CN111593079B - 一种提高长链二元酸发酵转化率的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种提高长链二元酸发酵转化率的方法，所述方法为在发酵过程中添加β‑氧化抑制剂。通过在发酵培养过程中添加β‑氧化抑制剂，能够有效抑制菌体的β‑氧化反应过程。本发明所述β‑氧化抑制剂的添加对菌体的生长无明显的抑制作用，且能够降低长链二元酸发酵的底物降解，提高底物的转化率。本发明提供的发酵生产方法，原料廉价，工艺简单易行，且能够显著提高长链二元酸的转化率，降低其发酵生产成本，能够在实践上用于长链二元酸的发酵生产。

Description

一种提高长链二元酸发酵转化率的方法

技术领域

本发明涉及生物技术和发酵工程领域，具体涉及一种提高长链二元酸发酵转化率的方法。

背景技术

长链二元酸(HOOC-(CH₂)n-COOH，n＝7～16，缩略DC9～DC18)有着非常广泛的用途，以长链二元酸为原料可以合成特种尼龙、高级香料、高档热熔胶、耐寒增塑剂、高级润滑油、高级防锈剂、高级油漆和涂料等。长链二元酸通常可以采用化学法或生物法合成。化学法合成路线长，反应需要高温高压，对催化剂要求比较苛刻，因此利用化学法生产的在工业规模上的长链二元酸品种较少，只有十二碳长链二元酸等少数品种。

生物法合成长链二元酸是以长链烷烃或其类似物为底物通过微生物转化得到，利用微生物双末端氧化的特殊功能发酵正构烷烃可以制取长链二元酸。由微生物氧化烷烃生成长链二元酸的机理研究可知，其主反应为α，ω-氧化反应，发生在微粒体和细胞基质，催化正构烷烃的双末端氧化，得到主产物长链二元酸；副反应为β-氧化，其反应步骤为：首先长链脂肪酸经过肉毒碱脂酰转移酶系统催化生成脂酰肉毒碱并转运进入线粒体内部，然后进行β-氧化催化脂肪酸的碳骨架逐步降解为乙酰CoA，并经过TCA循环氧化最终降解成CO₂和H₂O，为细胞生长和转化提供能量。β-氧化可以为微生物生长和底物转化提供能量，维持微生物细胞的代谢活力，β-氧化促进脂肪酸(烷烃催化生成长链脂肪酸的中间产物)的降解，导致底物烷烃生成长链二元酸的转化率降低。而烷烃的转化率对于二元酸的生产成本是至关重要的，因此，有效抑制β-氧化过程，对于提高烷烃的转化率具有重要作用。

目前，现有技术多采用β-氧化抑制剂调控β-氧化反应，中国专利CN102808004A公开了一种提高长链二元酸发酵产率的方法。该方法通过在发酵过程中添加α-氧化脱羧或β-氧化抑制剂来提高发酵转化率，使用的抑制剂为如盐酸氯丙嗪、卤代脂肪酸等试剂，此类试剂价格昂贵，同时增加了二元酸的提取精制工艺的难度和成本，且转化率最高只提高到89％(w/w)。王丽菊等在发酵生产十五碳二元酸的过程中添加丙烯酸作为β-氧化的抑制剂，发现24h添加0.1％丙烯酸,产酸水平最高,比不加丙烯酸提高16％(见《生物技术》2008年18(4)：76-78)。

然而，现有β-氧化抑制剂或价格昂贵(如盐酸氯丙嗪、卤代脂肪酸、甲基脂肪酸)，极大地增加了长链脂肪酸的生产成本，或对菌株生长影响较大(如丙烯酸)，不适于发酵过程的控制，或抑制作用有限，对于长链二元酸发酵产率的提升作用十分有限。因此，亟需开发廉价且对细胞毒性较小的高效β-氧化抑制剂，调控β-氧化，进而提高长链二元酸的转化率。

发明内容

为解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种提高长链二元酸发酵转化率的方法，在发酵生产长链二元酸的过程中添加β-氧化抑制剂，所述β-氧化抑制剂包括丙二酸、丙二酸盐或丙二酸酯，碳原子数为4-9的二元酸或一元酸，乙酸或乙醇中的任意一种或几种的组合。

