WO1996018737A2 - Vektoren und viren zur gentherapie - Google Patents

Vektoren und viren zur gentherapie Download PDF

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Harald Zur Hausen
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    • C12N2799/027—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid where the vector is derived from a retrovirus

Definitions

  • the present invention relates to vectors and viruses which are suitable for gene therapy, processes for their preparation and their use.
  • a common tumor therapy includes the surgical removal of the tumor and the aftertreatment of the patient by means of radiation and / or systemic application of cytostatics.
  • the aftertreatment attempts to kill tumor tissue which has not been removed or metastases formed.
  • the present invention is therefore based on the object of providing a means with which current tumor therapies can be improved and, in particular, the above-mentioned side effects can be avoided.
  • a vector suitable for gene therapy which comprises an expressible insert DNA which, for the DNA-binding domain (hereinafter with DBD), of a poly (ADP-ribose) polymerase (hereinafter with PARP) or for at least one partially catalytically inactive PARP coded.
  • DBD DNA-binding domain
  • PARP poly (ADP-ribose) polymerase
  • vector suitable for gene therapy encompasses any vectors which can be used alone or together with other agents in gene therapy. These are, for example, plasmid vectors and virus vectors. Of the latter, those of adenovirus, herpes simplex virus, adeno-associated virus (hereinafter referred to as AAV), "minute virus of mice” (hereinafter referred to as MVM) and retroviruses should be mentioned in particular.
  • Virus vectors from AAV for example AAV-sub201 (cf.
  • an insert DNA which codes for the DBD of a PARP or for an at least partially catalytically inactive PARP is inserted into a vector above.
  • An insert DNA above can be obtained from any organism, e.g. human or animal or from plants.
  • the above insert DNA is inserted into the vector in such a way that the insert DNA can be expressed.
  • This can be achieved by inserting the insert DNA in phase in an expression unit present in the vector.
  • it may be necessary to at least partially remove a DNA present in the expression unit.
  • elements of the existing expression unit such as enhancers, promoters or polyadenylation signals, with others.
  • a promoter which is specific for a tissue type is preferably introduced into an expression unit, as a result of which the expression of the insert DNA which is under the control of the promoter becomes tissue-specific.
  • a promoter which is active in tumor cells is particularly preferred.
  • virus vectors In the case of virus vectors, it often proves to be advantageous to insert the insert DNA into an expression unit present in the vector.
  • the hereby possibly Connected removal or partial removal of virus DNA present in the expression unit then leads to a virus vector which has a defect in a virus function.
  • This defect can be used as a selection marker.
  • the defect can, if necessary, be compensated for by conventional methods, such as complementation in trans.
  • virus vectors are preferred in which the insert DNA is inserted in such a way that the virus vectors alone are no longer able to form the viruses encoded by them.
  • Examples of such virus vectors are given in FIGS. 2 and 3. It is AAV r ⁇ p " DBD, MVM""-DBD and AAV r ⁇ D - / c " p - DBD (Fig. 2).
  • the viruses encoded by them can be formed by conventional complementation methods.
  • AAV r ⁇ p -DBD is transfected into cells which are co-transfected with a DNA construct expressing the rep gene. Viruses are obtained. These are well suited for gene therapy since they cannot multiply in the patient.
  • the virus encoded by the virus vector is obtained by transfection into a conventional packaging cell line. This is also well suited for gene therapy.
  • the present invention thus also relates to viruses which are encoded by the above virus vectors.
  • Vectors and viruses according to the invention are distinguished by the fact that they can inhibit the repair of DNA damage. They are therefore ideally suited for use in therapies in which cells are to be killed. All The suitability of the vectors and viruses according to the invention is particularly to be seen in the treatment of tumors, in particular together with conventional radiation and / or cytostatics methods. It is particularly important here that they can be tissue-specific (tumor) -active. The present invention is trend-setting for the gene therapy treatment of the most serious diseases.
  • Fig. 1 shows a DNA between positions -29 and + 1 127 for the
  • FIG. 2 shows the vectors AAV rep OBP, MVM cap " DBD and
  • FIG. 3 shows the retrovirus DBD vector according to the invention.
