JP2001503244A - クラブラン酸の調製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 炭素及び窒素の同化源を含む発酵培養液中におけるストレプトマイセス属のクラブラン酸産生種の発酵を含むクラブラン酸を調製するための方法であって、発酵培養液中のリンの濃度は０．１５重量／容量％未満である方法。

Description

【発明の詳細な説明】 クラブラン酸の調製法 本発明はクラブラン酸を調製するための方法に関する。 クラブラン酸は、（２Ｒ，５Ｒ，Ｚ）−３０（２−ヒドロキシエチリデン）− ７−オキソ−４−オキサ−１−アザビシクロ［３．２．０］ヘプタン−２−カル ボン酸の一般名である。クラブラン酸並びにそのアルカリ金属塩及びエステルは 、グラム陽性並びにグラム陰性の微生物によって酸性されるベータラクタマーゼ の阻害剤としての活性を有する。ベータラクタマーゼを阻害することに加え、ク ラブラン酸及びそのアルカリ金属塩はペニシリン系抗生物質及びセファロスポリ ン系抗生物質との併用による相乗作用を有する。クラブラン酸及びその塩は、ベ ータラクタム系抗生物質の不活性化を阻止するために薬剤調製物において使用さ れる。市販の製剤は、アモキシシリン三水和物とともにクラブラン酸カリウムを 含む。クラブラン酸カリウムは、遊離酸又は他の塩よりも安定である。 クラブラン酸は、例えば、エス．クラビュリジエラスＮＲＲＬ３５８５(S.cla vuligerus NRRL 3585)、エス．ジュモンジネンシスＮＲＲＬ５７４１(S.jumonji nensis NRRL 5741)、エス．カツラハマナスＩＦＯ１３７１６(S.katsurahamanus IFO 13716)及びストレプトマイセスｓｐ．Ｐ６６２１ ＦＥＲＭＰ２８０４（St reptomyces sp.P6621 FERM P2804）等のストレプトマイセス属の菌種に代表され る微生物の発酵によって調製される。発酵によって得られた水性培養液は、英国 特許第１５０８９７７号に開示されている濾過及びクロマトグラフィーによる精 製等の従来の方法に従って精製及び濃縮される。同精製及び濃縮は、溶媒中にク ラブラン酸粗製物を含む溶液を得るために有機溶媒を用いて水溶液を抽出する前 に行われる。 国際公開公報ＷＯ９５／２３８７０及びＷＯ９６／２８４５２は、クラブラン 酸の精製及びクラブラン酸カリウムの調製のための改良された大量生産の方法を 開示している。抗生物質産生微生物の成長は２つの時期を含み、即ち、バイオマ スが生成される増殖期（growth phase）と、それに続く成長が起こらない定常期 である。抗生物質のような二次代謝物は通常、定常期に生成される。 フェドバッチ発酵法（Fed batch fermentation process）は、抗生物質の産生 においては公知の方法であり、クラブラン酸の生産には好ましいものである。発 酵培養液中の窒素及び炭素同化源を所望のレベルに調節及び維持することは、リ ージェーエス（Lee J S）等のKor．Jour．Microbiol.、１５刊、１号、２１〜２ ９頁（１９７８年）に開示されており、同文献は、発酵漕内の微生物の要求に応 じて同化窒素源及び同化炭素源の添加を調節してペニシリンを調製する改良され た発酵法を記載している。リリージー（Lilley G）等のJ．Chem．Tech．Biotech nol.、３１刊、１２７〜１３４頁（１９８１年）には、ストレプトマイセス属の 種による抗生物質の生産が同化窒素源及び同化炭素源並びにリン源の濃度を変更 することにより調節されることが記載されている。例えば、発酵漕におけるチエ ナマイシンの生産はリンの濃度がゼロに近づくまでは開始しない。欧州特許第８ ２５２２号は、エス．クラビュリジェラスＮＲＲＬ３５８５発酵物中への同化炭 素源の連続的又は間欠的な添加を使用することを開示している。