DK160510B

DK160510B - Fremgangsmaade til fremstilling af lankacidin-antibiotika

Info

Publication number: DK160510B
Application number: DK158983A
Authority: DK
Inventors: Takashi Suzuki; Junya Okada; Hidekazu Sawada
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Priority date: 1982-04-12
Filing date: 1983-04-11
Publication date: 1991-03-18
Also published as: DK158983D0; CA1190165A; EP0091781B1; US4480033A; SG86088G; ES8502159A1; ES521361A0; JPS58179496A; EP0091781A1; JPS6314950B2; KR840004442A; DK158983A; HU192960B; DK160510C; KR920009510B1; DE3367618D1; ZA832470B

Description

i i

DK 160510 B

Den foreliggende opfindelse angår en særlig fremgangsmåde til fremstilling af lankacidin-antibiotika.

"Lankacidiner" er navnet på en gruppe antibiotika med nedenstående formler (I) og (II), herunder sådanne 5 strukturelt uidentificerede antibiotika som lankacidin K og lankacidin L:

OH

CH3nA H®YH3 10 ^CH3 5 T / V^>-NHC0C< , (I) >—i CH0 tV° 2 15 hvor R1 betyder =0, eller -H og -OH, og R betyder hydrogen eller lavere alkanoyl, h/\ f Η >-NHCOCH(OH)CH3 (XI) pa3 o 3 25 hvor R betyder hydrogen eller lavere alkanoyl. Sådanne lankacidiner er ellers betegnet som antibiotikum T-2636.

Herunder hører f.eks. lankacidin A med formlen (I), 12 (R ; =0, R : COCHg), lankacidin C med formlen (I), (R1: =0, R2: H) , lankacidinol Amed formlen (I) (R1:^?^,

2 1 H

30 R : COCH^), lankacidinol med formlen (I) , R : ^0Hf R2: H), lankacyclinol med formlen (II),(R^j H), lankacyc- 3 linol A med formlen (II),(R : COCH^), samt de ovenfor nævnte strukturelt uidentificerede lankacidiner K og L.

De fysisk-kemiske og biologiske egenskaber af 35 lankacidiner med formel (I) og (II) er kendte, jfr.

2

DK 160510 B

The Journal of Antibiotics, bind 24, 1, (1971), ibid., bind 26, 647 (1973), Chemical Pharmaceutical Bulletin, bind 22, 99 (1974), ibid., bind 23, 2201 (1974), medens de fysisk-kemiske og biologiske egenskaber af lankacidi-5 nerne K og L er beskrevet i japansk patentansøgning nr. 150018/1981.

Der er gjort betydelige fremskridt i forsøgene med henblik på anvendelser af lankacidiner, og det har i den seneste tid vist sig, at de er effektive som 10 antibakterielle midler og antitumormidler. Det forventes, at efterspørgselen efter lankacidinerne vil være stadig stigende, især på grund af deres bemærkelsesværdigt lave toksicitet.

Som følge af ovennævnte forhold er der gjort for-15 søg på at tilvejebringe en fremgangsmåde til fremstilling af lankacidiner i stor målestok og ved lave omkostninger, og det har nu ifølge opfindelsen vist sig, at der ved fremstilling af lankacidiner ved dyrkning af en mikroorganisme, der er i stand til at producere lankacidiner, i et dyrknings-20 medium, opnås en uventet forøgelse af den dannede mængde lan-kacidin, når der til dyrkningsmediet sættes en cyclodextrin.

Den foreliggende opfindelse angår således en fremgangsmåde til fremstilling af lankacidin-antibiotika ved dyrkning af en mikroorganisme af slægten Streptomyces, der 25 er i stand til at producere lankacidin, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at der tilsættes cyclodekstrin til dyrkningsmediet, og at der om ønsket sættes et til acylgrup-pen svarende alkylcarboxylat til det dannede dyrkningssubstrat eller et filtrat deraf til forøgelse af indholdet af 30 lankacidin-14-acylderivat.

