JP2000514652A

JP2000514652A - 産生能力の高いカプシド化系

Info

Publication number: JP2000514652A
Application number: JP10505665A
Authority: JP
Inventors: クラッツマン，ダビッド; サルツマン，ジャン―ルー
Original assignee: ユニベルシテ・ピエール・エ・マリ・キュリー（パリザシックスス）
Priority date: 1996-07-16
Filing date: 1997-07-09
Publication date: 2000-11-07
Also published as: CA2262814A1; US20020123146A1; US6872528B2; FR2751345A1; EP0912723A1; WO1998002529A1; FR2751345B1

Abstract

(57)【要約】本発明は、導入遺伝子を有する感染性欠損ウイルスの産生のためのパッケージング真核細胞において、特に選択培地の存在下でその成長に必須の細胞機能が欠損しており、該機能は、− パッケージング細胞のトランス補完機能を有するベクターと共に、又は− 導入遺伝子を有するベクターと共に、該細胞内に導入された外因性配列の発現によって回復でき、しかも前記外因性配列を有する細胞の選択培地内での選択を可能にすることを特徴とするパッケージング真核細胞に関する。

Description

【発明の詳細な説明】産生能力の高いカプシド化系本発明の目的は、遺伝予治療においてヒトに利用できる高力価の組換えレトロウイルスを産生する、カプシド化系（パッケージング系）と呼ばれる新しい細胞系にある。組換えレトロウイルスによる遺伝子導入は現在、治験の枠内のみならず実験的研究作業のためにも広く利用されている。これらの異なる状況下で利用されるレトロウイルスベクターは通常《パッケージング》又はパッケージング又はトランス補完（transcomplementation）系と呼ばれる系により産生され、これら３つの用語は同じ意味をもつ：これらの系は、構造タンパク質及びそれらの感染力に必要な酵素を含有するレトロウイルス粒子の製造に必要な異なるタンパク質の構成性発現を可能にする遺伝子構成体を用いて形質導入された細胞である。カプシド化系の目的は、トランス補完により、「ヘルパー」機能、特に、感染性欠損ウイルスの利用によって、その発現が探究されている導入遺伝子を有するゲノムベクターが有していないｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖタンパク質をコードする遺伝子を提供することにある。配列ψが備わっていないこれらの「ヘルパー」機能は、それらを含有しかつそのＲＮＡ転写物がカプシド化配列ψの欠失の結果ウイルス粒子内にカプシド化されていない単数又は複数のプラスミドのトランスフェクションの後、トランス補完細胞の中で安定した形で発現される。これらのカプシド化細胞が次に導入遺伝子を有するベクターによるトランスフェクションを受けた時点で、パッケージング細胞により産生されたウイルスタンパク質ｇａｇは、その後環境内で塩析されるウイルス粒子の中で、導入遺伝子を有するレトロウイルスベクターをカプシド化することができる。(概説についてはMiller AD Gene Ther，1990 1:5-14を参照のこと)。この一般的原理に基づき、異なるタイプのパッケージング系が実現され、今日広く利用されている。しかしながら、これらの系は、特に特定の導入遺伝子のためのその利用又は特定の方法に応じて最適化できるものでは全くない。特に、導入遺伝子又はその誘導された発現産物が望ましくない効果（不適切な発現又は不適切な挿入により）を誘発する場合、患者に投与された形質導入を受けた細胞を消滅させる手段は全く存在しない。必要な場合に破壊され得るパッケージング細胞を確保することが重要である理由となるもう１つの側面は、組換えがパッケージング系に基づく感染性ウイルスの形成を導き得るということがわかっている故に、厳密に安全上の問題である。パッケージング系を中で実現できる出発細胞の選択は、期待される特性及びその潜在的な臨床的利用から見て極めて重要である。今までのところ、臨床的に用いられる細胞系の大部分はすべてマウス由来の線維芽細胞つまりＮＩＨ−３Ｔ３細胞から誘導されている。これらの細胞の利点は、十分に特徴づけされていること、形質転換を受けていないこと(in vivoで再度注入された場合に腫瘍をひきおこさない)、多世代にわたり飼育され、その体内ひいては潜在的に利用される細胞の中に伝染性の感染性作用因子の存在を疑わせる可能性を残す特定の病気（例えば神経変性タイプの病気）を呈していないことがわかっている動物に由来するものであることにある。そのうえ、マウスの細胞の使用は、感染病理学において頻繁に観察される種の制限の結果、未知の伝達性感染作用因子による汚染の場合に補足的な安全性を提供する。