本发明提供丙二酸、丙二酸盐或丙二酸酯，碳原子数为4-9的二元酸或一元酸，乙酸或乙醇在长链二元酸的发酵生产过程中的应用，所述丙二酸、丙二酸盐或丙二酸酯，碳原子数为4-9的二元酸或一元酸，乙酸或乙醇作为长链二元酸的发酵生产过程中β-氧化抑制剂。

所述丙二酸盐选自丙二酸钠盐、丙二酸钾盐、丙二酸钙盐中的一种或多种的组合；所述丙二酸酯选自丙二酸甲酯、丙二酸乙酯中的一种或两种的组合；所述碳原子数为4-9的二元酸选自丁二酸、戊二酸、己二酸、庚二酸、辛二酸或壬二酸中的一种或多种的组合；所述碳原子数为4-9的一元酸选自丁酸、戊酸、己酸、庚酸、辛酸或壬酸中的一种或多种的组合。

长链二元酸的发酵生产通常以长链烷烃或长链脂肪酸及其衍生物为底物，然而这些底物或其中间代谢物进入菌体细胞后不可避免地会被为细胞提供能量的β-氧化过程降解，从而降低了底物向长链二元酸的转化率。现有技术中的β-氧化抑制剂主要包括：作为底物结构类似物、与底物竞争性抑制β-氧化相关酶的脂肪酸类似物(如卤代脂肪酸)；作为β-氧化第一步反应酰基-CoA氧化酶的反竞争抑制剂丙烯酸等。然而这些β-氧化的抑制剂或原料成本高、或抑制菌体生长、或抑制效率较低，对于长链二元酸发酵底物转化率的促进作用有限。发明人长期致力于长链二元酸的发酵生产研究，进行了大量的β-氧化抑制剂筛选研究，发现丙二酸、丙二酸盐或丙二酸酯，碳原子数为4-9的二元酸或一元酸，乙酸或乙醇能够高效抑制β-氧化过程，有效削弱底物长链烷烃等的降解作用，提高长链二元酸的发酵转化率。

在发酵生产长链二元酸的过程中，乙醇作为代谢的中间体，在细胞内通过乙醇脱氢酶ADH、乙醛脱氢酶AldDH，可以转化为乙酰CoA，进入TCA循环，产生能量用于生物转化和细胞维持。碳原子数为4-9的二元酸或一元酸、乙酸与乙醇类似，作为代谢的中间体在细胞内可以产生能量用于生物转化和细胞维持。发明人发现碳原子数为4-9的二元酸或一元酸、乙醇或乙酸来源的乙酰CoA能够抑制底物烷烃的β-氧化，降低烷烃β-氧化的通量，提高烷烃α-氧化的通量，并最终提高发酵底物转化为长链二元酸的转化率。此外，碳原子数为4-9的二元酸或一元酸、乙醇或乙酸的添加对于菌体生长和正常生理代谢的影响较小，不会因其添加对菌体正常生长造成影响或导致菌体的发酵活力降低，而且具有来源广泛，成本便宜的特点，便于工业化规模应用。

在微生物代谢调控研究中，丙二酸的主要用途是作为TCA循环中琥珀酰脱氢酶的抑制剂，对于β-氧化过程并无直接的调控作用。然而发明人发现丙二酸进入细胞后大部分会被丙二酰-CoA合成酶催化生成丙二酰CoA。丙二酰CoA是肉毒碱脂酰转移酶的抑制因子，能够非竞争性地抑制肉毒碱脂酰转移酶的活性，进而有效抑制长链烷烃和脂肪酸底物的降解，同时，丙二酸的添加对于菌体生长和正常生理代谢的影响较小，不会因其添加对菌体正常生长造成影响或导致菌体的发酵活力降低。添加丙二酸盐或丙二酸酯也可以获得类似的结果。

进一步地，发明人发现在一定浓度范围内添加上述β-氧化抑制剂对于长链二元酸的发酵的促进作用更好。

优选地，按相对于初始发酵体积的质量百分比计，所述β-氧化抑制剂的添加总量为至终浓度0.1％～15％，进而优选为0.1％～10％。

更进一步地，所述β-氧化抑制剂的添加可以为一次添加或多批次添加，优选为多次添加。

具体地，所述β-氧化抑制剂的添加为在发酵起始0～40h一次添加或在发酵起始至结束，间隔10～40h分别进行2～10批次的添加，各批次添加的浓度为至终浓度0.1％～3％。

