TW589379B - Novel promoters and gene expression method by using the promoters - Google Patents

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589379 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（1 ) 技術範疇 本發明係關於一種使目的基因之產物 ^ Μ間便且便貪妯古 表現之新穎啓動子、；具體而言，係關於_ + 同又 产χ丨、0 、 種具有該啓動子 序列t早離DNA以及用該DNA製造蛋白砰、 背景技術 貝 在以遺傳工程技術製造有用基因產物之場合，依 選用培養方法已被確立之大腸菌、枯草 、 调孩早囷及酵母等微生物 、，·田胞，動物細胞，昆蟲細胞以及植物細胞 —、、 及使用採用適於該宿主之啓動子之表現 王，以 钴A〜、a 、 尤其疋以大腸 囷馬佰王及使用lac啓動子及其衍生物等 〜〒义表現系，從操作 客易性之觀點言之，爲常被使用之表現系之_。 但是，使用lac啓動子及其衍生物之表現系，&於+基因 產物表現之時，必須謗導基因表現，所以具有不利^二業 生f之缺點。舉例言之，例如對於丨£^啓動予及uc啓動子等 而言，由於需要使用誘導基因表現的高價丨打以異丙基 -β-D-派喃型硫代半乳糖），因而具有不利於以工業規模^ 施之缺點。 另一方面，使用溫度誘導噬菌體啓動子之表現載體亦常 被使用。但是，用溫度誘導重組基因產物過剩表現具有下 列不利之點··（a)使溫度迅速上升有困難性；（b)在較高培養 溫度下’不溶性内涵體形成之·可能性增大；以及（c)在熱休 克時’大腸菌中數個蛋白酶被誘導等。 因此，期望一種在無需謗導基因表現下，可以良好效率 表現之方法。 -4 - ( CNS ) A4iiFT21〇X297^t i f ^w— .Bl.il ailj mV· tn K— - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 > 589379 之驗基序列之DNA或其片段： 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（2 發明之揭示 本發明（目的爲提供一種具有無需藉由誘導物質謗導基 因表現而能使該基、因高度表現之啓動子序狀dna，重組 DNA，基因表現用載體，表現載體及轉形細胞以及操作簡 便且便宜之蛋白質製造方法及其之套組。 本發明之要旨爲·· [1] —種在大腸菌或芽孢桿菌屬細菌中呈現構成性啓動 子活性之單離DNA，其爲具有—種選自下列者所組成群中 (A) 以序列編號：1或2表示之驗基序列， (B) 在序列編號：！或2中至少有—殘基被置換、刪失或附 加之鹼基序列， (.〇 2與包含序列編號：！或2表示之鹼基序列之核酸在嚴 苛條件下雜交之核酸之鹼基序列，以及 (D)與序列编號：表示之鹼基序列至少具有8〇%序列 同一性之鹼基序列。 [2] 上述[1]記載之單離DNA，若被配置於外來基因之上游 ’則可於謗導物質不存在下表現該基因。 [3] —種重組DNA，其中上述[1]或[2]記载之〇]^八與外來 基因’以外來基因可被表現之狀態配置。 [4] 上述[3]記載之重組DNA~r其中外來基因爲從編碼蛋白 質之核酸，編碼反義RNA之核酸以及編碼核糖核酸酶之核 酸所組成群中選出之核酸。 [5] —種基因表現用載體，其至少含有上述π]或[2]記載 -5- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁}

589379 五 發明説明（ 之 DNA 〇 % I 閱 I 讀 | I 面 | 之L 注I 意 項 再 填 窝 本 頁 [6]上述[5]記載之基因表現用載體，其中載體爲從質體類 載體、噬菌體類載體及病毒類載體所組成群中選出之一種。 m上述[5]或[6]記載之基m表現用載體，其具有序列编 號：3或4所示之鹼基序列。 [8] -種表現載體’其具有上述[3]或[4]記載之重组⑽八。 [9] 上述[8]記載之表現載體，其中載體爲從質體類載體、 p巫菌體類載體及病毒類載體所組成群中選出之一種。 [10] —種轉形細胞，其保持上述[3]或[4]記載之重組DNa 或上述[8]或[9]記載之表現載體。 [11] 一種蛋白質之製造方法，其特徵爲培養上述[1〇]記載 之轉形細胞，以及從所得培養物採取蛋白質。 訂 [12] —種蛋白質製造用套組，其至少含有上述[丨]或[2]記 載之DNA’或者±述[5]至[7]之任—者記載之基因表現用載 體。 圖式之簡單説明 圖1爲顯示篩選D-AAT活性之菌株之粗製酵素液及精製 酵素之SDS-PAGE結果之模式圖。 圖2爲顯示芽孢桿菌菌株SK_丨之〇-ΑΑΤ基因之限制酶解 析結果之圖。 圖1爲顯示芽孢桿菌菌歡SU之D-AAT基因產物之 SDS-PAGE解析結果之圖。 圖4顯示基因表現用載體-pHCE19T(II)之構築之概略圖。 圖5爲顯示基因表現用載體-pHCE19T(II)之概略圖。 -6 589379 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（4 ) 圖6爲顯示基因表現用載體-pHCE 19(11)之構築之概略圖。 圖7爲爲顯示基因表現用載體-pHCE 19(11)之概略圖。 圖8爲顯示供表、現tna用之表現載體pHCE19T(II)-TNA 之構築之概略圖。 圖9爲顯示在保持表現載體pHCE19T(II)-TNA之大腸菌 中’藉SDS-PAGE解析TNA表現之結果之圖。 圖10爲顯示大腸菌HB101/pHCE19T(II)-丁NA之繁殖曲線 ，TNA之合成活性及表現產物之解析結果之圖；其顯示在 2.5公升發酵槽中，於37〇c之條件下，大腸菌hb1〇1/ pHCE19T(II)-TNA之典型批式培養剖析圖。 圖11爲顯示溫度及pH値對於TNA之合成活性之影響圖。 圖12顯示氯化銨、啕哚濃度及丙酮酸鈉濃度對於tna之 合成活性之影響圖。 圖13爲顯示曲同χ_ι〇〇 (Trit〇n χ·ι〇〇)對於tna之合成活 性之影響之圖。 圖Η爲顯示在酵素反應器中^色胺酸之生產反應模式圖。 貫施發明之最佳形態 本發明之DNA來自位在芽孢桿菌菌株SK-1之D·胺基酸 胺基轉移酶之ORF之上游，且呈現啓動子活性之單元。本 發明係基於本發明者驚異地發現「若將外來基因（所謂目的 基因）酰置於上述DNA之下游r則可於表現誘導物質不存在 下’以全邵蛋白質質量之至少約3〇〜5〇%之程度表現目標基 因產物」。 做爲本發明之DNA者，例如爲具有序列表之序列編號：1 本纸張尺度通用中國國家標準（CNS〉A4規格（210 X297公釐） !々1 — _,ί丨4丨丨 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 、1Τ 辞： 589379 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（5 或2表示之鹼基序列之DNA。較佳者，如後述，爲在大腸菌 -或芽孢桿菌屬細菌中呈現構成性啓動子活 在本説明書卜所謂「啓動子」爲轉譯起始:=游 之20〜30個鹼基對，其雖然包含擔負使rNa聚合酶從正確位 置開始轉譯之機能之TATA區塊或TATA區塊類似領域，但 非必須限定於此等領域之前後，其也可包含該領域以外， 爲了接合RNA聚合酶以外之蛋-白質（用於調節表現）而必須 包含之領域。又，在本説明書中記載「啓動子領域」之場 合，'該用語係指包含本説明書中之啓動子之領域。 在本説明書中，所謂「啓動子活性」表示將基因以可表 現之狀態配置在啓動子下游，以及將所得構築物導入宿主 之時，有在宿主内或宿主外生產該基因之表現產物之能力 及機能。 一般而言，上述「啓動子活性」藉著包含下述步驟之方 法可以測定： ① 將測定對象之DNA連結於編碼易於定量或確認之蛋白 質之基因（以下稱爲報信子基因）之上游之步驟， ② 將所得構築物導入宿主之之步驟， ③ 培養所得轉形細胞及使該蛋白質表現之步驟，以及 ④ 測定該蛋白質之表現量之步驟。 又，「啓動子活性」之有無^例如係藉由將被認爲具啓動 子序列之序列連結在報信子基因之上游及將其導入宿主， 然後確I忍在宿主内或宿主外中該基因之基因產物是否表現 而貫施’其中表現被確認之場合，以在導入該啓動子之宿 8- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS〉A4規格（210X297公釐） L—l------- ^ J& (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T #Γ.. 589379 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（6 主中有啓動子活性爲指標。 在本説明書中，所謂「構成性啓動子」音 無關以固定量進行轉譯之啓動子。亦即，「二ΓΓ動= =不使用™等代表之謗導物質誘導下，使口配置於 β孓動子之下游之基因表現。 、 對於本發明之DNA，若觀察到構成性啓動子活性，則其 包含具有上述序列編號：表示之鹼基序列之單離DNA 之片段:在本文中，「片段」可以在能觀察到構成性啓動 子活性之範圍内適當選擇。該片段可以藉上述步驟①〜④ 之万法選擇。上述「片段」之長度例如爲500鹼基以下者。 再者，在本發明之DNA中亦包含具有於序列編號；1或2 之鹼基序列中至少一鹼基，具體而言丨或複數個鹼基，被置 換、刪失或附加之鹼基序列且具有構成性啓動子活性之 DNA。一般而言，在有短序列之dna中，具至少一鹼基突 變（置換、刪失或附加）之DN A，其之活性雖有變化，但藉 上述步驟①〜④之方法可以觀察到構成性啓動子活性之「具 突變之DN A」仍被包含在本發明之内。該突變可爲來自天 然之突變及人爲導入之突變之任一者。 人爲突變之導入方法例如有習用之部位特異性突變導入 法。導入部位特異性突變之方法例如可以採用利用琥珀突 變之方法[加缺口雙螺旋法，Nnaclbic Acids Research，第12 卷，第 9441 〜9456 頁（1984)]，利用 dut (dUTPase)及 ung(尿嘧 啶-DNA糖酶）基因缺損之宿主之方法[Klinkel法，美國科學 國家學會之會議記綠第82卷，第488〜4 92頁（1985)]，以及藉 9 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T #丨； 589379 A7 ______Β7 五、發明説明（7 ) ^ 由利用琥珀突變之PCR之方法（國際公開98/〇2535號公報 .等。 具哭變之DNA之、長度，爲藉上述步驟①〜④之方法可以觀 察到構成性啓動子活性之長度，例如5〇〇鹼基以下者。 又，與本發明之DNΑ之互補鏈在嚴苛條件下可以雜交之 DNA而且具有構成性啓動子活性iDNA (a);或者依據本發 明之DNA ,例如使用藉由一般方法設計及化學合成之寡核 荅酸探子或引子而得到之DNA且具有構成性啓動子活性之 DNA(b)，較佳在大腸菌或芽孢桿菌屬細菌中呈構成性啓動 子活性之單離DNA亦被包含在本發明之中。該DNA例如可 以選擇藉由上述步驟①〜④之方法能觀察到構成性啓動子 活性者。孩寡核：y：酸探子之鹼基序列雖無特殊限制，但以 在嚴苛條件下，能與具有上述01^八或與該〇1^八互補之鹼基 序列之DNA雜交者爲較佳。 土 在本又中所謂「嚴苛條件」例如爲以下之條件。亦即在 上述⑷之DNA之場合，在包含6xSSC (lxssc^ 〇 15 %

