JPH0646949B2 - クラブラン酸の製法 - Google Patents
クラブラン酸の製法Info
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- JPH0646949B2 JPH0646949B2 JP60242586A JP24258685A JPH0646949B2 JP H0646949 B2 JPH0646949 B2 JP H0646949B2 JP 60242586 A JP60242586 A JP 60242586A JP 24258685 A JP24258685 A JP 24258685A JP H0646949 B2 JPH0646949 B2 JP H0646949B2
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D503/00—Heterocyclic compounds containing 4-oxa-1-azabicyclo [3.2.0] heptane ring systems, i.e. compounds containing a ring system of the formula:, e.g. oxapenicillins, clavulanic acid derivatives; Such ring systems being further condensed, e.g. 2,3-condensed with an oxygen-, nitrogen- or sulfur-containing hetero ring
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
- C12P17/18—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
- C12P17/188—Heterocyclic compound containing in the condensed system at least one hetero ring having nitrogen atoms and oxygen atoms as the only ring heteroatoms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は、クラブラン酸およびその医薬上許容される塩
およびエステルの製法に関する。
およびエステルの製法に関する。
発明の背景 クラブラン酸、すなわち、（２Ｒ，５Ｒ，Ｚ）−３−
（２−ヒドロキシエチリデン）−７−オキソ−４−オキ
サ−１−アザビシクロ〔３．２．０〕ヘプタン−２−カ
ルボン酸は式： で示される公知の化合物である。
（２−ヒドロキシエチリデン）−７−オキソ−４−オキ
サ−１−アザビシクロ〔３．２．０〕ヘプタン−２−カ
ルボン酸は式： で示される公知の化合物である。
この化合物、その塩およびエステルはβ−ラクタマーゼ
阻害剤として作用し、グラム陽性およびグラム陰性生物
の両方によつて産生されるβ−ラクタマーゼの作用を阻
害する。したがつて、これらは、β−ラクタム抗生物質
の不活性化を防ぐために医薬組成物に用いられる。さら
に、クラブラン酸自体が抗菌活性を有するものと考えら
れている。
阻害剤として作用し、グラム陽性およびグラム陰性生物
の両方によつて産生されるβ−ラクタマーゼの作用を阻
害する。したがつて、これらは、β−ラクタム抗生物質
の不活性化を防ぐために医薬組成物に用いられる。さら
に、クラブラン酸自体が抗菌活性を有するものと考えら
れている。
先行技術 クラブラン酸は種々の微生物株、例えば、ストレプトマ
イセス・クラブリゲルス（Streptomyces clavuligerus)
NRRL3585（米国特許第４１１０１６５号）、ストレプト
マイセス・ジユモンジネンシス（S.jumonjinensis)ＮＲ
ＲＬ５７４１（英国特許第１５６３１０３号）、ストレ
プトマイセス・カツラハマヌス（S.Katsurahamanus）Ｉ
ＦＯ１３７１６（特願昭５８−００９５７９号）および
ストレプトマイセス・エス・ピイ（Streptomyces sp.）
Ｐ６６２１ ＦＥＲＭ２８０４（特開昭５５−１６２９
９３号）のようなストレプトマイセス属に属する株から
製造されている。
イセス・クラブリゲルス（Streptomyces clavuligerus)
NRRL3585（米国特許第４１１０１６５号）、ストレプト
マイセス・ジユモンジネンシス（S.jumonjinensis)ＮＲ
ＲＬ５７４１（英国特許第１５６３１０３号）、ストレ
プトマイセス・カツラハマヌス（S.Katsurahamanus）Ｉ
ＦＯ１３７１６（特願昭５８−００９５７９号）および
ストレプトマイセス・エス・ピイ（Streptomyces sp.）
Ｐ６６２１ ＦＥＲＭ２８０４（特開昭５５−１６２９
９３号）のようなストレプトマイセス属に属する株から
製造されている。
クラブラン酸の収率を増加させるため、醗酵法において
種々の修飾が行なわれている。例えば、英国特許第１５
７１８８８号は、ｐＨを６．３〜６．７に厳密に調整す
ると収率を著しく増加できることを開示している。
種々の修飾が行なわれている。例えば、英国特許第１５
７１８８８号は、ｐＨを６．３〜６．７に厳密に調整す
ると収率を著しく増加できることを開示している。
さらに、収率を増加される試みは、しばしば、精製方法
も包含している。例えば、クラブラン酸塩は、一般に、
遊離の酸よりも安定である。したがつて、アルカリ金属
塩やアルカリ土類金属塩のような塩が抽出収率を向上さ
せるために用いられている。
も包含している。例えば、クラブラン酸塩は、一般に、
遊離の酸よりも安定である。したがつて、アルカリ金属
塩やアルカリ土類金属塩のような塩が抽出収率を向上さ
せるために用いられている。
米国特許第４１１０１６５号は、クラブラン酸およびそ
の塩の水性相と有機相の間の溶解度の差に基づく抽出を
記載している。抽出後、吸着剤中で数回精製し、したが