Som eksempler på mikroorganismer, der er i stand til at producere lankacidiner og hører til slægten Streptomyces (herefter betegnet "St.") kan nævnes St. rochei var. volu-bilis (IFO-12507, ATCC-21250, FERM P-6155, US-patentskrift 35 nr. 3.626.055), St. griseofuscus (IFO-12870, ATCC-23916, ATCC Catalogue of Strains I (14. udgave, 1980), side 175),

St. violaceoniger (NRRL-2834, IFO-14166, US-patentskrift 3

DK 160510 B

nr. 3.118.812), og St. sp. 6642-GClf (IFO-14172, Agr. Biol.,

Chem. 35(1), side 27-32 (1971)).

Som eksempler på cyclodextriner, der kan anvendes ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, skal nævnes: 5 α-cyclodextrin, /3-cyclodextr in, nr-cyclodextrin og 5-cyclo-dextrin. Disse cyclodextriner kan anvendes alene eller i kombination af to eller flere heraf. F.eks. kan en blanding af j3-cyclodextrin og nr-cyclodextrin anvendes.

Koncentrationen af cyclodextrin i et dyrkningsmedium 10 er ikke kritisk, så længe den ikke hæmmer mikroorganismernes vækst. Der anvendes sædvanligvis en koncentration på 1-150 mM, fortrinsvis 2-100 mM, især 4-50 mM.

Cyclodextriner kan foreligge i krystallinsk form, pulverform eller flydende form eller kan indeholde uren-15 heder, såsom sukker eller stivelse. Mængden af sådanne urene cyclodextriner, når sådanne anvendes, reguleres således, at nettokoncentrationen af cyclodextrinen falder inden for det ovenfor anførte område.

Tilsætning af cyclodextriner til dyrkningsmediet 20 kan foretages på et vilkårligt tidspunkt under dyrkningen, men fortrinsvis før mikroorganismen podes eller overføres til mediet.

Carbonkilder for dyrkningsmediet er f.eks. ikke blot saccharider, såsom stivelse, dextrin, glucose, maltose, 25 saccharose, sorbitol,melasse, majssirup eller hirsegelé, men også organiske syrer, såsom eddikesyre eller ravsyre, polyvalente alkoholer, såsom glycerol, fedtstoffer og olier. Nitrogenkilder er uorganiske stoffer, såsom ammoniumsalte, nitrater eller urinstof, og naturlige organi-30 ske stoffer, såsom gærekstrakt, casein, kødekstrakt, bomuldsfrømask, majsstøbevand og sojabønnemask. Endvidere anvendes der, om nødvendigt, uorganiske salte, såsom jern (f.eks. ferrosulfat), magnesium (f.eks. magnesiumsulfat), mangan (f.eks. mangansulfat), cobalt (f.eks.

35 cobaltsulfat), kobber (f.eks. kobbersulfat), natrium (f.eks. natriumchlorid), kalium (f.eks. kaliumcarbonat),

DK 160510B

O

4 calcium (f.eks. calciumcarbonat), zink (f.eks. zinkchlo-rid) og lignende. Endvidere kan der anvendes aminosyrer, vitaminer eller nucleinsyrebaser, når det kræves af den anvendte mikroorganisme.

5 Der kan anvendes en hvilken som·helst stationær luftnings-omrøre- eller .rystekultur, men fortrinsvis en luf tnings-omrørekultur. Dyrkningen gennemføres ved en temperatur i området 15-40°C, fortrinsvis 20-34°C. Dyrkningsmediets pH-værdi ligger fortrinsvis i området fra 4 10 til 9. Til dette formål tilsættes natriumhydroxid, kaliumhydroxid, vandig ammoniak eller en fortyndet vandig opløsning af svovlsyre eller saltsyre, således at pH-værdien kan reguleres under dyrkningen. Alternativt s- kan der til dyrkningsmediet sættes alkalimetalsalte, så- 15 som kaliumcarbonat eller natriumcarbonat. Dyrkningen fortsættes, indtil der er dannet en betydelig mængde lan-kacidin, men sædvanligvis i 2-12 dage til opnåelse af det maksimale udbytte.