NaCM’ 0.015 Μ檸檬酸鋼，ρΗ 7 〇)，〇 5% SDS，5χ 單哈德 溶液[Denhardt’s s〇luti〇n，〇·1% 馬血清白蛋白（BSa)，〇 ι% 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 聚乙晞吡咯啶酮，〇·1%藻醇4〇〇]及1〇〇微克/毫升鮭魚精子 DNA又溶液中，於5(rc保溫一晚之條件等；以及在上述（b) 之DNA之場合，在與上述同κ溶液中，於所用探子之 Tm-25C之溫度保溫一晚之條件等。 又，在引子之鹼基序列方面沒有特別限定，在通常的PCR 反應條件中，只要能粘接於具有上述DNA或與該DNA互補 -10- 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 589379 A7 --------B7 五、發明説明（8 ) 之驗基序列之DNA且藉著DNA聚合酶可以開始伸長反應即 可。 寡核苷酸探子或、引子之Tm，例如可藉下列公式求得： Tm- 81.5 - 16.6 (log,〇[Na+]) + 0.41(〇/〇〇 +C) ~ (600/N) (式中，N爲寡核苷酸探子或引子之鏈長，0/〇(3+ c爲寡核铝 酸探子或引子中之鳥嘌呤及胞嘧啶殘基之含量）。 又，在寡核苷酸探子或引子—之鏈長比18個鹼基短之情況 ，Tm可藉[A+T(腺嘌呤及胸嘧啶）與2。〇之積]+ [G + C殘基之 各量與4 C之積]所得之和[(A + T)x2 + (G + C)x4]推定。 上述寡核荅酸探子之鏈長雖無特殊限定，但從防止非特 異性雜交之觀點言之，較佳爲15鹽基以上，更佳爲18鹽基 以上。 再者，關於引子，雖然鏈長沒有特殊限定，但期望例如 爲15〜40個鹽基，以17〜30個鹽基爲較佳。上述引子可用於 以PCR法爲開始之各種基因增幅.法，藉此所得到之具有構 成性啓動子活性之DNA亦被包含於本發明内。 —又，雜父操作之詳細説明，例如被記載於1989年冷泉港 實驗室發行，T· Maniatis等人編集之分子選殖：實驗手 册第2版中。 丁 上述⑷及（b)之DNA之長度」（爲藉由上述步㈣〜④之 万法能觀察到構成性啓動子活性者即可，例如爲·驗基以 下者。 又，在本發明之DNA中，亦包含具有與序列編號：… 表K驗基序列至少有80%(以9〇%爲較佳，以95%爲更佳） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁}

、1T -11 - 589379 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（9 ) 之序列同一性之鹼基序列且具有構成性啓動子活性之dna 。更具體而言，例如爲具有與序列編號：丨表示之鹼基序列 至少有80%(以90%、爲較佳，以95%爲更佳）之序列同一性之 驗基序列且具有構成性啓動子活性之DNA ;以及具有與序 列編號·· 2表示之鹼基序列至少有8〇%(以9〇%爲較佳，以95% 爲更佳）之序列同一性之鹼基序列且具有構成性啓動子活 性之DNA。孩等DNA若爲藉由上述步驟①〜④之方法能觀察 到構成性啓動子活性者即可。 上述所謂「序列同一性」係指2個聚核苷酸間之殘基之序 列類似性。上述Γ序列同一性」係藉由在比較對象之鹼基 序列領域中，比較以最適狀態對齊之2鹼基序列而決定。其 中，比較對象之聚核:y：酸，與供2序列最適對齊用之參考序 列（例如普遍序列）相比，不論有附加或刪失（例如缺口及外 伸序列等）均可。 序列同一性之數値（百分比），藉由決定存在於二序列中 之相同核酸驗基’決定適合部位之數目，繼而用比較對象 之序列領域内之鹼基之總數除上述適合部位，然後將所得 數値乘以10 0而算出。得到最適對齊及同一性之計算法，例 如爲Smith等人之局部同一性計算法[Add APL· Math·，第2 卷’第482頁（1981)]’ Needlem an等人之同一性對齊計算法 [Journal of Molecular Biology—，-第 48卷，第 443 頁（1970)]，

Pearson等人之相同性檢索法[美國科學國家學會之會議記 錄，第85卷，第2444頁（1988)]。更具體而言，可被列舉者 有動態程式設計法、缺口罰點法、Smith-Waterman計算法 12 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

【 - } s *' > I* 589379 A7 B7 五、發明説明（1〇) 、Good-Kanehisa計异法、BLAST計算法及FASTA計算法等。 核酸間之序列同一性，可以使用例如序列解析軟體，具 體而s，BLASTN、及FASTA等測定。上述BLASTN被載於 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ 中，FASTA 被載於 http://www.ddbj.nig.ac.jp 中，可供一般人利用。 再者，藉著本發明之DNA，可以提供將上述DNA與外來 基因，以上述外來基因可以表現之狀態配置之重組dna。 該重組DNA亦被包含在本發明之中。 在本説明書中，所謂外來基因意圖包含下列基因中之任 一者：與本發明DNA之來源生物爲不同起源之基因；對於 本發明心DNA爲異質之基因；以及如下述，在藉著導入適 訂 當的宿主而使用本發明DNA之場合，與該宿主爲異質之基 因。 做爲上述外來基因者’無特別限定，可被列舉者例如爲 編碼蛋白質之核酸’編碼反義RNA之核酸及編碼核糖核酸 酶《核酸。該外來基因之起源無特殊限定，可被列舉者例 有-·田菌4、酵母菌類、放,線菌類、絲狀菌類、子囊菌類 、擔子菌類等微生物；植物；昆蟲；以及動物等。 做爲:編碼蛋白質之核酸者，例如有編碼酵素、細胞激素 及扰也等足核酸，更具體而言，例如有間白素1〜I]基因、 干擾素ex’ β或γ基因、腫瘤壞死因-子基因、群落刺激因子基 X紅血球生成素基因、轉形增殖因子箱因 '免疫球蛋 白基因、組織纖維蛋白溶酶原活化因子基因 '尿激酶基因 西乎螢火蟲螢光素基因等，但不限於此等基因。 本紙張尺^ -13 589379 五、發明説明（η ) 在2龙明書中’所謂「核糖核酸酶」係指可以切斷特定 ^白貝〈mRN A以及抑制此等特定蛋自質轉譯者。核糖核 酸酶可依照編碼特、定蛋白質之基因之序列而設計。舉例言 之鐘㈤型核糖核酸酶係使用feBS Letter，第228卷，第 ^ 〇頁（1988)5己载之方法製作。又，不只是鐘頭型核糖 =酸酶，只要能切斷特定蛋白質之㈤^^^八因而可以抑制此 寺特疋蛋白質轉譯者，不論核擴核酸酶之種類，諸如髮夾 型核糖核酸酶或d核糖核酸酶等，皆被包含在本説明書之 核糖' 核酸酶之内。 在本1兄明書之中，「外來基因可以表現之狀態」意指該 外來基因受本發明DNA所發揮之啓動子活性控制。 、做爲本發明之DNA之取得方法者，例如有（1)如下述實例 (记載，從生物單離之方法；（2)按照序列編號：丨或2所示 之驗基序列，使用適當的探子或引子，而從生物之基因組 DNA選殖之方法；（3)按照序列編號：丨或2所示之鹼基序列 ’化學合成之方法。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

Hr. 在藉化學合成製作包含序列編號：1或2所示之鹼基序列 之DNA之場合，例如以習用之磷醯胺法等，藉由使化學合 成的寡核茹酸連結於酵素，而合成上述DN a。具體而言， 例如猎由進行下述步驟’可以得到本發明之Dna · (1)網羅序列編號：1或2所示之，鹼基序列之數十種寡核芬酸 Αη (η表示正整數），以及 由與從該Αη之序列之3’側或5’側位移數個鹼基之鹼基序列 互補之序列所組成之與該An之鏈長相同之寡核芬酸，藉由 -14 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 589379 A7 B7 五、發明説明（12 ) " 與該寡核菩酸八11連接，而生成之具有5’突出端或3,突出端之 雙股DN A之互補鏈寡核嘗酸an (η表示正整數），各藉由習用 之化學合成法合成、之步驟； [例如在製作包含序列編號·· 1所示之鹼基序列之寡核甞 酸之場合， 上述Αη爲包含序列編號：1之驗基編號：1〜20^^21-40 (A2)、41〜60 (A3)、61〜80 (A4)—、81 〜100 (八5)、1〇1〜120 (A6) 、121 〜140 (A7)、141 〜160 (A8)、161 〜180 (A9)、181 〜200 (A1Q)及201〜223 (Ah)之任一者之寡核：y：酸； ^爲包含序列編號：1之驗基編號：1〜23(a〇、24〜43 、44〜63 (a3)、64〜83 (a4)、84〜103 (a5)、1〇4〜123 (a6)、 124〜143 (a7)、144〜163 (a8)、164〜183 (a9)、184〜203 (a10) 及204〜223 (an)之任一者之寡核：y：酸之互補鏈； (2) 使用ATP以及習用之T4聚核苷酸酶，將上述步驟（1)所得 之各寡核甞酸An以及對應之互補鏈寡核甞酸^之各個之5, 終端骑酸化之步驟； (3) 4ι·上述步驟（2)所得之各寡核芬酸A。與對應之互補鏈寡 核站酸an粘接（anneaiing)，而得到數十種之「具有5,突出端 或3大出端之雙股dna (An，an)」之步驟； ⑷將上述步驟（3)得到之雙股DNA (An，％)，按照n之增加 順序，則應於序列丨或2所$线基㈣之方^，分成數 群，以及將上述步驟（3)得到之雙股DNA(An, 之每一群 各匯集於一試管之步驟； [例如在製作&含序列編？虎：i所示之驗基序列之寡核苷 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