しかしながら、マウスの細胞がもつ欠点の１つは、これらの細胞によって産生されるウイルス及びこれらの細胞自体がほとんどの場合ヒトの補体によって急速に中和されるということに起因するものである。この欠点を補正する単純な手段は、ヒトの細胞又はヒトの補体に対する耐性をもつその他の種の細胞からパッケージング細胞を産生することにある。しかしながら、ヒトの細胞の場合、それは往々にして形質転換されており、したがって、腫瘍の潜在性をもつ。そのうえ、当然のことながら細胞の由来そして、人間に感染し得る発生源のわかっていない感染性作用因子によるその汚染の可能性は、詳しくわかっていない。サルの細胞は、補体によって破壊されないウイルス粒子を作るその特性のため、ヒトの細胞と同様に利用できるが、これらの細胞は実際、感染作用物質の存在の可能性に関してヒトの細胞と同じ欠陥を有している。これは、ヒトの補体及び／又は血清に対するより大きな耐性を付与する遺伝子が中に導入されたマウスの細胞であってもよい。これらの遺伝子は特に、ＣＤ４６、ＣＤ５５、Ｃ₁阻害物質(Ｃ₁ＩＮＨ)、タンパク質Ｈ、可溶性ＣＲ₁、特に特許FR9508901号に記述されたような多量体形態であってもよい。本発明の目的は、上述の問題のうちの単数又は複数のものを少なくとも一部分補正し、 − 高い力価で組換えレトロウイルスを産生でき、 − 充分に寛容され得、 − その安全性に関して許容可能な状態にとどまりながら、補体に対し耐性をもつことができ、 − その発現において３ヶ月以上の安定性をもち、良好な実用製造条件下で容易に産生でき、 − 導入遺伝子を有するベクターを取込んだ血液細胞の正の選択を可能にする選択遺伝子を確保でき、 − 必要に応じて細胞を破壊できる安全系を確保できる、新しいカブシド化系の調製手段を提供することにある。これらの異なる前提条件を達成するためには、一方では、出発細胞系の選択、ならびに感染性欠損組換えレトロウイルス粒子の獲得に必要な構成要素の各々の選択、特にパッケージング細胞をレトロウイルスのｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖタンパク質を産生するものにすることのできるベクターの選択を最適化することが必要である。臨床的用途のウイルス及び細胞の産生のための優れた実用製造条件（ＧＭＰ）下で実現される大量培養でのこれらの細胞の産生に関しては、短い分割時間で、場合によっては懸濁状態で高い密度で発生する、完全に周知の成長特性をもつ細胞を得ることが必要である。最後に、利用される細胞から、異なる好都合な導入遺伝子を発現する安定したトランスフェクタントを選択できることが必要である。現在、好都合な遺伝子を含む唯一のベクター及びいわゆる選択遺伝子、又は２つの分離されたベクターによるパッケージング細胞の形質導入が利用されている。形質導入された細胞のその後の培養の際には、一般に、好都合な導入遺伝子を失うことがないよう、選択性を維持することが必要である。しかしながら、この選択性の存在下でさえ、異なるタイプの改変の結果、治療用遺伝子の発現が失われる可能性があるということも知られている。このことは特に、導入遺伝子が選択的利点を失なった稀な細胞に対しそれを付与することになる一定の傷害性をもつ場合に言えることである。したがって、この基準に基づくその選択を可能にする或る種の酵素が欠損した細胞の利用可能性は、特に治療用の遺伝子がその欠損を補完する場合、１つの補足的利点となる。換言すると、有毒物質（一般に抗生物質）に対する耐性をもつ遺伝子の代わりに細胞の遺伝的欠損を補足する遺伝子を選択遺伝子として利用することには、有毒物質のない状態で前記細胞を培養する可能性を含めた数多くの利点がある。そのうえ、この遺伝子が同じく好都合な遺伝子であるならば、それが選択上の不利点を付与する場合でも、選択の間にこれを失なう可能性はない。この遺伝子は同様に、いわゆる「安全性」遺伝子又は「自殺遺伝子」であってもよく、これは外因性物質の存在下でのこの遺伝子の発現産物が、細胞の特異的破壊を導くことを意味している。したがって本発明は導入遺伝子を有する感染性欠損ウイルスの産生のためのパッケージング真核細胞において、特に選択培地の存在下でその成長に必須の細胞機能が欠損しており、この機能は、 − パッケージング細胞のトランス捕完機能を有するベクターと共に、又は − 導入遺伝子を含むベクターと共に、該細胞内に導入された外因性配列の発現によって回復でき、しかも、細胞内にこのように導入された外因性配列の発現が前記配列を有する細胞の選択培地内での選択を可能にすることを特徴とするパッケージング真核細胞を目的とする。