DE69533694T2

DE69533694T2 - Hemmung von menschlichem papillomavirus durch "hairpin-ribozyme"

Info

Publication number: DE69533694T2
Application number: DE69533694T
Authority: DE
Inventors: Arnold Hampel; Joseph Dipaolo; Andrew Siwkowski
Original assignee: Northern Illinois University; National Institutes of Health NIH; University of Illinois
Current assignee: Northern Illinois University; National Institutes of Health NIH; University of Illinois
Priority date: 1994-05-13
Filing date: 1995-05-15
Publication date: 2006-02-16
Anticipated expiration: 2015-05-16
Also published as: EP1327683A3; DE69533694D1; CA2190102A1; AU712160B2; EP0759992A1; JP2006149387A; EP0759992B1; ATE280830T1; JPH10500307A; AU2588795A; EP1327683A2

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf einen RNA Katalysator, d. h. auf ein Ribozym, welches das menschliche Papillomavirus in ein Fragment mit 5' Hydroxyl und in ein Fragment mit 2', 3' Cyclophosphat spaltet. Die Produkte der hierin beschriebenen Reaktion gleichen denjenigen, welche sich aus der natürlichen Hydrolyse von RNA ergeben.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Papillomaviren sind kleine DNA Viren, welche die Hyperausbreitung von Epithelzellen auslösen. Es sind annähernd 70 verschiedene Genotypen des Menschens isoliert worden. Einige Typen (1, 2, 4 und 7) werden mit benignen d. h. gutartigen, schuppigen Papillomas (Warzen; Condylomas) beim Menschen in Verbindung gebracht, während man mindestens zwei Typen (16 und 18) mit menschlichen neoplastischen und präneoplastischen Verletzungen (Läsionen) in Verbindung gebracht hat (DiPaolo, et al., 1993, Critical Reviews in Oncogenesis 4: 337–360).
In den Vereinigten Staaten beeinträchtigt das Cervixkarzinom jedes Jahr annähernd 8,6 Frauen pro 100.000. Bei den Frauen wird HPV-16 (HPV = Human Papilloma Virus) häufig in Verbindung gebracht mit latenten Infektionen, mit gutartigen und präkanzerösen Cervixläsionen (Dysplasien /CIN) und mit der Hälfte der invasiven Cervixkarzinomen. Bei Männern wird HPV-16 in Verbindung gebracht mit subklinischen, makulären oder klinischen, papulösen Läsionen. Die bowenoide Papulosis gleicht beim Penis einem Karzinom in situ. Das Cervixkarzinom, welches jedes Jahr mindestens 500.000 Frauen weltweit tötet, schreitet durch progressive Zellveränderungen von den gutartigen Condylomas zu den hochgradigen Dysplasien /CIN voran, bevor es sich zu einem invasiven Krebs entwickelt. Über fünf Milliarden Dollar werden jedes Jahr in den Vereinigten Staaten im Rahmen der Gesundheitsbetreuung für den Nachweis und für die Behandlung dieser Läsionen ausgegeben.
Der epidemiologische Nachweis weist darauf hin, dass bis zu 89% von allen menschlichen und oralen Tumoren solche Typen von HPV aufweisen, welche in der Lage sind, primäre, menschliche Keratinocyte (Hornzellen) zu immortalisieren und Nagetierzellen zu transformieren. Das onkogene Potential des HPV scheint mit Produkten von zwei viralen Genen, E6 und E7, verbunden zu sein. Diese Produkte sind erforderlich für den Erwerb und die Aufrechterhaltung eines transformierten Phänotyps. Die durch diese Gene kodierten Proteine binden, mit einer hohen Affinität zu den mit der Neoplasie assoziierten Typen, an die Produkte der Rb und p53 Tumorsuppressorzellen und neutralisieren diese Produkte (Nasserie, 1991, Virol. 194: 136; Sedman, et al., 1991, J. Virol. 65: 4860–4866; Smotkin und Wettstein, 1989, J. Virol. 63: 1441–1447, Smotkin und Wettstein, 1986, J. Virol. 63: 1441–1447; Steele, et al., 1993, Cancer Res. 53: 2330; Storey, et al., Nuc. Acids Res. 19(15): 4109).
Die gegenwärtige Politik in dem urogenitalen Klinikbereich besteht mangels besserer Alternativen in der Chirurgie von hochgradigen Läsionen. Eine zervikale Laserablationstherapie beeinflusst langfristig gesehen den natürlichen Krankheitsverlauf der mit dem menschlichen zervikalen Papillomavirus verbundenen Krankheiten bei den Frauen nicht. Interferone, per se, sind, soweit die akute virale Infektion betroffen ist, enttäuschend gewesen, dies weil eine Behandlung gewöhnlich nicht rechtzeitig gestartet werden kann. Daher hat man angenommen, dass jeglicher Vorteil mit den Interferonen auf die antiproliferative Wirkung zurückzuführen ist und nicht auf die antivirale Wirkung.
Eine kombinierte Chemotherapie findet in der Krebstherapie ebenfalls Anwendung, und Cisplatin ist eines der zur Auswahl kommenden Arzneimittel für das Cervixkarzinom, und zwar alleine oder in Kombination mit anderen Mitteln der Chemotherapie. Der gegenwärtige Erfolg, welchen man mit der Chemotherapiebehandlung erzielt hat, ist jedoch schlecht. Die Ansprechrate auf eine kombinierte Behandlung mit Cisplatin und 5FU in den Studien der Phase II bei Patienten mit dem Cervixkarzinom ist nur bei 22% der Patienten wirksam, während dieselbe Kombination eine 88%-ige Antwort bei schuppenförmigen Karzinomzellen des Kopfes und des Nackens gewährleistete.
Die Verwendung von cytotoxischen Mitteln für die Karzinomtherapie unterliegt wegen der toxischen Nebeneffekte und wegen der Entwicklung einer vielfachen Arzneimittelresistenz Begrenzungen. Man hat daher in Betracht gezogen überzuwechseln zu einer Therapie, welche eine toxische Reaktion nicht direkt mit einbezieht, sondern welche das Wachstum der Tumorzellen verändern kann.
Gegenwärtige neue therapeutische Vorschläge für die Behandlung von HPV Infektionen zentrieren sich auf den Gebrauch von Antisense-Oligonukleotiden, um die virale mRNA Verwendung zu unterbrechen (DiPaolo, et al., 1993, Critical Reviews in Oncogenesis 4: 337–360; Steele, et al., 1993, Cancer Res. 53: 2330; Storey, et al.; 1991, Nuc. Acids Res. 19(15): 4109). Eine Antisense-Therapie ist jedoch begrenzt durch stöchiometrische Überlegungen (Sarver, et al., 1990, Gene Regulation and Aids, pp. 305–325).
Ribozyme sind RNA Moleküle, welche die RNA katalytische Fähigkeit besitzen (siehe Cech, et al., U.S. Patent 4,987,071), welche eine spezifische Stelle in einer Ziel RNA spalten. Die Anzahl der RNA Moleküle, welche durch ein Ribozym gespalten werden, ist größer als die von der Stöchiometrie her vorhergesagte Anzahl (Hampel und Tritz, 1989, Biochem. 28: 4929–4933; Uhlenbeck, 1987, Nature 328: 596–600). Dies liefert einen Vorteil gegenüber der Antisense-Technologie.
Die Antisense-Therapie hat zwei Nachteile, wenn man sie mit den Ribozymen vergleicht: (1) bedingt durch seine Natur, ist das Antisense-Molekül nicht katalytisch; und (2) Antisense-Moleküle sind normalerweise länger als die Zielerkennungssequenz des Ribozyms. Dies erhöht die Wahrscheinlichkeit, dass Antisense-Moleküle eine schädliche Wirkung auf ähnliche mRNA Sequenzen haben, welche in derselben Genfamilie vorgefunden werden.
Es sind Ribozyme nach dem "Hammerhead" ("Hammerkopf") Motiv entworfen worden (Sedman, et al., 1991, J. Virol. 65: 4860–4866). Jedoch weisen katalytische RNAs, wie etwa diejenigen, welche auf der Basis des "Hammerhead" Modells entworfen worden sind, mehrere Begrenzungen auf, welche ihre Verwendung in vitro einschränken und welche ihren Einsatz in vivo vereiteln können. Zum Beispiel liegt die optimale Temperatur für die Reaktion bei 50–55°C (Haseloff und Gerlach, 1988, Nature 334: 585; Uhlenbeck, 1987, Nature 328: 596–600). Zusätzlich liegt der Km Wert bei 0,6 μM (Uhlenbeck, 1987, Nature 328: 596–600), was bedeutet, dass die Reaktion hohe Konzentrationen des Substrats erfordert, was es schwierig, wenn nicht gar unmöglich für die katalytische RNA macht, geringe Anteile des Ziel-RNA-Substrates zu spalten, so wie man dies in vivo vorfinden würde.
Man hat herausgefunden, dass ein "Haarnadel" (hairpin) Motiv wirkungsvoller ist als das "Hammerhead" ("Hammerkopf") Motiv (Hampel und Tritz, 1989, Biochem. 28: 4929–4933; Hampel, et al., 1990, Nuc. Acids Res. 18: 299–304). Weiterhin sind Haarnadel – Ribozyme dazu verwendet worden, Ziele auf dem HIV zu spalten (Ojwang, et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 10802–10806; Yu, et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6340: 6344). Ribozyme für einen Virus werden jedoch im Allgemeinen andere Virusarten nicht spalten. Die Ribozyme erfordern für das Spalten nicht nur spezifische Zielsequenzen, sondern sie erfordern auch Veränderungen bei der Ribozymstruktur selbst, um in der Lage zu sein, ein spezifisches Ziel wirksam zu spalten. Gegenwärtig gibt es kein Haarnadel – Ribozym, für welches es nachgewiesen worden ist, dass es HPV RNA spaltet, und es ist in dem HPV keine Stelle identifiziert worden, welche in der Lage ist eine Spaltung durch ein Haarnadel – Ribozym zu erfahren.
Gewisse molekulare Komponenten sind in der Vergangenheit verwendet worden, um Ribozyme zu übertragen. Zum Beispiel sind retrovirale Vektoren verwendet worden, um Ribozyme zu übertragen. PoIIII Promotoren und retrovirale Vektoren mit PoIIII Promotoren sind auch verwendet worden.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG UND VORTEILE
Gemäß der vorliegenden Erfindung sind synthetische, katalytische RNAs, d. h. Ribozyme, einschließlich eines Haarnadelabschnittes, einer Bindungsstelle für das Anbinden an ein menschliches Papillomavirus nach der viralen Basis 434 und einer Spaltstelle für das Spalten des Virus an der Bindungsstelle konstruiert worden.
