KR800001241B1 - 클라블란산 항생물질의 정제방법 - Google Patents

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클라블란산 항생물질의 정제방법

제1도 : 실시예 1의 IR 스펙트럼(리튬염).

제2도 : 실시예 5의 IR 스펙트럼(나트륨염).

제3도 : 실시예 1의 IR 스펙트럼(칼슘염).

본 발명은 항생물질의 정제방법에 관한 것이다.

스트렙토마이세스 클라블리게루스(Streptomyces clavuligerus) 특히 균주 NRRL 3585를 발효시킬 때 많은 항생물질이 생성된다고, 공지되어 있으며 영국특허 명세서 제1315177호에서는 두 항생물질 즉 A16886 Ⅰ 및 A16886Ⅱ가 충분한 양 생성될때까지 스트렙토마이세스 클라블리게루스 균주 NRRL 3585를 배양하는 것을 상술하고 있다.

이 미생물로부터 다음 구조식(Ⅰ)의 다른 항생물질(즉(2r,5r,2)-3-(β-하이드록시에틸리덴)7-옥소-4-옥사-1-아자비사이클로[3,2,0]-헵탑-2-카복실산(이하 “클라블란산”이라함)을 수득할 수 있다.

본 발명은 상기 화합물 및 그염을 포함한다.

본 발명에 따르는 염으로서는 알칼리금속염 즉 나트륨, 칼륨 및 리튬염; 알칼리토금속염 즉 칼슘, 마그네슘 및 바륨염; 암모늄염; 유기염기성 염 예를 들면 1급, 2급, 3급 및 N-4급 아민에서 유도된 염 즉 메틸암모늄과 트리메틸암모늄염과 같은 모노, 디-또는 트리-알킬암모늄염 및, 피페리디늄염같은 복소환의 염기성이 있다.

무기염기성 염 및 대부분의 유기염기성염은 일반적으로 유리 클라블란산보다 수용액 상태에서 더 안정하다. 이들 염은 용매화합물, 즉 물 또는 기타 결정화 용매를 함유하는 형태로 존재하기도 한다.

이제까지는, 최소한 75중량%, 일반적으로 최소한 85중량%의 순도로 즉, 함유 불순물 및 제조도중 생기는 이성체의 함량이 25중량% 이하 일반적으로 15중량% 이하인 클라블란산 및 그염을 수득하여왔다.

그런데 후술하는 방법을 사용하면 순도가 보다 높고, 불순물 및 제조도중의 이성체가 2중량% 미만인 클라블란산을 수득하게 된다. 본 발명에 따르면 리튬 클라블라네이트 및 기타의 클라블란산 염을 결정형으로 수득하게 된다. 이들 염의 0.1M 수산화나트륨 수용액의 259±1㎚에서의 분자 흡광 계수는 최소한 16,200이며 이로써 염이 순수하다는 것을 알수 있다. 수용액의 분자선광

는 최소한 +137°±5°이다. 염으로부터 제조된 유리산의 0.1M 수산화나트륨 수용액의 흡광계수

259㎚에서 590 또는 그 이상이며 디메틸 설폭사이드중의 비선광도

는 약 +54°이다. 이러한 정도의 순도를 갖는 물질은 약학적 및 수의학적 조성물로 사용할 수 있으며 중간체로 사용하는 것이 매우 바람직하다.

여기에서 “순도”라함은 클라블란산 또는 그염의 퍼센트로서 결정과 회합한 기타 용매나 물을 제외한 총 고체의 중량퍼센트로 나타낸다.

클라블란산 및 그염은 그람음성 및 그람양성균에 대해 항균작용을 나타내며, 그런 균주의 예로는 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 이ㆍ콜라이(Escherichia coli), 살모넬라 타이피무리움(Salmonella typimurium), 시겔라 손네이(Shigella sonnei), 엔테로 박터클로아세(Enterobacter cloacae), 클렙시엘라 에어로게네스(Klebsiella aerogenes), 푸로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis), 푸로테우스 모르가니(Proteus morganii), 세라티아 마르세슨스(Serratia marcescens), 푸로비덴시아속(Provedencia species), 시트로박터 코세리(Citrobacter koseri), 헤모필루스 인플루엔자에(Haemophilus influenzae), 및 박테로이데스 속(Bacteroides)등이 있다.

