DE4436665C2 - Bereitstellung von rep-negativen AAV-Mutanten und hierfür verwendbare Zellen - Google Patents

Bereitstellung von rep-negativen AAV-Mutanten und hierfür verwendbare Zellen

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Description

Die Erfindung betrifft die Bereitstellung von rep-negativen AAV-Mutanten und hierfür verwendbare Säugerzellen.
Adeno-assoziierte Viren (AAVs) sind einzelsträngige, zur Familie der Parvoviren gehörende DNA-Viren. Zu ihrer Replikation benötigen AAVs Helferviren, insbeson­ dere Adenoviren oder Herpesviren. In Abwesenheit von Helferviren integrieren AAVs in das Wirtszell-Genom, insbesondere an einer spezifischen Stelle von Chromosom 19 bzw. in Chromosom 17.
Auf dem 4,65-kb großen, linearen Genom von humanem AAV-Typ 2 wurden drei virale Funktionen lokalisiert. Die 145 bp langen "inverted repeats" dienen als Replikationsursprung und als cis Signale für Integration und Verpackung. Das cap Gen codiert für drei Strukturproteine und das rep Gen für eine Familie multifunktio­ naler Regulatorproteine. Die mRNAs für Rep 78 und seine C-terminal gespleißte Version Rep 68 starten am p5 Promotor. Zwei N-terminal verkürzte Versionen von Rep 78 und Rep 68, nämlich Rep 52 bzw. Rep 40, werden unter der Kontrolle des p19 Promotors exprimiert. Rep Proteine sind für die DNA-Replikation von AAV notwendig. Ferner werden sie für die Genregulation von AAV benötigt.
AAVs unterdrücken die Tumorentwicklung in Versuchstieren. Ferner unterdrücken sie die durch Onkogene bedingte Zelltransformation wie auch die induzierte DNA- Amplifikation.
Desweiteren werden Rep-Proteine von AAV für nachstehende Aktivitäten verant­ wortlich gemacht: Hemmung der durch verschiedene Onkogene bedingten Zelltrans­ formation, Hemmung der induzierten DNA-Amplifikation und antiproliferative Wirkung. Eine präzise Zuordnung dieser Aktivitäten zu einzelnen Rep-Proteinen bzw. Rep-Proteindomänen existiert jedoch nicht. Eine solche Zuordnung wäre aber notwendig, um AAVs als tumorsuppressives therapeutisches Prinzip für die Medi­ zin verwenden zu können. Eine Möglichkeit, die Zuordnung der verschiedenen genannten Aktivitäten zu erreichen, liegt in der Untersuchung von AAVs, die Mutationen in den Rep-Proteinen aufweisen. Viele Versuche wurden diesbezüglich durchgeführt. Bisher ist es allerdings nicht gelungen, rep-negative AAV-Mutanten bereitzustellen, die frei von Wildtyp-AAV sind. Solche sind aber für vorstehende Untersuchungen unerläßlich.
Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Mittel bereitzu­ stellen, mit dem rep-negative AAV-Mutanten ohne vorstehende Nachteile erhalten werden können.
Erfindungsgemäß wird dies durch die Gegenstände in den Patentansprüchen erreicht.
Gegenstand der Erfindung sind somit Säugerzellen, welche die AAV-Rep-Proteine 78 und 52 sowie 40 und/oder 68 stabil exprimieren. Bevorzugt werden Säuger­ zellen, welche die Rep-Proteine 78, 52 und 40 exprimieren.
Erfindungsgemäße Säugerzellen können in üblicher Weise hergestellt werden. Vorliegend werden Zellen der bekannten Linie HeM1 als Ausgangsmaterial verwendet (vgl. "5th Parvovirus Workshop", Chrystal River, Florida, USA, Nov. 10-14, 1993). Diese Zellen exprimieren die AAV-Rep-Proteine 78 und 52, wobei die Rep 78- Expression unter der Kontrolle des Dexamethason-induzierbaren MMTV-LTR steht. Zellen von HeM1 werden mit einem für Rep 40 codierenden Expressionsplasmid und/oder einem für Rep 68 codierenden bzw. einem Expressionsplasmid trans­ fiziert, das für beide Rep-Proteine codiert. Vorzugsweise wird ein Expressions­ plasmid für Rep 40 verwendet, wobei das Expressionsplasmid pCMRep 40 ganz besonders bevorzugt ist. In diesem liegt die für Rep 40 codierende DNA zwischen den Schnittstellen Notl und Xbal des bekannten Vektors pKEX-2-XL vor (vgl. Rittner, K. H. et al., Methods Mol. Cell. Biol. 2 (1991), 176-181). pCMRep 40 wurde bei der DSM (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) unter DSM 9488 am 10. Okt. 1994 hinterlegt.
Die durch Transfektion von pCMRep 40 erhaltenen Säugerzellen exprimieren stabil die AAV-Proteine Rep 78, Rep 52 und Rep 40. Diese Säugerzellen wurden als Zellinie HeCM1g bei der DSM unter DSM ACC2185 am 30. Aug. 1994 hinter­ legt. Sie stellen ebenso einen Gegenstand der Erfindung dar.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Bereitstellung von rep­ negativen AAV-Mutanten. Ein solches Verfahren umfaßt die folgenden Verfahrens­ schritte:
