JPH11501822A - クラブラン酸及び／又はその塩を生産するための方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 バッチ発酵は、ストレプトマイセス・クラブリゲルス（Streptomyces clavuligerus）ATCC27064 の株又はその変異体を用いて、連続的又は半連続的に行われる。その発酵過程は、開始時及びその過程全体を通しての両方での培地中の可溶性ホスフェートの厳密な制御下で行われる。炭素源として、好ましくはトリグリセリドが用いられ得る。抗生物質の産生量の実質的な増加が得られる。

Description

【発明の詳細な説明】 クラブラン酸及び／又はその塩を生産するための方法 発酵の間に存在する可溶性ホスフェートの濃度を厳密に制御し、脂質、好まし くはトリグリセリドのような炭素源を任意に用いることで、ストレプトマイセス ・クラブリゲルス（Streptomyces clavuligerus）の選択された株を発酵させる ことにより、クラブラン酸及び／又はその塩を生産するための方法が記載される 。 先行技術 クラブラン酸は、式： の分子であり、その有用性はβ−ラクターゼと呼ばれる酵素を阻害する能力に基 づく。その酵素は、大腸菌及びクレブシエラ・エアロゲネス（Klebsiella aerog enes ）等のようないくつかのグラム陽性及びグラム陰性病原性微生物が有してお り、それらの作用のため、いくつかのβ−ラクタム抗生物質に対する耐性をそれ らに与える。結果として、前記抗生物質と混合されたクラブラン酸はそれらの抗 菌範囲を増加させる。 クラブラン酸の生産は、例えばストレプトマイセス・クラブリゲルス（Strept omyces clavuligerus ）ATCC27064 及びストレプトマイセス・ジュモンジネンシ ス（Streptomyces Jumonjinensis）NRRL 5741等のようなストレプトマイセス（Streptomyces）属に属するいくつかの株に より行われることが知られている。 初期の特許（ヨーロッパ特許 0,182,522B1）に既に開示されているように、ク ラブラン酸の産生は、例えばグリセロール又はマルトースのような同化可能な炭 素源が最初にのみ添加されるかわりに発酵の間に添加される場合に、バッチ発酵 において増加され得る。しかしながら、この方法において得られたこの生産の増 加はかなり低い。従って、本発明の目的は、先行技術で周知である方法により得 られるより明らかに多い生産量でクラブラン酸及び／又はその塩を得るための方 法を供することである。 多くの著者が抗生物質の生産へのホスフェートの阻害効果を証明した(Martin ，J．F.，1977，Adv．Biochem．Eng．6：105 〜127)。特に、ストレプトマイセ ス・クラブリゲルスによるセファロスポリ et al．1984，FEMS Microbiol．Lett．25: 75-79; Aharonowithz，Y．et al．19 77，Arch．Microbiol．115: 169-173; Jhang，J．et al．1989，FEMS，57: 145- 150)、前記微生物によるクラブラン酸の合成へのホスフェートの阻害効果も見い 出されている(Lebrihi，A．et al．1987，Appl．Microbiol．Biotechnol．26: 1 30-135; Romero，J．et al．1984，Appl．Microbiol．Biotechnol．20: 318-325 )。しかしながら、先の論文に報告される発見と反対に、我々は、驚くべきこと に、クラブラン酸の産生へのホスフェートの否定的効果のかわりに、培養培地中 の可溶性ホスフェートレベルが最適範囲に達し、その範囲が維持される場合にク ラブラン酸及び／又はその塩の産生が本質的に増加することを見い出した。更に 、我々は、培養培地中の可溶性ホスフェートの濃度の厳密な制御が、栄養素の実 際の添加より、その糸の生産の増加により大きな影響を有することを見い出した 。