由于β-氧化抑制剂添加的作用主要是抑制β-氧化过程，从而降低底物的降解，因此，在菌体生长进入对数期，开始进入大量底物转化阶段添加β-氧化抑制剂的作用和控制工艺更优。

在本发明一些优选的实施方式中，所述β-氧化抑制剂的添加为在发酵进入菌体生长的对数期一次添加或在发酵进入菌体生长的对数期后至发酵结束，间隔10～40h，分别进行2～10批次的添加，各批次添加的浓度为至终浓度0.1％～3％。

在本发明一些优选的实施方式中，在发酵进入菌体生长的对数期后至发酵结束，间隔10～40h，分别进行2～10批次的添加β-氧化抑制剂，各批次添加的浓度为至终浓度0.5％～3％，所述β-氧化抑制剂的添加总量为至终浓度为1％～10％。

在本发明一些优选的实施方式中，所述β-氧化抑制剂的添加为在发酵液的菌体光密度(OD₆₂₀)大于0.5(稀释30倍)之后一次添加，或者菌体光密度(OD₆₂₀)大于0.5(稀释30倍)之后至发酵结束，间隔10～40h，分别进行2～10批次的添加，各批次添加的浓度为至终浓度0.1％～3％。

本发明提供的长链二元酸的发酵生产方法为以碳链长度为C9～C18的正构烷烃、直链脂肪酸、直链脂肪酸酯或直链脂肪酸盐中的一种或多种为发酵底物，通过微生物发酵生产长链二元酸，所述长链二元酸为C9～C18直链二元酸中的一种或多种。

优选地，所述发酵的底物为C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17和C18的正构烷烃、直链饱和脂肪酸、直链饱和脂肪酸酯和直链饱和脂肪酸盐中的一种或多种。所述长链二元酸为C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17和C18的直链饱和二元酸中的一种或多种。

本领域技术人员应该理解，不同碳链长度的烷烃或脂肪酸衍生物会经发酵转化生成相应碳链长度的二元酸，然而对于本发明提供的通过添加β-氧化抑制剂抑制β-氧化提高长链二元酸的发酵转化率的方法中，碳链长度的选择对于本发明提供发酵方法中长链二元酸的发酵产率的提高不会造成显著的影响。

本发明发酵生产长链二元酸的微生物为酵母，优选为假丝酵母，更优选为热带假丝酵母(Candida Tropicalis)或清酒假丝酵母(Candida sake)。

其中，热带假丝酵母(Candida Tropicalis)包括但不限于保藏号为CCTCCM203052的热带假丝酵母(Candida Tropicalis)、热带假丝酵母(Candida Tropicalis)CATN145(保藏号为CCTCC M 2011192)、热带假丝酵母菌(Candida Tropicalis)CAT H1614(保藏号为CCTCC M 2015303)。

清酒假丝酵母包括但不限于清酒假丝酵母(Candida sake)CATH4013(保藏号为CCTCC M2011486)、清酒假丝酵母(Candida sake)CATH4014(保藏号为CCTCC M2011487)、清酒假丝酵母(Candida sake)CATH4012(保藏号为CCTCC M2011485)、清酒假丝酵母(Candidasake)CATH4016(保藏号为CCTCC M2011488)、清酒假丝酵母(Candida sake)CATH430(保藏号为CCTCC M2011489)。

具体地，本发明提供的长链二元酸的发酵生产方法包括如下步骤：

(1)种子培养：将假丝酵母接种于种子培养基中培养至种子成熟。

(2)发酵培养：将步骤(1)获得的种子液转接至发酵培养基中，当发酵进入菌体生长的对数期一次添加或在发酵进入菌体生长的对数期后至发酵结束，间隔10～20h，分2～10批次分别添加上述β-氧化抑制剂至其终浓度为0.1％～10％(w/v)，直至发酵结束。

优选地，上述步骤(2)的发酵培养中，当发酵进入菌体生长的对数期或在菌体光密度(OD₆₂₀)大于0.5(稀释30倍)之后，间隔10～20h，分批次分别添加发酵底物，控制发酵液中所述发酵底物浓度为0.1％～10％(v/v，相对发酵液体积)，进而优选为1％～5％(v/v)，直至发酵结束。所述底物浓度指发酵底物在发酵液中的体积浓度，可通过气质联用进行检测。

