CN1426474A - 新的启动子和使用该启动子的基因表达方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供即使对基因表达不进行诱导，也可以高水平表达该基因的启动子、重组DNA、基因表达用载体、表达载体、以及转化细胞以及操作简便、而且费用低的蛋白质的制造方法和其试剂盒。涉及到含有序列表中序列1或2的碱基序列的DNA或其片段、在大肠杆菌或芽孢杆菌属细菌中表现出构成启动子活性的分离DNA；可与该DNA杂交的、在大肠杆菌或芽孢杆菌属细菌中表现出组成型启动子活性的分离DNA；该DNA与外源基因以该外源基因可表达状态配置的重组DNA；至少含有该DNA的基因表达用载体；含有该重组DNA的表达载体；含有该重组DNA或该表达载体的转化细胞；培养该转化细胞，从得到的该培养物中提起蛋白质的蛋白质制造方法、以及至少含有该DNA或该基因表达用载体的蛋白质制造试剂盒。

Description

新的启动子和使用该启动子的基因表达方法

技术领域

本发明涉及能够简便、而且费用低地高效表达目的基因的产物的新的启动子，具体来说涉及含有该启动子序列的分离的DNA、以及使用该DNA的蛋白质的制造方法。

背景技术

通过基因工程手段制造有用基因产物时，根据目的不同，可以利用培养方法确立的大肠杆菌、枯草杆菌、酵母等微生物细胞、动物细胞、昆虫细胞、植物细胞等作为宿主，使用适用于这些宿主的启动子的表达系统。其中，以大肠杆菌作为宿主、使用lac启动子和其衍生物等的表达系统从其容易操作观点看是一种好用的系统。

然而在使用lac启动子和其衍生物等的表达系统中，由于在基因产物表达时必须要进行基因表达的诱导，所以存在着不利于工业生产的缺点。例如，lac启动子、tac启动子等由于在基因表达的诱导中需要高价的IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)，所以存在着不利于工业规模生产的缺点。

另外也普遍使用利用噬菌体λ启动子的温度诱导的表达载体。然而重组基因产物被温度诱导过量表达在：(a)完成迅速的温度加速的困难性、(b)在更高温度下形成不溶性包函体的可能性增大以及(c)几个蛋白酶在热休克时的大肠杆菌中的诱导等方面存在不利的情形。

因此，期待对基因表达不进行诱导也能有效表达的技巧。

发明公开

本发明的目的在于提供含有不通过诱导物质对基因表达进行诱导，可以高水平表达该基因的启动子序列的DNA、重组DNA、基因表达用载体、表达载体、以及转化细胞和操作简便、而且费用低的蛋白质的制造方法和其试剂盒。

本发明涉及的要点如下：

[1]作为含有从下列(A)～(D)构成的序列群中选择出的一种碱基序列的DNA或其片段，而且在大肠杆菌或杆菌属细菌中表现出组成型启动子活性的分离的DNA；

(A)序列1或2表示的碱基序列、

(B)含有在序列1或2中置换、缺失或附加至少一个残基的碱基序列、

(C)在严格条件下可与由序列1或2表示的碱基序列组成的核酸进行杂交的核酸的碱基序列、以及

(D)与序列1或2表示的碱基序列具有至少80％序列同源性的碱基序列。

[2]配置在外源基因上游时，没有诱导物质存在下也能表达该基因的上述[1]记载的分离的DNA、

[3]上述[1]或[2]记载的DNA和外源基因以该外源基因可表达状态下配置构成的重组DNA、

[4]上述[3]记载的重组DNA，其中外源基因是从编码蛋白质的核酸、编码反意RNA的核酸和编码核酶的核酸组成的核酸群中选择出的核酸、

[5]至少含有上述[1]或[2]记载的DNA的基因表达用载体、

[6]上述[5]记载的基因表达用载体是从质粒载体、噬菌体载体和病毒载体选择出的一种、

[7]上述[5]或[6]记载的基因表达用载体，含有序列3或4表示的碱基序列、

[8]含有上述[3]或[4]记载的重组DNA的表达载体、

[9]上述[8]记载的表达载体，是从质粒载体、噬菌体载体和病毒载体选择出的一种、

[10]携带有上述[3]或[4]记载的重组DNA或上述[8]或[9]记载的表达载体的转化细胞、

[11]蛋白质的制造方法，其特征是：培养上述[10]记载的转化细胞，从获得的培养物中提取蛋白质，以及

[12]至少含有上述[1]或[2]记载的DNA或[5]～[7]中任一项记载的基因表达用载体的蛋白质制造用试剂盒。

附图的简单说明

图1是表示对D-AAT活性进行筛选的菌株的粗酶液和纯化酶的SDS-PAGE结果的模式图。

图2是表示芽孢杆菌属SK-1的D-AAT基因限制酶切分析结果图。

图3是表示芽孢杆菌属SK-1的D-AAT基因产物的SDS-PAGE解析结果图。

图4表示基因表达用载体pHCE19T(II)的构建简图。

图5表示基因表达用载体pHCE19T(II)的简图。

图6表示基因表达用载体pHCE19(II)的构建简图。

图7表示基因表达用载体pHCE19(II)的简图。

图8表示表达TNA用的表达载体pHCE19T(II)-TNA的构建简图。

图9是表示通过SDS-PAGE对TNA在携带表达载体pHCE19(II)-TNA的大肠杆菌中的表达进行解析的结果。

图10是表示大肠杆菌HB101/pHCE19(II)-TNA的生育曲线、TNA的合成活性以及表达产物的解析结果图，表示在2.5L发酵槽中于37℃下大肠杆菌HB101/pHCE19T(II)-TNA的典型的批量培养分布图。

图11是表示温度和pH对TNA的合成活性影响的图。

图12是表示氯化铵、吲哚浓度以及丙酮酸钠浓度对TNA的合成活性影响的图。

图13是表示triton X-100对TNA的合成活性影响的图。

图14是表示于酶反应器中L-色氨酸的生产的反应模式图。

实施发明的最好方式

本发明的DNA是分布于来自芽孢杆菌(Bacillus sp.)SK-1的D-氨基酸氨基转移酶ORF上游，而且表现出启动子活性的元件。本发明是根据将外源基因(也称做目的基因)配置在上述DNA的下游时，在没有表达诱导物质存在下也能以大约至少为总蛋白量的30～50％水平表达目的基因产物的令本发明人惊奇的知识的发明。

作为本发明的DNA如含有序列表序列1或2表示的碱基序列的DNA。更理想的是象后面所叙述的那样，在大肠杆菌或杆菌属细菌中表现出组成型启动子活性的分离的DNA。

在本说明书中，所谓「启动子」是含有处于从转录起始点(+1)开始的20～30个碱基对上游，包含担当使RNA聚合酶从正确位置开始转录功能的TATA框或类似TATA框的区域，但不一定限定在这些区域的前后，为了调解表达即使在该区域以外含有RNA聚合酶以外的用于蛋白质聚合所必需的区域也可以。而在本说明书中有时记为「启动子区域」，该用语是指含有本说明书启动子的区域。

在本说明书中所谓「启动子活性」是表示以可表达状态将基因配置在启动子下游，将得到的构建物导入宿主时，具有在宿主内或宿主外生产该基因表达产物的能力或功能。

一般来说上述「启动子活性」可以通过下述步骤进行测定：

①在编码容易定量或确认的蛋白质的基因(以下也称之为报告基因)的上游连接上测定对象DNA的步骤、

②将得到的构建物导入宿主的步骤、

③培养得到的转化细胞，使该蛋白质表达的步骤以及

④测定该蛋白质表达量的步骤。

而有无「启动子活性」，例如是通过将认为含有启动子序列的序列连接在报告基因的上游，导入宿主，通过确认在宿主内或宿主外该基因的基因产物来实施的，在表达被确认时，该启动子就应当成了在导入的宿主中具有启动子活性的指标。

在本说明书中，所谓「组成型启动子」是指与生育条件无关以恒定水平进行转录的启动子。就是说「组成型启动子」不用IPTG等代表性的诱导物质进行诱导，而可使配置在该启动子下游的基因表达。

在本发明的DNA中只要是确认有组成型启动子活性的就可以，也包括具有上述序列1或2表示的碱基序列的分离的DNA片段。这里的「片段」可以在确认有组成型启动子活性的范围内适当地进行选择。相关片段可以通过上述步骤①～④的程序进行选择。上述「片段」的长度可以是诸如500碱基以下的片段。

本发明的DNA中也包括含有在序列1或2的碱基序列中置换、缺失或附加至少1个碱基、具体来说1个或数个碱基的碱基序列，而且具有组成型启动子活性的DNA。一般来说在含有短序列的DNA中至少有一个碱基变异(置换、缺失或附加)的DNA其活性也会有变化，通过上述①～④的程序确认组成型启动子活性的「含有变异的DNA」包括在本发明中。这样的变异无论是来自天然的变异还是人为导入的变异都可以。

