CS207694B2 - Způsob výroby antibiotika A-40104 faktoru A - Google Patents

Description

Vynález se týká způsobu výroby antibiotika A-40104 faktoru A.

Tento faktor je derivát pleuromutilinu a D-xylózy a mé formu acetalu.

Antibiotikum pleuromutilln bylo izolováno roku 1951 a je popsáno v publikaci Kvanagh a další [Proč. Nati. Acad. Soc. 37. 570 až 574 (1951)]. Pleuromutilln je možno vyjádřit následujícím vzorcem

Alkalickou hydrolýzou pleuromutilinu vzniká sloučenina známá jako mutllin, který je možno vyjádřit následujícím vzorcem

OH

Byla připravena celé řada pleuromutilinových derivátů [švýcarský patent č. 572 894 (Derwent č. 26553X), nizozemský patent δ. 69,11083 (Derwent ¢. 40,642), Knauseder a další, US patent č. 3 919 290, Brandl a další, US patent δ. 3 949 079, Riedl, US patent δ.

979 423, Baughn a další, US patent č. 3 987 194, Egger a další, US patent δ. 4 032 530,

K. Riedl, Studies on Pleuromutilin and Some of Its Derivatives, J. Antibiotics 29. ,32 až 139, (1976), H. Egger a H. Relnshagen, New Pleuromutilin Derivatives wlth Enhanced Antimicrobial Aetivity. I. Sýnthesis, J. Antibiotics 22, 915 až 922 (1976) a II. Struoture-Activity Correlations, ibid., 923 až 927 ¢1976), F. Knauseder and E. Brandl, Pleuromutilinsí Fermentation, Structure and Biosynthesis, J. Antibiotics 22, ,25 až 131 (1976), J. Drews.a další, Antimicrobial Activitcs of 81.723 hfu, a New Pleuromutilin De rivative, Antimierob. Agents and Chemitherapy 2, 507 až 516 (1975)1.

Nyní bylo zjištěno, že existují další dvě nové antibiotika, která náleží rovněž do skupiny pleuromutilinu. Mimoto bylo možno navrhnout nový způsob výroby pleuromutilinu.

Předmětem vynálezu je způsob výroby antibiotika A-40104 faktoru A, vyznačující se tím, že se pěstuje Clitopilus pseudopinsitus NRKL 11179 v živném prostředí s obsahem využitelných zdrojů uhlohydrétů, dusíku a anorganických soli v submerzní kultuře za aerobních podmínek alespoň dva dny při teplotě 20 až 33 °C a po skončené fermentaci se živné prostředí extrahuje chloroformem a antibiotikum A-40104 faktor A se z extraktu izoluje.

Fyzikální vlastnosti faktoru A antibiotika A-40104

Faktor A antibiotika A-40104 krystalizuje z chloroformu a má teplotu tání ,17 až 120 °C. Empirický vzorec faktoru A antibiotika A-40104 je ¢27^42^9’ ^^elc 'W³·^{0 st}®noveno elementární analýzou, molekulární hmotnost je 510, jak bylo stanoveno hmotovou spektrometrií.

Absorpční spektrum faktoru A antibitoika A-40104 v ultrafialovém světle ve trifluořethanolu mé absorpční maximum při 284 nm (e 32).

Spektrum faktoru A antibiotika A-40,40 při cirkulárnim dichroismu v trifluorethanolu má následující maxima:

Δε = +2,84 při 200 nm Δε = +172 při 295 nm.

Faktor A antibiotika A-40104 má následující specifickou otáčivost:

[n]25 _i₄° (_c = 1 ,o, C₂H₅OH).

Elektrometriekou titrací faktoru A antibiotika A-40140 v 66% vodném roztoku dimethylformamidu je možno prokázat nepřítomnost titrovatelných skupin.