优选地，上述步骤(2)的发酵培养中，发酵起始添加1％～10％(v/v，相对发酵起始体积)的发酵底物。

优选地，上述步骤(2)的发酵培养中，发酵温度为28～32℃，菌体生长阶段控制pH为3.5～6.5，在菌体光密度(OD₆₂₀)大于0.5(稀释30倍)之后的发酵中后期控制pH为5.0～8.5。

优选地，上述步骤(1)所述种子培养基包含如下成分：蔗糖10～30g/L、玉米浆1.5～10g/L、酵母膏2～15g/L、磷酸二氢钾4～15g/L、尿素0.5～5g/L。

优选地，上述步骤(2)所述发酵培养基包含如下成分：葡萄糖10～50g/L、硫酸铵0.2～6g/L、硝酸钾0.2～6g/L、磷酸二氢钾0.2～6g/L、氯化钠0.5～3g/L、柠檬酸0.1～0.5g/L、氯化钙0.1～0.5g/L。

更优选地，本发明提供的长链二元酸发酵生产方法包括如下步骤：

(1)种子培养：

取热带假丝酵母的甘油管菌种接种于装有YPD培养基的种子瓶中，在温度28～32℃，摇床转速200～250rpm的条件下，培养24-48h；

取种子瓶种子接入装有种子培养基的种子罐中，接种量为10％～30％(v/v)，接种后体系的起始pH值为6.0～6.8，控制温度28～32℃，通风比0.3～0.7vvm，罐压0.05～0.14MPa，保持一定的搅拌速度，以控制种子培养过程的溶解氧在10％以上，培养15～30h，培养成熟种子的标准为种子培养液的OD₆₂₀为15～30(稀释30倍时OD₆₂₀为0.5～1.0)。

(2)发酵培养：

将步骤(1)获得的种子液接种到装有发酵培养基的发酵罐中，接种后发酵起始体积为4～6L，接种量相对发酵起始体积10％～30％(v/v)。

发酵过程控制温度28～32℃，通风比为0.3～0.7vvm，罐压为0.05～0.14MPa，所述罐压为表压，保持一定的搅拌速度以控制溶氧在10％以上。补加10％～40％(w/v)的NaOH溶液控制发酵液的pH值：发酵前期菌体生长时控制pH为3.5～6.5，随着微生物的生长，发酵液的pH逐步下降，控制pH在3.0以上，并控制发酵中后期的pH为5.0～8.5。待菌体光密度(OD620)大于0.5(稀释30倍)时或在发酵10～20h时开始，间隔10～40h分批次添加发酵底物，控制发酵液中发酵底物含量为1％～10％，直至发酵结束，发酵底物总添加量为1～2L。发酵10～20h时开始，一次添加或间隔10～40h分别进行2～10批次添加β-氧化抑制剂，每次添加β-氧化抑制剂至终浓度0.1％～10％(w/v)，直至发酵结束，总发酵时间100～180h。

本发明的有益效果在于：

(1)本发明提供的长链二元酸发酵生产方法，通过添加丙二酸、丙二酸盐或丙二酸酯，碳原子数为4-9的二元酸或一元酸，乙酸或乙醇作为β-氧化抑制剂，能够显著提高长链二元酸的发酵底物转化率。

(2)本发明提供的长链二元酸发酵生产方法，β-氧化抑制剂的添加对于菌体的生长抑制作用较小，不会造成菌体的发酵活力降低。

(3)本发明提供的长链二元酸发酵生产方法，添加的β-氧化抑制剂的价格低廉，有效降低了发酵生产成本；且发酵工艺简单易行，易于发酵过程控制。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例和对比例的实验结果均为至少三次平行重复实验的平均值。

以下实施例如无特殊说明，热带假丝酵母发酵生产长链二元酸的方法如下，其中，β-氧化抑制剂的添加量均为相对于初始发酵培养体系体积的质量体积比(w/v)。

以下实施例中如无特殊说明，使用的培养基的配制方法为常规方法。所述培养基中使用的酵母膏总氮含量为6.5wt％，所用玉米浆的总氮含量为2.5wt％。发酵培养时使用10％(w/v)的NaOH溶液调整发酵液的pH值。

