DE69512219T2

DE69512219T2 - Gezielte spaltung von rns mittels gezielter bindung der ribonuklease p und spaltungssequenzen

Info

Publication number: DE69512219T2
Application number: DE69512219T
Authority: DE
Inventors: Sidney Altman; Cecilia Guerrier-Takada; Fenyong Liu; Yan Yuan
Original assignee: Yale University
Current assignee: Yale University
Priority date: 1994-03-07
Filing date: 1995-03-07
Publication date: 2000-01-20
Anticipated expiration: 2015-03-08
Also published as: US5869248A; DE69512219D1; ATE184649T1; EP0748383A1; CA2185117A1; AU2116595A; US5728521A; AU696138B2; EP0748383B1; WO1995024489A1; JPH10508181A

Description

Hintergrund der Erfindung

Diese Erfindung liegt auf dem allgemeinen Gebiet der gentechnischen Veränderung von Nucleinsäuresequenzen, insbesondere chemisch modifizierten externen Leitsequenzen und mit den Leitsequenzen verknüpften katalytischen RNA- Sequenzen.
Derzeit sind mehrere Klassen von Ribozymen bekannt, die an der Spaltung und/oder Verknüpfung von RNA-Ketten beteiligt sind. Ein Ribozym wird als ein aus RNA bestehendes Enzym definiert, von denen die meisten auf RNA-Substrate einwirken. Ribozyme sind seit 1982 bekannt, als Cech und Kollegen (Cell 31: 147-157) zeigten, daß ein ribosomaler RNA- Vorläufer in Tetrahymena, einem einzelligen Eukaryoten, eine Spaltung erfährt, die durch Elemente in der RNA-Sequenz, die während der Umwandlung des rmA-Vorläufers in reife rRNA entfernt werden, katalysiert wird. Für eine andere Ribozymklasse, die 1983 entdeckt wurde, konnte zum ersten Mal gezeigt werden, daß sie "trans" wirkt, d. h. unter Bedingungen wirkt, bei denen das Ribozym in eine RNA-Kette eingebaut ist, während das zu spaltende Substrat eine zweite getrennte RNA-Kette ist. Dieses als M1-RNA bezeichnete Ribozym wurde 1983 von Altman und Kollegen als für die Spaltung, die reife 5'-Enden aller Transfer-RNAs (tRNAs) in E. coli ausbildet, verantwortlich charakterisiert. Analoge, mit der tRNA-Synthese befaßte RNA-haltige Enzyme wurden seitdem in allen Zellen, in denen sie gesucht wurden, einschließlich einer Anzahl humaner Zellinien gefunden, obwohl bei den relevanten eukaryotischen RNAs bisher nicht gezeigt werden konnte, daß sie selbst, in vitro, katalytisch wirken.
Ein Überblick über die Entdeckung und Charakterisierung dieser katalytischen RNA findet sich bei Sidney Altman in "Ribonuclease P: An Enzyme with a Catalytic RNA Subunit" in Adv. Enzymol. 62: 1-36 (1989). Die Aktivität wurde zuerst aus Extrakten von E. coli isoliert und anschließend wurde bestimmt, daß es sich um ein Ribonucleoprotein mit zwei Komponenten, einer mit M1 bezeichneten RNA-Komponente und einer mit C5 bezeichneten Proteinkomponente, handelt. Die RNA spaltete Substrate in einer wirklichen enzymatischen Reaktion, wie dies unter Verwendung einer Michaelis-Menten- Kinetik gemessen wurde. Es ließ sich festlegen, daß M1 allein für die Substraterkennung verantwortlich war und daß C5 kcat, jedoch nicht Km änderte, siehe der Bericht von Güerrier-Takada et al., Cell 35: 849 (1983) und McClain et al., Science 238: 527 (1987). Die Sequenzierung ergab, daß M1-RNA 377 Nucleotide lang ist, Mr etwa 125000 beträgt und daß das Protein aus 119 Aminosäuren besteht und ein Mr von etwa 13800 aufweist, siehe der Bericht von Hansen et al., Gene 38: 535 (1987).
Die Spaltung von Vorläufer-tRNA-Molekülen durch die RNA- Komponente von eubakterieller RNase P wird von Guerrier- Takada et al., Cell 35, 849 (1983) beschrieben und von Altman, Adv. Enzymol. 62: 1 (1989) zusammenfassend dargestellt.
Die US-A-5 168 053 mit dem Titel "Cleavage Of Targeted RNA By RNase P" von Altman et al. offenbart, daß es möglich ist, ein beliebiges RNA-Molekül zur Spaltung durch bakterielle RNase P zielgerichtet anzusteuern, indem eine Nucleotidsequenz gebildet wird, von der ein Teil komplementär zu einer Zielstelle ist und die ein terminales 3'-NCCA umfaßt, wobei die Sequenz mit der Ziel-RNA hybridisieren soll, so daß die bakterielle RNase P das Substrat an der basenge paarten Hybridregion spaltet. Die Spezifität wird durch die komplementäre Sequenz festgelegt. Die Sequenz weist vorzugsweise eine Länge von 10 bis 15 Nucleotiden auf und kann insoweit nicht-komplementäre Nucleotide enthalten, als dies nicht die Bildung mehrerer Basenpaare durch die komplementäre Sequenz, der NCCA am 3'-Ende folgt, beeinträchtigt.
Nach der Beschreibung in der WO 92/03566 der Yale University kann Ribonuclease P (RNase P) aus E. coli Oligoribonucleotide spalten, die man in wasserstoffgebundenen Komplexen, die dem Aminoacylstamm ähneln und die 5'-Leader- Sequenz von tRNA-Vorläufern, -NCAA, umfassen, findet. Humane RNase P kann in vitro das 5'-proximale Oligoribonucleotid in den einfachen, durch RNase P von E. coli gespaltenen Komplexen nicht spalten, doch gelingt dies, wenn das 3'- proximale Oligoribonucleotid an eine externe Leitsequenz (EGS) unter Ausbildung einer Struktur, die Bereichen eines tRNA-Moleküls ähnelt, gebunden ist. Die EGS kann eine zu einem Zielsubstrat komplementäre Sequenz von mindestens 11 Nucleotiden, 7 Basen, die unter Ausbildung einer mit dem Aminoacylakzeptorstamm einer Vorläufer-tRNA verwandten Struktur an die Zielsequenz über Wasserstoff binden, und 4 Nucleotide, die unter Ausbildung einer mit dem Dihydroxyuracilstamm verwandten Struktur mit der Zielsequenz eine Basenpaarung eingehen, umfassen. Die WO 92/03566 offenbart keine EGS für prokaryotische RNase P mit weniger als 7 komplementären Nucleotiden.
Die WO 93/22434 der Yale University offenbart eine EGS für humane RNase P. Nach der Beschreibung in der WO 93/22434 besteht eine EGS für humane RNase P aus einer Sequenz, die, wenn sie als Komplex mit dem Zielsubstratmolekül vorliegt, eine Sekundärstruktur bildet, die der eines tRNA-Kleeblatts oder eines wesentlichen Teils desselben ähnelt, und zur Spaltung der Ziel-RNA durch RNase P führt. Die Sequenz der EGS der WO 93/22434 ist von einer beliebigen tRNA hergeleitet, wobei jedoch der D-Stamm und Aminoacylstamm so verändert sind, daß sie komplementär zur Zielsubstratsequenz sind. Die WO 93/22434 offenbart ferner EGS, bei denen entweder die Anticodon-Stamm-Schleifen-Struktur oder die Extraschleife deletiert sind, und EGS, bei denen die Sequenz der T-Stamm-Schleifen-Struktur geändert ist. Die WO 93/22434 offenbart keine eukaryotischen EGS, die nur eine zur Ziel-RNA komplementäre Region und eine Region, die eine Struktur ähnlich nur der T-Stamm-Schleifen-Struktur von tRNA bildet, umfaßt. Weder die WO 92/03566 noch die WO 93/22434 offenbaren EGS mit chemisch modifizierten Nucleotiden.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist daher die Bereitstellung von Verfahren und Zusammensetzungen zur spezifischen Spaltung von Ziel- bzw. Target-RNA-Sequenzen unter Verwendung verknüpfter katalytischer RNA- und minimaler Leitsequenzen.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung chemisch modifizierter externer Leitsequenzen für RNase P mit erhöhter Beständigkeit gegenüber einem Abbau durch Nuclease.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Selektion externer Leitsequenzen und verknüpfter katalytischer RNA- und Leitsequenzen, die eine Ziel-RNA mit größerer Effizienz spalten.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von Verfahren und Zusammensetzungen zur spezifischen Spaltung von RNA in vitro in eukaryotischen Zellen, zur Behandlung von Erkrankungen, an denen eine RNA- Transkription oder -Translation beteiligt ist, beispiels weise Erkrankungen, die durch RNA- und DNA-Viren und die Expression exzessiver oder pathogener Proteine durch mRNA oder exzessive oder pathogene RNA selbst verursacht werden.

Zusammenfassung der Erfindung

Jede beliebige RNA kann zur Spaltung durch RNase P zielgerichtet angesteuert werden, wobei ein geeignet aufgebautes Oligonucleotid ("externe Leitsequenz") zur Bildung eines Hybrids mit der Ziel-RNA verwendet wird, wobei ein Zielsubstrat zur Spaltung durch RNase P geschaffen wird. Die EGSs enthalten Sequenzen, die zur Ziel-RNA komplementär sind und mit Teilen eines tRNA-Moleküls verwandte Sekundär- und Tertiärstrukturen bilden. Eine eukaryotische EGS muß mindestens 7 Nucleotide enthalten, die mit der Zielsequenz 3' zur geplanten Spaltungsstelle unter Bildung einer Struktur gleich dem Aminoacylakzeptorstamm eine Basenpaarung eingehen, Nucleotide, die unter Ausbildung einer Stamm- Schleifen-Struktur ähnlich der T-Stamm-Schleifen-Struktur eine Basenpaarung eingehen, gefolgt von mindestens 3 Nucleotiden, die mit der Zielsequenz unter Ausbildung einer Struktur gleich dem Dihydroxyuracilstamm eine Basenpaarung eingehen. Die EGS kann gegenüber einem Abbau durch Nuclease beständiger gemacht werden, indem chemisch modifizierte Nucleotide oder Nucleotidverknüpfungen eingebaut werden.
Die externe Leitsequenz und die katalytische RNase-P-RNA können zusammen als getrennte Moleküle verwendet werden. Alternativ können die beiden Sequenzen zu einem einzigen Oligonucleotidmolekül, das sowohl Targeting- als auch katalytische Funktionen besitzt, kombiniert werden. Ein derartiges kombiniertes Oligonucleotid, das als interne RNase-P- Leitsequenz (RIGS) bezeichnet wird, erhöht die kinetische Effizienz der Spaltung, indem die Anzahl der Reaktanten verringert wird und die Targeting- und katalytischen Ele mente in enger Nachbarschaft gehalten werden. Eine chemische Modifizierung der Nucleotide und Phosphatverknüpfungen von EGS-Molekülen und RIGS-Molekülen machen die Oligonucleotide gegenüber einem Abbau durch Nuclease beständiger.
Es werden auch Methoden zur Selektion von RIGS-Molekülen und EGS-Molekülen mit erhöhter Substrataffinität und Brauchbarkeit in vivo zur Spaltung oder zielgerichteten Spaltung einer ausgewählten RNA und dadurch der Verhinderung einer Expression der Funktion der Ziel-RNA offenbart. Die Verfahren und Zusammensetzungen sollten sich zur Verhinderung der Expression von Krankheiten oder Störungen verursachenden Genen in vivo eignen.
Wie in den Beispielen beschrieben kann eine RIGS durch Verknüpfen einer Leitsequenz mit M1-RNA konstruiert werden (M1GS-RNA). M1GS-RNA kann als sequenzspezifische Endonuclease wirken und kann Ziel-RNAs, die mit der Leitsequenz in gleicher Weise wie Gruppe-I-Introns eine Basenpaarung eingehen, spalten. Eine nach Maß gearbeitete M1GS-RNA spaltet die mRNA mit Codierung für Thymidinkinase (TK) des humanen Herpes-simplex-Virus 1 (HSV-1) in vitro. Wenn diese M1GS-RNA in Säugetierzellen in Gewebekultur exprimiert wird, verringert sie das Ausmaß der Expression von TK durch Verringern der Menge an Ziel-TK-mRNA.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 ist die vorgeschlagenen Sekundärstruktur des beim Selektionsverfahren verwendeten chimären Substrats (Sequenz ID Nr. 1). Die kursiv geschriebene Sequenz ist aus CAT-mRNA und die übrige Sequenz beruht, abgesehen von Veränderungen, die zur Sicherstellung einer spezifischen Bindung über Wasserstoff an CAT-mRNA gemacht wurden, auf der Sequenz von tRNATyr von E. coli. Die 9 Nucleotide, die regellos gewählt bzw. randomisiert sind, sind jeweils durch N angegeben. Einige der EGS-Analoga für verschiedene Teile einer tRNA sind ebenfalls aufgezeigt: Akzeptor-Stamm, T-Schleife, Anticodon-Schleife und D-Schleife.
Fig. 2 gibt das allgemeine Schema zur in-vitro-Selektion und Amplifikation chimärer Substrate mit erhöhter Effizienz zur Lenkung einer Spaltung durch humane RNase P. Der Ausdruck "reverse Transkriptase" gibt an, daß die DNA- Polymerasefähigkeit von reverser Transkriptase verwendet wurde, um aus den überlappenden DNA-Oligonucleotiden SEC-1A (Sequenz ID Nr. 2) und SEC-1B (Sequenz ID Nr. 3) doppelsträngige Templat-DNA zu schaffen. Der Ausdruck "RNA-PCR" bezieht sich auf mit PCR gekoppelte reverse Transkription.
Fig. 3 zeigt die Sequenz und Sekundärstrukturen des Vorläufers zu tRNATyr (Sequenz ID Nr. 4) und eines Komplexes aus einem Substrat und EGSΔ (1-18) (Sequenz ID Nr. 5), das aus tRNATyr abgeleitet ist, dem jedoch die ersten 18 Nucleotide vom 5' -Ende der reifen tRNATyr fehlen.
pTyr: E. coli-tRNTyr-Vorläufer; pAva: Substrat (Ziel)-RNA mit 5'-Leader-Sequenz und den ersten vierzehn Nucleotiden von E. coli-tRNATyr (Sequenz ID Nr. 6).
Fig. 4A, 4B, 4C, 4D, 4E und 4F sind die vorgeschlagenen Sekundärstrukturen von Komplexen aus CAT-mRNA und verschiedenen EGS. 4A und 4D geben Komplexe zwischen der komplementären Region von CAT-mRNA (Sequenz ID Nr. 7) und EGSCAT (Sequenz ID Nr. 8) an. 4B und 4E sind Komplexe von CAT-mRNA (Sequenz ID Nr. 7) und EGS 9 (Sequenz ID Nr. 9). 4C und 4F sind Komplexe von CAT-mRNA (Sequenz ID Nr. 7) und EGSCATΔAC (Sequenz ID Nr. 10). Hohlpfeile bezeichnen die Stellen der Spaltung durch humane RNase P. In den Fig. 4A, 4B und 4C bezeichnen fette Pfeilspitzen die Stellen der Spaltung durch RNase T1 und Pfeile die Stellen der Spaltung durch RNase T2. In den Fig. 4D, 4E und 4F sind die Stellen der Spaltung durch Kobragiftnuclease durch fette Pfeile angezeigt.
Fig. 5 zeigt die Raten (nmol/min) der durch zwölf einzelne EGS-RNAs gelenkten Spaltung von CAT-mRNA durch humane RNase P. Neun einzelne EGS-RNAs: EGS 1 (Sequenz ID Nr. 17), EGS 4 (Sequenz ID Nr. 19), EGS 5 (Sequenz ID Nr. 20), EGS 6 (Sequenz ID Nr. 21), EGS 8 (Sequenz ID Nr. 22), EGS 9 (Sequenz ID Nr. 9), EGS 12 (Sequenz ID Nr. 26), EGS 14 (Sequenz ID Nr. 27), EGS 18 (Sequenz ID Nr. 31), wurden durch in-vitro-Selektion hergestellt. EGS 19 und EGS AAC (Sequenz ID Nr. 10) wurden durch in-vitro-Mutagenese hergestellt. Die Ergebnisse sind als Anfangsraten (nmol/mol) der Spaltung des Substrats durch RNase P während der linearen Phase jeder Reaktion dargestellt.
Fig. 6A, 6B und 6C zeigen die Sequenz und vorgeschlagene Sekundärstrukturen von EGS für Thymidinkinase-mRNA des Herpes-simplex-Virus (Sequenz ID Nr. 35). Fig. 6A ist eine EGS (Sequenz ID Nr. 36), die einen Aminoacylakzeptorstamm, eine T-Stamm-Schleifen-Struktur, eine variable Stamm-Schleifen- Struktur, eine Anticodon-Stamm-Schleifen-Struktur und einen D-Stamm bildet. Fig. 6B ist eine EGS (Sequenz ID Nr. 37), in der ein C in der EGS von Fig. 6A durch ein G in der T- Schleife ersetzt ist. Fig. 6C ist eine EGS (Sequenz ID Nr. 38), bei der die Anticodon-Stamm-Schleifen-Struktur der EGS von Fig. 6A deletiert ist.
Fig. 7 ist eine graphische Darstellung der prozentualen TK- mRNA-Expression für die Zellinien: CL-CAT, CL-109, CL-104 und CL-112.
Fig. 8 ist die Sequenz und Struktur von H1-RNA (Sequenz ID Nr. 11) von Altmann et al., Genomics 18: 418-422 (1993).
Fig. 9 ist eine schematische Darstellung von Komplexen, die von M1GS-RNA (Sequenz ID Nr. 51 und Sequenz ID Nr. 52) und zwei Substraten (Sequenz ID Nr. 53 und Sequenz ID Nr. 54) gebildet werden.
Fig. 10 ist ein.Diagramm von TK- und CAT-RNA-Substrat-RNAs. Die zwei 13-nt-Segmente, die in den TK-RNA- und CAT-RNA- Sequenzen herausgehoben sind (Sequenz ID Nr. 55 und Sequenz ID Nr. 56), sind komplementär zu den Leitsequenzen in M1TK13- bzw. M1CAT13-RNA. Die Spaltstellen sind durch Pfeile angegeben.
Fig. 11 ist eine schematische Darstellung der tk46- Substratsequenz (Sequenz ID Nr. 57) und der Struktur der verwendeten RNA-Enzyme (Sequenz ID Nr. 58, Sequenz ID Nr. 59, Sequenz ID Nr. 60, Sequenz ID Nr. 61, Sequenz ID Nr. 62, Seguenz ID Nr. 63, Sequenz ID Nr. 64 und Sequenz ID Nr. 65). Der Pfeil markiert die erwartete Spaltstelle. Die [in den M1GS-RNAs] in Fettdruck angegebenen Sequenzen sind die Leitsequenzen, die die 3'-CCA-Sequenz und die zur TK- Sequenz komplementäre Sequenz enthalten.
Fig. 12 ist eine schematische Darstellung von Retrovirusvektoren (ΔM1TK, M1TK und NB2), die M1GS-RNAs oder eine zum Influenzavirusprotein PB2 komplementäre EGS-Sequenz enthalten.
Fig. 13 ist eine graphische Darstellung der Höhe der Expression (Prozent der Kontrollexpression) von TK-mRNA und -Protein in ΨECRE-Zellen und anderen Zellinien. Die Werte sind Mittelwerte von Ergebnissen aus vier unabhängigen Experimenten. Die Ergebnisse aus den vier Experimenten variierten innerhalb von 5% in absoluter Form.
Volle Balken: TK-mRNA; leere Balken: TK-Protein.
Keine der in den Figuren oder in den Sequenzprotokollen gezeigten Sequenzen liegt innerhalb des Umfangs der Ansprüche.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Leitsequenz

Der hier verwendete Ausdruck "Leitsequenz" (GS) ist ein Oligonucleotid, das ein Substrat-RNA-Molekül zur Spaltung durch eine katalytische RNA mit der Aktivität einer katalytischen RNase-P-RNA zielgerichtet ansteuert. Eine Leitsequenz kann ein getrenntes Molekül sein, das als externe Leitsequenz bezeichnet wird, oder in einem einzigen Molekül mit katalytischer RNA kombiniert sein. Ein solches kombiniertes Molekül wird im folgenden als interne RNase-P- Leitsequenz (RIGS) bezeichnet.