-15- 五、 發明説明（13 酸之場合，設定 寡核苷酸A丨〜A4與互補鏈a丨〜叫之試管， 暴核荅酸八5〜八8與互補鏈心〜&8之試管，以及 寡核苷酸A9〜A"與互補鏈a9〜au之試管]; (5) 在對應於上述步驟（4)之各群之每一試管中，將雙股 DNA連接’藉此得到對應於各群之雙股dna之步驟； (6) 將上述步驟（5)得到之雙股DyA供應至凝膠電泳，然後從 凝膠萃取出對應於各群之具有目的鏈長之雙股DNA之帶之 步驟； (7) 將上述步驟（6)得到之對應於各群之具有目的鏈長之雙 股DNA匯集在一起並進行連接之步驟；以及 (8) 對於上述步驟（7)得到之DNA，藉凝膠電泳調查鏈長，及 /或藉由進行鹼基序列解析，確認其爲包含序列編號：1或2 所示之驗基序列之DNA之步驟。 本發明之DNA,縱使未謗導基因表現，但由於爲能高度 表現該基因之啓動子，特別適合用於外來基因(編碼蛋白 質之核酸）之表現。 又，藉由本發明之DNA，將提供至少含有Dna之基因表 現用載體。本發明亦包含相關之基因表現用載體。

若藉由本發明之基因表現用載體，由於其含有本發明之 DNA，所以可以宿主所生產冬全部細胞内蛋白質質量之： 少約30〜50%之程度，構成性表現目的基因產物，而且二 依照其之使用目的容易地表現。 A 做爲本發明之基因表現用載體之具體例者，例如有 訂 濟 部 中 央 員 工 消 費 印 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（ -16 589379 A7 B7 五、發明説明（Μ) pHCE19T(II)[圖 5]及 PHCE19(II)[圖 7]。 再者，上述用質體PHCE19T(II)轉形之大腸菌JM 1〇9，被 命名爲大腸菌JM109/PHCE19丁（Π)，且於2001年4月26曰寄 存於： 口 食品工業發展研究所 台灣新竹市食品路331號 寄存編號爲：CQRC 940346。 關於本發明之基因表現用載體，做爲載體者例如有質體 類载體、噬菌體類載體及病毒類載體。上述載體，依據做 爲宿主之細胞而適當選擇。 訂 被用作宿主之細胞，例如有大腸菌及芽孢桿菌屬細菌。 具體而言，做爲大腸菌者，例如有大腸菌κ-12系統之Ηβι〇ι 株，C600株，JM109株，DH5_、Dm〇B株、 株、曰斯IGF株等。又，做爲芽孢桿菌屬細菌者，例如爲芽 孢桿菌(Bachillus sp·)、枯草芽孢桿菌叫仆⑴旧⑽山⑷及 嗜熱脂，芽孢桿菌（Baehillus ste⑽the_phihis)等，惟不 P艮於此等細困，可將此等大腸菌或芽孢桿菌屬細菌進行變 異處理，然後將所得者做爲宿主。 做馬上述載體者，例如在宿主爲大腸菌之場合，例如有 做爲質體類載體之pUcl8、pUcl9、pBluescripapET等； =及做爲巫菌體類載體之λ04 〇及Xgt丨丨等λ噬菌體類載體 在本發明之基因表現用載體之構築上，可以利用上述分 子選殖：實驗室手册第2版記載之手法。舉例言之，可以依 -17- 589379 Α7 Β7 五、發明説明（15 ) 照圖4所示之構築概略圖製作。亦即，將包含上述好熱性芽 抱桿菌菌株SK-1之D-AAT基因之上游域之5、啓動子與 SD(Shine-dalgano>序列之DNA片段（350bp)，藉由使用下述 引子1 (序列編號：5)及引子2(序列編號：6): 引子 1 (5 -ccaagcttgatctctccttcacagattcc-3’）（29聚物），及 引子2 (5’-gaggatccagccatggtatatctcctttttccagaagtgtgaaa-3f)(44聚物） 以PCR法增幅。

接下來，將被增幅之含啓動子之片段用Hind III及Bam HI消化及精製。將所得到之片段連結於被mnd HI 消化之pUC19之較大片段，而製成pHUC19T。繼而，將包 含來自表現載體pTrc99A之強轉譯終結子rrnBTlT2之 Ncol-Scal片段插入pHUC19T之Nco I-EcoR I(填入）部位，能 夠得到基因表現用載體pHCE19T (11)(圖5)。再者，藉由DNA 驗基序列之決定，可以確認啓動子領域之序列。又，可用 下述引子3(序列編號：7)代替引子2 : 引子3 · (5-agggatccagccatgggttccagctcctttttccagaa-3’）（38聚物）， 與上述同樣，能夠得到SD序列與Ncol部位間之長度與 PHCE19T (II)不同之基因表現用載體pHCE19(n)(圖6及圖 7卜 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 广请先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 又’上述pHCE19(II)，可以藉著將pHcE19T(II)之SD序列 與Ncol部位間之鹼基序列：Aguatad，用公知之方法突變 成 5-gctggaac-3’而得到 〇 本發明之基因表現用載體，亦可以包含rrnBT1T等終結子 及供選擇之標記基因等。 -18- 本紙張尺度適用中國國冬標準（CNS ) Α4規格（21〇X297公餐） 五、發明説明（16) 做爲供選擇之枵亢 卡 那物性基因及:徵素二=:青黴素耐性基因 用二本見用裁體，依照目的基因產物之使 作簡便化，而酸t使目的基因之產物之單4 質等異種蛋白質之轉移酶及麥芽糖結合性蛋白 有組胺酸標籤之蛋白；序列，或者能以附加 二用載體，例如爲具有序_-或4表 載體。該表現2二重:_之表現 之表現載體中，亦可以包人葬^ ( a又，在本發明 表現用載體中而得到之由將目的基因組入上述基因 的使用M在上述基因表現用載體中所列舉之載體同樣 本發明之表現載體，藉著⑷將上述重組DNA組入適當的 以及⑻將目的基因組入上述基因表現用載體中而 又’藉著本發明之重組DNA及表現載體，可以得到保持 上述重組DNA之轉形細胞，或者保持上述表現載體之轉形 細胞。 …一- 做爲宿主者，例如爲與前文「做爲宿主之細胞」同樣的 細胞。 知重組DNA導入佰主’例如可藉文獻[Vir〇i〇gy，第52卷 -19- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 589379 A7 B7 五、發明説明（17) ，第456頁（197 3);分子及細胞生物學，第7卷，第2745頁 (1987) ; Journal of the National Cancer Institute，第 41 眷， 第 351 頁（1968); EMBO Journal，第 1卷，第 841 頁（1982)] 記載之方法進行。 知表現載fa導入值主之方法，例如可藉鱗酸約法 [Molecular and Cellular* Biology，第 7卷，第 2745 頁（1987)] ’電氣泠孔法[Proceedings of National Academy of Science of the USA，第 81 卷，第 7161 頁（1984)]，DEAE-葡聚糖法 [Methods in Nucleic Acids Research，第 283 頁，Clam 等人 編’ CRC出版社於1991年發行]及核糖體法[Bi〇Techniques ，第6卷，第682頁（1989)]等而進行。 再者，若藉由本發明之轉形細胞，可以提供一種蛋白質 之製造方法，其特徵爲培養該轉形細胞，然後從所得到之 培養物採取蛋白質。該「蛋白質之製造方法」亦被包含在 本發明之中。 更具體而1* ’藉著下述步驟可以製造蛋白質： 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

*1T (I) 使用a)將編碼蛋白質之核酸以可以表現之方式配置在 本务明之DNA之下游而得到之重組，或者b)使用 s有该重組DN A之載體轉形宿主細胞之步驟；以及 (II) 將（I)所得之轉形細胞在適於該蛋白質表現之條件下培 養’然後從所得到之培養，物採取該蛋白質之步驟。 轉形細胞又培養條件，可按照做爲宿主之細胞及表現對 象之蛋白質之性質等適宜選擇。 所得蛋白質可以藉習用之蛋白質精製手段精製。做爲該 -20