클라블란산 및 그염은 스타필로코커스 아우레우스와 바실루스 세레우스 등과 같은 그람양성균이 생성한 β-락타마제의 작용 및 리치몬드, M. H. 및 사이크스 R. B(1973)가 기술한 Ⅰ 내지 Ⅴ 부류의, 그람음성균이 생성한 β-락타마제에 대해 안정하다.

(“The β-lactamases of gram-nagative bacteria and their possible physiological role' Advances in Microbial physiology 9,31-88 참조).

클라블란산 및 그염은 또한 스타필로코커스 아우레우스 및 바실루스 세레우스와 같은 그람-양성균이 생성한 β-락타마제 및 프로테우스 마라빌라스, 이ㆍ콜라이, 프로테우스 모르가니, 클렙시엘라 에어로게네스, 살로넬라 타이피무리움, 시겔라 손네이 및 헤모필루스 인플루엔자에 균주와 같은 그람 음성균이 생성한 Ⅱ 내지 Ⅴ로 분류된 효소를 억제하는 능력을 가지고 있다.

또한 박테로이데스 프라질리스, 프로테우스 블가리스, 프로테우스 모르가니, 프로테우스 레트게리, 엔테로박터 클로아세, 시트로박터 프로인디, 프로비덴시아속 및 하프니아 알베이 등과 같은 균주가 생성하는 Ⅰ 부류의 많은 효소도 억제한다. 따라서 클라블란산 및 그염은 β-락타마제에 감수성을 나타내는 β-락탐 항생물질이 β-락타마제에 의해 가수분해되는 것을 막는다.

클라블란산 및 그염을 그람-양성 및 그람음성 균주가 생성한 β-락타마제에 감수성을 나타내는 β-락탐 항생물질과 병용하는 것은 흥미있는 일이다.

일반적으로 2%미만의 불순물 및 이성체를 함유하는 순도 98% 이상의 클라블란산 및 그염을 광범위 β-락탐 항생물질과 병용하는 것이 바람직하다.

일반적으로 클라블란산 및 그염은, 통상 경구 또는 비경구로 투여하는 β-락탐 항행물질과 병용한다. 경구로 흡수되는 광범위 β-락탐 항생물질로는 세팔렉신, 세팔로글리신, 앰피실린 및 아목시실린 및 그들의 경구로 흡수되는 에스테르, 예를 들면 아실옥시메틸 및 프탈리딜 에스테르, 그리고, 카베니실린, 세팔로리딘 및 티카르실린의 경구로 흡수되는 에스테르, 예를들면 인다닐 및 페닐에스테르등이 있다. 경구로 흡수되지 않는 광범위 β-락탐 항생물질로는 카베니실린, 티카르실린, 세팔로딘, 세팔로리딘, 세파졸린, 세파세트릴 및 세파피린등이 있다. 협영역의 β-락탐 항생물질로는 페니실린 G와 페니실린 V가 있다.

클라블란산 및 그염을 페니실린 G, 페니실린 V, 앰피실린, 아목시실린, 카베니실린 또는 티카르실린등과 병용하면, 스타필로코커스 아우레우스 균주가 생성하는 β-락타마제에 대해 상승효과를 나타낸다.

클라블란산 및 그염을 페니실린 G, 페니실린 V, 앰피실린, 아목시실린, 카베니실린, 티카르실린세파렉신, 세팔로글리신, 세팔로딘, 세팔로리딘, 세파세트릴 또는 세파피린등과 병용하면 이ㆍ콜라이, 크렙시엘라 에어로 게네스, 프로테우스 미라빌리스, 살모넬라 타이피무리움, 시겔라 손네이, 박테로 이데스프라질리스, 프코테우스 모르가니 및 프로테우스 불가리스 균주가 생성하는 β-락타마제에 대해 상승효과를 나타낸다.

본 발명에 의해, 클라블란산 바람직하게는 나트륨염 또는 불순물이나 제조과정에서 유래하는 이성체를 2% 미만 함유하는 염등의 약리학적으로 무독한 염을 함유하는 약학적 조성물(수의학적 조성물 포함)을 제공한다. 상술한 보호작용을 고려할 때, 다른 β-락탐 항생물질을 더 함유하면 유리하다. 조성물에는 통상 약학적(수의학적) 담체 및 부형제도 함유된다.