A. Eukaryotische RNase-P-Targeting-Sequenz

Eine Leitsequenz für humane RNase P besteht aus einer Sequenz, die als Komplex mit dem Zielsubstratmolekül eine Sekundärstruktur bildet, die der eines tRNA-Kleeblatts oder eines Teils desselben ähnlich ist. Der hier verwendete Ausdruck "einer Vorläufer-tRNA ähnlich sein" bedeutet, daß ein von der GS mit Ziel-RNA-Substrat gebildeter Komplex einem ausreichenden Teil der Sekundär- und Tertiärstruktur von tRNA ähnlich ist, so daß sich eine Spaltung der Ziel-RNA durch RNase P ergibt. Die Sequenz der GS kann von einer beliebigen tRNA abgeleitet sein, wobei jedoch der D-Stamm und der Aminoacylstamm so verändert sein müssen, daß sie zur Zielsubstratsequenz komplementär sind. Diese veränderten Stämme werden als Erkennungsarme bezeichnet. Der dem Ami noacylstamm entsprechende Erkennungsarm wird als der A- Erkennungsarm und der dem D-Stamm entsprechende Erkennungsarm als D-Erkennungsarm bezeichnet. Der übrige Teil der Leitsequenz, der bewirken soll, daß die katalytische RNase- P-RNA mit dem GS/Zielsequenz-Komplex wechselwirken soll, wird im folgenden als RNase-P-Bindungssequenz bezeichnet. Das Vorliegen eines 3'-CCA auf einer EGS verstärkt die Effizienz der in-vitro-Reaktion mit der humanen RNase P um etwa 35%. Die Anticodon-Stamm-Schleifen-Struktur und die Extraschleife können getrennt deletiert werden und die Sequenz der T-Stamm-Schleifen-Struktur kann geändert werden, ohne die Brauchbarkeit der Leitsequenz zu verringern. Im Falle der Deletion der Anticodon-Stamm-Schleifen-Struktur wird die Effizienz der Reaktion um das etwa 10fache erhöht. Veränderungen in anderen Teilen einer EGS können ihre Effizienz um das etwa 100fache erhöhen.
Die angestrebte Sekundärstruktur wird unter Verwendung üblicher Watson-Crick-Basenpaarungsschemata zur Bildung einer einer tRNA ähnelnden Struktur, d. h. mit einer wie unten beschriebenen Struktur, bestimmt. Die spezielle Sequenz der Regionen mit Wasserstoffbrückenbindung ist nicht sehr kritisch, sofern die gewünschte Struktur gebildet wird. Alle tRNAs, einschließlich tRNAs aus einer großen Vielzahl von Bakterien und Eukaryoten, entsprechen der gleichen allgemeinen Sekundärstruktur. Diese wird typischerweise in Form eines Kleeblatts, das durch Basenpaarung über Wasserstoffbrückenbindung zwischen kurzen komplementären Regionen aufrechterhalten wird, geschrieben. Die vier Hauptarme werden nach ihrer Struktur oder Funktion benannt: Der Akzeptorarm besteht aus einem 3'-terminalen CCAOH plus einem variablen vierten Nucleotid, die über den durch Basenpaarung der 5'- und 3'-Segmente des Moleküls gebildeten Stamm hinausragen. Die anderen Arme bestehen aus Stämmen mit Basenpaarung und ungepaarten Schleifen. Der "T"-Arm ist nach dem Vorhanden sein des Ribothymidinnucleotids benannt und enthält 7 ungepaarte Basen in der Schleife. Der Anticodonarm enthält immer das Anticodontriplett in der Mitte der Schleife und besteht aus 7 ungepaarten Basen. Der D-Arm ist nach dem Vorhandensein der Base Dihydrouridin in der Schleife, einer anderen chemisch modifizierten Base in tRNA, benannt und umfaßt zwischen 8 und 12 ungepaarte Basen. Die Positionen sind von 5' nach 3' entsprechend der am meisten üblichen tRNA-Struktur, die 76 Reste aufweist, numeriert. Der Gesamtbereich der tRNA-Längen liegt bei 74 bis 95 Basen. Die Variation der Länge wird durch Unterschiede in der Struktur von zwei Armen, dem D-Arm und dem Extra- oder variablen Arm, der zwischen den T- und Anticodon-Armen liegt, die zwischen 3 und 5 Basen oder zwischen 13 und 21 Basen mit einem Stamm von etwa 5 Basen enthalten können, verursacht. Die Basenpaarung, die die Sekundärstruktur aufrechterhält, ist praktisch unveränderlich: Es befinden sich immer 7 Basenpaare im Akzeptorstamm, 5 im T-Arm, 5 im Anticodon-Arm und 3 oder 4 im D-Arm.
Eine hier verwendete Hybridstruktur, die aus einer über Wasserstoffbrücken an ein RNA-Substrat gebundenen EGS besteht und unter Bedingungen, die die Spaltung des Substrats am Nucleotid am 5'-Ende der basengepaarten Region durch RNase P fördern, eine Sekundärstruktur aufweist, die einer Vorläufer-tRNA ähnlich ist, umfaßt vorzugsweise einen D- Stamm, einen Aminoacylstamm und eine T-Stamm-Schleifen- Struktur, wobei die Sequenz der letzteren im Vergleich zur Sequenz und detaillierten Struktur, die sich im Ausgangsmolekül findet, verändert werden kann.
Einige wenige Nucleotide finden sich immer in den gleichen Positionen in 90 bis 95% der tRNAs, wobei einige weitere Nucleotide semikonserviert oder semivariant sind. Dies ist für die GS nicht absolut erforderlich, sofern die Sequenz zum Target komplementär ist und die für die tRNA charakteristische Sekundärstruktur bildet. Tatsächlich werden die Sequenzen, die den Aminoacylstamm und die D-Stamm- Schleifen-Struktur bilden in der GS so geändert, daß sie komplementär zur Ziel-RNA sind.
Die basengepaarten Doppelhelixstämme der Sekundärstruktur werden in der Tertiärstruktur aufrechterhalten, wobei zwei Doppelhelices im rechten Winkel zueinander geschaffen werden. Der Akzeptor-Stamm und der T-Stamm bilden eine kontinuierliche Doppelhelix mit einer einzigen Lücke; der D- Stamm und der Anticodon-Stamm bilden eine weitere kontinuierliche Doppelhelix, ebenfalls mit einer Lücke. Viele der invarianten und semiinvarianten Basen sind an der Tertiärstruktur beteiligt.
Die komplementären Sequenzen bestehen im allgemeinen aus elf Nucleotiden oder sie können unter bestimmten Bedingungen aus nur sieben Nucleotiden bestehen, in zwei Blocks, die mit der Zielsequenz eine Basenpaarung eingehen und die durch zwei ungepaarte Nucleotide in der Zielsequenz, vorzugsweise UU, getrennt sind, wobei die beiden Blocks zu einer 3' zur Zielstelle der Spaltung befindlichen Sequenz komplementär sind.

D. Prokaryotische RNase-P-Targeting-Sequenz

Die Anforderungen an eine mit prokaryotischer RNase P wirksame GS sind weniger streng als die an eine eukaryotische GS. Die kritischen Elemente einer prokaryotischen GS sind (1) eine Nucleotidsequenz, die spezifisch an das Ziel-RNA- Substrat unter Bildung einer kurzen Sequenz von Basenpaaren 3' zur Spaltstelle auf der Substrat-RNA bindet, und (2) ein terminales 3'-NCCA, wobei N ein beliebiges Nucleotid, vorzugsweise ein Purin ist. Diese Sequenz besitzt im allgemei nen nicht weniger als 4, und häufiger 6 bis 15 zur Ziel-RNA komplementäre Nucleotide. Es ist nicht kritisch, daß alle Nucleotide komplementär sind, obwohl die Effizienz der Reaktion mit dem Grad der Komplementarität variiert. Die Spaltungsrate ist von der RNase P, der Sekundärstruktur des Hybridsubstrats, das die Ziel-RNA umfaßt, und dem Vorhandensein des 3'-NCCA im Hybridsubstrat abhängig.

Ribonuclease P

Ribonuclease P ist ein aus Protein- und RNA-Untereinheiten bestehendes Enzym, das tRNA-Vorläufer spaltet, wobei die 5' -Termini von tRNAs erzeugt werden. Diese wesentliche enzymatische Aktivität wurde in allen untersuchten Zelltypen, sowohl prokaryotischen als auch eukaryotischen, gefunden. Während der Untersuchungen bezüglich der Erkennung eines Substrats durch RNase P zeigte sich, daß RNase P von E. coli synthetische, mit tRNA verwandte Substrate, denen bestimmte Domänen fehlen, speziell die D-, T- und Anticodon- Stamm-Schleifen-Strukturen der normalen tRNA-Struktur fehlen, spalten kann. Eine Halbdrehung einer RNA-Helix und eine 3'-proximale CCA-Sequenz enthalten ausreichend Erkennungselemente, damit die Reaktion fortschreiten kann. Die 5'-proximale Sequenz der RNA-Helix muß nicht kovalent an die 3'-proximale Sequenz der Helix gebunden sein. Die 3'- proximale Sequenz des Stamms kann als "Leitsequenz" betrachtet werden, da sie die Spaltstelle in der 5'- proximalen Region über eine Basenpaarungsregion identifiziert.
RNase P aus E. coli und Humanzellen weisen ähnliche, jedoch nicht identische biochemische Eigenschaften auf. Ihre RNA- Komponenten besitzen ähnliche Sekundärstrukturen. Der Substratbereich von humaner RNase P ist jedoch viel enger als der des Enzyms E. coli. Beispielsweise kann zwar RNase P von E. coli ein synthetisches, mit tRNA verwandtes Substrat, dem drei spezifische Domänen der normalen tRNA- Struktur fehlen, spalten, aber das humane Enzym und das strukturell ähnliche Enzym aus der Hefe, S. cerevisiae, können das gleiche Substrat nicht spalten. RNase P von E. coli kann jedoch ein synthetisches, mit tRNA verwandtes Substrat, das auch von der humanen RNase P gespalten wird, spalten. Altmann et al., Genomics 18: 419-422 (1993) beschreibt mehrere katalytische Säugetier-RNase-P-RNAs und identifiziert gemeinsame Merkmale und Unterschiede.
Die hier verwendete RNase P bezeichnet, wenn nicht anders angegeben, die RNase P in der Zelle, in der sich die zu spaltende RNA befindet. Diese kann endogen, der Zelle zugesetzt oder in vitro verwendet sein. Viele der hier beschriebenen Techniken sind, ebenso wie die Verfahren zur Herstellung von Reagenzien und Quellen für Reagenzien Fachleuten bekannt.
Es ist nicht notwendig, RNase-P-Aktivität bereitzustellen, wenn die Spaltung in Bakterienzellen oder intrazellulär im Kern erfolgen soll, da alle eukaryotischen Zellen RNase P in den Kernen enthalten. RNase P muß zugeführt werden, wenn die Spaltung im Cytoplasma eukaryotischer Zellen erfolgen soll. Die hier zur leichteren Behandlung verwendete RNase P bezeichnet das aus prokaryotischen oder eukaryotischen Analoga von C5-Protein und M1-RNA von E. coli bestehende Ribonucleoprotein, ungeachtet der Quelle, isoliert oder durch chemische Synthese erzeugt. Die RNA-Untereinheit von RNase P kann auch aus einem Gen transkribiert werden. Die eukaryotische RNase-P-RNA-Untereinheit wird als H1-RNA bezeichnet. Die RNA-Untereinheit muß bei Fehlen von Proteinuntereinheiten in vitro nicht notwendigerweise katalytische Aktivität zeigen.

A. Endogene RNase P

Die Sequenz und vorgeschlagene Sekundärstruktur von H1-RNA, der RNA-Komponente von humaner RNase P, wurde von Altmann et al. (1993) berichtet. Diese Lehren sind auf dem einschlägigen Fachgebiet allgemein bekannt. Die Sequenz und vorgeschlagene Struktur von H1-RNA ist in Fig. 8 (Sequenz ID Nr. 11) gezeigt. Die Sequenz und vorgeschlagene Sekundärstruktur von Ml-RNA, der RNA-Komponente von RNase P von E. coli wurde durch James et al., Cell 52: 19 (1988) berichtet. Diese Lehren sind auf dem einschlägigen Fachgebiet allgemein bekannt. Die Sequenz von M1-RNA ist als Sequenz ID Nr. 40 angegeben.
Wegen der Ähnlichkeit in der Sekundärstruktur und Substratspezifität unter den RNase P's unterschiedlichen Ursprungs ist es möglich, eine EGS, die zur Maximierung der Effizienz der Spaltung für die fragliche RNase P unter Verwendung hier beschriebener Verfahren konstruiert wurde, zum zielgerichteten Ansteuern einer beliebigen RNA in einer beliebigen Zelle zu verwenden, auch wenn die katalytisch aktiven RNA-Untereinheiten deutlich verschiedene Sequenzen aufweisen. Siehe Altmann, Ann. Rev. Enzymology 62: 1-39 (1989); Altmann, J. Biol. Chem. 265: 20053-20056 (1990). Die Sekundärstruktur ist durch intramolekulare Assoziationen komplementärer Sequenzen definiert. Basenpaare können kanonisch, A/U und G/C, oder nicht-kanonisch, G/U, A/G und dgl. sein.

B. Exogene RNA mit katalytischer Aktivität

Eine EGS kann auch in Kombination mit einer RNA-Sequenz, die enzymatische Aktivität bei Vorhandensein oder Fehlen eines Proteins zeigt, verwendet werden. Für diese RNA- Sequenz kann ein Molekül wie das gesamte H1- oder M1-RNA- Molekül, ein funktionell äquivalentes Molekül von prokaryotischem(r) oder eukaryotischem(r) Ursprung oder Abstammung oder ein Teil desselben, für das katalytische Aktivität nachgewiesen wurde, entweder allein oder in Kombination mit einem Protein stehen. Eine solche katalytische RNA wird hier als katalytische RNase-P-RNA bezeichnet und ihre Sequenz wird als katalytische RNase-P-Sequenz bezeichnet. Eine wie oben beschriebene RNA wird als katalytische RNase-P- RNA, ungeachtet der Quelle, einer Isolierung, einer Herstellung durch chemische Synthese oder einer Transkription von einem Gen angesehen. Wie oben angegeben, ist eine zur Umwandlung einer Zielsequenz in ein Substrat für humane RNase P wirksame EGS auch wirksam, das Substrat zu einem Ziel für prokaryotische RNase P zu machen.
Katalytische RNase-P-RNA kann von natürlich vorkommenden katalytischen RNase-P-RNAs beispielsweise durch Deletion von Teilen und Durchführung von Nucleotidsubstitutionen abgeleitet werden. Solche abgeleiteten katalytischen RNAs müssen nur genügend der katalytischen Aktivität von natürlich vorkommender katalytischer RNase-P-RNA, um Ziel-RNA zu spalten, zurückbehalten. Ein bevorzugtes Verfahren zur Erzeugung katalytischer RNase-P-Sequenzen ist die im folgenden beschriebene in-vitro-Evolution.
Zwei prinzipielle Situationen existieren, in denen katalytische RNase-P-RNA oder RNase P in Kombination mit EGS genutzt wird: in vitro in Abwesenheit von Zellen oder cellulärer RNase P oder unter Umständen, bei denen sich die zu spaltende RNA in einem Teil einer Zelle befindet, der keine endogene RNase P enthält. Im letzteren Fall werden die Gene mit Codierung für die wie oben definierten Analoga von M1- RNA und C5-Protein oder deren humane oder sonstigen eukaryotischen Äquivalente in die Zelle an der zur Spaltung gewünschten Stelle unter Verwendung eines geeigneten Vek tors oder einem sonstigen, einem Fachmann bekannten Verfahren zur Einführung und Expression eines Gens in einer Zelle eingeführt.

Interne RNase-P-Leitsequenzen

Eine Leitsequenz und die katalytische RNA-Untereinheit einer RNase P können zur Bildung eines einzigen Oligonucleotidmoleküls, das sowohl die Targeting-Funktion einer EGS als auch die Spaltungsfunktion von katalytischer RNase-P- RNA besitzt, verknüpft werden. Eine solche Kombination in einem einzigen Oligonucleotidmolekül wird als interne RNase-P-Leitsequenz (RIGS) bezeichnet. Eine RIGS kann zur Spaltung eines Ziel-RNA-Moleküls auf die gleiche Weise wie EGS verwendet werden.
RIGSs können durch Verknüpfen einer Leitsequenz mit einer katalytischen RNase-P-Sequenz mittels beliebiger geeigneter Maßnahmen gebildet werden. Beispielsweise können eine EGS und katalytische RNase-P-RNA als getrennte Moleküle hergestellt werden, die dann kovalent in vitro verknüpft werden. Alternativ kann eine vollständige RIGS als einziges Molekül entweder durch chemische Synthese oder durch in-vitro- oder in-vivo-Transkription eines DNA-Moleküls mit Codierung für eine verknüpfte GS- und katalytische RNase-P-Sequenz synthetisiert werden. Die Verknüpfung zwischen den GS- und RNase-P-Domänen einer RIGS kann eine beliebige Form, die der Domäne die Spaltung einer Ziel-RNA ermöglicht, aufweisen. Beispielsweise könnten die beiden Domänen über einen Oligonucleotidlinker verbunden sein. Vorzugsweise besteht der Linker aus durch Phosphodiesterbindungen verbundenen üblichen Nucleotiden. Die Komponenten GS und katalytische RNase-P-Sequenz können in einer beliebigen Reihenfolge verbunden sein, wobei die katalytische RNase-P-Sequenz entweder mit dem 3'-Ende oder 5'-Ende der GS-Komponente ver knüpft ist.
RIGSs können zur Spaltung von Ziel-RNA sowohl in vitro als auch in vivo verwendet werden. In vitro kann die RIGS ohne RNase-P-Proteinkomponenten in vitro fungieren, obwohl die Aktivität der RIGS durch die Zugabe von RNase-P- Proteinkomponenten erhöht werden kann. In vivo stimulieren endogene RNase-P-Proteine die Aktivität der RIGS. Die Aktivität von RIGSs auf sowohl prokaryotischer als auch eukaryotischer Basis wird vermutlich durch das Vorhandensein von entweder prokaryotischen oder eukaryotischen RNase-P- Proteinkomponenten verstärkt.

Verfahren zur Herstellung von EGSs und RIGSs mit erhöhter Wirksamkeit

EGSs und RIGSs mit erhöhter Bindungsaffinität, gemessen als verringerte Bindungsenergie, können durch in-vitro- Evolution konstruiert werden. Ein solches Verfahren kann zur Identifizierung von RNA-Molekülen mit gewünschten Eigenschaften aus Pools von Molekülen, die regellos verteilte Sequenzen enthalten, verwendet werden. Wie in den Beispielen deutlicher aufgezeigt wird, können diese Verfahren entsprechend modifiziert zur Isolierung wirksamer EGSs und RIGSs verwendet werden. Diese neuen EGSs ermöglichen als Komplex mit einer Beispiel-Ziel-RNA, dem CAT-mRNA-Substrat (Sequenz ID Nr. 7), eine Spaltung des Targets durch humane RNase P mit Raten, die denen mit natürlichem Substrat erreichten ähnlich sind.
Das allgemeine Selektionsschema ist in Fig. 2 angegeben. In jeder Selektionsrunde wird der Pool von RNAs mit humaner RNase P oder mit der RIGS verdaut und die gespaltenen Produkte werden durch Elektrophorese isoliert und anschließend amplifiziert, wobei Nachkommen-RNAs erzeugt werden. Eines der Templat-erzeugenden Oligonucleotide wird als der 5'- Primer für die Polymerasekettenreaktion (PCR) verwendet, um eine Wiederherstellung der Promotor-Sequenz und der Leader- Sequenz der chimären RNA für den nächsten Selektionszyklus zu ermöglichen. Die Stärke der Selektion wird mit jedem Zyklus erhöht, indem die Enzymmenge und die für die Spaltungsreaktion gegebene Zeit verringert werden, so daß nur die Substrate, die rasch durch das Enzym gespalten werden, selektiert werden.
In den ersten drei Selektionsrunden werden RNA-Substrate mit einer geeigneten Menge von humaner RNase P, beispielsweise 3,6 Einheiten, oder der äquivalenten Aktivität der RIGS verdaut. Eine Einheit von humaner RNase P ist so definiert, daß diese Enzymmenge 1 umol des Vorläufers zu tRNATyr aus E. coli in 30 min bei 37ºC spaltet. Für Ansätze in folgenden Selektionsrunden wird die Enzymmenge verringert und die Inkubationsdauer verkürzt, so daß weniger als 20% des Substrats gespalten werden. Die Spaltungsprodukte werden von nicht gespaltenen Substraten durch Elektrophorese und RNA-Extraktion abgetrennt.
Die RNAs des gereinigten Spaltungsprodukts werden revers transkribiert und durch PCR amplifiziert. Die durch PCR erzeugte doppelsträngige DNA erhält die Promotor-Sequenz und die Leader-Sequenz von der Sequenz im Primer zurück und wird dann als Templat zur Transkription von RNA für die nächste Selektionsrunde verwendet. Nach acht Selektionszyklen wird der hierbei erhaltene Pool doppelsträngiger DNAs in einen geeigneten Vektor kloniert und sequenziert.
Zum Test der Fähigkeiten der von den einzelnen Varianten abgeleiteten EGSs oder RIGSs werden dem GS-Segment jeder chimären tRNA entsprechende Sequenzen durch PCR amplifiziert und die RNAs mit einer geeigneten RNA-Polymerase transkribiert. Dann wird die RNA-Spaltung durch die selektierten EGS oder RIGS getestet. Die den am stärksten aktiven EGSs und RIGSs gemeinsamen Sequenzen werden anschließend bestimmt und es werden neue EGS und RIGSs konstruiert.
Wie in den Beispielen beschrieben wurde eine Simulation der Evolution in vitro verwendet, um EGSs zu selektieren, die stark an eine Zielsubstrat-mRNA binden und die Effizienz der Spaltung des Targets durch humane Ribonuclease P zu einer Höhe, die der mit natürlichen Substraten erreichten gleich ist, steigern. Die wirksamsten EGSs stammen von tRNA-Vorläufer-ähnlichen Strukturen mit der Ziel-RNA, in denen das Analogon des Anticodon-Stamms abgespalten wurde, ein Beleg dafür, daß die Selektion bezüglich des optimalen Substrats für Ribonuclease P eine RNA-Struktur ergibt, die von der derzeitiger tRNA-Vorläufer verschieden ist.