ストレプトマイセス・クラブリゲルスのバッチ又は半連続（フェド・バッチ(f ed-batch)）培養を、クラブラン酸、並びに他の抗生物質又は分子、典型的に二 次代謝物の産生のために用いた。本明細書の目的のために、バッチ培養という言 葉は、栄養素が最初にのみ培養培地内に導入され、そのブイヨンがその過程の終 りにおいてのみ発酵タンクから抽出される発酵を示す。半連続（フェド・バッチ ）培養という言葉は、栄養素が最初ばかりでなくその発酵全体を通してもその培 養培地内に導入され、そのブイヨンがその過程の終りにのみ発酵タンクから抽出 される発酵を示す。クラブラン酸のバッチ又はフェド・バッチ生産の過程は、粘 度の大きな増加が最初におこり、結果としてより長期間に生産段階を延長するた めに許容されるレベルの溶解酵素を維持することが困難となるいくつかの特別の 特徴を示す。結果として、菌糸体のフラグメンテーション、粘度の減少及び生産 量の減少がおこり、その過程の終了が避けられない。 生物量、アミノ酸及び他の一次代謝物を得るために連続培養が有利に適用され る（Hospodka，J．1966，Theoretical and Methodological Basis of Continuou s Culture of Microorganisms，pp 493-645; Malek，J and Fencl，Z．eds．Aca demic Press New York）。しかしながら、二次代謝物（抗生物質）を得るための 連続培養の使用は、本当に開示されておらず、又は限られた効能で行われている (Vu-Trong，K．and Grey，1982 Biotechnol．Bioengineering 24: 1093-1103; T rangott C．S．et al．1993 Apol．Microbiol．Biotechnol．39: 433-437; Noac k．D．1988，J．Bas．Microbiol．28: 101-106)。本明細書の目的のために、連 続培養という言葉は、栄養素が最初及び発酵全体を通しての両方で培養培地内に 導入され、そ してブイヨンのいくつかの部分がその終りにおいてばかりでなく発酵全体を通し て発酵タンクから抽出される発酵を含む。我々は、可溶性ホスフェートを培養培 地に加える及び／又は発酵全体を通してその濃度を制御及び固定することにより 、高生産量で連続培養においてクラブラン酸及び／又はその塩を得ることが可能 で有利であることを見い出した。連続培養において、その培養物を適切に希釈す ることにより、その過程全体を通して粘度が次第に減少し、それにより撹拌量の 増加なしにより長期間、溶解酸素の濃度が維持される（40％超）ことを可能にし 、菌糸体のフラグメンテーション及びクラブラン酸の生産期間の長期化を防止す る。栄養素及び水の添加の結果として、設置容量の完全な充填が達成され、その ことは、適切な作動容量を維持するために、継続的又は連続的のいずれかでの発 酵過程全体を通してのブイヨンの連続的抽出を必要とする。この方法において、 その過程全体を通して培養培地に適切なホスフェートを添加することにより、そ の過程を制御することにより、発酵サイクルの長期化及び全生産量の増加が得ら れ、かわりに幾何的な設置容量当りの生産収率を増加させる。 発明の記載 従って、本発明は、エレーション及び撹拌での液中発酵において、バッチ、半 連続又は連続培養において、ストレプトマイセス・クラブリゲルスATCC27064 及 び／又はその変異体の選択された株を培養することにより、クラブラン酸及び／ 又はその塩を生産するための方法であって、発酵の最初及び全体で培養培地中に 存在する可溶性ホスフェートの濃度が、用いられる培養の各々のタイプにより、 バッチ培養における発酵の最初において 500〜4000mg／ｌ、又は半連続（フェド ・バッチ）もしくは連続培養において、発酵の最初に おいて 150〜600 mg／ｌの間、そして後者の全体を通して20〜150mg／ｌの間の 範囲内に固定及び／又は維持されることを特徴とする方法を提供する。 