以下实施例中使用的YPD培养基的配方如下：葡萄糖2.0％(w/v)、酵母膏1.0％(w/v)、蛋白胨2.0％(w/v)、琼脂2.0％(w/v)，余量为水。

以下实施例中使用的种子培养基的配方如下：蔗糖20g/L、玉米浆3g/L、酵母膏5g/L、磷酸二氢钾10g/L、尿素2g/L。

以下实施例中使用的发酵培养基的配方如下：葡萄糖30g/L、硝酸钾2g/L、硫酸铵1.5g/L、磷酸二氢钾3g/L、氯化钠2g/L、柠檬酸0.2g/L、氯化钙0.2g/L。

以下实施例中使用的发酵底物为长链烷烃，具体包括：正十烷、正十一烷、正十二烷或正十六烷。

1、种子培养：将热带假丝酵母(Candida tropicalis)菌株CATN145的甘油管菌种接种于装有YPD培养基的种子瓶中，控制温度28℃，摇床转速200rpm，培养24h；取获得的种子液接入装有种子培养基的种子罐中，接种量为10％(v/v)，接种后体系的起始pH值为6.0，控制温度28℃，通风比0.3vvm，罐压0.05MPa，保持一定的搅拌速度，控制种子培养过程的溶解氧DO在10％以上，培养15h。培养成熟种子的标准为稀释30倍后OD₆₂₀为0.5。

所述热带假丝酵母(Candida tropicalis)菌株CATN145于2011年6月9日进行生物保藏，保藏单位：中国典型培养物保藏中心(地址：中国.武汉.武汉大学，邮编：430072)，保藏编号：CCTCC M 2011192。

2、发酵培养：

(1)当发酵底物为正十烷，将在种子罐培养所得的种子液接种到含有发酵培养基的发酵罐中，接种后起始体积为4L，接种量10％(v/v，相对发酵起始体积)。发酵起始添加1％(v/v，相对发酵起始体积)的正十烷，发酵过程控制温度29℃，通风比约为0.3vvm，罐压(表压)约为0.14MPa，保持一定的搅拌速度以控制溶氧不低于10％。控制pH在3.0以上，待菌体光密度(OD₆₂₀)大于0.5(稀释30倍)时，调整发酵液的pH为5.5。发酵10h后，开始间隔10h分批次加入正十烷，总添加量1.2L，控制发酵液中正十烷含量在1％～3％(v/v，相对发酵液体积)，发酵至135h结束。

(2)当发酵底物为正十一烷，将在种子罐培养所得的种子液接种到含有发酵培养基的发酵罐中，接种后起始体积为4L，接种量10％(v/v，相对发酵起始体积)。发酵起始添加1％(v/v，相对发酵起始体积)的正十烷，发酵过程控制温度28℃，通风比约为0.3vvm，罐压(表压)约为0.05MPa，保持一定的搅拌速度以控制溶氧不低于10％。控制pH在3.0以上，待菌体光密度(OD₆₂₀)大于0.5(稀释30倍)时，调整发酵液的pH为5.5。发酵10h后，开始间隔10h分批次加入正十一烷，总添加量1.2L，控制发酵液中正十一烷含量在2％～5％(v/v，相对发酵液体积)，发酵至143h结束。

(3)当发酵底物为正十二烷，将在种子罐培养所得的种子液接种到含有发酵培养基的发酵罐中，接种后起始体积为5L，接种量10％(v/v，相对发酵起始体积)。发酵起始添加1％(v/v，相对发酵起始体积)的正十二烷，发酵过程控制温度28℃，通风比约为0.3vvm，罐压(表压)约为0.05MPa，保持一定的搅拌速度以控制溶氧不低于10％。控制pH在3.0以上，待菌体光密度(OD₆₂₀)大于0.5(稀释30倍)时，调整发酵液的pH为6.0。发酵10h后，开始间隔10h分批次加入正十二烷，总添加量1.3L，并控制发酵液中正十二烷含量在2％～5％(v/v，相对发酵液体积)，发酵至140h结束。