つて、時間および経費がかかる。
の塩の水性相と有機相の間の溶解度の差に基づく抽出を
記載している。抽出後、吸着剤中で数回精製し、したが
つて、時間および経費がかかる。
かくして、有機相からクラブラン酸を直接結晶させるこ
とが望ましい。スペイン特許第４９４４３１号におい
て、ｔ−ブチルアミンのようなアミンを添加し、つい
で、塩基交換によりカリウム塩に変えることにより、ク
ラブラン酸を有機相から直接結晶化している。
とが望ましい。スペイン特許第４９４４３１号におい
て、ｔ−ブチルアミンのようなアミンを添加し、つい
で、塩基交換によりカリウム塩に変えることにより、ク
ラブラン酸を有機相から直接結晶化している。
その低溶解度および製剤処方に許容される塩またはエス
テルに容易に変換できることから、リチウム塩もクラブ
ラン酸の調製に有用な中間体と考えられている。例え
ば、米国特許第４４９０２９４号はクラブラン酸の溶液
と、水性イオン性リチウム化合物との反応により、クラ
ブラン酸リチウム塩を得ることを開示している。英国特
許第１５４３５６３号は、過したブロスの顆粒状炭素
への吸着、イオン交換樹脂処理およびクラブラン酸リチ
ウムの結晶化を利用したクラブラン酸リチウムを得る他
の経路を開示している。
テルに容易に変換できることから、リチウム塩もクラブ
ラン酸の調製に有用な中間体と考えられている。例え
ば、米国特許第４４９０２９４号はクラブラン酸の溶液
と、水性イオン性リチウム化合物との反応により、クラ
ブラン酸リチウム塩を得ることを開示している。英国特
許第１５４３５６３号は、過したブロスの顆粒状炭素
への吸着、イオン交換樹脂処理およびクラブラン酸リチ
ウムの結晶化を利用したクラブラン酸リチウムを得る他
の経路を開示している。
醗酵ブロスを樹脂に直接吸着させた後、クラブラン酸リ
チウムをイソプロパノールから結晶させることも示唆さ
れている。そのような方法は困難で、低い収率しか与え
ない。
チウムをイソプロパノールから結晶させることも示唆さ
れている。そのような方法は困難で、低い収率しか与え
ない。
このように、従来利用できる醗酵および精製法は純度の
低いクラブラン酸を比較的低収率で製造している。
低いクラブラン酸を比較的低収率で製造している。
発明の開示 本発明の第１の態様によれば、本発明は生産微生物によ
る培地中での醗酵によるクラブラン酸の製法を提供する
もので、この方法においては、少なくとも同化炭素源の
一部を醗酵の間に添加する。
る培地中での醗酵によるクラブラン酸の製法を提供する
もので、この方法においては、少なくとも同化炭素源の
一部を醗酵の間に添加する。
特定の理論に限定するものではないが、同化炭素源を調
節して添加することは異化調節の欠如を導く。理論にか
かわりく、醗酵の間、常時、炭素レベルが比較的高くな
るのを注意しながら防止することにより、著しい改良を
達成することができる。
節して添加することは異化調節の欠如を導く。理論にか
かわりく、醗酵の間、常時、炭素レベルが比較的高くな
るのを注意しながら防止することにより、著しい改良を
達成することができる。
好ましい態様 好ましくは、同化炭素源のレベルを２％以下、さらに好
ましくは、１％以下に保持する（％は、固体同化炭素源
については重量／重量％、液体同化炭素源については容
量／容量％）。それに対応して、生産培地にバツチ式
で、または連続的に少量の同化炭素源を加える。いずれ
の同化炭素源の添加も、好ましくは、培地に対して１％
以下、さらに好ましくは、０．５％以下とする。事実、
培地中における炭素レベルは、好ましくは、０．２５％
より低く、例えば、＜０．１５％に保持する。
ましくは、１％以下に保持する（％は、固体同化炭素源
については重量／重量％、液体同化炭素源については容
量／容量％）。それに対応して、生産培地にバツチ式
で、または連続的に少量の同化炭素源を加える。いずれ
の同化炭素源の添加も、好ましくは、培地に対して１％
以下、さらに好ましくは、０．５％以下とする。事実、
培地中における炭素レベルは、好ましくは、０．２５％
より低く、例えば、＜０．１５％に保持する。
ポリオールまたは炭水化物を含め、いずれの同化炭素源
も使用でき、特に、化学的に明確は同化炭素源（すなわ
ち、化学的に公知の構造の炭素化合物）が用いられる。
明確な同化炭素源は、典型的には、分子量５００より小
さく、好適には、単糖類、二糖類または線型ポリオール
のような、分子中の炭素数１２までのものである。この
ような化合物の例には、マルトースおよびグリセロール
が包含される。本発明の他の好ましい形態においては、
同化炭素源なデキストリン、澱粉またはデキストリン化
澱粉である。さらに一般的には、同化炭素源は、通常、
水溶性または水混和性である。
も使用でき、特に、化学的に明確は同化炭素源（すなわ
ち、化学的に公知の構造の炭素化合物）が用いられる。
明確な同化炭素源は、典型的には、分子量５００より小
さく、好適には、単糖類、二糖類または線型ポリオール
のような、分子中の炭素数１２までのものである。この
ような化合物の例には、マルトースおよびグリセロール
が包含される。本発明の他の好ましい形態においては、
同化炭素源なデキストリン、澱粉またはデキストリン化
澱粉である。さらに一般的には、同化炭素源は、通常、
水溶性または水混和性である。
現在、ストレプトマイセス・クラブリゲルス、ことに、
ストレプトマイセス・クラブリゲルスＮＲＲＬ３５８５
（ＡＴＣＣ２７０６４；ＦＥＲＭ Ｐ−３００７）の使
用が好ましい。そのような微生物について、好ましい同
化炭素源には、マルトース、グリセロース、デキストリ
ンおよび、所望により、デキストリン化澱粉が包含され
る。グルコース、フルクトース、シユークロースおよび
ラクトースはストレプトマイセス・クラブリゲルスによ
つて、そんなに容易には同化されず、したがつて、その
ような微生物には、あまり好ましくない。
ストレプトマイセス・クラブリゲルスＮＲＲＬ３５８５
（ＡＴＣＣ２７０６４；ＦＥＲＭ Ｐ−３００７）の使
用が好ましい。そのような微生物について、好ましい同