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 ^--------BT_ 五、發明説明（18) '—^— - 从氣手&者例如爲鹽析、離子交換層析、疏水層析、親水 性層析及凝膠過濾層析等。 再者、，在本發日丹之蛋白質之製造方法上，可以使用含有 本，明（DNA或本發明之基因表現用載體《蛋白質製造用 套組。藉著該套組，可以更簡便地進行蛋白質之製造方法。 以下，藉著實例詳細地説明本發明，不過本發明不限於 此等實例。 貫例1生產D-胺基酸胺基轉移酶之好熱性細菌之篩選及特 徵鑑定 爲了得到在D-胺基酸之酵素合成及D-胺基酸之產業生產 上有用的活體觸媒，對於從韓國土壤單離之1，3〇〇之好熱性 細菌，解析D_胺基酸胺基轉移酶（D_aat)活性。 .藉著測定D-丙胺酸及α-酮基戊二酸從丙酮酸形成之速度 ’而決定D-A AT活性。丙酮酸之量，藉著與乳酸去經基激 酉母之偶合法或水楊酸法[Analytical Biochemistry，第27卷， 第 1659〜1660 頁（1995); Methods in Enzymology，第 113 卷 ，第108頁（1 985)]決定。 在活性測定方面，使用包含100 mM Tris HC1 (pH 8.5)， 50 mMp比今酸- 5’-鱗酸，100 mM D -丙胺酸及100 mM α-酮基 戊二酸之反應混合物。在乳酸去氫酶（LDH)偶合測定之場 合，包含0.3 mM NADH及5單〜元/毫升LDH。酵素活性之1單 元，被定義爲在1分鐘内催化1毫莫耳丙酮酸形成之酵素之 量。蛋白質濃度，藉由使用馬血清白蛋白做爲標準之布拉 德福特法[Analytical Biochemistry，第 72卷，第 248 〜254 頁 -21 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS )八4^格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 吸： 589379 五、發明説明（19) (1976)]決定。 檢索f自從各種環境單離之好熱性細菌之D-AA丁活性之 ΐ L Ί 1、1 G株之D _A A T生產株°其之大部分在好氣條件 菌屬^種類?形成内跑子，因而被認爲大約係屬於芽抱桿 =下來’比較D_AAT生產菌株之酵素活性及熱安定性。 ，果’選擇下列4種好熱菌作爲_供生產D_胺基酸 體觸媒之生產菌株··《更“活性之2種好熱性細菌^ 芽孢桿菌LK_1及LK_2.，以及具有比上述D-AAT生產株更高 熱安足性之2種好熱性細菌，即嗜熱脂肪芽孢桿菌株弘： 訂 (B— Ste⑽thermophilus KL_〇1)及枯草芽孢桿菌菌株 SK] (BacUhsuWHsu)。在呈D aat活性之陽性株中 ·’=顯示最高活性之2株山及⑴供分類學鑑^，而知在 形態學特徵及生化學特徵上與YM1株非常近似。[Km L Microbiol. Biotechnol•，第 27卷，第 184 〜19〇頁（1999]尤其 ，前述2株如同YM1株可以在机下發育。在來自不同芽孢 桿菌之D-AAT之西方吸潰解析中，LK1&LK2酵素盘對抗 YMi D-AAT之抗體有強交互作用，被單離之2個〇_八八丁之 經 濟 部 中 央 標 準 局 員 X 消 費 合 作 社 印 製 移動距離與來自YM1之D-AAT之移動距離（分子量：約3ι kDa)相同（圖1)。 另一方面，在65r繁殖之舁熱性芽孢桿菌株之d_aa丁顯 示較弱的免疫吸潰信號；又D-AA丁之移動距離，在SDS-聚 丙晞醯胺凝膠電泳解析（圖1)中，與顯示32〜34 kDa分子量 之YM1 D-AAT之移動距離顯然不同。在6rc繁殖之:埶= -22 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X29?公楚） 589379 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（2〇) 芽孢桿菌株之D-AAT活性爲0·02單位/毫克蛋白質以下，爲 LK1 及 LK2 之 D-AAT 活性之約五分之一 [Kor. J. Microbiol. Biotechnol.，第27、卷，第184〜190頁（1999)]。爲解明來自於 65 C繁殖之芽孢桿菌群之D-A AT之特性，在本實驗中，選 擇SK-1株做爲D-AAT之供應源。 實例2生產耐熱性D-胺基酸胺基轉移酶之好熱性細菌株 SK-1之特徵鑑定 — 被單離之芽孢桿菌株SK-1與托比共生菌 (Symbiobacterium toebii)有絕對共生相互作用。上述sk-1 株之諸性質如下文所示： 菌學的性質 好氣性、格蘭氏陽性、運動性芽孢桿菌， 基因組DNA之GC含量：43.9莫耳％。 最適當的培育條件 溫度：45〜7(TC (最適溫度：60。〇， pH : 6.0〜9.0(最適溫度·· pH 7.5)。 在細胞壁存在中二胺基庚二酸， 主要的細胞壁脂肪酸爲分枝脂肪酸異_丨5 : 〇及異_丨7 : 〇， 主要的井戊間二晞化合物· g昆：Μ K - 7， 1 6 S核糖體DNA之比較序列解析 與嗜;葡萄糖茅抱桿菌（BaeiHus thermoglucosidasius)有 密切關係。 只例3來自好熱性芽孢桿菌菌株SK_ 1之耐熱性D —胺基酸胺 基轉移酶之基因選殖及特徵鑑定 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

-23-

589379 A7 B7 五、發明説明（21 ) 1)菌株及質體 將芽孢桿菌菌株SK-1在MY培養基[組成：1·5%多腺，〇2〇/〇 酵母萃取物，〇·2%肉萃取物，0.2%甘油，0.2% Κ2ΗΡ04, 〇·2% ΚΗ2Ρ04 中，0.026% NH4C1 (pH 7.0)]在好氣條件下於 60°C培養。爲了 D-AAT基因之選殖，使用芽孢桿菌菌株 sk- 1 [絕對共生之好熱性細菌托比芽孢桿菌SC-丨之共生細 菌]做爲DNA供給體。使用大腸菌WM335株[leu，pro，his ’ arg，thyA，met，lac，gal，rspL，hsdM，hsdR，murI](D- 权胺故舍養要求株）做爲供基因互補法[J〇Urnal 〇f

Bacteriology，第 1 14卷，第 499〜50ό 頁（ 1973)]用之宿主株。 必要時，在補充有胺芊青黴素（100毫克/毫升）及〇_榖胺酸 (i〇〇^克/毫升）之盧里耳·柏藤奈（Luria Bertani)培養基中 垮養上述芽孢桿菌菌株SK-1。 質體 pBluescript II SK及 pBluescript II KS從 Stratagene公 司購入，以及質體pUCl 18及pUCl 19從寶酒製造公司購入。 使用大腸菌XL1-Blue [Stratagene公司製]做爲供D-A AT基 因之亞選殖及定序用之宿主株。 2)來自芽孢桿菌菌株SK-1之D-A AT之基因選殖 芽孢桿菌SK-1之基因組DNA按照齊藤等人[Biochimica 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) et Biophysica Acta，第 72卷，第 019〜629 頁（1963)]所述者製 備，接下來將所得DNA用Sait3Ar部分消化。使用Beckman 公司製之SW40轉子以及蔗糖梯度[5〜4〇〇/0 (w/v)]，於25,〇〇〇 rpm離心20分鐘，然後單離3〜1〇 kb之〇ΝΑ片段。接下來， 將所得片段與經BamHI消化之PUC118,用T4 DNA連接酶於 -24- 本紙張尺度適财目@家標準（CNS )八4祕（21GX]97公楚） 589379 A7 B7 五、發明説明（22 ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 1 6 C進行12小時之反應以連結。用所得連接混合液，藉電 泳轉形D-穀胺酸依存性營養要求株（大腸菌〜％ 335)。藉此 得到芽孢桿菌菌株、SK-1之基因組DNA庫。從基因組131^八， 藉WM33 5之互補性得到35個D_穀胺酸非依存性、胺苄青黴 素耐性純系。 用JetStar 2.0[商品名]質體米第（Midi)純化套組[Gen〇med 公司製]，精製各純系之質體DyA。 使用單離質體，再轉形大腸菌XL丨胃⑴此細胞。其後，培 養轉形細胞，藉與實例1同樣的測定法，測定D_ a at活性。 顯示0-八八丁活性之12個純系之中，〇-八八1：活性最高[35單 位/毫克蛋白質（比顯示0.02單位/毫克蛋白質之桿菌菌株 sk-1之無細胞萃取液之活性高1750倍）]之一純系（pDSK2) 含有3.6 kb之插入片段。爲了 D-AAT基因之亞選殖，將質體 pDSK2進行限制解析。其結果，pDSK2之d-AAT活性係歸 屬於1.7 kb之EcoRI-XhoI片段（圖2)。將上述1.7 kb之片段亞 選殖入pBluescript II SK 及 pBluescript II KS中，而各構築 成pDSK231及pDSK232。含有以逆方向插入pDSK23l之片 段之質體PDSK232，顯示產生同樣程度之D-AAT活性，以 及該基因藉由其本身之啓動子被構成性地表現。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 關於來自芽孢桿菌菌株SK-1之D-AAT基因之鹼基序列， 使用PRIS Μ套組[Perkin Elmer公司製]及應用生物系統 373A DNA定序器，藉在兩方DNA鏈中之引子移行法決定。 開始的引子爲pBluescript II SK之全領域引子及核糖體弓丨 子；對内部序列具特異性之引子則由Korea Biotech公司（韓 -25- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2 Η) X 2W公釐） 589379 A7 B7 五、發明説明（23 ) 國）合成。被決定之序列使用Software · Genetic-smack (S.D.S.公司製）。 3)精製 …. 在含100毫克/毫升胺苄青黴素之LB培養基（1公升）中，將 保持pDSK2之大腸菌XLl-Blue在37°C培養16小時。將回收 之菌體懸浮於50毫升標準緩衝液中[包含終濃度爲〇 〇1 %之 β-石荒醇基乙醇及終濃度爲2〇 之ρ比今酸- 5，-嶙酸（PLP)之 30 mM Tris HC1 (pH 8.0)]。使用 Sonifiei· 450 [Brason