Nach einem Aspekt umfasst die vorliegende Erfindung ein synthetisches Ribozym, welches einen Haarnadelabschnitt, eine Bindungsstelle zum Anbinden an eine Nukleotidsequenz eines menschlichen Papillomavirus und eine Spaltstelle zum Spalten der Sequenz enthält. Die Spaltstelle ist eine Stelle nach der Basis 434 der Viralsequenz. Die Bindungsstelle solch eines synthetischen Ribozyms bindet vorzugsweise an eine der folgenden Sequenzen an: 430-ACUG U*GUC CUGAAGA-444 (SEQ ID NO: 2), 430-ACUG-U*GUC CUGAAGAA-445 (SEQ ID NO: 3), und 430-ACUG U*GUC CUGAAGAAA-446 (SEQ ID NO: 4), wobei "*" die Spaltstelle angibt. Der Haarnadelabschnitt des Ribozyms enthält vorzugsweise auch die Sequenz von SEQ ID NO: 5.
Bei einer bevorzugten Ausführung bindet das synthetische Ribozym an eine Nukleotidsequenz von HPV-16 an. Bei dieser Ausführung enthält das Ribozym vorzugsweise die Sequenz von SEQ ID NO: 6. Bei einer weiteren Ausführung kann das synthetische Ribozym die zwei dimensionalen Konfigurationen aufweisen, welche in der 2 gezeigt werden.
Gemäß einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung schließt die Erfindung einen Vektor mit ein, welcher eine DNA-Sequenz enthält, die für das oben beschriebene, synthetische Ribozym kodiert ist. Entsprechend diesem Aspekt ist die DNA-Sequenz vorzugsweise operativ mit den Expressionskontrollsequenzen verbunden. Der Vektor kann zum Beispiel ein Plasmid sein. Ein weiterer Aspekt der Erfindung umfasst eine mit dem oben beschriebenen Vektor transformierte Wirtzelle, wobei die Wirtzelle fähig ist, das Ribozym aus dem Vektor zu exprimieren.
Gemäß einem noch anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung umfasst die Erfindung ein Verfahren zum Spalten eines menschlichen Papillomavirus mittels eines Ribozyms. Das Verfahren enthält die folgenden Schritte:
das Identifizieren einer Spaltstelle auf dem Genom des Virus;
das Bestimmen der Sequenz auf beiden Seiten der Spaltstelle;
das Aufbauen eines synthetischen Haarnadel – Ribozyms, wobei eine Bindungsstelle auf dem synthetischen Ribozym eine Sequenz enthält, welche nicht komplementär zu der Spaltstelle ist, und einen Bindungsbereich enthält, welcher komplementär zu den Sequenzen auf beiden Seiten der Spaltstelle ist; und
das Liefern des synthetischen Haarnadel – Ribozyms an das virale Genom, wodurch es dem Ribozym ermöglicht wird, das virale Genom zu spalten.
Nach diesem Aspekt der Erfindung kann der Schritt des Lieferns in vitro durchgeführt werden. Alternativ kann der Schritt des Lieferns in vivo durchgeführt werden. Der Schritt des Aufbauens eines synthetischen Haarnadel – Ribozyms kann auch weiterhin das Miteinbinden der Tetraschleife der Sequenz SEQ ID NO: 5 in das Ribozym umfassen.
Nach einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung umfasst die Erfindung ein Verfahren zum Aufspüren eines menschlichen Papillomavirus-16 (HPV-16) in einem menschlichen Gewebe. Dieses Verfahren umfasst die folgenden Schritte:
ein Gewinnen einer Probe aus einem menschlichen Gewebe, welches RNA enthält;
ein Aussetzen der RNA in dem menschlichem Gewebe gegenüber einem Ribozym, welches sich an eine Nukleotidsequenz von HPV-16 RNA derart bindet, dass eine in der Probe vorhandene HPV-16 RNA durch jenes Ribozym gespalten wird;
ein Verstärken der cDNA unter Einsatz von Primern, welche komplementär sind zu: einem 5' Ende einer vollständigen Länge eines HPV-16 – Transkripts, einem Fragment 5' der Ribozym – Spaltstelle der vollständigen Länge eines HPV-16 – Transkripts, und einem Fragment 3' der Ribozym – Spaltstelle der vollständigen Länge eines HPV-16 – Transkripts; und
ein Identifizieren der verstärkten DNA Fragmente.
Bei dem vorangehenden Verfahren stellt ein größeres DNA Fragment eine vollständige Länge eines HPV-16 Transkripts dar und ein kleineres DNA Fragment stellt dasjenige Fragment dar, das sich aus der Ribozym – Spaltung eines HPV Transkripts mit der vollständigen Länge ergibt. Wenn HPV-16 RNA in der Probe vorhanden ist, dann wird eine Überlegenheit des kleineren Fragments relativ zu dem größeren Fragment identifiziert. Bei einer Ausführung stellt das durch das von dem Ribozym gespaltene HPV-16 RNA ein E6 Transkript von HPV-16 dar. Das in diesem Verfahren verwendete Ribozym ist vorzugsweise ein RHPV434 und das menschliche Gewebe ist eine Probe aus einem Cervixgewebe. Das Verfahren kann zusätzlich den Schritt aufweisen, der in der Erzeugung von cDNA besteht, und zwar aus der in der Probe, anschließend an den Schritt des Aussetzens und vor dem Schritt des Verstärkens, vorhandenen RNA.,
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung umfasst ein Verfahren zur Behandlung eines Cervixkarzinoms, welches die folgenden Schritte umfasst:
ein Aufbauen eines synthetischen Ribozyms, welches einen Haarnadelabschnitt, eine Bindungsstelle zur Bindung an eine Nukleotidsequenz eines menschlichen Papillomavirus und eine Spaltstelle zum Spalten der Sequenz enthält, wobei die Spaltstelle ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus einer Stelle nach der Basis 434 der Sequenz; und
ein Übergeben einer wirksamen Menge des synthetischen Ribozyms an das Cervixgewebe.
Bei diesem Verfahren kann der Schritt des Übergebens das Suspendieren des synthetischen Ribozyms in einem auf einem Lipofektin beruhenden liposomalen Verabreichungssystem umfassen. Zusätzlich kann dieses Verfahren weiterhin den Schritt umfassen, zusätzliche Stoffe in Verbindung mit dem synthetischen Ribozym zu verabreichen, wie etwa immunologische Mittel oder chemotherapeutische Mittel. Vorzugsweise sind die immunologischen Zusatzstoffe LAK Zellen und das verwendete chemotherapeutische Mittel ist Cisplatin.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Andere Vorteile der vorliegenden Erfindung werden leicht anerkannt werden, weil dieselben besser verstanden werden unter Bezugnahme auf die folgende detaillierte Beschreibung, wenn man diese in Verbindung mit den begleitenden Zeichnungen betrachtet.
1 ist ein Diagramm der HPV Zielstellen und zeigt den Ort der durch das Haarnadel – Ribozym für die Spaltung ausgewählten Zielstellen, die Überlappungen in den Zielstellen der mRNA für beide Bereiche, sowohl für den E6 als auch für den E7 Bereich des HPV16, und den Punkt der Spaltung dieser Zielstelle durch das Haarnadel – Ribozym, welcher auftritt bei dem "*" nach dem Nukleotid 434 und dem Nukleotid 419.
2 ist ein Diagramm des Haarnadel – Ribozyms mit einer optimierten Helix 1, welche 8 bp umfasst, dazu entworfen HPV-16 nach der Position 434 zu spalten, und sie zeigt die Sequenzen des optimierten Ribozyms (RHPV) und des Substrats (SHPV), sowie die Bereiche der Basispaarung zwischen dem Zielsubstrat und dem Ribozym (gekennzeichnet als Helix 1 und Helix 2) und die Bereiche der Basispaarung, welche in dem "Haarnadel" – Abschnitt des Katalysators (gekennzeichnete als Helix 3 und Helix 4) erforderlich sind.
3 ist ein Autoradiogramm der Ergebnisse der Spaltung der HPV Substrate nach der 434 Stelle mit Hilfe der vorliegenden Erfindung mittels der Helix 1, welche Längen von 7 bp, 8 bp und 9 bp ausweist, wie gezeigt wurde; die Referenzkontrollen waren das Ribozym R53 und das Substrat S17 (Linien 1 und 2), die Reaktion wurde bei 37°C mit 25 nM Ribozym und 50 nM Substrat während einer Zeitdauer von 60 Minuten durchgeführt, und die Referenzreaktion war eine natürliche (–)sTRSV Sequenz S17/R53 bei 10 nM und 100 nM während der gezeigten Zeiten (Hampel und Tritz, 1989, Biochem. 28: 4929–4933).
4 illustriert die Ergebnisse eines Zeitverlaufs für die Spaltung durch RHPV434 und sie zeigt: (4A) ein Autoradiogramm der Spaltung an einem jeden Zeitpunkt, und (4B) eine grafische Kurvendarstellung der Ergebnisse von 4A, wobei die Spaltbedingungen dieselben waren wie in 3 unter Einsatz von [R] = 25 nM und [S] = 100 nM für die gezeigten Zeiten.
5 illustriert die kinetische Analyse der Spaltung durch RHPV434 und sie zeigt: (5A) eine grafische Kurvendarstellung der Ergebnisse von 4B, und (5B) ein Autoradiogramm der Spaltungsergebnisse nach 10 Minuten bei jeder Konzentration von [S] mit Spaltbedingungen wie in 3 unter Einsatz von [R] = 20 nM und [S] von 400 nM (Linie 1), 200 nM (Linie 2), 150 nM (Linie 3), 100 nM (Linie 4), 75 nM (Linie 5), 50 nM (Linie 6) und 25 nM (Linie 7)
6 zeigt in einem Diagramm den Bereich des Polylinkers, welcher in das pBluescript KS geklont wurde, um das Plasmid pBKS LNKR zu ergeben.
7 ist ein Diagramm des Plasmids ptV1, welches den tRNA^val Promotor enthält, dessen Bereich strangaufwärts, dessen Tetraschleifenvariante und polyT Endsequenz. Dies wurde hergestellt durch Klonen des tRNA^val Promotors und dessen Bereich strangaufwärts in den pBKS LNKR.
8 zeigt die DNA-Sequenz (SEQ ID NO: 19) des Plasmids ptV1, einschließlich des Polylinkers, des tRNA^val Promotors, des Bereichs strangaufwärts, der Tetraschleife, des Endbereiches; neue Ribozyme können in die Xhol/Mlul Stellen geklont werden.
9 ist ein Diagramm des Plasmids pBtV1-434, welches das RHPV434 Ribozym in dem Plasmid ptV1 enthält.
10 zeigt die DNA-Sequenz (SEQ ID NO: 20) des Polylinkers und des Ribozyms in dem Plasmid pBtV1-434.
11 ist ein Diagramm des Plasmids pZIPV1-434 (syn), welches das RHPV434 Ribozym in der "syn" Orientierung enthält, in welcher die Transkription dieselbe Richtung aufweist wie diejenige des retroviralen Genoms in dem retroviralen Vektor.
12 zeigt die DNA-Sequenz (SEQ ID NO: 21) der Verabreichungskassette und des Ribozyms in dem Plasmid pZIPV1-434 (syn).
