CN102191187B

CN102191187B - 一种解脂假丝酵母菌株及用其制备长链二元酸的方法

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Publication number: CN102191187B
Application number: CN2011100813709A
Authority: CN
Inventors: 赵友谊
Original assignee: SHANDONG HUAXING ENVIRONMENTAL PROTECTION GROUP CO Ltd
Current assignee: SHANDONG HUAXING ENVIRONMENTAL PROTECTION GROUP CO Ltd
Priority date: 2011-04-01
Filing date: 2011-04-01
Publication date: 2012-07-18
Anticipated expiration: 2031-04-01
Also published as: CN102191187A

Abstract

本发明公开了一种解脂假丝酵母菌株及用其制备长链二元酸的方法，属于微生物发酵领域。该解脂假丝酵母菌株为解脂假丝酵母(Candida lipolytica)CX-998 CCTCC NO：M2011094。该制备方法是在以C₁₀～C₁₈的正烷烃为基质的培养基中，用该菌株发酵，然后经分离、提取、回收得到与正烷烃基质链相同的长链二元酸。该方法可以生产C₁₀～C₁₈的各种单一和混合二元酸，其中在10立升发酵罐，从nC₁₁发酵转化生产DC₁₁时，144小时DC₁₁产量高达165g/L，后处理收率88％，当nC₁₁纯度＞99％时，DC₁₁纯度达到99％。

Description

一种解脂假丝酵母菌株及用其制备长链二元酸的方法

技术领域

本发明涉及一种解脂假丝酵母菌株及用其制备长链二元酸的方法，尤其是制备十一碳二元酸的方法，属于微生物发酵领域。

背景技术

长链二元酸是化工合成高级香料、高性能尼龙工程塑料、热熔胶、涂料、润滑油、高温电介质、医药和农药等的重要原材料。DC₁₁(十一碳二元酸)是合成高性能尼龙1112、尼龙1110、尼龙1111、高级全合成润滑油和绿色农药等的重要原料。

DC₁₁自然界中不单独存在，化学方法无法合成，因此利用微生物特殊的氧化酶活力，在常温常压下发酵转化石油副产物中的正十一烷(nC₁₁)生产DC₁₁，开辟了DC₁₁的新来源，为尼龙1111和尼龙1110等一系列尼龙工程塑料新品种的工业生产，为全合成润滑油的工业生产，为农药蜕皮性信息素的合成生产提供了物美价廉的重要原料。

在以中科院微生物所陈远童为代表的一系列国内外长链二元酸的专利文献中，有许多用热带假丝酵母生产十二碳、十三碳、十四碳、十五碳、十六碳和十七碳二元酸的报道，但鲜有微生物发酵转化高产十一碳二元酸的报道。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供了一种解脂假丝酵母菌株及用其制备长链二元酸的方法，该方法当原料正十一烷(nC₁₁)的纯度＞99％时，DC₁₁纯度达到99％。

本发明解脂假丝酵母(Candida lipolytica)CX-998号突变菌株是以一株在油田附近采集、分离筛选，按Lodder J.的酵母分类鉴定系统进行鉴定属于解脂假丝酵母，能氧化正烷烃生产二元酸的原始菌株为出发菌株，通过紫外线、亚硝酸和N⁺注入等方法，反复诱变和筛选培育出来的高产菌株，该菌株对正十一烷有较强的氧化酶活力、亲和力和乳化性。该菌株已于2011年3月24日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址：湖北省武汉市武昌珞珈山，武汉大学)，保藏号为CCTCC NO：M2011094。该菌株在麦芽汁琼脂斜面上菌落乳白色，粘湿，光泽，有些菌落的表面褶皱，边缘不整齐；细胞形态呈圆形或卵圆形。

本发明的技术放案是：以上述菌株制备长链二元酸的方法，其特征是，在以C₁₀～C₁₈的正烷烃为基质的培养基中，用上述菌株发酵，然后经分离、提取、回收得到与正烷烃基质链相同的长链二元酸。