Ultrasonics公司製]，在冰上以2〇%之效率，將所得懸浮物 弄碎10分鐘。於15000 rpm離心60分鐘分離後，回收上清液 ，然後於60 C熱處理20分鐘。藉著於1 5〇〇〇 rpm離心1 〇分鐘 ，除去蛋白質凝集物。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T ，將所得上清液加載在用上述標準緩衝液平衡化之 Resource Q陰離子交換層析管柱[pharmacia&司製]。將蛋 白質用0〜1 M NaCl線性梯度溶離。將顯示d-AAT活性之溶 出份匯集，並藉限外過濾[Amic〇n&司製]濃縮。處理所得 蛋白質溶液使其含有1.7M硫酸銨，並將其加載在用含17M 硫酸銨之標準緩衝液平衡化之苯基_超糖管柱[pharmacia公 司製]中。蛋白質藉1.7〜〇 Μ硫酸銨之線性梯度而溶離出。 回收具D-AAT活性之溶出份，濃縮，然後將所得濃縮物對 標準緩衝液透析。將所得之溶·出份保存於超低溫（_8(rc )冷 藏庫。全部之管柱，於室溫用FPLC系統[Pharmacia公司製] 進行。 來自保持有質體pDSK2之大腸菌XL 1-Blue之溶析份，顯 -26

589379 五、發明説明（24) 示分子量爲34kDa之極濃蛋白質帶（圖 彳 統[Biorad公司製]定量34kDa_帶之姓 ，，以像解析系 ^ . 果可知表現蛋白哲士 f爲全部大腸菌蛋白質之約60〇/〇 〇 .貝< 實例4構成表現系（基因表現用載體）之構築 可使外來基因構成性表現之基因表現用：體之構 採用市售凝膠精製及質體精製用之酵素，凝膠猜製Z套/ 及質體精製用套組。又，除❹別明白記載，㈣按昭:

如T. Maniatis等人編集第2版之M〇iecuiar A

Laboratory Manual 2nd ed·等記載之習用技術構築。 圖4顯示基因表現用載體_pHCE19T(n)之構築概略圖。包 含上述好熱性芽孢桿菌SK]之D-aat基因之上游域之5·_ 啓動子及SD (Shine-dalgano)序列之DNA片段（350 bp)，用 下述引子引子1(序列編號：5)及引子2(序列編號：6)以pcR 法增幅： 引子1 (S’-ccaagcttgatctctccttcacagattcc-SJGQ聚物），及 引子2 (5'-gaggatccagccatggtatatctcctttttccagaagtgtgaaa-3，）(44聚物）。 經濟部中央標準局員工消費合作衽印裝 將被增幅之含啓動子之片段用Hind III及Bam HI消化及 精製。將所得到之片段連結於被Hind III及Bam HI消化之 pUC19之較大片段，而製成pHUC19T。繼而，將包含來自 表現載體pTrc99A之強轉譯終結子ΓΓηΒΤ1Τ2之Ncol-Scal片 段插入PHUC19T之Nco I-EcoR I(填入）部位，能夠得到基因 表現用載體pHCE19T(II)(圖5)。再者，藉由DNA鹼基序列 之決定，可以確認啓動子領域之序列。 又，可用下述引子3(序列编號：7)代替引子2 : -27- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 589379 A7 B7 ___ 五、發明説明（25) 引子3 : (5丨-agggatccagccatgggttccagctcctttttccagaa-3丨)(38聚物）， 與上述同樣，能夠得到SD序列與Ncol部位間之長度比 pHCE19T(II)長2b之基因表現用載體pHCE19(II)(圖6及圖7)。 上述製作之基因表現用載體pHCE19T(II)之鹼基序列被 示於序列表之序列編號：3中，在轉譯開始密碼子ATG之上 游之啓動子領域之223 bp被示於序列表之序列編號·· 1中。 又，同樣製備之基因表現用_載體pHCE19(II)之鹼基序列 被示於序列表之序列編號·· 4中；在轉譯開始密碼子之上游 之啓動子領域之225 bp被示於序列表之序列編號：2中。 實例5使用構成表現系之色胺酸啕哚酶之大量生產 在本實施例中，使用上述pHCE19T(II)，測試來自好熱性 細菌托比共生菌（以下被稱爲TNA)菌株SC-1之色胺酸峭哚 酶之選殖TNA基因在大腸菌中是否大量生產。又，使用批 式培養操作，爲使TNA之生產達到最大，調查重組大腸菌 之培養條件。 1)具有TNA基因之構成表現載體之構築 如圖8之策略所示，使用上述pHCE19T(II)製作保持來自 托比共生菌菌株SC-1之TNA基因之構成性表現載體 pHCE19T(II)-TNA。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 以保持TNA基因之pTNA爲模板，藉PCR法增幅TNA基因 。使用之引子如下述： 一/ N 終端引子：5’-ccaaagggcgagccctttaa-3’(20 聚物）（序列编號·· 8) C終端引子：5'-tgactaagtctgcagaagcttattagaccagatcgaagtgcgc-3’（43聚物） (序列編號：9)。 -28- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 589379 A7 B7 五、發明説明（26) 被增幅之TNA基因用Hind III消化，以及精製。又，將 pHCE19T(II)用Ncol消化，用克蘭勞（Klenow)片段修復終端 ，然後用Hind 11、1再消化。將得到之TNA基因連結於 pHCE19T(II)之較大片段，得到pHCE19T(II)-TNA。 2) 轉形細胞之調製 使用基因脈衝裝置（Bio-Rad)，以上述pHCE19T(II)-TNA 轉形做爲宿主之大腸菌HB101 JsupE44，hsd20 (rB-mB-)， recA13，ara-14，proA2，lacYl，galK2，rpsL20，xyl-5， mt 1 -1，leuB6，thi-1 ]。

轉形細胞在含10公克/公升色胺酸[Difco公司製]，5公克/ 公升酵母萃取物[Difco公司製]及10公克/公升氯化鈉之LB 培養基中培養。 3) 酵素溶液之調製 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 將上述2)之轉形細胞藉由5,000 xg 20分鐘之離心分離回 收，然後將得到之菌體用50 mM磷酸鉀緩衝液（PH 8.5)洗淨 。將所得細胞懸浮於包含〇· 1 mM PLP及10 mM 4-胺基苯基 甲磺醯氟之50 mM磷酸鉀緩衝液（pH 8 · 5)。將所得細胞用布 蘭森超音波產生器[Branson Ultrasonics公司製]予以超音 波碎裂。接下來，將所得細胞溶裂物用20，〇〇〇 xg 60分鐘離 心並除去細胞殘〉查’將所得上清液用含〇 · 〇 5 m Μ P L P之 20 mM磷酸鈣緩衝液（ρΗ 8.5)透析、將透析後之溶液於6rc 加為3 0分鐘’將含有來自大腸菌之色胺酸^丨嗓酶之熱變性 大腸菌蛋白質除去，然後在冰上冷卻。將蛋白質凝集物藉 5,000 xg、20分鐘之離心而除去，將所得之上清液做爲酵素

589379 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（27 ) 溶液。將上述酵素溶液保存於_紙直至使用爲止。 4) L-色胺酸合成活性測定 在包含25 嗓’ 100 丙酮酸鈉及500 mM氣化銨 (pH 8.5)之奶口物中，測疋TNA之[_色胺酸合成活性。藉著 酵素命液之+力口開始反應，藉添加G G5毫升5N Hci並在 65Ό培育2〇分鐘後，停止反應。將形成之L-色胺酸在 pBondapak C18逆相管柱司製]上藉Ηριχ層析。使 用含有5% (v/v)甲醇，2% (v/v)乙酸及〇·ι %磷酸鈉緩衝液 (pH.6·5)之溶液，以1毫升/分鐘之速度溶離出。蛋白質之檢 出於280 nm藉吸光度計進行。酵素之丨單位，被定義爲在上 述條件下，每1分鐘合成丨微莫耳L_色胺酸之酵素量。i單位 表TF 1耄克酵素之比活性。蛋白質濃度，以馬血清白蛋白 [Sigma公司製]做爲標準物質，藉由布拉德福特法決定。 5) L-色胺酸之生產 藉著槽型反應咨進行L-色胺酸之生產。爲抑制受質巧嗓 之氧化，將氮氣充填於酵素反應器。反應溫度，藉著使水 經由水套管循環’而控制在3 7 C。爲防止受質之枯竭，藉 HPLC決定4丨嗓之濃度後’將π朵及丙gjgj酸鈉斷續地供給至 反應溶液。 6) 細胞之繁殖曲線 細胞培養物之光學密度（GD)用吸光光度計[商品名：

BioChrom4060，Pharmacia公司製]在 600 nm測定。 7) TNA之大量生產 依照上述1)〜6)，使用保持pHCE19T(II)-TNA之大腸菌 -30- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2 Η) X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 589379 A7 _____B7_ 五、發明説明（28 ) (HB101/pHCE19T(II)-TNA)進行TNA之生產。其結果，如圖 9所示，以大細翻之全邵細胞内蛋白質之約4 〇 〇/。之含量表現 。在批式培養中，、爲藉高度細胞繁殖達成TNA之大量生產 ’將大腸菌HB101/pHCE19T(II)-TNA在含有50公克/公升甘 油之複合培養基中培養。 在2.5公升之發酵槽中及於37〇c下，大腸菌hB1〇1/ pHCE19T(II)-TNA之批式培養規程被示於圖1〇中。圖中， 白圓圈表示細胞之乾燥重量（公克/公升），白色上三角形表 π TNA之合成活性（單位/毫升），以及白下三角形表示甘油 ;辰度（公克/公升）。培養3小時後，ΤΝA之生產隨著細胞之繁 殖而增加。於培養20小時之時，細胞繁殖速度與TNA之生 產率達到最大程度。最終細胞濃度，於24小時之時6〇〇 nm 之吸光度達到75 ’ TNA之最大活性達到3.450單位/毫升。該 TNA之生產量’與保持具有lac系啓動子之質體之細胞在lb 培養基中並於IPTG謗導條件下培養之場合之生產量相較 ，增加9.2倍。 SDS-PAGE後，從蛋白質帶藉掃描光密度計解析之結果可 以推定可溶性酵素之含有量爲大腸菌萃取物中全部細胞蛋 白質之約40%。在細胞中表現之tna多數以可溶型被生產。 大腸菌HB101/pHCE19T(II)-TNA之粗萃取物之L-色胺酸 合成比活性爲約〇·；! 5單位/毫克_細胞。其之結果暗示包含耐 熱性色胺酸⑼嗓酶之耐熱性酵素藉著構成性啓動子可以被 效率良好地表現。 -31 - 本紙張尺賴财關家辟（CNS 公 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