13 ist ein Diagramm des Plasmids pZIPV1-434(anti), welches das RHPV434 Ribozym in der "anti" Orientierung enthält, in welcher die Transkription in die entgegengesetzte Richtung zeigt wie diejenige des retroviralen Genoms in dem retroviralen Vektor.
14 zeigt die DNA-Sequenz (SEQ ID NO: 22) des Polylinkers und des Ribozyms in dem Plasmid pZIPV1-434 (anti).
15 ist ein Diagramm des Plasmids pBtV1-434(i), welches die katalytisch inaktive in das ptV1 geklonte Mutante des RHPV434 Ribozyms enthält.
16 zeigt die DNA-Sequenz (SEQ ID NO: 23) der Verabreichungskassette und des Ribozyms in dem Plasmid pBtV1-434 (i).
17 zeigt die Expression des HPV spezifischen Ribozyms in transformierte, menschliche CXT1 Karzinomzellen, wie sie durch einen RNase Schutz von Transkripten untersucht worden sind; dabei weist der Pfeil hin auf die erwartete Größe des geschützten Ribozym Transkriptes von dem poIIII Promotor, 160 nt.
18 zeigt die Expression des HPV E6 Transkriptes in CXT1 Zellen, welche das Haarnadel – Ribozym enthalten, so es wie durch das RT- und PCR-Verfahren untersucht worden ist.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Ein Haarnadel – Ribozym, welches eine Modifikation einer Tetraschleife umfasst, wurde entworfen, getestet und es zeigte sich, dass es eine spezifische Sequenz in dem primären Transkript von dem menschlichen Papillomavirus Typ 16 spaltet. Die Spaltstellen folgten unmittelbar dem Nukleotid 434 in der Sequenz dieses Virus. Eine Optimierung des Ribozyms wurde ausgeführt, was zeigte, dass eine 8 nt Helix 1 optimal war für die 434 Stelle. Der Zeitverlauf der Reaktion zeigte eine fast vollständige Spaltung des Substrats.
Die kinetischen Parameter für die 434 Stelle wurden gemessen unter Verwendung einer kinetischen Standard Michaelis Enzymanalyse. Der Km Wert für dies Reaktion betrug 21 nM, was eine sehr feste Bindung des Ribozyms und des Substrats zeigt. Die kcat oder die Wechselzahl betrug 0,083 min^–1, um eine gesamte katalytische Wirksamkeit (kcat/Km) von 4 μM^–1 min^–1 zu erzielen.
Die optimierten Zielstellen sind in der 1 gezeigt. Die Spaltung trat ein nach der Basis 434 bzw. nach der Basis 419 und vor der GUC Sequenz, welche so gezeigt wird wie sie in dem Diagramm gekennzeichnet ist. Diese vollständige Zielsequenz ist ein Teil des primären Transkriptes (SEQ ID NO: 1) für die E6 und E7 Bereiche des HPV16 (Nasseri, 1991, Virol. 194: 136; Smotkin and Wettstein, 1989, J. Virol. 63: 1441: 1447). Die Capstelle für diese mRNA ist auf nt 97. Eine Spleiß-Donorstelle existiert bei nt 226 und zwei Spleiß-Akzeptorstellen bestehen bei nt 409 und nt 526. Als ein Ergebnis können drei verschiedene E6–E7 mRNAs erzeugt werden: E6E7, E6: (I)E7 und E6(II)E7. E6E7 ist das Ergebnis des E6E7 Transkripts mit der vollständigen Länge, in welchem die Spleiß-Donorstelle an nt 26 nicht gebraucht wird. In E6E7 tritt ein Translationsende von E6 bei nt 557 auf. E6(I)E7, das größere Transkript, ist das Ergebnis der Verwendung des Spleiß-Donors an nt 226 und des Spleiß-Akzeptors an nt 409, und das Signal des Translationsendes von E6(I) ist bei nt 415. Dies ergibt einen verkürzten E6 Kodierungsabschnitt und einen E7 Abschnitt mit vollständiger Länge. E6(II)E7, das kleinere Transkript, ist das Ergebnis der Verwendung des Spleiß-Donors an nt 226 und des Spleiß-Akzeptors an nt 526, und das Signal des Translationsendes von E6(II) ist bei nt 541, um einen verkürzten E6 Kodierungsabschnitt und einen E7 Abschnitt mit vollständiger Länge zu ergeben (Nasserie, 1991, Virol. 194: 136).
Ein RNA Katalysator (Ribozym) ist identifiziert worden, welcher eine RNA Sequenz enthält, welche mit großer Präzision ein HPV spalten kann. Die Zielsequenzen für die Spaltung durch die Ribozyme sind in dem primären Transkript E6E7 vorhanden und in dem größeren Transkript E6(I)E7. Die Spaltung dieser Transkripte würde die Wirkung haben, die Produktion von E6 und E7 Proteinen mit vollständiger Länge abzusenken, von denen beide eine Schlüsselrolle bei der Keratinocyt-(Hornzellen-)Transformation (Sedman, et al., 1991, J. Virol. 65: 4860–4866) spielen.
Das Haarnadel – Ribozym (Hampel, et al., 1990, Nuc. Acids Res. 18: 299–304), welches so ausgelegt ist, um nach der 434 Stelle in HPV zu spalten, wird in 2 gezeigt und ist als RHPV434 bezeichnet. In der bevorzugten Ausführung weist dieses Haarnadel – Ribozym die Modifikation der Tetraschleife auf, so wie dies gezeigt worden ist (Anderson, et al., 1994 Nuc. Acids Res. 22: 1096–1100). Die GW Sequenz der Schleife 3 der Basisstruktur ist durch eine Tetraschleifensequenz GGAC (UUCG) GUCC ersetzt worden, von welcher in der vorliegenden Erfindung gezeigt worden ist, dass sie eine sehr stabile Struktur mit einer hohen katalytischen Effizienz erzeugen kann. Insbesondere umfasst die Erfindung bestimmte synthetische RNA Katalysatoren, welche zum Spalten eines RNA Substrats fähig sind, welches die Zielsequenzen enthält:
430-ACUG U*GUC CUGAAGA-444 (SEQ ID NO: 2),
430-ACUG-U*GUC CUGAAGAA-445 (SEQ ID NO: 3),
430-ACUG U*GUC CUGAAGAAA-446 (SEQ ID NO: 4).
"Synthetischer RNA Katalysator", so wie der Begriff hier verwendet wird, bedeutet einen Katalysator (Ribozym), welcher kein natürlich vorkommender RNA Katalysator ist, obwohl "synthetische Katalysatoren" verkürzte oder veränderte Versionen natürlich vorkommender Katalysatoren sein können. "Synthetischer Katalysator" schließt Katalysatoren mit ein, welche in vitro synthetisiert worden sind und Katalysatoren, welche in vivo synthetisiert worden sind. Insbesondere können "synthetische Katalysatoren" Katalysatoren mit einschließen, welche durch Wirte erzeugt worden sind, die durch einen Vektor transformiert worden sind, welcher eine Kodierungssequenz für den Katalysator enthält.
Eine RNA von irgendeiner Länge und von irgendeinem Typ kann als das Substrat verwendet werden, so lange wie sie die Zielsequenz enthält, welche durch die Formel 5'-F₁-CS-F₂-3' dargestellt ist. In dieser Formel ist CS die Spaltungssequenz, d. h. eine Sequenz von Basen, welche die Stelle enthalten, an welcher der Katalysator das Substrat spaltet. CS ist ein kurze Sequenz von Basen, welche keine Basispaarung mit dem Ribozym eingeht, und in der vorliegenden Erfindung hat CS vorzugsweise die Sequenz 5''-NGUC-3', wobei N irgendeine Basis ist, und das Substrat wird durch das Ribozym zwischen N und G gespalten, um ein Fragment zu erzeugen, welches ein OH an dem 5' Ende aufweist, und ein Fragment mit einem 2', 3' zyklischen Phosphat an dem 3' Ende.
CS wird flankiert durch zwei kurze Basissequenzen F₁ und F₂, welche eine Basispaarung mit dem RNA Katalysator eingehen. F₁ weist vorzugsweise mindestens 3 Basen in der Länge auf, mit dem größten Vorzug 4 Basen in der Länge. F₂ weist auch vorzugsweise mindestens drei Basen in der Länge auf, mit dem größten Vorzug 6 bis 12 Basen in der Länge.
Ribozyme gemäß der vorliegenden Erfindung enthalten auch einen ein Substrat bindenden Abschnitt und einen " Haarnadel" – Abschnitt. Der das Substrat bindende Abschnitt des Katalysators wird durch die folgende Formel dargestellt: 3'F₄-L₁-F₃-5', wobei
F₃ eine Sequenz von Basen ist, die so ausgewählt sind, dass F₃ im Wesentlichen eine Basenpaarung mit F₂ eingeht (Helix 1, 2 und 6), wenn der Katalysator an das Substrat gebunden ist;
F₄ eine Sequenz von Basen ist, die so ausgewählt sind, dass F₄ im Wesentlichen eine Basenpaarung mit F₁ eingeht, wenn der Katalysator an das Substrat gebunden ist (Helix 2, 2);
Die Sequenzen von F₃ und F₄ sind so ausgewählt, dass eine jede eine adäquate Anzahl von Basen enthält, um eine ausreichend große Bindung des RNA Substrats an den RNA Katalysator zu erzielen, so dass die Spaltung des Substrats stattfinden kann; und
L₁ ist eine Sequenz von Basen, die so ausgewählt sind, dass L₁ keine Basenpaarung mit CS eingeht, wenn der Katalysator an das Substrat gebunden ist (Schleife 1, 2).
So wie der Ausdruck hier verwendet wird, bedeutet "im Wesentlichen eine Basenpaarung eingegangen", dass mehr als 65% der Basen der zwei in Frage kommenden RNA Sequenzen eine Basenpaarung eingegangen sind, und dass vorzugsweise mehr als 75% der Basen eine Basenpaarung eingegangen sind. "Im Wesentlichen ungepaart" bedeutet, das mehr als 65% der Basen der zwei in Frage kommenden Sequenzen keine Basenpaarung eingegangen sind, und dass vorzugsweise mehr als 75% der Basen keine Basenpaarung eingegangen sind.
F₃ weist vorzugsweise mindestens 3 Basen, und mit dem größten Vorzug von 6 bis 12 Basen in der Länge auf. F₄ weist vorzugsweise von 3 bis 5 Basen, und mit dem größten Vorzug 4 Basen in der Länge auf.
L₁ ist eine kurze Sequenz von Basen, welche vorzugsweise die Sequenz 5'-AGAA-3' aufweisen, wenn CS die Sequenz 5'-NGUC-3' hat. Weiterhin, wenn L₁ 5'-AGAA-3' und CS 5'-NGUC-3' ist, dann ist das erste Basenpaar zwischen F₁ und F₄ benachbart zu CS und zu L₁ vorzugsweise G : C oder C : G (2). Gemäß der vorliegenden Erfindung enthält eine bevorzugte Zielsequenz in einem ausgewählten Substrat die Sequenz 5'-BNGUC-3', wobei B ist G, C oder U (Anderson, et al., Nuc. Acids Res. 22: 1096–1100).