アンモニアの量 を調節することは、国際公開公報ＷＯ９６／１８７４３に開示されている。連続 的な発酵法はクラブラン酸の製造においては開示されていない。 本発明に従うクラブラン酸を生産する方法は、炭素及び窒素の同化源を含む発 酵培養液中におけるストレプトマイセス属のクラブラン酸産生種の発酵を含み、 同方法において、発酵培養液中のリンの濃度は０．１５重量／容量％未満である 。 リンの濃度は、リンの濃度を減少可能にできた後の増殖期において０．１５重 量／容量％の限界値以下に維持されることが好ましい。５〜６日間続く典型的な クラブラン酸発酵のための増殖期は、約４０時間で完了する。同化可能なリン源 は、例えば、リン酸ナトリウム若しくはリン酸カリウム、リン酸二水素ナトリウ ム若しくはリン酸二水素カリウム、リン酸水素二ナトリウム若しくはリン酸水素 二カリウム又はそれらの混合物のようなリン酸塩として存在する。本明細書に引 用されたリンの濃度は、存在する同化可能なリン化合物の量に相当するリンの重 量／容量％として決定される。 リンの濃度は、好ましくは０．００１５〜０．１５重量／容量％、より好まし くは０．００２〜０．０１５重量／容量％である。リンの濃度は低い値に減少可 能であることが好ましく、４０時間の発酵によりゼロとなることが好ましい。 本発明に従う同化可能なリンの量を調節することにより、極めて高収率のクラ ブラン酸が得られる。 同化可能な炭素源の濃度は、使用されるストレプトマイセス属の菌株の特徴に 応じて、通常の試行により選択される。開始時の培地中のグリセロール、トリオ レイン酸グリセロール又はコーンスターチのような炭素源の割合は５重量／容量 ％より大きく、通常のフェドバッチ法に従う発酵時に更なる量の炭素源が添加さ れる。 同化可能な窒素は、開始培地中のタンパク質性の物質によって供給される。こ れに代えて、又は付随的に、アンモニアを発酵漕に導入することもできる。アン モニアは、発酵時における発酵培養液のｐＨを調節するためにも使用された。し かしながら、アンモニアの使用は、唯一の同化可能な窒素源としても、ｐＨ調節 用にも望ましくないことが発明者らによって明らかにされた。高濃度のアンモニ アは微生物に有害であり、ｐＨが低すぎると、クラブラン酸の生合成の効果を低 減する。従って、例えば、大豆粉（soy bean flour）のような同化可能な窒素源 を開始時の培地に加え、硫酸アンモニウムのようなアンモニウム塩を更なる窒素 源を供給する必要がある場合に発酵時に加えられることが好ましい。 本発明の好ましい態様に従って、窒素を含まない化合物、好ましくは水酸化ア ンモニウムがｐＨの調節に使用される。この場合、アンモニアを唯一の窒素源及 びｐＨ調節剤として使用した場合と比べ、バイオマスのレベルにおける減少が遅 くなる。従来の発酵と比較した結果を図１に示す。バイオマスの量に比例する粘 度を、従来の発酵（破線）及び本発明に従う発酵（実線）の場合について示す。 同化可能な窒素源は、例えば、大豆粉又は綿実粉（cotton seed flour）のよ う な粉（flour）である。同化可能な窒素の量は、好ましくは０．５〜１５重量／ 容量％、より好ましくは１．５〜７．５重量／容量％である。窒素の量は、５％ より多いことが好ましい。 本発明は、ストレプトマイセス属の種である、エス．クラビュリジェラスＮＲ ＲＬ３５８５、エス．ジュモンジネンシスＮＲＲＬ５７４１及びエス．カツラハ マナスＩＦＯ１３７１６、特にストレプトマイセスｓｐ．Ｐ６６２１ ＦＥＲＭ Ｐ２８０４の発酵に関する。本発明は、エス．クラビュリジエラスからのクラブ ラン酸の改善された収率を得る。本発明は、特に、１０⁴ｌを超えない培養液の 量、好ましくは５×１０⁴ｌの量である大量生産のスケールにおける発酵に関す る特殊な適用を見いだした。 発酵培養液は、発明者らの国際公開公報ＷＯ９５／２３８７０における開示又 は高純度のクラブラン酸カリウムが調製される公知の方法にて処理される。 