本発明によるパッケージング真核細胞は、 − １mlあたり１０⁵以上の粒子の割合でウイルス粒子を産生することができる； − それ自体補体に対する耐性をもつか、又は補体に対する耐性をもつウイルス粒子を産生する； − ３０時間未満の分割時間をもつ； − 非選択性培地内で少なくとも３ヶ月の安定性をもつ； − 内因性レトロウイルスが備わっていない；という特性のうちの１つ又は複数のものを確認するものであることを特徴とする本発明はまた、それ自体適切なベクターにより含まれる好都合な遺伝子が、欠損組換えウイルスを産生することのできるパッケージング系の選択遺伝子として利用される、治療用遺伝子を有する感染性欠損ウイルスを産生するパッケージング系にも関する。これを基礎として、複数のタイプの細胞を利用することができる：すなわちＮＩＨ−３Ｔ３ＴＫ^-細胞、ａ）臨床で利用される組換えレトロウイルスを産生するパッケージング細胞として現在広く利用されているマウスのＮＩＨ−３Ｔ３細胞(Takahara et al．J ournal of Virology（1992年６月）66（6）3725-32)。ｂ）ＮＩＨ−３Ｔ３ＴＫ^-細胞を含むＴＫ^-系についてはすでに記述されてきている(F，Wagner et al.，EMBO Journal(1985)，第４巻No.3，663〜666ページ)；これらの細胞は、ＨＡＴのような選択培地内で培養された場合、死滅する可能性がある。これらの細胞は、例えばＨＳＶ１−ＴＫウイルスに由来するもののようなチミジンキナーゼ機能については相補的であるものの、このとき選択培地内で発生し得る。したがってこのような系は、ＨＳＶ１−ＴＫ遺伝子を選択遺伝子として利用する可能性を提供する。ＨＳＶ１のチミジンキナーゼ又はその機能的誘導体の１つをコードする遺伝子は同様に、ガンシクロビル又はアシクロビルを細胞傷害性に転換させるプロドラッグとしての導入遺伝子として広く利用され、したがって例えばガン細胞といった細胞の選択的破壊に応用される(例えばW O95/22617参照)。さらに一般的には、ＴＫ^-細胞は、例えばベロ細胞といったパッケージング細胞として利用できるすべての細胞の突然変異によって誘導され得る。したがって、発現ベクターに含まれる治療用遺伝子がチミジンキナーゼのために欠損パッケージング細胞内に導入された場合、導入遺伝子を有するベクターを組込んだパッケージング細胞の選択は、治療用遺伝子自体について行われ、したがって欠損組換えウイルスの培養の生産性は増大し、組換えベクターを組込まなかったパッケージング細胞は必然的結果として選択培地内でとり除かれる。より一般的には、本発明は、導入遺伝子が欠損した細胞機能を回復することができる、その成長に不可欠な細胞機能が欠損したパッケージング細胞に関する。導入遺伝子を有する組換え感染性欠損ベクターが、補体ならびに血液又は間質液中のウイルス又は細胞を潜在的に破壊するその他の因子に対し耐性をもつことが重要である。そのために、本発明の細胞系は好都合にも、それ自体補体に対する耐性を持ち、したがって好ましくはヒト又はサルの細胞、より特定的には、旧世界（アジア、ヨーロッパ、北アフリカ）のサルの細胞又は改変されたヒトの細胞に由来するものであってよい。ヒト又はサルの細胞の場合、由来がはっきりしている、すなわち由来がわからず人間に感染し得る感染性作用因子を有していない細胞を確保することが重要である。１４３ＢＴＫ^-系は、既知のヒト由来の系である(Manservigi R et al． Virology内（1988年11月）167（1）284-8)；これは短かい分割時間すなわち約１８時間の分割時間をもち、補体に対する耐性をもつウイルス粒子を産生する。したがってこれは、本発明のパッケージング細胞として好都合に利用可能である。ベロ細胞は同様に、特にワクチンの生産のために広く用いられている。これは、同様に補体による中和に対する耐性をもつウイルス粒子を産生するサルの細胞である。これらの系の培養条件は完全に公知であり、チミジンキナーゼが欠損している系は従来の技術によって得ることができ、また、本発明の系の特徴をもつパッケージング系としてパッケージングの構成を可能にするベクターによる形質転換の後に好都合に利用できる。レトロウイルスのパッケージング細胞系の機能は、導入遺伝子を有する組換えベクターが、欠損したトランス補完機能を提供することにあり、これらの機能は、基本的に、タンパク質ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖをコードする遺伝子である。これらの機能は、複製に対する応答能のある組換え型粒子を生成する可能性をきわめて低下させるように、１つ又は好ましくは全く異なる少なくとも２つのプラスミドからパッケージング細胞内で安定した形で発現させられる。既存のパッケージング系は、マウス又は鳥のレトロウイルスタンパク質から作られており、Mi ller AD，Hum Gene Ther，1990 1:5-14内で記述されている。マウスのレトロウイルスのｇａｇ及びｐｏｌ遺伝子は、通常、オープンリーディングフレームのシフトによりｇａｇ前駆体又はｇａｇ／ｐｏｌ前駆体を発生させるのと同じＲＮＡによって合成される。