化炭素源には、マルトース、グリセロース、デキストリ
ンおよび、所望により、デキストリン化澱粉が包含され
る。グルコース、フルクトース、シユークロースおよび
ラクトースはストレプトマイセス・クラブリゲルスによ
つて、そんなに容易には同化されず、したがつて、その
ような微生物には、あまり好ましくない。
同化炭素源は、好ましくは、いつでも、同化炭素源のレ
ベルが２％を超さないように制御しながら、連続的また
は間けつ的に添加できる。例えば、小量の同化炭素源を
一定量づつ計量する手段を用い、培地に連続的に添加で
きる。連続添加は、約０．０１〜０．１％時間の速度で
好適に行なえ、さらに好ましくは、約０．５〜１．５％
／日、ことに、約０．０５％／時間である。別法とし
て、添加は所定の方法に従つてバツチ式で行なうことが
できる。例えば、通常、１分〜６時間ごとの間隔で間け
つ的添加を行なうことができる。１日の合計添加量は
０．２５％〜１．５％とすることができるが、好ましい
範囲は０．５〜１．５％である。
ベルが２％を超さないように制御しながら、連続的また
は間けつ的に添加できる。例えば、小量の同化炭素源を
一定量づつ計量する手段を用い、培地に連続的に添加で
きる。連続添加は、約０．０１〜０．１％時間の速度で
好適に行なえ、さらに好ましくは、約０．５〜１．５％
／日、ことに、約０．０５％／時間である。別法とし
て、添加は所定の方法に従つてバツチ式で行なうことが
できる。例えば、通常、１分〜６時間ごとの間隔で間け
つ的添加を行なうことができる。１日の合計添加量は
０．２５％〜１．５％とすることができるが、好ましい
範囲は０．５〜１．５％である。
添加は一定のパターンに従う必要はない。例えば、０．
５または１％／日の添加を最初の６０時間にわたつて維
持し、ついで、残りの醗酵の間、各々、１または０．５
％／日とすることができる。さらに、接種時、培地中に
当初存在する同化炭素源の量は、好ましくは、０〜２
％、さらに好ましくは、０〜０．５％、もつとも好まし
くは、０〜０．０５％とすることができる。
５または１％／日の添加を最初の６０時間にわたつて維
持し、ついで、残りの醗酵の間、各々、１または０．５
％／日とすることができる。さらに、接種時、培地中に
当初存在する同化炭素源の量は、好ましくは、０〜２
％、さらに好ましくは、０〜０．５％、もつとも好まし
くは、０〜０．０５％とすることができる。
同化炭素源は無菌的な方法で連続的に、または間けつ的
に添加し、この無菌性を保証し、維持する手段を与える
ことが好ましい。さらに、同化固体炭素源は水溶液の状
態で加えることが好ましい。液体同化炭素源は直接また
は適宜希釈して加えることができる。
に添加し、この無菌性を保証し、維持する手段を与える
ことが好ましい。さらに、同化固体炭素源は水溶液の状
態で加えることが好ましい。液体同化炭素源は直接また
は適宜希釈して加えることができる。
醗酵培地は、有機窒素源を含む他の適当な培地成分を含
有することができる。このような窒素源は、油質種子、
所望により脱脂されたミール、蛋白水解物または抽出物
からなる。鉱物塩（特に、塩化物、硫酸塩、炭酸塩また
はリン酸塩）および無機または有機起源の脱泡剤も、他
の公知の培地成分と共に、適宜添加することができる。
有することができる。このような窒素源は、油質種子、
所望により脱脂されたミール、蛋白水解物または抽出物
からなる。鉱物塩（特に、塩化物、硫酸塩、炭酸塩また
はリン酸塩）および無機または有機起源の脱泡剤も、他
の公知の培地成分と共に、適宜添加することができる。
至適醗酵温度は、通常、２４〜３０℃、好ましくは、２
６〜２８℃であるが、これらの範囲より上または下でも
該醗酵が起るので、本発明では温度は特に限定するもの
ではない。典型的には、醗酵はバツチ系で１日〜複数
日、通常、２４〜２４０時間、特に、１００〜２００時
間行なわれる。
６〜２８℃であるが、これらの範囲より上または下でも
該醗酵が起るので、本発明では温度は特に限定するもの
ではない。典型的には、醗酵はバツチ系で１日〜複数
日、通常、２４〜２４０時間、特に、１００〜２００時
間行なわれる。
本発明におけるもつとも適した醗酵容器は、攪拌および
通気手段を備えた通常の好気的醗酵容器である。このよ
うな容器の容量は、例えば、１〜２２５m3の範囲で変
えることができる。運転容量は、好ましくは、総容量の
２５〜７５％である。
通気手段を備えた通常の好気的醗酵容器である。このよ
うな容器の容量は、例えば、１〜２２５m3の範囲で変
えることができる。運転容量は、好ましくは、総容量の
２５〜７５％である。
ブロスを処理するに際して、好ましくは、まず、固体を
過または遠心分離により醗酵ブロスから除去する。ま
た、ブロスをpH１〜３、好ましくは、約pH２の酸性と
し、水非混和性溶媒を加え、例えば、遠心分離により２
相に分け、クラブラン酸を水非混和相中に得ることによ
り、クラブラン酸を抽出することも好ましい。
過または遠心分離により醗酵ブロスから除去する。ま
た、ブロスをpH１〜３、好ましくは、約pH２の酸性と
し、水非混和性溶媒を加え、例えば、遠心分離により２
相に分け、クラブラン酸を水非混和相中に得ることによ
り、クラブラン酸を抽出することも好ましい。
本発明はさらに、クラブラン酸をそのリチウム塩として
得、所望により、クラブラン酸リチウムをクラブラン酸
の他の塩またはエステルに変える新規方法にも関する。
得、所望により、クラブラン酸リチウムをクラブラン酸
の他の塩またはエステルに変える新規方法にも関する。
すなわち、さらに詳しくは、本発明の第２の態様によれ
ば、 (i)溶解した純度の低いクラブラン酸と、溶解した２−
エチルヘキサン酸リチウムを混合し（好ましくは、該酸
および塩の各々は水非混和性溶媒、さらに好ましくは、
同じ溶媒に溶解してある）、 (ii)クラブラン酸リチウムを単離し、 (iii)所望により、該リチウム塩を他の塩またはエステ
ルに変える。
ば、 (i)溶解した純度の低いクラブラン酸と、溶解した２−