作为人为导入变异方法如惯用的位点特异的变异导入法等。作为导入位点特异变异的方法如利用琥珀变异方法[缺口双链体(gappedduplex)法、核酸研究(Nucleic Acids Research)、第12卷、第9441～9456页(1984)]、利用缺损dut(dUTPase)和ung(尿嘧啶-DNA糖苷酶)基因的宿主的方法[Kunkel法，Proceedings of theNational Academy of Sciences of the USA，第82卷，第488～492页]、通过利用琥珀变异的PCR方法(国际公开98/02535号专利)等。

含有变异的DNA的长度只要是通过上述步骤①～④的程序确认有组成型启动子活性的长度就可以，例如长度在500碱基以下的DNA。

作为在严格条件下可与本发明的DNA的互补链杂交的DNA，而且具有组成型启动子活性的DNA(a)，或者作为以本发明的DNA为基础，例如使用通过常规方法设计并化学合成的寡核苷酸探针或引物获得的DNA，而且具有组成型启动子活性的DNA(b)，最好是在大肠杆菌或杆菌属细菌中表现出组成型启动子活性的分离DNA也都包括在本发明DNA中。这样DNA只要选择通过上述步骤①～④程序确认有组成型启动子活性的DNA就可以。对该寡核苷酸探针的碱基序列没有特别限定，只要是在严格条件下可与上述DNA或与含有与该DNA互补的碱基序列的DNA杂交的就可以。

这里所谓「严格条件」是指诸如以下的条件。即，如果是上述(a)DNA情况，严格条件是指在含有6×SSC(1×SSC：0.15M NaCl、0.015M柠檬酸钠、pH7.0)和0.5％SDS和5×Denhardt[Denhardt’s、0.1％牛血清白蛋白(BSA)、0.1％聚乙烯吡咯烷酮、0.1％Ficoll 400]和100μg/ml鲑精DNA的溶液中，于50℃下保温过夜的条件等，如果是上述(b)DNA，严格条件是指在与上述同样溶液中，于使用的探针的Tm-25℃的温度下保温过夜的条件等。

另外对引物的碱基序列也没有特别限定，在通常的PCR反应条件下，只要是对上述DNA或含有与该DNA互补的碱基序列的DNA进行退火，可以使通过DNA聚合酶进行的延伸反应开始的引物就可以。

寡核苷酸探针或引物的Tm可以通过诸如下式求出。

Tm＝81.5-16.6(log₁₀[Na⁺])+0.41(％G+C)-(600/N)(式中，N是寡核苷酸探针或引物的链长、％G+C是寡核苷酸探针或引物中的鸟嘌呤和胞嘧啶残基的含有量)。

当寡核苷酸探针或引物的链长比18个碱基短时，Tm可以通过A+T(腺嘌呤+胸腺嘧啶)残基的含有量和2℃乘积与G+C含有量和4℃乘积的和[(A+T)×2+(G+C)×4]推出。

上述寡核苷酸探针的链长没有特别限定，但从防止非特异杂交的观点出发，链长最好在15个碱基以上，更理想的是在18个碱基以上。

在引物中链长也没有特别限定，例如15～40个碱基，最好是17～30个碱基。上述引物可以用于PCR等各种基因扩增法中，因此获得的具有组成型启动子活性的DNA也包括在本发明中。

杂交操作的详细步骤如记载于1989年Cold Spring HarborLaboratory发行、T.Maniatis等人编辑的Molecular Cloning：ALaboratory Manunal 2nd ed.中。

上述(a)和(b)的DNA长度只要通过上述步骤①～④的程序确认有组成型启动子活性的长度就可以，例如在500碱基以下的长度。

在本发明DNA中也包括与序列1或2所示碱基序列的序列同源性至少有80％、最好为90％、最理想为95％的碱基序列，而且具有组成型启动子活性的DNA。更具体地讲如与序列1所示碱基序列的序列同源性至少有80％、最好为90％、最理想为95％的碱基序列，而且具有组成型启动子活性的DNA，与序列2所示碱基序列的序列同源性至少有80％、最好为90％、最理想为95％的碱基序列，而且具有组成型启动子活性的DNA。这样DNA如通过上述步骤①～④程序确认具有组成型启动子活性的DNA。

上述所谓「序列同源性」是指2个多核苷酸间残基的序列类似性。上述「序列同源性」是在比较对象的碱基序列的区域，通过对在最适状态下排列的2个碱基序列进行比较确定的。其中比较对象的多核苷酸与用于2个序列最适排列的参考序列(例如共有序列等)相比，即使含有附加或缺失(例如，间隙、突出端等)也可以。

序列同源性的数值(百分数)可以通过确定2个序列中存在的相同核酸碱基之后，确定适合部位的数，然后用比较对象序列区域内的碱基总数除上述适合部位的数，得到的数值乘以100算出的。作为获得最适排列和同源性的算法如Smith等人的局部算法[Add.APL.Math.、第2卷、第482页(1981)]、Needleman等人的同源性比对算法[Journal of Molecular Biology、第48卷、第443页(1970)]、Pearson等人的同源性检索法[Porceedings of theNational Academy of Sciences of the USA第85卷、第2444页(1988)]。更具体地讲如动态程序法、ギャツプペナルテイ法、Smith-Waterman算法、Good-Kanehisa算法、BLAST算法、FASTA算法等。

核酸间序列的同源性例如可以通过序列解析软件、具体的如BLASTN、FASTA等测定。上述的BLASTN在主网页http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/、FASTA在主网页http：//www.ddbj.nig.a c.jp一般都可以利用。

通过本发明的DNA可以进一步提供上述DNA和外源基因以该外源基因可表达状态配置的重组DNA。这样重组DNA也包括在本发明中。

在本说明书中，所谓外源基因是指来源与本发明DNA的来源生物不同的基因；对本发明DNA来说是异质的基因；就像后面所述那样，通过导入合适的宿主在使用本发明的DNA时，对于该宿主也包含作为异质的任一个基因。

上述外源基因没有特别限定，如编码蛋白质的核酸、编码反意RNA的核酸、编码核酶的核酸等。这样外源基因的来源没有特别限定，如细菌类、酵母类、放线菌类、丝状菌类、子囊菌类、担子菌类等微生物；植物；昆虫；动物等，另外按照目的人工合成的基因也可以。

作为编码蛋白质的核酸，如编码酶、细胞因子类、抗体等核酸，更具体来说如白介素1～12基因、干扰素α、β或γ基因、肿瘤坏死因子基因、集落刺激因子基因、红细胞生成素基因、转化增殖基因-β基因、免疫球蛋白基因、组织纤维蛋白溶酶原活化因子基因、尿激酶基因、欧美萤荧光素酶基因等，但不限定这些。

本说明书中的「核酶」是指切断特定蛋白质的mRNA的酶，阻碍这些特定蛋白质翻译的酶。核酶可以由编码特定蛋白质的基因序列设计。例如锤头型核酶可以通过FEBS Letter、第228卷、第228～230页(1988)记载的方法制作。另外除了锤头型核酶以外，还有发卡型核酶、δ型核酶等不同的酶，只要是切断特定蛋白质的mRNA的酶，阻碍这些特定蛋白质翻译的酶都包括在本说明书的核酶中。

在本说明书中，「外源基因可表达状态」是指该外源基因处于本发明DNA发挥启动子活性的调控下。

作为提取本发明DNA的方法有诸如(1)象后面所述的实施例记载的那样从生物中分离的方法；(2)使用根据序列1或2所示的碱基序列设计的适当的探针或引物，从生物的基因组DNA中挑选的方法；(3)以序列1或2所示的碱基序列为基础化学合成的方法等。

通过化学合成制作由序列1或2所示碱基序列构成的DNA时，例如可以通过惯用的氨基亚磷酸化合物法(phosphoramidite)等使化学合成的寡核苷酸用酶学方法连接合成上述的DNA。具体来说通过实施以下(1)～(8)工序可以获得本发明的DNA。

(1)通过惯用的化学合成法分别合成网罗序列1或2所示碱基序列的数十种寡核苷酸An(n为正的整数)和作为与从该An的序列的3’或5’端移动数个碱基的碱基序列互补的序列构成的该An相同链长的寡核苷酸，通过与该寡核苷酸An的退火生成含有5’突出末端或3’突出末端的双链DNA的互补链寡核苷酸a_n(n为正的整数)的工序：

[例如，制作由序列1所示碱基序列构成的寡核苷酸时、

上述An是由序列1的碱基序列：1～20(A₁)、21～40(A₂)、41～60(A₃)、61～80(A₄)、81～100(A₅)、101～120(A₆)、121～140(A₇)、141～160(A₈)、161～180(A₉)、181～200(A₁₀)和201～223(A₁₁)各个序列构成的寡核苷酸、