このプロセスは、モロニー型のレトロウイルス粒子において充分に最適化されており、本発明のパッケージング細胞を作るための構成体は、ψの欠失を除いてｇａｇ／ｐｏｌのＬＴＲ構造に触れることがない。ｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子ならびにＬＴＲの選択は、産生される組換え欠損ウイルス粒子の率を高くするという目標に応じて行われることになり、したがってこれらのｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子の可能なかぎり最大の発現が求められる。本発明の一実施態様に従うと、カプシド化細胞は、それが − たとえばフレンドウイルスＦＢ２９のＬＴＲといったそれ自体優れた転写効率を特徴とするＬＴＲを有するベクター(WO96/17071を参照のこと)； − その機能の構造及び発現が最適化されるかぎりにおいて、モロニーウイルス、又はフレンドウイルス又はその他すべてのレトロウイルスに由来するｇａｇ／ｐｏｌ領域；ｃ）定量的選択すなわち、選択圧力を増大すると実験的に合成される転写物の数が増大するような選択遺伝子；を含むことを特徴とする。定量型の選択遺伝子がｇａｇ及びｐｏｌをコードするプラスミドと同じプラスミド上にある場合、選択遺伝子をコードする転写物の数の増加は、ｇａｇ及びｐｏｌをコードする転写物の数と同じ要領で増大する。最適化は、選択遺伝子の翻訳がｇａｇ／ｐｏｌの翻訳より小さくなるようにした場合、さらに改善されることになる。このため、選択遺伝子は、ｐｏｌの停止コドンから約１００塩基対のところに位置づけられるか、又は正常なもしくは突然変異を受けたＩＲＥＳ配列（内部リボソーム進入部位：Internal Ribosomal Entry Site）の制御下に置かれ、したがって翻訳の開始がｇａｇ及びｐｏｌ遺伝子よりも効率が悪くなるようになっている。突然変異は、主要なＡＴＧを削除することからなるものであってよく、このとき開始は、既存の又は突然変異によって生成された比較的性能の低いＡＴＧ上で行われる。ＩＲＥＳ配列は、ポリシストロンＲＮＡ転写物の翻訳を制御するためレトロウイルス構成体の中で利用される配列である。ＩＲＥＳ配列は、開始コドン内で直接翻訳を開始させることができる。したがってこのような配列を内含することにより、同一のプロモーターから複数の遺伝子を発現することが可能となる。選択遺伝子をｐｏｌ停止コドンから約１００塩基のところに位置づけるというもう１つの代替案は同様に、ｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子の翻訳に比べて選択遺伝子の翻訳を減衰させることも可能にする。選択遺伝子は同様に、ｅｎｖ遺伝子を有するベクターがｇａｇ／ｐｏｌを有するベクターと全く異なるものである場合に、このｅｎｖ遺伝子を有するベクターの上に位置づけされてもよい；要するに、パッケージング細胞を構成する２つのベクターは両方共選択遺伝子を有することができる。選択遺伝子は例えば、ＢＳＲタイプの遺伝子、つまりブラスチシジンＳ耐性遺伝子又はゼオマイシン耐性遺伝子であってよい。ブラスチシジン耐性遺伝子は、特にExperimental Cell Research(1991)，197:229-233の中でIZUMI M et alによって記述された動物細胞のための選択遺伝子である。この遺伝子は、優れた収率でヒトのモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを産生するための選択マーカーとして特に利用されたため、特に効率が良いと思われる。(Journal of Immunolo gical methods，1994，177;17-22) 本発明のパッケージング系の構成に特に適したベクターの一例が図１ａの中に示されている。パッケージング細胞の構成のために利用できる第２のベクターは、レトロウイルスエンベロープをコードする遺伝子を有する。レトロウイルスエンベロープをコードする遺伝子の大部分は、細胞に対して一定レベルの傷害を有する可能性がある。ところが、組換え欠損レトロウイルス粒子が充分な感染力をもつためには、合成される充分な量のエンベロープタンパク質を有することが必要である。例えば両種指向性(enphotrope)であるようなエンベロープから誘導されたペプチドをコードするｅｎｖ配列は、例えばモロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）の４０７０ａのエンベロープであり得る。ただし、レトロウイルスの出芽時点で細胞膜内に組込まれる可能性のあるエンベロープタンパク質をコードするあらゆる遺伝子型が利用可能である：ｅｎｖタンパク質の選択は、組換え欠損レトロウイルスによるトランスフェクションが望まれる標的細胞のレセプターの性質によって導かれ得る。パッケージング細胞の構成プラスミドが有するｅｎｖ遺伝子は、ウイルス又は非ウイルス転写調節配列に依存している。