エチルヘキサン酸リチウムを混合し（好ましくは、該酸
および塩の各々は水非混和性溶媒、さらに好ましくは、
同じ溶媒に溶解してある）、 (ii)クラブラン酸リチウムを単離し、 (iii)所望により、該リチウム塩を他の塩またはエステ
ルに変える。
ことからなるクラブラン酸の精製法が提供される。
この方法により、向上した収率および純度が得られる。
この方法はクラブラン酸醗酵ブロスの精製に一般的に適
用できるが、ことに、本発明の第１の態様の方法によつ
て得られた抽出物を精製するために研究されたものであ
る。前記のごとく、そのような醗酵から、工程(i)で用
いるのに適したクラブラン酸の水非混和性溶媒溶液を容
易に得ることができる。
この方法はクラブラン酸醗酵ブロスの精製に一般的に適
用できるが、ことに、本発明の第１の態様の方法によつ
て得られた抽出物を精製するために研究されたものであ
る。前記のごとく、そのような醗酵から、工程(i)で用
いるのに適したクラブラン酸の水非混和性溶媒溶液を容
易に得ることができる。
好ましい有機溶媒は酢酸エチル、酢酸メチル、酢酸アミ
ル、メチルイソブチルケトンまたはｎ−ブチルアルコー
ルであり、ｎ−ブチルアルコールがもつとも好ましい。
ブロスの抽出は、好ましくは、クラブラン酸の分解によ
る損失を最小にするため、４〜１０℃の温度で行なう。
ル、メチルイソブチルケトンまたはｎ−ブチルアルコー
ルであり、ｎ−ブチルアルコールがもつとも好ましい。
ブロスの抽出は、好ましくは、クラブラン酸の分解によ
る損失を最小にするため、４〜１０℃の温度で行なう。
抽出後、公知の方法で適宜調製した２−エチルヘキサン
酸リチウム溶液の添加により、結晶化を行なうことがで
きる。好ましくは、有機溶媒中のクラブラン酸の濃度は
１０mg／ml以上である。結晶化は低温、通常、４〜１０
℃でもつとも良好に行なわれる。クラブラン酸リチウム
は１／４分子の水と共に結晶化するので、結晶化は、有
機溶媒中２〜４％のような、少量の水の存在下で行なう
ことが好ましい。過剰の２−エチルヘキサン酸リチウム
を用いることが好ましい。添加は攪拌、冷却下、ゆつく
りと行なうことができる。攪拌は、全ての２−エチルヘ
キサン酸リチウムを添加後、さらにある時間維持するこ
とが望ましい。
酸リチウム溶液の添加により、結晶化を行なうことがで
きる。好ましくは、有機溶媒中のクラブラン酸の濃度は
１０mg／ml以上である。結晶化は低温、通常、４〜１０
℃でもつとも良好に行なわれる。クラブラン酸リチウム
は１／４分子の水と共に結晶化するので、結晶化は、有
機溶媒中２〜４％のような、少量の水の存在下で行なう
ことが好ましい。過剰の２−エチルヘキサン酸リチウム
を用いることが好ましい。添加は攪拌、冷却下、ゆつく
りと行なうことができる。攪拌は、全ての２−エチルヘ
キサン酸リチウムを添加後、さらにある時間維持するこ
とが望ましい。
生成したクラブラン酸リチウムは、さらに処理すること
ができ、好ましくは、ガラス・プレートを通して過
し、イソプロパノール、アセトンおよびエタノールで洗
浄し、真空下で乾燥する。
ができ、好ましくは、ガラス・プレートを通して過
し、イソプロパノール、アセトンおよびエタノールで洗
浄し、真空下で乾燥する。
クラブラン酸リチウムは再結晶できる。再結晶は水性ク
ラブラン酸リチウムに、該リチウム塩の溶解度が非常に
低い有機溶媒、好ましくは、イソプロパノールを過剰に
加えて行なうことができる。別法として、かつ、より好
ましくは、他のリチウム塩の濃厚溶液を水性クラブラン
酸リチウムに加えて再結晶を生じさせる。適当なリチウ
ム塩には水に対する溶解度の高い有機または無機リチウ
ム塩が包含される。塩化リチウムがもつとも好ましい。
好適には、該リチウム塩溶液の濃度は５０％以上であ
り、最終濃度が２５％以上になるような充分量加える。
リチウム塩溶液の添加は、好ましくは、クラブラン酸リ
チウム溶液を攪拌しながらゆつくりと行なう。
ラブラン酸リチウムに、該リチウム塩の溶解度が非常に
低い有機溶媒、好ましくは、イソプロパノールを過剰に
加えて行なうことができる。別法として、かつ、より好
ましくは、他のリチウム塩の濃厚溶液を水性クラブラン
酸リチウムに加えて再結晶を生じさせる。適当なリチウ
ム塩には水に対する溶解度の高い有機または無機リチウ
ム塩が包含される。塩化リチウムがもつとも好ましい。
好適には、該リチウム塩溶液の濃度は５０％以上であ
り、最終濃度が２５％以上になるような充分量加える。
リチウム塩溶液の添加は、好ましくは、クラブラン酸リ
チウム溶液を攪拌しながらゆつくりと行なう。
再結晶したクラブラン酸リチウムは、さらに精製でき、
例えば、別し、アセトンで洗浄し、真空下で乾燥し、
これにより、８０％以上の収率と、８５％以上の純度が
得られる。
例えば、別し、アセトンで洗浄し、真空下で乾燥し、
これにより、８０％以上の収率と、８５％以上の純度が
得られる。
本発明によつて調製されたクラブラン酸リチウムは、所
望のカチオンの型、好ましくは、ナトリウムまたはカリ
ウム型のカチオン交換樹脂を用い、水で溶出するイオン
交換操作により、他の塩に変えることができる。さら
に、エステルは公知の方法により調製することができ
る。
望のカチオンの型、好ましくは、ナトリウムまたはカリ
ウム型のカチオン交換樹脂を用い、水で溶出するイオン
交換操作により、他の塩に変えることができる。さら
に、エステルは公知の方法により調製することができ
る。
リチウム塩形成の代りに、あるいは、しばしばそれに加
えて、本発明はさらに、より高い交換樹脂容量を可能に
するイオン交換樹脂を用いるクラブラン酸の抽出におけ
る一連の改良を提供する。適当な樹脂の例は、例えば、
英国特許第１５４３５６３号に記載されている。該樹脂
は、好ましくは、ＩＲＡ−６８型の弱塩基性イオン交換
樹脂で、好ましくは、アセテート型である。
えて、本発明はさらに、より高い交換樹脂容量を可能に
するイオン交換樹脂を用いるクラブラン酸の抽出におけ
る一連の改良を提供する。適当な樹脂の例は、例えば、
英国特許第１５４３５６３号に記載されている。該樹脂
