WO1996023889A1 - Rekombinanter rna-virus-vektor und verfahren zur herstellung desselben - Google Patents

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Definitions

  • the invention relates to a recombinant RNA virus vector, a method for producing the recombinant RNA virus vector and the use thereof for producing a medicament.
  • eukaryotic systems such as the Se liki Forest virus system (Liljeström P., Garoff H. 1991, Bio / Technology 9, 1356-1361) are based on an RNA-dependent principle; due to their pathogenic potential, they cannot be used in vivo.
  • RNA-coded viruses the so-called retro viruses.
  • the expression of foreign genes in such vector systems is not solely dependent on translation, but only takes place after integration into the genomic DNA of the target cell.
  • Retroviral vector systems interact as cDNA in the genome of the target cell. All constructs suitable for transcription must have regulatory and processing sequences.
  • the object of the present invention is to eliminate the disadvantages of the prior art by means of a new vector system and to provide a method for producing the vector system. stems as well as compilations and possible uses.
  • RNA virus vector for influencing cells in particular for gene therapy, is provided, the sequence of which is changed by removing at least one sequence section necessary for replication competence and by inserting at least one foreign sequence section such that expression of a Virus different sequence can be reached, mediated or disabled.
  • the advantage of this system is, in particular, that no transcription-regulating sequences are required.
  • the vector system according to the invention does not necessarily lead to lethal damage to the infected cells and, because of its primarily transient expression property, is suitable for in vivo or ex vivo application to the patient.
  • At least one helper cell, helper cell line or a helper virus is suitably provided.
  • the sequence other than the wild-type virus can be an antisense or ribozyme sequence for blocking or destroying a viral RNA or DNA molecule.
  • the sequence is derived from a positive-strand RNA virus, preferably a Picorna virus, and as a Picorna virus a polio virus. preferably use an attenuated polio virus. This ensures the expression of specific RNA sequences in the cytoplasmic region with high transfection efficiency.
  • a part of the coding vector sequence preferably the structure protein coding sequence, can be removed and the foreign sequence can be a protein coding, in particular a cDNA sequence. It is advantageous if the recombinant RNA virus vector has a plurality of internal ribosomal binding sites, preferably that of encephalomyocarditis, polio, foot-and-mouth disease or hepatitis A virus.
  • the helper virus can be expressed transiently or permanently in eukaryotic cells. It is useful to derive the helper virus from the polio virus.
  • a "suicide gene” can be produced contrary to the reading direction of the same RNA virus vector and a combination with such sequence elements is provided which, when a reverse transcriptase and in particular a “primer” are present binding site "which enables treatment of retroviral cells such as cells containing HIV provirus.
  • a method for producing a recombinant RNA virus vector according to the invention in which at least one sequence section necessary for replication competence is removed from the sequence of a preferably double-stranded copy of a wild-type virus, at least one foreign sequence section is inserted and the recombinant RNA virus vector is introduced into a production cell for supplementation.
  • the production cell is advantageously a helper cell or a helper cell line. It can in the «A helper virus is introduced for the production cell. It is advantageous if the recombinant RNA virus vector is cloned behind a transcription site of a eukaryotic expression vector or a prokaryotic promoter.
  • the recombinant RNA virus is provided with an infectious envelope by the helper cell line or an infectious envelope is provided by the helper virus in the production cell.
  • the recombinant RNA virus vector according to the invention can be used for the production of a medicament for transient gene therapy as well as for the treatment of tumor or autoimmune diseases and for wound treatment.
  • the treatment of retrovirally infected cells, in particular HIV-provirus-containing cells, is also possible.
  • the use of the recombinant RNA virus vector according to the invention for the production of a medicament for the oral administration of proteins and / or nucleic acids is important.
  • a preferred use of the invention is the production of clones which code for a gene which activates the immune system and which are suitable for use as a medicament for the genetic therapy of tumor patients.
  • Interleukins such as are here as immunomodulatory substances
  • IL-2, IL-10, GMCSF, GCSF and immunologically relevant adhesion molecules such as CD2, CD4, CD8, LFA-1, 4F2, CD40 and CD28 and their ligands LFA-3, ICAM-1, B7 or CD45.
  • These genes are preferably expressed in recombinant polio viruses instead of the viruseigenic structural proteins.
  • the virus proteins necessary in ice remain expressed by the use of a signal which allows a polycistronic sequence of genes and their expression, an internal ribosomal entry site (IRES).
  • a method for transient gene therapy uses a recombinant RNA virus vector according to the invention to influence a host cell, the expression of a sequence different from the wild-type virus being achieved, mediated or hindered.
  • a further solution to the above object is achieved by the provision of a kit or a combination of means for carrying out the method.
  • immunostimulating substances makes cancer therapy feasible ex vivo and in vivo; the cloning of suicide genes makes ablation of certain cell types, e.g. virus-infected cells possible with HIV infection.
  • An application of the invention for the treatment of autoimmune diseases is the production of clones which are suitable for an apoptosis-inducing gene, e.g. the receptor fas, the tumor suppressor gene p53 or the early adenovirus gene EIA, code or for a so-called suicide gene and its surface properties are preferably changed so that they bind specifically to cells of the immune system that recognize a certain autoantigen or its epitope and infect these cells.