本発明によるクラブラン酸及び／又はその塩を生産するための方法は、同化可 能なＣ及びＮ源の存在下、任意に無機塩の存在下で行われる。発酵は、好気的条 件下で液中培養で行われる。 最適発酵温度は、有利には、20℃〜40℃の間、特に22℃〜30℃の間にある。 Ｃ源は各々（バッチ培養の場合）最初にのみ、又は半連続（フェド・バッチ） もしくは連続培養の場合、断続的もしくは連続的添加により発酵全体を通して、 単一又は複合栄養素として添加され得る。用いられる株により、これらのＣ源は 炭水化物（デキストラン、スターチ、及びマルトース等）、グリセロールのよう なポリオール、例えば脂質（主に天然又は合成のいずれかのトリグリセリド）及 び一般に微生物の増殖を許容するいずれかの他のＣ源を含む。我々は特に、脂質 及びより詳しくは天然もしくは合成トリグリセリドが本発明の方法を行うための 好ましいソースの１つとして考えられ得ることを見い出し、他方先行技術におい てこの効果を示すものはない。実際、我々は、このような炭素源を用いて、培養 培地（バッチ培養）への１回の最初の添加によってのみでさえ、クラブラン酸及 び／又はその塩の産生が、単に可溶性ホスフェートの濃度が本発明に規定される 限界内にあることを注意することによって明白に増加し得ることを発見した。 培養培地は例えば大豆ミール、コーンスチープ液、可溶性留出物、イーストエ キス、綿−種子穀粉、ペプトン、カゼイン又は硫酸アンモニウムのような有機又 は無機Ｎの同化可能なソースも有する。 ナトリウム、カリウム、アンモニウム、鉄、カルシウム及びマグ ネシウム、クロライド、スルフェート及びホスフェートのような種々の無機塩も 培養培地中に組み込まれ得る。 クラブラン酸濃度は、高性能液体クロマトグラフィーを用いて測定することが 好ましいが、例えばクレブシェラ・エアロゲネス（Klebsiella aerogenes）のよ うなβ−ラクタマーゼを産生する微生物を用いることにより、微生物学的に決定 され得る。 ブイヨンからのクラブラン酸又はその塩の抽出は、他の抗生物質、特に他のβ −ラクタムがイオン交換樹脂もしくは溶媒又はいずれかの他の周知の慣用的方法 を用いて抽出される様式で行われ得る。 開始培地中の可溶性ホスフェートは、例えば市販のキット（Boehringer Mannh eim Automated Analysis for BM/Hitachi System 704）により、簡単かつ迅速な 手順により測定され得る。その方法の原理は、モリブデン酸アンモニウムとの無 機リンの反応である。次にこの無機リンはホスフェートとして表現される。可溶 性ホスフェートを分析するために、（培養ブイヨンから均一に取られた）サンプ ルは、固体を除去するために孔サイズ0.45μｍの Milliporeフィルター又はその 類似物を通して事前にろ過されるべきである。このサンプルは、可溶性ホスフェ ートの濃度が減菌過程に従って変動し得るので、培養培地の減菌の後に取られる べきである。 全ホスフェートのアッセイは、全ブイヨンの１mlを取り、１mlの硫酸及び５ml の硝酸を加えることによって行われる。この溶液を、最終容量１mlの透明な溶液 となるまで加熱することによりエバポレートする。その最終容量を蒸留水で25ml にし、可溶性ホスフェートについて先に言及される方法によりアッセイする。 バッチ様に発酵を行う場合、発酵の始めにおける可溶性ホスフェートの最適レ ベルは 500〜4000mg／ｌの間、好ましくは 800〜1600mg／ｌの間であることが見 い出された。 用いられる開始材料の性質及びその濃度のため、可溶性ホスフェートのレベル がこれらの限界より十分に高く又は低いなら、それは修正されるべきである。こ の終りに、そのレベルが下限より低い場合、要求されるレベルに到するまで、例 えばカリウム又はナトリウム塩の形態で減菌の前又は後により多くの無機ホスフ ェートが添加され得る。