Chemisch modifizierte EGS und RIGS

Obwohl chemisch nicht-modifizierte Oligoribonucleotide als wirksame EGS oder RIGS in einer nucleasefreien Umgebung fungieren können, verringert die kürzere Halbwertszeit in Serum und im Inneren von Zellen ihre Wirksamkeit als Therapeutika. Es können chemische Modifizierungen durchgeführt werden, die die Nucleasebeständigkeit von EGS und RIGS ohne Beeinträchtigung ihrer biologischen Funktion der Induktion oder Katalyse der Spaltung eines RNA-Targets stark erhöhen. Beispielsweise können eine oder mehr der Basen eines EGS- oder RIGS-Konstrukts unter Verwendung verfügbarer Nucleinsäuresynthesemethoden durch 2'-Methoxyribonucleotide oder Phosphorthioatdesoxyribonucleotide ersetzt werden. Synthesemethoden werden beispielsweise von Offensperger et al., EMBO J. 12: 1257-1262 (1993); PCT WO 93/01286 von Rosenberg et al. (Synthese von Schwefelthioatoligonucleotiden); Agrawal et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 7079-7083 (1988); Sarm et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 7448- 7794 (1989); Shaw et al., Nucleic Acids Res. 19: 747-750 (1991) (Synthese von 3'-Exonuclease-resistenten Oligonucleotiden mit 3'-terminalen Phosphoramidatmodifikationen) beschrieben.
In der derzeitigen Literatur ist klar dokumentiert, daß der Abbau von Oligonucleotidanaloga hauptsächlich auf 3'- Exonucleasen zurückzuführen ist. Mehrere Untersuchungen zeigten auch, daß verschiedene 3'-Modifikationen die Empfindlichkeit dieser Analoga gegenüber Nuclease stark verringern können. Ein anderes Verfahren zur Verringerung der Empfindlichkeit gegenüber 3'-Exonucleasen ist daher die Einführung eines freien Amins an einer 3'-terminalen Hydroxylgruppe des EGS- oder RIGS-Moleküls, wie beispielsweise von Orson et al., Nucl. Acids Res. 19: 3435-3441 (1991) beschrieben. Darüber hinaus können in der Sequenz eventuell vorhandene Cytosine methyliert werden oder es kann ein Interkalationsmittel, beispielsweise ein Acridinderivat, kovalent an ein 5'-terminales Phosphat gebunden werden, um die Empfindlichkeit eines Nucleinsäuremoleküls gegenüber intrazellulären Nucleasen zu verringern. Beispiele hierfür sind in Maher et al., Science 245: 725-730 (1989) und Grigoriev et al., J. Biol. Chem. 267: 3389-3395 (1992) beschrieben.
Eine weitere Klasse chemischer Modifikationen ist die Modifikation der 2'-OH-Gruppe der Riboseeinheit eines Nucleotids, von der gezeigt wurde, daß sie für die Aktivität verschiedener intrazellulärer und extrazellulärer Nucleasen kritisch ist. Typische 2'-Modifikationen sind die Synthese von 2'-O-Methyloligonucleotiden, beschrieben von Paolella et al., EMBO J. 11: 1913-1919 (1992), und von 2'-Fluor- und 2'-Aminooligonucleotiden, beschrieben von Pieken et al., Science 253: 314-317 (1991) und Heidenreich und Eckstain, J. Biol. Chem. 267: 1904-1909 (1992). Teile von EGS- und RIGS-Molekülen können auch Desoxyribonucleotide enthalten. Diese Substitutionen verbessern die Nucleasebeständigkeit durch Eliminieren der kritischen 2'-OH-Gruppe.

Anwendung von EGSs und RIGSs als Laborreagenzien oder klinische Reagenzien

Externe Leitsequenzen und RIGSs finden Anwendung als invitro-Reagenzien in ähnlicher Weise wie Restriktionsenzyme und als therapeutische Mittel zur Spaltung und Inaktivierung spezifischer Wirtszellen-RNA oder von RNA, die durch pathogene Organismen, wie Bakterien oder Viren codiert wird, wie durch die folgenden Beispiele gezeigt wird.
Die hier verwendete EGS oder RIGS ist ein Oligonucleotidmolekül. Selbstverständlich kann jedoch für therapeutische Zwecke ein DNA-Molekül mit Codierung für ein EGS-Molekül oder mit Codierung für ein RIGS-Molekül verwendet werden. Entsprechend umfaßt, wenn nicht anders angegeben, die Verabreichung einer EGS oder RIGS sowohl das RNA-Molekül, das über Wasserstoffbrücken an eine zu spaltende Zielnucleinsäuresequenz bindet, als auch ein DNA-Molekül mit Codierung für das RNA-Molekül, das unter Bedingungen, bei denen das RNA-Molekül als eine EGS oder RIGS fungiert, exprimiert wird.
Eine externe Leitsequenz kann in Gegenwart von RNase P in Kontakt mit einer RNA mit zur EGS komplementären Sequenzen gebracht werden und die RNA wird an der Zielstelle gespalten. Auf diese Weise kann die Aktivität von endogener RNase P in einer beliebigen Zelle, beispielsweise der RNase P von Humanzellen, durch die Verwendung einer geeigneten EGS-RNA gelenkt werden, um spezielle Boten-, Virus- oder sonstige RNAs zu zerstören.

A. Reagenzien für in-vitro-Anwendungen

DNA-Restriktionsendonucleasen sind unschätzbare Reagenzien für den Molekularbiologen. Restriktionsfragmentgrößenmuster werden zum Herstellen von Sequenzbeziehungen zwischen DNA- Molekülen verwendet und große DNAs können zur Bildung von Fragmenten mit Größen, die zur gentechnischen Veränderung, Sequenzierung und Untersuchung von Proteinbindung geeignet sind, gespalten werden. RNA-Prozessierungsenzyme können unter derartigen Bedingungen, daß sie ebenfalls RNA mit beträchtlicher Sequenzspezifität spalten, genutzt werden.
Spezifische Ribozyme können durch Kombination der spezifischen Leitsequenz mit RNase P oder funktionellen Äquivalenten derselben hergestellt werden. In der bevorzugten Ausführungsform sind die externe Leitsequenz und die katalytische RNase-P-RNA getrennt; alternativ können die beiden Sequenzen entweder direkt oder über einen Linker verbunden sein. Der Linker kann aus einem beliebigen Molekül, das kovalent an Oligonucleotide gebunden werden kann, bestehen. Zahlreiche Linker sind dem Fachmann bekannt. Ein bevorzugter Linker ist ein Oligonucleotid, da es eine direkte Synthese der vollständigen RIGS ermöglicht.

B. Therapeutika

1. Bestimmung und Herstellung komplementärer Sequenzen

Jedes als RNA exprimierte zelluläre Genprodukt, einschließlich durch mRNA codierter Proteine und Struktur-RNAs selbst, kann zur Inaktivierung durch RNase P oder direkt durch eine RIGS, die Sequenzen verwendet, die so aufgebaut sind, daß sie geeignete Sequenzbereiche und/oder eine Struktur zum Binden an die Ziel-RNA und die gewünschte Spaltstelle umfassen, zielgerichtet angesteuert werden. Das zelluläre Genprodukt könnte ein Produkt eines Onkogens mit einer veränderten Sequenz, beispielsweise das ras- Genprodukt; im Falle eines Produkts aus einer nicht normalen Zellkomponente ein Virusprotein, beispielsweise eines mit Codierung durch ein essentielles Gen zur HIV- Replikation; oder ein bakterielles Protein sein.
In vielen Fällen wurden die kritischen Gene einer infektiösen oder pathologischen Substanz isoliert und sequenziert. Entsprechende komplementäre Sequenzen können unter Verwendung von Standardtechniken, -reagenzien und -ausrüstung auf der Basis dieser bekannten Sequenzen synthetisiert werden.

2. Herstellung einer geeigneten pharmazeutischen Zusammensetzung zur Zufuhr der EGS oder RIGS zur Ziel-RNA

Es existieren zwei Hauptmechanismen zur Zufuhr der EGS oder RIGS zu intracellulärer RNA, die zur Spaltung angesteuert wurde: Diffusion und über einen Vektor.
Wie zuvor erörtert, können jede RNA, die bei einem Krankheitsprozess von Bedeutung ist, angesteuert werden und entsprechende komplementäre Sequenzen synthetisch oder durch Kopieren einer klonierten Sequenz hergestellt werden. Beispielsweise können Krebsregulationsgene zielgerichtet angesteuert werden. Da sich RNase P vorwiegend im Kern eukaryotischer Zellen findet, sind infektiöse Mittel, die durch Verabreichung geeigneter EGS an die infizierten Zellen am wahrscheinlichsten gehemmt werden, diejenigen, in denen kritische RNA-Sequenzen im Kern transkribiert werden. Wichtige Beispiele für Virussubstanzen, deren Replikation im Zellkern erfolgt, umfassen Herpesviren, einschließlich des Herpes-simplex-Virus, Varicella-Herpes-zoster-Virus, Cytomegalovirus und Epstein-Barr-Virus; Hepatitis-B-Virus; Ade noviren; Paramyxoviren, wie Masern; und die Retroviren, wie Humanimmunschwächevirus, HIV I, HIV II, HIV III und HTLV-1. RIGSs sollten Ziel-RNA in jedem Zellbereich spalten, da die katalytische Aktivität in ihnen selbst enthalten ist.

3. Vektorvermittelte Zufuhr von EGS und RIGSs

Bevorzugte Vektoren sind Virusvektoren, wie die Retroviren, die eine EGS und RIGS direkt in den Kern einführen, wo sie transkribiert und in den Kern freigesetzt wird. Unter den entsprechenden Bedingungen hybridisiert die EGS oder RIGS mit der Ziel-RNA und die endogene RNase P oder RIGS spaltet die hybridisierte RNA an der 5'-Seite der Hybridregion.
Methoden zur Verwendung von Retrovirusvektoren zur Gentherapie sind in der US-A-4 868 116 und 4 980 286 und der PCT- Anmeldung WO 90/02806 und WO 89/07136 beschrieben.
Defektiöse Retrovirusvektoren, die ihre eigene RNA-Sequenz in Form von DNA in das Wirtschromosom einbauen, können so verändert werden, daß sie EGS und RIGSs in den Wirt einbauen, in dem Kopien hergestellt und in das Cytoplasma freigesetzt werden, wobei sie mit den Zielnucleotidsequenzen wechselwirken.
EGS und RIGSs eignen sich besonders als Mittel zur zielgerichteten Therapie in Hämatopoesezellen von Patienten, die an virusinduzierten Erkrankungen dieser Zellen, wie AIDS, leiden. Die zur Zeit verfügbare wirksamste Verfahrensweise zur Einführung spezifischer Gensequenzen in Humanzellen umfaßt die Verwendung von RNA-haltigen Retroviren, die als Vehikel oder Vektoren zur hochwirksamen Genübertragung in Humanzellen dienen.
Eine auf RNase P basierende Therapie kann auch als Maßnahme zur Verhinderung des Ausbreitens von HIV-1 oder zur Bereitstellung einer HIV-1-resistenten Population von T-Zellen, die infizierten Individuen eine Immunfunktion verleihen kann, verwendet werden. Patienten, bei denen vor kurzem Antikörper zu HIV-1 diagnostiziert wurden, die jedoch bisher noch keine AIDS-Symptome zeigen, sind die bevorzugten Kandidaten für eine Therapie. Dieses Verfahren erfordert die Entfernung von einigen der Knochenmarkstammzellen des Patienten und die anschließende partielle Cytoblation. Die entfernten Zellen können im Labor mit geeigneten EGS- oder RIGS-Zusammensetzungen unter Verwendung entsprechender Virusvektoren, beispielsweise unvollständiger Virusvektoren, behandelt werden und dann in das gleiche Individuum wieder eingebracht werden. Die behandelten Zellen entwickeln sich im Patienten zu reifen Hämatopoesezellen einschließlich T- Zellen. Diese T-Zellen weisen eine normale Immunfunktion auf und sind - was von größter Bedeutung ist - intrazellulär immunisiert, wobei eine Zerstörung durch etwaiges im Patienten noch vorhandenes HIV-1 verhindert wird.
Knochenmarkstammzellen und Hämatopoesezellen lassen sich relativ einfach entfernen und ersetzen und liefern eine sich selbst regenerierende Zellpopulation zur Fortpflanzung übertragener Gene. Auf RNase P basierende Therapeutika ermöglichen die selektive Inaktivierung sonstiger unerwünschter Gene in Zellen, wie aktivierte Onkogene, die an der Verursachung und Aufrechterhaltung von Krebszellen beteiligt sind.
Im Gegensatz zu den derzeit gebräuchlichen Ansätzen, die eine Infektion mit HIV verhindern oder einschränken sollen, sollte es möglich sein, eine auf RNase P basierende Technik zur Behandlung und möglicherweise zur Heilung einer HIV- Infektion und verwandter Erkrankungen weißer Blutzellen zu verwenden, wobei diese einer Transformation durch EGS oder RIGS tragende Retrovirusvektoren unterzogen werden. Spezielle Beispiele von Erkrankungen, die unter Verwendung von EGS und RIGS behandelt werden können, umfassen nicht nur HTLV-1, sondern auch verschiedene von Retroviren induzierte Leukämien, die sich aus Chromosomentranslokationen ergeben, die chimäre RNAs produzieren, die für diese Zellen ungewöhnliche und als Wachstumsstimulatoren oder Onkogene wirkende Proteine erzeugen. Andere Arten möglicherweise behandelbarer transformierter Gewebe umfassen alle Krebszellen, die identifizierte Onkogene bekannter Sequenz tragen.

4. Topische und andere EGS- und RIGS-Zusammensetzungen zur lokalen Verabreichung

EGS und RIGS können auch topisch, lokal oder systemisch in einem geeigneten pharmazeutischen Träger verabreicht werden. Remington's Pharmaceutical Sciences, 15. Auflage von E. W. Martin (Mark Publishing Company, 1975), dessen Lehren hier als Bezug aufgenommen sind, offenbart typische Träger und Herstellungsverfahren. EGS und RIGS können auch in geeigneten biologisch kompatiblen Mikrokapseln, Mikroteilchen oder Mikrokügelchen, die aus biologisch abbaubaren oder hicht biologisch abbaubaren Polymeren oder Proteinen oder Liposomen gebildet sind, zur zielgerichteten Ansteuerung von Phagocytenzellen eingekapselt sein. Solche Systeme sind dem Fachmann bekannt und können zur Verwendung mit den entsprechenden EGS und RIGSs optimiert werden.
Therapeutisch werden Oligoribonucleotide als pharmazeutische Zusammensetzung, die aus einer wirksamen Menge der EGS oder RIGS zur Hemmung der Transkription einer Ziel-RNA und einem pharmazeutisch akzeptablen Träger besteht, verabreicht. Beispiele typischer pharmazeutischer Träger, die allein oder in Kombination verwendet werden, umfassen ein oder mehr feste, halbfeste oder flüssige Verdünnungsmittel, Füllstoffe und Formulierungshilfsstoffe, die nicht-toxisch, inert und pharmazeutisch akzeptabel sind. Derartige pharmazeutische Zusammensetzungen liegen vorzugsweise in Einheitsdosisform vor, d. h. physikalisch diskreten Einheiten, die eine vorgegebene Menge des Wirkstoffs entsprechend einem Bruchteil oder einem Vielfachen der Dosis, die als das gewünschte therapeutische Ansprechen bietend berechnet wurde, enthalten. Es ist wesentlich, daß die Oligonucleotide in einer Form geliefert werden, die einen Abbau aller Oligonucleotide verhindert, bevor sie die angestrebte Zielstelle erreichen.
Eine bevorzugte Ausführungsform ist eine als viraler Vektor mit Codierung für die EGS oder RIGS oder in einem Liposom verabreichte EGS oder RIGS, so daß eine wirksame Menge von EGS oder RIGS geliefert wird. Im allgemeinen erzeugen diese eine Konzentration zwischen 1 uM und 1 mM an der Stelle der zu behandelnden Zellen. Solche Verbindungen und Zusammensetzungen können als topische Zusammensetzung, beispielsweise zur Applikation an einer Virusverletzung, die beispielsweise durch den Herpes-simplex-Virus erzeugt wurde, formuliert werden. Diese enthalten im allgemeinen zwischen 1 uM und 1 mM Oligonucleotid pro Einheit des Trägers oder ergeben eine Konzentration zwischen 1 uM und 1 mM an der Stelle der zu behandelnden Zellen. Orale Zusammensetzungen, die zwar nicht bevorzugt sind, liegen in Form von Tabletten oder Kapseln vor und können übliche Streckmittel enthalten. Eine weitere bevorzugte Zusammensetzung ist ein lokal appliziertes polymeres Material zur Freisetzung von EGS oder RIGS. Eine weitere bevorzugte Zusammensetzung ist eine Lösung oder Suspension der EGS oder RIGS in einem geeigneten Vektor in Kombination mit üblichen pharamzeutischen Vehikeln, die für parenterale Zusammensetzungen, beispielsweise eine wäßrige Lösung zur intravenösen Injektion oder ölige Suspension zur intramuskulären Injektion angewandt werden.
Für klinische Anwendungen sollten die Dosierung und die Dosierungsvorschrift in jedem Fall sorgfältig eingestellt werden, wobei das Alter, Gewicht und der Zustand des Empfängers, der Verabreichungsweg und die Natur und Schwere der Erkrankung gründlich professionell geprüft und bedacht werden sollen.
Die vorliegende Erfindung, EGS und RIGSs, läßt sich unter Bezug auf die folgenden nicht-beschränkenden Beispiele genauer verstehen.
Die folgenden Beispiele illustrieren Konzepte und Techniken, die zur Herstellung, zum Testen und Gebrauch externer Leitsequenzen geeignet sind. Die in den Beispielen verwendeten externen Leitsequenzen werden nicht speziell von den Ansprüchen umfaßt. Die Art und Weise der Synthese, Behandlung, Verwendung und Aktivitätsmessung der Beispiele der externen Leitsequenzen nach der hier gegebenen Beschreibung erläutert die Synthese, Behandlung, Verwendung und Aktivitätsmessung der beanspruchten externen Leitsequenzen.