  • an apoptosis-inducing gene e.g. the receptor fas, the tumor suppressor gene p53 or the early adenovirus gene EIA, code or for a so-called suicide gene and its surface properties are preferably changed so that they bind specifically to cells of the immune system that recognize a certain autoantigen or its epitope and infect these cells.
  • TNF ⁇ which also causes apoptotic and necrotic cell death, also aims in this direction. calls, as well as the genes known as suicide genes TK and CDD.
  • Certain immunologically relevant cells can also be switched off by induction of energy by means of the depletion of primary receptor molecules (for example by means of antisense constructs) or the receptor-associated motifs (Reth motifs). Specificity for target cells of this type can be achieved by replacing the main antigen of VP1 with the reaction-triggering antigen or by targeted receptor recognition. In the case of target cells carrying CD4, for example, the corresponding epitope of the HI virus (gpl20-V3) is appropriate.
  • Such clones can be administered to autoimmune-reactive patients, preferably systemically, and affect the autoimmune-reactive cells.
  • a suicide gene or an apoptosis-inducing gene is expressed there. This leads to a higher specificity with regard to the target cells.
  • Another preferred application of the invention uses genes which lead to the death of the target cells. These still contain a specified specificity for a target cell group, e.g. Cd-4 or Cd-26-bearing cells, as a therapeutic against an existing HIV infection.
  • a target cell group e.g. Cd-4 or Cd-26-bearing cells
  • the killing of potential target cells of the HIV virus and of cells in which the HIV virus is integrated leads to a remission of the infection, particularly in the phase of low viral load.
  • Another preferred application is the expression of anti-inflammatory molecules in the therapy of partially. tissue-destructive autoimmunopathies.
  • the method for producing the recombinant RNA virus vector according to the invention can in particular have the following steps: In a first step, a double-stranded cDNA copy of an RNA virus, preferably an attenuated polio virus, is made available, produced, obtained or otherwise acquired (vector DNA). This cDNA copy is preferably in a prokaryotic replication system.
  • areas are cut out of the cDNA construct according to the size of the gene to be cloned. These are primarily sequences whose function can be replaced in trans, preferably encoded envelope proteins, in the case of the polio virus the genes VP4, VP3, VP2 and / or VP1. The sequences necessary for expression in ice, the recognition sites for the proteases necessary for processing, the internal ribosomal binding sites and the polymerases are retained.
  • the transsupplementation with the removed genes is ensured by a helper virus or a helper cell line.
  • the gene to be newly expressed in the viral genome is preferably named after a suitable internal one
  • Ribosomal binding site internal ribosomal entry
  • the gene to be cloned preferably ends with a stop codon and has a new IRES and a methionine for a new initiation of translation of the subsequent proteins of the virus
  • Sequence usually has approximately the same sequence length as the removed fragment.
  • the fragments supplementing in trans are sufficiently provided by a helper virus or, preferably, a helper cell line, the expression of toxic products, e.g. of the complete PI fragment, is usually avoided or restricted.
  • the replication-defective recombined polio virus genome is transferred to the production cell and expressed in a eukaryotic expression vector.
  • the recombinant polio virus RNA can also be obtained after in vitro transcription and transfection, e.g. Electroporation, in the production cell.
  • the recombinant polio virus RNA is packed in the production cell in infectious particles.
  • helper virus can also be used, which due to missing genome areas can no longer be packaged into viral particles. Recombination of the helper virus and the recombinant expression virus should preferably be avoided.
  • infectious particles which contain the recombinant expression virus are preferably obtained from the supernatant of the cell culture or from the cytoplasm of infected cells.
  • infectious particles with recombinant virus genome are used to infect target cells. These can be cells kept in cell culture, clones, ex vivo explants or systemic or tissue-specific applications of whole organisms.
  • a fragment of the cDNA of a Sabin 1 poliovirus (vaccine strain) is cloned via its Celli and SnaBI interfaces.
  • the cDNA of the human IL-2 gene is inserted into this fragment via adapters and the Muni and Spei interfaces.
  • the IL-2 coding region is followed by a second internal ribosomal entry site (IRES, internal ribosome binding site) of the EMC virus.
  • IRES internal ribosomal entry site
  • stop codons are located in all three reading frames.
  • the subgenomic fragment of the poliovirus obtained with the IL-2 gene and the second IRES is now inserted into the original construct. Transcription with T7 RNA polymerase provides the recombinant full-length RNA.
  • the sequences between the first (item 3913) and the last (item 6770) HincII site are removed from the starting vector which can be transcribed with T7 RNA polymerase.
  • the RNA transcript of this construct provides the structural proteins required for packaging when co-infected. Cotransfection of both recombinant RNAs leads to the packaging of the recombinant full-length encoding IL-2 RNA in virus envelopes and thus to recombinant polio-viruses, which are used to infect tumor cells.
  • Tumor cells and fibroblasts are obtained by biopsy, cultivated in vitro and lethally irradiated and separated. The tumor cells are frozen in aliquots of 107 cells at -180O c. The fibroblasts are transfected by coincubation with a recombinant poliovirus. The vaccination is carried out after lethal irradiation of the fibroblasts and autologous tumor cells with 10,000 rad. Subcutaneous administration is carried out immediately afterwards.