あるいは、そのレベルが極めて高いなら、可溶性ホスフ ェートの部分は、いずれかの沈殿剤を添加することにより、例えば水酸化カルシ ウムもしくは酢酸カルシウムのようなカルシウム化合物により、又はこの目的が 得られるのを確実にするいずれかの他のシステムにより、沈殿され得る。 本発明によれば、バッチ培養における培地中の開始可溶性ホスフェートの制御 がない発酵系と比較して、産生量の５倍までの増加が観察された。表１は、可溶 性ホスフェートの最適レベルで、及びこのレベル外で行われたいくつかの発酵の 結果を示す。 割合の増加（％）は、最終値（μｇ／ml）に 100をかけて、この値を（72時間 の場合）311 又は（92時間の場合）420 で割った結果として表されたクラブラン 酸及び／又はその塩の生産量を意味とす ると理解される。これは可溶性ホスフェートレベルが最適範囲外にある発酵の結 果を表す。 このホスフェートは、次の表２の結果に反映されるように、発酵ブイヨン中で 可溶性であるべきである。この表において、同様のレベルの全ホスフェートが、 最適範囲内であるか否かに依存する極めて異なる結果での発酵を導く。 異なるホスフェートレベルにおける微生物の増殖の差は少くとも主要な因子と しては産生量の差の原因となるようではない。表３において、ホスフェートレベ ルがもう一度産生量の増加の原因であるかのように、同様の増殖において異なる 生産量のレベルがあることが観察された。菌糸体容量は、10分間、2500ｇでの遠 心で測定した（ｇは重力を示す）。 発酵の間、ホスフェートの、及び全体の発酵を通してまかれる栄養素の残りの フェド・バッチ添加の過程を行うことができる。全可溶性ホスフェート（開始及 び添加したもの）の最適レベルはバッチモードにおけるレベルより少し低く、40 0〜2000mg／ｌの間にあることが見い出された。 この投入量は、開始レベルが 150〜600 mg／ｌの間であり、発酵全体を通して の可溶性ホスフェートのレベルが20〜150 mg／ｌの間であるように行われるべき である。この終りに、それを示される限界内に維持するために、ホスフェートレ ベルを上昇又は下降させることのいずれが要求されるかによって、バッチ発酵の 場合として、可溶性ホスフェートイオン又はいずれかの沈殿剤カルシウム化合物 の投入が行われる。表４は、開始及び添加により存在する異なる濃度の可溶性ホ スフェートで行われたいくつかの半連続発酵の結果を示す。 添加されたホスフェートの全量は、その添加が開始時のかわりに発酵全体を通 して行われる場合に産生量を損うことなくかなり高くなることが観察され得る。 行われた全てのテストは、そのレベルが要求される値より低い発酵番号８，９及 び10並びにそのレベルが高い番号16を除き、示されるレベルにおける発酵全体を 通して可溶性ホスフェートの濃度を維持した。 連続培養において、培養物の適切な希釈により、その過程全体を通して粘度は 次第に減少し、これにより撹拌量を増やすことなく、より長期間、溶解酸素の濃 度が維持（40％超）されることが可能になり、菌糸体のフラグメンテーションを 避け、そしてクラブラン酸の生産期間の長期化を可能にする。栄養素及び水の添 加の結果として、設置容量の完全な充填が達成され、それは、適切な作動容量を 維持するためにブイヨンの連続的抽出を必要とする。この方法において、その過 程全体を通して培養培地内に可溶性ホスフェートを添加することによりその過程 を制御することにより、発酵サイクルの長期化及び全生産量の増加が達成され、 次に設置容量当りの生産収率を増加させる。 先の場合におけるような連続培養において、バッチにおいて、そ して半連続モードにおいて、可溶性ホスフェートの開始時の添加が行われる。こ の添加は、バッチ及び半連続培養において、150〜600 mg／ｌ、好ましくは最初 200〜400 mg／ｌのオーダー、同じオーダーのブイヨン中の次のレベルにおいて 、20〜150 mg／ｌがより長期間（50〜100 時間）、維持されるより一般に少い。 