つまりこれは、予備選択によって細胞に大量のエンベロープを強制的に合成させるような、遺伝子構成体の枠内のサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のプロモーターのような強力なプロモーターであると考えられる。「強力なプロモーター」というのは、ＲＮＡポリメラーゼ固定部位、ならびに調節タンパク質の固定部位を有しかつこのようなプロモーターの制御下にある配列の高い率での転写を可能にするあらゆる核酸配列のことである。同様にここで問題となるのは、その後ウイルス粒子の収集の際に一時的に誘発され得ることになるエンベロープの欠如又は低い発現を可能にするような誘導プロモーターでもあり得る。「誘導プロモーター」というのは、所定の分子により意のままに活性化できるプロモーター配列のことである。このタイプのプロモーターは、所定の遺伝子の発現を要求に応じて開始させたい場合にその都度に利用される。本発明のパッケージング細胞の構成において利用可能な誘導プロモーターの例としては、Mol．and Gen．Genetics（1977 ９月）157(3);301-11の中でBujard et alによって記述されているテトラサイクリンによる誘導プロモーター又は、プロモーターＲＡＲ−β（Japanese Journal of Genetics（1993年６月）68（3 ）175-84）といったような条件付き誘導プロモーターがある；「条件付きプロモーター」は、例えば厳密に膵臓の因子に対し感受性をもつインシュリンのプロモーターといったように、所定の組織によって特異的に産生されるものの必ずしも同定されていない単数又は複数のトランス調節因子によって活性化されるプロモーター配列で構成されている。これらの構成体は、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）の４０７０Ａ型の従来のあらゆるｅｎｖ遺伝子又は、特にＲＤ１１４タイプの補体に対する耐性のようなその特定の特性に応じて利用可能なエンベロープに対し応用できる。ＨＴＬＶ１タイプのエンベロープ又は泡沫状ウイルスのようなレンチウイルスの誘導体も同様に利用できる。パッケージング細胞により産生された組換え欠損ウイルスによるトランスフェクションを受ける可能性のある標的細胞に対して特定の親和性をもつエンベロープ遺伝子は、例えば、ヒト造血細胞に対して特定の親和性をもつスプマウイルスのエンベロープ配列のように、好都合に利用可能である。最後に、以上で記述したような誘導系の枠内では、このときＶＳＶ−Ｇタイプのエンベロープを利用することが可能となるだろう。ｅｎｖ遺伝子を有するベクターは、３’において、ＳＶ４０ウイルスに由来するようなポリアデニル化配列を有している。ｅｎｖ遺伝子を有するベクターの一例が、図１ｂに示されており、この図中、ＺｅｏＲはゼオマイシン耐性遺伝子である。パッケージング細胞を構成できるようにする２つのベクターは、当然のことながら、カプシド化配列を備えていない。その異なる実施態様と合わせて、上述したような組換えパッケージング細胞は、治療用に選ばれたヌクレオチド配列（導入遺伝子）の標的細胞のゲノム内部での発現及び／又は組込みのため組換えレトロウイルススベクターによるトランスフェクションを受けることができる。この導入遺伝子は、標的細胞内の欠損機能をコードし、かつその中にこの機能を回復させることが望まれている配列、又は標的細胞内に補足的及び／又は調節用機能を導入するための配列、あるいは制限的な意味なく、ガンシクロビル又はアシクロビルを細胞を破壊する有毒薬物に転換するＨＳＶ１ウイルスのチミジンキナーゼの遺伝子、又は５フルオロウラシル前駆体を活性薬物に転換するシトシンデアミナーゼの遺伝子の場合のように、プロドラッグを活性化させることを可能にする配列であり得る。最後に、これは、腫瘍細胞の操作又は免疫系自体の細胞の操作により免疫系を誘発するか又は刺激することができる導入遺伝子であってもよいし、又は反対に、例えば移植片拒絶の場合や自己免疫疾患の場合において免疫応答を特異的に阻害することのできる導入遺伝子であってもよい。導入遺伝子を有するレトロウイルスベクターの一般的構造は、単数又は複数の好都合な遺伝子又は導入遺伝子をとり囲む２つのＬＴＲの存在を必要とし、本発明のパッケージング細胞によりコードされる構造タンパク質をもつシュードレトロウイルス粒子の中の転写物のカプシド化を可能にする領域を有する。利用されるＬＴＲに関しては、上述のようにその高い発現率を理由としてフレンドウイルスから誘導されたＬＴＲ、あるいはなかんづく腫瘍細胞がそうであるほとんど又は全く分化していない細胞中で発現されるそのより大きな能力を理由として、Ｍｏｖ菌株から誘導され特許出願EP第0674716号の中で記述されたＬＴＲ（Jaenish参照）などのモロニー菌株から誘導されたＬＴＲが好まれる。