De i dyrkningssubstratet dannede lankacidiner kan 20 isoleres ved konventionelle metoder hertil. Der kan f.eks. foretages ekstraktion fra dyrkningssubstratet eller dets filtrat med et vand-uopløseligt opløsningsmiddel, såsom ketoner, f.eks. acetone, 4-methyl-2-pentanon, estere, f.eks. ethylacetat, ethylpropionat, eller carbonhydrider, 25 f.eks. hexan eller benzen, idet der drages fordel af disses neutrale og lipofile egenskaber. Ekstrakten vaskes med en vandig syreopløsning og en vandig alkaliopløsning og inddampes, hvorved der fås det rå lankacidin. Råproduktet kan om nødvendigt renses yderligere ved søjlechromatografi 30 på silicagel, aluminiumoxid eller lignende ved de i ovennævnte litteratursteder beskrevne, kendte metoder. Således fremstillede lankacidiner kan endvidere individuelt adskilles i deres bestanddele.

Hydroxygruppen i 14-stillingen i lankacidinet kan 35 selektivt omdannes til de tilsvarende estere ved, at der

J

5

DK 160510 B

til det beskrevne dyrkningssubstrat, fortrinsvis dets filtrat, sættes estere, såsom Ci_4-alkoholestere, glycolestere eller glycerolestere af lavere (C1-.5) -alkylcarboxylsyrer, f.eks. eddikesyre eller propionsyre. Som eksempler på esterne 5 skal nævnes methylformiat, ethylacetat, ethylpropionat, monoacetin og triacetin. Hydroxygruppen i 14-stillingen este-rificeres af et enzym i dyrkningssubstratet, f.eks. ved tilsætning af ethylacetat til dyrkningssubstratet til dannelse af det tilsvarende 14-acetylesterderivat. Esterifice-10 ringen gennemføres f.eks. ved tilsætning af en ester til dyrkningssubstratets filtrat i en mængde på 1/4 - 2 gange mængden af filtratet, hvorpå blandingen omrøres, indtil den er emulgeret, sædvanligvis fra 1 minut til 1 time, ved en temperatur i området 15-70°C, fortrinsvis 20-40°C, ved en 15 pH-værdi på 4-9. De som ovenfor beskrevet fremstillede 14-esterderivater kan isoleres fra reaktionsblandingen ved den ovenfor beskrevne metode.

Lankacidinerne fremstillet som beskrevet ovenfor kan anvendes som antitumormidler, antibakterielle midler og som 20 antibiotikum til behandling af svinedysenteri.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen illustreres i de efterfølgende eksempler, hvor alle procenter er på vægt/rum-fangsbasis, medmindre andet er angivet.

25 Eksempel 1 (1) 25 ml af et dyrkningsmedium indeholdende opløselig stivelse (1%), råt sojabønnemel (2%), calciumcarbonat (1%) og sojabonneolie (0,1%) sættes til en 200 ml kolbe og steriliseres. Mediet podes med ét podenålsøjefuld vækstkultur af 30 Streptomyces rochei var. volubilis (IFO-12507) og inkuberes ved 28°C i et roterende rysteapparat ved 200 rpm i 24 timer.

Denne kultur anvendes som podekultur.

6

DK 160510 B

o

Til portioner på hver 25 ml af et dyrkningsmedium indeholdende 10% glycerol, 2% Proflo (Traders Oil Mill Co., U.S.A.), 0,5% majsstøbevand, 1% Polypepton (Daigo Nutritive Chemicals, Ltd., Japan), 0,1% ferrosulfat og 5 0,01% sojabønneolie sættes 3-cyclodextrin, indtil koncen trationen af 3-cyclodextrin i det fremkomne dyrkningsmedium er som vist i den efterfølgende tabel I. Blandingernes pH-værdi indstilles på 7,0 ved tilsætning af en 20%'s vandig natriumhydroxidopløsning.

10 20 ml Af hver af blandingerne sættes til en 200 ml kolbe og steriliseres. Disse medier podes med 1 ml af podekulturen og inkuberes ved 24°C i et roterende rysteapparat ved 200 rpm i 96 timer. De i dyrkningssubstraterne dannede lankacidiner bestemmes kvanti-15 tativt ved en kendt metode (The Journal of Antibiotics, bind 24, 1 (1971)), idet mængderne beregnes ud fra bio-forsøg med prøver på følgende måde:

Lankacidin, fremstillet som beskrevet ovenfor, ekstraheres med methylisobutylketon. Ekstrakten frem-20 kaldes ved tyndtlagschromatografi (punktfilm,

Tokyo Kasei Co., Japan) med en blanding af ethylacetat og ethylether (L: 3) . Diameteren af inhiberingszonen mod væksten af Sarcina lutea PCI-1001 sammenlignes med standardens.