  • Example 1 Preparation of the vector AAV ,, p DBD according to the invention
  • the vector pSR2 (cf. Russell, SJ et al., Above) is assumed. This vector is split with Hindlll and Bglll. A vector fragment and a 1.6 kb capsid fragment (II) from MVM are obtained. The latter fragment is removed and replaced by the insert fragment (II) from Example 1, DBD-Poly-A. The vector MVM cap OBD is obtained.
  • Example 3 Production of the vector AAV r, / c, DBD according to the invention
  • the vector AAV-sub201 from Example 1 is used. This vector is cleaved with Xbal and all AAV components except the terminal repetitions are removed. The remaining fragment is made up of the intermediate sequence, for example a 2.4 kb BamHI / BamHI fragment from pCosAGy2 (cf. Auer, B. et al., DNA 8 (1989), 575-580), which contains non-coding sequences has the 7th intron of human PARP. Then fragments I and II from Example 1 are inserted. The vector AAV r ⁇ p "cap OBD is obtained.
  • the vector N2 (cf. Keller, G. et al., Above) is used as the starting point. This vector is opened with EcoRI partial digest 3 'of the neomycin gene. The following sequences are then inserted into the vector from 5 'to 3' at the 3 'end of the neomycin gene: (I) the 0.7 kb poly-A signal of the ⁇ -globin gene (for example the EcoRI / Sall- Fragment from pECV; see Berg, BGM et al., Gene 4 (1989), 407-417); (II) a 259 bp BamHI / Ncol fragment which contains the P4 promoter (cf. Example 1, (I)); (IM) a 1.73 kb EcoRI / HindIII fragment from pPARP6 (cf. Example 1, (II)). The retrovirus DBD vector is obtained.
  • Example 5 Inhibition of repair of DNA damage
  • the inhibition of the repair of DNA damage is shown by the inhibition of the synthesis of poly (ADP-ribose).
  • the vector AAV ⁇ DBD according to the invention is transfected by electroporation in HeLa cells. After transfection, the cells are sown on cover slips for microscopy. Two days later, the transfected cells are placed on the coverslips of a genotoxic treatment, e.g. X-ray radiation or treatment with alkylating carcinogens. This causes DNA breaks, which leads to an activation of the PARP, which then synthesizes poly (ADP-ribose).
  • a genotoxic treatment e.g. X-ray radiation or treatment with alkylating carcinogens. This causes DNA breaks, which leads to an activation of the PARP, which then synthesizes poly (ADP-ribose).
  • the HeLa cells are fixed with trichloroacetic acid and subjected to indirect immunofluorescence against poly (ADP-ribose). No poly (ADP-ribose) -specific signals are obtained.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft einen zur Gentherapie geeigneten Vektor, der eine exprimierbare Insert-DNA umfasst, die für die DNA-Bindungsdomäne einer Poly(ADP-Ribose)-Polymerase oder für eine zumindest teilweise katalytisch nichtaktive Poly(ADP-Ribose)-Polymerase codiert. Ferner betrifft die Erfindung Verfahren zur Herstellung eines solchen Vektors und Viren, die zur Gentherapie geeignet sind.

Description

Vektoren und Viren zur Gentherapie
Die vorliegende Erfindung betrifft Vektoren und Viren, die sich zur Gentherapie eignen, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung.
Eine gängige Tumortherapie umfaßt die operative Entfernung des Tumors und die Nachbehandlung des Patienten mittels Bestrahlung und/oder systemischer Ap¬ plikation von Zytostatika. Durch die Nachbehandlung wird versucht, nicht entfern¬ tes Tumorgewebe bzw. gebildete Metastasen abzutöten.
Der Erfolg gängiger Tumortherapien ist allerdings gering. Insbesondere treten bei den nachbehandelten Patienten häufig Nebenwirkungen, wie Induktion von Zweit¬ tumoren, Schädigungen innerer Organe oder Schmerzen, auf.
Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Mittel bereitzu¬ stellen, mit dem gängige Tumortherapien verbessert und insbesondere vorstehende Nebenwirkungen vermieden werden können.
Erfindungsgemäß wird dies durch einen zur Gentherapie geeigneten Vektor er¬ reicht, der eine exprimierbare Insert-DNA umfaßt, die für die DNA-Bindungsdomäne (nachstehend mit DBD) einer Poly(ADP-Ribose)-Polymerase (nachstehend mit PARP) oder für eine zumindest teilweise katalytisch nicht-aktive PARP codiert.