(4)当发酵底物为正十六烷，将在种子罐培养所得的种子液接种到含有发酵培养基的发酵罐中，接种后起始体积为6L，接种量30％(v/v，相对发酵起始体积)。发酵起始添加6％(v/v，相对发酵起始体积)的正十六烷，发酵过程控制温度30℃，通风比约为0.4vvm，罐压(表压)约为0.1MPa，保持一定的搅拌速度以控制溶氧不低于10％。控制pH在3.0以上，待菌体光密度(OD₆₂₀)大于0.5(稀释30倍)时，调整发酵液的pH为7.5。发酵10h后，开始间隔10h分批次加入正十六烷，总添加量1.5L，并控制发酵液中正十六烷含量在2％～5％(v/v，相对发酵液体积)，发酵至145h结束。

3、如下实施例及对比例中发酵液中的长链二元酸浓度测定：

采用中国专利ZL 95117436.3公开的测定方法。具体为，用盐酸溶液调节发酵液的pH到3.0，然后加100mL乙醚用于萃取发酵液中的二元酸，蒸发去除乙醚，得到二元酸粉末；将得到的二元酸粉末溶解在乙醇中，并用0.1mol/L的NaOH溶液滴定，最终得到发酵液中的二元酸滴定量。所述转化率为重量转化率(w/w)，即发酵底物烷烃转换为长链二元酸的重量百分比。