本発明は、以下に示す例によって更に記載されるが、この例示は、本発明をそ れのみに限定するものではない。 例１ Ａ）ストレプトマイセスＳＰ．Ｐ６６２１ ＦＥＲＭ Ｐ２８０４の培養 菌種の選択及び維持 ストレプトマイセスｓｐ．ＰＰ６６２１ ＦＥＲＭ Ｐ２８０４の最も生産的な クローンは選択法により得られた。この微生物の最も生産的な培養物が保存され 、更に、新たな選択のサイクル源として使用された。 ストレプトマイセスｓｐ．ＰＰ６６２１ ＦＥＲＭ Ｐ２８０４のコロニーは、 無菌水（２ｃｍ³）の入った無菌ポッター（potter）中に無菌的に移され、均一 化された。菌糸体のフラグメントは、寒天斜面培地に移され、２５℃のサーモス タット中にて熟成するまで（約１０〜１４日）インキュベートされた。 ８〜１０日後、寒天の表面は灰緑色の細菌の菌糸体により覆われた。表面から 胞子を掻き取り、接種用栄養培地（seed vegetative medium）内に無菌的に植 え付け、２５０ｒｐｍ及び２５°±１℃にて、２４時間、振とう器にてインキュ ベートした。 寒天斜面培地から得られた胞子の均一な懸濁液は、スキムミルク（保護培地と して使用される）中にて、２ヶ月以上保存される。 栄養期（vegetative stage）が終了した後、培養物の一部は発酵培地中へ無菌 的に移され、回転振とう器にて９６時間インキュベートされた。最終的な発酵状 態となった後に、クラブラン酸の量が分析された。最も高い収率を示す培養物が 発酵槽における実験接種材料として使用された。 全工程は無菌状態にて実施された。 菌株は、寒天斜面培地では最大４℃にて４週間保存され、スキムミルク中では 、同様の条件にて２ヶ月保存され、凍結乾燥された菌株は４℃にて、数年間保存 され得る。発酵漕中に接種される菌株の選択を行うための培地の組成 斜面及びペトリ皿に対する培地 組成物は、従来法に従って調製された。微量元素 ^* 菌株選択のための栄養培地 菌株選択のための発酵培地 実験接種材料の調製 実験接種材料調製用の培養物の起源は、寒天斜面培地から培養された。選択さ れた斜面培地の寒天は無菌水（１０ｃｍ³）で無菌的に満たされ、胞子が掻き取 られ、無菌ポッター中にて均一化された。胞子の溶液は実験接種材料として使用 された。前接種（pre-seed）タンク中での栄養相 前接種タンクのための培地 前接種の容量＝５００ｌ 培地の容量＝３５０ｌ ^*エストールの代わりに大豆粉を使用することもできる。 接種材料は前接種タンク中にて滅菌された培地中に移され、無菌空気により２ ８℃に冷却された。栄養相は２８±１℃の温度、０．３バールの圧力、無菌空気 を用いた通気及び連続した混合の条件下において５０〜７０時間継続した。前接種タンクでの成長パラメータ 単位の説明： ｐＨ＝サンプルのｐＨ値 ＰＭＶ％＝サンプル中の培養物の容量％ 脱色＝メチレン染料の脱色に要する時間接種発酵漕における栄養相 接種発酵漕のための培地 接種発酵漕の容量＝７５００ ｌ 培地の容量＝４５００ ｌ ^*エストールの代わりに大豆粉を使用することもできる。 前接種タンクからの栄養相は、加圧下において、接種発酵漕中にて滅菌された 培地中に移され、無菌空気にて２８℃まで冷却された。空気は、孔径０．２μｍ のフィルタにて無菌化された。 栄養相は、２８±１℃、０．３バールの圧力、無菌空気を用いた通気及び連続 した混合の条件下において１０〜２０時間継続した。 成長は、ｐＨ、ＰＭＶ％、メチレンの脱色の分析及びサンプルの顕微鏡試験に よりモニタリングされた。前接種タンク中の成長パラメータ 単位の説明： ｐＨ＝サンプルのｐＨ値 ＰＭＶ％＝サンプル中の培養物の容量％ 脱色＝メチレン染料の脱色に要する時間 Ｂ）ストレプトマイセスＳＰ．Ｐ６６２１ ＦＥＲＭ Ｐ ２８０４の発酵漕中に おけるバッチ発酵発酵漕の培地 発酵漕の容量＝９００００ ｌ 培地の容量＝６００００ ｌ 単位の説明： −エストールはトリオレイン酸グリセロールの一般名である（プリオルブ１４３ ５はドイツ連邦共和国ウニヘム社（Unichem GmbH）の登録商標名） −シンパロニック（英国ＩＣＩ社の登録商標名）は、プロピレングリコール消泡 剤である。