Absorpční spektrum faktoru A antibiotika A-40,04 v KBr je znázorněna na obr. 1 na přiložených výkresech. Absorpční maxima je možno pozorovat při následujících frekvencích:

(cm^-1)

3 590, 3 500, 3 450 (široké),	3 280	(široké)	, 2 990, 2 980, 2 960, 2 940, 2 920, 2 890,
2 860, 1 755, 1 735,	1 645, 1	465, 1	447, 1	420, 1 380, 1 330, 1 310, 1 274, 1 240, 1 220,
1 160, 1 117, 1 093,	1 070, 1	060, 1	1 040, 1	014, 984, 955, 940, 921, 905, 865, 760, 742,

698, 674, 603, 530 a 442.

Faktor A antibiotika A-40104 je rozpustný v alkoholech, například methanolu nebo ethanolu, částečně rozpustný v chloroformu a nerozpustný ve vodě.

Podle svých fyzikálních a chemických vlastností je faktor A antibiotika A-40104 pravděpodobně beta,D-xylopyranosylaoetonový derivát pleuromutilinu s následujícím vzorcem:

Kmen Clitopilus pseudopinsitus, vhodný pro produkci antibiotika A-40104 faktoru A byl získán z Centraalburesu voor Schimmelcultures (CBS) v Nizozemí. CBS kultura (CBS 270.36) byla klasifikována jako Octojuga pseudopinsite. Rodové jméno Clitopilus, které je synonymem pro Octojuga bude dále užíváno k označení užitého mikroorganismu. Schopnost této kultury vyrábět antibiotikum nebyla až dosud známa. Tato schopnost k produkci antibiotika A-40104 byla zjištěna při široce založených zkouškách s různými typy mikroorganismů.

Kmen Clitopilus pseudopinsitus, byl uložen ve veřejné sbírce Kultur Northern Marketing and Nutrition Research Division, US papartmen of Agriculture, Agricultural Research Service, Peoria, Illinois 61604, odkud je možmo jej získat pod číslem NRRL 11179.

Stejně jako je tomu u jiných mikroorganismů, vlastnosti kultury Clitopilus pseudopinsitus NRRL 11179, která produkuje antibiotikum A-40104 faktor A podléhají různým variacím. Například různé umělé varianty a mutanty kmene NRRL 11,79 je možno získat působením různých známých mutagenů, jako jsou ultrafialové paprsky, paprsky X, vysokofrekvenční vlny, radioaktivní paprsky a chemické látky. Všechny přírodní i umělé varianty a mutanty, které mají v podstatě stejné vlastnosti jako Clitopilus pseudopinsitus NRRL ,1,79 a produkují antibiotikum A-40140 je možno užít při provádění způsobu podle vynálezu.

živné prostředí, jehož se užije k pěstování Clitopilus pseudopinsitus NRRL 11179 může být velmi různé, Z hospodárných důvodů a pro získáni otpimálního výtěžku i pro snadnou izolaci jsou však výhodná některé zvláštní živná prostředí. Při fermentaoi ve velkém měřítku je například výhodným uhlohydrétovým zdrojem glukóza, dextrin z tapioky, škrob a kukuřičný olej, i když je možno užit také glycerol, maltózu, fruktózu a další zdroje. Dalšími výhodnými zdroji uhlíku jsou soli kyseliny olejové a laurové a lecitin. Výhodnými zdroji dusíku jsou so'jové mouka nebo extrakt z kvasnic.

Dalšími vhodnými zdroji dusíku jsou kvasnice, mouka z bavlníkových semen, arašídové mouka, pepton z masa, sušené krmivo pro psy. Přestože anorganické soli nejsou pro růst a produkci antibiotika podstatné, je možno přidávat rozpustné soli, které obsahují sodík, hořčík, vápník, amonný ion, chloridový ion, uhličitanový ion, síranový ion, dusičnanový ion apod. Produkci antibiotika je možno zlepšit například přidáním 0,05 % MgSO^.7H₂O a 0,2 % CaCO^ do živného prostředí.

Do živného prostředí by měly být přidávány také základní stopové prvky, které jsou nutné pro růst a vývoj mikroorganismu. Tyto stopové prvky se obvykle běžně vyskytují jako nečistoty v ostatních živných látkách prostředí v množství, které je dostatečné vzhledem k růstovým požadavkům mikroorganismu.

Někdy může být zapotřebí přidat malé množství, tj. přibližně 0,2 ml/litr protipěnivého činidla, například polypropylenglykolu, protože zejména při fermentaci ve velkém měřítku se pěnění stává problémem.

Pro výrobu větěioh množství antibiotika A-40140 faktoru A je vhodné použít fermentaci v submerzní kultuře za aerobních podmínek ve velkých tankách. Malé množství antibiotika A-40104 faktoru A je možno získat v třepaeích lahvích. Protože období lag je obvykle velmi dlouhé při produkci antibiotika ve velkých tankách při použití malého množství kultury jako očkovacího materiálu, je výhodnější užít vegetativní očkovací materiál, který obsahuje větěí množství buněk v aktivním růstovém stádiu.

Vegetativní očkovací materiál se připraví tak, že se naočkuje malý objem živného prostředí fragmenty mycelia, čímž se získá čerstvé, aktivní rostoucí kultura mikroorganismu. Vegetativní očkovací materiál se pak přenese do většího tanku. Živné prostředí, užité pro růst vegetativního očkovacího materiálu může být stejné, jako pro pěstování ve větěím měřítku, je však možno užít i odlišného živného prostředí.

Mikroorganismus Clitopilus pseudopinsituš, který produkuje antibiotikum A-40104 faktor A je možno pěstovat v teplotním rozmezí 20 až 33 °C. K optimální produkci antibiotika A-40104 dochází při teplotách v blízkosti 30 °C.

Jak ja obvyklé při aerobní fermentaci v submerzních kulturách, vhání se do živného prostředí za stálého míchání sterilní vzduch. K účinnému růstu mikroorganismu je nutno dosta tečně provzdušňovat a míchat prostředí tak, aby hladina rozpuštěného kyslíku se udržovala co nejblíže k hodnotě 80 %. NižSí úroveň rozpuštěného kyslíku snižuje produkci faktoru A.

Vhodné inkubační doba pro produkci faktoru A antibiotika A-40140 je přibližně 12 dní. Přidáním kukuřičného oleje k živnému prostředí se podporuje přeměna faktoru C na faktor A v průběhu fermentace. Za podmínek, které jsou optimální pro produkci faktoru antibiotika A-40104 dochází k tomu, že faktor A tvoří 70 až 90 % veškerého vyprodukovaného antibiotika.

Zfiltrované živné prostředí se extrahuje chloroformem a faktor A antibiotika A-40104 se izoluje z chloroformového extraktu.

Účinnost antibiotika A-40104 faktoru A

Antibiotikum A-40104 faktor A inhibuje růst různých pathogenních mikroorganismů, zejména grampozitivních bakterií. Minimální inhibiční koncentrace (MIC) pro faktor A a pro různé bakterie jsou uvedeny v agarovém ředění v následující tabulce III

Tabulka III

MIC Qug/ml)

Mikroorganismus A-40104 faktor A

Staphylococus aureus 3055 <0,5

Staphylococcus aureus 3074 <0,5

Streptococeus faecalis <0,5

Bordetella bronehiseptica <0,5

Antibiotikum A-40104 faktor A je účinné také proti mikroorganismům, které jsou odolné proti jiným antibiotikům. V následující tabulce IV je uvedeno shrnutí výsledků která byly získány na agarových plotnách při použití disků s antibiotikem A-40104 faktoru A při použití různých mikroorganismů. Účinnost byla měřena jako průměr zóny inhibice v mm. Průměr disku byl v každém případě 6,35 mm·

IV

Průměr zón (mm)

Mikroorgani smus	Koncentrace (jug/disk)	A-40104 faktor A
Staphylococcus aureus 30551	100	31,2
Staphylococcus aureus 30551	10	27,2
Staphylococcus aureus 30742	100	29,2
Staphylococcus aureus 30742	10	25,4
Staphylococcus aureus 3130^	1 00	34,0
Staphylococcus aureus 3130^	10	29,2
A, Streptococcus pyogenes	100	27,0
Streptococcus pyogenes	10	21 ,0
Streptococcus sp. 9960^	100	8,7
Streptococcus sp. 9960^	10	0
Diplococcus pneumoniae	100	20,0
Diplococcus pneumoniae	10	14,0

citlivý na ’ penicilín G penicilin-G resistentní methicilin resistentní skupina A skupina D

Z tabulky V je zřejmé, že faktor A antibiotika A-40104 je možno srovnat s příznivým výsledkem s ampicilinem v řadě pokusů in vitro, které byly provedeny při použití zřeňovací řady na agarových plotnách.

Tabulka

k a V	MIC
	((Ug/ml)
Mikroorganismus	A-40104 faktor A	Ampicilin
Streptococcus pyogenes	<0,01	<0,01
Streptococcus sp. X-66 (skupina D)	0,5	0,8
Streptococcus sp. 9960 (skupina D)	70	0,6
Neisseria gonorrhea	0,5	0,5
Neisseria gonorrhea Sand.	0,07	0,07
Neisseria gonorrhea Lind.	0,5	0,5
Hemophilus influenzae Brun’	2	0,5
Hemophilus influenzae Dick.1	2	0,5
Hemophilus influenzae Laiv.1	4	0,5
Hemophilus influenzae 2512	0,7	70
Hemophilus influenzae 2592	0,7	70
Hemophilus influenzae 2602	0,7	70

Faktor A antibiotika A-40104 má antimikrobiální účinnost in vivo proti experimentálním bakteriálním infekcím. Dvě dávky byly podány myším, pozorovaná účinnost byla měřena jako ^ED50’ dávka v mg/kg, která chrání 50 % pokusných zvířat, jak bylo popsáno v publikaci ďarren tVick a další, J. Bacteriol. 81 , 233 až 235 (1961). Hodnoty byly shrnuty v následující tabulce VI.

Tabulka VI

Účinnost faktoru A antibiotika A-40104

Mikroorganismus

Staphyloeocous aureus 3055 Streptococcus pyogenes C203 Streptoooocus pneumoniae Park I

Cesta podání	^50*	Způsob infekce
podkožně	15,7	1 ,260 x intraperitoneálně
podkožně	3,6	195 x LDjq intraperitoneálně
podkožně	21,5	1,280 x LD^q intraperitoneálně

Faktor A antibiotika A-40104 rovněž inhibuje růst různých anaerobních bakterií.

V následující tabulce VIII je shrnuta účinnost faktoru A antibiotika A-40104, tak jak byla stanovena standardní zředevací řadou na agarovém prostředí.

a b	u 1 k a	VIII
		Mikroogranismus	MIC (jug/ml)*
		Actinomyces israelli	*0,5
		Clostridium perfringens	8
		Clostridium septicum	8
		Eubacterium aerofaciens	16
		Peptococcus prevoti	*0,5
		Peptococcus asaccharolytious	* 0,5
		Peptostreptococcus anaerobius	2
		Peptostreptoeoccus intermedius	*0,5
		Bacteroides fragilis 111	8
		Bacteroides fragilis 1877	8
		Bacteroides fragilis 1936B	8
		Bacteroides thetaiotaomicron	2
		Bacteroides melaninogenicus 1856/28	4
		Bacteroides melaninogenicus 2736	4
		Bacteroides vulgaris	4
		Bacteroides corrodens	8
		Fusobacterium symbiosum	4
		Fusobacterium necrophorum	*0,5
MIC	stanoveny	zřeSovací metodou na agaru. Koncové body	byly odečítány po 24 hodinách
inkubace.

LD^q pro faktor A při intraperltoneálním podání u myší je vySší než 300 mg/kg.

Účinnost proti mykoplasmatům je zvláště důležitým hlediskem antimikrobiální účinnosti antibiotika A-40104 faktoru A. Mykoplasmata jsou pathogenní pro člověka a různá zvířata. Je proto zapotřebí účinných látek pro prevenci a léčbu těchto onemocnění u drůbeže, vepřů a skotu.

V následující tabulce IX jsou uvedeny minimální inhibiční koncentrace faktoru A, antibiotika A-40104 proti různým mykoplasmatům při stanovení zřeSovací řadou in vitro.

Tabulka IX

Minimální inhibiční koncentrace

Mikroorganismus

A-40104 faktor A

Mycoplasma galiisepticum Mycoplasma synoviae Myooplasma hyorhinia Mycoplasma hyopneumoniae <0,78 <0,78

1,56 0,195

Důležitým hlediskem je použití antibiotika A-40104 faktoru A k léčbě dysenterie vepřů. Jak bylo vysvětleno W. E. Brownem v US patentu č. 4 041 175, je pleuromutilin účinný při léčbě dysenterie vepřů. Nyní bylo zjištěno, že antibiotikum A-40104 faktor A, vyrobené způsobem podle vynálezu je účinné také proti Treponema hyodysenteriae, to jest proti mikroorganismu, který obvykle působí dysenterii vepřů. Účinnost byla stanovena in vitro, přičemž bylo užito dávek 50, 5,0, 0,5 a 0,05jug/ml na agarových plotnách s tryptikézou a sójou s obsahem 5 % defibrinované krve skotu. Povrch agaru byl očkován 0,1 ml 10' ředění suspenze T. hyodysenteriae. Plotny byly inkubovány za anaerobních podmínek čtyři dny a pak byly vyhodnoceny na přítomnost nebo růst hemolytiokých treponemat. Při tomto pokusu bylo prokázáno, že faktor A antibiotika A-40104 inhibuje růst T. hyodysenteriae v koncentraci 50, 5,0 a 0,5 jug/ml.

Při použití k léčbě dysenterie vepřů je možno podat antibiotikum A-40104 faktor A vepřům perorálně ve formě tablet, kapslí, prášku apod. Je možno připravit veterinární prostředek, který obsahuje inertní nosič a jako účinnou složku antibiotikum A-40104.

Výhodným způsobem podání je však včlenění antibiotika A-40104 faktoru A do krmivá pro vepře.

Mimoto je možno antibiotikum A-40104, faktor A, vyrobené způsobem podle vynálezu užít proti druhu Pasteurella. P. multocida je například příčnou infekcí dýchacích cest u skotu, drůbeže a vepřů. P. hemolytica je nejčastější příčinou onemocnění dýchacích cest u skotu. Účinnost faktoru A proti Pasteurella byla stanovena standardním způsobem in vitro. Výsledky jsou uvedeny v tabulce X.

Tabulka X

MIC Qug/ml)

Mikroorgani smus

Faktor A - A-40104

Pasteurella multocida (skot) Pasteurella multocida (krocen) Pasteurella hemolytica

6,25

12,5

25,0

Je také možno vyrobit farmaceutický prostředek, který by obsahovat inertní nosič a jako účinnou složku antibiotikum A-40104 a byl by účinný proti pathogenním mikroorganismům u člověka.

Dalším důležitým hlediskem je účinnost antibiotika A-40104 proti Spiroplasma citri. Spiroplasma citri je příčinou onemocněni citrusových plodů, další epiroplasmata nepříznivě ovlivňují růst kukuřice. Při pokusech in vitro se Spiroplasma citri bylo zjištěno, že faktor A antibiotika A-40104 inhibuje S. citri v dávkách 0,01 ppm.

Antibiotikum A-40104 faktor A je také účinný proti organismům, které způsobují onemocnění rostlin. Například při aplikaci na list nebo do půdy je faktor A antibiotika A-40104 účinný proti plísním u fazolí i u ječmene, a to zejména při aplikaci do půdy, kde je faktor

A antibiotika A-40104 účinný v dávce 100 ppm, což znamená, že sloučeniny mají zřejmě eystemiekou účinnost. Systemieká účinnost antibiotik je zvláště výhodná při potlačování organismů, pathogenníoh pro rostliny nebo Spiroplasmat.

Vynález bude osvětlen následujícími příklady.

Přiklad 1

A. Fermentace antibiotika A-40104 ve třepacích lahvích

Zralé kultura Clitopilus pseudopinsitus NRRL 11179 na šikmém agaru se odebere sterilním nástrojem a asepticky se přenese na šikmý agar následujícího složení:

Složka	Množství
sacharóza	25 g
melasa	36 g
kukuřičný výluh	6 g
sladový extrakt	10 g
k2hpo4	2 g
enzymaticky hydrolyzovený kasein*	10 g
promytý agar	25 g
deionizovaná voda do	1 litru

* N-Z Čase, Humko Sheffield, Norwich, N.Y.

Naočkovaný šikmý agar se inkubuje 14 dní při teplotě 30 °C. Zralá kultura na šikmém p

agaru se odebere sterilním nástrojem a mycelium z plochy přibližně 5 cm se užije k naočkování 50 ml vegetativního živného prostředí následujícího složení:

Složka Množství glukóza 1 0 g dextrin z tapioky* ¹0 g práškovaný sójový hydrolyzát** 10 g frakce pivovarských kvasnic*** 5 g voda z vodovodu do 1 litru pH prostředí je 5,3 a je nutno ho upravit na 6,9 přidáním hydroxidu sodného * Stadex 11, A. E. Staley, Decatur, 111.

** HySoy T. Humko Sheffield, Nerwich, N. Y.

*** Amber BYF300, Amber Laboratories, Juneau, Wisc.

Naočkované vegetativní prostředí se inkubuje v Erlenmeyerových baňkách o obsahu 250 ml při teplotě 25 °C 96 hodin na rotační třepačce při výkyvu 5 cm a při 250 otáčkách za minutu.

Inkubované vegetativní prostředí je možno užít přímo k inkubaci vegetativního živného prostředí ve druhém stupni. S výhodou je toto prostředí možno skladovat do dalšího použití tak, že se kultura skladuje nad kapalným dusíkem. K tomuto účelu se kultura dělí do malých lékovek tak, že do každé lékovky se uloží 4 ml inkubovaného vegetativního živného prostředí a 2 ml roztoku glycerinu a laktózy následujícího složení:

Složka

Množství glycerin 100 g laktóza 150 g deionizovaná voda do 1 litru

Připravené suspenze se skladují do použití nad kapalným dusíkem.

ml takto připravené skladované suspenze se užije k naočkování 50 ml vegetativního živného prostředí o uložení, jaké bylo svrchu uvedeno pro vegetativní živné prostředí. Kultura se pak inkubuje v Erlenmeyerových baňkách se širokým hrdlem o obsahu 250 ml 4 dny při teplotě 25 °C na rotační třepačce s výkyvem 5 cm při 250 otáčkách za minutu.

B. Fermentace v tanku

Aby bylo možno získat větší objem očkovacího materiálu, užije se 10 ml svrchu uvedeného vegetativního prostředí z prvního stupně k naočkování 400 ml vegetativního živného prostředí z druhého stupně. Prostředí mé totéž složení, jaké bylo svrchu uvedeno pro vegetativní živné prostředí. Toto prostředí se inkubuje v Erlenmeyerových baňkách o obsahu 2 litry se širokým hrdlem 48 hodin při teplotě 25 °C na rotační třepačce při výkyvu 5 cm a 250 otáčkách za minutu.

800 ml takto inkubovaného vegetativního prostředí z druhého stupně se užije k naočkování 100 litrů sterilního produkčního prostředí následujícího složení:

Složka	Množství g/litr
glukóza	15
glycerin	5
dextrin z tapioky	30
sušené krmivo pro psyx	25
extrakt z kvasnic	5
KC1	1
MgS04.7H20	0,5
FeS04.7H20	0,1
MnCl2.4H2Q	0,05
ZnSO2.7H2O	0,05
CaCO^	0,1
deionizovaná voda do	1 litru

pH se upraví na 5,0 4N kyselinou chlorovodíkovou.

* Purina Dog Chow, Talston Purina Co., St. Louis, Mo. 63188

Naočkované produkční prostředí se fermentuje ve fěrmentačním tanku o obsahu 165 litrů při teplotě 30 °C přibližně 12 dní. Fermentační prostředí se provzdušňuje sterilním vzduchem, přičemž se udržuje hladina rozpustného kyslíku na hodnotě 80 %.

Příklad 2

Fermentace se provádí stejným způsobem jako v příkladu 1, avšak užije se vegetativního živného prostředí následujícího složení:

Složka

Množství g/litr dextróza 5 galaktóza 5 glycerin 5 rozpustný škrob 5 extrakt z kvasnic 2 sušené krmivo pro psy^x 5 sójový olej 2 kukuřičný olej 2

Složka

ΚΗ₂Ρ0₄

MgSO₄.7H₂O

PaSO₄.7H₂O

CaCOj

MgCl₂.4H₂O ZnS0₄.7H₂0 deionizovaná voda do

Prostředí mé pH 5,7 a je nutno jej upravit kové.

* Purina Dog Chow

Přiklad 3

Množství g/litr

0,5 0,1 1,0 0,05 0,05 1 litru na pH 5,0 přidáním 4N kyseliny chlorovodíFermentace se provádí stejným způsobem jako v příkladu 1, avšak užije se fermentačního prostředí následujícího složení:

Složka

Množství g/litr glukóza drt ze sójových bobů

MgS0₄.7H₂0

CaCOj deionizovaná voda do

7,5 1 ,0 2,0 litru

Prostředí má pH 7,4 a je nutno jej upravit na 6,5 přidáním 4N kyseliny chlorovodíkové .

Příklad 4

Izolace faktoru A antibiotika A-40104

500 litrů fermentačního prostředí, získaného způsobem podle příkladu 3 se zfiltruje, přičemž se jako pomocný prostředek při filtraci užije infusoriová hlinka, (Hyflo Supper-cel Johns-Manville Products Corp.), čímž se získá 3 640 litrů filtrátu. Myceliální koláč se promyje deionizovanou vodou, čímž se získá dalších 1 820 litrů filtrátu. Filtráty se slijí a úhrnné množství filtrátu 5 460 litrů se extrahuje bez úpravy pH polovičním objemem toluenu, čímž se po hodinové extrakci získá 2 500 litrů toluenového extraktu. Tento toluenový extrakt obsahuje převážné faktor C antibiotika A-40104 to jest pleuromutilin.

Vodný roztok, zbývající po toluenové extrakci se pak‘extrahuje hodinu polovičním objemem chloroformu. Takto získaný chloroformový extrakt se zahustí na objem 10 litrů a pak se chladí na teplotu 4 °C po dobu 72 hodin. Krystaly se oddělí filtrací, čímž se získá 588 g faktoru A antibotika A-40104.

Claims (1)

1. PŘEDMĚT VYNÁLEZU

   Způsob výroby antibiotika A-40104 faktoru A, vyznačující se tím, že se pěstuje Clitopilus pseudopinsitus NEEL 11179 v živném prostředí s obsahem využitelných zdrojů uhlohydrétů, dusíku a anorganických solí v submerzní kultuře za aerobních podmínek alespoň 2 dny při teplotě 20 až 33 °C a po skončené fermentaci se živné prostředí extrahuje chloroformem a antibiotikum A-40104 faktor A se z extraktu izoluje.