Beispiel 1: Spaltung von tRNA-Vorläuferfragmenten durch humane RNase P in Gegenwart von EGS

Eine EGS, die RNA zur Spaltung durch humane RNase P zielgerichtet ansteuern kann, wurde unter Verwendung eines kleinen RNA-Fragments, pAva (Sequenz ID Nr. 6, Fig. 3), das eine 5'-Vorläufersequenz und die ersten vierzehn Nucleotide vom 5'-Terminus einer tRNA enthält, hergestellt. Die Leader-Sequenz des tRNATyr-Vorläufers von E. coli kann korrekt abgespalten werden, wenn ein anderes Stück RNA, beispielsweise EGSΔ1-18 (Sequenz ID Nr. 5), dem die ersten achtzehn Nucleotide des 5'-Terminus von reifer tRNAtYr fehlen, das jedoch die verbliebene 3'-praximale Sequenz beibehält, mit der Ziel-RNA hybridisiert wird.
Humane RNase P wurde aus HeLa-Zellen unter Verwendung des Verfahrens von Bartkiewicz et al., Genes & Development 3: 488-499 (1989) partiell gereinigt. Die Substrate wurden durch in-vitro-Transkription in Gegenwart von [α -32P]GTP hergestellt. Mit [α -32P]GTP markierte pAva (Sequenz ID Nr. 6)-I-RNA (28 nt) wurde mit nicht-markierter EGS-RNA vermischt und das Gemisch wurde 30 min lang mit Enzym bei 37 ºC in 50 mM Tris-Cl (pH-Wert 7,5), 100 mM NH&sub4;Cl und 10 mM MgCl&sub2; inkubiert. Markierte pAva (Sequenz ID Nr. 6)-I-RNA allein wurde ebenfalls mit oder ohne Enzym inkubiert. Die Analyse durch Gelelektrophorese zeigt, daß die EGS plus Enzym zu einer Spaltung der RNA führte.
Das 3'-proximale Oligonucleotid ist die externe Leitsequenz. Da die Längen der Leader und ihrer Sequenzen sowie die Sequenzen der reifen Domäne bei verschiedenen Vorläufer-tRNAs nicht konserviert sind, müssen die Hauptdeterminanten für die Spaltung der humanen RNase P in einigen der konservierten Strukturmerkmale verschiedener tRNAs liegen. Dieser allgemeine Gedanke ergibt sich aus der Tatsache, daß mehrere andere EGSs, die die Struktur von Teilen einer tRNA nicht exakt nachbildeten, komplementäre RNAs nicht zielgerichtet ansteuerten. Beispiele solcher Veränderungen umfassen Veränderungen in der Anzahl möglicher Basenpaare in den D- oder Aminoacylstämmen, Veränderungen an den Positionen 8 und 9 der reifen tRNA-Sequenz und eine Veränderung von Cytosin nach Uracil an Position 57. Jedoch führte eine EGS, der die Anticodon-Stamm-Schleifen-Struktur oder die variable Stamm-Schleifen-Struktur fehlten, zu einer effizienten Spaltung, was belegt, daß diese Teile der EGS getrennt für die Erkennung des Zielkomplexes durch das Enzym nicht wesentlich waren.
Wird demgemäß eine mRNA im Gegensatz zu einem Teil einer Vorläufer-tRNA-Sequenz in die doppelsträngige Stammregion eines vermutlichen Zielkomplexes eingebaut und enthält das dadurch erhaltene Hybrid die für ein Substrat für humane RNase-P-Aktivität erforderlichen Strukturmerkmale, wird die mRNA durch humane RNase P gespalten.

Beispiel 2: Spezifische Spaltung von CAT-mRNA in vitro durch humane RNase P unter Verwendung einer externen Leitsequenz

Die im folgenden angegebenen Beispiele zeigen die Effizienz der Spaltung der mRNA für Chloramphenicolacetyltransferase (CAT) durch humane RNase P. Die Sequenz des 5'- Oligoribonucleotids sowie die der EGS hängt von der Wahl der Zielstelle in der mRNA ab. Das Vorliegen der in geeigneter Weise konstruierten EGS verringert die enzymatische Aktivität von CAT in vivo effizient und fördert auch die Spaltung von CAT-mRNA in vitro, was belegt, daß dieses Verfahren von allgemeinem Nutzen zur Geninaktivierung sein sollte.
Eine nach Maß konstruierte EGS für die mRNA für Chloramphenicoltransacetylase (CAT), die in Fig. 4A angegeben ist, EGS (Sequenz ID Nr. 8), kann die spezifische Spaltung von CAT-mRNA durch humane RNase P in vitro oder in vivo in Zellen in Gewebekultur lenken. Die Spaltungsreaktion ist jedoch im Vergleich zur Spaltung natürlicher tRNA- Vorläufersubstrate ineffizient.
Die vorgeschlagene Sekundärstruktur eines Komplexes von CAT-mRNA (Sequenz ID Nr. 7) und EGSCAT (Sequenz ID Nr. 8) ähnelt der tRNA-Kleeblattstruktur, umfaßt jedoch Sequenzen, die sich normalerweise in der tRNA, aus der sie ursprüng lich abgeleitet wurde, nicht finden, nämlich Tyrosyl-tRNA (tRNATyr) (Sequenz ID Nr. 6) von Escherichia coli. Um sicherzustellen, daß entsprechende tertiäre Wechselwirkungen, die den Vorgang der Enzym-Substrat-Erkennung erleichtern, im Komplex auftreten, wurden Teile der EGS, die an tertiären Wechselwirkungen in den analogen tRNA-Strukturen teilnehmen, auf zwei Arten geändert. Als erstes wurden vier Nucleotide in dem Äquivalent der T-Schleife und fünf in dem Äquivalent der variablen Schleife durch Einarbeiten äquimolarer Mengen der Desoxyribonucleotide dA, dG, dc und T in ein DNA-Templat regellos verteilt bzw. randomisiert, wobei eine Anfangspopulation von 2,6 · 10&sup5; Sequenzvarianten erhalten wurde. Als zweites wurden während jeder Runde der selektiven Amplifikation regellose Mutationen durch Durchführen einer Polymerasekettenreaktion (PCR) mit einer Fehlerrate von etwa 0,1% pro eingearbeitetes Nucleotid unter Verwendung des Verfahrens von A. Beaudry und G. F. Joyce, Science 257: 635 (1992) eingeführt. Die mRNA für das Gen für Chloramphenicolacetyltransferase (CAT) kann ohne Schwierigkeiten auf Plasmiden manipuliert werden und die enzymatische Aktivität läßt sich ohne weiteres in Gewebekulturzellen exprimieren, so daß sie als Zielsubstrat verwendet wurde. Wie im folgenden demonstriert, kann eine EGS CAT-mRNA (Sequenz ID Nr. 7) zur spezifischen Spaltung durch humane RNase P zielgerichtet ansteuern. Fig. 4A zeigt einen Komplex, in dem eine EGS, EGS (Sequenz ID Nr. 8), mit den Nucleotiden 67 bis 79 von CAT-mRNA (Sequenz ID Nr. 7), wobei das erste Nucleotid des Translationsinitiationscodons mit 1 beziffert wird, eine Basenpaarung eingehen kann und humane RNase P zur Spaltung der mRNA bei Nucleotid 67 lenken kann. Das EGS (Sequenz ID Nr. 8)-Konstrukt wurde aus dem tRNATyr (Sequenz ID Nr. 6)-Gen von E. coli abgeleitet, wobei die ersten 18 Nucleotide vom 5'-Terminus ausgehend deletiert wurden und die Sequenzen auf der D-Schleife und Akzeptor-Schleife geändert wurden, um Basenpaare mit CAT mRNA zu bilden. Die stromaufwärts mit einem T7-Promotor fusionierte EGS (Sequenz ID Nr. 8) wurde in einen pUC19- Vektor kloniert. Die EGSCAT-RNA (Sequenz ID Nr. 8) wurde über in-vitro-Transkription mit T7-RNA-Polymerase hergestellt.
Das HindIII-BamHI-Fragment des CAT-Gens (pCATTM, Promega) wurde in pcem-2 kloniert. Das Plasmid wurde mit EcoRI gestutzt und ein 260 Nucleotide langes Transkript wurde durch in-vitro-Transkription mit T7-RNA-Polymerase in Gegenwart von [α -32P]GTP erhalten. Die EGS-Sequenz wurde durch Polymerasekettenreaktion unter Verwendung des tRNATyr -Gens von E. coli als Templat mit dem Oligonucleotid GCCAAACTGAGCAG- ACTC (Sequenz ID Nr. 12) und GCGCggtaccAAAAATGGTGAGGCAT- GAAGG (Sequenz ID Nr. 13) synthetisiert. Die fetten Buchstaben in den Oligonucleotidsequenzen geben die zur Herstellung von Basenpaaren mit CAT-mRNA notwendigen Basen, die unterstrichenen Buchstaben die zum Transkriptionsterminationssignal komplementäre Sequenz und die kleingeschriebenen Buchstaben eine zusätzliche Linkersequenz an. Die Sequenz GCGC am 5'-Ende des zweiten Oligonucleotids sind zusätzliche Nucleotide. Das PCR-Fragment wurde mit HindIII verdaut und in pUC19 mit einem T7-Promotor stromaufwärts der EGS-Sequenz kloniert. Die EGSCAT-RNA (Sequenz ID Nr. 8) wurde mit T7-RNA-Polymerase nach der Linearisierung des Plasmids mit Dral transkribiert. Ein Gemisch von nichtmarkiertem und mit [α-³²P]GTP markiertem CAT-mRNA-Fragment, insgesamt 0,2 umol, wurde mit der EGS -RNA (Sequenz ID Nr. 8) in Mengen von 4 umol, 1 umol, 1 umol, 0,4 umol und 0,2 pmol gemischt. Jedes Gemisch wurde 1 h lang mit Enzym bei 37ºC in 50 mM Tris-Cl (pH-Wert 7,5), 100 mM NH&sub4;Cl und 25 mM MgCl&sub2; inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe eines gleichen Volumens einer Farbstofflösung mit EDTA im Überschuß gestoppt und dann auf ein 5% Polyacrylamid/7M- Harnstoff-Gel gegeben. CAT-mRNA allein wurde ohne und mit Enzym inkubiert und auf das Gel aufgegeben.
Die Primer-Extension-Analyse zur Bestimmung der genauen Stelle der EGSS CAT-gelenkten Spaltung durch humane RNase P wurde wie folgt durchgeführt. Eine reverse Transkriptionsreaktion wurde an der nicht gespaltenen und gespaltenen CAT-mRNA unter Verwendung eines zu den Nucleotiden 129 bis 107 von CAT-mRNA komplementären Oligodesoxyribonucleotids GGCCGTAATATCCAGCTGAACGG (Sequenz ID Nr. 14) durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde 2 h lang bei 46ºC in 100 mM Tris-Cl (pH-Wert 8,3), 10 mM KCl, 6 mM MgCl&sub2;, 10 mM DTT und 2 Einheiten AMV-reverse-Transkriptase inkubiert. Markiertes G, A, U, C wurden als Referenzanalysen von dem CAT-mRNA- Templat entsprechenden DNA-Sequenzen verwendet.
Die genaue Stelle der Spaltung von CAT-mRNA wurde durch Primer-Extension-Analyse unter Verwendung eines zu den Nucleotiden 129 bis 107 der RNA komplementären Oligodesoxyribonucleotidprimers bestimmt, die zeigte, daß die Spaltung wie erwartet zwischen den Nucleotiden 66 und 67 erfolgt. Die Ergebnisse der 555 -RNA-gelenkten Spaltung von CATmRNA wurden durch Gelelektrophorese analysiert. In Gegenwart von EGS (Sequenz ID Nr. 8)-Molekülen wurden CATmRNAs gespalten, wobei zwei Produkte mit der erwarteten Größe entstanden. Die Analyse der Reaktionsprodukte zeigte, daß die Endgruppen 5'-Phosphoryl- und 3'-Hydroxyltermini, die gleichen wie die normalerweise durch RNase P erzeugten, enthielten. Die Ergebnisse zeigen schlüssig, daß die spezifische Spaltung von CAT-mRNA auf einer EGSgelenkten RNase- P-Hydrolysereaktion beruht.
Für einen bis zu 5-fachen molaren Überschuß von EGSCAT-RNA gegenüber mRNA ist die Spaltungseffizienz proportional zur Menge der zugesetzten EGSCAT. Ein mehr als 10-facher Über schuß von EGSCAT-Molekülen verursachte jedoch eine Abnahme der Spaltungseffizienz. Eine Erklärung hierfür ist, daß EGS CAT allein die enzymatische Aktivität durch Konkurrenz mit dem mRNA-EGS-Komplex um das Enzym hemmt. Die Reaktion schreitet linear mehr als 3 h lang bei 37ºC fort. Eine Denaturierung und Renaturierung der Oligonucleotide im Targetkomplex verbesserte die Effizienz der Spaltung nicht. Für die Reaktion ist Mg² mit einer optimalen Konzentration von 25 mM absolut erforderlich. Dies steht im Gegensatz zu der mit tRNATTyr-Vorläufer als Substrat, die eine optimale Mg²&spplus;-Konzentration von 2 bis 10 mM besitzt.

Beispiel 3: Hemmung der Expression von CAT-Aktivität in grünen Affen-CV-1-Zellen durch EGS CAT

Zum Testen einer Wirkung der EGS in vivo wurde die EGSCAT- Sequenz (Sequenz ID Nr. 8) stromabwärts eines Maus-U6- snRNA-Genpromotors in einen BLUESCRIPTTM (Stratagene, La Jolla, CA)-Vektor inseriert, wobei pEGSCAT gebildet wurde. Die EGS -Sequenz (Sequenz ID Nr. 8) kann durch RNA- Polymerase III transkribiert werden und die Transkription kann bei einem T&sub5;-Cluster im Anschluß an die EGS-Sequenz in entweder einem S100-Extrakt oder lebenden Zellen enden. Grüne Affenfibroblastenzellen CV-1 wurden gemeinsam mit pCAT- und pEGS -Plasmiden transfiziert. Nach der Transfektion mit pCAT, das das CAT-Gen codiert, und pEGS wurden die Zellen geerntet und die CAT-Aktivität getestet.
Die CV-1-Zellen wurden in nach Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium, das 10% Kalbfetusserum enthielt, gehalten. Einen Tag vor der Transfektion wurden die Zellen 1 : 10 aufgespalten und in 60-mm-Petrischalen plattiert. Zwei Stunden vor der Transfektion wurden die Zellen mit 4,5 ml frischem Medium mit 10% Kalbfetusserum versetzt. Die Transfektion erfolgte durch das Calciumphosphatfällverfahren unter Ver wendung von 2,5 ug pCAT-DNA und verschiedener Mengen von pEGS -DNA im Bereich von 1 bis 6,25 ug. 24 h nach der Transfektion wurden die Zellen geerntet und Zellextrakte bezüglich CAT-Aktivität getestet.
Der Extrakt aus Zellen, die mit EGS -Konstrukt cotransfiziert waren, verringerte offensichtlich die Umwandlung von Chloramphenicol in dessen acetylierte Formen. Der Grad der Hemmung wurde quantitativ durch Zählen der aus einer TLC- Platte ausgeschnittenen Flecken gemessen. Eine Cotransfektion mit EGSCAT ergab eine mehr als 50%ige Hemmung im Vergleich zur Kontrolle ohne ohne EGS -Cotransfektion. Die Fähigkeit zur Hemmung der CAT-Expression ging beträchtlich verloren, wenn ein höheres Verhältnis von pEGS zu pCAT eingeführt wurde. Ähnliche Experimente, die etwa 70% der CAT- Aktivität ergaben, wurden auch mit Humanzellen in Gewebekultur durchgeführt.

Beispiel 4: Herstellung von EGS mit veränderter Sequenz, die den Abbau von Ziel-RNA durch RNase P verstärkt

Wie im folgenden detailliert erläutert, wurden zwei Klassen von EGS, wie in Fig. 4A, 4B, 4C, 4D, 4E und 4F angegeben, konstruiert. Die erste Klasse umfaßt Deletionen großer Segmente der EGS, wie in Beispiel 1 vorgeschlagen und in den Beispielen 2 und 3 beschrieben. Beispielsweise zeigte sich, daß die Anticodon-Stamm-Schleifen-Struktur deletiert werden kann, wie bei EGS AAC (Sequenz ID Nr. 10) von Fig. 4C und 4F angegeben, und die EGS dennoch die Spaltung einer Ziel- RNA (CAT-mRNA mit der Sequenz ID Nr. 7 in Fig. 4C und 4F) durch RNase P fördern kann. Die Anticodon-Schleife und ein Teil der variablen Schleife können alternativ aus der EGS deletiert werden und die EGS fördert dann die Spaltung mit größerer Effizienz als das Ausgangs-EGS-Molekül. Die am stärksten effiziente EGS dieser Deletionsklasse war dieje nige, in der die Anticodon-Stamm-Schleifen-Struktur deletiert war. Diese EGS ΔAC (Sequenz ID Nr. 10) förderte die Spaltung einer Ziel-mRNA (CAT-mRNA) durch humane RNase P mit einer zehnfach höheren Rate als die Ausgangs-EGS. Die Deletion von sowohl der variablen als auch der Anticodon- Stamm-Schleifen-Strukturen ergibt jedoch keine stärker effiziente EGS, obwohl die variable Schleife aus nur einem oder zwei Nucleotiden bestehen kann und dennoch sehr effizient ist.
Die zweite Klasse von EGSs weist Veränderungen in sowohl dem Äquivalent der T-Schleife, der variablen Schleife und dem Anticodon-Stamm des tRNA-ähnlichen Segments der EGS auf. Drei solche EGSs, die im folgenden beschrieben sind, sind EGS 6, EGS 8 und EGS 9 (Sequenz ID Nr. 9, Fig. 4B und 4E). Wie im folgenden gezeigt, ist EGS 9 die am stärksten effiziente der EGSs in diesen Beispielen und sie lenkt die Spaltung einer Ziel-RNA (CAT-mRNA) durch humane RNase P mit einer etwa 50- bis 100fach größeren Rate als die Ausgangs- EGS.
Diese Ergebnisse gelten für relative Raten der Spaltung an einer speziellen Stelle in einer Ziel-mRNA. Die absoluten Raten der Spaltung an einer beliebigen speziellen Stelle hängen noch vom Zugang der EGS zu der speziellen Stelle ab.

Beispiel 5: Herstellung von RNAs mit regellos verteilten bzw. randomisierten Nucleotiden

A. Herstellung eines chimären, kovalent gebundenen mRNA- EGS-Substrats

Das Verfahren zur Selektion bezüglich EGSs, die in Bezug auf das Lenken von RNase P zur Ziel-CAT-mRNA effizienter sind, umfaßt die Synthese einer Population chimärer, kovalent gebundener mRNA-EGS-Substrate, die anschließend Zyklen einer in-vitro-Mutation und Selektion bezüglich Molekülen, die als Substrate für RNase P dienen können, durchlaufen. Doppelsträngige DNA-Template wurden durch Annealing und enzymatisches Verlängern zweier überlappender synthetischer Oligonucleotide: TAATACGACTCACTATAGAACATTTTGAGGCATTTCAGT- CAGTTGGCCAAACTGAGCAGAC (SEC-1A, Sequenz ID Nr. 2) und TGGTGAGGCATGAAGGNNNNGAACCTTCNNNNNGCAGATTTAGAGTCTGCTCAGTTTGG (SEC-1B, Sequenz ID Nr. 3), wobei die komplementären Sequenzen unterstrichen sind und die randomisierten Nucleotide (N) während der Maschinensynthese durch Einarbeiten äquimolarer Mengen von 4 Nucleotiden eingeführt wurden, hergestellt. Diese Sequenzen erzeugen ein chimäres tRNA-Gen, das Sequenzen von CAT-mRNA und tRNATyr von E. coli sowie 9 Nucleotide (N), die regellos verteilt sind, enthält. Ein Promotor für T7-Bacteriophagen-RNA-Polymerase ist in SEC-1A (Sequenz ID Nr. 2) enthalten. Die Verlängerung wurde mit AMV-reverser-Transkriptase 2 h lang bei 46ºC durchgeführt. Unterschiedliche RNA-Pools wurden durch Transkription mit T7-Polymerase bei 37ºC in 40 mM Tris-Cl (pH-Wert 7,9), 6 mM MgCl&sub2;, 10 mM Dithiothreit, 2 mM Spermidin, 1 mM NTPs, die 20 uCl [α-³²P]GTP enthalten, hergestellt.