  • a) Transfektion erfindungsgemäßer Säugerzellen mit der DNA einer rep­ negativen AAV-Mutante,
  • b) Infektion der transfizierten Säugerzellen von (a) mit einem AAV-Helfervirus, und
  • c) Isolierung der erhaltenen rep-negativen AAV-Mutanten.
In bevorzugter Ausführungsform erfolgt in Verfahrensschritt (a) eine Cotrans­ fektion mit einem für einen Glukokortikoid-Rezeptor codierenden Expressions­ plasmid. Ein solches ist dem Fachmann bekannt. Beispielsweise kennt er das Expressionsplasmid HGO (vgl. Kumar, V., et al., Cell 51 (1987), 941-951).
Desweiteren kennt der Fachmann sämtliche zur Durchführung vorstehender Verfahrensschritte notwendigen Techniken. Ergänzend wird auf Maniatis et al., Molecular Cloning: A laboratory mannual (1982), Cold Spring Harbor, New York, verwiesen.
Der Ausdruck "DNA einer rep-negativen AAV-Mutante" umfaßt ein AAV-Genom mit Mutationen im rep-Gen. Insbesondere kann es sich um Deletionen, Insertionen und/oder Substitutionen von ein oder mehreren Nukleotiden handeln. Auch kann die AAV-DNA eine Deletion des gesamten für Rep codierenden Bereichs aufwei­ sen. Desweiteren kann die Rep codierende DNA teilweise oder ganz durch eine für ein Fremdprotein codierende DNA ersetzt sein. Vorzugsweise ist das Fremdprotein ein für eine Gentherapie verwendbares Protein bzw. Peptid.
Desweiteren umfaßt der Ausdruck "DNA einer rep-negativen AAV-Mutante" auch eine DNA, die neben den vorstehend angegebenen Mutationen weitere Mutationen in anderen Bereichen der AAV-DNA aufweist. Dies können z. B. Mutationen im cap- Gen sein. Für einen solchen Fall ist es dann günstig, wenn das verwendete AAV- Helfervirus ein exprimierbares AAV-cap-Gen aufweist. Dem Fachmann sind Ver­ fahren bekannt, ein solches Gen in ein AAV-Helfervirus zu inserieren.
Der Ausdruck "AAV-Helfervirus" umfaßt Viren, die zur Replikation von AAVs notwendig sind. Dies sind insbesondere Adenoviren, wie Adenovirus-2, und Her­ pesviren.
Mit der vorliegenden Erfindung ist es möglich, rep-negative AAV-Mutanten bereit­ zustellen. Diese sind frei von Wildtyp-AAV, da Rekombinationsereignisse, wie sie bei transienter Transfektion von Rep-Expressionskonstrukten in Zellen eintreten, vermieden werden. Die vorliegende Erfindung stellt somit die Basis dar, die den Rep-Proteinen zugeschriebenen Aktivitäten auf einzelne Rep-Proteine bzw. Domä­ nen davon zu beschränken. Damit ist die Möglichkeit gegeben, den Wirkungs­ mechanismus von AAV als tumorsuppressives Prinzip eingehend zu untersuchen, was für den Einsatz von AAV in der Tumortherapie unabdingbar ist. Desweiteren eröffnet die vorliegende Erfindung die Möglichkeit, rekombinante AAVs bereitzu­ stellen, welche im Rahmen der Gentherapie als virale Vektoren eingesetzt werden können. Erfindungsgemäße rep-negative AAV-Mutanten können hierfür verwend­ bare Gene bzw. Genabschnitte tragen. Diese können insbesondere in dem rep-Gen und/oder cap-Gen liegen. Die vorliegende Erfindung stellt somit einen Durchbruch auf dem Gebiet der Herstellung von für Gentherapien verwendbaren Vektoren dar.
Kurze Beschreibung der Zeichnung:
Fig. 1 zeigt eine schematische Darstellung der Rep-codierenden DNA im Expres­ sionsplasmid pCMRep40. Das Start-ATG-Triplett und das Terminationscodon TGA sind angegeben, sie entsprechen denen des Wildtyp-AAV-Genoms. Durch gerichte­ te Mutagenese ist das Intron (Position: 1907-2227) entfernt, wodurch Rep 40 ohne Spleißen exprimiert werden kann.
Die Erfindung wird durch das Beispiel erläutert.
Beispiel: Bereitstellung einer rep-negativen AAV-Mutante
HeCM1g-Zellen werden mit der DNA des bekannten, klonierten im rep-Gen mutier­ ten AAV-Genoms pTAV 2-3 und dem Expressionsplasmid HGO kotransfiziert. pTAV2-3 weist eine "frameshift"-Mutation an der Position 1045 auf, wodurch die Expression sämtlicher Rep-Proteine verhindert ist (vgl. Heilbronn, R., et al., J. Virol. 64 (1990), 3012-3018). Die Zellen werden mit Adenovirus-2 (MOL = 10-20) infiziert. Danach werden sie mit 10-6 M Dexamethason induziert.
Die Zellen werden bis zum vollständigen, durch Adenovirus ausgelösten zytopathi­ schen Effekt (ca. 48 h) inkubiert und anschließend durch Frier-Tau-Lyse und Ultraschallbehandlung in einem hypotonen Puffer geerntet. Die Zellfragmente werden abzentrifugiert, die AAV-Partikel befinden sich im Überstand. Diese zeigen sich auch als infektiös.
Vorstehende Daten zeigen, daß mit den erfindungsgemäßen Säugerzellen rep-negative AAV-Mutanten bereitgestellt werden können.