589379 經 濟 部 中 央 標 準 局 員 工 消 費 合 作 社 印 製 A7 B7 五、發明説明（29 ) 實例6各種反應條件對於L -色胺酸之生產之影響 1) 溫度 爲調查TNA之熱安定性，將TNA在50 磷酸鈣緩衝液 (pH 8 · 5)中’於各種溫度培育3 〇分鐘，然後測定殘存活性。 以於60°C熱處理無細胞萃取物後所得之酵素溶液做爲本實 驗之活體觸媒。 如圖1 1所π，本酵素在60°C—以下保持安定，熱處理後維 持95%之酵素活性。TNA之安定性，由於被認爲係決定l_ 色胺酸合成之生產性之主要因子，所以Tna在改良酵素法 上可能有優異效果。又，L-色胺酸之最大合成反應溫度爲 65〇C 〇

2) pH ，在過量氯化銨及丙酮酸鈉存在下，調查pH値對於藉由 TNA合成L-色胺酸之速度之影響。在具有各種？9値之各緩 衝液中進行反應。如圖11所示，ρΗ値對於TNA之合成、、舌陡 之影響相當大，對於色胺酸合成，TNA之最大活性於pH<§ 9.0時被見到。甘油-Na0H緩衝液被觀察到對於酵素反鹿= 顯著之抑制作用。 ％ 3) 銨離子供給者 爲選擇在色胺酸合成上最適當的銨離子供給者， 銨、氣化銨、檸檬酸銨、甲酸銨_、硝酸銨、溴酸銨、磷酸 氫一按及硫酸銨等各種銨鹽分別用於反應混合物中。' 果示於表1中。 、° -32- 本紙張尺度家標準（CNS) A4規格（210χ297公慶 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

州379 A7 B7 五、發明説明（30) 表1 銨離子供給者 醋酸铵 氯化銨 甲酸銨 嶙酸氫二铵 硝酸銨 硫酸二铵 活性（％) 85.8 100 58.8 82.4 62.3 80.4 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 反應條件· 5 mM或25 mM吲哚，2〇〇 mM丙酮酸鈉及 1·0 Μ銨離子供給者，pH 9.0，6(TC 如表1所7F，氯化銨在L-色胺酸合成上爲最適當的銨離子 仪、，Ό者。在乙酸銨及磷酸氫二銨之場合，TNA之色胺酸合 成活性爲使用氯化銨之場合者之約8〇%。又，〇〜15 Μ濃度 範圍内之氣化銨對於色胺酸之合成之影響被示於圖丨2之 (A)格中。合成活性高度依存於氣化銨濃度，在1〇〜丨.5 ^ 氣化銨濃度，大約具相同的合成活性。 4)吲哚濃度 耐熱性酵素，由於對於化學變性劑具有安定之傾向，所 以在使用酵素做爲活體觸媒之生物技術工程中提供顯著的 優點。爲評價TNA之安定性，調查^丨哚濃度對於耐熱性tnA <生產性之影響。如圖12(B)格所示，TNA之吲哚合成活性 ’在吲P木丨辰度爲5 mM以下時，隨著4丨嗓濃度增加而增加， 但超過該濃度時，由於吲哚之毒性而逐漸減少。同時，大 -33 尽紙張尺度通用中國國家榡準（CNS ) A4規格（2Η)^797公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、11 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 589379 A7 B7__ 五、發明説明（31) 一 " " 腸菌之TNA，在啕哚濃度爲3 mM時被完全不活化。結果， 托比共生菌，與大腸菌相較，顯示對於啕哚造成之酵素不 活化具有相對高的、安定性。 5) 丙酮酸鈉濃度 圖12(C)格，顯示使用在〇〜3 〇〇 mM範圍内各種濃度之丙 酮酸鈉濃度時，TNA之L-色胺酸合成活性之調查結果。色 胺酸生產速度’隨著丙酮酸鈉i度增加而呈比例地直線增 加。最大合成活性，於〇·1Μ丙酮酸濃度下得到。超過上述 ;辰度後’色胺紅合成速度保持近似之値。 6) 曲同（Tdt〇n)TMX-i00 將曲同（Triton)X-1〇〇等非離子界面活性劑形成膠團且將 吲哚包含於其之内側，而在L-色胺酸合成之酵素反應期間 做爲啕哚之貯存所。調查曲同（Triton)x_1〇〇對於L_色胺酸 生產速度之影響，並與無曲同（Triton)X-l〇〇之反應混合物 之生產速度比較。結果被示於圖13中。具有3% (v/v)之曲同 (Trit〇n)X-l〇〇之反應混合物中，卩色胺酸之最大合成速度 在啕哚濃度爲50 mM時得到，該値比無曲同（Trit〇n)x」〇〇 之反應混合物高1 0倍。超過該濃度時，L-色胺酸之生產減 少0 7) 將供色胺酸生產之活體觸媒前處理至適化 爲比較在L-色胺酸之生產中各糧活體觸媒之效率，將包 含典細胞萃取物、冗整全細胞、透過細胞及丙酮乾燥細胞 之活體觸媒添加至包含5 mM或25 mM嗓之反應混合物中 。透過細胞係藉甲苯或甲醇處理全細胞，繼而分離而製備 -34- 本紙張尺度制巾關家料（（：叫》4規格（21()、;<297公釐) ----------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

*1T 考： 589379 A7 B7 五、發明説明（32) 。丙酮乾燥細胞，係用丙酮處理全細胞後，藉氣流乾燥細 胞而得到。丙酮酸鈉之濃度及氯化銨之濃度各爲200 mM及 1 Μ 〇 、 表2 活體觸媒型 相對活性(％) (5 mivH 卜朵） 相對活性(％) (25 mlvHj 嗓） 完整全細胞 Ίοο 100 無細胞萃取物 98.2 75.5 經5%甲醇處理之細胞 98.5 78.9 經10%甲醇處理之細胞 97.5 71.7 經5%甲苯處理之細胞 95.5 69.9 經10%甲苯處理之細胞 90.2 53.3 丙酮乾燥細胞 97.5 62.4 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 丨 .

，1T 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 反應條件：5 mM或25 mM啕哚，200 mM丙酮酸鈉， 1·0 Μ氣化銨，pH 9.0，37°C 如表2所示，在低濃度之p?f嗓下（5 mM)，L-色胺酸在全部 試驗或活體試驗中被效率良好地合成。同時，在高濃度（25 mM)之巧嗓下，只有冗整的細胞顯示高L-色胺酸合成活性 。該場合，較低活性之其他法體觸媒，被認爲係因酵素與 高濃度的局限p朵直接相互作用而抑制酵素。其結果顯示 全細胞爲最適於以良好效率生產L-色胺酸之活體觸媒。使 用過剩生產TNA之全細胞做爲L-色胺酸生產用之活體觸媒。 -35- 翁丨·· • 1— II— - 本纸張尺度適用中國國家榇準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 589379 A7 B7 五、發明説明（33) "" " 1 8)藉全細胞活體觸媒生產L-色胺酸 做爲受質之丙酮酸於超過45°C之溫度非常不安定，在該 /EL度，丙S同故於乳敗去氣酶存在下，在從藉由nadh之還 原推定之反應混合物中將立即消失。經由銨離子形成亞胺 或許爲回應丙酮酸減少之主要反應，但未排除丙酮酸發生 進一步反應。由於丙酮酸之熱不安定性，合成反應在65^ 無法安定地進行反應，因而無」去生產大量的L-色胺酸。因 此之故，L-色胺酸之生產，在37。(：之酵素反應器中，藉1 公升之反應混合物而實施。 開始反應混合物含有1.0 Μ氣化銨，1〇〇 mM丙酮酸鈉， 30 mM啕哚，0.1 mM PLP，0.1%亞硫酸鈉及1〇公克（乾燥重 量）/公升之大腸菌HB101/PHCE19T(II)-TNA。將3%曲同 (Triton) X-100添加至反應混合物中，以溶解添加之吲哚。 爲防止受質耗盡，將啕哚及丙酮酸鈉繼續供應至反應溶液 中0 圖14表示在酵素反應器中L-色胺酸之生產之反應模式。 色胺酸之生產速度，於27小時期間維持同樣的水平，其後 逐漸減少。從以HPLC對反應混合物之解析，認爲色胺酸之 生產速度減少係由於被高度蓄積於反應器中之W嗓造成。 從反應3小時開始，由於L-色胺酸以白色結晶沉澱，因此反 應以更佳之效率進行。反應14小^寺後，在37。〇，約66·2公 克/公升（0.325 M)之L-色胺酸從啕嗓以85%之轉換率被生 產0 -36- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 589379 A7 ——___ B7_ 五、發明説明（34 ) 庠列表内容 序列编號：1顯示pHCE19T(II)中之啓動子領域之序列。 序列编號·· 2顯示pHCE19(II)中之啓動子領域之序列。 序列編號·· 3顯示pHCE19T(II)之序列。 序列編號：4顯示pHCE19(II)之序列。 序列编號：5顯示供增幅芽孢桿菌菌株之d-AAT基因之啓 動子用之寡核苷酸序列之序列」 序列編號·· 6顯示供增幅芽孢桿菌菌株之d-AAT基因之啓 動予用之寡核芬酸序列。 序列編號：7顯示供增幅芽孢桿菌菌株之d-AAT基因之啓 動子用之寡核省:酸序列。 序列编號：8顯示供增幅來自托比共生菌菌株^-丨之丁”八 基因用之寡核茹酸序列。 序列編號：9顯示供增幅來自托比共生菌菌株SC-丨之TNa 基因用之寡核苷酸序列。 產業上之利用可能性 若藉由本發明之DNA，由於具有被構成性表現之啓動子 之序列，所以可以發揮所謂「在不藉謗導物質謗導下，使 目的基因之產物簡便且便宜地高度表現」之優異效果。因 此，若藉由本發明之DNA，可以工業規模生產有用的基因 的表現產物。又，藉由本發明之蛋白質之製造方法，可以 工業規模生產有用的基因的表現產物。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁}