B. Das Selektionsverfahren

Das allgemeine Selektionsschema ist oben beschrieben. Eines der Templat-bildenden Oligonucleotide (SEC-1A, Sequenz ID Nr. 2) wurde auch als der 5'-Primer für die Polymerasekettenreaktion (PCR) verwendet, um die Wiederherstellung der T7-Promotor-Sequenz und der Leader-Sequenz der chimären RNA für den nächsten Selektionszyklus zu ermöglichen. Die Strenge der Selektion wurde bei jedem Zyklus durch Verringern der Enzymmenge und der zugestandenen Zeit für die Spaltungsreaktion erhöht, so daß nur die Substrate, die schnell durch das Enzym gespalten wurden, selektiert wurden.
In den ersten drei Runden der Selektion wurden RNA- Substrate mit 3,6 Einheiten von humaner RNase P verdaut, und über die von Yüan und Altman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 8006-8010 (1992) und Bartkiewicz et al., Genes and Dev. 3: 488 (1989) beschriebene Glyceringradientenstufe 2 h bei 37ºC in 50 mM Tris-C1 (pH-Wert 7,5), 10 mM MgCl&sub2; und 100 mM NH&sub4;Cl gereinigt. Eine Einheit von humaner RNase P ist als die Enzymmenge definiert, die 1 umol des Vorläufers zu tRNATyr von E. coli in 30 min bei 37ºC spaltet. Für Ansätze in aufeinanderfolgenden Selektionsrunden wurde die Enzymmenge verringert und die Inkubationsdauer verkürzt, so daß weniger als 20% des Substrats gespalten wurden.
Die Spaltungsprodukte wurden von nicht gespaltenen Substraten durch Elektrophorese auf einem 8%-Polyacrylamid-7M- Harnstoff-Gel getrennt. RNA wurde aus den Gelen durch die Methode Ausdrücken und Aufsaugen extrahiert.
Die RNAs des gereinigten Spaltungsprodukts wurden revers transkribiert und durch PCR mit SEC-1A (Sequenz ID Nr. 2) und SEC-1C (TGGTGAGGCATGAAGG, Sequenz ID Nr. 15) als Primern mit einem RNA-PCR-Kit von Perkin Elmer amplifiziert. Die durch PCR erzeugte doppelsträngige DNA erhielt die T7- Promotor-Sequenz und die Leader-Sequenz von der Sequenz in dem Primer SEC-1A zurück und wurde dann als Templat zur Transkription von RNA für die nächste Selektionsrunde verwendet.

C. Charakterisierung der selektierten RNAs und von ihnen abgeleiteten EGS-RNA

Nach acht Selektionszyklen wurde der hierbei erhaltene Pool doppelsträngiger DNAs in den BLUESCRIPTTM-Vektor (Stratagene, La Jolla, CA) kloniert. Achtzehn Plasmid-DNAs wurden unter Verwendung von Sequenase 2,0 (U. S. Biochemicals, Cleveland, OH) sequenziert.
Um die Fähigkeiten von von den einzelnen Varianten, die zuvor bezüglich CAT-mRNA-Targeting selektiert wurden, abgeleiteten EGSs zu testen, wurden dem EGS-Segment jeder chimären tRNA entsprechende Sequenzen durch PCR unter Verwendung der Pritner SEC-1A (Sequenz ID Nr. 2) und SEC-1T (TAATACGACTCACTATAGGCCAACTGAGCAGAC (Sequenz ID Nr. 16), der eine Promotor-Sequenz für T7-Polymerase enthält, amplifiziert und die RNAs wurden mit T7-RNA-Polymerase transkribiert. Die EGS gelenkte CAT-mRNA-Spaltung wurde in 10 ul von 50 mM Tris-Cl (pH-Wert 7,5), 10 mM MgCl&sub2;, 100 mM NH&sub4;Cl, die 0,25 umol (1000 cpm) Substrat-RNA und 1 oder 5 umol EGS-RNAs enthielten, getestet. Die Reaktionsgemische wurden 30 min bei 37ºC mit 10 Einheiten von RNase P aus HeLa- Zellen inkubiert und anschließend einer Elektrophorese in 5 % Polyacrylamid/7M-Harnstoff-Gelen unterzogen.
Die Gele zeigten eine RNA-Art, die in der für die Spaltung von Substrat-RNA erwarteten Position wanderte, in den Spuren, bei denen sich die neu selektierten EGSs in den Reaktionsgemischen befanden.

D. Sequenzanalyse randomisierter EGSs

Sechzehn einzelne Klone wurden sequenziert. Die Sequenz von Anticodon-Stamm/Schleife, variabler (V-)Schleife und T- Stamm/Schleife sind in Fig. 6 angegeben. Von der Sequenz, die in der T-Schleife randomisiert war, wurden zwei spezielle Sequenzen äußerst häufig selektiert: UUCGUGC, das in 7 Klonen gefunden wurde, und UUCGCCC, das auch in 7 Klonen gefunden wurde. Die T-Schleife-Sequenzen der beiden übrigen Klone enthielten Mutationen mit einem einzigen Übergang der beiden Hauptsequenzen, UUCGUCC und UUCaCCC. Im Gegensatz hierzu wurde bezüglich der Sequenz der 5 Nucleotide in der variablen Schleife keine signifikante sequenzbezogene Beeinflussung beobachtet.
Zusätzlich zu den Sequenzen in den T- und variablen Schleifen, die aus der vollständig randomisierten Sequenz selektiert wurden, wurde in die EGS in den chimären Substraten als Folge der Bedingungen für PCR eine beträchtliche Anzahl Mutationen eingeführt. Einige dieser Mutationen waren vorteilhaft und deshalb wurden die Sequenzen, die sie enthielten, selektiert und angesammelt. In fast allen der einzelnen selektierten Klone war die Unversehrtheit der Basenpaarung im Anticodon-Stamm unterbrochen.
Tabelle 1 zeigt die Teilsequenzen der Anticodon- Schleife/Stamm-Region, der variablen (V-)Schleife und der T-Stamm/Schleife-Region des chimären Ausgangs-mRNA-EGS Substrats (P), die Nucleotide 28 bis 88 der Sequenz ID Nr. 1. Tabelle 1 zeigt auch Teilsequenzen von EGS-Segmenten einiger individueller chimärer mRNA-EGS-Substrate, die Nucleotide 1 bis 60 der Sequenz ID Nr. 9 und Sequenz ID Nr. 17 bis 31, die als Ergebnis des in-vitro- Selektionsverfahrens erhalten wurden. Nucleotide, die sich von der chimären Ausgangs-mRNA-EGS -Substratsequenz unterscheiden, sind in fetten Buchstaben angegeben und unterstrichen. Bindestriche zeigen Deletionen an. Der restliche Teil der Sequenz der chimären mRNA-EGS-Substrate ist in Fig. 4A gezeigt. Die Numerierung der Teilsequenzen ist nicht gleichförmig fortlaufend, da einige Klone keine entsprechenden Inserts aufweisen und nur sechzehn selektierte Sequenzen aufgelistet sind. Tabelle 1

E. syntnese und Analyse einzeiner EGS-RNAS aur aer basis selektierter chimärer Substrate

Das beste selektierte chimäre Substrat war Klon 9, dessen entsprechende RNA-Sequenz partiell in Sequenz 9 (Nucleotide 1 bis 60 der Sequenz ID Nr. 9) in Tabelle 1 angegeben ist. Das chimäre Substrat des Klons 9 wurde um das etwa 5,5fache effizienter als das nicht-randomisierte chimäre Stammsubstrat, mRNA-EGSCAT-Chimäre, gespalten. Unter Verwendung der Sequenzen der selektierten chimären Substrate wurden neun einzelne entsprechende EGS-RNAs synthetisiert: EGS-1 (Sequenz ID Nr. 17), EGS-4 (Sequenz ID Nr. 19), EGS-5 (Sequenz ID Nr. 20), EGS-6 (Sequenz ID Nr. 21), EGS-8 (Sequenz ID Nr. 22), EGS-9 (Nucleotide 1 bis 60 der Sequenz ID Nr. 9), EGS-12 (Sequenz ID Nr. 25), EGS-14 (Sequenz ID Nr. 27) und EGS-18 (Sequenz ID Nr. 31), um die Wirkung dieser selektierten EGSs bezüglich Lenkung von RNase P zur Target-CAT-mRNA zu untersuchen.
Jeder der einzelnen EGS-RNAs wurde mit ³²P-markierter CATmRNA vermischt und die Gemische wurden dann RNase P ausgesetzt. Jede selektierte EGS-RNA steigerte die Anfangsgeschwindigkeit der Spaltungsreaktion, gemessen während der linearen Phase der Reaktion, über die mit EGS und die Spaltung erfolgte an der erwarteten Stelle in der ZielmRNA, wie in Fig. 5 gezeigt.
Die dramatischste Steigerung der Geschwindigkeiten erfolgte mit der EGS-Sequenz auf der Basis von Klon 9, EGS9 (Nucleotide 1 bis 60 von Sequenz ID Nr. 9), die die Spaltung der CAT-mRNA mit einer gegenüber der mit EGS im Komplex beobachteten mehr als 30fach schnelleren Gesamtrate lenkte. Die drei wirksamsten getesteten EGSs, die von Klon 6, Klon 8 und Klon 9 abgeleitet waren, hatten alle in der T-Schleife eine gemeinsame Sequenz UUCGUGC.

F. Analyse der Sekundärstruktur von mRNA-EGS-Komplexen

Die vorgeschlagene Sekundärstruktur des Komplexes von CATmRNA und EGS 9 (Sequenz ID Nr. 9) (Fig. 4B) kann mit dem CAT-mRNA-EGS -Stammkomplex (Fig. 4A) verglichen werden. Die Strukturen von CAT-mRNA-EGS-Komplexen wurden teilweise durch partielle Verdauung mit den RNasen T1 und T2 unter Bedingungen, die die Bildung des mRNA-EGS-Komplexes erlaubten, und Identifizierung einzelsträngiger Regionen in RNA bestätigt. Die partielle Verdauung von CAT-mRNA-EGS- Komplexen mit den RNasen T1 und T1 (Pharmacia) wurde in RNase-P-Testpuffer (50 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 10 mM MgCl&sub2; und 100 mM NH&sub4;Cl) durchgeführt. Das Reaktionsgemisch enthielt mit [³²P] am 5'-Terminus markierte Substrat-RNA (2000 cpm), 0,2 mg/ml Ratten-55-RNA als Träger und drei unterschiedliche Konzentrationen, 2 · 10&supmin;&sup4;, 1 · 10&supmin;³ und 5 · 10&supmin;³ Einheiten /ml, von RNase T1 oder RNase T2. Die Reaktionsgemische wurden 5 min lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Proben wurden durch PAGE in 12,5% Sequenzierungsgelen analysiert. Doppelsträngige Regionen wurden durch Verdau mit Kobragiftnuclease (Pharmacia, Alameda, CA) identifiziert. Die Bedingungen zum Verdau mit Kobragiftnuclease waren wie zuvor für RNase T1 und T2 beschrieben, wobei jedoch die Inkubation bei 37ºC erfolgte.
Die Spaltungsstellen durch die verschiedenen Nucleasen im CAT-mRNA-EGS -Komplex sind in Fig. 4A und 4D durch fette Pfeile angezeigt. Die tRNA-Domäne ist in dieser Struktur sehr ähnlich derjenigen, die man in natürlicher tRNA findet. Die mit Kobragiftnuclease erhaltenen Ergebnisse zeigen, daß die ersten paar Nucleotide im Analogon der D- Schleife an einer tertiären Wechselwirkung, vermutlich mit Nucleotiden in der variablen Schleife, beteiligt sind (Fig. 4D). Diese Wechselwirkung ist in dem Komplex mit EGS 9 (Sequenz ID Nr. 9) (Fig. 4E) entweder nicht vorhanden oder viel weniger stark und in der Tat ist die gleiche Region im Analogon der D-Schleife für einen Angriff durch RNasen T1 und T2 empfänglich, ein Beleg, daß sie in einer einzelsträngigen Konformation vorliegt (Fig. 4B). Dieses Ergebnis, zusammen mit dem Auftreten neuer Stellen einer Empfänglichkeit gegenüber einem Angriff durch Kobragift in der Anticodon-Schleife von EGS 9 bestätigt, daß diese EGS dem Komplex der EGS und CAT-mRNA neue tertiäre Wechselwirkungen verleiht, die die Spaltungsrate durch RNase P erhöhen. Die Ergebnisse der Spaltungen durch Nuclease bestätigten auch, daß der Anticodon-Stamm in EGS 9 als Ergebnis der Deletion eines einzelnen Nucleotids unterbrochen war. EGS 9 und 14 sind einander in Form ihrer Wirksamkeit zur Lenkung von RNase P zu einem Zielsubstrat nicht ähnlich. Der einzige Unterschied in ihren Nucleotidsequenzen besteht in der variablen Schleife, wie durch Tabelle 1 gezeigt. Dieser Unterschied allein muß für die relative Unwirksamkeit von EGS 14 in Form der Targeting-Fähigkeit verantwortlich sein. Ferner ergab der Verdau mit RNase T1 des EGS 9 enthaltenden Komplexes einen starken Schutz des letzten Nucleotids G in der variablen Schleife vor einem Angriff durch RNase T1, wie durch Fig. 4B gezeigt. Die Rolle dieses G kann ähnlich der Rolle sein, die Nucleotid 57 bei tertiären Wechselwirkungen in tRNA-Molekülen spielt; d. h. G kann Wasserstoffbrückenbindungen mit einem Nucleotid in der CAT-mRNA- Sequenz ausbilden, um eine Faltung der "tRNA"-Domäne der mRNA-Sequenz sicherzustellen.

G. Anticodon-Stamm und -Schleife einer EGS verringern die Spaltungsrate von RNase P und sind entbehrlich

Eine unabhängige Untersuchung der Erkennung von VorläufertRNA-Substraten durch humane RNase P zeigte, daß die Anticodon-Stamm-Schleifen-Struktur ein entbehrliches Struktur merkmal bei der Erkennung von Substraten durch humane RNase P bildet. Zur Bestimmung einer eventuellen Wirkung der Anticodon-Stamm-Schleifen-Struktur in negativer Weise auf die Gesamtspaltungsrate von Ziel-RNA durch RNase P wurden zwei weitere EGS-RNAs konstruiert, wobei die eine, EGS AAC (Sequenz ID Nr. 10) eine Deletionsmutante war, der im Vergleich zur Stamm-EGSCAT (Fig. 4A) das Äquivalent der Anticodon-Stamm-Schleifen-Struktur fehlte, und die andere, EGS 19, ein Derivat von EGS 9 war, in dem die Struktur des Anticodon-Stamms wiederhergestellt war.
DNA mit Codierung für EGS CATAAC wurde durch PCR mit pEGSCAT- DNA als Templat gemäß der Beschreibung von Yuan et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 89: 8006 (1992) synthetisiert. Das Oligonucleotid EC-1Δ AC (GCCAAACTGACGTCATCGACTTCG, Sequenz ID Nr. 32) und der M13-reverse-Primer (AACAGCTATGACCATG; Sequenz ID Nr. 33) wurden als Primer verwendet. Die durch PCR erzeugte DNA wurde mit Hindill verdaut und dann in pUC19 stromabwärts einer T7-RNA- Polymerase-Promotorsequenz inseriert. EGS AAC-RNA (Sequenz ID Nr. 10) wurde durch Transkription in vitro nach der Linearisierung der neuen Plasmid-DNA mit Dral hergestellt. DNA mit Codierung für EGS 19 wurde durch ein PCR- Verfahren in ähnlicher Weise wie für die Synthese von DNA für EGS 9 verwendet mit den Oligonucleotiden SEC-1C (Sequenz ID Nr. 15) und SEC-1I (GTAATACGACTCACTATAGGCCAAACTGAGCAGACTCTAAATCIGCAAACGGAAGGTT C, Sequenz ID Nr. 34) synthetisiert: der neu inserierte T- Rest in SEC-1I ist unterstrichen. Die DNA wurde in vitro mit T7-RNA-Polymerase transkribiert, wobei EGS-19-RNA erhalten wurde. EGS-19(Sequenz ID Nr. 39)-RNA unterscheidet sich von EGS-9-RNA nur im zusätzlichen U, das die Struktur des Anticodon-Stamms wiederherstellt.
In EGSCAT AAC (Sequenz ID Nr. 10) wurde die Länge von EGSCAT um 25% verringert: Die kürzere Deletionsmutante lenkte die Spaltung von Ziel-RNA etwa 6fach effizienter als die Stamm- EGS, wie durch Fig. 5 gezeigt. Die Wiederherstellung der Anticodon-Stamm-Struktur, wie bei EGS 19, verringerte die Spaltungsrate der Ziel-RNA mit EGS 19 auf einen 4fach niedrigeren Wert als mit EGS 9. Diese Ergebnisse zeigen zusammen mit der Messung der Reaktionsraten mit in vitro selektierten EGSs eine signifikante inverse Korrelation zwischen der Effizienz einer EGS in der Spaltungsreaktion und dem Vorhandensein eines Anticodon-Stamms in EGS-RNA.

H. Stabilität von EGS-mRNA-Komplexen

Die Stabilität von EGS-mRNA-Komplexen wurde auf der Basis sowohl der Bindungskonstanten zwischen der mRNA und jeder EGS als auch der Abhängigkeit der Spaltungsreaktion von Mg²&spplus;-Ionen mit der Annahme, daß relativ hohe Konzentrationen von Mg²&spplus;-Ionen zur Stabilisierung relativ instabiler Komplexe benötigt wurden, gemessen. Die Dissoziationskonstanten (Kd) von mRNA-EGS-Komplexen wurden direkt durch Gel- Retardation in Polyacrylamidgelen, die 10 mM Mg²&spplus;-Ionen enthielten, gemäß dem Verfahren von Pyle et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 8187-8191 (1990) gemessen. Ein Fragment von CAT-mRNA einer Länge von 160 Nucleotiden wurde durch Transkription mit T7-RNA-Polymerase in Gegenwart von [α- ³²P]GTP hergestellt. 10 ul EGS-RNA in 2X Bindungspuffer wurden 4 min lang bei 80ºC erhitzt, bevor sie mit einem gleichen Volumen von 2 nM CAT-mRNA-Fragment in Wasser gemischt wurden. 1X Bindungspuffer enthält 50 mM Tris-Cl (pH-Wert 7,5), 10 mM MgCl&sub2;, 100 mM NH&sub4;Cl, 3% Glycerin, 0,05% Xylolcyanol. Die Gemische wurden 20 min lang bei 37ºC inkubiert und unmittelbar darauf auf 5% Polyacrylamidgelen mit 9 W getrennt. Der Elektrophoresepuffer bestand aus 36 mM Tris-Base, 64 mM HEPES, 0,1 mM EDTA, 10 mM MgCl&sub2; (pH-Wert 7,5 ohne jegliche Einstellung). Die quantitative Bestimmung der freien Ziel-RNA und des Komplexes erfolgte mit einem Betaskop (Betagen, Waltham, MA). Die freien Bindungsenergien wurden aus der Gleichung ΔGº = -RT ln(1/Kd) mit R = 0,00198 kcal/mol und T = 310,15ºK bestimmt.
Die Dissoziationskonstanten für ausgewählte EGSs sind in Tabelle 2 angegeben. Tabelle 2: Dissoziationskonstanten von EGSs
Tabelle 2 zeigt die kinetischen Parameter einer EGSgelenkten Spaltung von CAT-mRNA in vitro durch RNase P von HeLa-Zellen. Kd bezieht sich auf Messungen der Dissoziationskonstanten für die Bindung von EGS an CAT-mRNA. Die anderen Parameter wurden in Standardtests der Enzymkinetik bestimmt. Vmax ist der mit 0,5 ml (0,6 Einheiten) humaner RNase P erhaltene Wert. pTyr bezieht sich auf den Vorläufer zu tRNATyr von E. coli.
Die in Tabelle 2 angegebenen Ergebnisse zeigen, daß die Kd- Werte von in vitro selektierten EGSs 4- bis 40fach niedriger als die der Stamm-EGS sind. Die selektierten EGSs haben daher eine höhere Affinität für die Ziel-RNA als EGSCAT. Das von Klon 9 abgeleitete chimäre Substrat wurde durch RNase P mit einer nur etwa 1,5fachen schnelleren Rate als das Target im mRNA-EGS-9-Komplex gespalten, ein Beleg, daß die Fähigkeit der EGS zur festen Bindung an die Ziel-RNA in Lösung eine kritische Determinante in der Wirksamkeit des Substratkomplexes sein muß.
Die Unterschiede in den Kd-Werten zwischen Komplexen mit EGS (Sequenz ID Nr. 8) und den selektierten EGSs entsprechen dem Beitrag von -1 bis -2,4 kcal/mol zur freien Bindungsenergie (ΔGº) mit selektierten EGSs. (ΔGº) beträgt -8,5 kcal/mol für den Komplex mit EGS, -10,1 für den Komplex mit EGS 9 (Sequenz ID Nr. 9) und -10,9 für den Komplex mit EGS ΔAC (Sequenz ID Nr. 10), wodurch neue Wechselwirkungen in den selektierte EGS-mRNA-Komplexen aufgezeigt werden.
Die Deletion des Anticodon-Stamms von EGS führte zu einem 44fach geringeren Kd-Wert für EGSCATΔAC und die Wiederherstellung des Stamms von EGS 9 (EGS 19) führte zu einem Kd- Wert, der 10mal größer als der für EGS 9 war und dem von EGSCAT nahe war (Tabelle 2). Der intakte Anticodon-Stamm stabilisierte daher eine Konformation der EGS, die ebenso stark an die Ziel-RNA wie eine EGS ohne eingerichteten Anticodon-Stamm binden konnte. Daher kann die Verstärkung der Fähigkeit der selektierten EGSs zur zielgerichteten Ansteuerung von RNA teilweise der Zunahme der Stärke ihrer Bindung an Ziel-RNA zugeordnet werden.
Die durch die ursprüngliche EGSCAT gelenkte Spaltung von mRNA erfordert Mg²&spplus;-Ionen mit einer optimalen Konzentration von 25 mM. Im Gegensatz dazu verläuft die Reaktion mit bestimmten selektierten EGSs, d. h. EGS 6 (Sequenz ID Nr. 21) und EGS 9 (Nucleotide 1-60 der Sequenz ID Nr. 9) optimal bei 2 bis 10 mM Mg²&spplus;-Ionen. Diese letztere Konzentration ist nahe der optimalen Konzentration von Mg²&spplus;-Ionen zur Prozessierung von tRNA-Vorläufern durch humane RNase P, die von Doersen et al., J. Biol. Chem. 260: 5942 (1985) berichtet wurde. Da hohe Konzentrationen von Mg²&spplus;-Ionen besonders wirksam bei der Neutralisation einer Abstoßung zwischen benachbarten Regionen des Phosphatrückgrats und der Stabilisierung der RNA-Faltung sind, zeigen die Ergebnisse, daß die selektierten EGSs die entsprechenden gefalteten Strukturen in dem Komplex mit Ziel-RNAs ohne die Hilfe hoher Konzentrationen von Mg²&spplus;-Ionen erreichen können.
Eine kinetische Analyse wurde zur Bestimmung der Michaelis- Konstante (Km) und der Maximalgeschwindigkeit (Vmax) der enzymatischen Reaktionen durchgeführt. Die Spaltung des Vorläufers zu tRNATyr von E. coli und von CAT-mRNA in mRNA-EGS- Komplexen wurde bei verschiedenen Substratkonzentrationen sowohl oberhalb als auch unterhalb des Km-Werts für diese Substrate getestet. Aliquote Teile wurden in regelmäßigen Intervallen aus den Reaktionsgemischen gezogen und auf Polyacrylamid-Harnstoff-Gelen analysiert. Die Werte von Km und Vmax wurden aus doppelt reziproken Lineweaver-Burk- Diagrammen erhalten. Die verwendeten wirksamen Substratkonzentrationen wurden als die Konzentration des Komplexes von Ziel-mRNA mit EGS, aus den in Tabelle 2 angegebenen Kd- Werten bestimmt, berechnet. Der Km-Wert für den Vorläufer zu tRNATyr (pTyr) mit humaner RNase P beträgt 10 nM, während der Km-Wert des Komplexes mRNA-EGS 12fach höher liegt (Tabelle 2). Der Km-Wert für alle getesteten selektierten EGSs war gleich dem von EGSCAT. Die Maximalgeschwindigkeiten der Reaktionen mit selektierten EGSs waren jedoch bis zu 10fach grober als die mit aer ursprunglichen EGS. Der Wert Vmax/Km für selektierte EGSs war daher erhöht. Der Wert Vmax/Km von EGS 9 war beispielsweise 10fach größer als der von EGS und war sehr nahe dem des tRNATyr-Vorläufers. Wenn der Anticodon-Stamm von EGS 9 jedoch wie bei EGS 19 wiederhergestellt wurde, fiel Vmax um das 2,5fache, was nahelegt, daß die Freisetzungsrate des Produkts durch physikalische Wechselwirkungen des Enzyms mit einem intakten Anticodon- Stamm spezifisch verringert wurde. Diese Daten zeigen, daß die gesteigerten Fähigkeiten der selektierten EGSs für Targeting, gemessen als Gesamtrate der Spaltungsreaktion, sowohl auf einer erhöhten Bindungsaffinität zu Substrat-RNAs als auch Steigerungen der Geschwindigkeit der enzymatischen Reaktion beruhten.