バッチ又は半連続発酵におけるような連続培養において、可溶性ホスフェート 塩もしくはカルシウム化合物又は他の有効な金属イオン封鎖剤の投入が、各々の 場合に必要とされる開始濃度を確立し、発酵の間、要求される濃度を維持するた めに行われる。全可溶性ホスフェート塩の添加は、半連続発酵に用いられるそれ と同様であるか、又はそれより少し多い。 更に、ブイヨンの粘度を 700cP未満の値に維持する目的で、32日間後から培養 培地に水が添加される。それは、古典的な系において加えられる栄養素の量を増 加させ、溶解酸素のレベルを40％超に維持し、そしてクラブラン酸の生産期間を 150〜170 時間、延長させることを許容する。 その過程の完了時に、古典的な培養では 0.9〜1.1 であるのに対して、1.5〜1 .6 の全希釈が一般に達成され、設置された幾何的容量を経済的に価値あるもの とする。その過程は、栄養素を発酵全体を通して連続的に開始培地に加えること により行われる。これらの栄養素は主に炭素源である。100時間後から、そのブ イヨンの連続的又は継続的な抽出が、容量を一定に維持し、培地の粘度を 700cP 未満にする目的で、１日当り発酵槽の容量の 2.5〜14％の割合で行われる。その 過程は、160〜170 時間まで延長され得る。 フェド・バッチ及び連続培養での、異なる栄養素及び可溶性ホスフェートの異 なるレベル又は投入量での実施例19〜25を表５に再現する。 詳説するために、以下の実施例を記載する。実施例１（比較例） 次の組成で接種培地を調製する： pHを 6.7に調節し、培地をフラスコ当り40mlの割合で 250mlエーレンマイカー フラスコ内に入れる。そのフラスコに栓をして20分間、121℃で減菌する。 これにより調製された培地に、Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグア ニジンでのストレプトマイセス・クラブリゲルスATCC27064 の変異のステップ及 び紫外光での変異のいくつかのステップにより得られたクラブラン酸を過剰産生 する変異株の胞子の懸濁液を接種する。この懸濁液は、増殖及び胞子形成を許容 することができる栄養培地で、斜面又はプレートから調製される。 接種後、その培地を５cmの偏心距離で250rpmでロタリーアジテーター上で25℃ で２日間、インキュベートする。 これにより調製された培養物を次の組成の５％発酵培地の割合で接種するのに 用いる。 培地のpHを 7.0に調整し、その培地をフラスコ当り30mlの割合で 250mlフラス コ内に入れる。そのフラスコに栓をし、121℃で20分間、減菌する。滅菌後、可 溶性ホスフェートをフラスコの１つにおいて測定し、100ml／ｌの値を得る。 実施例により、表１に示される発酵番号：１の結果を示すために、0.5mlの 0. 5％水酸化カルシウム溶液を各々のフラスコに加えた。その添加の後、フラスコ の１つにおいて、可溶性ホスフェートのレベルを再びアッセイし、18mg／ｌの値 を得た。そのレベルにおいて、前記発酵番号：１を行った。 これにより調製され、接種された発酵培地を５cmの偏心距離で250rpmでロータ リーアジテーター内で25℃でインキュベートする。96時間のインキュベーション において、得られたクラブラン酸の産生量は 420μｇ／ml（HPLC）であった。実施例２（比較例） その手順は実施例１の場合と同じであるが水酸化カルシウムの添加を行わない 。結果として、100mg／ｌの可溶性ホスフェートを有する培地中で発酵を行う。9 6時間のインキュベーションの後、クラ ブラン酸の産生量は 790μｇ／ml（HPLC）であった。（表１の発酵番号：２を参 照のこと）。実施例３ 手順は実施例１の場合と同じであるが、この場合において、水酸化カルシウム の添加を行わず、pHを調節する前に添加された0.12％のリン酸−カリウムが発酵 培地の調合に含まれる。