本発明は同様に、標的細胞の中でのその発現が探求されている非相同遺伝子を有する組換えベクターにおいて、 − １つのプロモーターの制御下にある治療用遺伝子Ｘ； − その発現がパッケージング細胞内の欠損機能を補完するヌクレオチド配列Ｙ； − カプシド化配列ψ； − 場合によっては、外因性物質の存在下でのその発現がトランスフェクション又は感染を受けた細胞の破壊を導く安全遺伝子Ｚ；を有することを特徴とする組換えレトロウイルスベクターにも関する。治療用導入遺伝子が、例えばＨＳＶ１−ＴＫ又はその機能的誘導体のうちの１つをコードするような自殺遺伝子である場合、配列Ｘ及びＹ又はＹ及びＺは、唯一の同じ遺伝子しか形成せず、このようなベクターの利用は、このベクターによるトランスフェクションを受けた前記パッケージング細胞を選択することを可能にする。優れたウイルス力価は、パッケージング細胞によって産生されたカプシド化可能な転写物の数により左右される。本発明は同様に、ａ）少なくとも、 − 治療用遺伝子Ｘ； − ｇａｌ、ｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子を有するベクターによるパッケージング細胞の構成後もこの欠損が存続する場合に、その発現がパッケージング細胞の欠損機能を補完するヌクレオチド配列Ｙ； − カプシド化配列ψ； − 場合によっては、外因性物質の存在下でのその発現がトランスフェクション又は感染を受けた細胞の破壊を導く安全遺伝子Ｚ；を有する組換えベタクーによる前記細胞の感染又はトランスフェクション；ｂ）パッケージング細胞が所定の機能を欠損しており、導入遺伝子を有するベクターがこの欠損を補足する場合の、選択培地内での前記細胞の選択；を含む、上述のとおりの細胞の中での高力価の組換え感染性欠損ウイルスの獲得方法にも関する。パッケージング系にチミジンキナーゼが欠損している場合、導入遺伝子を有するベクターは、ＨＳＶ１のチミジンキナーゼ遺伝子又はその機能的誘導体の存在下で選択を可能にするジシストロンベクターとなる。ＨＳＶ１−ＴＫ遺伝子の驚くべき特性は、高い発現率が細胞に対する傷害をひき起こし、多数の転写物の獲得を妨げているということにある。遺伝子のこの傷害の場合、産生能力のある細胞の選択は、遺伝子の発現が弱く、したがって感染性力価がきわめて低いクローンの獲得を導く。したがって、上述のパッケージング細胞を感染又はトランスフェクションすることのできる本発明のベクターは、導入遺伝子のカプシド化可能な転写物の産生が、ＨＳＶ１−ＴＫタンパク質の産生と比べて高くなるような形で構成されることになる。したがって、一方では導入遺伝子を有し、他方ではＨＳＶ１−ＴＫ又はその誘導体の１つを有するジシストロンベクターによるトランスフェクションを受けたパッケージング細胞ＴＫ^-は、遺伝子が活発に翻訳された場合ＨＳＶ１−ＴＫの有毒活性に起因する対抗選択を回避しながら、高力価のウイルス粒子を産生できると同時に、ＨＡＴ選択培地内で選択可能でもある。したがって、こうして、ＨＳＶ１−ＴＫ単独又は好都合な遺伝子とＨＳＶ１−ＴＫをコードする欠損レトロウイルスを産生し、高い力価を有するパッケージング細胞の実現が可能となる。一方では導入遺伝子Ｘ他方ではＹの転写物の産生におけるこの差異は、例えばＨＳＶ１−ＴＫといったパッケージング細胞の欠損機能をその発現が補完するヌクレオチド配列Ｙが導入遺伝子の停止コドンから約１００塩基対のところに位置づけされているか、又は上述のような正常な又は突然変異を受けたＩＲＥＳ型配列の制御下におかれ、したがって配列Ｙの翻訳の開始が配列Ｘの翻訳より効率が悪いものとなるようになっている、組換えベクターの構成によって実現される。導入遺伝子自体がパッケージング細胞の選択を可能にする遺伝子である場合、つまりＸ及びＹが唯一の同じ遺伝子（例えばＨＳＶ１−ＴＫ）である場合、好都合な遺伝子はそれ自体選択遺伝子として利用される。反対に遺伝子Ｘ及び遺伝子Ｙが異なる場合、遺伝子Ｙは同様に安全遺伝子Ｚの機能も果たすことができる。これは、該当する場合この遺伝子Ｙが、プロドラッグを有毒薬物に転換する物質で患者を治療することにより治療用遺伝子でトランスフェクションを受けた細胞を破壊できるようにするからである。配列Ｙ、場合によっては配列Ｚが、ＨＳＶＩ−ＴＫをコードする場合、本発明の組換えベクターの実施例は、図２に表わされている。この図において、表示された２つのベクターは、遺伝子Ｘの停止コドンからの一定の距離によって又はＩＲＥＳ配列の導入によって遺伝子ＨＳＶ１−ＴＫ（配列Ｙ及びＺが統合したもの）のより小さな発現を可能にする２つの実施態様の間の差異を示している。ｇａｇ＊で表わされた配列は、パッケージング配列がカプシド化に必要な遺伝子領域のみならず、ｇａｇタンパク質の再構成を可能にしないもののカプシド化の効率を高めることのできる突然変異したｇａｇ遺伝子の部分を含むことができるということを意味している。ＨＳＶ１−ＴＫの特性は、この概念と相容れるものである。実際、負のＴＫ細胞が誘導された細胞クローンをＨＡＴ選択培地の存在下で選択できるためには、きわめて少量のＴＫで充分である。