上述的a_n是由序列1的碱基序列：1～23(a₁)、24～43(a₂)、44～63(a₃)、64～83(a₄)、84～103(a₅)、104～123(a₆)、124～143(a₇)、144～163(a₈)、164～183(a₉)、184～203(a₁₀)和204～223(a₁₁)各个序列构成的寡核苷酸的互补链]

(2)使用ATP和惯用的T4多核苷酸激酶，对上述工序(1)中得到的各个寡核苷酸An和对应的互补链寡核苷酸a_n的各个5’末端进行磷酸化的工序；

(3)使上述工序(2)中得到的各个寡核苷酸An和对应的互补链寡核苷酸a_n退火，得到数十种的「含有5’突出末端或3’突出末端的双链DNA(A_na_n)」的工序；

(4)就上述工序(3)得到的双链DNA(A_na_n)，依照n增加顺序与序列1或2所示的碱基序列相对应分成数个区段，对应于各个区段将上述工序(3)得到的双链DNA(A_na_n)归于一个试管中的工序；

[例如制作由序列1所示碱基序列构成的寡核苷酸时、

设定寡核苷酸A₁～A₄与互补链a₁～a₄的试管、

寡核苷酸A₅～A₈与互补链a₅～a₈的试管、

寡核苷酸A₉～A₁₁与互补链a₉～a₁₁的试管]

(5)在对应于上述工序(4)的各个区段的每个试管中对双链DNA进行连接，由此可以得到对应于各个区段的双链DNA的工序；

(6)对上述(5)得到的双链DNA进行凝胶电泳，从凝胶中萃取含有对应于各个区段的目的链长的双链DNA带的工序；

(7)将含有对应于上述(6)得到的各个区段的目的链长的双链DNA归于1处进行连接的工序；

(8)就上述工序(7)得到的DNA通过电泳研究其链长和/或进行碱基序列解析，对由序列1或2所示的碱基序列构成的DNA进行确认的工序。

本发明的DNA由于是即使对基因表达不进行诱导也可以高水平表达该基因的启动子，所以特别适用于作为编码特定蛋白质的核酸的外源基因的表达。

另外通过本发明的DNA可以提供至少含有DNA的基因表达用的载体。这样的基因表达用载体也包括在本发明中。

如果利用本发明的基因表达用载体，由于含有本发明的DNA可以组成型表达目的基因产物，其表达水平大约至少是宿主生产的全细胞内蛋白质量的30～50％水平，而且根据其使用目的等可以很容易地使目的基因产物表达。

作为本发明基因表达用载体的具体例子如pHCE19T(II)[第5图]、pHCE19(II)[第7图]。

再者，用上述质粒pHCE19T(II)转化的大肠杆菌JM109被命名和表示为大肠杆菌JM109/pHCE19T(II)，从平成12年4月14日(原保藏日)开始，在布达佩斯条约下以委托号：FERM BP-7535寄托在日本国茨城县筑波市东1丁目1-1中央第6(邮政编号305-8566)的独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心。用上述质粒pHCE19(II)转化的大肠杆菌JM109以大肠杆菌JM109/pHCE19(II)命名和表示，从平成12年4月14日(原保藏日)开始，在布达佩斯条约下以保藏号：FERM BP-7534委托在日本国茨城县筑波市东1丁目1-1中央第6(邮政编号305-8566)的独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心。作为本发明的基因表达用载体的一个例子-pHCE19T(II)和pHCE19(II)也可以从保藏的大肠杆菌中获得。

在本发明的基因表达用载体中，作为载体如质粒载体、噬菌体载体、病毒载体等。上述载体根据作为宿主使用的细胞进行适当选择。

可以用作宿主的细胞如大肠杆菌和杆菌属细菌。具体来说，作为大肠杆菌如大肠杆菌K-12系统的HB101株、C600株、JM109株、DH5α株、DH10B株、XL-1Blue MRF’株、TOP10F株等。而作为杆菌属细菌如芽孢杆菌属、枯草芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌等。但并不限定于这些细菌，对这些大肠杆菌或杆菌属细菌进行变异处理等，得到的变异细菌也可以作为宿主使用。

作为载体例如宿主为大肠杆菌时，作为质粒载体可以使用pUC18、pUC19、pBluescript、pET等，作为噬菌体载体可以使用λgt10、λgt11等λ噬菌体载体等。

在本发明基因表达用载体的构建中可以利用上述MolecularCloning：A Laboratory Manunal第2版记载的方法。例如可以按照图4给出的构建概图制作。就是说通过使用下面引物[引物1(序列5)和引物2(序列6)]的PCR法对含有上述嗜热性芽孢杆菌SK-1的D-AAT基因上游区的5’-启动子和SD(Shine-dalgano)序列的DNA片段(350bp)进行扩增。

引物1(5′-ccaagcttgatctctccttcacagattcc-3′)(29mer)

引物2(5′-gaggatccagccatggtatatctcctttttccagaagtgtgaaa-3′)(44mer)

然后用HindIII和BamHI对含有扩增的启动子的片段进行消化，并进行纯化。将得到的片段与经HindIII和BamHI消化的pUC19的大的片段连接，制作pHUC19T。然后将含有来自表达载体pTrc99A的强转录终止子rrnBT1T2的NcoI-ScaI片段插入到pHUC19T的NcoI-EcoRI(filling-in)位点，可以得到基因表达用载体pHCE19T(II)(图5)。另外通过DNA碱基序列确定可以确认启动子区的序列。用下面引物3(序列7)取代引物2与上述一样可以获得SD序列和NcoI位点之间的长度与pHCE19T(II)不同的基因表达用载体pHCE19(II)(图6和图7)。

引物3(5′-agggatccagccatgggttccagctcctttttccagaa-3′)(38mer)

而上述pHCE19(II)也可以使用众所周知的变异导入方法通过将pHCE19T(II)的SD序列和NcoI位点之间的碱基序列：5’-gatata-3’变异为5’-gctggaac-3’得到。

本发明的基因表达用载体也可含有rrnBT1T等终止子、可选择标志基因等。

作为选择标志如氨苄青霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、氯霉素抗性基因等。

本发明的基因表达用载体根据目的基因产物的使用目的，例如为使目的基因的产物分离操作简便，以含有与谷胱甘肽-S-转移酶、麦芽糖结合蛋白等异种蛋白的融合蛋白也能够表达的序列，或者含有以带有组氨酸标记等蛋白质能够表达的标记序列也可以。

本发明的基因表达用载体如含有序列3或4所示的碱基序列的载体。

另外通过本发明可以提供含有上述重组DNA的表达载体。这样的表达载体也包括在本发明中。另外在本发明的表达载体中也包括通过将目的基因插入到上述基因表达用载体后得到的构建物。

可以使用与在上述基因表达用载体中列举载体同样的载体。

本发明的表达载体可以通过(a)将上述重组DNA整合到适当的载体、(b)将目的基因整合到上述基因表达用载体来制作。

另外通过本发明的重组DNA和表达载体还可以提供带有上述重组DNA的转化细胞、或带有上述表达载体的转化细胞。

作为宿主可例举与上面「可用作宿主的细胞」同样的细胞。

重组DNA向宿主的导入可以根据例如文献[Virology，第52卷，第456页(1973)，Molecular and Cellular Biology，第7卷，第2745页(1987)，Journal of the National Cancer Institute，第41卷，第351页(1968)，EMBO Journal，第1卷，第841页(1982)]记载的方法进行。

表达载体向宿主的导入可以根据例如磷酸钙法[Molecular andCellular Biology，第7卷，第2745页(1987)]，电穿孔法[Proceedings of National Academy of Sciences of the USA，第81卷，第7161页(1984)]、DEAE-葡聚糖法[Methods in Nucleic AcidsResearch、第283页、カラム等人编、CRC Press、1991发行]、脂质体法[BioTechniques、第6卷、第682页(1989)]等方法实施。

另外通过本发明的转化细胞可以提供以通过培养转化细胞从得到的培养物中提取蛋白质为特征的蛋白质的制造方法。这样的「蛋白质制造方法」也包括在本发明中。

更具体地讲，可以通过(I)利用含有a)在本发明的DNA的下游配置可表达的编码蛋白质的核酸的重组DNA、或b)该重组DNA的载体转化宿主细胞的工序，(II)对(I)中得到的转化细胞在适合该蛋白表达的条件下进行培养，从得到的培养物中提取该蛋白质的工序制造蛋白质。