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589379 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（35) 序列表 <110〉BioLeaders公司 <110> Takara Shuzo Co. f Ltd. 〈120>新穎啓動子及用該啓動子調節基因表現之方法

〈130> 01-035TW <150〉 JP 2000-128528 <151> 2000-04-27 <160> 9 <170> Patent In Ver. 2. 1 <210> 1 <211〉 223 <212> DNA ^ , <213〉人造序列 <220> 〈223>人造序列之説明·· pHCE19T(II)上之啓動子區之序列 -38- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部中央標準局員工消費合作社印装 589379 A7 B7 五、發明説明（36) <400> 1 gatctctcct tcacagattc ccaatctctt gttaaataac gaaaaagcat caatcaaaac 60 ggcggcatgt ctttctatat iccagcaatg ttttataggg gacatattga tgaagatggg 120 tatcacctta gtaaaaaaag aattgctata agctgctctt ttttgttcgt gatatactga 180 taataaattg aattttcaca cttctggaaa aaggagatat acc 223 <210> 2 一 <211> 225 <212> DNA <213〉人造序列 <220> 〈223>人造序列之説明：pHCE19(II)上之啓動子區之序列 <400> 2 gatctctcct tcacagattc ccaatctctt gttaaataac gaaaaagcat caatcaaaac 60 ggcggcatgt ctttctatat tccagcagtg ttttataggg gacatattga tgaagatggg 120 tatcacctta gtaaaaaaag aattgctata agctgctctt ttttgttcgt gatatactga 180 taataaattg aattttcaca cttctggaaa aaggagctgg aaccc 225 〈210〉 3 <211> 3753 〈212〉 DNA 〈213>人造序列 -39- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 589379 A7 _____B7 五、發明説明（37) <220〉 〈223>人造序列之説明·· pHCE19T(II)之序列： <400> 3 gatctctcct tcacagattc ccaatctctt gttaaataac gaaaaagcat caatcaaaac 60 ggcggcatgt ctttctatat tccagcaatg ttttataggg gacatattga tgaagatggg 120 tatcacctta gtaaaaaaag aattgctata agctgctctt ttttgttcgt gatatactga 180 taataaattg aattttcaca cttctggaaa aaggagatat accatggaat tcgagctcgg 240 tacccgggga tcctctagag tcgacctgca ggcatgcaag cttggctgtt ttggcggatg 300 agagaagatt ttcagcctga tacagattaa atcagaacgc agaagcggtc tgataaaaca 360 gaatttgcct ggcggcagta gcgcggtggt cccacctgac cccatgccga actcagaagt 420 gaaacgccgt agcgccgatg gtagtgtggg gtctccccat gcgagagtag ggaactgcca 480 ggcatcaaat aaaacgaaag gctcagtcga aagactgggc ctttcgtttt atctgttgtt 540 tgtcggtgaa cgctctcctg agtaggacaa atccgccggg agcggatttg aacgttgcga 600 agcaacggcc cggagggtgg cgggcaggac gcccgccata aactgccagg catcaaatta 660 agcagaaggc catcctgacg gatggccttt ttgcgtttct acaaactctt tttgtttatt 720 tttctaaata cattcaaata tgtatccgct catgagacaa taaccctgat aaatgcttca 780 ataatattga aaaaggaaga gtatgagtat tcaacatttc cgtgtcgccc ttattccctt 840 ttttgcggca ttttgccttc ctgtttttgc tcacccagaa acgctggtga aagtaaaaga 900 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) tgctgaagat cagttgggtg cacgagtggg ttacatcgaa ctggatctca acagcggtaa 960 gatccttgag agttttcgcc ccgaagaacg tttt-ccaafg atgagcactt ttaaagttct 1020 gctatgtggc gcggtattat cccgtgttga cgccgggcaa gagcaactcg gtcgccgcat 1080 acactattct cagaatgact tggttgagta attcactggc cgtcgtttta caacgtcgtg 1140 actgggaaaa ccctggcgtt acccaactta atcgccttgc agcacatccc cctttcgcca 1200 gctggcgtaa tagcgaagag gcccgcaccg atcgcccttc ccaacagttg cgcagcctga 1260 -40- ^紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ' 589379 A7 B7 五、發明説明（38) atggcgaatg gcgcctgatg cggtattttc tccttacgca tctgtgcggt atttcacacc 1320 gcatatggtg cactctcagt acaatctgct ctgatgccgc atagttaagc cagccccgac 1380 acccgccaac acccgctgac gcgccctgac gggcttgtct gctcccggca tccgcttaca 1440 gacaagctgt gaccgtctcc gggagctgca tgtgtcagag gttttcaccg tcatcaccga 1500 aacgcgcgag acgaaagggc ctcgtgatac gcctattttt ataggttaat gtcatgataa 1560 taatggtttc ttagacgtca ggtggcactt ttcggggaaa tgtgcgcgga acccctattt 1620 gtttattttt ctaaatacat tcaaatatgt atccgctcat gagacaataa ccctgataaa 1680 tgcttcaata atattgaaaa aggaagagta tgagtarttca acatttccgt gtcgccctta 1740 ttcccttttt tgcggcattt tgccttcctg tttttgctca cccagaaacg ctggtgaaag 1800 taaaagatgc tgaagatcag ttgggtgcac gagtgggtta catcgaactg gatctcaaca 1860 gcggtaagat ccttgagagt tttcgccccg aagaacgttt tccaatgatg agcactttta 1920 aagttctgct atgtggcgcg gtattatccc gtattgacgc cgggcaagag caactcggtc 1980 gccgcataca ctattctcag aatgacttgg ttgagtactc accagtcaca gaaaagcatc 2040 ttacggatgg catgacagta agagaattat gcagtgctgc cataaccatg agtgataaca 2100 ctgcggccaa cttacttctg acaacgatcg gaggaccgaa ggagctaacc gcttttttgc 2160 acaacatggg ggatcatgta actcgccttg atcgttggga accggagctg aatgaagcca 2220 taccaaacga cgagcgtgac accacgatgc ctgtagcaat ggcaacaacg ttgcgcaaac 2280 tattaactgg cgaactactt actctagctt cccggcaaca attaatagac tggatggagg 2340 cggataaagt tgcaggacca cttctgcgct cggcccttcc ggctggctgg tttattgctg 2400 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) ataaatctgg agccggtgag cgtgggtctc gcggtatcat tgcagcactg gggccagatg 2460 gtaagccctc ccgtatcgta gttatctaca cgacggggag tcaggcaact atggatgaac 2520 gaaatagaca gatcgctgag ataggtgcct cactgattaa gcattggtaa ctgtcagacc 2580 aagtttactc atatatactt tagattgatt taaaacttca tttttaattt aaaaggatct 2640 aggtgaagat cctttttgat aatctcatga ccaaaatccc ttaacgtgag ttttcgttcc 2700 actgagcgtc agaccccgta gaaaagatca aaggatcttc ttgagatcct ttttttctgc 2760 gcgtaatctg ctgcttgcaa acaaaaaaac caccgctacc agcggtggtt tgtttgccgg 2820 -41 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 589379 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 Α7 Β7 五、發明説明（39) atcaagagct accaactctt tttccgaagg taactggctt cagcagagcg cagataccaa 2880 atactgtcct tctagtgtag ccgtagttag gccaccactt caagaactct gtagcaccgc 2940 ctacatacct cgctctgcta atcctgttac cagtggctgc tgccagtggc gataagtcgt 3000 gtcttaccgg gttggactca agacgatagt taccggataa ggcgcagcgg tcgggctgaa 3060 cggggggttc gtgcacacag cccagcttgg agcgaacgac ctacaccgaa ctgagatacc 3120 tacagcgtga gcattgagaa agcgccacgc ttcccgaagg gagaaaggcg gacaggtatc 3180 cggtaagcgg cagggtcgga acaggagagc gcacgaggga gcttccaggg ggaaacgcct 3240 ggtatcttta tagtcctgtc gggtttcgcc acctctgact tgagcgtcga tttttgtgat 3300 gctcgtcagg ggggcggagc ctatggaaaa acgccagcaa cgcggccttt ttacggttcc 3360 tggccttttg ctggcctttt gctcacatgt tctttcctgc gttatcccct gattctgtgg 3420 ataaccgtat taccgccttt gagtgagctg ataccgctcg ccgcagccga acgaccgagc 3480 gcagcgagtc agtgagcgag gaagcggaag agcgcccaat acgcaaaccg cctctccccg 3540 cgcgttggcc gattcattaa tgcagctggc acgacaggtt tcccgactgg aaagcgggca 3600 gtgagcgcaa cgcaattaat gtgagttagc tcactcatta ggcaccccag gctttacact 3660 ttatgcttcc ggctcgtatg ttgtgtggaa ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggaa 3720 acagctatga ccatgattac gccaagctag ctt 3753 <210〉 4 〈211〉 3755 〈212〉 DNA 〈213>人造序列 〈220> 〈223〉人造序列之説明：pHCE19(II)之序列 <400> -42 - ，’很中國國家標準（CNS)A4規格（2ΐ〇χ297公羡） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 589379 A7 B7 五、發明説明（40) gatctctcct tcacagattc ccaatctctt gttaaataac gaaaaagcat caatcaaaac 60 ggcggcatgt ctttctatat tccagcagtg ttttataggg gacatattga tgaagatggg 120 tatcacctta gtaaaaaaag aattgctata agctgctctt ttttgttcgt gatatactga 180 taataaattg aattttcaca^t'tctggaaa aaggagctgg aacccatgga attcgagctc 240 ggtacccggg gatcctctag agtcgacctg caggcatgca agcttggctg ttttggcgga 300 tgagagaaga ttttcagcct gatacagatt aaatcagaac gcagaagcgg tctgataaaa 360 cagaatttgc ctggcggcag tagcgcggtg gtcccacctg accccatgcc gaactcagaa 420 gtgaaacgcc gtagcgccga tggtagtgtg gggtctcccc atgcgagagt agggaactgc 480 caggcatcaa ataaaacgaa aggctcagtc gaaagactgg gcctttcgtt ttatctgttg 540 tttgtcggtg aacgctctcc tgagtaggac aaatccgccg ggagcggatt tgaacgttgc 600 gaagcaacgg cccggagggt ggcgggcagg acgcccgcca taaactgcca ggcatcaaat 660 taagcagaag gccatcctga cggatggcct ttttgcgttt ctacaaactc tttttgttta 720 tttttctaaa tacattcaaa tatgtatccg ctcatgagac aataaccctg ataaatgctt 780 caataatatt gaaaaaggaa gagtatgagt attcaacatt tccgtgtcgc ccttattccc 840 ttttttgcgg cattttgcct tcctgttttt gctcacccag aaacgctggt gaaagtaaaa 900 gatgctgaag atcagttggg tgcacgagtg ggttacatcg aactggatct caacagcggt 960 aagatccttg agagttttcg ccccgaagaa cgttttccaa tgatgagcac ttttaaagtt 1020 ctgctatgtg gcgcggtatt atcccgtgtt gacgccgggc aagagcaact cggtcgccgc 1080 atacactatt ctcagaatga cttggttgag taattcactg gccgtcgttt tacaacgtcg 1140 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) tgactgggaa aaccctggcg ttacccaact taatcgcctt gcagcacatc cccctttcgc 1200 cagctggcgt aatagcgaag aggcccgcac cgatcgccct tcccaacagt tgcgcagcct 1260 gaatggcgaa tggcgcctga tgcggtattt tctccttacg catctgtgcg gtatttcaca 1320 ccgcatatgg tgcactctca gtacaatctg ctctgatgcc gcatagttaa gccagccccg 1380 acacccgcca acacccgctg acgcgccctg acgggcttgt ctgctcccgg catccgctta 1440 cagacaagct gtgaccgtct ccgggagctg catgtgtcag aggttttcac cgtcatcacc 1500 gaaacgcgcg agacgaaagg gcctcgtgat acgcctattt ttataggtta atgtcatgat 1560 -43- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 589379 A7 __B7____ 五、發明説明（41) aataatggtt tcttagacgt caggtggcac ttttcgggga aatgtgcgcg gaacecctat 1620 ttgtttattt ttctaaatac attcaaatat gtatccgctc atgagacaat aaccctgata 1680 aatgcttcaa taatattgaa aaaggaagag tatgagtatt caacatttcc gtgtcgccct 1740 tattcccttt tttgcggcat t'ttgccttcc tgtttttgct cacccagaaa cgctggtgaa 1800 agtaaaagat gctgaagatc agttgggtgc acgagtgggt tacatcgaac tggatctcaa 1860 cagcggtaag atccttgaga gttttcgccc cgaagaacgt tttccaatga tgagcacttt 1920 taaagttctg ctatgtggcg cggtattatc ccgtattgac gccgggcaag agcaactcgg 1980 tcgccgcata cactattctc agaatgactt ggttgagtac tcaccagtca cagaaaagca 2040 tcttacggat ggcatgacag taagagaatt atgcagtgct gccataacca tgagtgataa 2100 cactgcggcc aacttacttc tgacaacgat cggaggaccg aaggagctaa ccgctttttt 2160 gcacaacatg ggggatcatg taactcgcct tgatcgttgg gaaccggagc tgaatgaagc 2220 cataccaaac gacgagcgtg acaccacgat gcctgtagca atggcaacaa cgttgcgcaa 2280 actattaact ggcgaactac ttactctagc ttcccggcaa caattaatag actggatgga 2340 ggcggataaa gttgcaggac cacttctgcg ctcggccctt ccggctggct ggtttattgc 2400 tgataaatct ggagccggtg agcgtgggtc tcgcggtatc attgcagcac tggggccaga 2460 tggtaagccc tcccgtatcg tagttatcta cacgacgggg agtcaggcaa ctatggatga 2520 acgaaataga cagaicgctg agataggtgc ctcactgatt aagcattggt aactgtcaga 2580 ccaagtttac tcatatatac tttagattga tttaaaactt catttttaat ttaaaaggat 2640 ctaggtgaag atcctttttg ataatctcat gaccaaaatc ccttaacgtg agttttcgtt 2700 ccactgagcg tcagaccccg tagaaaagat caaaggatct tcttgagatc ctttttttct 2760 gcgcgtaatc tgctgcttgc aaacaaaaaa accaccgcta ccagcggtgg tttgtttgcc 2820 ggatcaagag ctaccaactc tttttccgaa ggtaactggc ttcagcagag cgcagatacc 2880 aaatactgtc cttctagtgt agccgtagtt aggccaccac ttcaagaact ctgtagcacc 2940 gcctacatac ctcgctctgc taatcctgtt accagtggct gctgccagtg gcgataagtc 3000 gtgtcttacc gggttggact caagacgata gttaccggat aaggcgcagc ggtcgggctg 3060 aacggggggt tcgtgcacac agcccagcti ggagcgaacg acctacaccg aactgagata 3120 -44- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