本发明的种子培养基：

(1)12Be′糖度的麦芽汁加麦芽汁重量1.8％的琼脂制成的固体斜面；

(2)12Be′糖度的麦芽汁液体培养基

培养种子的过程为：取一接种环解脂假丝酵母CX-998菌株，涂布在麦芽汁固体斜面上(每个茄子瓶中装有20ml培养基，灭菌后放成斜面)，于28℃培养40-44小时。取一支在茄子瓶培养好的上述解脂假丝酵母CX-998菌种全部刮入装有培养基的三角瓶中，于200rpm的旋转摇床，28℃培养44-48小时，作为发酵罐种子。

用本发明解脂假丝酵母CX-998菌株发酵转化生产长链二元酸，特别是十一碳二羧酸的具体方法是：把培养好并生长旺盛、无杂菌的发酵罐种子液接入pH6.0-7.2的含20-25％(v/v)的C₁₀～C₁₈正烷烃和80-75％(v/v)的发酵培养基的混合液中；所述种子液的接种量优选为(v/v)：18-24％；所述发酵培养基的组成为：NaAC 8-15g/L，优选为10-12g/L，KH₂PO₄ 4-14g/L，优选为8-10g/L，NaCl 1.0-1.5g/L，优选为1.0-1.2g/L，尿素1.0-2.5g/L，优选为1.2-1.5g/L，蔗糖10-20g/L，优选为12-16g/L，维生素C 0.5-1.5g/L，优选为1.0-1.2g/L，及一些公知的营养源。在pH7.0-8.2下，将混合液在26-32℃，优选在27-30℃，通风发酵转化70-160小时。在0-48小时，pH控制在7.0-7.5；在48-120小时，pH控制在7.5-7.8；在120小时以后，pH控制在7.8-8.2。

发酵结束后进行破乳，用过滤膜分离除去菌体和残烃，清液用活性炭脱色，脱色液用H₂SO₄或HCl酸化结晶，压滤、洗涤、吹干、烘干得白色DC₁₀～DC₁₈。

本发明的有益效果是：用本发明的解脂假丝酵母CX-998菌株和发酵转化方法，可生产C₁₀～C₁₈的各种单一和混合二元酸，其中在10立升发酵罐，从nC₁₁发酵转化生产DC₁₁时，144小时DC₁₁产量高达165g/L，后处理收率88％，当nC₁₁纯度＞99％时，DC₁₁纯度达到99％。

具体实施方式

实施例1

(1)取一接种环解脂假丝酵母CX-998菌株，涂布在￠15×180大试管麦芽汁固体斜面上28℃培养44小时；取上述培养好的菌种1支，接入装有300ml麦芽汁(12Be′糖度)种子培养基的500ml三角瓶中，于28℃在200rpm的旋转摇床上培养2天。

(2)在装有18ml含C₁₁正烷烃和发酵培养基的混合液的500ml三角瓶中，接入4ml上述种液，在200rpm的旋转摇床上发酵4天，每24小时用NaOH溶液调一次pH至7.5。所述含C₁₁正烷烃和发酵培养基的混合液的成分为：nC₁₁200ml/L(纯度＞99％)，NaAC 12g/L，KH₂PO₄9g/L，NaCl 1.1g/L，酵母膏3g/L，玉米浆2.5g/L，尿素1.2g/L，蔗糖13g/L，维生素C lg/L，维生素B20.02g/L，自来水配制，pH7.2，110℃灭菌30分钟。发酵结束后用HCl调pH至3。用乙醚提取两次，除去乙醚，得二元酸结晶，用NaOH滴定，计算二元酸产量。结果DC₁₁产量为75g/L，DC₁₁纯度为99.2％。