25 De fremkomne resultater er anført i nedenstå ende tabel I.

•30 35 7

DK 160510 B

Tabel I

Koncentration af β-cvclo- dextrin (mM) i dyrknings- Lankacidin C Lankacidin A mediet_ (mM) (mM)_ O 0,40 0,05 5 1 0,60 0,07 3 1,74 0,19 5 4,00 0,44 7 4,00 0,52 9 4,20 0,53 10 11 4,60 0,55 30 4,50 0,55 50 4,52 0,55 (2) 1 Liter af det som ovenfor beskrevet fremstil-15 lede dyrkningssubstrat, hvortil der er sat 9 mM β-cyc-* lodextrin, centrifugeres. Den ovenstående væske ekstrahe-res med 1 liter 4-methyl-2-pentanon, vaskes med vand og inddampes under formindsket tryk. Til koncentratet sættes 100 ml n-hexan, hvorved der dannes 3 g udfældnings-20 produkt. 2,5 g Af det således dannede rå stof opløses i 25 ml af et blandet opløsningsmiddel af chloroform og ethylacetat (1:1), som underkastes adsorptionschromato-grafi på 75 g silicagel (0,05-0,2 mm: Merck & Co., U.S.A.).

25 250 ml Ether ledes gennem søjlen, hvorpå der elu- eres successivt med en 1:1 blanding af ether og ethylacetat (1 liter), ethylacetat (1 liter) og en 1:1 blanding af ethylacetat og acetone (1 liter), hvorved størstedelen af de antibak-terielt effektive fraktioner indeholdes i eluaterne.

30 De effektive fraktioner kombineres og koncentreres, hvorved der fås ca. 1,4 g gult pulver. Dette rå pulver underkastes tyndtlagschromatografi på 0,5 kg silicagel (HF254: Merck & Co., U.S.A.). Det rå produkt adskilles i de respektive antibiotika, som udgør antibiotika af 35 lankacidin-gruppen.

DK 160510 B

8

Chromatogrammet fremkaldes med et blandet opløsningsmiddel af ethylacetat og ether (1:3) og ekstraheres med ethylacetat. Efter vaskning med vand henholdsvis tørres:/· koncentreres og derpå omkrystalliseres ekstrakterne, 5 hvorved der fås 40 mg lankacidin C og 3,5 mg lankacidin A.

Deres smeltepunkter, specifikke rotationer (c=l,0, ethanol), ultraviolette absorptionskoefficienter (ved 227 nm) og elementaranalyser er nøjagtigt identiske med 10 de i The Journal of Antibiotics, bind 24, 13, (1971) anførte værdier.

Eksempel 2

Til portioner på hver 25 ml dyrkningsmedium indeholdende 5% glucose, 0,5% glycerol, 1% Polypepton, 0,5% 15 kødekstrakt, 1% råt sojabønnemel, 0,1% magnesiumsulfat og 0,5% kaliumcarbonat i en 200 ml kolbe sættes β-cyclo-dextrin, indtil de i tabel II anførte koncentrationer er nået, hvorefter der steriliseres.

Til hvert dyrkningsmedium sættes 1 ml podekultur 20 af Streptomyces rochei var. volubilis (IF0-12507), fremstillet ifølge eksempel 1. Dyrkningen foretages ved 24°C i et rotationsrysteapparat ved 200 rpm i 96 timer.

Mængden af hvert lankacidin frembragt i hvert dyrknings-substrat måles ved den i eksempel 1 beskrevne metode.

25 30 35 9

DK 160510 B

Tabel II

Koncentration af tilsat 5 β-cyclodextrin Lankacidinol Lankacidinol A Lankacyclinol A (mM)_(mM)_(mM)_(mM)_ 0 0,21 0,04 0,13 1 0,32 0,06 0,19 3 1,23 0,16 0,55 5 2,80 0,39 1,40 10 7 2,85 0,41 1,42 9 2,91 0,41 1,40 11 2,91 0,42 1,39 30 2,89 0,40 1,41 50 2,88 0,40 1,40 15

Eksempel 3

Den i eksempel 1 (1) beskrevne fremgangsmåde gentages med den undtagelse, at der i stedet for β-cyclodextrin 20 anvendes forskellige cyclodextriner, hver for sig eller i blanding, i de i Tabel III anførte mængder. Produktmængderne måles ved den i eksempel 1 (1) anvendte metode. Resultaterne er anført i den efterfølgende tabel III.