Der "Haarnadel" – Abschnitt ist ein Abschnitt des Katalysators, welcher in eine haarnadelähnliche Konfiguration faltet, wenn der Substrat – Katalysator Komplex in zwei Dimensionen modelliert wird für eine Faltung in einen Zustand minimaler Energie. Dies ist in der 2 gezeigt. Der "Haarnadel" – Abschnitt ist keine absolute Haarnadel in dem Sinne, dass nicht alle Basen des "Haarnadel" – Abschnittes eine Basenpaarung eingegangen sind. Tatsächlich ist es notwendig für den "Haarnadel" – Abschnitt, mindestens einen im Wesentlichen ungepaarten Bereich zu haben, so dass der Katalysator eine tertiäre Struktur einnehmen kann, welche eine bessere oder eine optimale, katalytische Wirkung erlaubt.
Der "Haarnadel" – Abschnitt des Katalysators weist vorzugsweise die Sequenz auf:
wobei
P₁ und P₄ Basensequenzen sind, welche so ausgewählt sind, dass P₁ und P₄ im Wesentlichen eine Basenpaarung eingegangen sind (Helix 3, 2 und 6).
P₁ kovalent an F₄ gebunden ist;
S₁ und S₂ Sequenzen sind, welche so ausgewählt sind, dass S₁ (Schleife 2) und S₂ (Schleife 4) im Wesentlichen ungepaart sind;
P₂ und P₃ Basensequenzen sind, welche so ausgewählt sind, dass P₂ und P₃ im Wesentlichen eine Basenpaarung eingegangen sind (Helix 4, 2 und 6); und
L₂ eine Sequenz ungepaarter Basen ist (Schleife 3).
"Im Wesentlichen eine Basenpaarung eingegangen" und "im Wesentlichen ungepaart" haben dieselben Bedeutungen wie oben diskutiert.
P₁ und P₄ weisen beide jeweils vorzugsweise eine Anzahl von 3 bis 6 Basen in der Länge auf, und mit dem größten Vorzug weist P₁ die Sequenz 5'-ACCAG-3' auf und P₄ die Sequenz 5'-CUGGUA-3'. Man hat herausgefunden, dass das A an dem 5' Ende von 5'-ACCAG-3' (unterstrichen) nicht basengepaart ist mit dem U an dem 3' Ende von 5'-CUGGUA-3' (unterstrichen) und dass das ungepaarte A als ein "Gelenk" wirken kann (2).
S₁ und S₂ weisen beide jeweils vorzugsweise von 4 bis 9 Basen in der Länge auf, und mit dem größten Vorzug weist S₁ die Sequenz 5'-AGAAACA-3' auf und S₂ die Sequenz 5'-GUAUAUUAC-3'.
In unerwarteter Weise fand man heraus, dass das Haarnadel – Ribozym, so wie es für eine HIV Zielsequenz aufgebaut worden ist (Ojwang, et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 10802–10806) nicht so wirksam war wie ein Haarnadel – Ribozym, welches mit einer "Tetraschleifen" – Veränderung aufgebaut worden ist.
Nach dem Stand der Technik weist die bevorzugte Sequenz P₂ die Sequenz 5'-CAC-3' auf, P₃ die Sequenz 5'-GUG-3' und L₂ die Sequenz 5'-GW-3' (Ojwang, et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 10802–10806).
In der bevorzugten Ausführung der vorliegenden Erfindung sind L₂, P₂, P₃ (2, Schleife 3, Helix 4) so aufgebaut, um die stabile RNA Haarnadel – Sequenz mit einzuschließen.
5'-GGAC UUCG GUCC-3' (SEQ ID NO: 5) führt in die "Tetraschleifen" – Veränderung. Als ein Ergebnis ist Helix 4 um vier Basenpaare erweitert gegenüber der hier oben aufgelisteten Sequenz nach dem Stand der Technik. Weiterhin ist die GUU Sequenz der Schleife 3 ausgetauscht mit der Sequenz UUCG. Das sich daraus ergebende Ribozym ist aktiver und thermisch stabiler als das nicht modifizierte Ribozym.
Die Struktur der vorliegenden Erfindung, so wie sie in der 2 für RHVP434 gezeigt und hier oben beschrieben worden ist, kann in der Form eines Diagramms durch die folgende Formel dargestellt werden:
Die vollständige Sequenz des Ribozyms entsprechend der bevorzugten. Ausführung nach der hier vorliegenden Erfindung zeigt sich wie folgt 5'-UUCUUCAGAGAACAGUACCAGAGAAACACACGGACUUCGUCCGUGGUAUAUUACCUGGUA -3' (SEQ ID NO: 6).
Das Ribozym der vorliegenden Erfindung, welches die RNA des HPV spaltet, kann als ein therapeutischer Wirkstoff bei der Behandlung von HPV Infektionen verwendet werden, welche im Zusammenhang stehen mit Genitalwarzen und genitalen Neoplasmen.
In der bevorzugten Ausführung gibt es zwei Verfahren zur Verabreichung des therapeutischen Wirkstoffes: Gentherapie und eine Modifikation der Antisense Methodologie. Der in der vorliegenden Erfindung verwendete therapeutische Wirkstoff wird in Verbindung mit anderen Arzneimitteln oder einzeln verabreicht, entsprechend in Übereinstimmung mit der guten medizinischen Praxis. Die Zusammensetzung wird verabreicht und dosiert gemäß der guten medizinischen Praxis, wobei der klinische Zustand des einzelnen Patienten, die Stelle und das Verfahren der Verabreichung, die Festlegung des Verabreichungsplanes und andere Faktoren zu berücksichtigen sind, welche den medizinischen Praktikern bekannt sind. Die "wirksame Menge" für Zwecke hierfür wird somit durch solche Überlegungen bestimmt, wie sie nach dem Stand der Technik bekannt sind.
HUMANE GENTHERAPIE
Die Kodierungssequenz für das HPV16 spezifische Ribozym wird in einen Vektor geklont, so wie es hierin beschrieben worden ist, und in der humanen Gentherapie verwendet wird (Mulligan, 1993, Science 260: 926–932). In einer Ausführung wurde ein U6 Promotor in den Vektor geklont und unmittelbar vor dem Kodierungsbereich des Ribozyms positioniert. Der U6 Promotor ist ein eukaryontischer pol III Promotor, welcher fähig ist, die Transkription des Ribozyms unter Verwendung der RNA Polymerase II der Wirtzelle anzutreiben (Das, 1988, EMBO J. 7(2): 503–512). Die Verwendung eines retroviralen Vektors zum Tragen und Transportieren des kodierten Ribozyms hilft bei der Integration der Kodierungssequenz des Ribozyms innerhalb der Genom DNA der Zelle, womit eine langfristige Produktion des Anti-HPV16 Ribozyms innerhalb der Zelle geliefert wird (Chatterjee und Wong, 1993, Methods: Companion to Methods in Enzymology 5(1): 51–59).
Um den das Ribozym kodierenden Vektor an die Zielstellen zu übergeben, wird ein auf einer Lipofektion beruhendes liposomales Verabreichungssystem eingesetzt. Der Einsatz von Liposomen hilft dabei, die Vektor-Ribozym-DNA zu der Zelle zu bringen, ohne dass sie dabei verschlechtert (degradiert) wird, weil die Liposomen als eine Schutzbarriere vor den Nukleasen wirken (Sullivan, 1993, Methods: Companion to Methods in Enzymology, 5(1): 61–66). Die Zellen nehmen die den Vektor enthaltenden Liposomen über den natürlich auftretenden Prozess der Endozytose auf. Der Vorteil der Verwendung des Lipofektion Reagens besteht darin, dass es dem Liposom, wenn es erst einmal in der Zelle aufgenommen worden ist, erlaubt, einen Abbau (Degradierung) durch lyposomale Enzyme, was das normale Schicksal von endozytischem Material ist, zu umgehen (Felgner, et al., 1993, Methods: Companion to Methods in Enzymology, 5(1): 67–75). In einer bevorzugten Ausführung werden Ribozyme, welche entweder gegen einen von den beiden Stoffen oder gegen beide von E6 und E7 gerichtet sind, in Verbindung mit immunologischen Wirkstoffen wie etwa LAK Zellen oder chemotherapeutischen Wirkstoffen wie etwa Cisplatin, welches Anwendung beim Cervixkarzinom findet, verabreicht. Die Übergabe eines Ribozyms an den Cervixbereich kann durch eine Tinktur oder durch eine Injektion erfolgen.
Zusätzlich zu dem oben beschriebenen Vektor können andere Vektoren für die Übergabe des HPV spezifischen Ribozyms in der Gentherapie verwendet werden. Solche Vektoren werden in größeren Einzelheiten unten beschrieben.
Die verwendeten Verfahren und die Nützlichkeit der vorliegenden Erfindung können weiter durch die folgenden Beispiele gezeigt werden.
MATERIALIEN UND VERFAHREN
Enzyme und Chemikalien. Alle verwendeten Restriktionsenzyme kamen entweder von den Bethesda Research Laboratories (BRL) oder von Boehringer Mannheim Biochemicals. Die Puffer für die Restriktionsenzyme wurden von dem Hersteller geliefert. T4 DNA Ligase und die Testausrüstung für die Sequenzierung wurden von Pharmacia bezogen. Die Testausrüstung für die in vitro Transkription und die relevanten Enzyme wurden von Promega bezogen. Das Rinderkalbserum, die Antibiotika (Penicillin und Streptomycin), L-Glutamin, Natriumpyruvat, durch Phosphat gepuffertes Salz (PBS = Phosphate Buffered Saline) und Dulbecco modifiziertes Eagle Medium (DMEM) wurden von GIBCO eingekauft.
Die eingesetzte T7 RNA Polymerase wurde von US Biochemicals (USB) hergestellt. Mit der Ausnahme von T7 RNA Polymerase wurden die Puffer für die verwendeten Enzyme von dem Hersteller geliefert. Der T7 RNA Polymerase Transkriptionspuffer bestand aus dem Folgenden: 40 mM Tris pH 8,0, 6 mM MgCl₂, 5 mM DTT, 1 mM Spermidin, 1% Triton-X 100. Die für in vitro Transkriptionen und für das Klonen verwendeten synthetischen DNA Matrizen wurden hergestellt unter Verwendung eines Applied Biosystems 392 DNA Synthesizers.
Rekombinante DNA Techniken. Sofern nicht anderweitig vermerkt, wurden die Techniken so durchgeführt, wie sie in Sambroock et al. beschrieben sind (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed.), Sections 1.25–1.28, 160–1.61, 1.68–1.69, 1.82–1.84, 6.9–6.13, 6.46–6.48), dessen vollständige Offenbarung hierin durch Referenz mit eingeschlossen ist.