  • Tumor therapy can alternatively be achieved by in vivo application of the attenuator t ized recombinant poliovirus for direct infection, eg solid tumors.
  • Example 2 Analogously to Example 1, the cDNA of the human fas receptor gene is used and the corresponding recombinant full-length RNA from the polio virus and the helper construct are obtained. Co-transfection of both recombinant RNAs leads to fas encoding recombinant polioviruses, which are used to infect cells to be ablated. Epitopes of an endogenous antigen, such as that of the acetylcholine receptor in patients with myasthenia gravis, are inserted into the main antigen site of the poliovirus instead of the sequence NSAST-KNKDK in the helper construct and lead to preferential uptake of the poliovirus into these autoreactive lymphocytes.
  • an endogenous antigen such as that of the acetylcholine receptor in patients with myasthenia gravis
  • recombinant polio viruses coding for the human p53 tumor suppressor gene are obtained.
  • region V3 of the HIV glycoprotein gpl20 the recombinant polio virus can be delivered to the same target cells as the HIV.
  • Expression of the p53 gene now induces cell death in all cells expressing CD4 and thus in all cells that contain HIV provirus.
  • the epitope of the protein region gpl20-V3 is inserted into the main antigen site of the poliovirus instead of the sequence NSAST-KNKDK analogously to Example 2.
  • the production and application of recombinant viruses is carried out analogously to Example 2.
  • recombinant polio viruses which are used for anti-inflammatory genes, e.g.
  • the genes which code for IL-10, IL13, IL-4, TGFß or the TNF ⁇ -T55 receptor are carried out analogously to Examples 1 and 2 in Hep-2 cells.
  • the recombinant viruses obtained are used to infect isolated body cells.
  • IRES in front of the polyprotein, which is broken down into various end products by processing by various proteases, including the virus-specific P2A and P3D.
  • the resulting proteins can be seen in the drawing. They can be divided into structural proteins (VP1 to VP4) and nutritional proteins.
  • the former form the envelope of the virus, the latter perform different functions in the life cycle of the virus.
  • the helper construct shown in FIG. 3 provides the structural proteins missing from the vector shown in FIG. 2. However, it is not packed itself.
  • the polyprotein of the starting vector is processed by various proteases, including the viral P2A and P3D, broken down into various end products.
  • Part of the virus genome (from VP4 to VP2, VP3 to VP1) is replaced by the human GMCSF gene and the subsequent virus proteins are controlled by an additional IRES.
  • the antigenic epitopes of the virus envelopes e.g. the main epitope in VP1, be changed.

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Abstract

Die Erfindung betrifft einen rekombinanten RNA-Virus-Vektor zur Beeinflussung von Zellen, insbesondere zur Gentherapie, dessen Sequenz durch Entfernen mindestens eines zur Replikationskompetenz notwendigen Sequenzabschnitts und durch Einfügen mindestens eines Fremdsequenzabschnitts so verändert ist, daß eine Expression einer vom Wildtyp-Virus verschiedenen Sequenz erreich-, vermittel- oder behinderbar ist.

Description

Rekombinanter R A-Virus-Vektor und Verfahren zur Herstellung desselben
Die Erfindung betrifft einen rekombinanten RNA-Virus- Vektor, ein Verfahren zur Herstellung des rekombinanten RNA-Virus-Vektors sowie dessen Verwendung zur Herstellung eines Medikaments.
Nach dem Stand der Technik gibt es DNA-abhängige Systeme zur Proteinexpression in höheren eukaryontisehen Zellen. Bekannt ist bsp. das Baculovirus-System (Bishop DHL, 1990 , p. 62-67., Current Opinion in Biotechnology. ), das jedoch nur in Insektenzellen angewendet werden kann.
Andere eukaryontische Systeme, wie das Se liki Forest Virussystem (Liljeström P. , Garoff H. 1991, Bio/Technology 9, 1356-1361) basieren auf einem RNA-abhängigen Prinzip; sie sind aufgrund ihres pathogenen Potentials nicht in vivo anwendbar.
Weitere Systeme beruhen auf RNA-kodierten Viren, den soge¬ nannten Retro-Viren. Die Expression von fremden Genen in solchen Vektorsystemen ist nicht allein translationsabhän¬ gig, sondern erfolgt erst nach Integration in die genomi- sehe DNA der Zielzelle.
Die angesprochenen Systeme haben unter anderem den Nachteil, in das Genom der jeweiligen Zielzelle zu inte¬ grieren, was fatale Folgen haben kann.- Retrovirale Vektorsysteme interagieren als cDNA in das Genom der Zielzelle. Alle für eine Transkription geeigneten Konstrukte müssen mit regulatorischen und für die Prozessierung notwendigen Sequenzen versehen sein.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, durch ein neues Vektorsystem die Nachteile nach dem Stand der Technik zu beseitigen und ein Verfahren zur Herstellung des Vektorsy- stems sowie Zusammenstellungen und Verwendungsmöglichkeiten anzugeben.
Diese Aufgabe wird durch die Merkmale der Ansprüche 1, 11 und 16 bis 23 gelöst. Zweckmäßige Weiterbildungen ergeben sich aus den Merkmalen der Anspüche 2 bis 9 und 12 bis 15.