減菌した後、１つのフラスコから可溶性ホスフェートを アッセイし、発酵が 900mg／ｌの可溶性ホスフェートを有する培地中で行われる ことを確立する。96時間のインキュベーションの後、クラブラン酸の産生量は22 10μｇ／ml（HPLC）であった（表１の発酵番号：３を参照のこと）。実施例４ 手順は実施例３と同じであるが、この場合、0.21％のリン酸−カリウムが調合 内に含まれる。可溶性ホスフェートを減菌後に１つのフラスコからアッセイし、 1580mg／ｌの可溶性ホスフェートを有する培地中で発酵が行われることを確立す る。この場合、全ホスフェートも測定し、表２に見られ得るように2380mg／ｌの 値を得た。96時間のインキュベーションにおいて、クラブラン酸の生産量は2240 μｇ／ml（HPLC）であった（表１の発酵番号：４を参照のこと）。実施例５ 手順は実施例３と同じであるが、この場合、0.4％のリン酸−カリウムが調合 内に含まれる。可溶性ホスフェートを減菌後に１つのフラスコからアッセイし、 3000mg／ｌの可溶性ホスフェートを有する培地中で発酵が行われることを確立す る。96時間のインキュベーションにおいて、クラブラン酸の生産量は1750μｇ／ ml（HPLC）であった（表１の発酵番号：５を参照のこと）。実施例６（比較例） 手順は実施例３の場合と同じであるが、この場合、0.95％のリン酸−カリウム が調合内に含まれる。可溶性ホスフェートを減菌後に１つのフラスコからアッセ イし、7000mg／ｌの可溶性ホスフェートを有する培地中で発酵が行われることを 確立する。96時間のインキュベーションにおいて、クラブラン酸の生産量は 780 μｇ／ml（HPLC）であった（表１の発酵番号：６を参照のこと）。実施例７（比較例） 手順は実施例３と同じであるが、この場合、0.245％の三塩基リン酸カルシウ ムが調合内に含まれる（リン酸−カリウムは含まれない）。可溶性ホスフェート を減菌後に１つのフラスコからアッセイし、230mg／ｌの可溶性ホスフェートの 結果を得る。この場合、全ホスフェートも測定し、2265mg／ｌの値を得た（表３ の発酵番号：７を参照のこと）。96時間のインキュベーションの後、クラブラン 酸の生産量は 920μｇ／ml（HPLC）であった。実施例８〜18 （表４を参照のこと） 実施例１に記載されるのと同じ組成の接種培地を調製し、500mlの培地で2000m lエーレンマイヤーフラスコ内に入れる。そのフラスコに栓をして、20分間、121 ℃で減菌する。 接種を実施例１に用いられるのと同様の胞子懸濁液で行う場合、培地を５cmの 偏心距離で250rpmでロータリーアジテーター上で25℃で２日間、インキュベート する。 この培地 400mlを取り、次の組成の 150リッターのタンクに接種するのに用い る。 培地のpHを 7.3に調節し、その培地を20分間、121℃で減菌する。115rpmの撹 拌、0.5ｖ／ｖ／分のエレーション及び１kg／cm²のひ面体圧で、約30時間、28℃ でインキュベーションを行う。 先の条件下でインキュベートされた培養物45リッターを取り、次の組成の 450 リッターのタンクに移す。 培地のpHを 7.0に調節し、その培地を20分間、121℃で減菌する。減菌後、可 溶性ホスフェートを測定し、この場合、200mg／ｌ〜300 mg／ｌの結果となる。 必要に応じて、異なる開始濃度を得る目的で、この値を適切な容量の１％リン酸 −カリウム溶液を加えることにより（実施例10，11，12，14，15及び16）、又は カルシウム化合物で（実施例８、適切な容量のCa(OH)₂で溶液を加えたもの）調 整する。可溶性ホスフェートを調節する場合、接種培養物45リッターの移動を行 い、発酵を開始する。後者を25℃の一定温度、115rpm、最初の24時間 0.5ｖ／ｖ ／分、25時間から発酵の終りまで 1.5ｖ／ｖ／分を維持しながら、0.5kg／cm²の ひ面体圧下で行う。 