^* エストールの代わりに大豆粉を使用することもできる。 接種発酵漕からの成長の栄養相におけるストレプトマイセスｓｐ．ＰＰ６６２ １ ＦＥＲＭ Ｐ ２８０４の培養物４７００ｌを、攪拌と、孔径０．２μｍのフ ィルタを通過させた無菌空気の送達とが可能な設備を備えた容積が９００００ｌ のステンレススチール製の発酵漕中の無菌開始培地（６００００ｌ）に、無菌的 な移動により接種した。発酵培地及び全ての入口管は滅菌されるとともに、無菌 空気により２４℃まで冷却された。接種発酵漕からの発酵相は２４℃〜２５℃、 ０．３バールに維持された。発酵の全工程中において、発酵液は混合及び通気さ れ、培地のｐＨは、２５％水酸化アンモニウム水溶液を添加することにより、６ ．８〜６．９に維持された。発酵は９６時間続けられ、得られたクラブラン酸の 濃度は、３５８０ｍｇ／ｌであった。 ストレプトマイセスｓｐ．ＰＰ６６２１ ＦＥＲＭ Ｐ ２８０４の発酵工程時 において、リン源及び同化可能な窒素源（５０００ｌの水中に５００ｋｇの大豆 粉及び２５％水酸化アンモニウム水溶液）は以下のように添加された：発酵培養液中におけるリン同化源及び窒素同化源の濃度 ５１時間の発酵の後のリンの濃度は検出限界以下であった。 培養増殖の初期の時間におけるｐＨ値は、ほぼ７．５に上昇した。この間、リ ンは消費され、クラブラン酸が生成し始めた。それによりｐＨ値が減少するので 、培地におけるｐＨレベルを最適値に維持するためには培地のｐＨの調節が必要 で あった。 例２ 同化可能な窒素源としての硫酸アンモニウム及びｐＨ調節剤としての水酸化ナ トリウムを使用することによる発酵の栄養相の延長 例１Ｂと同様の成分比にて使用される培地を、２つのステンレススチール製の 発酵漕（各々の容量が５００ｌ）中に置いた。第１の発酵漕中における発酵は例 １Ｂに記載されたものと同一の条件にて行われた。第２の発酵漕中における発酵 条件は、接種後４０〜６０時間の間に発酵培養液に９ｃｍ³／ｌの割合にて１１ ％硫酸アンモニウム水溶液が加えられる点のみが例１Ｂに記載された条件と異な る。ｐＨは、水酸化ナトリウムによって所望のレベルに維持された。６０時間後 に、窒素源の添加を停止した。バイオマスの量に比例する発酵培養液の粘度は、 発酵工程時に分析された。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】平成１０年５月５日（１９９８．５．５） 【補正内容】 請求の範囲 １．炭素及び窒素の同化源を含む発酵培養液中におけるストレプトマイセス属の クラブラン酸産生種の発酵を含むクラブラン酸を生産するための方法であって、 同化可能な窒素の開始濃度が５％より大きく、かつ、発酵培養液中の同化可能な リンの濃度は増殖期において０．１５重量／容量％未満であり、同リンの濃度は 増殖期の終了後に減少可能である方法。 ２．リンの濃度は４０時間の発酵時間の後に減少可能である請求項１に記載の方 法。 ３．リンの濃度は、発酵時間が４０時間までは、０．００１５〜０．１５重量／ 容量％である請求項１あるいは２に記載の方法。 ４．リンの濃度が０．００２〜０．０５重量／容量％である請求項３に記載の方 法。 ５．４０時間の発酵時間後には、同化可能なリンを添加しない請求項１乃至４の いずれか１項に記載の方法。 ６．同化可能な窒素源がアンモニアを含まない請求項１乃至５のいずれか１項に 記載の方法。 ７．唯一の同化可能な窒素源がアンモニアではない請求項６に記載の方法。 ８．同化可能な窒素源が粉である請求項１乃至７のいずれか１項に記載の方法。 ９．同化可能な窒素源が硫酸アンモニウムである請求項１乃至８のいずれか１項 に記載の方法。 １０．同化可能な窒素源の濃度が０．５〜１５重量／容量％である請求項１乃至 ９のいずれか１項に記載の方法。 １１．同化可能なリン源はリン酸ナトリウム若しくはリン酸カリウム、リン酸二 水素ナトリウム若しくはリン酸二水素カリウム、リン酸水素ニナトリウム若しく はリン酸水素二カリウム、又はそれらの混合物である請求項１乃至１０のいずれ か１項に記載の方法。 １２．微生物がストレプトマイセスクラビュリジェラス、ストレプトマイセスジ ュモンジネンシス、ストレプトマイセスカツラハマナス又はストレプトマイセス ｓｐ．Ｐ６６２１である請求項１乃至１１のいずれか１項に記載の方法。 １３．前記方法は、フェドバッチ法であるか、又は同化可能なリン源を間欠的若 しくは連続的に加える連続法である請求項１乃至１２のいずれか１項に記載の方 法。 １４．発酵培養液の容量が１０⁴ｌより大きい請求項１乃至１３のいずれか１項 に記載の方法。 １５．容量が５×１０⁴ｌである請求項１４に記載の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ， ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ， ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，Ｎ Ｏ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ， ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．炭素及び窒素の同化源を含む発酵培養液中におけるストレプトマイセス属の クラブラン酸産生種の発酵を含むクラブラン酸を生産するための方法であって、 発酵培養液中の同化可能なリンの濃度は０．１５重量／容量％未満である方法。 ２．リンの濃度は増殖期において０．１５重量／容量％の限界値以下に維持され る請求項１に記載の方法。 ３．リンの濃度は増殖期の終了後に減少可能である請求項２に記載の方法。 ４．リンの濃度は４０時間の発酵時間の後に減少可能である請求項１乃至３のい ずれか１項に記載の方法。 ５．リンの濃度は、発酵時間が４０時間までは、０．００１５〜０．１５重量／ 容量％である請求項１乃至４のいずれか１項に記載の方法。 ６．リンの濃度が０．００２〜０．０５重量／容量％である請求項５に記載の方 法。 ７．４０時間の発酵時間後には、同化可能なリンを添加しない請求項１乃至６の いずれか１項に記載の方法。 ８．同化可能な窒素源がアンモニアを含まない請求項１乃至７のいずれか１項に 記載の方法。 ９．唯一の同化可能な窒素源がアンモニアではない請求項８に記載の方法。 １０．同化可能な窒素源が粉である請求項１乃至９のいずれか１項に記載の方法 。 １１．同化可能な窒素源が硫酸アンモニウムである請求項１乃至１０のいずれか １項に記載の方法。 １２．同化可能な窒素源の濃度が０．５〜１５重量／容量％である請求項１乃至 １１のいずれか１項に記載の方法。 １３．同化可能な窒素源の開始濃度が５重量／容量％より大きい請求項１乃至１ ２のいずれか１項に記載の方法。 １４．同化可能なリン源はリン酸ナトリウム若しくはリン酸カリウム、リン酸二 水素ナトリウム若しくはリン酸二水素カリウム、リン酸水素二ナトリウム若しく はリン酸水素二カリウム、又はそれらの混合物である請求項１乃至１３のいずれ か１項に記載の方法。 １５．微生物がストレプトマイセスクラビュリジェラス、ストレプトマイセスジ ュモンジネンシス、ストレプトマイセスカツラハマナス又はストレプトマイセス ｓｐ．Ｐ６６２１である請求項１乃至１４のいずれか１項に記載の方法。 １６．前記方法は、フェドバッチ法であるか、又は同化可能なリン源を間欠的若 しくは連続的に加える連続法である請求項１乃至１５のいずれか１項に記載の方 法。 １７．発酵培養液の容量が１０⁴ｌより大きい請求項１乃至１６のいずれか１項 に記載の方法。 １８．容量が５×１０⁴ｌである請求項１７に記載の方法。