Tabel III 25

Koncentration af Lankacidin C Lankacidin A

tilsat cyclodextrin_ (mM)_(mM)_ β-cyclodextrin 10 mM 4,40 0,54 a-cyclodextrin 10 mM 0,75 0,08 γ-cyclodextrin 10 mM 3,01 0,35

30 β-cyclodextrin 5 mM

. . . . c „ 4,10 0,49

a-cyclodextrm 5 mM

35

DK 160510B

10

Tabel III (fortsat)

Koncentration af Lankacidin C Lankacidin A

tilsat cyclodextrin_. (111^__ β-cyclodextrin 5 mM 4 25 O 51

5 Y-cyclodextrin 5 mM

a-cyclodextrin 5 mM ^ 21 O 40

γ-cyclodextrin 5 mM

a-cyclodextrin 3 mM

10 β-cyclodextrin 3 mM 3,02 0,38

γ-cyclodextrin 3 mM

Intet 0,40 0,05

Eksempel 4 15 Portioner på hver 25 ml af ét dyrkningsmedium indeholdende 2,8% opløselig stivelse, 3,0% råt jordnødde-mel, 0,5% melasse, 0,5 % Polypepton, 0,3% calciumcarbo-nat, 0,25% natriumchlorid, 0,003% zinksulfat, 0,0007% kobbersulfat, 0,0007% mangansulfat og 0,2% sojabønneolie 20 sættes til 200 ml kolber og steriliseres. Hvert af disse medier podes med et øjefuld af en skråkultur af Streptomyces griseofuscus IF0-12870 og inkuberes i et roterende rysteapparat ved 200 rpm og 28°C i 30 timer. Denne kultur an- v. vendes som podekultur.

25 Til 25 ml portioner af et dyrkningsmedium med den ovenfor beskrevne sammensætning, sættes de i tabel IV anførte cyclodéxtriner i de i samme tabel anførte mængder. Hver af disse blandinger sættes til en 200 ml kolbe og steriliseres.

30 Een ml af den ovenfor beskrevne podekultur over føres til hver af blandingerne, og disse inkuberes i et roterende rysteapparat ved 200 rpm og 24°C i 96 timer.

De i dyrkningsmediet dannede lankacidiner måles ved den i eksempel 1 (1) beskrevne metode.

35 Resultaterne er anført i den efterfølgende Tabel IV.

11

DK 160510 B

Tabel IV

Koncentration af Lankacidin C Lankacidin A

tilsat cyclodextrin_(mM)_(mM)_ β-cyclodextrin 10 mM 1,55 0,21 a-cyclodextrin 10 mM 6,31 0,04 γ-cyclodextrin 10 mM 1,10 0,12 β-cyclodextrin 5 mM 1 50 O 19

a-cyclodextrin 5 mM

e-cyclodextrin 5 m lj53 0,20

10 γ-cyclodextrin 5 mM

a-cyclodextrin 5 mM

γ-cyclodextrin 5 mM 1/12 0,13

a-cyclodextrin 3 mM

15 β-cyclodextrin 3 mM 1,11 0,13

γ-cyclodextrin 3 mM

Intet 0,15 0,02

Eksempel 5 500 ml Dyrkningsmedium indeholdende 3% glucose, 1% Proflo, 3,5% majsstøbevand, 0,02% magnesiumsulfat, 0,1% dikalium-hydrogenphosphat, 0,05% sojabønneolie og 1,5% calciumcarbonat indstilles på pH-værdi 7,0 med en 20%'s vandig natriumhydroxidopløsning. Dyrkningsmediet sættes til en 2 liter Sakaguchi-kolbe, tilproppes med vat 25 og steriliseres. Dyrkningsmediet podes derpå med en skråkultur af Streptomyces rochei var. volubilis IF0-12507 og inkuberes i et frem- og tilbagegående rysteapparat ved 28°C i 24 timer. 30 liter af et dyrknings-medium med samme sammensætning som den ovenfor beskrevne sættes til en 50 liter gæringsbeholder og steriliseres.