発酵全体を通して異なる濃度の可溶性ホスフェートを、異なる容量の減菌１％ リン酸−カリウム溶液を加えることにより得た（実施例13〜18）。 6.8〜7.2 の間に維持するためにpHの自動制御を行う。次の添加 も行う： 大豆油：10〜120 時間に 100ml／ｈ 33％グリセロール：32〜120 時間に400 ml／ｈ １％リン酸−カリウム：０〜25時間に 400〜1400ml／ｈ及び 25〜50時間に1500〜5000ml／ｈ 120時間のインキュベーションの後、クラブラン酸の割合は表４に従って、990 〜4020μｇ／mlの間で種々である。実施例19 培地の調製及び発酵条件の確立を、実施例８〜18（表４）の通りに行うが、34 ｇ／ｌの濃度のデキストリンを開始サイクルに含めた。グリセロールの添加を省 略し、Weichol-92（Industria QuimicaLassemにより製造された60％のオレイン 酸を含む合成トリグリセリド）及び１％リン酸−カリウムのみを次の添加プログ ラムで供給した。 Weichol-92：10〜120 時間に 100ml／ｈ リン酸−カリウム（１％）：０〜25時間に 400〜1400ml／ｈ及び 25〜50時間に1500〜5000ml／ｈ実施例20 手順は実施例19と同じであるが、合成トリグリセリドWeichol-92の添加を大豆 油のそれと置換する。実施例21 手順は実施例19と同じであるが、発酵を 172時間まで延長し、減菌後の発酵槽 の開始容量に対して24時間毎に 2.5％のブイヨン割合で、100時間の発酵後から 全ブイヨンの抽出を行う連続システムを確立する。 グリセロール（33％）、Priolube（Unichenta により製造されたグリセリルト リオレエート）及びリン酸−カリウム（１％）の添加 を次のプログラムに従って、行った。 Priolube：10時間〜最後に 100ml／ｈ Glycerol（33％）：32時間〜最後に 400ml／ｈ リン酸−カリウム（１％）：０〜25時間に 400〜1400ml／ｈ及び 25〜50時間に1500〜5000ml／ｈ実施例22 手順は実施例21に従うが、発酵を 150時間まで延長し、ブイヨンの抽出を24時 間毎に９％の割合で行う。添加は次のプログラムに従って修正する。 Priolube：10時間〜100 時間に 100ml／ｈ 100 時間〜最後に 200ml／ｈ グリセロール（33％）：32時間〜 100時間に 420ml／ｈ 100 時間〜最後に 780ml／ｈ リン酸−カリウム（１％）：０〜25時間に 400〜1400ml／ｈ 25〜50時間に1500〜5000ml／ｈ 50時間〜最後に 300ml／ｈ 減菌水：32〜100 時間に 312ml／ｈ 100 時間〜最後に 625ml／ｈ実施例23 手順は実施例22に従う。発酵を、24時間毎に14％の抽出と共に、172時間まで 延長する。減菌水の添加のプログラムも、粘度レベルを低く維持するために含ま れる。 Priolube：10時間〜100 時間に 130ml／ｈ 100 時間〜最後に 240ml／ｈ グリセロール（33％）：32時間〜 100時間に 515ml／ｈ 100 時間〜最後に 960ml／ｈ リン酸−カリウム（１％）：０〜25時間に 400〜1400ml／ｈ 25〜50時間に1500〜5000ml／ｈ 50時間〜最後に 300ml／ｈ 減菌水：32〜100 時間に 630ml／ｈ 100 時間〜最後に1260ml／ｈ実施例24 手順は実施例23の通りであるが、開始発酵培地は全てのその開始材料に対して 30％だけ増加させる。発酵を 155時間まで行い、抽出を24時間毎に14％で行う。 用いた添加のプログラムは次の通りである。 Priolube：10時間〜100 時間に 130ml／ｈ 100 時間〜最後に 240ml／ｈ グリセロール（33％）：32時間〜 100時間に 515ml／ｈ 100 時間〜最後に 960ml／ｈ リン酸−カリウム（１％）：０〜25時間に 400〜1400ml／ｈ 25〜50時間に1500〜5000ml／ｈ 50時間〜最後に 300ml／ｈ 減菌水：32〜100 時間に 630ml／ｈ 100 時間〜最後に1260ml／ｈ実施例25 手順は実施例21の通りである。