は、好ましくは、ＩＲＡ−６８型の弱塩基性イオン交換
樹脂で、好ましくは、アセテート型である。
醗酵ブロスをイオン交換樹脂に吸着し、リチウム塩で溶
出させ、ついで、例えば、イソロパノールから結晶させ
て、クラブラン酸リチウムの良好な結晶化を行なうた
め、好適には、醗酵ブロスは８００μｇ／ml以上のクラ
ブラン酸の初期活性を有する。
出させ、ついで、例えば、イソロパノールから結晶させ
て、クラブラン酸リチウムの良好な結晶化を行なうた
め、好適には、醗酵ブロスは８００μｇ／ml以上のクラ
ブラン酸の初期活性を有する。
ブロスを樹脂に吸着させる前に清澄化を行なうことが好
ましい。
ましい。
本発明の第３の態様によれば、醗酵ブロスを凝集剤で処
理して菌糸を凝集させる。
理して菌糸を凝集させる。
菌糸の凝集は過をより良好にする。適当な凝集剤はフ
イルター・コアジユバンド、プラエストール（西独バイ
エルＡＧの商標Praestol）である。コアジユバンドは、
好ましくは０．１〜０．５％の濃度でブロスに加え、
過前に、約１５分間攪拌する。過自体は、好適には、
ブフナー斗中、ダイカライト（ダイカライト・リミテ
ツドの商標Dicalite）のような無機材（典型的には約
６％ｗ／ｖ）のベツドを通して行なう。もし、１回の
過で良好に清澄化しない場合、同じダイカライト層を通
して再過できる。ブロスはまた、過後、遠心分離
（典型的には１００００rpmで３０分間）によつても清
澄化できる。
イルター・コアジユバンド、プラエストール（西独バイ
エルＡＧの商標Praestol）である。コアジユバンドは、
好ましくは０．１〜０．５％の濃度でブロスに加え、
過前に、約１５分間攪拌する。過自体は、好適には、
ブフナー斗中、ダイカライト（ダイカライト・リミテ
ツドの商標Dicalite）のような無機材（典型的には約
６％ｗ／ｖ）のベツドを通して行なう。もし、１回の
過で良好に清澄化しない場合、同じダイカライト層を通
して再過できる。ブロスはまた、過後、遠心分離
（典型的には１００００rpmで３０分間）によつても清
澄化できる。
本発明のもう１つの改良は、過したブロスの除蛋白に
よるイオン交換樹脂の吸着能の増大である。
よるイオン交換樹脂の吸着能の増大である。
除蛋白は、好ましくは、酸性化、通常、約pH４までの酸
性化、あるいは、アセトンのような沈澱溶媒による処理
で行なう。
性化、あるいは、アセトンのような沈澱溶媒による処理
で行なう。
本発明の一具体例において、過したブロスのｐＨは、
塩酸または硫酸のような鉱酸で約４．０に調整する。pH
を調整したら、上澄液を樹脂に吸着させる。pH６におけ
るアセテート型の樹脂の吸着能はこのようにして増大さ
せる。過ブロス：樹脂（Ｖ／Ｖ）の好ましい比率は１
０：１以下である。
塩酸または硫酸のような鉱酸で約４．０に調整する。pH
を調整したら、上澄液を樹脂に吸着させる。pH６におけ
るアセテート型の樹脂の吸着能はこのようにして増大さ
せる。過ブロス：樹脂（Ｖ／Ｖ）の好ましい比率は１
０：１以下である。
過ブロスはアセトンのような沈澱溶媒で処理しても除
蛋白できる。本発明の具体例において、ブロス１容を約
１容のアセトンと混合する。好ましくは、ブロスをアセ
トンと共に５〜１０分間攪拌し、２０分間放置し、沈澱
を遠心分離または過で分離する。このように清澄化さ
れたブロスが樹脂に吸着させるのに適している。アセト
ンは、ブロス吸着前、減圧下、蒸留により回収できる。
アセトンを回収し、または回収せずして、過ブロス
は、著しい損失なしに１０：１〜１２：１の割合（過
ブロスの当初の容量：樹脂の容量）で樹脂に吸着でき
る。
蛋白できる。本発明の具体例において、ブロス１容を約
１容のアセトンと混合する。好ましくは、ブロスをアセ
トンと共に５〜１０分間攪拌し、２０分間放置し、沈澱
を遠心分離または過で分離する。このように清澄化さ
れたブロスが樹脂に吸着させるのに適している。アセト
ンは、ブロス吸着前、減圧下、蒸留により回収できる。
アセトンを回収し、または回収せずして、過ブロス
は、著しい損失なしに１０：１〜１２：１の割合（過
ブロスの当初の容量：樹脂の容量）で樹脂に吸着でき
る。
イオン交換樹脂の溶出液からのクラブラン酸リチウムの
結晶化は、従来、ガムの形成および、いくつかの場合に
は、低純度をもたらしていた。この問題を最少にするた
め、５％塩化リチウムのようなリチウム塩での溶出前
に、樹脂を０．５％塩化ナトリウム、ついで水で洗浄ま
たは予備洗浄することが好ましい。
結晶化は、従来、ガムの形成および、いくつかの場合に
は、低純度をもたらしていた。この問題を最少にするた
め、５％塩化リチウムのようなリチウム塩での溶出前
に、樹脂を０．５％塩化ナトリウム、ついで水で洗浄ま
たは予備洗浄することが好ましい。
クラブラン酸リチウムの結晶化は、アセトンでの溶出液
の処理により、さらに改良できる。樹脂からの溶出液
を、例えば、２容のアセトンと共に攪拌し、１５分間放
置する。沈澱を遠心分離し、アセトンを除去後、イソプ
ロパノールからクラブラン酸リチウムを結晶化させる。
の処理により、さらに改良できる。樹脂からの溶出液
を、例えば、２容のアセトンと共に攪拌し、１５分間放
置する。沈澱を遠心分離し、アセトンを除去後、イソプ
ロパノールからクラブラン酸リチウムを結晶化させる。
より一般的には、本発明は医薬として処方するのに適し
た形のクラブラン酸、その塩およびエステルを容易に与
えることができる。
た形のクラブラン酸、その塩およびエステルを容易に与
えることができる。
実施例 つぎに実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明する
が、これらに限定されるものではない。
が、これらに限定されるものではない。
実施例１ つぎの組成の培地を調製した。
フイツシユ・ミール ２．０ｇ グリセロール １．５ｇ 可溶性澱粉 １．５ｇ 炭酸カルシウム ０．２ｇ 蒸留水 １００mlに調製 pHを７に調整し、４０mlづつを２５０mlエルレンマイヤ
ー・フラスコに入れ、滅菌した。