转化细胞的培养条件可以根据用作宿主的细胞、表达对象蛋白质的性质进行适当选择。

得到的蛋白质可以通过惯用的蛋白质纯化手段进行纯化。这样的纯化手段如盐析、离子交换层析、疏水层析、亲和层析、凝胶过滤层析等。

另外在本发明的蛋白质的制造方法中可以使用含有本发明的DNA或本发明的基因表达用载体的蛋白质制造用试剂盒。通过这样的试剂盒可以更简便地实施蛋白质的制造方法。

以下通过实施例对本发明进行详细地说明，但本发明不限定于这些实施例。实施例1生产D-氨基酸氨基转移酶的嗜热性细菌的筛选和鉴定

为了获得在D-氨基酸的酶的合成以及D-氨基酸的产业化生产有用的生物催化剂，从韩国的土壤中分离的1,300嗜热性细菌的D-氨基酸氨基转移酶(D-AAT)活性进行解析。

通过测定由D-丙氨酸和α-酮戊二酸形成丙酮酸的速度确定D-AAT活性。丙酮酸的量通过与乳酸脱氢酶的偶联法或水杨醛法[Analytical Biochemistry，第27卷，第1659～1660页(1995)；Methods in Enzymology，第113卷，第108页(1985)]确定。

在活性测定中使用在100mM Tris-HCl(pH8.5)中含有50mM的吡哆醛-5’-磷酸、100mM D-丙氨酸和100mM的α-酮戊二酸的反应混合物。乳酸脱氢酶(LDH)偶联分析时，含有0.3mM NADH和5单位/ml LDH。酶活性的1个单位定义为在1分钟内催化1mmol的丙酮酸形成的酶量。蛋白质浓度通过使用牛血清白蛋白作为标准的考马斯亮蓝结合方法(Bradford法)[Analytical Biochemistry、第72卷，第248～254页(1976)]确定。

对从各种环境分离的嗜热性细菌的D-AAT活性进行检索，结果得到110株D-AAT生产株。这些菌株几乎都在需氧条件下生长，形成内生孢子，大概都属于杆菌属的种。

接下来对D-AAT生产菌株的酶活性和热稳定性进行了比较。结果选择出作为D-氨基酸生产用的蛋白质生物催化剂生产菌株的4个嗜热菌：具有更高比活性的2个嗜热性细菌芽孢杆菌LK-1和LK-2以及比上述D-AAT生产株热稳定性更高的2个嗜热性细菌嗜热脂肪芽孢杆菌KL-01和芽孢杆菌SK-1株。在表现出D-AAT活性的阳性株中对表现出最高活性的2个菌株LK1和LK2进行分类学上的鉴定，与YM1株的形态学上的特征和生物化学上的特征[Kor.J.Microbiol.Biotechnol.，第27卷，第184～190页(1999)]非常类似。特别是上述2株可以象YM1株那样在65℃下生长。在来自不同杆菌的D-AAT的蛋白质印迹解析中，LK1和LK2酶表现出与抗YM1D-AAT抗体的强的相互作用，分离出的2个D-AAT的移动距离与来自YM1的D-AAT的移动距离(分子量：约31kDa)相同(图1)。

另外在65℃下生长的嗜热性杆菌株的D-AAT表现出相对弱的免疫印迹信号，D-AAT的移动距离在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳解析中(图1)与显示32～34kDa分子量的YM1 D-AAT的移动距离明显不同。65℃下生长的杆菌株的D-AAT活性在0.02单位/mg蛋白以下，大约是LK-1和LK-2的D-AAT活性的五分之一[Kor.J.Microbiol.Biotechnol.，第27卷，第184页～190页(1999)]。为了阐明来自于65℃下生长的杆菌群的D-AAT的特性，在本实验中作为D-AAT的供给源选择了SK-1株。实施例2生产耐热性D-氨基酸氨基转移酶的嗜热性芽孢杆菌SK-1的鉴定

分离的芽孢杆菌SK-1与Symbiobacterium toebii株具有绝对共生相互作用。以下给出了上述SK-1的各种性质：

菌学性质

需氧、革兰氏阳性、运动性杆菌

基因组DNA的GC含量：43.9摩尔％

最适生长条件

温度：45～70℃(最适温度：60℃)

pH：6.0～9.0(最适pH：pH7.5)

细胞壁存在间-二氨基庚二酸

作为主要的细胞脂肪酸存在分支脂肪酸iso-15∶0和iso-17∶0

主要的类异戊二烯和醌：MK-7

16S核酶DNA的序列比较解析

与热葡糖苷酶芽孢杆菌有密切关系。实施例3来自嗜热性Bacillus sp.SK-1的耐热性D-氨基酸氨基转移酶的基因克隆和鉴定

1)菌株和质粒

对Bacillus sp.SK-1于MY培养基[组成：1.5％的多胨、0.2％酵母提取物、0.2％肉汤、0.2％甘油、0.2％K₂HPO₄、0.2％KH₂PO₄、0.026％NH₄Cl(pH7.0)]、于需氧条件60℃下进行培养。为了克隆D-AAT基因，用Bacillus sp.SK-1[绝对共生的嗜热性细菌Symbiobacterium tobii SC-1共生细菌]作为DNA供体。大肠杆菌WM335株[leu，pro，his，arg，thyA，met，lac，gal，rspL，hsdM，hsdR，murI](D-谷氨酸营养需求株)作为实施基因互补性方法[Journal ofBacteriology，第114卷，第499～506页(1973)]的宿主株使用。根据需要在补充了氨苄青霉素(100mg/ml)和D-谷氨酸(100mg/ml)的Luria Bertani培养基中对上述芽孢杆菌SK-1进行培养。

质粒pBluescript II SK和pBluescript II KS从Stratagene公司购入，质粒pUC118和pUC119从宝酒造公司购入。用于D-AAT基因的亚克隆和测序的宿主株使用大肠杆菌XL1-Blue[Stratagene公司生产]。

2)来自Bacillus sp.SK-1的D-AAT的基因克隆

按照斋藤等人[Biochimica et Biophysica Acta、第72卷，第619～629页(1963)]记述那样制备Bacillus sp.SK-1的基因组DNA，然后得到的DNA用Sau3AI进行部分消化。通过于Beckman公司生产的SW40离心机进行蔗糖梯度的[5～40％(w/v)]25,000rpm、20小时的离心分离，分离3～10kb的DNA片段。然后得到的片段和经BamHI消化的pUC118用T4DNA连接酶于16℃下反应12小时进行连接。使用得到的连接混合液通过电穿孔[法]转化D-谷氨酸依赖营养需求株(大肠杆菌WM335)。由此得到芽孢杆菌SK-1的基因组DNA文库。从基因组DNA文库通过WM335的互补性得到35个D-谷氨酸非依赖性、氨苄青霉素抗性菌落。

使用JetStar 2.0 Plasmid Midi purificaton kit[Genomed公司生产]对各个菌落的质粒DNA进行纯化。

用分离的质粒再转化大肠杆菌XL1-Blue细胞。然后培养转化细胞，通过与实施例1同样的测定方法分析D-AAT活性。

在表现出D-AAT活性的12个克隆中，D-AAT活性[35单位/mg蛋白质(比表现出0.02单位/mg蛋白质的Bacillus sp.SK-1的无细胞提取液的活性高1750倍)]最高的一个克隆(pDSK2)含有3.6kb的插入片段。为了进行D-AAT的亚克隆对质粒pDSK2进行限制酶切分析。结果pDSK2的D-AAT活性归属于1.7kb的EcoRI-XhoI片段(图2)。将上述的1.7kb片段亚克隆到pBluescript II SK和pBluescriptII KS中，分别构建pDSK231和pDSK232。含有与pDSK231反方向插入片段的质粒pDSK232表现出同样水平的D-AAT活性，表明该基因通过其本身的启动子可以进行组成型表达。

来自Bacillus sp.SK-1的D-AAT的碱基序列使用PRISM试剂盒[Perkin Elmer公司生产]和Applied Biosystems373A DNA测序仪，通过两个DNA链中引物步行法确定。起始引物是pBluescript IISK的通用引物和反向引物，对内部序列特异的引物在コリア·バイオテック公司(韩国)合成的。使用软件·基因谱(S.D.S公司生产)对确定的序列进行分析。

3)纯化

将带有pDSK2的大肠杆菌XL1-Blue于含有100mg/ml的氨苄青霉素的LB培养基(1升)中，在37℃下培养16小时。得到的菌体经离心分离回收，然后将回收的菌体悬浮于50ml的标准缓冲液[含有终浓度为0.01％的β-巯基乙醇和终浓度20mM的吡哆醛-5’-磷酸(PLP)的30mMTris-HCl(pH8.0)]中。使用Sonifier 450[BrasonUltrasonics公司生产]，于冰上以20％的效率对得到的悬浮液进行10分钟破碎。经15000rpm、60分钟离心分离后，回收上清，于60℃下进行20分钟热处理。经15000rpm、60分钟离心分离除去蛋白质凝集物。