発酵を 150時間まで延長し、24時間毎に９％の 割合で抽出を行う。グリセロールの抽出を完全に省略し、トリグリセリドPriolu beの添加量を増加させる。ホスフェート及び減菌水の添加量は実施例22のそれと 同一である。Priolubeの添加は次のプログラムに従う。 Priolube：10時間〜100 時間に 320ml／ｈ 100 時間〜最後に 590ml／ｈ

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，Ｉ Ｓ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，Ｓ Ｄ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ロペス ニエト，マニュエル イエズス スペイン国，エー−24010 リオン，カリ ェ マルケス デ サンティラーナ 23 (72)発明者 コラドス デ ラ ビエヤ，アルフォンソ フアン スペイン国，エー−24010 リオン，カリ ェ バルカルセル ３−テルセイロセー (72)発明者 ビタレール アルバ，アレヤンドロ スペイン国，エー−24001 リオン，カリ ェ カルメン ３

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．バッチ、半連続又は連続培養において、エレーション及び撹拌を伴う液中 発酵において、ストレプトマイセス・クラブリゲルス（Streptomyces clavulige rus ）ATCC27064 又はそれから得られた変異体を培養することにより、クラブラ ン酸及び／又はその塩を生産するための方法であって、可溶性ホスフェートの濃 度が指定値内に、開始時に固定され、及び／又は発酵全体を通して維持されるこ とを特徴とする方法。 ２．バッチ培養において、発酵の開始時においてその培地中に存在する可溶性 ホスフェートの確立された濃度が、500〜4000mg／ｌの間の範囲内に固定される ことを特徴とする請求項１に記載の方法。 ３．半連続又は連続培養において、発酵の開始時においてその培地中に存在す る可溶性ホスフェートの確立された濃度が 150〜600mg／ｌの間の範囲内に固定 され、及び／又は発酵全体を通して、指定範囲、好ましくは20〜150 mg／ｌの範 囲内に維持されることを特徴とする請求項１に記載の方法。 ４．培養培地中に存在する可溶性ホスフェートの濃度が、開始時に固定され、 及び／又は可溶性ホスフェートイオンをそのいずれかの形態において前記培養培 地に添加することにより発酵全体を通して維持されることを特徴とする請求項１ 〜３のいずれかに記載の方法。 ５．培養培地中に存在する可溶性ホスフェートの濃度が、開始時において固定 され、及び／又は前記可溶性ホスフェートを、それが要求される限界を超える場 合に沈殿させることにより発酵全体を通して維持されることを特徴とする請求項 １〜３のいずれかに記載の 方法。 ６．前記可溶性ホスフェートが、カルシウム化合物を前記培養培地に添加する ことにより沈殿されることを特徴とする請求項５に記載の方法。 ７．１以上の天然又は合成トリグリセリドからなり、発酵の開始時及び／又は それ全体を通して添加される炭素源が用いられることを特徴とする先の請求項の いずれか一に記載の方法。 ８．発酵の開始時及び／又はそれ全体を通して添加される１以上の天然又は合 成トリグリセリドが炭素源として排他的に用いられることを特徴とする先の請求 項のいずれか一に記載の方法。 ９．前記発酵が20〜40℃の温度で行われることを特徴とする先の請求項のいず れか一に記載の方法。 10．前記発酵が22〜30℃の温度で行われることを特徴とする先の請求項のいず れか一に記載の方法。