ー・フラスコに入れ、滅菌した。
ついで、この培地にストレプトマイセス・クラブリゲル
スＮＲＲＬ３８５８の胞子懸濁液を接種し、攪拌下、２
８℃で２日間培養した。この培養物を、２エルレンマ
イヤー・フラスコ中、５００mlの同じ培地に２％の濃度
で接種した。ロータリー・シエーカー上、同様に２８℃
で２日間培養した。
スＮＲＲＬ３８５８の胞子懸濁液を接種し、攪拌下、２
８℃で２日間培養した。この培養物を、２エルレンマ
イヤー・フラスコ中、５００mlの同じ培地に２％の濃度
で接種した。ロータリー・シエーカー上、同様に２８℃
で２日間培養した。
得られた培養物５００mlを、攪拌、通気および温度調節
装置を付した３４０のステンレス・スチール容器に接
種した。容器には、つぎの組成の滅菌培地１００を入
れた。
装置を付した３４０のステンレス・スチール容器に接
種した。容器には、つぎの組成の滅菌培地１００を入
れた。
大豆ミール ３％ コーン・デキストリン ３％ 大豆油 ０．５％ ＫＨ2ＰＯ４ ０．１％ 脱泡剤〔ユーコン（ucon）〕 ０．００５％ 水道水 最終容量まで 接種した培地を２８℃で、攪拌下、空気を送りながら４
５時間培養した。ついで、さらに、同じ培地１５０を
用い、３４０容器中で７％の濃度で接種した。培養は
攪拌下、通気しながら２８℃で３０時間行なつた。
５時間培養した。ついで、さらに、同じ培地１５０を
用い、３４０容器中で７％の濃度で接種した。培養は
攪拌下、通気しながら２８℃で３０時間行なつた。
終了後、この培養物を、タンクに入れたクラブラン酸生
産培地に７％の濃度で接種した。タンクは総容量８００
で、４２５のつぎの培地を入れた。
産培地に７％の濃度で接種した。タンクは総容量８００
で、４２５のつぎの培地を入れた。
大豆ミール １．２５％ 落花生ミール １．２５％ デイステイラーズ乾燥グレイン ０．５％ ＫＨ2ＰＯ４ ０．１％ 脱泡剤（ユーコン） ０．００５％ 水道水 最終容量まで 滅菌は、pH６．７に調整後、１２１℃で２０分間行なつ
た。クリセロールを１時間ごとに、つぎのように間けつ
的に加えた。
た。クリセロールを１時間ごとに、つぎのように間けつ
的に加えた。
醗酵は攪拌下、通気しながら２６℃で行なつた。１６０
時間後、クラブラン酸の濃度は１４０３μｇ／mlもの高
濃度であつた。
時間後、クラブラン酸の濃度は１４０３μｇ／mlもの高
濃度であつた。
実施例２および３、比較例１および２ 醗酵の間にグリセロールを徐々に加える効果を、醗酵の
開始時点で全てのグリセロールを含有させる場合の効果
と直接比較した。
開始時点で全てのグリセロールを含有させる場合の効果
と直接比較した。
つぎの表に結果を示す。
同化炭素源を醗酵の間に加えた場合、著しい生産の向上
が認められる。
が認められる。
実施例４ 実施例１と同じ醗酵生産培地４０に７５フアーメン
ター中で同じ接種物を接種した。５０％マルトースの滅
菌水性溶液を、１日８００mlの割合（１％マルトース／
日）で１１２時間、連続添加ダイアフラム・ポンプを用
い、連続的に添加し、ついで、ブロスを収集した。フア
ーメンターは常法により、攪拌し、通気した。１１２時
間後、ブロス中で観察されたクラブラン酸の濃度は１４
２４μｇ／mlであつた。
ター中で同じ接種物を接種した。５０％マルトースの滅
菌水性溶液を、１日８００mlの割合（１％マルトース／
日）で１１２時間、連続添加ダイアフラム・ポンプを用
い、連続的に添加し、ついで、ブロスを収集した。フア
ーメンターは常法により、攪拌し、通気した。１１２時
間後、ブロス中で観察されたクラブラン酸の濃度は１４
２４μｇ／mlであつた。
実施例５ ｎ−ブタノール７．５を実施例１の過ブロス７．５
に加え、冷４Ｎ硫酸でpH２に調整した。混合液を１６
０００ｇで遠心分離し、水性相とブタノール相の２相に
分離した。ブタノール相を減圧下、３５℃で２００mlに
濃縮した。
に加え、冷４Ｎ硫酸でpH２に調整した。混合液を１６
０００ｇで遠心分離し、水性相とブタノール相の２相に
分離した。ブタノール相を減圧下、３５℃で２００mlに
濃縮した。
このようにして濃度２６．７mg／mlのｎ−ブタノール２
００ml中のクラブラン酸溶液を得た。水５mlを加え、水
分濃度を２．５２％とした。この溶液に、攪拌下、ｎ−
ブタノール中、２−エチルヘキサン酸リチウムの１０％
溶液１００mlを加えた。全体を１５０mlに濃縮し、５℃
で２時間攪拌し、過プレートで過した。得られた結
晶をイソプロパノール１００ml、アセトン１００ml、つ
いで、エーテル１００mlで洗浄し、真空下、４０℃で乾
燥して生成物７．５７ｇを得た。純度５４％、水分３．
２％、灰分（硫酸リチウムとして）２３．５％ 実施例６ 実施例５で得られたクラブラン酸１０ｇを水５０mlに溶
解し、攪拌下、塩化リチウムの５０％ｗ／ｖ溶液７５ml
をゆつくりと添加する。結晶化が始まり、混合物を５℃
で３０分間攪拌し、ガラスフラスコに過し、アセトン
で洗浄し、真空下、４０℃で乾燥し、生成物５．２７ｇ
を得た。収率８４％、純度８０％ 再結晶したクラブラン酸リチウムの物性はつぎのとおり
である。
００ml中のクラブラン酸溶液を得た。水５mlを加え、水
分濃度を２．５２％とした。この溶液に、攪拌下、ｎ−
ブタノール中、２−エチルヘキサン酸リチウムの１０％
溶液１００mlを加えた。全体を１５０mlに濃縮し、５℃
で２時間攪拌し、過プレートで過した。得られた結
晶をイソプロパノール１００ml、アセトン１００ml、つ
いで、エーテル１００mlで洗浄し、真空下、４０℃で乾
燥して生成物７．５７ｇを得た。純度５４％、水分３．
２％、灰分（硫酸リチウムとして）２３．５％ 実施例６ 実施例５で得られたクラブラン酸１０ｇを水５０mlに溶
解し、攪拌下、塩化リチウムの５０％ｗ／ｖ溶液７５ml
をゆつくりと添加する。結晶化が始まり、混合物を５℃
で３０分間攪拌し、ガラスフラスコに過し、アセトン
で洗浄し、真空下、４０℃で乾燥し、生成物５．２７ｇ
を得た。収率８４％、純度８０％ 再結晶したクラブラン酸リチウムの物性はつぎのとおり
