５０ヌクレオチド長との間であり、および／または３’末端にアンカー配列を有する、請求項２に記載の方法。
前記アンカーオリゴヌクレオチドが、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、ペプチド−核酸（ＰＮＡ）またはロックド核酸（ＬＮＡ）、ホスホロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓｔｈｉｏａｔｅ）−デオキシリボ核酸、シクロヘキセン−核酸（ＣｅＮＡ）、Ｎ３’−Ｐ５’−ホスホロアミデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓａｍｉｄａｔｅ）（ＮＰ）、またはトリシクロ−デオキシリボ核酸（ｔｃＤＮＡ）である、請求項３に記載の方法。
前記リボヌクレオチドを、アデノシン−５’−三リン酸、チミン−５’−三リン酸、シトシン−５’−三リン酸、グアニン−５’−三リン酸、ウラシル−５’−三リン酸、塩基アナログを有するリボヌクレオチドを含む群から選択することができる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
前記デオキシリボヌクレオチドを、デオキシアデノシン−５’−三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシチミン−５’−三リン酸（ｄＴＴＰ）、デオキシシトシン−５’−三リン酸（ｄＣＴＰ）、デオキシグアミン（ｄｅｏｘｙｇｕａｍｉｎｅ）−５’−三リン酸（ｄＧＴＰ）、デオキシウラシル−５’−三リン酸（ｄＵＴＰ）を含む群から選択することができる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
前記デオキシリボヌクレオチドが標識され、前記デオキシリボヌクレオチドの標識を、放射性標識、および蛍光色素を含む群から選択することができる、請求項６に記載の方法。
前記デオキシリボヌクレオチドが修飾され、前記修飾が、ビオチン化、ジゴキシゲニン標識、およびハプテンを含む群から選択される、請求項６に記載の方法。
前記デオキシリボヌクレオチド濃度が、反応物中で少なくとも０．０１ｍｍｏｌであり、且つ反応物中で最大限で１０ｍｍｏｌである、請求項６〜８のいずれか１項に記載の方法。
前記デオキシリボヌクレオチドｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰが、０．２ｍｍｏｌ〜２ｍｍｏｌの濃度で存在する、請求項９に記載の方法。
前記緩衝液が、ｐＨ６〜ｐＨ１０であり、Ｍｇ²⁺イオンを有する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
前記ポリアデニル化活性を有する酵素が、原核生物起源、真核生物起源、ウイルス起源、古細菌起源、および植物起源の酵素を含む群から選択される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
前記ポリアデニル化活性を有する酵素が、大腸菌由来のポリ（Ａ）−ポリメラーゼ、酵母由来のポリ（Ａ）−ポリメラーゼ、ウシ由来のポリ（Ａ）−ポリメラーゼ、カエル由来のポリ（Ａ）−ポリメラーゼ、およびヒトポリ（Ａ）−ポリメラーゼを含む群から選択される、請求項１２に記載の方法。
前記逆転写酵素活性を有する酵素が、ウイルス、細菌、古細菌、真核生物に由来する酵素、特に熱安定性生物に由来する酵素、およびその遺伝子配列変異誘発の変化または対応する緩衝液条件のみによってかかる機能が得られる酵素を含む群から選択される、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
前記逆転写酵素活性を有する酵素が、ＨＩＶ逆転写酵素、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素、ＥＡＩＶ逆転写酵素、ＡＭＶ逆転写酵素、サーマスサーモフィルス（Thermus thermophilus）ＤＮＡポリメラーゼＩ、およびＭ−ＭＬＶＲＮＡｓｅＨ ^-を含む群から選択される、請求項１４に記載の方法。
前記反応が、６５℃〜９５℃のより高い温度での温度工程をさらに含む、請求項１５に記載の方法。
前記方法において生成されたｃＤＮＡを、次いで、ポリメラーゼ連鎖反応を使用して増幅し、該ポリメラーゼ連鎖反応が反応ランダムプライマーおよび／または特定のプライマーおよび／または１つまたは複数のプローブを含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
前記工程（ａ）の同時準備が、ＤＮＡ合成活性を有する熱安定性酵素の準備も含み、ｃＤＮＡの特異的検出のための少なくとも１つのオリゴヌクレオチドが存在する、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
前記反応がさらなるポリ−（Ｃ）−ポリヌクレオチドを含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
ポリアデニル化活性を有する第１の酵素、逆転写酵素活性を有する第２の酵素、緩衝液、少なくとも１つのリボヌクレオチド、少なくとも１つのデオキシリボヌクレオチド、およびポリ−（Ｔ）ホモポリマー部分を含むアンカーオリゴヌクレオチドを含む反応混合物。
請求項２０に記載の反応混合物を含むキット。
請求項２０に記載の反応混合物または請求項２１に記載のキットの、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の製造方法における、使用。