Det ovenfor beskrevne dyrkningsmedium podes med 500 ml af det ovenfor nævnte dyrkningssubstrat og inkuberes ired 24°C i 24 timer under luftning med 1 WM (luftninqsrumfang __ pr. minut pr. rumfang af mediet) og omrøring ved 150 arpm.

35 12

DK 160510 B

Denne kultur anvendes som podekultur. I en 200 liter gæringsbeholder anbringes 100 liter af et dyrkningsmedium indeholdende 10% glycerol, 2% Proflo, 0,5% majsstøbevand, 1% Polypepton, 0,1% ferrosulfat, 0,1% 5 sojabønneolie og 1% β-cyclodextrin, hvorefter der steriliseres. Til dette dyrkningsmedium overføres 5 liter af den ovenfor beskrevne podekultur, og der inkuberes ved 24°C i 96 timer under luftning med 1 WM og omrøring ved 165 rpm.

10 Til 60 liter af det således dannede dyrknings substrat sættes 20 liter vand og 2 kg Hyflo®-Supercel (Johns Manville Products Corp., U.S.A.), og blandingen filtreres, hvorved der fås 70 liter filtrat. En del af filtratet underkastes lankacidinmåling, som viser et 15 indhold på 3,3 mmol lankacidin C og 0,2 mmol lankacidin A. 70 Liter af filtratet anbringes i en 200 liter beholder udstyret med omrører. Filtratet tilsættes 35 liter ethylacetat, og der omrøres i 30 minutter ved stuetemperatur med en omrører, der roterer med 120 rpm, 20 og en del af filtratet udtages som prøve til bestemmelse af lankacidinindholdet. Lankacidin C findes ikke i prøven, men Lankacidin A findes deri. Efter omrøring af filtratet i 1 time med ethylacetat isoleres ethylacetat-laget og koncentreres til 5 liter i en rotationsfordam-25 per (indvendig temperatur; 30°C). Dette koncentrat underkastes adsorptionschromatografi på 10 kg silicagel (0,05 mm - 0,2-mm, Merck & Co., U.S.A.), idet der ækvi-libreres med toluen. Søjlen elueres med 30 liter toluen og derpå med 120 liter af et blandet opløsningsmiddel 30 af toluen og ethylacetat (8:2). En alikvot del på hver gang 1 liter opsamles fraktionsvis, og de aktive fraktioner inddampes på en rotationsfordamper (indvendig temperatur 30°C), hvorved der udfældes krystaller. Krystallerne tørres, hvorved der fås 80,0 g krystallinsk lankacidin A.

35

13 DK 160510 B

Eksempel 6

En 20%'s vandig natriumhydroxidopløsning sættes dråbevis til et dyrkningsmedium indeholdende 3% glucose, 1% Proflo, 3,5% majsstøbevand, 0,02% magnesiumsulfat, 5 0,1% dikalium-hydrogenphosphat og 1,5% calciumcarbonat til indstilling af dyrkningsmediets pH-værdi på 6,5.

25 ml Af dette dyrkningsmedium anbringes i en 200 ml Erlenmeyer-kolbe, der tilproppes med vat og steriliseres. Dyrkningsmediet podes med ét øjefuld af en skråkultur af 10 Streptomyces violaceoniger (IF0-14166) og inkuberes ved 28°C i 24 timer i et roterende rysteapparat ved 200 rpm.

Dette dyrkningssubstrat anvendes som podekultur. Til dyrkningsmedier indeholdende 10% glycerol, 2% Proflo, 0,5% majsstøbevand, 1% Polypepton, 0,1% ferrosulfat, 15 0,0025% kobbersulfat og 0,5% natriumchlorid sættes β- -cyclodextrin i de i tabel V anførte mængder. Blandingens pH-værdi indstilles på 6,0 ved dråbevis tilsætning af en 20%'s vandig natriumhydroxidopløsning. Portioner på hver 25 ml af mediet anbringes i 200 ml Erlenmeyer-kolber og 20 steriliseres ved 120°C i 20 minutter. Hvert af disse dyrkningsmedier podes med 1 ml af podekulturen og inkuberes ved 24°C i 96 timer i et rotationsrysteapparat ved 200 rpm.