Beispiel 6: Hemmung der Expression von Virus-mRNA mit humaner Ribonuclease P

Der Herpes-simplex-Virus wurde zur Demonstration, daß EGS zur zielgerichteten Ansteuerung eines Virusgens in vivo zur Hemmung der Virusreplikation verwendet werden kann, verwendet. Herpes-simplex-Viren sind DNA-haltige Viren, die Zellen infizieren, die Synthese von Boten-RNAs induzieren, die dann zur Erzeugung von mit DNA-Synthese und -Abbau befaßten Enzymen einschließlich Thymidinkinase, DNA-Polymerase und einer DNA-Exonuclease transkribiert werden, und Virus-DNA und Virus-Strukturproteine werden hergestellt und zu infektiösen Virusteilchen angeordnet. Die Struktur und Organisation des Genoms des Herpes-simplex-Virus ist bekannt, beispielsweise nach dem Bericht von Roizman, Cell 16: 481-494 (1979). Die Nucleotidsequenz des Thymidinkinasegens von Herpes simplex Typ 1 wurde von Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1441-1445 (1981) beschrieben.
Eine EGS, die in Fig. 6A gezeigt ist, wurde zur zielgerich teten Ansteuerung der mRNA mit Codierung für Thymidinkinase (TK) konstruiert. Die Zielstelle für die RNase-P-Spaltung liegt etwa 25 Nucleotide stromabwärts der TK- Translationsinitiationsstelle. Es wurde eine EGS, etwa 3/4- ähnliche tRNA konstruiert und gezeigt, daß sie in vitro die TK-Sequenz an der vorgeschlagenen Spaltstelle spaltet. Zwei andere EGSs, die eine einzelne Punktmutation in der T- Schleife (C zu G) oder Deletion der Anticodon-Region enthalten, in Fig. 6B bzw. 6C angegeben, wurden auf der Basis der in Beispiel 5 beobachteten Ergebnisse konstruiert.
Dann wurden Zellinien und EGS-Expressionsvektoren konstruiert. Fünf Zellinien wurden durch Transfektion von Plasmid- DNAs in humane 143TK-Zellen, die von der American Type Culture Collection, Rockville, MD erhalten werden können, konstruiert.
Das Plasmid pFL116 wurde unter Verwendung von pGEM-72 (Promega, Wisconsin) und Einbau eines Gens für Neomycin- Resistenz (Neo), das im Handel von Clontech oder Stratagene, CA erhältlich ist, konstruiert. EGS-DNA (Fig. 6A, 6B und 6C) wurde mit KpnI verdaut und in das Plasmid pmU6(- 315/1), beschrieben von Yuan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 : 8006-8010 (1992) und das et al., EMBO 7: 503-512 (1988), an der PstI (geglättet)/KpnI-Stelle inseriert. Dieses Plasmid enthält den Promotor für das Gen für U6- kleinkernige-RNA, einen sehr starken Promotor, und ein Signal zur Termination der Transkription (T-Cluster) durch RNA-Polymerase II. Die EGS-Plasmide wurden als pFL104, pFL109 bzw. pFL112 bezeichnet. Das Plasmid auf der Basis von Sequenz 9 in Tabelle 1 wurde als Kontrolle verwendet.
Die Zellen wurden stabil unter Verwendung eines Calciumphosphatfällverfahrens nach der Beschreibung von Wigler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 1373-1376 (1979) trans fiziert, wobei pFL116 CL116, die Plasmide EGS 9 und pFL116 CLCAT, die Plasmide pFL104 und pFL116 CL104, die Plasmide pFL109 und pFL116 CL109 und die Plasmide pFL112 und pFL116 CL112 ergaben, und anschließend bezüglich Neomycin selektiert. Die Zellen wurden kloniert, vermehrt und die RNA wurde isoliert. Sowohl die Gesamt-RNA als auch die Cytoplasma-RNA wurde isoliert und nach dem RNase- Schutzverfahren, beschrieben in "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition" Sambrook et al., (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) auf S. 7.71-7.78, untersucht. Dies ist ein extrem empfindlicher Test, bei dem Verdau von unter Verwendung einer radioaktiv markierten Sonde gebildeter RNA : RNA-Hybride verwendet wird, um festzustellen, welche Zellklone die EGS exprimieren.
Die Ergebnisse zeigten, daß die EGSs sowohl in den Kernen als auch im Cytoplasma exprimiert werden.
Die Zellen wurden dann mit Herpes-simplex-Virus unter Verwendung einer Infektionsmultiplizität (MOI) von 1 bis 1,5, speziell 1 bis 1,5 Millionen Virusteilchen/1 Million Zellen, infiziert, um einer natürlichen Infektion mit Virus zu gleichen. RNA wurde 4, 8 und 12 h nach der Infektion geerntet. Die interne Kontrollprobe wurde zum Nachweis der mRNA- Konzentrationen von HSV α 47 und der späten Gene US10 und US11 verwendet. Die Sonde wird so gewählt, daß der Nachweis eines hohen Grades der Expression von Virus-mRNA über den gesamten Virusinfektionszyklus sichergestellt ist.
Die Ergebnisse sind in Fig. 7 angegeben. Die exprimierte TK-mRNA war um 0% in der Kontrolle CL-CAT, um 30% in CL- 109, um 45% in CL-104 und um 65% CL-112 verringert.

Beispiel 7: Interne RNase-P-Leitsequenzen A. Konstruktion von Plasmiden, katalytischen RNAs und RNA- Substraten für Untersuchungen in vitro

DNA-Template zur in-vitro-Transkription der RNA-Substrate tk7, tk46 und cat7 wurden durch Annealing des den T7- Promotor enthaltenden Oligonucleotids OliT7 (5'- TAATACGACTCACTATAG-3') (Sequenz ID Nr. 41) mit den Oligonucleotiden Olitk7 (5'-CGCAGACGGTCCTATAGTGAGTCGTATTA-3') (Sequenz ID Nr. 42), OliTK46 (5'- ACCGCCGCAGCCTGGTCGAACGCAGACGCGTGTTGATGGCAGGGGTCTATAGTGAGTCG TATTA-3') (Sequenz ID Nr. 43) bzw. Olicat7 (5- ATGCCTCGGTCCTATAGTGAGTCGTATTA-3') (Sequenz ID Nr. 44) konstruiert. Die Plasmide pTK117 und pTK146 sind Derivate von pUC19 und wurden von Guerrier-Takada und Altman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 1266-1270 (1992) beschrieben. Die DNA-Sequenzen mit Codierung für M1-RNA (pTK117) und mutierte Ml-RNA mit einer Deletion der Nucleotide 167 bis 377 (pTK146) stehen unter der Kontrolle des T7-RNA- Polymerasepromotors. Die DNA-Template für M1TK19, M1TK16, M1TK13, M1TK10, M1TK5 und M1CAT13 wurden durch die Polymerasekettenreaktion (PCR) mit dem Gen für M1-RNA, das sich im Plasmid pTK117 findet, mit OliT7 als dem 5'-Primer- Oligonucleotid und 3'-Primern, die die entsprechenden Leitsequenzen enthielten, konstruiert. Die 3'-Primer waren OliTKl9 (5'-GTGGTGTCTGCGTTCGACCAGGCTATGACCATG-3') (Sequenz 1D Nr. 45), OliTKl6 (5'-GTGGTGTCTGCGTTCGACCAGTATGACCATG-3') (Sequenz ID Nr. 46), OliTKl3 (5'-GTGGTGTCTGCGTTCTATGACCATG- 3') (Sequenz ID Nr. 47), OliTK10 (5'- GTGGTGTCTGCGTTCTATGACCATG-3') (Sequenz IDNr. 48), OliTK5 (5'-GTGGTGTCTGTATGACCATG-3') (Sequenz ID Nr. 49) und Oli- CAT13 (5'-GTGGTGAGGCATTTCAGTTATGACCATG-3') (Sequenz ID Nr. 50). Die 10 3'-proximalen Sequenzen dienen als die Primer für die PCR mit der pUC19-Sequenz. Die unterstrichenen Sequenzen und die fettgedruckten Sequenzen entsprechen der 3'-CCAC-Sequenz bzw. den Leitsequenzen. Das DNA-Templat für ΔM1(167-377)TK13-RNA wurde durch PCR mit der Sequenz für M1-RNA in pTK146 und den Primern OliT7 und OliTK13 konstruiert. Das DNA-Templat für EGS TK16 wurde durch PCR mit dem 5'-Primer OliT7 und dem 3'-Primer OliTKIE für das DNA- Templat pUCT7, das von pUC19 durch Insertion einer T7- Promotorsequenz in die BamHI-Stelle abgeleitet wurde, konstruiert. Das CAT-mRNA-Fragment mit 550 nt wurde mit T7- RNA-Polymerase und EcoRI-verdauter pCAT-1-Plasmid-DNA (Promega Inc.) synthetisiert, während das TK-mRNA-Fragment mit 450 nt aus Plasmid-pTK101-DNA, in der die Sequenz für TK-mRNA unter der Kontrolle des T7-Promotors steht, synthetisiert wurde.

D. Versuche zur Spaltung durch M1GS-RNA

RNA-Enzym (20 nM) und -Substrat (50 nM) wurden, entweder gleichförmig mit [α-³²P] GTP markiert oder mit [γ-³²P] ATP 5'-endmarkiert, 30 min lang bei 37ºC oder 50ºC in Puffer A (50 mM Tris, pH-Wert 7,5, 100 mM NH&sub4;Cl, 100 mM MgCl&sub2;) oder Puffer B (50 mM Tris, pH-Wert 7,5, 100 mM NH&sub4;Cl), der MgCl&sub2; in verschiedenen Konzentrationen enthielt, inkubiert. Die Reaktionen wurden durch die Zugabe von 8 M Harnstoff gestoppt und die Spaltungsprodukte wurden dann auf entweder 15% oder 20% Polyacrylamidgelen, die 8 M Harnstoff enthielten, getrennt. C&sub5;-Protein und humanes RNase-P-Protein wurden aus E. coli bzw. HeLa-Zellen gereinigt, wie dies früher von Vioque et al., J. Mol. Biol. 202: 835-848 (1988) und Bartkiewicz et al., Genes & Dev. 3: 488-499 (1989) beschrieben wurde. Das RNase-P-Holoenzym von E. coli wurde durch Mischen von M1-RNA und C&sub5;-Protein im Molverhältnis 1: 20 zusammengebaut.
Versuche zur Bestimmung kinetischer Parameter unter Einfach- und Mehrfachumsatzbedingungen wurden, wie früher von Guerrier-Takada et al., Cell 35: 849-857 (1983) und Liu und Altman, Cell 77: 1083-1100 (1994) beschrieben, durchgeführt. Die Spaltung wurde bei verschiedenen Substratkonzentrationen mit 2- bis 20fachem Überschuß über die Enzymkonzentration, sowohl oberhalb als auch unterhalb des Km-Werts für das Substrat, untersucht. Aliquote Teile wurden in regelmäßigen Intervallen aus den Reaktionsgemischen gezogen und die Spaltungsprodukte wurden in Polyacrylamid- Harnstoff-Gelen getrennt. Die quantitative Bestimmung wurde mit einem Phosphorimager (Molecular Dynamics) durchgeführt. Die Werte von Km und kcat wurden aus doppelt reziproken Lineweaver-Burk-Diagrammen erhalten. In Einfachumsatzexperimenten wurden Spurenmengen der Substrate verwendet und die Konzentrationen, 1 nM, waren viel kleiner als der Km-Wert (> 80 nM). Die Enzymkonzentration lag im Bereich von 5 nM bis 200 nM. Die beobachtete Spaltungsrate (kobs) wurde bestimmt und der Wert kcat/Km wurde aus der Gleichung kcat/Km = kobs/[E], wobei [E] die Enzymkonzentration ist, erhalten.

C. Viren, Zellen und Antikörper

Die Eigenschaften von HSV-1(F), einem Prototyp des humanen Herpes-simplex-Virus-1, wurden von Ejercito et al., J. Gen. Virol. 2: 357-364 (1968) beschrieben. Der Retrovirusvektor LXSN, Retrovirusverpackungszellinien, PA317 (αmphotrop) und WCRE (ektopisch), und ihre Aufrechterhaltung und Fortpflanzung wurden von Miller und Rosman, BioTechniques 7: 980-990 (1989) und Δanos und Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci USA 85: 6460-6464 (1988) beschrieben. Der polyklonale Kaninchenantikörper gegen Thymidinkinase von HSV-1(F) wurden von Liu und Summers, Virology 163: 638-642 (1988) und der monoklonale Mausantikörper MCA406 gegen HSV-1-ICP35- Protein von Liu und Roizman, J. Virol. 65: 206-212 (1991) beschrieben und von Harlan Bioproducts for Sciences Inc. (Indianapolis, IN) gekauft. Die in den Western-Blots verwendeten sekundären Antikörper, Anti-Kaninchen- oder Anti- Maus-IgGs, konjugiert mit Meerrettichperoxidase, wurden von Vector Laboratories Inc. bzw. Bio-Rad Inc. gekauft.

D. Konstruktion von Plasmiden für in-vivo-Untersuchungen

Die Promotorsequenz für U6-kleinkernige-RNA und ein Signal für die Termination der Transkription (T-Cluster) durch RNA-Polymerase III, beschrieben von Yuan et al. (1992), wurden in die EcoRI-Stelle für den Retrovirusvektor LXSN, beschrieben von Miller und Rosman (1989) inseriert, um pRVO zu erzeugen. Die Retroviruskonstrukte PB2, M1TK und ΔM1TK wurden konstruiert, indem die ΔNA-Sequenz mit Codierung für die EGS mit der Fähigkeit zum zielgerichteten Ansteuern der mRNA für Influenzavirusprotein PB2, der m1TK13-RNA und ΔM1(167-377)TK13-RNA jeweils unter die Kontrolle des U6- Promotors in Plasmid pRVO gesetzt wurde. Das Plasmid pTK129 und pTK141 wurden konstruiert, indem das Bg1II-MluI- Fragment (87 nt) des HSV-1(F)-BamHI-Q-Fragments bzw. das BamHI-AccI-Fragment (181 nt) des HSV-1(F)-BamHI-Z-Fragments unter die Kontrolle eines Phage-T3-RNA-Polymerasepromotors gesetzt wurden. Diese beiden Fragmente entsprechen den Sequenzen mit Codierung für die 5'-Sequenz von TK-mRNA und den überlappenden Transkripten für die Gene HSV-1 α47, UslO bzw. Usll, wie von McMeoch et al., J. Gen. Virol. 69: 1531-1574 (1988) beschrieben.

E. Konstruktion von Zellinien

Die Protokolle wurden von Miller und Rosman (1989) modifiziert. Kurz gesagt wurden Zellen mit Retrovirusvektor-DNAs mithilfe eines von Stratagene Inc. (La Jolla, CA) gekauften Säugetiertransfektionskits transfiziert. 48 h nach der Transfektion wurde Neomycin (Gibco-BRL) dem Kulturmedium mit einer Endkonzentration von 600 ug/ml zugesetzt. Die Zellen wurden anschließend in Gegenwart von Neomycin zwei Wochen lang selektiert ung Neomycin-resistente Zellen wurden kloniert und sich in neomycinhaltigem Medium, wie von Sambrook et al. (1989) beschrieben, vermehren gelassen. Die neu konstruierten Zellinien NB2, ΔM1TK und M1TK und eine Kontrollzellinie, in der Zellen mit LXSN-Vektor-DNA transfiziert worden waren, waren bezüglich Zellwachstum und Lebensfähigkeit während bis zu zwei Monaten ununterscheidbar. Schließlich wurden Aliquote dieser Zellen entweder zur Langzeitlagerung in flüssigem Stickstoff eingefroren oder unmittelbar für weitere in-vivo-Untersuchungen verwendet.

F. Virusinfektion und Herstellung von RNA- und Proteinextrakten

Etwa 10&sup6; Zellen in einem T25-Kolben wurden in 1,5 ml von mit 1% Kalbfetusserum ergänztem Medium 199 (M199; GIBCO) entweder zum Schein infiziert oder mit HSV-1 infiziert. Nachdem die Zellen 2 h lang bei 37ºC dem Virus ausgesetzt waren, wurde das Medium mit mit 5% Rinderfetusserum ergänztem, nach Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium versetzt. Die Zellen wurden 11 h lang inkubiert und dann geerntet, um Virus-mRNA und/oder Protein zu isolieren. RNA- und Proteinextrakte wurden aus Zellen hergestellt, die beide mit HSV-1 zum Schein infiziert waren, wie zuvor von Jenkins und Howett, J. Virol. 52: 99-107 (1984) und Liu und Roizman (1991) beschrieben.