Nach Maßgabe der Erfindung ist ein rekombinanter RNA-Virus- Vektor zur Beeinflussung von Zellen, insbesondere zur Gentherapie, vorgesehen, dessen Sequenz durch Entfernen mindestens eines zur Replikationskompetenz notwendigen Sequenzabschnitts und durch Einfügen mindestens eines Fremdsequenzabschnitts so verändert ist, daß eine Expression einer vom Wiltyp-Virus verschiedenen Sequenz er- reich-, vermittel- oder behinderbar ist.
Der Vorteil dieses Systems besteht insbesondere darin, daß keine transkriptionsregulierenden Sequenzen benötigt wer¬ den. Das erfindungsgemäße Vektorsystem führt nicht zwangs- läufig zu einer letalen Schädigung der infizierten Zellen und ist wegen seiner primär transienten Expressionseigenschaft zu einer in vivo oder ex vivo Applikation am Patienten geeignet.
Geeigneterweise ist mindestens eine Helferzelle, Helferzellinie oder ein Helfer-Virus vorgesehen. Dadurch ist der durch das Entfernen mindestens eines zur Replikationskompetenz notwendigen Sequenzabschnitts hervor¬ gerufene Funktionsverlust des rekombinanten RNA-Virus- Vektors kompensierbar. Die vom Wildtyp-Virus verschiedene Sequenz kann eine Antisens- oder Ribozymsequenz zur Blockierung oder Zerstörung eines viralen RNA- oder DNA- Moleküls sein.
Eine Ausgestaltung sieht vor, daß die Sequenz von einem Positiv-Strang-RNA-Virus, vorzugsweise einem Picorna-Virus abgeleitet ist und als Picorna-Virus ein Polio-Virus, vor- zugsweise ein attenuiertes Polio-Virus zu verwenden.- Dies gewährleistet mit hoher Transfektionseffizienz die Expression spezifischer RNA-Sequenzen im Cytoplasmabereich.
Ein Teil der kodierenden Vektorsequenz, vorzugsweise der strukturproteinkodierenden Sequenz, kann entfernt, und die Fremdsequenz eine proteinkodierende, insbesondere eine cDNA-Sequenz sein. Dabei ist es günstig, wenn der rekombin- ante RNA-Virus-Vektor eine Mehrzahl interner ribosomaler Bindungsstellen, vorzugsweise die des Enzephalomyokarditis- des Polio-, des Foot-and-Mouth-Disease- oder des Hepatitis-A-Virus, aufweist.
Das Helfer-Virus kann transient oder permanent in eukaryontischen Zellen exprimierbar sein. Es ist zweckmäßig, das Helfer-Virus vom Polio-Virus abzuleiten.
In einer Ausgestaltung des rekombinanten RNA-Virus-Vektors ist ein "Selbstmord-Gen" entgegen der Leserichtung dessel- ben RNA-Virus-Vektors herstellbar und eine Kombination mit solchen Sequenzelementen vorgesehen, die bei Vorliegen ei¬ ner reversen Transkriptase und insbesondere einer "primer binding Site", die Behandlung retroviraler Zellen wie HIV- Provirushaltiger Zellen ermöglicht.
Nach einer weiteren erfindungsgemäßen Lösung ist ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen rekombin¬ anten RNA-Virus-Vektors vorgesehen, bei dem aus der Sequenz einer vorzugsweise doppelsträngigen Kopie eines Wildtyp- Virus mindestens ein zur Replikationskompetenz notwendiger Sequenzabschnitt entfernt, mindestens ein Fremdsequenzabschnitt eingefügt und der rekombinante RNA- Virus-Vektor zur Supplementation in eine Produktionszelle eingebracht wird.
Vorteilhafterweise ist die Produktionszelle eine Helferzelle oder eine Helferzellinie. Dabei kann in die «fr Produktionszelle ein Helfer-Virus eingebracht werden. Es ist günstig, wenn der rekombinante RNA-Virus-Vektor hinter einer Transkiptionsstelle eines eukaryontisehen Expressionsvektors oder einem prokaryontisehen Promoter kloniert wird.
In weiterer verfahrensmäßiger Ausgestaltung wird das rekom¬ binante RNA-Virus durch die Helferzellinie mit einer infektiösen Hülle versehen oder er wird durch das Helfer- Virus in der Produktionszelle eine infektiöse Hülle bereitgestellt.
Nach einer weiteren Lösung der Aufgabe wird ein Kit bzw. Zusammenstellung von Mitteln zur Durchführung des erfin- dungsgemäßen Verfahrens bereitgestellt.
Der erfindungsgemäße rekombinante RNA-Virus-Vektor kann zur Herstellung eines Medikaments zur transienten Gentherapie sowie zur Behandlung von Tumor- oder Autoimmunerkrankungen und zur Wundbehandlung- verwendet werden. Auch die Behandlung von retroviral infizierter Zellen, insbesondere HlV-Provirushaltiger Zellen ist möglich. Des weiteren ist die Verwendung des erfindungsgemäßen rekombinanten RNA- Virus-Vektors zur Herstellung eines Medikaments zur oralen Administration von Proteinen und/oder Nucleinsäuren von Bedeutung.