Die vorliegende Erfindung beruht auf der Erkenntnis des Anmelders, daß PARP, ein zur Reparatur von DNA-Schädigungen benötigtes Enzym, durch Zugabe von DBD- Molekülen in seiner Aktivität gehemmt wird und die Reparatur von DNA-Schädi¬ gungen drastisch in ihrer Geschwindigkeit vermindert wird. Der vorstehende Ausdruck "zur Gentherapie geeigneter Vektor" umfaßt jegliche Vektoren, die alleine oder zusammen mit anderen Mitteln in der Gentherapie ver¬ wendet werden können. Dies sind z.B. Plasmid-Vektoren und Virus-Vektoren. Von letzteren sind insbesondere solche von Adenovirus, Herpes Simplex Virus, Adeno- assoziiertem Virus (nachstehend mit AAV bezeichnet), "Minute virus of mice" (nachstehend mit MVM bezeichnet) und Retroviren zu nennen. Ganz besonders bevorzugt werden Virus- Vektoren von AAV, z.B. AAV-sub201 (vgl. Samulski, R.J. et al., J. Virology 61 , (1987), 3096 - 3101 ), von MVM z. B. pSR2 (vgl. Russell, S.J. et al., J. Virology 66, (1992), 2821 - 2828) und von Retroviren, z. B. N2 (vgl. Keller, G. et al., Nature 318, (1985), 149 - 154).
Erfindungsgemäß wird in einen vorstehenden Vektor eine Insert-DNA eingefügt, die für die DBD einer PARP oder für eine zumindest teilweise katalytisch nicht-aktive PARP codiert. Eine vorstehende Insert-DNA kann aus einem beliebigen Organis¬ mus, z.B. dem Menschen oder dem Tier oder aus Pflanzen, stammen. Vorzugs¬ weise wird eine Insert-DNA aus dem Menschen und besonders bevorzugt jene von Fig. 1 , Position -29 bis + 1127, oder eine durch ein oder mehrere Nukleotide davon unterschiedliche DNA verwendet.
Die Einfügung vorstehender Insert-DNA in den Vektor erfolgt derart, daß die Insert- DNA exprimiert werden kann. Dies kann erreicht werden, indem die Insert-DNA in eine im Vektor vorhandene Expressionseinheit in Phase inseriert wird. Dazu kann es notwendig sein, eine in der Expressionseinheit vorliegende DNA zumindest teilweise zu entfernen. Auch kann es vorteilhaft sein, Elemente der vorhandenen Expressionseinheit, wie Enhancer, Promotor oder Polyadenylierungssignale, zu¬ mindest teilweise durch andere zu ersetzen. Vorzugsweise wird in eine Expres¬ sionseinheit ein Promotor eingeführt, der spezifisch für eine Gewebe-Art ist, wodurch die Expression der unter der Kontrolle des Promotors stehenden Insert- DNA gewebespezifisch wird. Besonders bevorzugt ist ein Promotor, der in Tumor¬ zellen aktiv ist. Ein Beispiel eines solchen Promotors ist der P4-Promotor von MVM (vgl. Russell, S.J. et al., vorstehend). Die Expression vorstehender Insert-DNA kann ferner in einer Expressionseinheit erreicht werden, die hierzu in den Vektor eingeführt werden muß. Für diese Ex¬ pressionseinheit gelten auch die vorstehenden Ausführungen.
Im Falle von Virus- Vektoren erweist es sich oftmals als günstig, die Insert-DNA in eine im Vektor vorhandene Expressionseinheit einzufügen. Die hiermit u.U. ver¬ bundene Entfernung oder Teilentfernung von in der Expressionseinheit vorliegender Virus-DNA führt dann zu einem Virus-Vektor, der in einer Virus-Funktion einen Defekt aufweist. Dieser Defekt kann als Selektionsmarker genutzt werden. Ande¬ rerseits kann der Defekt, wenn nötig, durch übliche Verfahren, wie Komplementa- tion in trans, ausgeglichen werden.
Erfindungsgemäß werden Virus-Vektoren bevorzugt, in denen die Insert-DNA so eingefügt ist, daß die Virus-Vektoren alleine nicht mehr zur Bildung der durch sie codierten Viren in der Lage sind. Beispiele solcher Virus-Vektoren sind in den Figuren 2 und 3 angegeben. Es handelt sich um AAV rβp"DBD, MVM ""-DBD und AAV rβD-/c"p- DBD (Fig. 2). Durch übliche Komplementationsverfahren können allerdings die durch sie codierten Viren gebildet werden. Beispielsweise wird AAV rβp-DBD in Zellen transfiziert, die gleichzeitig mit einem das rep-Gen exprimierenden DNA-Konstrukt cotransfiziert sind. Es werden Viren erhalten. Diese eignen sich gut zur Gentherapie, da sie sich im Patienten nicht vermehren können.