Claims (9)

1. Säugerzellen, stabil exprimierend die AAV-Rep-Proteine 78 und 52 sowie 40 und/oder 68.
2. Säugerzellen nach Anspruch 1, nämlich die Zellinie HeCM1g, hinterlegt unter DSM ACC 2185 am 30.8.1994.
3. Verfahren zur Bereitstellung von rep-negativen AAV-Mutanten, frei von Wildtyp-AAV, umfassend die folgenden Verfahrensschritte:
  • a) Transfektion der Säugerzellen nach einem der Ansprüche 1 oder 2 mit der DNA einer rep-negativen AAV-Mutante,
  • b) Infektion der transfizierten Säugerzellen von (a) mit einem AAV- Helfervirus, und
  • c) Isolierung der erhaltenen rep-negativen AAV-Mutanten.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß in Verfahrens­ schritt (a) eine Cotransfektion mit einem für einen Glukokortikoidrezeptor codierenden Expressionsplasmid erfolgt.
5. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA der rep-negativen AAV-Mutante von Verfahrensschritt (a) ein oder mehrere Deletionen, Insertionen und/oder Substitutionen im rep Gen aufweist.
6. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß in der DNA der rep-negativen AAV-Mutante von Verfahrensschritt (a) das rep Gen deletiert ist.
7. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß in der DNA der rep-negativen AAV-Mutante von Verfahrensschritt (a) das rep Gen zumindest teilweise durch ein Fremd-Gen ersetzt ist.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 3-7, dadurch gekennzeichnet, daß das AAV-Helfervirus ein Adenovirus oder Herpesvirus ist.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 3-8, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA der rep-negativen AAV-Mutante von Verfahrensschritt (a) eine weitere Mutation im cap-Gen aufweist, mit der Maßgabe, daß das AAV-Helfervirus ein exprimierbares cap-Gen enthält.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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VIROL, J.: Vol. 60, No. 3, S. 823-832, 1986 *
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