Da die vorerwähnten Medikamente nicht ohne weiteres applizierbar sind, ist erfindungsgemäß eine Zusammenstellung von Mittel zur Aplikation der Medikamente vorgesehen.
Eine bevorzugte Verwendung der Erfindung ist das Herstellen von Klonen, die für ein das Immunsystem aktivierendes Gen kodieren und geeignet sind, als Medikament zur genetischen Therapie von Tumorpatienten eingesetzt zu werden. Als im- munmodulatorische Substanzen sind hier Interleukine, wie IL-2, IL-10, GMCSF, GCSF sowie immunologisch relevante Adhäsionsmoleküle, wie CD2, CD4, CD8, LFA-1, 4F2, CD40 und CD28 sowie deren Liganden LFA-3, ICAM-1, B7 oder CD45 zu verstehen. Diese Gene sind bevorzugt anstelle der virusei¬ genen Strukturproteine in rekombinanten Polio-Viren expri- miert. Die in eis nötigen Virusproteine bleiben exprimiert durch die Verwendung eines Signals, das eine polycistroni- sche Aneinanderreihung von Genen und deren Expression er¬ laubt, einer internal ribosomal entry Site (IRES).
Ein Verfahren zur transienten Gentherapie verwendet einen erfindungsgemäßen rekombinanten RNA-Virus-Vektor zur Beeinflussung einer Wirtszelle, wobei die Expression einer vom Wildtyp-Virus verschieden Sequenz erreicht, vermittelt oder behindert wird. Eine weitere Lösung der obigen Aufgabe wird durch die Bereitstellung eines Kits bzw. einer Zusammenstellung von Mitteln zur Durchführung des Verfahrens erzielt.
Die erfindungsgemäße -Expression immunstimulierender Substanzen macht eine Krebstherapie ex vivo und in vivo durchführbar; die Klonierung von Suizid-Genen macht eine Ablation bestimmter Zelltypen, z.B. virusinfizierter Zellen bei der HIV-Infektion möglich.
Eine Anwendung der Erfindung zur Behandlung von Autoiπununerkrankungen ist das Herstellen von Klonen, die für ein apoptoseinduzierendes Gen, z.B. den Rezeptor fas , das Tumorsuppressorgen p53 oder das frühe Adenovirusgen EIA, kodieren bzw. für ein sogenanntes Suizid-Gen und deren Oberflächeneigenschaften vorzugsweise so verändert sind, daß sie sich speziell an Zellen des Immunsystems binden, die ein bestimmtes Autoantigen bzw. dessen Epitop erkennen und diese Zellen infizieren.
In diese Richtung zielt auch die Verwendung von TNFα, das ebenfalls apoptotischen und nekrotischen Zelltod hervor- ruft, sowie die als Suizidgene bekannten Gene TK und CDD. Eine Ausschaltung bestimmter immunologisch relevanter Zellen kann auch durch Anergieinduktion mittels der Depletion von primären Rezeptormolekülen (z.B. durch Antisens-Konstrukte) bzw. der rezeptorassoziierten Motive (Reth-Motive) geschehen. Eine Spezifität für derargtige Zielzellen kann durch den Austausch des Hauptantigens von VP1 durch das reaktionsauslösende Antigen oder durch ge¬ zielte Rezeptorerkennung erreicht werden. Im Fall CD4-tra- gender Zielzellen bietet sich z.B. das entsprechende Epitop des HI-Virus (gpl20-V3) an. Derartige Klone können autoim- munreaktiven Patienten appliziert werden, bevorzugterweise systemisch, und die autoimmunreaktiven Zellen befallen.
Nach ihrer Infektion wird dort ein Suizid-Gen oder ein apoptoseinduzierendes Gen exprimiert. Dies führt zu einer höheren Spezifität bezüglich der Zielzellen.
Eine weitere bevorzugte Anwendung der Erfindung verwendet Gene, die zum Absterben der Zielzellen führen. Diese ent¬ halten noch eine vorgegebene Spezifität für eine Zielzellgruppe, z.B. Cd-4 oder Cd-26 tragender Zellen, als Therapeutikum gegen eine schon bestehende HIV-Infektion.
Das Abtöten potentieller Zielzellen des HIV-Virus sowie von Zellen, in die das HIV-Virus integriert ist, führt beson¬ ders in der Phase geringer Virusbelastung zu einer Remission der Infektion.
Eine weitere bevorzugte Anwendung ist die Expression anti- inflammatorischer Moleküle in der Therapie von z.T. gewebs- destruierende Autoimmunopathien.
Das Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemäßen rekom- binanten RNA-Virus-Vektors kann insbesondere die folgenden Schritte aufweisen: : In einem ersten Schritt wird eine doppelsträngige cDNA-Kopie eines RNA-Virus, bevorzugterweise eines at- tenuierten Polio-virus, bereitgestellt, hergestellt, gewonnen oder anderweitig erworben (Vektor-DNA). Diese cDNA-Kopie liegt bevorzugt in einem prokaryotisehen Replikations-System vor.