Ferner weist Fig. 3 auf den bevorzugten Retrovirus DBD-Vektor hin. Durch Trans- fektion in eine übliche Packaging-Zellinie wird das durch den Virus- Vektor codierte Virus erhalten. Dieses eignet sich ebenfalls gut zur Gentherapie.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind somit auch Viren, die durch vor¬ stehende Virus-Vektoren codiert werden.
Erfindungsgemäße Vektoren und Viren zeichnen sich dadurch aus, daß sie die Reparatur von DNA-Schäden hemmen können. Sie eignen sich daher bestens, in Therapien eingesetzt zu werden, in denen Zellen abgetötet werden sollen. Ganz besonders ist die Eignung der erfindungsgemäßen Vektoren und Viren in der Behandlung von Tumoren, insbesondere zusammen mit konventionellen Bestrah- lungs- und/oder Zytostatika-Verfahren, zu sehen. Hierbei schlägt besonders zu Buche, daß sie gewebe(tumor)-spezifisch aktiv sein können. Die vorliegende Erfindung ist richtungsweisend für die gentherapeutische Behandlung schwerster Erkrankungen.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen:
Fig. 1 zeigt eine DNA, die zwischen den Positionen -29 und + 1 127 für die
DBD einer humanen PARP codiert, Fig. 2 zeigt die erfindungsgemäßen Vektoren AAVrepOBP, MVMcap"DBD und
AAVrβp-/c*^DBD, und Fig. 3 zeigt den erfindungsgemäßen Retrovirus-DBD-Vektor.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.
Beispiele
Beispiel 1 : Herstellung des erfindungsgemäßen Vektors AAV ,,p DBD
Es wird von dem Vektor AAV-sub201 (Samulski, R.J. et al., vorstehend) ausge¬ gangen. Dieser Vektor wird mit den Restriktionsenzymen Xbal und Bstbl gespalten. Es werden ein 3,3 kb Vektor-Fragment und ein 1 ,4 kb Rep-Fragment erhalten. Letzteres erstreckt sich bis an das 5 '-Ende des p40-Promotors und wird verworfen. Die Enden des Vektor-Fragments werden "geglättet" In dieses wird ein Insert, P4- DBD-poly A, eingefügt, das von 5' nach 3' folgende Sequenzen umfaßt: (I) ein 259 bp BamHI/Ncol-Fragment, das den P4-Promotor enthält. Dieses Fragment stammt z.B. aus dem Plasmid pEG618 (vgl. Asteil, C. et al., J. Virology 57, (1986), 656-669); (II) ein 1 ,73 kb EcoRI/Hindlll-Fragment aus pPARP6 (vgl. Küpper, J.H. et al., J. Biol. Chem. 265 (1990), 18721 -18724), das sowohl die 1 ,1 kb DBD als auch das 630 bp HSV-Thymidinkinase Poly-A-Signal aufweist. Es wird der Vektor AAV ""»"DBD erhalten.
Beispiel 2: Herstellung des erfindungsgemäßen Vektors MVM """DBD
Es wird von dem Vektor pSR2 (vgl. Russell, S.J. et al., vorstehend) ausgegangen. Dieser Vektor wird mit Hindlll und Bglll gespalten. Es werden ein Vektor-Fragment und ein 1 ,6 kb Capsid-Fragment (II) von MVM erhalten. Letzteres Fragment wird entfernt und durch das Insert-Fragment (II) von Beispiel 1 , DBD-Poly-A, ersetzt. Es wird der Vektor MVM capOBD erhalten.