将得到的上清加到用上述标准缓冲液平衡的Resource Q阴离子交换柱[Pharmacia公司生产]。用0～1M NaCl线性梯度洗脱蛋白质。收集表现出D-AAT活性的级分，经超滤[Amicon公司生产]浓缩。将得到的蛋白质溶液处理为含有1.7M硫酸铵的溶液，加到用含有1.7M硫酸铵标准缓冲液平衡的Phenyl-Superose柱[Pharmacia公司生产]上。蛋白质用1.7～0M硫酸铵浓度的线性梯度洗脱。收集D-AAT活性级分，浓缩，然后得到浓缩物对标准缓冲液透析。将得到的级分保存在冰柜(-80℃)中。全部的层析过程于室温下用FPLC[Pharmacia公司生产]进行。

来自带有质粒pDSK2的大肠杆菌XL1-Blue的级分显示出分子量为34kDa的非常浓的蛋白质带(图3)。通过影像分析系统[Biorad公司生产]对34kDa带进行定量，结果表达的量大约为总大肠杆菌蛋白质的60％。实施例4组成表达系统(基因表达用载体)的构建

可组成型表达外源基因的基因表达用载体的构建使用市售的凝胶纯化和质粒纯化用的酶、凝胶纯化用试剂盒以及质粒纯化用试剂盒。另外只要没有特别说明，根据例如Molecular Cloning：A LaboratoryManunal第2版[T.Maniatis等人编辑]等记载的技术构建。

图4中给出了基因表达用载体pHCE19T(II)构建的概图。通过使用下面引物[引物1(序列5)和引物2(序列6)]的PCR法对含有上述嗜热性芽孢杆菌SK-1的D-AAT基因的上游区的5’-启动子和SD(Shine-dalgano)序列的DNA片段(350bp)进行扩增。

引物1(5′-ccaagcttgatctctccttcacagattcc-3′)(29mer)

引物2(5′gaggatccagccatggtatatctcctttttccagaagtgtgaaa-3′)(44mer)

然后含有扩增的启动子片段用HindIII和BamHI消化，并纯化。将得到的片段与经HindIII和BamHI消化的pUC19大的片段连接，制作pHUC19T。然后将含有来自表达载体的pTrc99A的强的转录终止子rrnBT1T2的NcoI-ScaI片段插入到pHUC19T的NcoI-EcoRI(filling-in)位点，可以得到基因表达用载体pHCE19T(II)(图5)。另外通过DNA碱基序列确定可以确认启动子区的序列。

用下面引物3(序列7)取代引物2与上述一样可以获得SD序列和NcoI位点之间的长度较pHCE19T(II)长26的基因表达用载体pHCE19(II)(图6和图7)。

引物3(5′agggatccagccatgggttccagctcctttttccagaa-3′)(38mer)

序列表中序列3给出了上述制作的基因表达用载体pHCE19(II)的碱基序列，序列表中序列1给出了从翻译起始密码ATG开始的上游的启动子区223bp。

或者，序列表中序列4给出了上述制作的基因表达用载体pHCE19(II)的碱基序列，序列表中序列2给出了从翻译起始密码ATG开始的上游的启动子区225bp。实施例5使用组成表达系统大量生产色氨酸吲哚酶

在本实施例中尝试用上述pHCE19T(II)在克隆TNA基因的大肠杆菌中大量生产来自嗜热性细菌Symbiobacterium toebii SC-1的色氨酸吲哚酶(以下称为TNA)。而为了利用批量培养操作，使TNA的生产达到最大，对重组大肠杆菌的培养条件进行了研究。

1)含有TNA基因的组成表达载体的构建

就像图8的概图所示那样，用上述pHCE19T(II)制作带有来自嗜热性细菌Symbiobacterium toebii SC-1的TNA基因的组成表达载体pHCE19T(II)-TNA。

以带有TNA基因的pTNA作为模板，利用PCR法扩增TNA基因。使用的引物如下：

N末端引物：5′ccaaagggcgagccctttaa-3′(20mer)(序列8)

C末端引物：5′-tgactaagtctgcagaagcttattagaccagatcgaagtgcgc-3′(43mer)(序列9)

扩增的TNA基因用HindIII消化，并纯化。另外pHCE19T(II)用NcoI消化，用克列诺片段进行末端修复，再用限制性核的内切酶III消化。将得到的TNA基因与pHCE19T(II)的大片段连接，得到pHCE19T(II)-TNA。

2)转化细胞的制备

使用基因脉动装置(Bio-Rad公司生产)，用上述的pHCE19T(II)-TNA转化作为宿主的大肠杆菌HB101[supE 44，hsd20(rB-mB-)，recA13，ara-14，proA2，lacY1，galK1，rpsL20，xyI-5，mt1-1，leuB6，thi-1]。

转化细胞于含有10g/l的色氨酸[Difco公司生产]、5g/l的酵母提取物[Difco公司生产]和10g/l氯化钠的LB培养基中进行培养。

3)酶液的制备

通过5,000×g，20分钟离心分离回收上述2)的转化细胞。得到的菌体用50mM磷酸钾缓冲液(pH8.5)洗净。然后将得到的细胞悬浮于含有0.1mM PLP和10mM 4-氨基苯甲基磺酰氟化物的50mM磷酸钾缓冲液(pH8.5)中。使用ブランソン·ソニファイヤ-[BransonUltrasonics公司生产]对得到的细胞进行超声破碎。然后得到的细胞裂解液经20,000×g离心分离60分钟，除去细胞残渣，用含有0.05mMPLP的20mM磷酸钾缓冲液(pH8.5)对得到的上清进行透析。透析后的溶液于65℃下加热30分钟，除去含有来自大肠杆菌色氨酸吲哚酶的热变性大肠杆菌蛋白质，于冰上冷却。通过5,000×g，20分钟离心分离除去蛋白质凝集物，将得到的上清作为酶液。上述酶液在使用之前一直保存在-20℃下。

4)L-色氨酸合成活性测定

于含有25mM吲哚、100mM丙酮酸钠和500mM氯化铵(pH8.5)的混合物中测定TNA的L-色氨酸合成活性。通过添加酶液使反应开始，通过添加0.05ml 5N HCl于65℃下温育20分钟后，停止反应。通过装有反相柱子(Waters公司生产，商品名：μBondapak C18)的HPLC测定形成的L-色氨酸。使用含有5％(v/v)甲醇、2％(v/v)醋酸和0.1M磷酸钠缓冲液(pH6.5)的溶液，以流速1ml/分进行洗脱。蛋白质的检测是通过分光光度计的280nm进行的。酶的1个单位定义为1分钟内合成1μmol的L-色氨酸的酶量。比活性用每1mg酶的单位数表示的。蛋白质浓度是通过以牛血清白蛋白(Sigma公司)作为标准物质使用考马斯亮篮结合法(ブラッドフォ一ド法)确定的。

5)L-色氨酸的生产

通过搅拌槽型反应器进行L-色氨酸的生产。为了阻止底物吲哚的氧化，将氮气充填到酶反应器中。反应温度通过水套使水循环，控制在37℃。为了防止底物耗尽，通过HPLC确定吲哚浓度后，将吲哚和丙酮酸钠断断续续地加到反应溶液中。

6)细胞的生长曲线

用分光光度计[商品名：BioChrom4060，Pharmacia公司生产]于280nm测定细胞培养物的光密度(OD)。

7)TNA的大量生产

按照1)～6)步骤使用带有pHCE19T(II)-TNA大肠杆菌(HB101/pHCE19T(II)-TNA)进行TNA的生产。其结果如图9所示那样，表达量大约是大肠杆菌全细胞内蛋白质的40％。为了达到通过批量培养的高的细胞生长下TNA的大量生产，将大肠杆菌HB101/pHCE19T(II)-TNA于含有50g/l甘油的复合培养基中进行培养。

图10给出了于2.5L发酵槽中37℃下大肠杆菌HB101/pHCE19T(II)-TNA的批量培养分布图。图中白圈表示细胞的干燥重量(g/L)，白上三角表示TNA的合成活性(单位/ml)，白下三角表示甘油浓度(g/L)。培养3小时后，TNA的生产随着细胞的生长而增加。在培养到20小时时，细胞生长速度和TNA的产率达到最大水平。最终细胞浓度24小时后600nm的吸光度达到75，TNA的最大活性达到3.450单位/ml。这样的TNA生产水平是携带含有lac系启动子的质粒的细胞于LB培养基中在IPTG诱导条件下进行培养时生产水平的9.2倍。

SDS-PAGE后，通过扫描光密度计对蛋白质带进行解析，通过扫描结果可以推定可溶性酶的含有量大约为大肠杆菌提取物中全细胞内蛋白质的约40％。细胞内表达的很多TNA是以可溶型生产的。