In einem zweiten Schritt werden, entsprechend der Größe des zu klonierenden Gens, Bereiche aus dem cDNA- Konstrukt herausgeschnitten. Dabei handelt es sich in erster Linie um Sequenzen deren Funktion in trans er¬ setzbar sind, preferentiell um kodierte Hüllproteine, im Falle des Polio-Virus um die Gene VP4, VP3, VP2 und/oder VP1. Die für die Expression in eis nötigen Sequenzen, die zur Prozessierung nötigen Erkennungsstellen für die Proteasen, die internen ri- bosomalen Bindungsstellen und die Polymerasen bleiben erhalten.
Die Transsupplementation mit den entfernten Genen wird durch einen Helfervirus bzw. eine Helferzellinie si¬ chergestellt.
Das neu in dem viralen Genom zu exprimierende Gen wird vorzugsweise nach einer geeigneten internen
Ribosomalen Bindungsstelle (internal ribosomal entry
Site, IRES) und, mit einem eigenen Methionin versehen, kloniert. Das zu klonierende Gen endet vorzugsweise mit einem Stopcodon und besitzt für eine Neuinitiation der Translation der nachfolgenden Proteine des Virus, eine weitere IRES und ein Methionin für die
Wiederaufnahme der Translation. Die neu hinzugefügte
Sequenz inklusive der eben erwähnten Strukturen hat gewöhnlich etwa die gleiche Sequenzlänge, wie das ent- fernte Fragment. f
Die in trans supplementierenden Fragmente werden von einem Helfervirus oder preferenziell einer Helferzellinie ausreichend zur Verfügung gestellt, wo¬ bei die Expression toxischer Produkte, z.B. des kom- pletten Pl-Fragments, gewöhnlich vermieden oder einge¬ schränkt wird.
In einer Ausführung wird das replikationsdefekte re¬ kombinante Polio-Virus-Genom in einem eukaryontischen Expressionsvektor in die Produktionszelle transferiert und exprimiert. Die rekombinante Polio-Virus-RNA kann auch nach in vitro Transkription und Transfektion, z.B. Elektroporation, in der Produktionszelle vorlie¬ gen. Die rekombinante Polio-Virus-RNA wird in der Produktionszelle in infektiöse Partikel verpackt.
Alternativ dazu kann auch ein Helfervirus verwendet werden, das wegen fehlender Genombereiche nicht mehr in virale Partikel verpackt werden kann. Dabei ist eine Rekombination des Helfervirus und des rekombinan¬ ten Expressionsvirus vorzugsweise zu vermeiden.
Die infektiösen Partikel, die das rekombinante Expressionsvirus enthalten, werden vorzugsweise aus dem Überstand der Zellkultur oder aus dem Cytoplasma infizierter Zellen gewonnen.
Die infektiösen Partikel mit rekombinantem Virusgenom werden zur Infektion von Zielzellen eingesetzt. Dabei kann es sich um in Zellkultur gehaltene Zellen, um Klone, um ex vivo Explantate oder um systemische oder gewebsspeziefisehe Applikationen ganzer Organismen handeln.
Beispiele 3
1. Rekombinante Poliovirus Konstrukte zur transienten Expression von Interleukin 2.
Ein Fragment der cDNA eines Sabin 1 Poliovirus (Impfstamm) wird über seine Schnittstellen Celli und SnaBI rekloniert. In dieses Fragment wird über Adaptoren und die Schnittstellen Muni und Spei die cDNA des menschlichen IL-2 Gens eingesetzt. Die IL-2 kodierende Region ist gefolgt von einer zweiten inter-nal ribosomal entry Site (IRES, interne Ribosomenbindungsstelle) des EMC Virus. Vor dieser zweiten IRES liegen Stopcodons in allen drei Leserahmen. Das erhal¬ tene subgenomische Fragment des Poliovirus mit dem IL-2 Gen und der zweiten IRES wird nun in das ursprüngliche Konstrukt eingefügt. Eine Transkription mit T7 RNA Polymerase liefert die rekombinante Vollängen-RNA.
Von dem mit T7 RNA Polymerase transkribierbaren Ausgangsvektor werden die Sequenzen zwischen der ersten (Pos. 3913) und letzten (Pos. 6770) HincII Stelle entfernt. Das RNA-Transkript dieses Konstrukts stellt bei einer Koinfektion die für die Verpackung nötigen Strukturproteine zur Verfügung. Eine Kotransfektion beider rekombinanter RNAs führt zur Verpackung der rekombinanten IL-2 kodieren¬ den Vollänge-RNA in Virushüllen und damit zu rekombinanten Polio-Viren, die zur Infektion von Tumorzellen dienen.
Tumorzellen und Fibroblasten werden durch Biopsie gewonnen, in vitro kultiviert und letal bestrahlt und separiert. Die Tumorzellen werden in Aliquots zu 107 Zellen tiefgefroren bei -180O c. Die Fibroblasten werden durch Koinkubation mit einem rekombinantem Poliovirus transfiziert. Die Vakzinierung wird nach letaler Bestrahlung der Fibroblasten und autologer Tumorzellen mit 10.000 rad durchgeführt.- Die subkutane Applikation erfolgt unmittelbar anschließend.