De i dyrkningsmedierne dannede mængder lankacidin måles ved den i eksempel 1 beskrevne metode. Resultaterne er 25 anført i den efterfølgende tabel V.

Tabel V

Koncentration af β-cyclodextrin Lankacidin C Lankacidinol i et dyrkningsmedium (raM)_. (mM) _(mtt)_ 0 0,40 0,06 2,25 2,55 0,7t8 30 4,5 3,76 0,8© 9 4,60 1,25 13,5 4,04 2,33 18 4,01 2,66 35 14

DK 160510 B

Eksempel 7 10 ml Af det i eksempel 6 beskrevne dyrkningssubstrat, hvor koncentrationen af β-cyclodextrin i dyrkningsmediet er 9 ni som anført i tabel V, centrifugeres ved 5 stuetemperatur ved 2000 rpm. 6 ml Af den ovenstående væske anbringes i en 100 ml Erlenmeyer-kolbe udstyret med prop, og 6 ml ethylacetat sættes dertil. Blandingen omrøres ved 18°C i 30 minutter ved 200 rpm, således at der sker en acetyleringsreaktion. Efter fraskillelse af 10 ethylacetatlaget med en 50 ml skilletragt måles lankacidin-indholdet ved den i eksempel 1 beskrevne metode. Resultaterne er anført i den efterfølgende tabel VI.

Tabel VI

Lankacidiner Koncentration af reaktionsprodukt 15 ____(mM). _

Lankacidin A 4,55

Lankacidinol A 1,21

Eksempel 8 20 Dyrkningen foretages på den i eksempel 6 beskrevne metode med den undtagelse, at der anvendes Streptomyces sp. 6642-GC^ (IFO-14172) i stedet for Streptomyces vio-laceoniger (IFO-14166). De i dyrknings substraterne, dannede lankacidinmængder måles ved den i eksempel 1 be-25 skrevne metode. Resultaterne er anført i den efterfølgende tabel VII.

Tabel VII

Koncentration af β-cyclodextrin i dyrkningsmediet Lankacidin C Lankacidinol _(mM) _(mM)_(mM)_ 30 0 0,39 0,037 2,25 0,68 0,101 4,5 0,79 0,135 9 0,59 0,060 13,5 0,54 0,051 35 18 0,54 0,050

DK 160510 B

15

Eksempel 9 10 ml Af det ifølge eksempel 8 fremstillede dyrkningssubstrat, hvori koncentrationen af β-cyclodex-trin i dyrkningsmediet er 4,5 mM som anført i tabel VII, 5 underkastes acetyleringsreaktion ved samme fremgangsmåde som den i eksempel 7 beskrevne.

Resultaterne er anført i den efterfølgende tabel VIII.

Tabel VIII

10

Lankacidiner Koncentration af reaktionsproduktet _(mM)_

Lankacidin A 0,75

Lankacidinol A 0,138 15 20 25 30 35

Claims

1. Fremgangsmåde til fremstilling af lankacidin-an-tibiotika ved dyrkning af en mikroorganisme af slægten Strep-tomyces, der er i stand til at producere lankacidin, k e n -5 detegnet ved, at der tilsættes cyclodextrin til dyrkningsmediet, og at der om ønsket sættes et til acylgrup-pen svarende alkylcarboxylat til det dannede dyrkningssubstrat eller et filtrat deraf til forøgelse af indholdet af lankacidin-14-acylderivat.

2. Fremgangsmåde ifølge krav l, kendeteg net ved, at cyclodextrinet sættes til dyrkningsmediet, før mikroorganismen podes i eller overføres til dyrkningsmediet, og at koncentrationen af cyclodextrinet i mediet er mellem 1 og 150 mM.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendeteg ne t ved, at den anvendte mikroorganisme er Streptomyees rochei var. volubilis (ATCC-21250), Streptomyees griseofuscus (ATCC-23916), Streptomyees violaceoniger (IFO-14166) eller Streptomyees sp. 6642-GC2 (IFO-14172).

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendeteg ne t ved, at alkylcarboxylatet er ethylacetat, og lankacidin- 14 -acyl -derivatet er 14-acetyl-derivatet af lankacidin C.

. 5. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegne t ved, at den mikroorganisme, der dyrkes, er Strep- 25 tomyces rochei var. volubilis (ATCC-21250).