大肠杆菌HB101/pHCE19T(II)-TNA的粗提取物的L-色氨酸合成比活性大约是0.15单位/mg细胞。该结果表明含有耐热性色氨酸吲哚酶的耐热性酶可以通过组成型启动子有效地表达。实施例6在L-色氨酸的生产中各种反应条件的影响

1)温度

为了研究TNA的热稳定性，将TNA于50mM磷酸钾缓冲液(pH8.5)，在各种温度下温育30分钟，测定剩余活性。将60℃下无细胞提取物的热处理后得到的酶液作为本实验的生物催化剂。

就像图11表示的那样，本酶直到60℃之前都是稳定的，热处理后，仍维持在酶活性的95％。由于认为TNA的稳定性是决定L-色氨酸合成中的产率的主要因子，所以认为TNA是对酶法进行改良有优越性的产物。而L-色氨酸的最大合成反应温度是65℃。

2)pH

在有过量氯化铵和丙酮酸钠存在下，研究pH对通过TNA进行的L-色氨酸合成速度的影响。在各种不同pH的缓冲液中进行反应。就像图11所表示的那样，pH对TNA的合成活性的影响非常大，TNA对L-色氨酸合成的最大活性出现在pH9.0。观察到甘氨酸-NaOH缓冲液对酶反应有显著的抑制。

3)铵供体

为了选择L-色氨酸合成中最适的铵供体，在各种反应混合物中使用了醋酸铵、氯化铵、柠檬酸铵、蚁酸铵、硝酸铵、草酸铵、磷酸氢二铵和硫酸铵等各种铵盐。结果如表1所示。

              表1

铵供体	相对活性(％)
		醋酸铵	85.8
氯化铵	100
		蚁酸铵	58.8
磷酸氢二铵	82.4
		硝酸铵	62.3
磷酸二铵	80.4

反应条件：5mM或25mM吲哚、200mM丙酮酸钠、1.0M铵供体、

          pH9.0、60℃

从表1可以看出氯化铵在L-色氨酸合成中是最适的铵供体。使用醋酸铵和磷酸氢二铵时活性大约是使用氯化铵时TNA的色氨酸合成活性的80％。另外图12(A)给出了L-色氨酸合成中0～1.5M浓度范围的氯化铵的影响。合成活性极大地依赖于氯化铵的浓度，是与1.0～1.5M氯化铵浓度几乎同样的水平。

4)吲哚浓度

耐热性酶由于具有对化学变性剂稳定的倾向，所以在作为生物催化剂使用酶的生物技术工程中提供显著的优点。为了评价TNA的稳定性，研究了吲哚浓度对耐热性TNA产率的影响。就像图12(B)所表示的那样，TNA的色氨酸的合成活性在5mM吲哚浓度之前是增加的，但该活性在该浓度之后由于吲哚的毒性而阶段地减少。同时大肠杆菌的TNA在3mM的吲哚下完全失活。该结果表明Symbiobacterium toebii与大肠杆菌相比，对吲哚引起的酶失活有相对较高的稳定性。

5)丙酮酸钠浓度

图12(C)表示在0～300mM范围各种丙酮酸钠浓度中研究TNA的L-色氨酸的合成活性的结果。色氨酸的生产速度与丙酮酸钠浓度成比例地直线增加。最大合成活性在0.1M丙酮酸浓度下得到。0.1M浓度后，色氨酸合成速度稳定在类似的值上。

6)Triton^TMX-100

Triton^TMX-100等非离子表面活性剂形成微团，其内侧含有吲哚，在L-色氨酸合成的酶反应期间起着吲哚的贮存器的作用。因此研究Triton X-100对L-色氨酸生产速度的影响，与没有Triton X-100的反应混合物中生产速度进行比较。结果如图13所示。在含有3％(v/v)的Triton X-100的反应混合物中，L-色氨酸的最大合成速度在50mM吲哚浓度得到，这一速度值比没有Triton X-100的反应混合物高10倍。在50mM吲哚浓度之后，L-色氨酸的生产减少。

7)用于L-色氨酸生产的生物催化剂的前处理的最适化

为了比较在L-色氨酸生产中各种生物催化剂的效率，将含有无细胞提取物、诱导全细胞、可通透细胞、以及丙酮干燥细胞的生物催化剂添加到5mM或25mM吲哚的反应混合物中。可通透细胞通过甲苯或甲醇对全细胞进行处理，然后经离心分离制备。丙酮干燥细胞是全细胞经丙酮处理后，通过用气流对细胞进行干燥得到的。丙酮酸钠的浓度和氯化铵的浓度分别是200mM和1M。

                     表2

生物催化剂类型	相对活性(％)   相对活性(％)(5mM吲哚)    (25mM吲哚)
		诱导全细胞	100             100
无细胞提取物	98.2            75.5
		5％甲醇处理的细胞	98.5            78.9
10％甲醇处理的细胞	97.5            71.7
		5％甲苯处理的细胞	95.5            69.9
10％甲苯处理的细胞	90.2            53.3
		丙酮干燥的细胞	97.5            62.4

反应条件：5mM或25mM吲哚、200mM丙酮酸钠、1.0M氯化铵、pH9.0、

      37℃

就像表2表示的那样，在低浓度吲哚(5mM)下，L-色氨酸通过所有试验的生物催化剂都能有效地进行合成。同时在高浓度吲哚(25mM)下，只有诱导细胞表现出高的L-色氨酸的合成活性。这种情况下，更低活性的其他生物催化剂是引起通过酶与高浓度存在的吲哚直接的相互作用的导致酶抑制的物质。这一结果表明全细胞是最适合L-色氨酸有效生产的生物催化剂。因此过剩生产TNA的全细胞可以作为L-色氨酸生产用的生物催化剂使用。

8)通过全细胞生物催化剂生产L-色氨酸

作为底物的丙酮酸在温度超过45℃时非常不稳定，在这一温度下，丙酮酸在乳酸脱氢酶存在下，通过被NADH还原在反应混合物中推定为立刻消失。由铵形成亚胺大概是对丙酮酸减少响应的主要反应，但丙酮酸反应的发生不能排除在外。由于丙酮酸的热不稳定性，合成反应不能在65℃下稳定进行，因此不能大量生产L-色氨酸。因此L-色氨酸的生产是在37℃的酶反应器中，通过1升的反应混合物实施。

起始反应混合物含有1.0M氯化铵、100mM丙酮酸钠、30mM吲哚、0.1mMPLP、0.1％亚硫酸钠和10g(干燥重量)/l的大肠杆菌HB101/pHCE19T(II)-TNA细胞。将3％的Triton X-100添加到反应混合物中，使添加的吲哚可溶。为了防止底物耗尽，断断续续地向反应溶液中供给吲哚和丙酮酸钠。

图14给出了在酶反应器中L-色氨酸生产的反应模式。L-色氨酸的生产速度27小时维持在同样水平，之后逐渐减少。通过利用HPLC解析反应混合物，该L-色氨酸生产速度减少是由于高度蓄积在反应器中的吲哚的抑制引起的。从反应3小时开始L-色氨酸开始以白色结晶沉淀，然后反应更有效地进行。反应24小时后，于37℃下约66.2g/l(0.325M)的L-色氨酸由吲哚以85％的变换效率生产。序列表说明

序列1表示pHCE19T(II)中启动子区的序列。

序列2表示pHCE19(II)中启动子区的序列。

序列3表示pHCE19T(II)的序列。

序列4表示pHCE19(II)的序列。

序列5表示用于扩增芽孢杆菌属的D-AAT基因的启动子的寡核苷酸序列的序列。

序列6表示用于扩增芽孢杆菌属的D-AAT基因的启动子的寡核苷酸序列的序列。

序列7表示用于扩增芽孢杆菌属的D-AAT基因的启动子的寡核苷酸序列的序列。

序列8表示用于扩增Symbiobacterium toebii SC-1.的TNA基因的启动子的寡核苷酸序列的序列。

序列9表示用于扩增Symbiobacterium toebii SC-1.的TNA基因的启动子的寡核苷酸序列的序列。

产业上利用的可能性

通过本发明的DNA由于不用通过诱导物质诱导目的基因产物，含有可以组成型表达目的基因产物的启动子序列，带来简便、而且费用低高效表达的优良的效果。因此通过本发明的DNA有用的基因的表达产物通过工业规模生产成为可能。另外通过本发明的蛋白质的制造方法有用的基因的表达产物通过工业规模生产成为可能。