G. RNase-Schutztest der Virus-mRNA-Expression

Die zum Nachweis von TK-mRNA und der Transkripte der α 47-, UslO- und Usll-Gene verwendeten RNA-Sonden wurden in vitro mit T3-RNA-Polymerase (Promega, Madison, WI) ausgehend von den DNA-Templaten pTK129 bzw. pTK141, die mit EagI linearisiert worden waren, synthetisiert. RNase-Schutztests wurden wie zuvor von Yuan et al. (1992) beschrieben durchgeführt.
Die geschützten RNA-Produkte wurden in 8 M Harnstoff/ 8% Polyacrylamid-Gelen getrennt und quantitativ mit einem Phosphorimager bestimmt. Die quantitative Bestimmung wurde im linearen Bereich der RNA-Erfassung durchgeführt.

H. Elektrophoretische Trennung und Anfärbung mit Antikörpern von Polypeptiden aus infizierten Zellen

Denaturierte solubilisierte Polypeptide aus Zellysaten wurden auf STS-9% [v/v]-Polyacrylamidgelen getrennt. Die getrennten Polypeptide wurden elektrisch auf Nitrocellulosemembranen übertragen und in einem enzymgekoppelten Immunnachweis mit Antikörpern gegen entweder Maus- oder Kaninchen-IgG, die mit Meerrettichperoxidase konjugiert waren, nach der Reaktion mit Antikörpern gegen HSV-1-TK oder ICP35 reagieren gelassen. Die Membranen wurden anschließend mit dem Farbentwicklungssubstrat aus dem von Vector Laboratories Inc. gekauften Peroxidasesubstratkit angefärbt oder mit dem Chemolumineszenz zeigenden Substrat in einem Lumi- GLOTM-Chemolumineszenzkit (Kirkegaard and Perry Laboratories Inc.) umgesetzt-und anschließend damit ein Röntgenfilm belichtet. Schließlich wurden die Mengen des TK- und ICP35- Proteins auf der Membran quantitativ durch Rastern des Film mit einem Densitometer (Bio-Rad, Inc.) bestimmt. Die quantitative Bestimmung erfolgte im linearen Bereich der Proteinerfassung.

I. Spaltung von Modellsubstraten durch M1GS-RNA in vitro

Das HSV-1-TK-Gen ist gut charakterisiert und von Roizman und Sears, "Virology", 2. Auflage, herausgegeben von Fields et al., S. 1795-1841 (Raven Press, New York, 1990) zusammenfassend behandelt. Obwohl das TK-Genprodukt für die Virusreplikation in Gewebekulturzellen nicht wesentlich ist, verwendeten wir es wegen seiner so guten Untersuchung als Modelltarget bzw. -ziel zur Geninaktivierung durch M1GS- RNA. DNA mit Codierung für eine Leitsequenz (TK13), die eine zur 5'-terminalen Sequenz von mRNA für das HSV-1-TK- Protein komplementäre Sequenz von 13 nt enthält, wurde kovalent an das 3'-Ende von DNA mit Codierung für M1-RNA gebunden (Fig. 9). Das RNA-Transkript dieses Konstrukts, M1TK13, spaltete Ziel-RNA, tk7, die 7 nt der 5'-Sequenz von TK-mRNA und eine als Leader-Sequenz dienende nichtverwandte Sequenz von 5 nt enthält (Sequenz ID Nr. 52). Die Spaltung im Target erfolgt an Position 5, wobei zwei Spaltungsprodukte von 5 nt bzw. 7 nt Länge erhalten werden. M1TK13 bleibt während der Reaktion, wie von einem richtigen Enzym erwartet, unverändert, da nach Inkubation des Reaktionsgemischs nur markierte M1TK13-RNA voller Länge nachgewiesen wird. Das Befestigen von Leitsequenzen am 3'-Ende von M1-RNA bei der Konstruktion von M1GS-RNA ist im Gegensatz zum Befestigen am 5'-Ende bevorzugt, da das Vorhandensein einer 3'-terminalen CCA-Sequenz in der Leitsequenz für eine maximale Wirksamkeit der Spaltung wichtig ist. Ferner erniedrigen zusätzliche Sequenzen stromabwärts der CCA- Sequenz die Spaltungsrate von Substraten.
M1GS-RNA spaltet nur Substrate, die zur Leitsequenz komplementär sind. M1TK13-RNA kann das Substrat tk7 spalten, jedoch nicht das Substrat cat7, das eine Sequenz von 7 nt von der mRNA für Chloramphenicolacetyltransferase (CAT) enthält. M1CAT13-RNA, in der die Leitsequenz eine zu CAT-mRNA komplementäre Sequenz von 13 nt enthält, kann jedoch wirksam cat7, jedoch nicht tk7 spalten. M1GS-RNA scheint daher als sequenzspezifische Endonuclease zu wirken, die ihre Substrate durch spezifische Basenpaarung zwischen der GS und der Zielsequenz erkennt, was auch von Frank et al., Biochemistry 33: 10800-10808 (1994) mit unterschiedlichen Konstrukten gezeigt wurde. Um zu bestimmen, ob längere RNAs durch diese neuen RNA-Enzyme spezifisch gespalten werden können, wurden gleichförmig [³²P]-markierte Fragmente der TK (450 nts)- und CAT (550 nts)-mRNA-Sequenzen (Fig. 10) mit entweder M1TK13-RNA oder M1CAT13-RNA inkubiert. Es wurde eine sequenzspezifische und effiziente Spaltung dieser RNA- Substrate durch die entsprechenden RNA-Enzyme erzielt.
Ein Satz von RNA-Enzymen mit der Bezeichnung M1TK19, M1TK16, M1TK13, M1TK10 und M1TK5 wurde konstruiert, in denen die GSs jeweils zur TK-mRNA-Sequenz komplementäre Sequenzen mit 19, 16, 13, 10, 5 Nucleotiden enthielten (Fig. 11), um die Länge der Targethelix mit der Effizienz der Spaltung in Beziehung zu setzen. Das Substrat tk46, das eine TK-mRNA-Sequenz von 46 nt enthält, wurde durch alle Konstrukte gespalten und die Spaltungsstelle wurde wie erwartet als an Position G21 befindlich bestimmt (Fig. 11). Des weiteren wurde auch eine kinetische Analyse der Spaltung des Substrats tk46 durch M1TK16-, M1TK13-, M1TK10- und M1TK5-RNAs durchgeführt und die Ergebnisse sind in Tabelle 3 angegeben. Tabelle 3: Kinetische Parameter von durch verschiedene M1GS-RNA-Konstrukte katalysierten Reaktionen
Die Werte von kcat nahmen in der Rangfolge von M1TK5- bis M1TK16-RNA zu. Die Werte Km nahmen fortschreitend mit zunehmender Länge der Doppelhelix ab. Der Gesamt-Km-Wert der Reaktion umfaßt zweifellos sowohl die Substratbindung an die Leitsequenz (Helixbildung) als auch das Andocken des Doppelhelixsegments an der aktiven Stelle von M1-RNA, ein komplexer Prozeß. Es trat eine Ausnahme zur Regel der Zunahme von kcat mit der Länge der Leitsequenz auf: kcat nahm von M1TK13 zu M1TK16 ab. Dieses letzte Ergebnis läßt sich erklären, wenn die Produktfreisetzung der geschwindigkeitsbestimmende Schritt in der von M1TK16-RNA bestimmten Reaktion unter Einfach- und Mehrfachumsatzbedingungen wird, wie von Fersht, "Enzyme structure and mechanism", 2. Auflage (W. H. Freeman and Co., New York, 1985) beschrieben. Die weitere Analyse der Reaktion mit M1TK13 zeigte, daß etwa 5 pmol von tk46 durch 1 umol von M1TK13 in 30 min gespalten wurden, was belegt, daß das RNA-Enzym während der Inkubationsperiode fünfmal umgesetzt wird. Dieses Ergebnis ist mit dem durch klassische Michaelis-Menten-Kinetikanalyse gemessenen Wert von kcat konsistent (siehe Tabelle 3).
M1GS-RNAs wirken effizienter, als dies M1-RNA in der klassischen Spaltungsreaktion trans tut. M1TK16 spaltet tk46 mindestens 10mal schneller als dies M1-RNA bei Verwendung einer getrennten Leitsequenz, TK16, unter äquivalenten experimentellen Bedingungen tut. Darüber hinaus spaltet M1GS- RNA effizienter in Puffern, die physiologische Bedingungen in Form der Magnesiumionenkonzentration (10 mM MgCl&sub2;) enger nachahmen als dies M1-RNA mit einer getrennten Leitsequenz in Puffern, die 100 mM MgCl&sub2; enthalten, tut, ein Beleg, daß die hohen Konzentrationen von Mg²&spplus;-Ionen zum Vermitteln der Bindung des Substrats an M1-RNA allein benötigt werden, wie von Kazakov und Altman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 9193-9197 (1991) und Smith und Pace, Biochemistry 32: 5273- 5281 (1993) angegeben. Eine weitere Analyse der Spaltungsreaktion von M1GS-RNA zeigte, daß die Spaltung optimal bei einer Temperatur von 62ºC mit Konzentrationen einwertiger Kationen von 100 mM und Konzentrationen an Mg²&spplus;-Ionen von 60-100 mM verläuft.
Zum Nachweis, daß die katalytische Aktivität von M1GS-RNA in der Sequenz, die M1-RNA codiert, sitzt, wurde ein Satz von M1TK-RNAs konstruiert, in dem jede RNA in einer unterschiedlichen Region der M1-RNA-Sequenz eine Deletion aufwies, in der jedoch jede die gleiche Leitsequenz TK13 aufwies. Den verschiedenen M1-RNA-Deletionsmutanten, beispielsweise A167-377, Δ1-163 und Δ65 fehlt die zur Prozessierung von pre-tRNAs notwendige katalytische Aktivität, wie von Guerrier-Takada et al., Science 286 : 1578-1584 (1989) und Guerrier-Takada und Altman (1992) gezeigt. M1GS- RNA-Konstrukte mit diesen Deletionsmutanten und der gebundenen TK13-Sequenz waren nicht fähig, tk46 zu spalten.

Stimulation der Aktivität von M1GS-RNA durch Proteine

C5-Protein, die Proteinuntereinheit von RNase P aus E. coli erhöht die Rate der Spaltung natürlicher Substrate durch M1-RNA gemäß der Beschreibung durch Guerrier-Takada et al. (1983) und Reich et al., Science 239: 178-181 (1988). Das C5-Protein stimuliert auch die Spaltung durch M1GS-RNA um einen Faktor 30 oder mehr. Ferner kann die Spaltung durch M1GS-RNA mindestens 5fach durch eine partiell gereinigte Präparation von humaner RNase P stimuliert werden. Diese Verstärkung der Rate war erwartet worden, da früher gezeigt worden war, daß Protein aus einer Rohpräparation von humaner RNase P (aus HeLa-Zellen) die Spaltung von ptRNA durch M1-RNA nach der Beschreibung von Gold und Altman, Cell 44: 243-249 (1986) verstärken kann. Die Geschwindigkeitsstimulierung läßt sich nicht restlicher humaner RNase-P- Aktivität zuschreiben, da sie das Substrat tk46 in Komplexen mit katalytisch inaktiver ΔM1(167-377)TK13-RNA allein nicht spalten kann. Das letztere Ergebnis ist mit Beobachtungen konsistent, nach denen eine einfach Stamm-Schleife- Struktur als Substrat für M1-RNA, jedoch nicht für eukaryotische RNase P dienen kann. Dies wurde spezifisch mit humaner RNase P und RNase P von X. laevis durch Yuan und Alt man, Science 263: 1269-1273 (1994) und Carrara et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA gezeigt. Es konnte keine Stimulierung der Spaltung von Substrat tk46 durch M1TK13-RNA beobachtet werden, wenn Fraktionen ohne humane RNase-P- Aktivität verwendet wurden. Es wird daher erwartet, daß beim Vorhandensein von M1GS-RNA-Konstrukten in Säugetierzellen deren Aktivität durch endogene Proteine verstärkt werden sollte.

J. Expression von M1GS-RNA in vivo

Zur Expression von M1GS-RNA in Säugetierzellen wurden Retroviruskonstrukte, M1TK und Δ M1TK erzeugt, indem Gene für M1TK13 und AM1(163-377)TK13 in den Retrovirusvektor LXSN unter der Kontrolle eines Maus-U6-snRNA-Promotors gemäß der Beschreibung von Das et al., EMBO J. 7: 503-512 (1988) und Yuan et al. (1992) (Fig. 12) kloniert wurden. Ein zusätzliches Retrovirus-DNA-Konstrukt, NB2, das den U6- Promotor und eine externe Leitsequenz (NB2), die die mRNA mit Codierung für das PB2-Protein des humanen Influenzavirus zielgerichtet anstrebt, enthält, wurde als Kontrolle verwendet.
Die Zielspaltungsstelle von in mit HSV-1 infizierten Zellen exprimierter TK-mRNA scheint durch Dimethylsulfat (DMS) in vivo modifizierbar zu sein, beruhend auf Peattie und Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4679-4682 (1980), Inoue und Cech, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 648-652 (1985), Climie und Friesen, J. Biol. Chem. 263: 15166-15175 (1988) und Ares und Igel, Genes & Dev. 4: 2132-2145 (1990). Dies ist ein Hinweis, daß diese Stelle zur Bindung an M1GS in vivo zugänglich sein könnte. Amphotrope Verpackungszellen (PA317) wurden mit Retrovirusvektor-DNAs zur Erzeugung von Retroviren mit Codierung für die Gene für M1GS-RNA transfiziert. Anschließend wurden esotrope Verpackungszel len (ψCRE) mit diesen Retroviren infiziert und die Retroviren und Ribozyme exprimierende Zellen kloniert. Eine stabile Expression von M1GS-RNAs wurde durch einen RNA- Schutztest mit einer Sonde, die zur Sequenz von M1-RNA und aus diesen Zellinien isolierter RNA komplementär war, demonstriert. Des weiteren kann aus M1TK exprimierenden Zellen extrahierte RNA das Substrat tk46 in vitro spalten, während aus den Stamm-H'CRE-Zellen, Zellen, die NB2-RNA und ΔM1TK-RNA exprimierten, extrahierte RNA keine Spaltungsaktivität zeigt. Diese Ergebnisse belegen, daß die in gezüchteten Zellen exprimierte M1TK-RNA intakt und katalytisch aktiv war.

K. Hemmung der Expression von TK von HSV-1 in Zellen, die M1GS-RNA exprimieren

Zellen wurden mit dem Herpes-simplex-Virus 1 (HSV-1) mit einer Infektionsmultiplizität (MOI) von 0,05 bis 0,1 infiziert. Die Konzentrationen von TK-mRNA in den infizierten Zellen wurden durch einen RNase-Schutztest mit einer RNA- Sonde (TK-Sonde), die eine zur 5'-proximalen Sequenz von TK-mRNA komplementäre Sequenz von 87 nt enthielt, bestimmt. Eine RNA-Sonde (α 47), die eine zu den überlappenden Regionen von α 47-, Us10- und Us11-mRNAs mit Codierung durch HSV-1 komplementäre Sequenz von 181 nt enthielt, wurde zur Bestimmung der Konzentrationen dieser letzteren mRNAs verwendet. Die Konzentrationen der letzteren RNAs wurden als interne Kontrollen zur quantitativen Bestimmung der Expression von TK-mRNA verwendet. Fig. 13 faßt die Ergebnisse der RNase-Schutzexperimente mit sowohl den TK- als auch den α 47-Sonden graphisch zusammen. Eine Verringerung um etwa 80 ±5%, gemittelt über 4 Experimente, des Grades der TKmRNA-Expression wurde in Zellen, die M1TK-RNA exprimierten, beobachtet, während Zellen, die Δ M1TK-RNA exprimierten, nur eine Verringerung um 9 ±3%, gemittelt über 4 Experimente, zeigten. Offensichtlich erfolgte daher die Spaltung von TK-mRNA durch M1TK-RNA in der Tat innerhalb der Zellen, mit einer anschließenden Verringerung der Menge von TKmRNA, die translatiert werden konnte. Keine Produkte der Spaltung von TK-mRNA wurden in unseren RNase-Schutztests nachgewiesen, da diese RNAs, denen entweder eine Cap- Struktur oder polyA-Sequenz fehlt, vermutlich rasch durch intrazelluläre RNasen abgebaut werden.
Proteinextrakte der infizierten Zellen wurden bezüglich des Vorhandenseins des TK-Polypeptids analysiert. Polypeptide wurden auf zwei identische Membranen übertragen und eine wurde mit einem TK-spezifischen Antikörper (anti-TK), beschrieben von Liu und Summers (1988), angefärbt, während die andere mit einem monoklonalen Antikörper gegenüber dem Capsidprotein ICP35 von HSV-1 (anti-ICP35), beschrieben von Liu und Roizman (1991), angefärbt wurde. Die Expression von ICP35 dient als interne Kontrolle für die quantitative Bestimmung der Expression von TK. Die Ergebnisse von 4 unabhängigen Experimenten sind in Fig. 13 zusammengefaßt: eine Verringerung um mindestens 76 ±5%, gemittelt über 4 Experimente, der Menge des TK-Proteins wurde in Zellen, die M1TK-RNA exprimierten, beobachtet, während eine Reduktion um nur 10 ±4%, gemittelt über 4 Experimente, in Zellen, die Δ M1TK-RNA exprimierten, zu sehen war. Der geringe Grad der Hemmung, der in AM1TK-RNA exprimierenden Zellen gefunden wurde, beruhte vermutlich auf einem Antisense-Effekt.
Diese Beispiele zeigen, daß M1-RNA bei Umwandlung in eine RIGS (M1GS-RNA) nur ein spezielles Substrat in einer durch Sequenzspezifität bestimmten Reaktion spaltet. Eine nach Maß konstruierte, für eine Thymidinkinasesequenz spezifische RIGS (M1TK-RNA) spaltet die TK-mRNA in vitro und kann in Säugetierzellen stabil exprimiert werden und den Grad der Expression von TK um ≥75% verringern, wenn diese Zellen mit HSV-1 infiziert sind. Die Verringerung des Grades der Expression von TK, die dem Antisense-Effekt der (internen) Leitsequenz zugeschrieben werden kann, beträgt nicht mehr als 15% der Gesamthemmwirkung. Ferner macht der hohe Grad der Sequenzspezifität, die durch eine Leitsequenz bestimmt wird, die mit einer komplementären Sequenz im Substrat hybridisiert, unser Konstrukt zur Verwendung als ein Werkzeug zum Targeting von RNAs in vivo geeignet. Die optimale Länge einer Antisense-Sequenz zu in-vivo-Targeting beträgt etwa 13 Nucleotide, wie von Stein und Cheng, Science 261: 1004-1012 (1993) diskutiert. Das Ausmaß der Inaktivierung, das wir beobachteten, war sehr ähnlich dem, das bei der Verwendung von endogener RNase P als katalytisches Mittel zur Spaltung von Komplexen von Ziel-TK-mRNA und getrennter, von synthetischen Genen exprimierter EGSs, die stabil in Humanzellen in Gewebekultur eingearbeitet waren, erreicht wurde.
Die Aktivität von M1GS-RNA wurde in vitro durch C5-Protein und Säugetierproteine stimuliert. Gold und Altman (1986) schlugen vor, daß C5-Protein und Proteinuntereinheiten von humaner RNase P an homologe Sequenzen und ähnliche Strukturen, die sich in sowohl M1-RNA als auch H1-RNA, der RNA- Komponente von RNase P von HeLa-Zellen, finden, binden könnten. Die Spaltungsreaktionen durch M1GS-RNA in Zellen, die katalytische RNase-P-RNA bindende Proteine enthalten, verlaufen vermutlich mit höheren Raten als die in vitro beobachteten. Insbesondere erwartet man höhere Raten in Gegenwart von zusätzlichen, nicht-spezifischen, RNA bindenden Proteinen, RNA-Chaperonen, die bekanntlich die Aktivität anderer RNA-Enzyme stimulieren, wie von Tsuchihashi et al., Science 262: 99-102 (1993), Coetzee et al., Genes & Dev. 8: 1575-1588 (1994), Bertrand und Rossi, EMBO J. 13: 2904-2912 (1994) und Herschlag et al., EMBO J. 13: 2913-2924 (1994) angegeben.