Spaltung der HPV Substrate. Die Spaltung wurde ausgeführt in 12 mM MgCl₂, 2 mM Spermidin und 40 mM Tris, pH 7,5 unter Verwendung von früher veröffentlichten Verfahren (Hampel und Tritz, 1989, Biochem. 28: 4929–4933). Alle Reaktionen wurden ausgeführt bei 37°C mit 25 nM Ribozym und 50 nM Substrat während einer Zeitdauer von 60 Minuten, sofern nicht anderweitig angezeigt. Die Referenzreaktion war eine native (–)s TRSV Sequenz S17/R53 bei 10 nM und 100 nM während der gezeigten Zeitdauern (Hampel und Tritz, 1989, Biochem. 28: 4929–4933).
P³² Kennzeichnung. Substrate und Ribozyme wurden gekennzeichnet mit einem P³²-CTP durch Transkription aus synthetischen DNA Matrizen unter Verwendung von T7 RNA Polymerase, so wie es früher beschrieben worden ist (Hampel und Tritz, 1989, Biochem. 28: 4929–4933), und die Reaktionsprodukte wurden getrennt auf 15–18% Polyacrylamid Gele in 7M Urea.
Aufbau des Ribozyms. Das Ribozym wurde aufgebaut mittels einer T7 Transkription aus komplementären, synthetischen DNA Matrizen. Dies wurde ausgeführt, so wie es früher beschrieben worden ist (Hampel und Tritz, 1989, Biochem. 28: 4929–4933).
Aufbau der Plasmide und Vektoren, welche RHPV enthalten. Codierte und nicht codierte Stränge für RHPV wurden synthetisiert und mit HPLC gereinigt. Die Stränge schlossen in die EcoR1 Stelle mit ein den Codierungsbereich des Ribozyms, ein poly-T Abschlusssignal für die RNA Polymerase III und eine BamHI Stelle. Die zwei Stränge wurden dann erwärmt durch eine Hinzugabe einer gleichen Molmenge von einem jeden und durch ein Inkubieren in H₂O bei 90°C während einer Zeitdauer von 5 Minuten, dann wurde den Strängen erlaubt, sich langsam auf Raumtemperatur abzukühlen während einer Zeitdauer von über 30 Minuten. Das sich daraus ergebende Doppelstrangfragment wurde zerlegt mit EcoR1 und BamHI. Die Zerlegungsprodukte wurden auf ein Agarosegel geschickt und der Codierungsbereich des Ribozyms wurde isoliert und gereinigt.
Das Plasmid pHC (Altschulder, 1992, Gene, 122: 85–90) wurde zerlegt mit EcoR1 und BamHI und das Fragment wurde isoliert und gereinigt wie oben. Das RHPV434 oder RHVP419 Fragment wurde dann ligiert und die Mischung der Ligation wurde verwendet, um kompetente DH5α Bakterienzellen zu transformieren. Einzelne Kolonien wurden ausgewählt und in einem bakteriellen so genannten CircleGrow Medium aufgewachsen und gezüchtet, und die Plasmide wurden extrahiert und gereinigt unter Verwendung eines Standard Miniprep Protokolls (Sambroock et al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed.), Sections 1.25–1.28, 160–1.61, 1.68–1.69, 1.82–1.84, 6.9–6.13, 6.46–6.48). Die Plasmide wurden gescreent für die Einbindung des RHPV434 oder RHVP419 Inserts. Eine Kolonie, welche die Einfügung einband, wurde dann sequenziert unter Verwendung der Sequenase Version 2.0 Enzyme und des Sequenase Version 2.0 Protokolls, um die geeignete DNA-Sequenz zu verifizieren. Das resultierende Plasmid wurde als pHC-434 bzw. als pHC-419 bezeichnet.
Die Ribozyme werden in einen auf einem Moloney Retrovirus basierenden Expressionsvektor geklont für einen in vivo Test in menschlichen Zellen, welche mit dem HVP-16 transformiert worden sind. Das Verfahrensschema des Klonens läuft wie folgt ab. Die Ribozymoligos werden synthetisiert mit einem Pol III Abschlusssignal und mit EcoR1/BamH1 Enden. Diese werden dann in pHC geklont (Altschuler, 1992, Gene, 122: 85–90), der bakterielle Standardexpressionsvektor, welcher in einer bevorzugten Ausführung verwendet wird. Das Ribozym wird mit EcoR1 HindIII herausgeschnitten und in pU6 geklont, was ein Bluescript Vektor ist, welcher einen Maus U6 Promotor enthält (Das, 1988, EMBO J. 7(2): 503–512). Die Einfügung, welche den U6 Promotor enthält, wird dann in die BamH1 Stelle des pZIP-NeoSV(X) geklont (Cepko, et al., 1984, Cell 37: 1053–1062).
pHC-434 und pMU6, ein Plasmid, welches einen RNA Polymerase III Promotorbereich enthält (Das, 1988, EMBO J. 7(2): 503–512), wurde zerlegt mit EcoR1 und HindIII. Das RHPV434 Fragment, welches den Haarnadel – Kassettenbereich behält, und das pMU6 Fragment wurden isoliert und gereinigt wie oben beschrieben. Die Ligation und die bakterielle Transformation der zwei Fragmente wurde wie oben beschrieben ausgeführt. Kolonien wurden gescreent (durchgemustert) und sequenziert wie oben beschrieben. Das resultierende Plasmid wurde bezeichnet mit pMU6-434.
Screening der HPV Sequenz (SEQ ID No: 1) für die Spaltstelle. Die HPV16 Sequenzdaten wurden durch eine Genbank gewonnen. HPV16 E6 und E7 Bereiche wurden hinsichtlich potentieller Zielsequenzen überprüft wie oben beschrieben. Alle potentiellen Stellen, welche potentielle Zielsequenzen enthielten, wurden getestet, und Ribozyme, welche eine deutliche katalytische Aktivität zeigten, wurden weiter entwickelt. RHPV434 und RHVP419 sind Beispiele von Ribozymen, welche eine deutliche katalytische Aktivität zeigten.
Die allgemeinen Prinzipien der vorliegenden Erfindung können mehr anerkannt werden durch die Bezugnahme auf die folgenden, nicht beschränkenden Beispiele.
Beispiel 1
In der bevorzugten Ausführung der vorliegenden Erfindung werden, wie in der 2 gezeigt ist, die Schleife 3 und die Helix 4 so aufgebaut, um die stabile RNA Haarnadel – Sequenz mit einzuschließen.
5'-GGAC UUCG GUCC-3' (SEQ ID No: 5) führt zu der "Tetraschleifen" – Veränderung (Cheong, et al., 1990, Nature, 346: 680–682; Varani, et al., 1991, Biochem. 30: 3280–89). Als ein Ergebnis wird die Helix 4 um vier Basenpaare über die nicht veränderte Sequenz erweitert. Weiterhin wird die GUU Sequenz der Schleife 3 mit der Sequenz UUCG ausgetauscht.
Um die Aktivität des Ribozyms zu bestimmen, wird es zu einem Substrat RNA in einem Verhältnis von 1 : 30 hinzugefügt und der Zeitverlauf der untersuchten Spaltung wird als Parameter variiert. Die Reaktion wird durchgeführt in 12 mM MgCl₂, 40 mM Tris, pH 7,5 und 2 mM Spermidin während einer Zeitdauer von über 150 Minuten. Für die Temperaturabhängigkeit wird die Geschwindigkeit der Spaltung eines Ribozyms, welches die Tetraschleifen – Veränderung enthält, über einen Temperaturbereich getestet und mit einer Kontrollreaktion bei 37°C verglichen. Die Reaktionsprodukte werden analysiert auf Polyacrylamid/Urea Gele. Die Bänder werden herausgeschnitten und in einem Flüssigszintillationszähler gezählt. In der Kontrollreaktion verbleiben nur 2% des Substrats nach 150 Minuten, was einen Hinweis darauf liefert, dass das Ribozym mit mehrfachen Substraten in Wechselwirkung treten muss während des Verlaufs der Reaktion, da 30-mal soviel Substrat wie Ribozym vorhanden waren. Weiterhin verbleibt die Menge an Ribozym dieselbe und unverändert wie man es von einem Katalysator erwartet.
Bei der temperaturabhängigen Untersuchung der Tetraschleifen – Veränderung im Vergleich zu dem Stand der Technik wurde die Aktivität des Ribozyms gemessen bei 20°C, 27°C, 33°C, 37°C, 41°C und 45°C.
Die Reaktion zeigte eine Temperaturabhängigkeit ähnlich zu derjenigen, welche man von einer Reaktion erwarten würde, welche RNA Moleküle mit einbeziehen, die eine Basenpaarung eingegangen sind. Der Arrhenius Plot (grafischer Arrhenius Kurvenverlauf) der Daten ergibt ein Temperaturoptimum von 37°C für die Reaktion. Höhere Temperaturen vermindern die Reaktionsgeschwindigkeit mit einer sehr schnellen Abnahmegeschwindigkeit bei etwa 41°C, was im Einklang steht mit einem Herausschmelzen der katalytischen RNA Struktur. Bei 50°C war keine Reaktion nachweisbar. Die Reaktionsgeschwindigkeit bei Temperaturen unter 37°C zeigte eine lineare, reziproke Temperaturabhängigkeit, was im Einklang steht mit einer klassischen Erniedrigung der Aktivierungsenergie für die Reaktion. Die Steigung der Linie in dem Arrhenius Plot ergab eine Aktivierungsenergie von 19 kcal/Mol, welcher Wert nahe bei jenem Wert liegt, welcher für Katalysatoren gefunden worden ist, die auf den Hammerkopf Spaltmechanismus angepasst sind (13,1 kcal/Mol) (Uhlenbeck, 1987, Nature 328: 596–600).
Das Beispiel zeigt, dass ein Ribozym mit der Tetraschleifen – Veränderung aktiver und thermisch stabiler ist als ein Ribozym nach dem Stand der Technik. Diese Form des Ribozyms verbleibt aktiv bei 45°C, während das nicht veränderte Ribozym den größten Teil seiner Aktivität bei dieser Temperatur einbüßte.
Man schloss aus diesem Experiment, dass die Schleife 3 keine bewahrte oder Invariante Basensequenz aufweist und dass die Helix 4 in die Schleife 3 erweitert werden kann durch mindestens vier Basenpaare mit keinem Verlust an Aktivität. Die vier zusätzlichen Basenpaare in der Helix 4 liefern eine Helixstabilisierung dieses Bereiches. Die zweite Faltungsenergie der Helix 4 und der Schleife 3 in der Struktur nach dem Stand der Technik liegt bei +0,6 kcal/Mol, während die des Ribozyms mit der erweiterten Helix 4 und Schleife 3 der Sequenz UUCG (Tetraschleife) der vorliegenden Erfindung auf den Wert –11,1 kcal/Mol bestimmt wurde. Daher erhöht das Vorhandensein der der Tetraschleifen – Sequenz die Faltungsenergie um 11,7 kcal/Mol.