                  序列表<110>生物领袖公司<110>宝生物工程株式会社<120>新的启动子和利用该启动子调节基因表达的方法<130>01-035-PCT<150>JP 2000-128528<151>2000-04-27<160>9<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>223<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工合成序列：用于pHCE19T(II)的启动子区的序列。<400>1gatctctcct tcacagattc ccaatctctt gttaaataac gaaaaagcat caatcaaaac 60ggcggcatgt ctttctatat tccagcaatg ttttataggg gacatattga tgaagatggg 120tatcacctta gtaaaaaaag aattgctata agctgctctt ttttgttcgt gatatactga 180taataaattg aattttcaca cttctggaaa aaggagatat acc                   223<210>2<211>225<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工合成序列：用于pHCE19(II)的启动子区的序列<400>2gatctctcct tcacagattc ccaatctctt gttaaataac gaaaaagcat caatcaaaac 60ggcggcatgt ctttctatat tccagcagtg ttttataggg gacatattga tgaagatggg 120tatcacctta gtaaaaaaag aattgctata agctgctctt ttttgttcgt gatatactga 180taataaattg aattttcaca cttctggaaa aaggagctgg aaccc                 225<210>3<211>3753<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工合成序列：用于pHCE19T(II)的序列。<400>3gatctctcct tcacagattc ccaatctctt gttaaataac gaaaaagcat caatcaaaac 60ggcggcatgt ctttctatat tccagcaatg ttttataggg gacatattga tgaagatggg 120tatcacctta gtaaaaaaag aattgctata agctgctctt ttttgttcgt gatatactga 180taataaattg aattttcaca cttctggaaa aaggagatat accatggaat tcgagctcgg 240tacccgggga tcctctagag tcgacctgca ggcatgcaag cttggctgtt ttggcggatg 300agagaagatt ttcagcctga tacagattaa atcagaacgc agaagcggtc tgataaaaca 360gaatttgcct ggcggcagta gcgcggtggt cccacctgac cccatgccga actcagaagt 420gaaacgccgt agcgccgatg gtagtgtggg gtctccccat gcgagagtag ggaactgcca 480ggcatcaaat aaaacgaaag gctcagtcga aagactgggc ctttcgtttt atctgttgtt 540tgtcggtgaa cgctctcctg agtaggacaa atccgccggg agcggatttg aacgttgcga 600agcaacggcc cggagggtgg cgggcaggac gcccgccata aactgccagg catcaaatta 660agcagaaggc catcctgacg gatggccttt ttgcgtttct acaaactctt tttgtttatt 720tttctaaata cattcaaata tgtatccgct catgagacaa taaccctgat aaatgcttca 780ataatattga aaaaggaaga gtatgagtat tcaacatttc cgtgtcgccc ttattccctt 840ttttgcggca ttttgccttc ctgtttttgc tcacccagaa acgctggtga aagtaaaaga 900tgctgaagat cagttgggtg cacgagtggg ttacatcgaa ctggatctca acagcggtaa 960gatccttgag agttttcgcc ccgaagaacg ttttccaatg atgagcactt ttaaagttct 1020gctatgtggc gcggtattat cccgtgttga cgccgggcaa gagcaactcg gtcgccgcat 1080acactattct cagaatgact tggttgagta attcactggc cgtcgtttta caacgtcgtg 1140actgggaaaa ccctggcgtt acccaactta atcgccttgc agcacatccc cctttcgcca 1200gctggcgtaa tagcgaagag gcccgcaccg atcgcccttc ccaacagttg cgcagcctga 1260atggcgaatg gcgcctgatg cggtattttc tccttacgca tctgtgcggt atttcacacc 1320gcatatggtg cactctcagt acaatctgct ctgatgccgc atagttaagc cagccccgac 1380acccgccaac acccgctgac gcgccctgac gggcttgtct gctcccggca tccgcttaca 1440gacaagctgt gaccgtctcc gggagctgca tgtgtcagag gttttcaccg tcatcaccga 1500aacgcgcgag acgaaagggc ctcgtgatac gcctattttt ataggttaat gtcatgataa 1560taatggtttc ttagacgtca ggtggcactt ttcggggaaa tgtgcgcgga acccctattt 1620gtttattttt ctaaatacat tcaaatatgt atccgctcat gagacaataa ccctgataaa 1680tgcttcaata atattgaaaa aggaagagta tgagtattca acatttccgt gtcgccctta 1740ttcccttttt tgcggcattt tgccttcctg tttttgctca cccagaaacg ctggtgaaag 1800taaaagatgc tgaagatcag ttgggtgcac gagtgggtta catcgaactg gatctcaaca 1860gcggtaagat ccttgagagt tttcgccccg aagaacgttt tccaatgatg agcactttta 1920aagttctgct atgtggcgcg gtattatccc gtattgacgc cgggcaagag caactcggtc 1980gccgcataca ctattctcag aatgacttgg ttgagtactc accagtcaca gaaaagcatc 2040ttacggatgg catgacagta agagaattat gcagtgctgc cataaccatg agtgataaca 2100ctgcggccaa cttacttctg acaacgatcg gaggaccgaa ggagctaacc gcttttttgc 2160acaacatggg ggatcatgta actcgccttg atcgttggga accggagctg aatgaagcca 2220taccaaacga cgagcgtgac accacgatgc ctgtagcaat ggcaacaacg ttgcgcaaac 2280tattaactgg cgaactactt actctagctt cccggcaaca attaatagac tggatggagg 2340cggataaagt tgcaggacca cttctgcgct cggcccttcc ggctggctgg tttattgctg 2400ataaatctgg agccggtgag cgtgggtctc gcggtatcat tgcagcactg gggccagatg 2460gtaagccctc ccgtatcgta gttatctaca cgacggggag tcaggcaact atggatgaac 2520gaaatagaca gatcgctgag ataggtgcct cactgattaa gcattggtaa ctgtcagacc 2580aagtttactc atatatactt tagattgatt taaaacttca tttttaattt aaaaggatct 2640aggtgaagat cctttttgat aatctcatga ccaaaatccc ttaacgtgag ttttcgttcc 2700actgagcgtc agaccccgta gaaaagatca aaggatcttc ttgagatcct ttttttctgc 2760gcgtaatctg ctgcttgcaa acaaaaaaac caccgctacc agcggtggtt tgtttgccgg 2820atcaagagct accaactctt tttccgaagg taactggctt cagcagagcg cagataccaa 2880atactgtcct tctagtgtag ccgtagttag gccaccactt caagaactct gtagcaccgc 2940ctacatacct cgctctgcta atcctgttac cagtggctgc tgccagtggc gataagtcgt 3000gtcttaccgg gttggactca agacgatagt taccggataa ggcgcagcgg tcgggctgaa 3060cggggggttc gtgcacacag cccagcttgg agcgaacgac ctacaccgaa ctgagatacc 3120tacagcgtga gcattgagaa agcgccacgc ttcccgaagg gagaaaggcg gacaggtatc 3180cggtaagcgg cagggtcgga acaggagagc gcacgaggga gcttccaggg ggaaacgcct 3240ggtatcttta tagtcctgtc gggtttcgcc acctctgact tgagcgtcga tttttgtgat 3300gctcgtcagg ggggcggagc ctatggaaaa acgccagcaa cgcggccttt ttacggttcc 3360tggccttttg ctggcctttt gctcacatgt tctttcctgc gttatcccct gattctgtgg 3420ataaccgtat taccgccttt gagtgagctg ataccgctcg ccgcagccga acgaccgagc 3480gcagcgagtc agtgagcgag gaagcggaag agcgcccaat acgcaaaccg cctctccccg 3540cgcgttggcc gattcattaa tgcagctggc acgacaggtt tcccgactgg aaagcgggca 3600gtgagcgcaa cgcaattaat gtgagttagc tcactcatta ggcaccccag gctttacact 3660ttatgcttcc ggctcgtatg ttgtgtggaa ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggaa 3720acagctatga ccatgattac gccaagctag ctt                              3753<210>4<211>3755<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工合成序列：用于pHCE19(II)的序列。<400>4gatctctcct tcacagattc ccaatctctt gttaaataac gaaaaagcat caatcaaaac 60ggcggcatgt ctttctatat tccagcagtg ttttataggg gacatattga tgaagatggg 120tatcacctta gtaaaaaaag aattgctata agctgctctt ttttgttcgt gatatactga 180taataaattg aattttcaca cttctggaaa aaggagctgg aacccatgga attcgagctc 240ggtacccggg gatcctctag agtcgacctg caggcatgca agcttggctg ttttggcgga 300tgagagaaga ttttcagcct gatacagatt aaatcagaac gcagaagcgg tctgataaaa 360cagaatttgc ctggcggcag tagcgcggtg gtcccacctg accccatgcc gaactcagaa 420gtgaaacgcc gtagcgccga tggtagtgtg gggtctcccc atgcgagagt agggaactgc 480caggcatcaa ataaaacgaa aggctcagtc gaaagactgg gcctttcgtt ttatctgttg 540tttgtcggtg aacgctctcc tgagtaggac aaatccgccg ggagcggatt tgaacgttgc 600gaagcaacgg cccggagggt ggcgggcagg acgcccgcca taaactgcca ggcatcaaat 660taagcagaag gccatcctga cggatggcct ttttgcgttt ctacaaactc tttttgttta 720tttttctaaa tacattcaaa tatgtatccg ctcatgagac aataaccctg ataaatgctt 780caataatatt gaaaaaggaa gagtatgagt attcaacatt tccgtgtcgc ccttattccc 840ttttttgcgg cattttgcct tcctgttttt gctcacccag aaacgctggt gaaagtaaaa 900gatgctgaag atcagttggg tgcacgagtg ggttacatcg aactggatct caacagcggt 960aagatccttg agagttttcg ccccgaagaa cgttttccaa tgatgagcac ttttaaagtt 1020ctgctatgtg gcgcggtatt atcccgtgtt gacgccgggc aagagcaact cggtcgccgc 1080atacactatt ctcagaatga cttggttgag taattcactg gccgtcgttt tacaacgtcg 1140tgactgggaa aaccctggcg ttacccaact taatcgcctt gcagcacatc cccctttcgc 1200cagctggcgt aatagcgaag aggcccgcac cgatcgccct tcccaacagt tgcgcagcct 1260gaatggcgaa tggcgcctga tgcggtattt tctccttacg catctgtgcg gtatttcaca 1320ccgcatatgg tgcactctca gtacaatctg ctctgatgcc gcatagttaa gccagccccg 1380acacccgcca acacccgctg acgcgccctg acgggcttgt ctgctcccgg catccgctta 1440cagacaagct gtgaccgtct ccgggagctg catgtgtcag aggttttcac cgtcatcacc 1500gaaacgcgcg agacgaaagg gcctcgtgat acgcctattt ttataggtta atgtcatgat 1560aataatggtt tcttagacgt caggtggcac ttttcgggga aatgtgcgcg gaacccctat 1620ttgtttattt ttctaaatac attcaaatat gtatccgctc atgagacaat aaccctgata 1680aatgcttcaa taatattgaa aaaggaagag tatgagtatt caacatttcc gtgtcgccct 1740tattcccttt tttgcggcat tttgccttcc tgtttttgct cacccagaaa cgctggtgaa 1800agtaaaagat gctgaagatc agttgggtgc acgagtgggt tacatcgaac tggatctcaa 1860cagcggtaag atccttgaga gttttcgccc cgaagaacgt tttccaatga tgagcacttt 1920taaagttctg ctatgtggcg cggtattatc ccgtattgac gccgggcaag agcaactcgg 1980tcgccgcata cactattctc agaatgactt ggttgagtac tcaccagtca cagaaaagca 2040tcttacggat ggcatgacag taagagaatt atgcagtgct gccataacca tgagtgataa 2100cactgcggcc aacttacttc tgacaacgat cggaggaccg aaggagctaa ccgctttttt 2160gcacaacatg ggggatcatg taactcgcct tgatcgttgg gaaccggagc tgaatgaagc 2220cataccaaac gacgagcgtg acaccacgat gcctgtagca atggcaacaa cgttgcgcaa 2280actattaact ggcgaactac ttactctagc ttcccggcaa caattaatag actggatgga 2340ggcggataaa gttgcaggac cacttctgcg ctcggccctt ccggctggct ggtttattgc 2400tgataaatct ggagccggtg agcgtgggtc tcgcggtatc attgcagcac tggggccaga 2460tggtaagccc tcccgtatcg tagttatcta cacgacgggg agtcaggcaa ctatggatga 2520acgaaataga cagatcgctg agataggtgc ctcactgatt aagcattggt aactgtcaga 2580ccaagtttac tcatatatac tttagattga tttaaaactt catttttaat ttaaaaggat 2640ctaggtgaag atcctttttg ataatctcat gaccaaaatc ccttaacgtg agttttcgtt 2700ccactgagcg tcagaccccg tagaaaagat caaaggatct tcttgagatc ctttttttct 2760gcgcgtaatc tgctgcttgc aaacaaaaaa accaccgcta ccagcggtgg tttgtttgcc 2820ggatcaagag ctaccaactc tttttccgaa ggtaactggc ttcagcagag cgcagatacc 2880aaatactgtc cttctagtgt agccgtagtt aggccaccac ttcaagaact ctgtagcacc 2940gcctacatac ctcgctctgc taatcctgtt accagtggct gctgccagtg gcgataagtc 3000gtgtcttacc gggttggact caagacgata gttaccggat aaggcgcagc ggtcgggctg 3060aacggggggt tcgtgcacac agcccagctt ggagcgaacg acctacaccg aactgagata 3120cctacagcgt gagcattgag aaagcgccac gcttcccgaa gggagaaagg cggacaggta 3180tccggtaagc ggcagggtcg gaacaggaga gcgcacgagg gagcttccag ggggaaacgc 3240ctggtatctt tatagtcctg tcgggtttcg ccacctctga cttgagcgtc gatttttgtg 3300atgctcgtca ggggggcgga gcctatggaa aaacgccagc aacgcggcct ttttacggtt 3360cctggccttt tgctggcctt ttgctcacat gttctttcct gcgttatccc ctgattctgt 3420ggataaccgt attaccgcct ttgagtgagc tgataccgct cgccgcagcc gaacgaccga 3480gcgcagcgag tcagtgagcg aggaagcgga agagcgccca atacgcaaac cgcctctccc 3540cgcgcgttgg ccgattcatt aatgcagctg gcacgacagg tttcccgact ggaaagcggg 3600cagtgagcgc aacgcaatta atgtgagtta gctcactcat taggcacccc aggctttaca 3660ctttatgctt ccggctcgta tgttgtgtgg aattgtgagc ggataacaat ttcacacagg 3720aaacagctat gaccatgatt acgccaagct agctt                            3755<210>5<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工合成序列：用于扩增来自芽孢杆菌SK-1的D-AAT基因的启动子序列的寡核苷酸序列。<400>5ccaagcttga tctctccttc acagattcc                                   29<210>6<211>44<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工合成序列：用于扩增D-AAT基因的启动子序列的寡核苷酸序列。<400>6gaggatccag ccatggtata tctccttttt ccagaagtgt gaaa                  44<210>7<211>38<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工合成序列：用于扩增来自芽孢杆菌SK-1的D-AAT基因的启动子序列的寡核苷酸序列。<400>7agggatccag ccatgggttc cagctccttt ttccagaa                         38<210>8<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工合成序列：用于扩增来自Symbiobacterium toebii SC-1的TNA基因的启动子序列的寡核苷酸序列。<400>8ccaaagggcg agccctttaa                                             20<210>9<211>43<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工合成序列：用于扩增来自Symbiobacterium toebii SC-1的TNA基因的启动子序列的寡核苷酸序列。<400>9tgactaagtc tgcagaagct tattagacca gatcgaagtg cgc                   43