实施例2

正烷烃采用nC₁₃(纯度为99.0％)，其余步骤同实施例1，结果DC₁₃产量为65.4g/L，DC₁₃纯度为98.5％。

实施例3

正烷烃采用nC₁₅(纯度为98.5％)，其余步骤同实施例1，结果DC₁₅产量为54g/L，DC₁₅纯度为98.3％。

实施例4

正烷烃采用nC₁₈(纯度为97.0％)，其余步骤同实施例1，结果DC₁₈产量为44g/L，DC₁₈纯度为96.5％。

实施例5

(1)同实施例1步骤(1)。

(2)含C₁₁正烷烃和发酵培养基的混合液：nC₁₁200ml/L(纯度＞99％)；NaAC12g/L，KH₂PO₄9g/L，NaCl 1.1g/L，酵母膏3g/L，玉米浆2.5g/L，尿素1.2g/L，蔗糖13g/L，维生素C 1g/L，维生素B20.02g/L；自来水配制，pH7.2，110℃灭菌30分钟。

将1300ml培养2天，OD为1.0，pH4.2，健壮，无杂菌的种子液接入装有5.5L含C11正烷烃和发酵培养基的混合液中，经121℃灭菌30分钟的10L发酵罐中，28±0.5℃，650rpm，罐压0.8kg/cm²，通气量1∶1，在0-48小时，pH控制在7.0-7.5；在48-120小时，pH控制在7.5-7.8；在120小时以后，pH控制在7.8-8.2。发酵144小时，产酸量达到165g/L。发酵结束后，进行破乳，通过膜分离，除去菌体和残烃，清液用活性炭脱色，脱色清液用H₂SO₄酸化结晶，压滤、洗涤，吹干，烘干，得到白色DC₁₁产品，后处理收率为88.0％，DC₁₁纯度为99.1％。

实施例6

(1)取一接种环解脂假丝酵母CX-998菌株，涂布在￠15×180大试管麦芽汁固体斜面上28℃培养42小时；取上述培养好的菌种1支，接入装有300ml麦芽汁(12Be′糖度)种子培养基的500ml三角瓶中，于28℃在200rpm的旋转摇床上培养44小时。

(2)含C13正烷烃和发酵培养基的混合液：nC₁₃200ml/L(纯度99％)；NaAC11g/L，KH₂PO₄8g/L，NaCl 1.2g/L，酵母膏3g/L，玉米浆2.5g/L，尿素1.5g/L，蔗糖12g/L，维生素C 0.8g/L，维生素B20.02g/L，自来水配制，pH7.2，110℃灭菌30分钟。

将1300ml培养44小时，OD为1.0，pH4.2，健壮，无杂菌的种子液接入装有5.5L含C₁₃正烷烃和发酵培养基的混合液，经121℃灭菌30分钟的10L发酵罐中，27.5±0.5℃，650rpm，罐压0.8kg/cm²，通气量1∶1，在0-48小时，pH控制在7.0-7.5；在48-120小时，pH控制在7.5-7.8；在120小时以后，pH控制在7.8-8.2。发酵150小时，产酸量达到140g/L。发酵结束后，进行破乳，通过膜分离，除去菌体和残烃，清液用活性炭脱色，脱色清液用H₂SO₄酸化结晶，压滤、洗涤，吹干，烘干，得到白色DC₁₁产品，DC₁₁纯度为98.2％。

实施例7

(1)取一接种环解脂假丝酵母CX-998菌株，涂布在￠15×180大试管麦芽汁固体斜面上28℃培养43小时；取上述培养好的菌种1支，接入装有300ml麦芽汁(12Be′糖度)种子培养基的500ml三角瓶中，于28℃在200rpm的旋转摇床上培养46小时。

(2)含C₁₅正烷烃和发酵培养基的混合液：nC₁₅200ml/L(纯度99％)；NaAC10g/L，KH₂PO₄8g/L，NaCl 1.3g/L，酵母膏3g/L，玉米浆2.5g/L，尿素1.2g/L，蔗糖15g/L，维生素C 1.2g/L，维生素B20.02g/L；自来水配制，pH7.2，110℃灭菌30分钟。