Beispiel 3: Herstellung des erfindungsgemäßen Vektors AAV r, /c, DBD
Es wird von dem Vektor AAV-sub201 von Beispiel 1 ausgegangen. Dieser Vektor wird mit Xbal gespalten und sämtliche AAV-Bestandteile außer den terminalen Repetitionen werden entfernt. Das restliche Fragment wird mit der intermediären Sequenz, z.B. einem 2,4 kb BamHI/BamHI-Fragment aus pCosAGy2 (vgl. Auer, B. et al., DNA 8 (1989), 575-580), welches nicht-codierende Sequenzen aus dem 7. Intron der humanen PARP aufweist, ligiert. Danach werden die Fragmente I und II aus Beispiel 1 eingefügt. Es wird der Vektor AAV rβp" capOBD erhalten.
Beispiel 4: Herstellung des erfindungsgemäßen Retrovirus-DBD-Vektors
Es wird von dem Vektor N2 (vgl. Keller, G. et al., vorstehend) ausgegangen. Dieser Vektor wird mit EcoRI-Partialverdau 3' des Neomycin-Gen geöffnet. In den Vektor werden dann von 5' nach 3' folgende Sequenzen am 3'-Ende des Neomycin-Gens inseriert: (I) das 0,7 kb poly-A-Signal des ß-Globin-Gens (z.B. das EcoRI/Sall- Fragment aus pECV; vgl. Berg, B.G.M. et al., Gene 4 (1989), 407 - 417); (II) ein 259 bp BamHI/Ncol-Fragment, das den P4-Promotor enthält (vgl. Beispiel 1 , (I)); (IM) ein 1 ,73 kb EcoRI/Hindlll-Fragment aus pPARP6 (vgl. Beispiel 1 , (II)). Es wird der Retrovirus-DBD-Vektor erhalten. Beispiel 5: Hemmung der Reparatur von DNA-Schäden
Die Hemmung der Reparatur von DNA-Schäden wird anhand der Hemmung der Synthese von Poly(ADP-Ribose) gezeigt. Der erfindungsgemäße Vektor AAV^DBD wird durch Elektroporation in HeLa-Zellen transfiziert. Nach der Transfektion werden die Zellen auf Deckgläschen für die Mikroskopie ausgesät. Zwei Tage später werden die transfizierten Zellen auf den Deckgläschen einer genotoxischen Behandlung, z.B. Röntgenbestrahlung oder Behandlung mit alkylierenden Kanzero¬ genen, unterzogen. Dadurch entstehen DNA-Brüche, die zu einer Aktivierung der PARP führen, die dann Poly(ADP-Ribose) synthetisiert. Innerhalb von 30 min nach der genotoxischen Behandlung werden die HeLa-Zellen mit Trichloressigsäure fixiert und einer indirekten Immunfluoreszenz gegen Poly(ADP-Ribose) unterzogen. Es werden keine Poly(ADP-Ribose)-spezifischen Signale erhalten.
Dies zeigt, daß die in Zellen exprimierte DBD eine Hemmung der PARP verursacht.

Claims

Patentansprüche
1 . Vektor, geeignet zur Gentherapie, mit einer exprimierbaren Insert-DNA, die für die DNA-Bindungsdomäne einer Poly(ADP-Ribose)-Polymerase oder für eine zumindest teilweise katalytisch nicht-aktive Poly(ADP-Ribose)-Polyme- rase codiert.
2. Vektor nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß der Vektor auf einem Virus-Vektor beruht.
3. Vektor nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Virus-Vektor ein Adeno-assoziierter Virus-, ein Maus-Minute Virus- oder ein Retrovirus-Vektor ist.
4. Vektor nach einem der Ansprüche 1 - 3, dadurch gekennzeichnet, daß die für die DNA-Bindungsdomäne codierende DNA die Sequenz von Fig. 1 zwischen den Positionen -29 und + 1 1 27 oder eine durch ein oder mehrere Nukleotide davon unterschiedliche Sequenz aufweist.
5. Vektor nach einem der Ansprüche 1 - 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Insert-DNA in einem Tumor exprimierbar ist.
6. Verfahren zur Herstellung des Vektors nach Anspruch 1 , umfassend die Einfügung der Insert-DNA nach Anspruch 1 in einen zur Gentherapie ge¬ eigneten Vektor derart, daß eine Expression der Insert-DNA durch eine bereits im Vektor vorhandene oder ebenfalls inserierte Expressionseinheit erfolgen kann.
7. Virus, codiert durch den Vektor nach Anspruch 2 oder 3.
8. Verwendung des Vektors nach einem der Ansprüche 1 -5 bzw. des Virus nach Anspruch 7 zur Gentherapie, insbesondere bei Tumorerkrankungen.
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