Die Vakzinierungen werden wiederholt. Eine Tumortherapie kann alternativ durch eine in vivo Applikation des attenu- t ierten rekombinanten Poliovirus zur direkten Infektion, z.B. solider Tumoren, erreicht werden.
2. Rekombinante Poliovirus Konstrukte zur transienten Expression des Apoptose induzierenden fas Gens.
Analog zu Beispiel 1 wird die cDNA des menschlichen fas Rezeptor Gens eingesetzt und die entsprechende rekombinante Vollängen-RNA vom Polio-Virus sowie das Helferkonstrukt er- halten. Kotransfektion beider rekombinanter RNAs führt zu fas kodierenden rekombinanten Polioviren, die zur Infektion zu ablatierender Zellen dienen. Epitope eines körpereigenen Antigens wie das des Acetylcholinrezeptors bei Patienten mit Myasthenie gravis werden in die Hauptantigenstelle des Poliovirus an die Stelle der Sequenz NSAST-KNKDK im Helferkonstrukt eingefügt und führen zu einer bevorzugten Aufnahme des Poliovirus in diese autoreaktiven Lymphocyten.
Nach Abtrennung und säulenchromatographischer Aufreinigung der rekombinanten Viruspräparation werden geeignete Dosen an rekombinantem Virus i.v. verabreicht.
3. Rekombinante Poliovirus Konstrukte zur Zelltyp spezifi¬ schen Apoptose-Induktion.
Analog zu Beispiel 1 und 2 werden für das menschliche p53 Tumorsuppressor-Gen kodierende rekombinante Polio-Viren er¬ halten. Durch Verwendung eines Teils des CD4-spezifischen HIV-Rezeptor, die Region V3 des HIV Glykoproteins gpl20, kann das rekombinante Polio-Virus an dieselben Zielzellen wie das HIV gebracht werden. Eine Expression des p53 Gens induziert nun in allen CD4 exprimierenden Zellen und damit allen HlV-Provirus beherbergenden Zellen den Zelltod. Das Epitop der Proteinregion gpl20-V3 wird in die Hauptantigenstelle des Poliovirus an die Stelle der Sequenz NSAST-KNKDK analog zu Beispiel 2 eingesetzt. Die ΛΛ Herstellung und Applikation rekombinanter Viren erfolgt analog zu Beispiel 2.
4. Rekombinante Polio-Viruskonstrukte zur Expression anti- inflammatorischer Moleküle in Körperzellen.
Die Herstellung rekombinanter Polio-Viren, die für antiin- flammatorischer Gene, z.B. der Gene, die für IL-10, IL13, IL-4, TGFß oder den TNFα-T55-Rezeptor kodieren, erfolgt analog zu Beipiel 1 und 2 in Hep-2 Zellen. Die erhaltenen rekombinanten Viren werden zur Infektion von isolierten Körperzellen verwendet.
Nach Präparation und Aufreinigung der rekombinanten Viruspräparation werden frisch isolierten Körperzellen, z.B. Synoviozyten, bzw. mononukleäre Zellen von Patienten in vitro mit geeigneten Dosen infiziert.
In der Zeichnung sind Ausführungsbeispiele der Erfindung dargestellt. Es zeigen
Fig.l den Bauplan des Impfvirus Sabin 1,
Fig.2 ein rekombinantes Virus am Beispiel des Fremdgens GM-CSF und
Fig.3 ein Helferkonstrukt.
In dem in Fig. 1 gezeigten Ausgangsvektor befindet sich ei- ne IRES vor dem Polyprotein, das durch Prozessierung durch verschiedene Proteasen, u.a. den viruseigenen P2A und P3D, in diverse Endprodukte zerlegt wird. Die dabei entstehenden Proteine sind aus der Zeichnung ersichtlich. Sie lassen sich in Strukturproteine (VP1 bis VP4 ) und Niehtstrukturproteine unterteilen. Die Ersteren bilden die Hülle des Virus, die Letzteren übernehmen verschieden Funktionen im Lebenszyklus des Virus. I
In dem in Fig. 2 gezeigten rekombinanten Virus sind Teile der Strukturproteine durch ein Fremdgen (GM-CSF) und weite¬ re IRES (EMC-IRES) ersetzt.
Das in Fig. 3 dargestellte Helferkonstrukt stellt die dem in Fig. 2 gezeigten Vektor fehlenden Strukturproteine zur Verfügung. Es wird selbst jedoch nicht verpackt.
Die Konstruktion stellt sich wie folgt dar:
Das Polyprotein des Ausgangvektors wird durch Prozessierung durch verschiedene Proteasen, u.a. den viruseigenen P2A und P3D, in diverse Endprodukte zerlegt. Ein Teil des Virusgenoms (von VP4 über VP2, VP3 bis VPl) wird durch das menschliche GMCSF-Gen ersetzt und die nachfolgenden Virusproteine durch eine zusätzliche IRES gesteuert. Um eine neue Spezifizität für diese rekombinanten Viren einzu¬ führen, können auf dem Helferkonstrukt die antigenen Epitope der Virushüllen, z.B. das Hauptepitop in VPl, ver¬ ändert werden.

Claims

Patentansprüche
1. Rekombinanter RNA-Virus-Vektor zur Beeinflussung von Zellen, insbesondere zur Gentherapie, dessen Sequenz durch Entfernen mindestens eines zur Replikationskom¬ petenz notwendigen Sequenzabschnitts und durch Einfügen mindestens eines Fremdsequenzabschnitts so verändert ist, daß eine Expression einer vom Wiltyp-Virus ver¬ schiedenen Sequenz erreich-, vermittel- oder behinder- bar ist.
2. Rekombinanter RNA-Virus-Vektor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine Helferzelle, Helferzellinie oder ein Helfer-Virus vorgesehen ist, durch die bzw. das der durch Entfernen mindestens eines zur Replikationskompetenz notwendigen Sequenzabschnitts hervorgerufene Funktionsverlust des rekombinanten RNA- Virus-Vektors kompensierbar ist.
3. Rekombinanter RNA-Virus-Vektor nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die vom Wildtyp-Virus ver¬ schiedene Sequenz eine Antisens- oder Ribozymsequenz zur Blockierung oder Zerstörung eines viralen RNA- oder DNA-Moleküls ist.
4. Rekombinanter RNA-Virus-Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Sequenz von einem Positiv-Strang-RNA-Virus, vorzugsweise einem Picorna-Virus abgeleitet ist.
5. Rekombinanter RNA-Virus-Vektor nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Picorna-Virus ein Polio-Virus, vorzugsweise ein attenuiertes Polio-Virus ist.
6. Rekombinanter RNA-Virus-Vektor nach einem der vorherge¬ henden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß ein Teil der kodierenden Sequenz, vorzugsweise der Strukturpro- teinkodierenden Sequenz, entfernt, und die Fremdsequenz eine proteinkodierende, insbesondere eine cDNA-Sequenz ist.
7. Rekombinanter RNA-Virus-Vektor nach einem der vorher- genden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß er eine Mehrzahl interner ribosomaler Bindungsstellen, vorzugs¬ weise die des Enzephalomyokarditis-, des Polio-, des Foot-and-Mouth-Disease- oder des Hepatitis-A-Virus, aufweist.
8. Rekombinanter RNA-Virus-Vektor nach einem der Ansprüche 2 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Helfer-Virus transient oder permanent in eukaryontischen Zellen ex- primierbar ist.
9. Rekombinanter RNA-Virus-Vektor nach einem der Ansprüche 2 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Helfer-Virus vom Polio-Virus abgeleitet ist.
10. Rekombinanter RNA-Virus-Vektor nach einem der Ansprüche 2 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß eine Einkombination eines "Selbstmord-Gens" entgegen der Leserichtung des RNA-Virus-Vektors und eine Kombination mit solchen Sequenzelementen vorgesehen ist, die bei Vorliegen einer reversen Transkriptase, insbesondere einer "primer binding Site", die Behandlung retrovira- ler Zellen wie HlV-Provirushaltiger Zellen ermöglicht.
11. Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten RNA- Virus-Vektors nach Anspruch 1, wobei aus der Sequenz einer vorzugsweise doppelsträngi- gen Kopie eines Wildtyp-Virus mindestens ein zur Replikationskompetenz notwendiger Sequenzabschnitt ent- fernt, mindestens ein Fremdsequenzabschnitt eingefügt, und »5 der rekombinante RNA-Virus-Vektor zur
Supplementation in eine Produktionszelle eingebracht wird.
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Produktionszelle eine Helferzelle oder eine Helferzellinie ist.
13. Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekenn- zeichnet, daß ein Helfer-Virus in die Produktionszelle eingebracht wird.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß das rekombinante RNA-Virus-Genom hinter einer Transkiptionsstelle eines eukaryontischen Expressionsvektors oder einem prokaryontisehen Promoter kloniert wird.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß das rekombinante RNA-Virus durch die Helferzellinie mit einer infektiösen Hülle versehen wird oder das Helfer-Virus in der Produktionszelle eine infektiöse Hülle bereitstellt.
16. Kit bzw. Zusammenstellung von Mitteln zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 11.
17. Verwendung eines rekombinanten RNA-Virus-Vektors nach Anspruch 1 zur Herstellung eines Medikaments zur tran- sienten Gentherapie.
18. Verwendung eines rekombinanten RNA-Virus-Vektors nach Anspruch 1 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Tumor- oder Autoimmunerkrankungen sowie zur Wundbehandlung.
19. Verwendung eines rekombinanten RNA-Virus-Vektors nach Anspruch 1 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung retroviral infizierter Zellen, insbesondere HlV-Provirushaltiger Zellen.
20. Verwendung eines rekombinanten RNA-Virus-Vektors nach Anspruch 1 zur Herstellung eines Medikaments zur oralen Administration von Proteinen und/oder Nucleinsäuren.
21. Kit bzw. Zusammenstellung von Mitteln zur Applikation des Medikaments nach einem der Anspüche 17 - 20.
22. Verfahren zur transienten Gentherapie, wobei unter Verwendung eines rekombinanten RNA-Virus-Vektors nach Anspruch 1 die Genexpression einer Wirtszelle so beein¬ flußt wird, daß die Expression einer vom Wildtyp-Virus verschieden Sequenz erreicht, vermittelt oder behindert wird.
23. Kit bzw. Zusammenstellung von Mitteln zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 22.
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