实施例1-实施例6

当发酵底物为正十二烷，在上述发酵培养阶段，发酵20h时添加丙二酸至终浓度分别为0.1％，0.5％，1％，2％，5％，10％。

实施例7

当发酵底物为正十二烷，在上述发酵培养阶段，发酵20h、40h、60h、80h时分别添加丙二酸至终浓度为1％。

实施例8

当发酵底物为正十二烷，在上述发酵培养阶段，发酵20h、40h、60h、80h时分别添加丙二酸至终浓度为2％。

实施例9

当发酵底物为正十二烷，在上述发酵培养阶段，发酵10h、20h、30h、40h、50h、60h、70h、80h、90h时分别添加丙二酸至终浓度为0.5％。

实施例10

当发酵底物为正十二烷，在上述发酵培养阶段，发酵10h、20h、30h、40h、50h、60h、70h、80h、90h时分别添加丙二酸至终浓度为1％。

实施例11

当发酵底物为正十二烷，在上述发酵培养阶段，发酵20h添加乙醇至终浓度为2.5％。

实施例12

当发酵底物为正十二烷，在上述发酵培养阶段，发酵20h、40h、60h、80h时分别添加乙酸至终浓度为2％。

实施例13

当发酵底物为正十二烷，在上述发酵培养阶段，发酵20h、40h、60h、80h时分别添加己二酸至终浓度为1.5％。

对比例1

当发酵底物为正十二烷，在上述发酵培养阶段，发酵过程不添加任何β-氧化抑制剂。

对比例2

当发酵底物为正十二烷，在上述发酵培养阶段，发酵20h时添加丙烯酸至终浓度为0.1％。

对比例3

当发酵底物为正十二烷，在上述发酵培养阶段，发酵20h时添加乙酸钠至终浓度为0.5％。

对比例4

当发酵底物为正十二烷，在上述发酵培养阶段，发酵20h时添加2-溴代辛烷酸至终浓度为0.5mmol/L。

对比例5

当发酵底物为正十二烷，在上述发酵培养阶段，发酵20h、40h、60h、80h时分别添加丙烯酸至终浓度为0.1％。

实施例14

当发酵底物为正十烷，在上述发酵培养阶段，发酵10h、30h、50h、70h、90h时分别添加乙醇至终浓度为1.5％。

实施例15

当发酵底物为正十烷，在上述发酵培养阶段，发酵20h、40h、60h、80h时分别添加壬二酸至终浓度为2％。

对比例6

当发酵底物为正十烷，在上述发酵培养阶段，发酵过程不添加任何β-氧化抑制剂。

实施例16

当发酵底物为正十一烷，在上述发酵培养阶段，发酵20h、40h、60h、80h时分别添加乙醇至终浓度为1％。

实施例17

当发酵底物为正十一烷，在上述发酵培养阶段，发酵10h、20h、30h、40h、50h、60h、70h、80h、90h时分别添加乙酸至终浓度为1％。

对比例7

当发酵底物为正十一烷，在上述发酵培养阶段，发酵过程不添加任何β-氧化抑制剂。

实施例18

当发酵底物为正十六烷，在上述发酵培养阶段，发酵20h、40h、60h、80h时分别添加丙二酸至终浓度为2％。

实施例19

当发酵底物为正十六烷，在上述发酵培养阶段，发酵20h、40h、60h、80h时分别添加己二酸至终浓度为2％。

对比例8

当发酵底物为正十六烷，在上述发酵培养阶段，发酵过程不添加任何β-氧化抑制剂。

实验例1添加β-氧化抑制剂对菌体生长的影响

当发酵底物为正十二烷，在上述发酵培养的初始分别加入如下的β-氧化抑制剂：丙烯酸、乙酸钠、2-溴代辛烷酸、丙二酸、乙醇、乙酸、己二酸、壬二酸，各抑制剂分别设置终浓度均为0.2％和1％两个浓度梯度，经48小时的发酵培养，菌体的OD₆₂₀如表1所示，结果表明，添加丙烯酸、乙酸钠或2-溴代辛烷酸对于菌体生长均会产生显著的抑制作用，并且随着添加浓度的提高，抑制作用增强；而添加丙二酸、乙醇、乙酸、己二酸、壬二酸对于菌体生长无明显的抑制作用。

表1菌体生长情况

表1中实验数据为三次平行实验的平均值。

实施例1～13以及对比例1～5发酵生产十二碳长链二元酸实验结果：

十二碳长链二元酸的发酵产量和转化率如表2所示，结果表明，添加丙二酸、乙醇、乙酸和己二酸对于长链二元酸产量和转化率的提升具有显著的促进作用，其作用效果明显优于添加丙烯酸、乙酸钠或2-溴代辛烷酸。其中采用实施例10的分批添加方式添加丙二酸，长链二元酸的产量较未添加任何β-氧化抑制剂的对比例1的产量和转化率分别提高了23.8％和13.2％。

表2 DC12的发酵产量

表2中实验数据为三次平行发酵实验的平均值。

实施例14～15发酵生产十碳长链二元酸实验结果：

十碳长链二元酸的发酵产量和转化率如表3所示，结果表明，添加乙醇和壬二酸对于长链二元酸产量和转化率的提升相比于没有添加β-氧化抑制剂具有显著的促进作用。

表3 DC10的发酵产量

表3中实验数据为三次平行发酵实验的平均值。

实施例16～17发酵生产十一碳长链二元酸实验结果：

十一碳长链二元酸的发酵产量和转化率如表4所示，结果表明，添加乙醇或乙酸对于长链二元酸产量和转化率的提升具有显著的促进作用，其作用效果明显优于没有添加β-氧化抑制剂的对比例7。

表4 DC11的发酵产量

表4中实验数据为三次平行发酵实验的平均值。

实施例18～19发酵生产十六碳长链二元酸实验结果：

十六碳长链二元酸的发酵产量和转化率如表3所示，结果表明，添加丙二酸或己二酸对于长链二元酸产量和转化率的提升具有显著的促进作用，其作用效果明显优于没有添加β-氧化抑制剂的对比例8。

表5 DC16的发酵产量

表5中实验数据为三次平行发酵实验的平均值。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (2)

1.一种提高长链二元酸发酵转化率的方法，其特征在于，在发酵生产长链二元酸的过程中添加β-氧化抑制剂，所述β-氧化抑制剂为丙二酸；

按相对于初始发酵体积的质量百分比计，所述β-氧化抑制剂的添加总量为至终浓度0.1%~10%；

所述β-氧化抑制剂的添加为在发酵进入菌体生长的对数期后一次添加或在发酵进入菌体生长的对数期后至发酵结束，间隔10~40 h分别进行2~10批次的添加，各批次添加为至终浓度0.1%~3%；

发酵生产长链二元酸的微生物为热带假丝酵母（Candida Tropicalis），在发酵培养过程中，间隔10~20 h，分批次添加发酵底物，控制发酵液中发酵底物含量为0.1%~10%，直至发酵结束；

所述长链二元酸为C9~C18直链二元酸中的一种或多种。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在发酵进入菌体生长的对数期后至发酵结束，间隔10~20 h，分批次添加发酵底物，控制发酵液中发酵底物含量为0.1%~10%，直至发酵结束。