同様にしてガンシクロビルに対する優れた感受性を得るためには、非常にわずかなＴＫ発現で充分である。或る種の場合には、３つの遺伝子Ｘ、Ｙ及びＺは、同時に導入遺伝子、選択遺伝子及び安全遺伝子の役目を果たす遺伝子ＨＳＶ１−ＴＫの場合のように、唯一の遺伝子しか表わさないことがある。このような構成体は、例えば、ガン細胞を除去したい場合にサイトカインをコードする遺伝子のような第２の治療用遺伝子をベクター内に付加できるという利点を呈する。ＴＫ遺伝子が治療用遺伝子自体である場合、本発明のもう１つの実施態様は、遺伝子Ｙが例えば上述のＢＳＲ遺伝子のようなもう１つの選択マーカーをコードする遺伝子又は例えばサイトカイン遺伝子のような治療用のもう１つの遺伝子であり得ることを特徴とすることができる。遺伝子Ｙの最適化された発現のためには、この遺伝子Ｙを、それ自体レトロウイルスベクターのＬＴＲによる「読み過し(read through)」によって減衰され得る弱い内部プロモーターの制御下におくことができる。この条件下で、ベクターのＬＴＲ３’は同様に、この「読み過し」が組換えウイルス粒子による標的細胞の感染後の発現を妨げることがないような形でアンプリファイアの欠失を含有することができる。一般に、高力価の組換え欠損ウイルスの獲得方法は、それが欠如するとパッケージング細胞に対する負の選択圧力が誘発されるようなあらゆる導入遺伝子に関わるものである；このように、この導入遺伝子をコードする遺伝子が欠失した細胞は、このとき選択ベクターの役割を同時に果たすレトロウイルスベクターによって「助けられる」ことになる。好都合な遺伝子の発現がそれを対抗選択する傾向をもつ場合でさえ、組換えレトロウイルスを有しそれを産生するパッケージング細胞のみが、正の選択を受けることになるため、上述のことはしたがって、その過剰発現が細胞のための負の選択圧力を誘発するような細胞遺伝子全てにあてはまるだろう。本発明は、遺伝子治療用薬剤に必要とされる安全面及び効力面の長所すなわち補体に対する耐性及び必要に応じてin situで破壊される可能性を有するこのような遺伝子治療用薬剤の調製における、上述のパッケージング細胞及びベクターの利用に関する。本発明は、造血幹細胞、リンパ細胞又はガン細胞のような免疫系の標的細胞の形質転換における、前述のとおりの好都合な遺伝子を有する組換えベクター及び本発明によるパッケージング細胞の利用に関する。本発明は同様に、パッケージング細胞によって産生される遺伝子治療用遺伝子を有する感染性欠損レトロウイルスの標的細胞の共存培養方法における、上述の通りのパッケージング細胞の利用にも関する。なおここで、前記パッケージング細胞は、このようにして薬剤に転換された前記標的細胞の利用の前に絶対に破壊されなくてはならない。実際には、例えば標的細胞がリンパ系の細胞又は造血幹細胞である場合のように、或る種の適応に標的細胞及びパッケージング細胞のin vitroでのこの共存培養が必要となることが知られている。パッケージング細胞は、このように転換された標的細胞の再導入の前に必ず除去されなくてはならない。パッケージング細胞が例えば選択遺伝子のようなＨＳＶ１−ＴＫ遺伝子を有する場合、ガンシクロビル及びアシクロビルの存在下でＨＡＴを含有する培地の利用は、前記パッケージング細胞によって産生されたレトロウイルスによるトランスフェクションを受けた唯一の標的細胞に好都合なように、ＨＳＶ１−ＴＫ遺伝子を有する細胞ひいては、パッケージング細胞を選択的に破壊することを可能にすることができる。共存培養の場合におけるもう１つの実施態様も、ＨＳＶ１−ＴＫ遺伝子を本来有していないパッケージング細胞を用いて実現でき、適切な細胞濃度を維持しながらＨＡＴ選択培地の存在下で細胞混合物を選択することによって、同様に標的細胞を変性させることなくパッケージング細胞を消滅させることができる。

Claims

【特許請求の範囲】１．導入遺伝子を有する感染性欠損ウイルスの産生のためのパッケージング真核細胞において、特に選択培地の存在下でその成長に必須の細胞機能が欠損しており、かかる機能は、 − パッケージング細胞のトランス補完機能を有するベクターと共に、又は − 導入遺伝子を有するベクターと共に、該細胞内に導入された外因性配列の発現によって回復でき、しかもこの発現が前記外因性配列を有する細胞の選択培地内での選択を可能にすることを特徴とするパッケージング真核細胞。２．− １mlあたり１０⁵以上の粒子の割合でウイルス粒子を産生することができる； − 補体に対する耐性をもつか又は補体に対する耐性をもつウイルス粒子を産生する； − ３０時間未満の分割時間をもつ； − 非選択性培地内で少なくとも３ヶ月の安定性をもつ； − 内因性レトロウイルスが備わっていない；という特性のうちの１つ又は複数のものを確認するものであることを特徴とする請求項１に記載の真核細胞。３．ヒト又はサルの細胞に由来することを特徴とする請求項１又は２に記載の細胞。４．