Beispiel 2
Die Spaltreaktion und die Optimierung der Helix 1 Länge für RHVP434. Eine Spaltuntersuchung wurde vorgenommen, um die Länge der Helix 1 zu optimieren. Die 3 zeigt Bänder auf einem denaturierten Polyacrylamid Gel, welches das Ribozym identifiziert, ein Substrat und die Spaltprodukte. Drei Substrate wurden gespalten durch das Ribozym, davon ein jedes mit einer unterschiedlichen Länge Helix 1. Die Substrate waren wie im Folgenden:
Das am wirkungsvollsten gespaltene Substrat war jenes, welches eine 8 bp Helix 1 (SEQ ID NO: 3) aufwies und welches für alle weiteren Untersuchungen verwendet wurde. Man bezeichnet es als SHPV und das entsprechende Ribozym bezeichnet man als RHPV-434 (2).
Zeitverlauf der Parameter der Spaltung. Der Zeitverlauf der Spaltung von SHPV durch RHPV-434 wurde während einer Zeitdauer von über 180 Minuten ausgeführt (4). Das Ribozym spaltete das Substrat wirksam bis zu einem Vollständigkeitsgrad von 88%.
Kinetische Parameter der Spaltung. Eine kinetische Michaelis Analyse der Reaktion wurde ausgeführt, indem man begrenzendes Ribozym und eine Überschussmenge an Substrat für eine konstante Ribozymkonzentration einsetzte und indem man die Substratkonzentrationen variierte, um Anfangsgeschwindigkeiten zu messen (5). Der K_m Wert für die Reaktion lag bei 21 nM und der k_cat Wert oder die Wechselzahl (katalytische Aktivität) betrug 0,083 min^–1. Dies ergibt eine gesamte katalytische Effizienz (kcat/kM) von 4 μM^–1 min^–1, was etwa 7% von der der original nativen Haarnadel – Sequenz sind (Hampel und Tritz, 1989, Biochem. 28: 4929–4933).
Aufbau des Vektors ptV1, welcher eine Verabreichungskassette enthält. Der Vektor ptV1 (7 und 8) wurde hergestellt durch das Klonen einer aus einem neuen Polylinker bestehenden Verabreichungskassette, eines menschlichen tRNA^val poIIII Promotors mit einem menschlichen Bereich aufwärts (Arnold, et al., 1986, Gene 44 287–297), einer Tetraschleifen – Sequenzvariante und einer Poly-T Sequenz in den Vektor pBluescript KS (von Stratagene). Der menschliche Bereich strangaufwärts ist gezeigt, z. B. in 12 (siehe auch Arnold und Gross, 1987, Gene 51: 237–246).
Die Schritte für den Aufbau des Vektors sind wie folgt. Beide Stränge eines neuen 119 nt Verbindungsbereiches (6) wurden hergestellt durch eine chemische Oligonukleotidsynthese. Dieser Verbindungsbereich enthielt verschiedene Restriktionsstellen, die oben beschriebene Tetraschleifen – Sequenz und einen Poly-T Trakt, um die poIIII Transkription zu beenden. Dies wurde in die Asp718(Kpn1)/Sac1 Stellen von pBluescript KS (Stratagene) geklont, um pBKSLNKR (nicht gezeigt) zu ergeben. Das Plasmid pHTV1 (siehe Arnold, et al., 1986, Gene 44: 287–297) enthält den menschlichen tRNA^val Promotor. Das tRNA^val Gen plus zusätzliche 50 nt einer Sequenz aufwärts wurden verstärkt durch PCR mit EcoR1/XhoI Enden. Dies wurde geklont in die entsprechenden Seiten des Linkerbereiches pBKSLNKR, um das endgültige ptV1 Konstrukt zu ergeben (7 und 8).
Die Ribozym Kodierungssequenzen können in die XhoI/MIuI Stellen von ptV1 geklont werden. Alle chemischen Synthesen von DNA Oligonukleotiden wurden durchgeführt unter Verwendung von Standardmethoden auf einem ABI 392 DNA/RNA Synthesizer (unter Verwendung der Empfehlungen des Herstellers für die Verfahren). Alle Konstruktionen der Plasmide wurden durchgeführt unter Verwendung von Standardmethoden (Sambroock et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed.)).
Die Tetraschleifenvariante an dem 3' Ende des Ribozyms hat die Sequenz CCUG(UUCG)CAGG (SEQ ID NO: 16). Diese Sequenz ist eine Variante der hoch stabilen Tetraschleifen – Sequenz GGAC(UUCG)GUCC (SEQ ID NO: 5), welche man in verschiedenen nativen RNA Sequenzen findet (Cheong, et al., 1990, Nature, 346: 680). Im Gegensatz zu der nativen Tetraschleife kehrt die Variante die zwei Sequenzen um, wobei sie die Helix relativ zu dem Original formt. Dieser Unterschied, relativ zu der nativen Tetraschleife und andere synthetische Haarnadel – Ribozymkonstrukte (Anderson, et al., 1994, Nuc. Acids Res. 22: 1096–1100), vermindert die Wahrscheinlichkeit einer Rekombination in vivo zwischen dem Konstrukt und nativen oder anderen synthetischen Sequenzen. Dieses Vektorkonstrukt hat auch den Vorteil, dass die Tetraschleifenvariante durch eine andere Tetraschleifen – Sequenz entfernt und ersetzt werden kann durch ein einfaches Zerlegen des Vektors mit Mlu1/Bstx1 und durch ein Einsetzen einer anderen Tetraschleifen – Sequenz mit den geeigneten Enden.
Das ptV1 Plasmid hat zusätzliche Vorteile, welche auf seinen Komponenten und seiner Anordnung beruht. Der poIIII Promotor gibt eine sehr hohe in vivo Transkription des Ribozyms (Yamada et al., 1994, Gene Therapy 1: 38–45). Der Bereich strangaufwärts verbessert die in vivo Transkriptionsanteile des Ribozyms (Arnold and Gross, 1987, Gene 51: 237–246). Die Tetraschleifenvariante gibt dem Ribozym eine verbesserte Stabilität, indem sie das 3" Ende vor dem Abbau durch eine 3' Exonuklease schützt. Die Poly-T Sequenz erlaubt eine wirksame Beendigung der Transkription, welche bei dem poIIII Promotor beginnt. Restriktionsstellen (XhoI/MIuI oder BGIII/MIuI) nach dem tRNA Kodierungsbereich sind geeignet für das Einfügen der Ribozym Kodierungssequenzen. Zum Beispiel kann ein BgIII Überhang zu einem BamH1 Überhang ligiert werden. Die Transkription beginnt an dem tRNA Kodierungsbereich und endet wirksam, nachdem der Poly-T Trakt in einen Poly-U Abschnitt des Ribozyms transkribiert worden ist.
Die gesamte Verabreichungskassette kann leicht von ptV1 zerlegt werden als eine Einheit und in die entsprechenden Restriktionsstellen der viralen Expressionsvektoren kloniert werden einschließlich der auf dem Moloney – Retrovirus beruhenden Vektoren, des Adenovirus, des mit dem Adenovirus zusammenhängenden Virus und dergleichen. Dieser Ansatz ist verwendet worden, um eine Reihe von Konstrukten für die Verabreichung von HPV spezifischen Ribozymen an lebende Zellen zu bauen.
Konstruktion des Vektors für die Verabreichung von menschlichen Papillomavirus spezifischen Ribozymen an menschliche Zellen. Unsere Konstrukte, welche die Verabreichungskassette, eine Haarnadel – Ribozymsequenz und einen retroviralen Vektor enthalten, sind ausgelegt worden, um spezifisch HPV Sequenzen zu spalten. Das Ribozym RHPV434 wurde ausgelegt, um die Stelle 434 in der Sequenz des menschlichen Papillomavirus HPV-16 (GenBank Zugang #K02718) zu spalten. Die 434 Stelle befindet sich in der E6/E7 Sequenz des menschlichen Papillomavirus (HPV), welche man in dem menschlichen Karzinom gefunden hat (DiPaolo, et al., 1993, Critical Reviews in Oncogenesis 4: 337–360). Der verwendete retrovirale Vektor war pZIP-NeoSV(X)1 (Cepko, et al., 1984, Cell 37: 1053–1062), was ein auf einem Moloney Retrovirus basierender Vektor ist, welcher im Bereich des humanen Gen Engineering verwendet wird (siehe zum Beispiel die 1994 RAC Anwendung von Wang-Stall).
Die DNA, welche einem HPV-16 spezifischen Haarnadel – Ribozym für die Stelle 434 in der HPV-16 Sequenz entspricht, wurde synthetisiert und geklont in die XhoI/MIuI Stellen des Vektors ptV1 wie oben beschrieben, um das Plasmid pBtV1-434 (9 und 10) zu ergeben. Der Vektor pBtV1-434 wurde zerlegt mit Sau3A1 und eine 226 bp Einfügung, welche die Verabreichungskassette mit ihrem eingesetzten Ribozym enthält, wurde isoliert, wobei die Trennung durch eine Agarose Gel Elektrophorese unter Verwendung von Standardmethoden erfolgte. Die Zerlegung dieses Plasmids mit Sau3AlA erzeugt eine Anzahl von Fragmenten. Das 226 bp Fragment (herausgeschnitten zwischen dem BamH1 und den Bell Stellen) wurde identifiziert, indem man eine Kontrollzerlegung von pBluescript KS Seite an Seite mit der Zerlegung von pBtV1-434 durchlaufen lässt; das 226 bp Fragment wurde nur in der pBtV1-434 Zerlegung gesehen. Dieses 226 bp Fragment wurde in die BamH1 Stelle des pZIP-NeoSV(X)1 in beide Orientierungen geklont, um die Plasmide pZIPV1-434(syn) (11 und 12) bzw. pZIPV1-434(anti) (13 und 14) zu ergeben. Die "syn" Orientierung bezieht sich auf solche Konstrukte, in denen sich der eingefügte poIIII Promotor in derselben Orientierung befindet wie der poIIII Promotor des Retrovirus. Die "anti" Konstrukte haben den eingefügten poIIII Promotor in der entgegengesetzten Orientierung relativ zu der des poIIII Promotors des Retrovirus.
In diesen Konstrukten befindet sich der Kodierungsbereich des RHPV434 Ribozyms strangabwärts und er wird daher von einem sehr mächtigen poIIII Promotor in einen auf einem Moloney Retrovirus basierenden Vektor transkribiert. Der poIIII Promotor gibt eine sehr hohe Transkription eines in vivo wirksamen Ribozyms (Yamada et al., 1994, Gene Therapy 1: 38–45). Der Bereich stromaufwärts verbessert die in vivo Transkriptionsanteile des Ribozyms (Arnold and Gross, 1987, Gene 51: 237–246). Die Tetraschleife gibt eine verbesserte Stabilität, indem sie das 3' Ende des Ribozyms vor dem Abbau durch eine Nuklease schützt. Die Poly-T Sequenz beendet die Transkription von dem poIIII Promotor.