将1300ml培养46小时，OD为1.0，pH4.2，健壮，无杂菌的种子液接入装有5.5L含C15正烷烃和发酵培养基的混合液，经121℃灭菌30分钟的10L发酵罐中，28.5±0.5℃，650rpm，罐压0.8kg/cm²，通气量1∶1，在0-48小时，pH控制在7.0-7.5；在48-120小时，pH控制在7.5-7.8；在120小时以后，pH控制在7.8-8.2。发酵140小时，产酸量达到118g/L。发酵结束后，进行破乳，通过膜分离，除去菌体和残烃，清液用活性炭脱色，脱色清液用H₂SO₄酸化结晶，压滤、洗涤，吹干，烘干，得到白色DC₁₁产品，DC₁₁纯度为98.0％。

Claims

1.一种解脂假丝酵母（Candida lipolytica）菌株CX-998，其特征在于，所述菌株的保藏号为CCTCC NO：M2011094。

2.用权利要求1所述菌株制备长链二元酸的方法，其特征是，在以C₁₀~C₁₈的正烷烃为基质的培养基中，用权利要求1所述菌株发酵，然后经分离、提取、回收得到与正烷烃基质链相同的长链二元酸。

3.如权利要求2所述的制备长链二元酸的方法，其特征是，

（1）取权利要求1所述菌株，涂布在麦芽汁固体斜面上，于28℃培养40-44小时；将培养好的菌种刮入装有培养基的三角瓶中，于200rpm的旋转摇床，28℃培养44-48小时，作为发酵罐种子液；所述麦芽汁固体斜面为：12 Brix糖度的麦芽汁加麦芽汁重量1.8%的琼脂制成的固体斜面；所述培养基为：12 Brix糖度的麦芽汁液体培养基；

（2）将步骤（1）培养好的发酵罐种子液接入pH6.0-7.2的含20-25%（v/v）的C₁₀~C₁₈正烷烃和80-75%（v/v）的发酵培养基的混合液中；在pH7.0-8.2下，将混合液在26-32℃，通风发酵转化70-160小时；所述发酵培养基的主要组成成份为：NaAC 8-15g/L，KH₂PO₄ 4-14g/L，NaCl 1.0-1.5g/L，尿素1.0-2.5g/L，蔗糖10-20g/L，维生素C 0.5-1.5g/L；

（3）发酵结束后进行破乳，用过滤膜分离除去菌体和残烃，清液用活性炭脱色，脱色液用H₂SO₄或HCl酸化结晶，压滤、洗涤、吹干、烘干得到产物长链二元酸。

4.如权利要求3所述的制备长链二元酸的方法，其特征是，所述步骤（2）的发酵条件是：在0-48小时，pH控制在7.0-7.5；在48-120小时，pH控制在7.5-7.8；在120小时以后，pH控制在7.8-8.2。

5.如权利要求3所述的制备长链二元酸的方法，其特征是，所述种子液的接种量为18-24%。

6.如权利要求3所述的制备长链二元酸的方法，其特征是，所述发酵培养基的主要组成成份为：NaAC 10-12g/L，KH₂PO₄ 8-10g/L，NaCl 1.0-1.2g/L，尿素1.2-1.5g/L，蔗糖12-16g/L，维生素C 1.0-1.2g/L。

7.如权利要求6所述的制备长链二元酸的方法，其特征是，所述发酵培养基的组成为：NaAC 12g/L，KH₂PO₄ 9g/L，NaCl 1.1g/L，酵母膏3g/L，玉米浆2.5g/L，尿素1.2 g/L，蔗糖13g/L，维生素C 1g/L，维生素B2 0.02g/L。

8.如权利要求2-7中任意一项所述的制备长链二元酸的方法，其特征是，所述长链二元酸为十一碳二元酸。