導入遺伝子自体が欠損細胞機能を回復できることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞。５．導入遺伝子は、チミジンキナーゼ又はその機能的誘導体をコードする遺伝子であることを特徴とする請求項４に記載の細胞。６．系１４３ＢＴＫ^-又はベロ細胞３Ｔ３−ＴＫ^-に由来する請求項３〜５のいずれか１項に記載の細胞。７．− 最初のものについては、ＬＴＲタイプのプロモーター、ポリアデニル化配列、場合によってはｇａｇ及びｐｏｌの転写調節シグナルの制御下にあるｇａｌ／ｐｏｌ遺伝子； − 第２のものについては、好都合にはｐＣＭＶタイプの強力なプロモーター又は誘導プロモーターの中から選ばれることになるプロモーター、ポリアデニル化配列の制御下にあるエンベロープタンパク質をコードする遺伝子； − 第１又は第２のベクター上に位置づけされ得るパッケージング系の形での細胞の確立のための少なくとも１つの選択遺伝子；を有し、しかもカプシド化配列を持たない少なくとも２つのレトロウイルスベクターでのトランスフェクションによって改変される請求項１〜６のいずれか１項に記載の細胞。８．選択遺伝子が第１のベクター上にあり、特にブラスチシジンＳ（ＢＳＲ遺伝子）又はゼオマイシン（ZeoR遺伝子）に対して耐性をもつ遺伝子であり得ることを特徴とする請求項７に記載のパッケージング細胞。９．選択遺伝子が、ｐｏｌの停止コドンから約１００塩基対のところにあるか、又は正常な又は突然変異を受けたＩＲＥＳタイプの配列の制御下にあり、そのため選択遺伝子の翻訳の開始が遺伝子ｇａｇ及びｐｏｌのものより効率の悪いものとなっていることを特徴とする請求項７又は８に記載のパッケージング細胞。１０．遺伝子ｇａｇ及びｐｏｌを制御するプロモーターがフレンドＢ２９ウイルスのＬＴＲであることを特徴とする請求項７〜９のいずれか１項に記載のパッケージング細胞。１１．第２のベクターが同様に、第１のベクター上にあるものとは異なる選択遺伝子も含有しており、前記選択遺伝子はｐｏｌの停止コドンから約１００塩基対のところにあるか、又はＩＲＥＳ型配列の制御下にあり、そのため選択遺伝子の翻訳の開始が遺伝子ｇａｇ及びｐｏｌのものより効率の悪いものとなっていることを特徴とする請求項７〜１０のいずれか１項に記載のパッケージング細胞。１２．配列ψを有する標的細胞内でその発現が探求されている異種遺伝子を有する組換えレトロウイルスベクターにおいて、 − その発現がパッケージング細胞内で欠損機能を補完しているようなヌクレオチド配列Ｙ； − 場合によっては、外因性物質の存在下でのその発現がトランスフェクション又は感染を受けた細胞の破壊を導く安全遺伝子Ｚ；を含むことを特徴とする組換えレトロウイルスベクター。１３．Ｘ及びＹ、又はＹ及びＺ、又はＹ及びＺが、単一の同じ遺伝子しか表わしていないこと、及び、前記ベクターが好都合な導入遺伝子Ｘを含有するパッケージング細胞の選択を可能にすることを特徴とする請求項１２に記載のベクター。１４．ａ）少なくとも、 − １つのプロモーターの制御下にある治療用遺伝子Ｘ； − その発現がパッケージング細胞内で欠損機能を補完するヌクレオチチド配列Ｙ； − カプシド化配列ψ； − 場合によっては、外因性物質の存在下でのその発現がトランスフェクション又は感染を受けた細胞の破壊を導く安全遺伝子Ｚ，を有する組換えベクターによる前記細胞の感染又はトランスフェクション；ｂ）配列Ｙが発現されない場合、細胞の死をひき起こす物質を含む培地内での前記細胞の選択；を含む請求項１〜１３のいずれか１項に記載のパッケージング細胞内の高力価の組換えウイルスの獲得方法。１５．配列ＹがＸの停止コドンから約１００塩基対のところにあるか、又はＩＲＥＳ型配列の制御下にあり、したがって配列Ｙの翻訳の開始が配列Ｘのものより効率の悪いものとなっていることを特徴とする請求項１４に記載の方法。１６．配列Ｙ及びＺが同一である請求項１４及び１５のいずれか１項に記載の方法。１７．治療用遺伝子Ｘと配列Ｙが同一である請求項１４又は１６のいずれか１項に記載の方法。１８．細胞は、例えば１４３ＢＴＫ^-系由来の細胞のようなチミジンキナーゼが欠損した細胞であり、配列ＹはＨＳＶ１−ＴＫのチミジンキナーゼ又はその機能的誘導体のうちの１つの遺伝子の配列であり、このとき細胞はＨＡＴ培地内で選択され、必要な場合にはガンシクロビル又はアシクロビルの存在下で破壊され得ることを特徴とする請求項１４〜１７のいずれか１項に記載の方法。１９．前記パッケージング細胞により産生される遺伝子治療で好都合な遺伝子を有する感染性欠損レトロウイルスの標的細胞の共存培養方法における請求項１〜１１のいずれか１項に記載のパッケージング細胞の利用において、パッケージング細胞がこのようにして医薬に転換された標的細胞の利用の前に破壊されなくてはならないパッケージング細胞の使用。２０．標的細胞は、造血幹細胞又はリンパ細胞といった免疫系の細胞である請求項１９に記載の使用。２１．遺伝子治療用薬剤の調製における請求項１〜１１のいずれか１項に記載のパッケージング細胞の使用。