589379 經濟部中央標準局員工消費合作衽印製 A7 B7 五、發明説明（42) cctacagcgt gagcattgag aaagcgccac gcttcccgaa gggagaaagg cggacaggta 3180 tccggtaagc ggcagggtcg gaacaggaga gcgcacgagg gagcttccag ggggaaacgc 3240 ctggtatctt tatagtcctg tcgggtttcg ccacctctga cttgagcgtc gatttttgtg 3300 atgctcgtca ggggggcgga gcctatggaa aaacgccagc aacgcggcct ttttacggtt 3360 cctggccttt tgctggcctt ttgctcacat gttctttcct gcgttatccc ctgattctgt 3420 ggataaccgt attaccgcct ttgagtgagc tgataccgct cgccgcagcc gaacgaccga 3480 gcgcagcgag tcagtgagcg aggaagcgga agagcgccca atacgcaaac cgcctctccc 3540 cgcgcgttgg ccgaitcatt aatgcagctg gcacgacagg tttcccgact ggaaagcgg^ 3600 cagtgagcgc aacgcaatta atgtgagtta gctcactcat taggcacccc aggctttaca 3660 ctttatgctt ccggctcgta tgttgtgtgg aattgtgagc ggataacaat ttcacacagg 3720 aaacagctat gaccatgatt acgccaagct agctt 3755 <210> 5 <211> 29 <212> DNA 〈213>人造序列 <220> <223〉人造序列之説明：供增幅來自芽孢桿菌菌株SK-1之D-AAT基因之啓動1 子序列之寡核替酸序列 <400> 5 ccaagcttga tctctccttc acagattcc ^ <210> 6 <211> 44 -45 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 . 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 589379 A7 B7 五、發明説明（43) <212> DNA <213>人造序列 〈220> 〈223>人造序列之説明：供增幅D-AAT基因之啓動子序列之寡核替酸序列 <400> 6 一 gaggatccag ccatggtata tctccttttt ccagaagtgt gaaa 44 〈210〉 7 <211> 38 <212〉 DNA 〈213〉人造序列 <220> <223〉人造序列之説明：供增幅來自芽孢桿菌菌株SK-1之D-AA丁基因之啓動 子序列之寡核茹酸序列 <400> 7 agggatccag ccatgggttc cagctccttt ttccagaa <210〉 8 <211> 20 <212〉 DNA 〈213>人造序列 -46- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4M ( 210x 297公釐） (请先閱讀背面之注意事項存填寫本頁)

589379 A7 B7 五、發明説明（44) <220> <223〉人造$列·^明··供增幅來自托比共生 目之序列 用之寡核甞酸序0… <400> 8 ccaaagggcg agccctttaa 20 <210> 9 <211> 43 <212〉 DNA <213>人造序列 <220> 〈223〉人造序列之説明：供增幅來自托比共生菌菌株sc-l之TNA基因之序列 用之寡核苷酸序列 <400> 9 tgactaagtc tgcagaagct tattagacca gatcgaagtg cgc 43 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 -47 - 本紙張尺度適用中國國家榡準（CNS ) A4規格（210X297公釐）

Claims (1)

1. ο 中文申請 ί2〇7號專利申請案 專利範圍替換本(93年4月） A BCP 六、申请專利範圍

   L 一種在大腸菌或芽孢桿菌屬細菌中呈現構成性啟動子活 性之單離DNA，其為具有一種選自下列者所組成群中之 鹼基序列之DNA或其片段： (A) 以序列編號·· 1或2表示之鹼基序列， (B) 在序列編號：}或2中至少有一殘基被置換、刪除或 附加之鹼基序列，以及 (C) 能與包含序列編號：表示之鹼基序列之核酸在 嚴苛條件下雜交之核酸之鹼基序列。 2·如申請專利範圍第1項之單離DNA，其中在其被配置於外 來基因之上游時，於謗導物質不存在下可以表現該基因。 3· —種重組DNA，其係由申請專利範圍第丨或2項之DNA與 外來基因以可表現該外來基因之狀態配置所成者。 4·如申請專利範圍第3項之重組DNA，其中該外來基因為從 編碼蛋白質之核酸、編碼反義RNA之核酸以及編碼核糖 核酸酶之核酸所組成群中選出之核酸。 5. —種基因表現用載體，其至少含有申請專利範圍第丨或2 項之DNA 〇 6·如申請專利範圍第5項之基因表現用載體，其中該載體為 從質體類載體、噬菌體類載體及病毒類載體所組成群中 選出之一種。 7·如申請專利範圍第5或6項之基因表現用載體，其具有序 列編號：3或4所示之驗基序列。 589379 A8 B8 C8 D8

   六、申請專利範圍 8. 一種表現載體，其含有申請專利範圍第3或4項之重组 DNA 〇 9·如申請專利範圍第8項之表現載體，其中載體為從質體類 載f豆、噬菌體類載體及病毒類載體所組成群中選出之一 種。 10.—種轉形細胞，其係保持申請專利範圍第3或4項之重組 DNA或申請專利範圍第8或9項之表現載體。 11·種蛋白質之製造方法，其特徵為培養申請專利範圍第 1 〇項之轉形細胞，並從所得培養物採取蛋白質。 12· —種蛋白質製造用套組，其至少含有申請專利範圍第丄 或2項之DNA，或者申請專利範圍第5至7項中任—項之基 因表現用載體。 -2 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐)