PL185620B1

PL185620B1 - Sposób wytwarzania kwasu klawulanowego

Info

Publication number: PL185620B1
Application number: PL97329291A
Authority: PL
Inventors: Sasa Kranjc; Artur Racman
Original assignee: Lek Pharmaceuticals Dd
Priority date: 1996-04-12
Filing date: 1997-04-11
Publication date: 2003-06-30
Also published as: RU2188868C2; WO1997039137A1; CA2251596A1; EP0906446A1; AU2516497A; PL329291A1; JP2001503244A; SI9600120A; ZA973139B

Abstract

1. Sposób wytwarzania kwasu klawulanowego lub jego soli, przez fermentacje gatunku Streptomyces produkujacego kwas klawulanowy w brzeczce fermentacyjnej zawierajacej przyswajalne zródla wegla i azotu oraz zródlo fosforu, znamienny tym, ze w fazie wzro- stowej fermentacji dodaje sie dalsze zródlo fosforu utrzymujac stezenie fosforu w zakresie 0,0015% do 0,15% i ewentualnie w trakcie fermentacji dodaje sie dalsze zródla przyswa- jalnego wegla i azotu, po czym z brzeczki fermentacyjnej wyodrebnia sie kwas klawula- nowy lub jego sól. PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania kwasu klawulanowego.

Kwas klawulanowy jest powszechnie przyjętą nazwą dla kwasu (2R,5R,Z)-30(2hydroksyetylideno)-7-okso-4-oksa-1-azabicyklo-[3.2.0]heptano-2-karboksylowego. Kwas ten i jego sole z metalami alkalicznymi oraz estry stanowią aktywne inhibitory beta laktamazy

185 620 produkowanej przez niektóre mikroorganizmy Gram dodatnie oraz Gram ujemne. Poza inhibitowaniem beta laktamazy, kwas klawulanowy i jego sole z metalami alkalicznymi mają również działanie synergiczne z antybiotykami penicylinowymi i cefalosporynowymi. Kwas klawulanowy i jego sole są stosowane w preparatach farmaceutycznych w celu zapobiegania dezaktywacji antybiotyków beta laktamowych. Preparaty dostępne w handlu zawierają klawulanian potasu w połączeniu z trójwodzianem amoksycyliny. Klawulanian potasu jest bardziej trwały niż womy kwas lub inne sole.

Kwas klawulanowy otrzymuje się przez fermentację mikroorganizmów takich jak szczepy Streptomyces, na przykład S.clavuligerus NRRL 3585, S.jumonjinensis NRRL 5741 i S.katsurahamanus IFO 13716 oraz Streptomyces sp.P6621 KERM P2804. Wodne hodowle otrzymane po fermentacji oczyszcza się i zatęża zgodnie ze znanymi sposobami, na przykład przez filtrację i oczyszczanie chromatograficzne, jak opisano w opisie patentowym GB 1508977, a następnie ekstrakcję wodnego roztworu rozpuszczalnikiem organicznym, otrzymując roztwór zanieczyszczonego kwasu klawulanowego w rozpuszczalniku.

W publikacjach W095/23870 i W096/28452 ujawniono ulepszony sposób przemysłowy oczyszczania kwasu klawulanowego i wytwarzania klawulanianu potasu. Rozwój mikroorganizmu produkującego antybiotyk może obejmować dwie fazy, fazę wzrostową, w której produkowana jest biomasa i następnie fazę stacjonarną, podczas której nie następuje wzrost. Metabolity wtórne takie jak antybiotyki zwykle produkowane są podczas fazy stacjonarnej.

Procesy produkcyjne zasilane składnikami pożywek podczas fermentacji są dobrze znane w produkcji antybiotyków i były uznane za korzystne przy wytwarzaniu kwasu klawulanowego. Kontrola i utrzymanie pożądanych poziomów źródeł przyswajalnego azotu i węgla w brzeczce fermentacyjnej są dobrze zilustrowane przez J. S. Lee i wsp., Kor. Jour. Microbiol. 1978, tom 15, nr 1, str. 21-29, który opisał ulepszenie procesu fermentacyjnego w celu wytwarzania penicyliny, poprzez regulację dodawania źródeł przyswajalnego azotu i węgla zgodnie z potrzebami mikroorganizmów w fermentorze. G.Lilley i wsp. J.Chem.Tech. Biotechnol. 1981, tom 31, str. 127-134 wykazali, że produkcja antybiotyków przy użyciu gatunku Streptomyces może być regulowana przez zmianę stężenia źródeł przyswajalnego azotu i węgla oraz źródła fosforu. Na przykład, wytwarzanie tienamycyny w fermentorze nie rozpocznie się dopóki stężenie fosforu nie zbliży się do zera. W opisie EP 182522 przedstawiono zastosowanie ciągłego lub przerywanego dodawania źródła przyswajalnego węgla podczas fermentacji S. Clavuligerus NRRL 3585. Regulowanie ilości amoniaku ujawniono w WO 96/18743. Jednak ciągły proces fermentacji nie został ujawniony w celu wytwarzania kwasu klawulanowego.

Wynalazek bazuje na nieoczekiwanym stwierdzeniu, że utrzymywanie stężenia fosforu podczas fermentacji gatunku Streptomyces produkującego kwas klawulanowy w brzeczce fermentacyjnej zawierającej źródła przyswajalnego źródła węgla i azotu w pewnych określonych i regulowanych granicach wybitnie zwiększa wydajność kwasu klawulanowego w procesie.

Sposób wytwarzania kwasu klawulanowego lub jego soli, przez fermentację gatunku Streptomyces produkującego kwas klawulanowy w brzeczce fermentacyjnej zawierającej przyswajalne źródła węgla i azotu oraz źródło fosforu, polega na tym, że w fazie wzrostowej fermentacji dodaje dalsze źródło fosforu utrzymując stężenie fosforu w zakresie 0,0015% do 0,15% i ewentualnie w trakcie fermentacji dodaje się dalsze źródła przyswajalnego węgla i azotu, po czym z brzeczki fermentacyjnej wyodrębnia się kwas klawulanowy lub jego sól.

Proces ten korzystnie prowadzi się w sposób periodyczny, przy ciągłym lub nieciągłym dodawaniu źródła fosforu.

Podczas całej fazy wzrostowej reguluje się poziom fosforu, zaś po ustaniu fazy wzrostowej pozwala się na obniżenie stężenia fosforu, zazwyczaj następuje to po 40 godzinnym okresie fermentacji. Przez okres fermentacji do 40 godziny utrzymuje się stężenie fosforu w zakresie 0,0015% do 0,15%, korzystnie w zakresie 0,002 do 0,15%. Po 40 godzinnym okresie fermentacji zaprzestaje się dodawania źródła fosforu.

185 620

Jako źródło fosforu stosuje się fosforan sodu, fosforan potasu, dwuwodorofosforan sodu, dwuwodorofosforan potasu, wodorofosforan sodu, wodorofosforan potasu lub ich mieszaniny, korzystnie dwuwodorofosforan sodu w stężeniu około 0,008%.

W przypadku stwierdzenia niedoboru źródła węgla lub azotu w tracie fermentacji można uzupełnić te braki poprzez dodanie przyswajalnego źródła węgla i/lub źródła azotu w trakcie fermentacji.

Stężenie źródła przyswajalnego węgla można dobrać przez przeprowadzenie rutynowych prób zależnie od charakterystyki użytego szczepu Streptomyces. Jako źródło węgla korzystnie stosuje się trioleinian gliceryny, glicerynę i skrobię kukurydzianą. Udział źródła węgla takiego jak gliceryna, trioleinian gliceryny lub skrobia kukurydziana w materiale wyjściowym może być wyższy od 5% a dalsze ilości źródła węgla mogą być dodawane w trakcie fermentacji, zgodnie ze zwykłą procedurą zasilania szarży.

W początkowym środowisku fermentacyjnym jako źródło przyswajalnego azotu na ogół stosuje się mączkę sojową lub siarczan amonu i takie dalsze źródło przyswajalnego azotu ewentualnie dodaje się do brzeczki fermentacyjnej w trakcie fermentacji. Korzystnym źródłem przyswajalnego azotu jest mączka, na przykład sojowa lub z nasion bawełny. Ilość przyswajalnego azotu korzystnie wynosi 0,5 do 15%, korzystniej 1,5 do 7,5%. Zwykle ilość azotu jest większa niż 5%.

Alternatywnie lub dodatkowo do fermentora można wprowadzić amoniak. Amoniak stosuje się również do regulowania pH brzeczki fermentacyjnej w trakcie procesu fermentacji. Jednak stwierdzono, że stosowanie amoniaku zarówno jako wyłącznego źródła przyswajalnego azotu jak i do regulacji pH jest niepożądane. Wysokie stężenie amoniaku może zatruć mikroorganizm a zbyt niskie pH powoduje mniej efektywną biosyntezę kwasu klawulanowego. Zgodnie z tym, korzystnym źródłem przyswajalnego azotu jest na przykład mączka sojowa dodana do wyjściowej pożywki a w przypadku zapotrzebowania na dalszy azot w trakcie prowadzonej fermentacji dostarczana jest sól amonowa taka jak siarczan amonu.

Zgodnie z korzystnym aspektem wynalazku, do regulacji pH stosowany jest wolny związek azotu, korzystnie wodorotlenek amonu. Powoduje to późniejsze obniżenie poziomu biomasy niż w przypadku, gdy amoniak jest jedynym źródłem azotu i regulatorem pH.

Stosowane w niniejszym opisie określenie „stężenie fosforu” oznaczane jest jako % wagowy/objętościowy równoważnika fosforu w odniesieniu do ilości zawartego związku przyswajalnego fosforu.

Stężenie fosforu korzystnie utrzymywane jest poniżej limitu 0,15% wagowo/objętość podczas fazy wzrostowej, po której można pozwolić na zmniejszenie stężenia fosforu. Faza wzrostowa dla typowej fermentacji kwasu klawulanowego trwającej w sumie 5 do 6 dni może być zakończona w ciągu około 40 godzin. Korzystnie pozwala się na obniżenie stężenia fosforu do niskiej wartości, korzystnie do zera po 40 godzinnej fermentacji.

Regulowanie ilości przyswajalnego fosforu zgodnie z wynalazkiem, może zapewnić nieoczekiwanie wysokie wydajności kwasu klawulanowego.

Przeprowadzono próby porównawcze rozwiązania według wynalazku z innymi sposobami wytwarzania kwasu klawulanowego, w szczególności z rozwiązaniami według opisów patentowych US 4 110 165, GB 1 571 888, EP 182 522 i obecnego wynalazku, w których bądź stosowano źródło fosforu, bądź dodatkowe wprowadzanie składników pożywek hodowlanych w trakcie trwającej fermentacji.

Brzeczka fermentacyjna może być poddana obróbce tak jak ujawniono w WO 95/23870 lub innymi znanymi sposobami za pomocą których wytwarza się klawulanian potasu o wysokiej czystości.

Wynalazek opisano dalej w nawiązaniu do załączonych przykładów, które w żadnym przypadku nie ograniczają zakresu wynalazku.

Przykład I.

A) Hodowla Streptomycetes sp. P. 6621 FERM P 2804.

Dobór i utrzymanie szczepu

185 620

Najproduktywniejsze klony Streptomyces sp. PP 6621 FERM P 2804 utrzymano metodami selekcyjnymi. Najproduktywniejsze hodowle tego mikroorganizmu przechowywano i następnie stosowano jako źródło dla następnych cyklów selekcji.

Kolonię Streptomycetes sp. P. 6621 FERM P 2804 aseptycznie przeniesiono do sterylnego naczynia ceramicznego ze sterylną wodą (2 cm³) i homogenizowano. Kawałki grzybni przeniesiono na skos agarowy i inkubowano do dojrzałości (przez 10 do 14 dni) w termostacie w temperaturze 25°C.

Po 8 do 10 dniach powierzchnia agarowa była przerośnięta szaro-zidoną grzybnią bakteryjną. Zarodniki zeskrobano z powierzchni, aseptycznie zaszczepiono do wegetatywnej pożywki nasiennej i inkubowano na wytrząsarce przez 24 godziny przy 250 obr/min i w temperaturze 25 ± 1°C.

Homogeniczną zawiesinę zarodników ze skosu agarowego można przechowywać w odtłuszczonym mleku (które może być stosowane jako pożywka ochronna) przez więcej niż dwa miesiące.

Po zakończeniu etapu wegetatywnego, część hodowli aseptycznie przeniesiono do pożywki fermentacyjnej i inkubowano na obrotowej wytrząsarce przez 96 godzin. Po zakończeniu etapu fermentacji przeprowadzono analizę na zawartość kwasu klawulanowego. Hodowle, które dały najwyższą wydajność użyto jako inokulum laboratoryjne w fermentorze.

Całe postępowanie prowadzono w warunkach aseptycznych.

Szczepy mogą być przechowywane na skosie agarowym w temperaturze 4°C maksymalnie przez 4 tygodnie, w odtłuszczonym mleku w tych samych warunkach przez 2 miesiące a szczepy liofilizowane można przechowywać w temperaturze 4°C przesz okres 1 roku.

Skład pożywek dla selekcji szczepu do zaszczepienia w fermentorze Pożywki dla skosów i szalek Petriego

Skład

Dekstryna

KHoPOą

MgSO4-7H₂O

NaCl (NH4)₂SO4

CaCO,

Pierwiastki śladowe Agar

Woda demineralizowana do

Ilość 10 g 1 g 1 g 1 g Ig 4^g1 cm³20 g ,

1000 cm³

Kompozycję sporządzono metodami klasycznymi.

Pierwiastki śladowe Skład

CaCl₂-2H₂O

MgCl₂-6H₂O

NaCl

FeCl3-6H2O

ZnCl2

CuCl2-2H2O MnSO4-H₂O Woda demineralizowana

Ilość 10,0 g 10,0 g 10,0 g 3,0 g 0,5 g 0,5 g 0,5 g do 1000 cm³

Pożywki wegetatywne dla selekcji szczepu Skład Ilooć

Skrobia kukurydziana Mączka sojowa KH2PC4

Estol (Priolube 1435) Woda z kranu

10,0 g 20,0 g

0,6 g 5,0 g do 1000 em³.

185 620

Pożywki fermentacyjne dla selekcji szczepu

Skład Ilość

Skrobia kukurydziana 9,6g

Mączka sodowa 33,5g

KH2PO4 l,2g

Estol (Priolube 1435) 22,0 g

Gliceryna 5,0 g

Kwas morfolinopropanosulfonowy 12,0g

Pierwiastki śladowe 12,0 g

Woda z kranu do 1000 cm .

Przygotowanie inokulum laboratoryjnego

Do hodowli w celu przygotowania laboratoryjnych materiałów inokulacyjnych pobrano hodowlę ze skosu agarowego. Wybrany skos agarowy napełniono aseptycznie sterylna wodą (10 cmg), zarodniki zeskrobano i homogenizowano w sterylnym naczyniu ceramicznym. Roztwór zarodników użyto jako inokulum laboratoryjne.

Faza wegetatywna w tanku przed-posiewowym

Pożywki dla tanku przed-posiewowego

Objętość tanku przed-posiewowego = 500 1

Objętość pożywki =350 1

Skład Ilość

Skrobia kukurydziana 7,0 kg

Mączka sojowa 7,0 g

NaH,PO4 0J8gkg

Estol (Priolube 2435)* 0,7 kg

Synperonic 0,150 kg

Woda z kranu do 350 1 * zamiast estolu można użyć olej sojowy

Inokulum zostało przeniesione do pożywki którą wysterylizowano w tanku przedposiewowym i schłodzono sterylnym powietrzem do temperatury 28°C. Faza wegetatywna trwała od 50 do 70 godzin w temperaturze 28 ± 1°C, pod ciśnieniem 30 kPa przy napowietrzaniu za pomocą powietrza sterylnego i ze zgodnymi mieszaninami.

Parametry wzrostu w tanku przed-posiewowym
Czas/h	pH	PMV%	Odbarwienie/min
0	7,20	—	—
4	7,25	10	>5
10	7,35	8	>5
16	7,30	10	>5
22	7,20	16	4
28	7,02	17	2,5
34	6,85	18	0,5
39	6,66	20	0,3
45	6,60	21	0,5
51	6,52	22	1,0
56	6,39	22	1,0
61	6,45	20	1,3
Legenda: pH = wartość pH próbki PMV% = % objętościowy hodowli w próbce

Odbarwienie = czas potrzebny na odbarwienie barwnika metylenowego

185 620

Faza wegetatywna w posianym fermentorze

Pożywki dla fermentora z posiewem

Objętość fermentora z posiewem = 7500 1

Objętość pożywki = 4500 1

Skład Ilość

Skrobia kukurydziana 9(00 kg

Mączka sojowa 90,0 0

NaH2PO4 2,4 kg

Estol- (Priolube 1435)* 9 kg

Synperonic 0,5 kg

Woda do 45001 * zamiast estolu można użyć olej sojowy

Fazę wegetatywną z przed-posiewowego tanku przeniesiono pod ciśnieniem do pożywki uprzednio wysterylizowanej w fermentorze posiewowym i ochłodzono sterylnym powietrzem do temperatury 28°C. Powietrze sterylizowano na filtrach o wielkości porów 0,2 pm.

Faza wegetatywna trwała od 10 do 20 godzin w temperaturze 28 ± 1°C, pod ciśnieniem 30 kPa, przy napowietrzaniu sterylnym powietrzem i stałym mieszaniu.

Rozwój monitorowano za pomocą analizy pH, PMV%, odbarwienie barwnika metylenowego i przez mikroskopowe badanie próbek.

Parametry rozwodu w tanku przed-posiewowym

Czas/h	EH	PMV%	Odbarwienie/min
0	7,20	--	—
6	7,10	15	>5
12	6,87	20	1,^
16	6,65	22	o,:3

Legenda:

pH = wartość pH próbki

PMV% = % objętościowy hodowli w próbce

Odbarwienie = czas potrzebny na odbarwienie barwnika metylenowego

B). Fermentacja periodyczna Streptomyces sp. P 6621 FERM P 2804 w fermentorze

Pożywki dla fermentorów

Objętość fermentora = 90.0001

Objętość pożywki = 60.000 1

Skład Ilość

Skrobia kukurydziana	570 kg
Mączka sojowa	2300 kg
NaCl	6 kg
Estol (Priolube 1435)*	1680 kg
NaH2PO4	5 kg
MgCl2-6H2O	7 kg
FeCl3-6H₂O	1,6 kg
ZnCl2	0,5 kg
MnSO4-H2O	0,1 kg
Synperonic	225 kg
Woda	do 60 m³

Legenda:

- Estol jest rodzajową nazwą trioleinianu gliceryny: (Priolube 1435 zarejestrowany znak towarowy Unichem GmbH, Niemcy)

- Synperonic (zarejestrowany znak towarowy ICl W. Brytania) jest propylenoglikolowym środkiem przeciwpieniącym * zamiast Estolu może być stosowany olej sojowy.

4700 1 hodowli Streptomyces sp. P 6621 FERM P2804 w fazie wegetatywnej wzrostu z fermentora posiewowego zaszczepiono przez sterylne przeniesienie do sterylnej wyjściowej

185 620 pożywki (60.000 1) w 90.000 1 fermentorze ze stali nierdzewnej wyposażonym w mieszanie i dostarczanie sterylnego powietrza przez filtry o średnicy porów 0,2 pm. Pożywki fermentacyjne i wszystkie rury wlotowe wysterylizowano i schłodzono do temperatury 24°C za pomocą powietrza sterylnego. Fazę fermentacyjną w fermentorze posiewowym utrzymywano w temperaturze 24 do 25°C pod ciśnieniem 30 kPa. Brzeczkę mieszano i napowietrzano w trakcie całej fermentacji a pH pożywek utrzymywano przez dodawanie 25% wodnego roztworu wodorotlenku amonu przy wartości 6,8 - 6,9. Fermentacja trwała 96 godzin a uzyskane stężenie kwasu klawulanowego wynosiło 3580 mg/l.

W trakcie fermentacji Streptomyces sp. P 6621 FERM P 2804 dodawano źródło fosforu i źródło przyswajalnego azotu (500 kg mączki sojowej w 5000 1 wody i 25% wodnego roztworu wodorotlenku amonu) jak następuje:

Stężenie źródeł przyswajalnego fosforu i azotu w brzeczce fermentacyjnej

Czas Stężenie fosforu (% wag/obj) Stężenie azotu (% wag/obj)

0	0,035	1,73975
8	0,030625	1,692286
16	0,0095	1,331
24	0,005188	0,9785
32	0,004638	0,5527
40	0,003638	0,69945
48	0,000863	0,9128
56	0,000863	0,8475
64	0	0,709
72	0	0,653625
80	0	0,571
88	0	0,47675
96	0	0,53825
104	0	0,7555
112	0	0,77025
120	0	0,673375
128	0	0,78725
136	0	0,734625
144	0	0,8985

Stężenie fosforu po 51 godzinach fermentacji było poniżej granicy wykrywalności.

Wartość pH osiągnięta w pierwszych godzinach rozwoju hodowli wzrosła prawie do

7,5. W tym czasie fosfor był zużywany i rozpoczęła się produkcja kwasu klawulanowego. Z tego powodu pH obniżyło się i konieczna była regulacja pH pożywek w celu utrzymania poziomu pH na wartości optymalnej.

Przykład II

Przedłużenie fazy wegetatywnej fermentacji przez zastosowanie siarczanu amonu jako źródła przyswajalnego azotu i wodorotlenku sodu jako czynnika regulującego pH.

Pożywkę stosowaną w takich samych proporcjach jak w przykładzie 1B umieszczono w fermentorach ze stali nierdzewnej (każdy po 500 1). Fermentację w pierwszym fermentorze prowadzono w takich samych warunkach jakie opisano w przykładzie 1B. Warunki fermentacji w drugim fermentorze różniły się od opisanych w przykładzie 1B tylko tym, że dodano do brzeczki fermentacyjnej 11% wodny roztwór siarczanu amonu w ilości 9 cm³/l w okresie między 40 a 60 godziną po zaszczepieniu. Wartość pH utrzymywano na pożądanym poziomie za pomocą wodorotlenku sodu. Po 60 godzinie wstrzymano dodawanie źródła azotu. Lepkość brzeczki fermentacyjnej, która jest proporcjonalna do ilości biomasy, była analizowana w trakcie fermentacji.

185 620

Szarża 1, lepkość (mPa-s)

Szarża 2, lepkość (mPa-s)

474	551
728	714
948	998
995	1076
936	12^26
824	863
628	873

185 620

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 60 egz. Cena 2,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób wytwarzania kwasu klawulanowego lub jego soli, przez fermentację gatunku Streptomyces produkującego kwas klawulanowy w brzeczce fermentacyjnej zawierającej przyswajalne źródła węgla i azotu oraz źródło fosforu, znamienny tym, że w fazie wzrostowej fermentacji dodaje się dalsze źródło fosforu utrzymując stężenie fosforu w zakresie 0,0015% do 0,15% i ewentualnie w trakcie fermentacji dodaje się dalsze źródła przyswajalnego węgla i azotu, po czym z brzeczki fermentacyjnej wyodrębnia się kwas klawulanowy lub jego sól.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że prowadzi się proces periodyczny, przy ciągłym lub nieciągłym dodawaniu źródła fosforu.
3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że po ustaniu fazy wzrostowej pozwala się na obniżenie stężenia fosforu.
4. Sposób według zastrz. 1 albo 4, znamienny tym, że pozwala się na obniżenie stężenia fosforu po 40 godzinnym okresie fermentacji.
5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że przez okres fermentacji do 40 godziny utrzymuje się stężenie fosforu w zakresie 0,0015% do 0,15%.
6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że stężenie fosforu utrzymuje się z zakresie 0,002 do 015%.
7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że po 40 godzinnym okresie fermentacji zaprzestaje się dodawania źródła fosforu.
8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako źródło fosforu stosuje się fosforan sodu, fosforan potasu, dwuwodorofosforan sodu, dwuwodorofosforan potasu, wodorofosforan sodu, wodorofosforan potasu lub ich mieszaniny.
9. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że jako źródło fosforu stosuje się dwuwodorofosforan sodu.
10. Sposób według zastrz. 1 albo 9, znamienny tym, że w wyjściowej brzeczce fermentacyjnej jako źródło fosforu stosuje się dwuwodorofosforan sodu w stężeniu około 0,008%.
11. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w przypadku dodawania przyswajalnego źródła węgla w trakcie fermentacji, jako źródło węgla stosuje się trioleinian gliceryny, glicerynę i skrobię kukurydzianą.
12. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w początkowym środowisku fermentacyjnym jako źródło przyswajalnego azotu stosuje się mąkę sojową lub siarczan amonu i taicie dalsze źródło przyswajalnego azotu ewentualnie dodaje się do brzeczki fermentacyjnej w trakcie fermentacji.
13. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że źródło przyswajalnego azotu stosuje się w stężeniu 0,5% do 15% w przeliczeniu na azot.
14. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się źródło przyswajalnego azotu, z dodatkiem amoniaku.
15. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się źródło przyswajalnego azotu jest wolne od amoniaku.