DE19707273C1 - Expressionsvektor zur dauerhaften Expression einer Fremd-DNA - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft einen Expressionsvektor zur dauerhaften Ex­ pression einer Fremd-DNA. Ferner betrifft die Erfindung ein einen solchen Ex­ pressionsvektor enthaltendes Mittel sowie die Verwendung beider zur dauerhaf­ ten Expression einer Fremd-DNA in Zellen.

Zur Durchführung einer Gentherapie ist es wichtig, eine Fremd-DNA in Zellen einzuführen und dort zu exprimieren. Ersterer Schritt wird durch bekannte Verfahren erreicht. Die Expression einer Fremd-DNA in Zellen stellt allerdings oft ein Problem dar, insbesondere, wenn eine dauerhafte Expression der Fremd-DNA erreicht werden soll.

CA 114: 137216 beschreibt, daß die Replikation an verschiedenen Stellen in einem autonom replizierenden Plasmid in menschlichen Zellen beginnt.

CA 116: 16636 betrifft die Rolle von EBNA-1 bei der Replikation.

CA 110: 2101 beschäftigt sich mit einer Replikationsgabelbarriere am 3'-Ende von ribosomalen RNA-Genen aus Hefe.

CA 118: 249206 betrifft konservierte Merkmaie bei der Replikation eukaryotischer ribosomaler RNA-Gene.

CA 120: 70809 beschäftigt sich mit der Chromatinstruktur und der transkriptiona­ len Aktivität um Replikationsgabeln am 3'-Ende von rRNA-Genen aus Hefe.

Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Mittel bereitzu­ stellen, mit dem eine Fremd-DNA in Zellen dauerhaft exprimiert werden kann.

Erfindungsgemäß wird dies durch die Gegenstände in den Patentansprüchen erreicht.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit ein Expressionsvektor mit einer Fremd-DNA, wobei am 3'-Ende der Fremd-DNA eine Sequenz vorliegt, die verhindert, daß die Replikation des Expressionsvektors in entgegengesetzter Richtung zu seiner Transkription verläuft.

Die vorliegende Erfindung beruht auf der Erkenntnis des Anmelders, daß bei eukaryotischen ribosomalen RNA-Genen, also Genen, die in der S-Phase trans­ kribiert und repliziert werden, am 3'-Ende eine mit Replikationsgabel-Barriere (RGB) bezeichnete Sequenz vorliegt, die in Zusammenwirkung mit dem in Zellen vorliegenden Transkriptions-Terminations-Faktor TTF-1 verhindert, daß die Replikation der Gene in entgegengesetzter Richtung zu ihrer Transkription verläuft. Damit wird erreicht, daß der DNA-Replikations-Apparat mit der Trans­ kriptions-Maschinerie nicht kollidiert und somit auch kein Abbruch der Gen- Expression eintritt.

In der vorliegenden Erfindung wird diese Erkenntnis dazu genutzt, einen Ex­ pressionsvektor mit einer Fremd-DNA bereitzustellen, bei dem am 3'-Ende der Fremd-DNA eine Sequenz vorliegt, die verhindert, daß die Replikation des Ex­ pressionsvektors in entgegengesetzter Richtung zu seiner Transkription verläuft.

Der Ausdruck "Expressionsvektor" umfaßt jeglichen Vektor, der zur Expression einer Fremd-DNA geeignet ist. Beispiele solcher Expressionsvektoren umfassen Virus-Vektoren, wie Adenovirus-, Vacciniavirus-, Baculovirus- und Adeno-assozi­ ierte Virus-Vektoren. Der Ausdruck "Virus-Vektor" versteht sich dabei sowohl als DNA wie auch als Virus-Partikel. Weitere Beispiele von Expressionsvektoren umfassen Plasmid-Vektoren, wie pKCR, pEFBOS, cDM8 und pCEV4. Darüber hinaus sind als Expressionsvektoren auch künstliche Chromosomen-Vektoren zu nennen. Solche enthalten günstigerweise ein Zentromer und an beiden Enden des Chromosomenvektors gelegene Telomeren, sowie einen Replikationsur­ sprung. Erfindungsgemäß werden künstliche Chromosomen-Vektoren bevorzugt.

Der Ausdruck "Sequenz, die verhindert, daß die Replikation des Expressions­ vektors in entgegengesetzter Richtung zu seiner Transkription verläuft," umfaßt eine Sequenz jeglicher Art und Herkunft, die solches vermag. Die Sequenz wird nachstehend mit (RGB) bezeichnet. Günstig ist es, wenn (RGB) vom 3'-Ende eines Gens stammt, das in der S-Phase sowohl transkribiert als auch repliziert wird. Beispiele eines solchen Gens sind eukaryotische ribosomale RNA-Gene von Mensch, Tier und Pflanze. Besonders günstig ist es, wenn (RGB) eines solchen Gens eine als Sal Box 2 bezeichnete Sequenz mit ihrem flankierenden GC-Be­ reich darstellt. Ganz besonders günstig ist es, wenn (RGB) eine Sal Box 2 mit ihren flankierenden GC- und T-Bereichen darstellt. Ein Beispiel von erfindungs­ gemäß verwendeter (RGB) wird nachstehend aufgezeigt. Diese kann auch eine durch ein oder mehrere Basen unterschiedliche Sequenz haben. Gleiches gilt für eine (RGB), die sich nur in Form einer Sal Box 2 mit ihrem flankierenden GC- Bereich darstellt. Desweiteren kann es vorteilhaft sein, wenn mehrere gleiche oder unterschiedliche (RGBs) in einem Expressionsvektor vorliegen.

Beispiel einer erfindungsgemäß verwendeten (RGB):

Der Ausdruck "Fremd-DNA" betrifft jegliche DNA, die in einem vorstehenden Expressionsvektor integriert sein kann. Die Fremd-DNA kann für ein diagnostisch und/oder therapeutisch verwendbares Polypeptid kodieren. Beispiele eines therapeutisch verwendbaren Polypeptids sind Tumornekrosefaktor, Lymphokine, Wachstumsfaktoren, Plasmaproteine, Rezeptoren und die Immunogenität von Zellen, insbesondere Tumorzellen, steigernde Polypeptide. Letztere sind z. B. Polypeptide, die Tumorzellen fehlen, wie MHC-I Polypeptide, kostimulatorische Moleküle, z. B. B7-Polypeptide, wie B7.1 und B7.2, sekretorische Immunstimu­ latoren, z. B. Zytokine, wie IL-2, Interferone und GM-CSF, und tumorassoziierte Antigene, z. B. MAGE-1, Tyrosinasen oder virale Proteine, wie E7-Polypeptid von humanem Papillomvirus und EBNA-3 Polypeptid von Epstein-Barr-Virus. Vor­ teilhaft kann es sein, wenn die Expression der Fremd-DNA unter der Kontrolle eines konstitutiven oder induzierbaren Promotors, wie eines Gewebe- oder Tumor-spezifischen Protomors, steht.

Ein erfindungsgemäßer Expressionsvektor eignet sich, Fremd-DNA in Zellen einzuführen und dort dauerhaft zu exprimieren. Die Zellen können jeglicher Art und Herkunft sein. Ferner können die Zellen einzeln oder in einem Verband, wie in einem Gewebe oder Organ, vorliegen. Auch können die Zellen in oder au­ ßerhalb eines Organismus vorliegen. In letzterem Fall können die Zellen in Kultur gehalten sein. Desweiteren können die Zellen gesunde Zellen, erkrankte Zellen, wie Virus-infizierte oder durch Mikroorganismen bzw. Einzeller befallene Zellen, oder Tumorzellen sein.

Die Einführung des Expressionsvektors in Zellen kann durch übliche Verfahren erfolgen. Liegt der Expressionsvektor als Virus-Partikel vor, so können die Zellen mit diesem infiziert werden. Liegt er allerdings als DNA vor, so kann diese z. B. durch Transfektion, Lipofektion oder Elektroporation in die Zellen eingeführt werden.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Mittel, das einen vorstehenden Expressionsvektor und übliche Hilfsstoffe, wie Puffer, Verdün­ nungsmittel, Trägermittel, etc. umfaßt. Ferner kann das Mittel Substanzen enthalten, die das durch die Fremd-DNA des Expressionsvektors kodierte Poly­ peptid in seiner Wirkung unterstützten. Enthält z. B. der Expressionsvektor eine Fremd-DNA, die für ein die Immunogenität von Zellen steigerndes Polypeptid kodiert, ist es vorteilhaft, wenn das Mittel weitere, die Immunogenität von Zellen steigernde Substanzen, insbesondere Tumor-spezifische Antigene umfaßt. Diese Antigene können z. B. in Form von Peptiden, insbesondere synthetischen Pepti­ den, vorliegen. Auch können die Antigene in Form von sie kodierenden Expres­ sionsvektoren vorliegen, die ferner für HLA-Moleküle kodieren können. Beson­ ders günstig ist es, wenn das Mittel auch die durch den Expressionsvektor transduzierten Zellen und/oder die durch diese Zellen stimulierten nukleären Blutzellen enthält. Für die Zellen gelten vorstehende Ausführungen. Insbesondere ist es günstig, wenn die Zellen inaktiviert sind.

Mit der vorliegenden Erfindung ist es möglich, Fremd-DNA dauerhaft in Zellen zu exprimieren. Diese Zellen können innerhalb oder außerhalb eines Organismus liegen. Somit eignet sich die vorliegende Erfindung zur in vivo und ex vivo Diagnostik und Therapie schwerster Erkrankungen. Solche sind insbesondere Tumorerkrankungen. Die vorliegende Erfindung stellt einen Durchbruch auf dem Gebiet der Gentherapie dar.

Die Erfindung wird durch das nachfolgende Beispiel erläutert.

Beispiel: Herstellung eines erfindungsgemäßen Expressionsvektors und seine Verwendung zur dauerhaften Expression einer Fremd-DNA

Zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Expressionsvektors wird ein Adeno- assoziierter Virus-Vektor (AAV-Vektor) verwendet, der 5'- und 3'-ITR-Sequenzen von AAV, nicht aber für AAV-Rep und -Cap-Proteine kodierende Sequenzen enthält. Ein solcher AAV-Vektor ist allgemein erhältlich. Er wird nachstehend als pAAV bezeichnet. In pAAV wird zwischen den 5'- und 3'-ITR-Sequenzen von AAV eine Expressionskassette inseriert, die in 5'- 3'-Richtung folgendes um­ faßt:
einen Maus-Metallothioneinpromotor, eine für menschliche Adenosindesaminase (ADA) kodierende cDNA (Fremd-DNA), SV40 Poly A-Sequenzen und eine (RGB), wie vorstehend beschrieben. Zur Insertion der genannten Elemente werden übliche DNA-Rekombinationsverfahren durchgeführt, wobei die einzelnen Ele­ mente jeweils über eine "blunt-end"-Ligierung miteinander verbunden werden. Die erhaltene Expressionskassette wird ebenfalls über eine "blunt-end"-Ligierung mit pAAV verbunden. Es wird der erfindungsgemäße Expressionsvektor pAAV- ADA erhalten.

Zu seiner Vermehrung wird pAAV-ADA zusammen mit einem zweiten Expres­ sionsvektor, der einen SV40-Replikationsursprung und für AAV-Rep- und -Cap- Proteine kodierende Sequenzen enthält, in Zellen transfiziert, die ein SV40-T Antigen exprimieren. Solche Zellen sind z. B. COS-Zellen. Durch das T-Antigen wird der SV40-Replikationsursprung letzteren Expressionsvektors aktiviert und dieser repliziert. Dadurch wird eine hohe Expression der AAV-Rep - und Cap- Proteine erhalten. Durch Infektion der transfizierten COS-Zellen mit einem Helfer- Virus, z. B. Adenovirus, wird pAAV-ADA als Viruspartikel erhalten.

Ein solches Viruspartikel wird zur Infektion von Zellen verwendet. In diesen wird die Expression der Fremd-DNA (ADA) durch einen gegen ADA gerichteten Antikörper nachgewiesen. Es zeigt sich, daß die Expression von ADA dauerhaf­ ten Charakters ist.

Claims (12)

1. Expressionsvektor mit einer Fremd-DNA, wobei am 3'-Ende der Fremd- DNA eine Sequenz vorliegt, die verhindert, daß die Replikation des Ex­ pressionsvektors in entgegengesetzter Richtung zu seiner Transkription verläuft.

2. Expressionsvektor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Sequenz von Genen stammt, die in der S-Phase transkribiert und repliziert werden.

3. Expressionsvektor nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Gene eukaryotische ribosomale RNA-Gene sind.

4. Expressionsvektor nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Sequenz eine Sal Box 2 mit flankierendem GC-Bereich umfaßt.

5. Expressionsvektor nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Sequenz eine Sal Box 2 mit flankierenden GC- und T-Bereichen umfaßt.

6. Expressionsvektor nach einem der Ansprüche 1-5, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die Fremd-DNA unter der Kontrolle eines konstitutiven oder induzierbaren Promotors steht.

7. Expressionsvektor nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Promotor ein Gewebe- und/oder Tumor-spezifischer Promotor ist.

8. Expressionsvektor nach einem der Ansprüche 1-7, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die Fremd-DNA für ein diagnostisch und/oder therapeutisch verwendbares Polypeptid kodiert.

9. Expressionsvektor nach einem der Ansprüche 1-8, dadurch gekennzeich­ net, daß der Expressionsvektor ein Virus-, Plasmid- oder künstlicher Chro­ mosomen-Vektor ist.

10. Mittel zur dauerhaften Expression von Fremd-DNA in Zellen, enthaltend den Expressionsvektor nach einem der Ansprüche 1-9 und übliche Hilfsstoffe.

11. Mittel nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß der Expressions­ vektor in Zellen vorliegt.

12. Verwendung des Expressionsvektors nach einem der Ansprüche 1-9 oder des Mittels nach Anspruch 10 oder 11 zur dauerhaften Expression einer Fremd-DNA.