である。
ＩＲ（cm-1，ヌジヨール）：3420，3010，１７６５，１
６８０，１６２０，１４００，１３４０，１３２５，１
３００，１２２０，１２００，１１３０，１１００，１
０６０，１０５０，１０２０，９９０，９７０，９５
０，９００，８８０，８５０，７３０，７０８20 〔α〕D＝451（ｃ＝145μｇ／ml，水）UV λmax＝259（ｃ＝10μｇ／ml，0.1Ｎ NaOH） （吸光モル係数ε＝１９４５１） リチウム含量（吸収による）＝３．３％ 灰分＝２６．５％（硫酸リチウムとして） 実施例７ 実施例１または４で得られた全醗酵ブロス８０００ml
（クラブラン酸の活性１２８０μｇ／ml）を０．５％プ
ラエストールのような過コアジユバント共に１５分間
攪拌した。ブロスを６：１（ｗ／ｖ）の収率でダイカラ
イトと混合し、紙でブロナーフラスコ中に注意しなが
ら過した。ブロスを過、清澄化した後、pHを４．０
に調整して除蛋白した。沈澱を遠心分離した。過ブロ
ス：樹脂の比率１０：１（ｖ／ｖ）のカラム中、塩基性
ＩＲＡ−６８樹脂にpH６．０で上澄液を吸着させた。こ
の樹脂はアセテート型のpH４．０のものであつた。
６８０，１６２０，１４００，１３４０，１３２５，１
３００，１２２０，１２００，１１３０，１１００，１
０６０，１０５０，１０２０，９９０，９７０，９５
０，９００，８８０，８５０，７３０，７０８20 〔α〕D＝451（ｃ＝145μｇ／ml，水）UV λmax＝259（ｃ＝10μｇ／ml，0.1Ｎ NaOH） （吸光モル係数ε＝１９４５１） リチウム含量（吸収による）＝３．３％ 灰分＝２６．５％（硫酸リチウムとして） 実施例７ 実施例１または４で得られた全醗酵ブロス８０００ml
（クラブラン酸の活性１２８０μｇ／ml）を０．５％プ
ラエストールのような過コアジユバント共に１５分間
攪拌した。ブロスを６：１（ｗ／ｖ）の収率でダイカラ
イトと混合し、紙でブロナーフラスコ中に注意しなが
ら過した。ブロスを過、清澄化した後、pHを４．０
に調整して除蛋白した。沈澱を遠心分離した。過ブロ
ス：樹脂の比率１０：１（ｖ／ｖ）のカラム中、塩基性
ＩＲＡ−６８樹脂にpH６．０で上澄液を吸着させた。こ
の樹脂はアセテート型のpH４．０のものであつた。
ブロスを吸着させたら、樹脂を０．５％塩化ナトリウ
ム、ついで水で洗浄した。塩化リチウムを用い、クラブ
ラン酸をリチウム塩として溶出した。樹脂の溶出液５１
０ml（クラブラン酸の活性：４５００μｇ／ml）をアセ
トン２容で処理し、沈澱を遠心分離する。上澄液をイソ
プロパノール５容と混合し、再度、沈澱を遠心分離し
た。上澄液を濃縮し、４℃で２４時間、リチウム塩を結
晶させた。収量１１８２mg、収率１１．５％、純度９
６．９２％ 実施例８ 実施例７と同様に、全醗酵ブロス５０００ml（クラブラ
ン酸の活性１３９６μｇ／ml）を過した。
ム、ついで水で洗浄した。塩化リチウムを用い、クラブ
ラン酸をリチウム塩として溶出した。樹脂の溶出液５１
０ml（クラブラン酸の活性：４５００μｇ／ml）をアセ
トン２容で処理し、沈澱を遠心分離する。上澄液をイソ
プロパノール５容と混合し、再度、沈澱を遠心分離し
た。上澄液を濃縮し、４℃で２４時間、リチウム塩を結
晶させた。収量１１８２mg、収率１１．５％、純度９
６．９２％ 実施例８ 実施例７と同様に、全醗酵ブロス５０００ml（クラブラ
ン酸の活性１３９６μｇ／ml）を過した。
連続攪拌下、液をアセトン１容と混合し、１５〜２０
分間沈澱させる。沈澱を遠心分離して除去し、アセトン
をロータリーエバポレータで除去した。
分間沈澱させる。沈澱を遠心分離して除去し、アセトン
をロータリーエバポレータで除去した。
清澄化したブロスを実施例７と同様に、ＩＲＡ−６８イ
オン交換樹脂に吸着させた（ブロス：樹脂比１０：１ｖ
／ｖ）。同様に、樹脂を洗浄し、イソプロパノールから
結晶させるため、クラブラン酸リチウムを溶出させた。
収率は２０％であつた。溶出液を２つのフラクシヨンに
分離した。第１のフラクシヨンは、生成物６５０mgを与
えた（純度６９．３％、総収率９％）。第２のフラクシ
ヨンは生成物７７０mgを与えた（純度９８％、総収率１
１％）。
オン交換樹脂に吸着させた（ブロス：樹脂比１０：１ｖ
／ｖ）。同様に、樹脂を洗浄し、イソプロパノールから
結晶させるため、クラブラン酸リチウムを溶出させた。
収率は２０％であつた。溶出液を２つのフラクシヨンに
分離した。第１のフラクシヨンは、生成物６５０mgを与
えた（純度６９．３％、総収率９％）。第２のフラクシ
ヨンは生成物７７０mgを与えた（純度９８％、総収率１
１％）。
純度６９．３％の結晶クラブラン酸リチウムは、リチウ
ム５％および、硫酸リチウムとして灰分３５．４％を含
有していた。クラブラン酸リチウムを５５％塩化リチウ
ムから再結晶させて、つぎの物性の生成物を得た。
ム５％および、硫酸リチウムとして灰分３５．４％を含
有していた。クラブラン酸リチウムを５５％塩化リチウ
ムから再結晶させて、つぎの物性の生成物を得た。
ε＝１５９０８（０．１Ｎ ＮａＯＨ） リチウム含量＝３．６％ 灰分＝２５％（硫酸リチウムとして） 純度＝９５％ ＩＲ（ヌジヨール，cm-1）３４３０，３０１０，１７６
０，１６８０１６１５，１３７５，１３００，１２１
０，１１３０，１１０５，１０６５，１０５０，１０３
０，９９５，９８０，９５０，９００，８８５，８５
５，７４０，７１０ 実施例９ 全ブロス４０００ml（クラブラン酸３００μｇ／ml）を
プラエストールで処理し、実施例７と同様に過する。
ブロスをpH６．０で清澄化し、混合比４０：１（過ブ
ロス容量：樹脂容量）でＩＲＡ−６８およびＸＡＤ−２
樹脂の混合カラムを通した。
０，１６８０１６１５，１３７５，１３００，１２１
０，１１３０，１１０５，１０６５，１０５０，１０３
０，９９５，９８０，９５０，９００，８８５，８５
５，７４０，７１０ 実施例９ 全ブロス４０００ml（クラブラン酸３００μｇ／ml）を
プラエストールで処理し、実施例７と同様に過する。
ブロスをpH６．０で清澄化し、混合比４０：１（過ブ