SEQUENZPROTOKOLL

(1) ALLGEMEINE ANGABEN:
(i) ANMELDER: Yuan, Yan
Guerrier-Takada, Cecilia
Altmann, Sidney
Liu, Fenyong
(ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: GEZIELTE SPALTUNG VON RNA UNTER EINSATZ VON RIBONUCLEASE-P-TARGETING UND SPALTUNGSSEQUENZEN
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 65
(iv) KORRESPONDENZADRESSE:
(A) ADRESSAT: Patrea L. Pabst
(B) STRASSE: 2800 One Atlantic Center
1201 West Peachtree Street
(C) ORT: Atlanta
(D) BUNDESLAND: Georgia
(E) LAND: USA
(F) ZIP: 30309-4530
(v) COMPUTERLESBARE FASSUNG:
(A) DATENTRÄGER: Diskette
(B) COMPUTER: IBM-kompatibler PC
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, Version #1.25
(vi) DATEN DER JETZIGEN ANMELDUNG:
(A) ANMELDENUMMER:
(B) ANMELDETAG:
(C) KLASSIFIKATION:
(vii) DATEN DER VORANMELDUNG
(A) ANMELDENUMMER: 08/207547
(B) ANMELDETAG: 7. März 1994
(viii) ANGABEN ZU ANWALT/VERTRETER:
(A) NAME: Pabst, Patrea L.
(B) REGISTRIERUNGSNUMMER: 31284
(C) REFERENZ/AKTENZEICHEN: YU112
(ix) TELEKOMMUNIKATIONSANGABEN:
(A) TELEFON: (404)-873-8794
(B) TELEFAX: (404)-873-8795
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 1:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 88 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: RNA (genomisch)
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: nein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:
GAACAUUUUG AGGCAUUUCA GUCAGUUGGC CAAACUGAGC AGACUCUAA 50 UCUGCNNNNN GAAGGUUCNN NNCCUUCAUG CCUCACCA 88
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 2:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 61 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: nein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2:
TAATACGACT CACTATAGAA CATTTTGAGG CATTTCAGTC AGTTGGCCAA 50 ACTGAGCAGA C 61
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 3:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 61 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: nein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 3:
TGGTGAGGCA TGAAGGNNNN GAACCTTCNN NNNGCAGATT TAGAGTCTGC 50 TCAGTTTGGC C 61
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 4:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 99 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: tRNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: nein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 4:
GAAUACACGG AAUUGGUGGG GUUCCCGAGC GGCCAAAGGG AGCAGACUCU 50 AAAUCUGCCG UCAUCGACUU CGAAGGUUCG AAUCCUUCCC CCACUGCCA 99
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 5:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 71 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: tRNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: nein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 5:
GCCAAAGGGA GCAGACUCUA AAUCUGCCGU CAUCGACUUC GAAGGUUCGA 50 AUCCUUCCCC CACCACCAUC A 71
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 6:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 28 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: tRNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: nein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 6:
GAAUACACGG AAWGGUGGG GWCCCGA 28
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 7:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 33 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: mRNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: nein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 7:
AUGGAACAW WGAGGCAW UCAGUCAGW UAA 33
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 8:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 70 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: tRNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: nein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 8:
GGCCAAACUG AGCAGACUCU AAAUCUGCCG UCAUCGACW CGAAGGWCG 50 AAUCCWCAU GCCUCACCAU 70
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 9:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 61 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: tRNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: nein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 9:
GGCCAAACUG AGCAGACUCU AAAUCGCAAA CGGAAGGUUC GUGCCCUUCA 50 UGCCUCACCA U 61
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 10:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 53 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: tRNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein ·
(iv) ANTISENSE: nein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 10:
GGCCAAACUG ACGUCAUCGA CUUCGAAGGU UCGAAUCCUU CAUGCCUCAC 50 CAU 53
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 11:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 341 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: RNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: nein
(vi) URSPRÜNGLICHE HERKUNFT:
(A) ORGANISMUS: Homo sapiens
(x) ANGABEN ZUR VERÖFFENTLICHUNG:
(A) AUTOREN: Altman et al.
(C) ZEITSCHRIFT: Genomics
(D) BAND: 18
(F) SEITEN: 418-422
(G) DATUM: 1993
(K) RELEVANTE RESTE IN SEQ ID NO: 1: VON 1 BIS 341
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 11:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 12:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE 18 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: nein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 12:
GCCAAACTGA GCAGACTC 18
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 13:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 31 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: nein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 13:
GCGCGGTACC AAAAATGGTG AGGCATGAAG G 31
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 14:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 23 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: nein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 14:
GGCCGTAATA TCCAGCTGAA CGG 23
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 15:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 16 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: nein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 15:
TGGTGAGGCA TGAAGG 16
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 16:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 33 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: nein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 16:
TAATACGACT CACTATAGGC CAACTGAGCA GAC 33
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 17:
(1) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 61 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: tRNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: nein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 17:
GGCCAAACUG AGCAGACUCU AAAUCGGCCC UUCGAAGGUU CGCCCCCUUC 50
AUGCCUCACC A 61
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 18:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 62 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: tRNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: nein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 18:
GGCCAAACUG AGCAGACUCU AAAUCUGCAC GAGAGAAGGU UCGUGCCCUU 50 CAUGCCUCAC CA 62
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 19:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 61 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: tRNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: nein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 19:
GGCCAAACUG AGCAGACUCU AAACUGGCCU AACGAAGGUU CGCCCCCUUC 50 AUGCCUCACC A 61
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 20:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 60 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: tRNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: nein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 20:
GGCCAAACUG AGCAGACUCU AAAUUGCCCA ACGAAGGUUC ACCCCCUUCA 50 UGCCUCACCA 60
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 21:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 59 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: tRNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: nein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 21:
GGCCAAACUG AGCAGACUCC AAAUCCACCA AGAAGGUUCG UGCCCUUCAU 50 GCCUCACCA 59
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 22:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 60 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: tRNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: nein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 22:
GGCCAAACUG AGCAGACUCU AAACUCCUCC CAGAAGGUUC GUGCCCUUCA 50 UGCCUCACCA 60
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 23:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 61 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: tRNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: nein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 23:
GGCCAAACUG AGCAGACUCU AAAUCGGCCU ACGGAAGGUU CGCCCCCUUC 50 AUGCCUCACC A 61
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 24:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 61 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: tRNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: nein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 24:
GGCCAAACUG AGCAGACGCU AAAUCUACCC CGUGAAGGUU CGUCCCCUUC 50 AUGCCUCACC A 61
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 25:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 61 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: tRNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: nein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 25:
GGCCAAACUG AGCAGACUCU AAAUUUGCCA CCAGAAGGUU CGCCCCCUUC 50 AUGCCUCACC A 61
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 26:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 61 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: tRNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: nein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 26:
GGCCAAACUG AGCAGACUCA AAUCUGGCCA UUCGAAGGUU CGCCCCCUUC 50 AUGCCUCACC A 61
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 27:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 60 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: tRNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: nein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 27:
GGCCAAACUG AGCAGACUCU AAAUCGCAGU GUGAAGGUUC GUGCCCUUCA 50 UGCCUCACCA 60
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 28:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 61 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: tRNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: nein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 28:
GGCCAAACUG AGCAGACUCU AAAUCAGCGC GUGGAAGGUU CGUGCCCUUC 50 AUGCCUCACC A 61
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 29:
(1) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 61 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: tRNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: nein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 29:
GGCCAAACUG AGCAGACUCU AAAUCGGCCG CACGAAGGUU CGCCCCCUUC 50 AUGCCUCACC A 61
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 30:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 61 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: tRNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: nein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 30:
GGCCAAACUG AGCAGACACU AAAUUUGCAC GAGGAAGGUU CGCCCCCUUC 50 AUGCCUCACC A 61
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 31:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 61 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: tRNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: nein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 31:
GGCCAAACUG AGCAGACCCU AAAUCUGCCC CCGGAAGGUU CGUGCCCUUC 50 AUGCCUCACC A 61
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 32:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 24 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: nein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 32:
GCCAAACTGA CGTCATCGAC TTCG 24
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 33:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 16 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: nein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 33:
AACAGCTATG ACCATG 16
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 34:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 59 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: nein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 34:
GTAATACGAC TCACTAGG CCAAACTGAG CAGACTCTAA ATCTGCAAAC 50 GGAAGGTTC 5g
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 35:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 47 Basenpaare
(B) ART; Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: tRNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: nein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 35:
ATGGCTTCGT ACCCCTGCCA TCAACACGCG TCTGCGTTCG ACCAGGC 47
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 36:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 71 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: tRNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: nein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 36:
GGTTAACGTC GGACAGACTC TAAATCTGTT GCGGTCTCCG CGCGCAGGTT 50 CAAATCCTGC CGCAGACGTT T 71
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 37:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 71 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: tRNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: nein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 37:
GGTTAACGTC GGACAGACTC TAAATCTGTT GCGGTCTCCG CGCGCAGGTT 50 GAAATCCTGC CGCAGACGTT T 71
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 38:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 54 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: tRNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: nein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 38:
GGTTAACGTC GGTGCGGTCT CCGCGCGCAG GTTCAAATCC TGCCGCAGAC 50 GTTT 54
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 39:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 62 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: tRNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: nein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 39:
GGCCAAACUG AGCAGACUCU AAAUCUGCAA ACGGAAGGUU CGUGCCCUUC 50 AUGCCUCACC AU 62
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 40:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 377 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: RNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: nein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 40:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 41:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 18 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: nein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 41:
TAATACGACT CACTATAG 18
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 42:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 29 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: nein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 42:
CGCAGACGGT CCTATAGTGA GTCGTATTA 29
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 43:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 63 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: nein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 43:
ACCGCGCAGC CTGGTCGAAC GCAGACGCGT GTTGATGGCA GGGGTCTATA 50 GTGAGTCGTA TTA 63
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 44:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LANGE: 29 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: nein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 44:
ATGCCTCGGT CCTATAGTGA GTCGTATTA 29
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 45:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 32 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: nein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 45:
GTGGTGTCTG CGTTCGACCA GCTATGACCA TG 32
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 46:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 31 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: nein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 46:
GTGGTGTCTG CGTTCGACCA GTATGACCAT G 31
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 47:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 28 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: nein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 47:
GTGGTGTCTG CGTTCGACTA TGACCATG 28
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 48:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 25 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: nein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 48:
GTGGTGTCTG CGTTCTATGA CCATG 25
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 49:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 20 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: nein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 49:
GTGGTGTCTG TATGACCATG 20
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 50:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 28 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: nein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 50:
GTGGTGAGGC ATTTCAGTTA TGACCATG 28
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 51:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 12 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: RNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: nein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 51:
AUGCCUCACC AC 12
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 52:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 12 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: RNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: nein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 52:
CGCAGACACC AC 12
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 53:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 12 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: RNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: nein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 53:
GGACCGAGGC AU 12
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 54:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 12 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: RNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: nein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 54:
GGACCGUCUG CG 12
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 55:
(1) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 12 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: RNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: nein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 55:
GUCUGCGUUC GA 12
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 56:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 13 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: RNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: nein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 56:
GAGGCAUUUC AGU 13
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 57:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 46 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: nein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 57:
GACCCCTGCC ATCAACACGC GTCTGCGTTC GACCAGGCTG CGCGGT 46
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 58:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 26 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: RNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: nein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 58;
AGCCUGGUCG AACGCAGACA CCAAAA 26
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 59:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 24 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: RNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: nein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 59:
AGCCUGGUCG AACGCAGACA CCAC 24
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 60:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 21 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: RNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: nein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 60:
CUGGUCGAAC GCAGACACCA C 21
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 61:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 18 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: RNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: nein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 61:
GUCGAACGCA GACACCAC 18
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 62:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 15 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: RNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: nein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 62:
GAACGCAGAC ACCAC 15
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 63:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 10 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: RNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: nein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 63:
CAGACACCAC 10
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 64:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 18 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: RNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: nein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:
GUCGAACGCA GACACCAC 18
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 65:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 21 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: RNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: nein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 65:
CUGGUCGAAC GCAGACACCA C 21

Claims

1. Oligonucleotidmolekül, umfassend eine externe Leitsequenz, wobei die externe Leitsequenz

eine Erkennungssequenz, die zu einer Zielsequenz in einem Ziel-RNA-Molekül komplementär ist, und

eine RNase-P-Bindungssequenz, die aus einer Nucleotidsequenz besteht, die mit sich selbst unter Ausbildung einer der T-Stamm-Schleifen-Struktur einer Vorläufer-tRNA ähnlichen Struktur eine Basenpaarung eingeht, umfaßt,

wobei die externe Leitsequenz mindestens 7 Nucleotide, die mit der Zielsequenz 3' zur geplanten Spaltungsstelle eine Basenpaarung eingehen, und die RNase-P- Bindungssequenz, auf die mindestens 3 mit der Zielsequenz eine Basenpaarung eingehende Nucleotide folgen, aufweist und wobei die externe Leitsequenz die katalytische RNA-vermittelte Spaltung des Ziel-RNA-Moleküls durch RNase P fördert.

2. Oligonucleotidmolekül nach Anspruch 1, des weiteren umfassend eine katalytische Sequenz von RNase P, wobei das Oligonucleotidmolekül die Ziel-RNA spaltet.

3. Oligonucleotidmolekül nach Anspruch 2, wobei die katalytische Sequenz an RNase P eine H1-Sequenz oder eine M1-Sequenz ist.

4. Oligonucleotidmolekül nach Anspruch 2, wobei die kata lytische Sequenz von RNase P an das 3'-Ende der mindestens 7 Nucleotide gebunden ist, oder wobei die katalytische Sequenz von RNase P an das 5'-Ende der mindestens 3 Nucleotide gebunden ist.

5. Oligonucleotidmolekül nach Anspruch 2, wobei die katalytische Sequenz von RNase P die Sequenz einer natürlich vorkommenden katalytischen RNA von RNase P umfaßt.

6. Oligonucleotidmolekül nach Anspruch 2, wobei das Oligonucleotidmolekül durch

regelloses bzw. statistisches Schneiden der Sequenz des Ausgangsoligonucleotidmoleküls;

Selektieren einer Subpopulation aus den regellos verteilten Sequenzen bezüglich ihrer Fähigkeit zur wirksamen Spaltung der Ziel-RNA;

Amplifizieren der Sequenzen, die wirksamer als das Ausgangsoligonucleotidmolekül spalten, und

Wiederholen der Stufen der Selektion und der Amplifikation

selektiert wird.

7. Zusammensetzung zur Förderung der Spaltung einer Ziel- RNA, wobei die Zusammensetzung das Oligonucleotidmoleküls nach Anspruch 2 in einem pharmazeutisch akzeptablen Zuführungssystem umfaßt.

8. Zusammensetzung nach Anspruch 7, wobei das pharmazeutisch akzeptable Zuführungssystem aus der Gruppe Liposome, Virosome, Mikrokügelchen und Mikrokapseln ausge wählt ist, oder wobei das pharmazeutisch akzeptable Zuführungssystem aus der Gruppe von Trägern, die zur topischen, subkutanen, parenteralen und enteralen Verabreichung geeignet sind, ausgewählt ist.

9. Zusammensetzung zur Förderung der Spaltung einer Ziel- RNA, wobei die Zusammensetzung einen technisch veränderten Expressionsvektor mit Codierung für das Oligonucleotidmolekül nach Anspruch 2 umfaßt.

10. Zusammensetzung nach Anspruch 9, wobei der technisch veränderte Expressionsvektor ein aus der Gruppe Retrovirusvektoren, adenoassoziierte Virusvektoren und Epstein-Barr-Virusvektoren ausgewählter viraler Vektor ist.

11. Ex-vivo-Verfahren zur Spaltung einer Ziel-RNA durch

In-Kontakt-bringen unter die RNase-P-Spaltung fördernden Bedingungen der Ziel-RNA und eines Oligonucleotidmoleküls, umfassend eine externe Leitsequenz, wobei die externe Leitsequenz

wobei die externe Leitsequenz mindestens 7 Nucleotide, die mit der Zielsequenz 3' zur geplanten Spaltungsstelle eine Basenpaarung eingehen, und die RNase-P- Bindungssequenz, auf die mindestens 3 mit aer zie±sequenz eine Basenpaarung eingehende Nucleotide folgen, aufweist und wobei die externe Leitsequenz die katalytische RNA-vermittelte Spaltung des Ziel-RNA-Moleküls durch RNase P fördert.

12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei das Oligonucleotidmolekül ferner eine katalytische Sequenz von RNase P umfaßt, wobei das Oligonucleotidmolekül die Ziel-RNA spaltet.

13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Stufe des In- Kontakt-bringens durch Verabreichen des Oligonucleotidmoleküls an Zellen eines Patienten erfolgt und

wobei sich das Oligonucleotidmolekül in einem pharmazeutisch akzeptablen Zuführungssystem befindet.

14. Verfahren zur Selektion einer Population von internen Leitsequenzen von RNase P, die eine Ziel-RNA mit einer gegenüber einer internen Ausgangsleitsequenz von RNase P höheren Effizienz spalten, wobei sowohl die internen Leitsequenzen von RNase P, die eine Ziel-RNA mit einer gegenüber einer internen Ausgangsleitsequenz von RNase P höheren Effizienz spalten, als auch die interne Ausgangsleitsequenz von RNase P Oligonucleotidmoleküle gemäß Anspruch 2 sind, wobei das Verfahren

regelloses Schneiden der internen Ausgangsleitsequenz von RNase P,

Auswählen einer Subpopulation aus den regellos verteilten Sequenzen bezüglich ihrer Fähigkeit zur wirksamen Spaltung der Ziel-RNA;

Wiederholen der Stufen der Selektion und der Amplifikation

selektiert wird,

umfaßt.

15. Oligonucleotidmolekül nach Anspruch 1, wobei mindestens ein Nucleotid im Oligonucleotidmolekül aus der Gruppe chemisch modifizierte Nucleotide und chemisch unmodifizierte Desoxyribonucleotide ausgewählt ist.

16. Zusammensetzung zur Förderung der Spaltung eines Ziel- RNA-Moleküls, wobei die Zusammensetzung das Oligonucleotidmolekül nach Anspruch 15 in einem pharmazeutisch akzeptablen Zuführungssystem umfaßt.

17. Zusammensetzung nach Anspruch 16, wobei das pharmazeutisch akzeptable Zuführungssystem aus der Gruppe Liposome, Virosome, Mikrokügelchen und Mikrokapseln ausgewählt ist.

18. Oligonucleotidmolekül nach Anspruch 15, wobei

a) eine oder mehr der 2'-Hydroxylgruppen der Ribonucleotide durch eine chemische Gruppe, ausgewählt aus der Gruppe Wasserstoff, eine O-Alkylgruppe, eine Aminogruppe und Fluor, ersetzt (ist) sind,

b) eine oder mehr der verknüpfenden Phosphatgruppen durch eine verknüpfende Gruppe, ausgewählt aus der Gruppe Methylphosphonat und Phosphorthioat, ersetzt (ist) sind, und

c) das Ersetzen von einer oder mehr der 2'- Hydroxylgruppen die Beständigkeit der externen Leitsequenz gegenüber Nucleasen erhöht.

19. Oligonucleotidmolekül nach Anspruch 15, wobei eine oder mehr der 2'-Hydroxylgruppen der Ribonucleotide durch Wasserstoff oder eine Methoxygruppe ersetzt (ist) sind, und wobei eine oder mehr der verknüpfenden Phosphatgruppen durch Phosphorthioat ersetzt (ist) sind.

20. Oligonucleotidmolekül nach Anspruch 15, das ferner eine katalytische Sequenz von RNase P umfaßt, wobei das Oligonucleotidmolekül die Ziel-RNA spaltet.

21. DNA-Molekül mit Codierung für ein RNA-Molekül, umfassend eine externe Leitsequenz, wobei die externe Leitsequenz

22. DNA-Molekül nach Anspruch 21, wobei das RNA-Molekül ferner eine katalytische Sequenz von RNase P umfaßt, wobei das RNA-Molekül die Ziel-RNA spaltet.

23. Ein Oligonucleotid- oder DNA-Molekül gemäß Anspruch 2 oder 16 oder 21 zur Verwendung in der Medizin.

24. Verwendung eines Oligonucleotidmoleküls, umfassend eine externe Leitsequenz, wobei die externe Leitsequenz

wobei die externe Leitsequenz mindestens 7 Nucleotide, die mit der Zielsequenz 3' zur geplanten Spaltungsstelle eine Basenpaarung eingehen, und die RNase-P- Bindungssequenz, auf die mindestens 3 mit der Zielsequenz eine Basenpaarung eingehende Nucleotide folgen, aufweist und wobei die externe Leitsequenz die katalytische RNA-vermittelte Spaltung des Ziel-RNA-Moleküls durch RNase P fördert, zur Herstellung eines Medikaments zur Spaltung einer Ziel-RNA, wobei die Ziel-RNA und das Oligonucleotid unter die RNase-P-Spaltung fördernden Bedingungen in Kontakt gebracht werden.