Ein entsprechendes inaktives Konstrukt wurde auch hergestellt. Das inaktive Konstrukt hatte eine Mutation, welche ein AAA zu einem CGU in der Schleife 2 des Haarnadel – Ribozyms veränderte, welches in das ptV1 geklont worden ist (wie oben beschrieben). Das katalytisch inaktive Ribozym wird durch das pBtV1-434 (i) Plasmid kodiert (15 und 16).
Um zu verifizieren, dass diese und ähnliche Konstrukte eine Aktivität in vivo aufweisen, wurden die Konstrukte in Gewebezellkulturen transfiziert und die Produktion von Ribozym untersucht.
Beispiel 3
In vivo Test. Das Testen in vivo wurde durchgeführt unter Verwendung der HPV-16 spezifischen Konstrukte. Die pZIPv1-434(syn) und pZIPV1-434(anti) Vektoren wurden stabil transfiziert in menschliche CXT1 Zellen unter Verwendung von Standardmethoden (Sambroock et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed.). Die CXT1 Zelllinie wurde abgeleitet von einem spontanen menschlichen Tumor eines Cervixkarzinoms und von ihr ist gezeigt worden, dass die E6 und E7 Proteine des HPV-16 exprimiert werden.
Das Ribozym wird in vivo exprimiert durch die Verabreichungskassette in dem Retrovirusvektor. Die Expression des Ribozyms wurde bestimmt durch RNase Schutztests (17; unter Verwendung der Methode von Lee und Costlow, 1987, Methods Enzymol. 152: 633–648). Die CXT1 Zellen wurden transfiziert mit den pZIP-NeoSV(X), pZIP-V1434(anti) und pZIP-V1434(syn) Konstrukten und die transformierten Zellen wurden danach ausgewählt, wie widerstandsfähig sie gegenüber dem Arzneimittel G418 sind. RNA wurde isoliert von den transfizierten Zellen unter Verwendung der Methode der Phenolsäure (Sambroock et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed.). Die verwendete Sonde wurde transkribiert mit T7 RNA Polymerase aus dem Plasmid pBtV1-434 (13 und 14), welches vorher mit BamH1 geschnitten wurde; das so hergestellte RNA Transkript von 265 nt wurde als die Sonde verwendet. RNase Schutz wurde durchgeführt und Produkte, welche durch Gelelektrophorese getrennt worden waren, unter Verwendung der Methode der Phenolsäure (Sambroock et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed.).
Unter Bezugnahme auf die 17 weist der Pfeil auf die 160 nt Größe des geschützten Ribozym Transkripts von dem poIIII Promotor hin. Ribozym sieht man in der pZIPV1-434(syn) Linie, wobei nichts zu sehen ist in den Linien, welche der RNA aus den mit pZIP-Neo-SV(X) und pZIP-V1434(anti) transfizierten Zellen entsprechen. In ähnlicher Weise sieht man kein 160 nt Fragment in der Kontrolllinie für Zellen, welche nicht transfiziert waren ("NT" Linie). Die anderen Linien sind Kontrollen, welche zeigen, dass die ³²P Sonde intakt ist ("Sonden" Linie) und dass die RNase aktiv ist für die Zerlegung von zellulärem RNA und von der Sonde ("RNase +" Linie).
Es sei zu beachten, dass nur ein 160 nt Band gesehen wurde. Wenn man ein längeres 230 nt Band gesehen hätte, dann würde dies auf eine Transkription hinweisen, welche aus dem poIIII Promotor des Vektors entstanden wäre. Das Vorhandensein nur des 160 nt Fragmentes zeigt, dass das Ribozym Transkript von dem poIIII Promotor der Verabreichungskassette transkribiert wurde und nicht von dem Vektor Promotor.
Es ergab sich, dass das Haarnadel – Ribozym die Expression der E6 mRNA in vivo erniedrigt. Um zu bestimmen, ob die Expression des Ribozyms die HPV Expression beeinträchtigt, wurde ein Versuch verwendet, der auf einer reversen Transkription (RT) und auf einer Verstärkung durch die Polymerase – Kettenreaktion (PCR = Polymerase Chain Reaction) beruht. Die CXT1 Zellen, welche mit den pZIP-NeoSV(X), pZIP-V1434(anti) und pZIP-V1434(syn) Konstrukten transfiziert wurden und welche nach ihrer G418 – Resistenz ausgewählt wurden, wurden als eine Quelle von HPV mRNA verwendet. Die mRNA wurde isoliert durch die Methode der Phenolsäure und weiter gereinigt unter Verwendung eines Anbindens an Poly-A unter Verwendung von Standardtechniken (Sambroock et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed.). Die mRNA wurde revers transkribiert, um die cDNA herzustellen, welche PCR verstärkt wurde mit E6 spezifischen Primern, um einen Verlust an E6 mRNA nachzuweisen. Der für die reverse Transkription verwendete Primer ("16E7R" genannt), welcher komplementär zu dem 3' Ende der E6 mRNA war, war: 5' TTATGGTTTCTGAG 3' (SEQ ID NO: 12).
Einer der PCR Primer war eine verankerte Sonde spezifisch gegenüber E6 cDNA, welche den unteren Strang der E6 cDNA verstärkt, ob dieser durch das Ribozym gespalten ist oder nicht. Die zwei anderen PCR Primer waren spezifisch für die Verstärkung des oberen Stranges der E6 cDNA. Einer dieser Primer für den oberen Strang ist 5' der Ribozymschnittstelle an nt 434 und der andere ist 3' der Ribozymschnittstelle. Diese drei Primer waren: der verankerte Primer, genannt E7X, mit der Sequenz 5' CCCTCTAGAGGCACAATTCCTAGTG 3' (SEQ ID NO: 13); der Primer 3' der Ribozymschnittstelle, genannt E6-U2, mit der Sequenz 5' CACGTAGAGAAACCCAGC 3' (SEQ ID NO: 14); und der Primer 5' der Ribozymschnittstelle, genannt E6-16U, mit der Sequenz 5' CAGCAATACAACAAACCG 3' (SEQ ID NO: 15).
Die PCR Verstärkung wurde durchgeführt unter Verwendung von Standardbedingungen: 25 PCR-Reaktionzyklen bei 94°C während einer Zeitdauer von einer Minute für das Schmelzen, dann 65°C während einer Zeitdauer von 45 Sekunden für das Abkühlen und 72°C während einer Zeitdauer von einer Minute für die Polymerisation unter Verwendung eines automatischen Thermocyclers (Perkin Elmer Model 480). Fünf Einheiten der Amplitaq Polymerase (Perkin Elmer), 100 μM von NTP, 10 ng des Primers E6-16U (SEQ ID NO: 15), 10 ng des Primers E6-U2 (SEQ ID NO: 14) und 20 ng des Primers E7X (SEQ ID NO: 13) wurden verwendet.
Die Kombination der drei Primer ergab zwei PCR Produkte von annähernd 300 nt bzw. 500 nt in Zellen, in denen die E6 mRNA intakt war. In den Zellen jedoch, in denen das Ribozym die E6 mRNA schnitt, war das kleinere der zwei PCR Produkte von 300 nt vorherrschender wegen des molaren Verhältnisses der von dem Ribozym geschnittenen E6 mRNA zu der vollständigen Länge von E6 mRNA. Die Produkte wurden getrennt durch Gel-Elektrophorese.
Die 18 zeigt, dass der RT und PCR Test das Vorhandensein von HPV E6 mRNA in infizierten Zellen nachweist. Die Figur zeigt auch, dass das Ribozym die E6 mRNA in transfizierte Zellen spaltet, welche das Ribozym exprimieren. Die Pfeile zeigen die Positionen an, wo die zwei PCR verstärkten Produkte auf ein Gel wandern, wobei der linke äußere Pfeil die Position des 300 bp Fragmentes anzeigt und der rechte äußere Pfeil die Position des 500 bp Fragmentes anzeigt, wie es von den Positionen auf dem Gel der molekularen Gewichtsmarker ("MWM" Linie) bestimmt worden ist. Die positive Kontrolllinie ("HPV-16") zeigte Bänder an beiden Positionen, was darauf hinwies, dass E6 mRNA in den CXT1 Zellen anwesend ist und dass der Test erfolgreich beide Fragmente verstärkte. Mit dem pZIP-NeoSV(X) Plasmid transfizierte Zellen dienen auch als eine Kontrolle, weil das Plasmid nicht ein HPV spezifisches Ribozym kodiert, und Bänder wurden an beiden Positionen gesehen.
Eine Verstärkung unter Verwendung von den drei Primern kann dazu verwendet werden, um das Vorhandensein von HPV-16 im menschlichen Gewebe zu identifizieren. Eine Probe, welche RNA aus dem menschlichen Gewebe enthält, kann dem Ribozym unterzogen werden und nachfolgend verstärkt werden unter Verwendung von den drei Primern. Das Ribozym wird nur diejenige RNA schneiden, welche die HPV-16 Bindungssequenz aufweist. Daher werden Proben, welche HPV-16 RNA enthalten, von dem Ribozym geschnitten werden und zu einer bevorzugten Verstärkung des kürzeren Produkts führen, welches von dem Primer 5' der Ribozymschnittstelle erzeugt worden ist.
Beispiel 4
Auswahl einer nicht HPV-16 transformierten Zelllinie mit HPV-16 spezifischen Ribozymen und Transfektion mit einem HPV-16/E7 Expressionsvektor. HeLa Zellen werden stabil transfiziert mit Konstrukten, welche fähig sind zur Expression eines HPV Ribozyms spezifisch für die Stelle 434 in HPV. Diese Konstrukte exprimieren das Ribozym unter Verwendung eines poIIII Promotors entweder von der Maus U6 (MU6) oder von einem menschlichen Ursprung tRNA^val (tV1). Eine Verifikation der Ribozym Expression wird bestimmt durch Verwendung von RNA Sonden und RNase Schutzversuchen.
Ein für die Stelle 434 von HPV spezifisches Ribozym wird in Vektoren geklont, wobei das Ribozym Konstrukt entweder von der Maus U6 (MU6) oder von einem menschlichen tRNA^val (tV1) poIIII Promotor transkribiert wird. Beide Konstrukte, nämlich sowohl die bakteriellen Plasmid – Konstrukte als auch die auf einem Moloney Retrovirus basierenden Konstrukte, werden hergestellt. Die bakteriellen Plasmid – Konstrukte weisen den menschlichen tRNA^val Promotor auf, welcher in das pBluescript(KS) Plasmid (erhältlich von Stratagene) geklont ist. Das 434 spezifische Ribozym wird in die pBluescripts mit dem tRNA^val Promotor an der mehrfachen Klonierungsstelle geklont, um das Plasmid pBTV1-434 zu ergeben. Die Einfügung wird aus diesem Plasmid entfernt durch ein Herausschneiden mit dem Restriktionsenzym Sau3A1 und die geeignete Fragmentgröße, welche die Einfügung enthält, wird isoliert unter Verwendung von Standardverfahren der Gelreinigung. Die Einfügung wird dann subkloniert in die BamH1 Stelle von pZIP-neo, was ein auf dem Moloney Murine Leukämievirus beruhendes Plasmid ist, um das Plasmid pZIP-V1434 zu ergeben mit der Einfügung entweder in der "syn" oder in der "anti" Konfiguration.