ロス容量：樹脂容量）でＩＲＡ−６８およびＸＡＤ−２
樹脂の混合カラムを通した。
当初のクラブラン酸活性の実質的に１００％を含有する
プレカラム溶出物をブロス：樹脂比１０：１（ｖ／ｖ）
でカラムに吸着させた。樹脂を０．５％塩化ナトリウ
ム、ついで水で洗浄した。クラブラン酸リチウムを塩化
リチウムで溶出させた。クラブラン酸塩が溶出したら、
実施例７と同様に、第１の生成物１８１mg（純度９５．
３％、収率１５．０８％）を得た。物性は実施例７の生
成物と同様であつた。
プレカラム溶出物をブロス：樹脂比１０：１（ｖ／ｖ）
でカラムに吸着させた。樹脂を０．５％塩化ナトリウ
ム、ついで水で洗浄した。クラブラン酸リチウムを塩化
リチウムで溶出させた。クラブラン酸塩が溶出したら、
実施例７と同様に、第１の生成物１８１mg（純度９５．
３％、収率１５．０８％）を得た。物性は実施例７の生
成物と同様であつた。
実施例１０〜１５ ＩＲＡ−６８樹脂アセテート型にブロスの吸着の一部と
して、異なつた処理を試みた。実施例１０では、ブロス
を過し、樹脂処理を作用した。実施例１１では、ま
ず、樹脂を塩化ナトリウム溶液で洗浄した。実施例１２
では、ブロスをコアジユバントと共に過した。実施例
１３では、実施例１２の操作に加えて、pH４でブロスの
除蛋白を行なつた。実施例１４では、実施例１２の操作
に加えて、アセトンでブロスを除蛋白した。実施例１５
では、実施例１３の操作に加えて、アセトンで溶出液を
後処理した。
して、異なつた処理を試みた。実施例１０では、ブロス
を過し、樹脂処理を作用した。実施例１１では、ま
ず、樹脂を塩化ナトリウム溶液で洗浄した。実施例１２
では、ブロスをコアジユバントと共に過した。実施例
１３では、実施例１２の操作に加えて、pH４でブロスの
除蛋白を行なつた。実施例１４では、実施例１２の操作
に加えて、アセトンでブロスを除蛋白した。実施例１５
では、実施例１３の操作に加えて、アセトンで溶出液を
後処理した。
最適な方法は、コアジユバンドの存在下における過、
ｐＨ４．０における除蛋白および結晶化に先立つアセト
ン処理を包含する。
ｐＨ４．０における除蛋白および結晶化に先立つアセト
ン処理を包含する。
実施例１６および１７ 前記の実施例の方法は、まず、過ブロスをＩＲＡ−６
８樹脂またはＩＲＡ−６８とＸＡＳ−２混合樹脂のプレ
カラムに通し、ｐＨ４．０にて、もしくはアセトンで除
蛋白あるいは除蛋白せずに、前記と同様に直接イオ交換
樹脂に吸着させた。実施例１６では、プレカラム処理が
実施例１２の操作に含まれ、実施例１７では、ｐＨ４に
おける除蛋白およびアセトン後処理が実施例１２の操作
に包含されていた。
８樹脂またはＩＲＡ−６８とＸＡＳ−２混合樹脂のプレ
カラムに通し、ｐＨ４．０にて、もしくはアセトンで除
蛋白あるいは除蛋白せずに、前記と同様に直接イオ交換
樹脂に吸着させた。実施例１６では、プレカラム処理が
実施例１２の操作に含まれ、実施例１７では、ｐＨ４に
おける除蛋白およびアセトン後処理が実施例１２の操作
に包含されていた。
実施例１６および１７では、樹脂の吸着能の増加および
目的生成物のより良好な収率および純度が得られた。
目的生成物のより良好な収率および純度が得られた。
フロントページの続き 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−３００７ (72)発明者 ミグエル・アンヘル・モレノ・バレ スペイン国マドリツド、ブラボ・ムリロ38 番 シー／オー、アンチビオチコス・ソシ エダード・アノニマ (72)発明者 フランシスコ・サルト・マルドナド スペイン国マドリツド、ブラボ・ムリロ38 番 シー／オー、アンチビオチコス・ソシ エダード・アノニマ (72)発明者 トマス・オレロス・イサルド スペイン国マドリツド、ブラボ・ムリロ38 番 シー／オー、アンチビオチコス・ソシ エダード・アノニマ (72)発明者 ルイス・コスタ・プラ スペイン国マドリツド、ブラボ・ムリロ38 番 シー／オー、アンチビオチコス・ソシ エダード・アノニマ (72)発明者 ホセ・マリア・フエルナンデス・サウサ- フアロ スペイン国マドリツド、ブラボ・ムリロ38 番 シー／オー、アンチビオチコス・ソシ エダード・アノニマ (56)参考文献 特公 昭52−1996（ＪＰ，Ｂ２) 特公 昭57−14832（ＪＰ，Ｂ２)
Claims (10)
- 【請求項１】同化炭素源の少なくとも一部を醗酵の間に
添加することを特徴とするストレプトマイセス属に属し
クラブラン酸を産生する能力を有する微生物による培地
中での醗酵によるクラブラン酸の製法。 - 【請求項２】同化炭素源のレベルを２％以下に保つ前記
第（１）項の製法。 - 【請求項３】生産醗酵の間、炭素レベルを０．２５％以
下に保つ前記第（２）項の製法。 - 【請求項４】同化炭素源が、少なくとも、グリセロール
およびマルトースのうちの１つからなる前記第（１）〜
第（３）項いずれか１つの製法。 - 【請求項５】同化炭素源を０．５〜１．５％／日の速度
で連続的または間けつ的に添加する前記第（１）〜第
（４）項いずれか１つの製法。 - 【請求項６】同化炭素源を約０．０５％／時間の速度で
添加する前記第（５）項の製法。 - 【請求項７】（ｉ）純度の低いクラブラン酸溶液を２−
エチルヘキサン酸リチウム溶液と混合し、 （ii）クラブラン酸リチウムを単離し、 （iii）所望により、リチウム塩を他の塩またはエステ
ルに変える、 工程を用いてクラブラン酸を溶液から精製する前記第
（１）〜第（６）項いずれか１つの製法。 - 【請求項８】イオン交換樹脂を用いてクラブラン酸を精
製する前記第（１）〜第（７）項いずれか１つの製法。 - 【請求項９】醗酵ブロスを凝集剤で処理して菌糸を凝集
させる前記第（１）〜第（８）項いずれか１つの製法。 - 【請求項１０】醗酵ブロスを濾過し、除蛋白する前記第
（１）〜第（９）項いずれか１つの製法。
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