Claims (12)

1.作为含有从下列(A)～(D)构成的序列群中选择出的一种碱基序列的DNA或其片段，而且在大肠杆菌或杆菌中表现出组成型启动子活性的分离的DNA，

(A)序列1或2表示的碱基序列、

(B)含有序列1或2中至少置换、缺失或附加一个残基的碱基序列、

(C)在严格条件下可与序列1或2表示的碱基序列组成的核酸进行杂交的核酸的碱基序列、以及

(D)与序列1或2表示的碱基序列至少具有80％序列同源性的碱基序列。

2.权利要求1记载的分离的DNA，其特征是当配置在外源基因的上游时，没有诱导物质存在下也能表达该基因。

3.权利要求1或2记载的DNA和外源基因在该外源基因可表达的状态下配置成的重组DNA。

4.权利要求3记载的重组DNA，其中外源基因是从编码蛋白质的核酸、编码反意RNA的核酸和编码核酶的核酸组成的核酸群中选择出的核酸。

5.至少含有权利要求1或2记载的DNA的基因表达用载体。

6.权利要求5记载的基因表达用载体，是从质粒载体、噬菌体载体和病毒载体选择出的一种。

7.权利要求5或6记载的基因表达用载体，其含有序列3或4表示的碱基序列。

8.含有权利要求3或4记载的重组DNA的表达载体。

9.权利要求8记载的基因表达用载体，是从质粒载体、噬菌体载体和病毒载体选择出的一种。

10.携带权利要求3或4记载的重组DNA或权利要求8或9记载的表达载体的转化细胞。

11.蛋白质的制造方法，其特征是：培养权利要求10记载的转化细胞，从获得的培养物中提取蛋白质。

12.至少包括权利要求1或2记载的DNA或权利要求5～7中任一项记载的基因表达用载体的蛋白质制造用试剂盒。

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