HeLa Zellen werden mit den Ribozym – Konstrukten transfiziert und stabile Transfektanten werden unter Verwendung des Auswahlkriteriums der G418-Resistenz ausgewählt. Die Zellen lässt man heranwachsen und RNA wird von den Zellen isoliert für den Einsatz in einem RNase Schutztest, um ein exprimiertes Ribozym zu identifizieren. Die zur Identifikation des Ribozyms zu verwendende Sonde ist von einem Plasmid, wobei das Ribozym zwischen einem T3 und einem T7 Promotor eingefügt ist. Diese zwei Plasmide haben die Bezeichnung pMU6-434A für das U6 Promotor – Ribozym – Konstrukt und pBtV1-434 für das tRNA^val Promotor – Ribozym – Konstrukt. Die Sonde für das MU6 Promotor – Konstrukt wird erzeugt durch eine Linearisierung des das MU6 enthaltenden Plasmids, pMU6-434A, mit EcoR1 und durch eine Transkribierung des linearisierten Plasmids mit T3 RNA Polymerase unter Verwendung von Standardverfahren. Diese Sonde, welche 110 nt lang ist, kühlt zu Ribozymen ab, die von beiden produziert werden, nämlich sowohl von der langen terminalen Sequenzwiederholung (LTR = Long Terminal Repeat) des pZIP-V1434(syn) Plasmids als auch von dem poIIII Promotor der Plasmide pZIP-V1434(syn) und pZIP-V1434(anti). Kein Ribozym kann erzeugt werden durch das LTR aus der pZIP-V1434(anti) Konfiguration. Nach dem Abkühlen und nach der RNase Zerlegung weist das aus dem LTR hergestellte geschützte Fragment eine Länge von 77 nt auf, während das von dem poIIII Promotor hergestellte geschützte Fragment 64 nt lang ist.
Die mit dem tV1 Promotor – Konstrukt verwendet Sonde wird erzeugt durch eine Linearisierung des Plasmids pBtV1-434 mit BamHI und durch eine Transkribierung des Plasmids DNA mit T7 RNA Polymerase unter Verwendung von Standardbedingungen der Polymerisation. Diese Sonde, welche 265 nt lang ist, kühlt zu Ribozymen ab, die von beiden produziert werden, nämlich sowohl von dem LTR des pZIPV1-434(syn) als auch von dem poIIII Promotor der Plasmide pZIPV1-434(syn) und pZIPV1-434(anti), aber die Größen der geschützten Fragmente unterscheiden sich. Nach der RNase Zerlegung weist das geschützte Fragment aus dem LTR eine Länge von 230 nt auf, während das von dem poIIII Promotor hergestellte geschützte Fragment 160 nt lang ist.
Zellen werden mit einem retroviralen Vektor infiziert, welcher fähig ist zur Expression von E6/E7 Genen. Vergleichbare Anteile der drei mRNA Arten für diese zwei Proteine (genannt E6E7, E6(I)E7, E6(II)E7; die ersten zwei sind die größeren Arten und die dritte ist die kleinere Art) werden gemessen unter Verwendung eines Tests mit einer reversen Transkriptase und mit einer Polymerase – Ketten – Reaktion (RT/PCR), so wie es dargelegt ist von Cornelissen et al. in J. Gen. Virol. 71: 1243–1246, 1990.
Die verwendeten Primer in dem RT/PCR Test sind wie folgt. Primer 1 ist 5' NNNAAGCTTCTGCAATGTTTCAGGACCC 3' (SEQ ID NO: 17) und Primer 2 ist 5' NNNGGATCCCCATTGGTACCTGCAGGATC 3' (SEQ ID NO: 18). Der Primer 2 ist der in der RT Reaktion verwendete Primer; beide Primer 1 und 2 werden in der PCR Reaktion verwendet. Die RT/PCR Reaktion ergibt Fragmente der folgenden Größen: 791 bp entsprechend zu dem E6E7 Produkt; 608 bp für das E6(I)E7 Produkt und 491 bp für das E6(II)E7 Produkt.
Weil das Ribozym 434 die zwei größeren Arten der mRNA (E6E7 und E6(I)E7) spaltet und nicht die kleinere Art (E6(II)E7), dient die kleinere Art als ein interner Referenzstandard in dem Test. Die Anteile der zwei größeren Arten (das 791 bp und das 608 bp Produkt) relativ zu der kleineren Art (das 491 bp Produkt) werden gemessen, um die in vivo Wirksamkeit des 434 Ribozyms zu bestimmen. Die größeren Arten zeigen eine 10–50% Verminderung relativ zu dem internen kleineren Produkt, wenn das Ribozym exprimiert ist. Als Kontrolle werden sowohl Zellen verwendet, welche nur mit dem Ribozymvektor, der nicht die Ribozymeinfügung enthält, transfiziert worden sind, als auch solche Zellen, welche mit dem inaktiven Ribozym – Konstrukt transfiziert worden sind. Der RT/PCR Test zeigt keine Abnahme bei den zwei größeren Arten relativ zu der kleineren Art, wenn diese Plasmide transfiziert sind.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Synthetisches Hairpin (Haarnadel)-Ribozym, welches sich an eine Zielstelle in einem menschlichen Papillomavirus-Transkript bindet und welches eine solche Zielstelle spaltet, wobei die besagte Zielstelle ausgewählt wird aus der Gruppe, die aus den Zielstellen besteht, welche dargestellt sind durch: 430-ACUG U*GUC CUGAAGA-444 (SEQ ID NO: 2), 430-ACUG-U*GUC CUGAAGAA-445 (SEQ ID NO: 3), und 430-ACUG U*GUC CUGAAGAAA-446 (SEQ ID NO: 4), wobei "*" die Spaltstelle angibt.
Synthetisches Haarnadel-Ribozym gemäß Anspruch 1, welches eine Tetraschleife umfasst, welche aus der SEQ ID NO: 5 besteht.
Synthetisches Ribozym gemäß Anspruch 1, welches aus der vollständigen Sequenz besteht, wie sie in der SEQ ID NO: 6 dargelegt ist.
Verfahren für den Aufbau eines Ribozyms zum Spalten eines menschlichen Papillomavirus-Transkripts, welches den Schritt des Aufbaus eines Haarnadel-Ribozyms umfasst, wobei eine Bindungsstelle auf dem Ribozym eine Sequenz enthält, welche nicht komplementär zu der Spaltstelle auf einem menschlichen Papillomavirus ist, und einen Bindungsbereich enthält, welcher komplementär zu den Sequenzen auf beiden Seiten der Spaltstelle ist, wo die Bindungsbereiche komplementär zu Sequenzen sind, welche ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus: 430-ACUG U*GUC CUGAAGA-444 (SEQ ID NO: 2), 430-ACUG-U*GUC CUGAAGAA-445 (SEQ ID NO: 3), 430-ACUG U*GUC CUGAAGAAA-446 (SEQ ID NO: 4), und wobei "*" die Spaltstelle angibt.
Verfahren für den Aufbau eines Ribozyms zum Spalten eines menschlichen Papillomavirus-Transkripts gemäß Anspruch 4, wobei der Schritt des Aufbaus des besagten Haarnadel-Ribozyms das Miteinbinden einer Tetraschleife umfasst, welche die Sequenz besitzt, wie sie in der SEQ ID NO: 5 dargelegt ist.
Vektor, welcher eine DNA-Sequenz enthält, die für das besagte Ribozym kodiert ist, gemäß Anspruch 1, wobei die DNA operativ mit den Expressionskontrollsequenzen verbunden ist.
Wirtzelle, welche mit einem Vektor gemäß Anspruch 6 transformiert worden ist und welche zur Expression des besagten Ribozyms fähig ist, welches von dem besagten Vektor kodiert wird.
Ein in vitro Verfahren zum Aufspüren eines menschlichen Papillomavirus-16 (HPV-16) in einem menschlichen Gewebeextrakt, welches umfasst: a. ein Aussetzen von RNA aus einer Probe aus menschlichem Gewebe gegen ein Ribozym gemäß Anspruch 1, welches sich an eine Nukleotidsequenz von HPV-16 RNA derart bindet, dass eine in der besagten Probe vorhandene HPV-16 RNA durch das besagte Ribozym gespalten wird; b. ein Verstärken der cDNA unter Einsatz von Primern, welche komplementär sind zu: einem 5' Ende einer vollständigen Länge eines HPV-16-Transkripts, einem Fragment 5' der Ribozym-Spaltstelle der vollständigen Länge eines HPV-16-Transkripts, und einem Fragment 3' der Ribozym-Spaltstelle der vollständigen Länge eines HPV-16-Transkripts; und c. ein Identifizieren der verstärkten DNA Fragmente derart, dass ein größeres DNA Fragment eine vollständige Länge eines HPV-16-Transkripts darstellt und ein kleineres DNA Fragment dasjenige Fragment darstellt, das sich aus dem Ribozym-Spalten des HPV-Transkripts mit der vollständigen Länge ergibt, wobei, wenn HPV-16 RNA in der Probe vorhanden ist, eine Überlegenheit des kleineren Fragments über das größere Fragment identifiziert wird.
Verfahren gemäß Anspruch 8, wobei die von dem Ribozym gespaltene HPV-16 RNA ein E6 Transkript von HPV-16 ist.
Verfahren gemäß Anspruch 8, wobei das Ribozym die Sequenz von SEQ ID NO: 6 aufweist.
Verfahren gemäß Anspruch 8, wobei das menschliche Gewebe aus einem Cervixgewebe besteht.
Verfahren gemäß Anspruch 8, welches zusätzlich den Schritt der Erzeugung von cDNA aus der in der Probe vorhandenem RNA aufweist anschließend an den Schritt des Aussetzens und vor dem Schritt des Verstärkens.
Ribozym gemäß Anspruch 1 für die Verwendung bei der medizinischen Behandlung.
Ribozym gemäß Anspruch 13 für die Verwendung bei der Behandlung eines Cervixkarzinoms oder eines präkanzerösen Zustandes der Cervix.
Ribozym gemäß Anspruch 13, welches in einem auf einem Lipofektin beruhenden liposomalen Verabreichungssystem suspendiert ist.
Ribozym gemäß Anspruch 13 in Verbindung mit einem immunologischen Mittel oder mit einem chemotherapeutischen Mittel.
Ribozym gemäß Anspruch 13 in Verbindung mit LAK Zellen.
Ribozym gemäß Anspruch 13 in Verbindung mit Cisplatin.