본 발명에 의한 약학적 조성물(수의용 약물을 포함하여)은 클라블란산 또는 그 약학적 응용가능한 염(예를들면 나트륨염)으로부터 제조하며, 이 조성물은 β-락탐 항생물질을 더 포함할 수도 있으며 또한 약학적(수의학적) 담체나 부형제를 함유할 수도 있다.

이들 조성물은 경구, 비경구, 좌약 또는 국소 투여용으로 제형화할 수 있다.

조성물은 경구투여에 적절한 산제, 정제, 캅셀제, 로젠지, 액제 및 시럽제 형태로 할 수 있으며 전분, 락토스, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 젤라틴, 증류수, 현탁화제, 분산제, 유화제, 방향제 또는 착색제를 함유할 수 있다.

클라블란산 및 그염은 비경구투여형으로 할 수도 있으며, 비경구투여가 바람직하다. 임의로 다른 β-락탐 항생물질과 함께 앰플에 충진할 수 있다.

일반적으로 β-락탐 항생물질에 대한 클라블란산 또는 그염의 중량비는 10 : 1 내지 1 : 10이며, 바람직하게는 5 : 1 내지 1 : 5이고, 특히 2 : 1 내지 1 : 2가 바람직하다.

본 발명은 또한 2% 미만의 불순물 또는 제조과정에서 유래하는 이성체를 함유하는 클라블란산, 더 바람직하게는 그것의 약리학적으로 무독한 염을 유효량 인체 또는 동몰에 투여하여, 그람양성 또는 그람음성균에 의한 감염증을 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다.

일반적으로 활성물질은 상술한 이유에서 β-락탐 항생물질과 병용한다.

클라블란산 또는 그염은 성인에 있어, 매회 100㎎ 내지 6g의 양을 1일에 2내지 4회 투여할 수 있다.

조성물이 다른 β-락탐 항생물질을 함유할때에는 투여량은 β-락탐 항생물질의 총량과 관계된다. 클라블란산 또는 그염을 단독 또는 다른 β-락탐 항생물질과 병용할때는 매회 250㎎ 내지 1g을 1일에 2 내지 4회 투여하는 것이 바람직하다.

클라블란산 및 그염은, 디아조 메탄과 같은 디아조알칸과 산을 반응시키거나 또는 메틸 요다이드와 같은 알킬할라이드와 그염을 반응시켜서 에스테르와 같은 유도체를 제조하는데도 사용한다.

[클라블란산 및 그염의 정체]

클라블란산 및 그염은 균주 NRRL 3585 또는 그 변이주와 같은 스트렙토마이세스 클라블리게루스 균주를 영국특허 명세서 제1315177호에 따라서 배양시킨 배양액에서 분리한다. 분획기술을 도입하여 단백질, 효소, 특히 기타 β-락탐 항생물질과 같은 불필요한 성분을 제거하여 분리한다. 그러나, 통상의 기술을 사용하여서는, 배양액에 존재하는 여러 β-락탐 카복실산 특히 전술한 항생물질 A 16886 Ⅰ 및 Ⅱ와 같은 것이 유사한 성질을 가지고 있기 때문에 분리정제가 어렵다. 그런데 클라블란산 또는 그염을 리튬 클라블라네이트로 전환시키고 이것을 통상 결정형태로 침전시켜서 대단히 편리하게 이 항생물질을 분리할 수 있음을 발견하였다. 이러한 침전은 클라블라네이트 이온이 리튬 이온과 대단히 높은 친화성을 가지고 있고 불순물 특히 기타의 β-락탐 화합물의 공침이 거의 일어나지 않기 때문에 가능한 것이다. 더구나, 염을 직접 분리하므로써 클라블란산의 에스테르와 같은 유기 유도체로의 전환 및 환원법 등으로 산으로 재전환 시킬 때 클라블란산의 이성체로의 전위를 피할 수 있다. 클라블란산 에스테르를 환원성 분해시키면 이성체가 15% 정도 생성될 수 있다.

발효액 및 다른 용액에서, 중성에 가까운 pH에서는 클라블란산 및 그염은 하나 이상의 양이온과 평형상태로 존재하며, 그 분리공정은 pH 및 다른 조건에 따라 달라진다. 일반적으로 클라블란산 및 그염은 pH5.5 내지 8 이외의 수용액에서는 불안정하며, 후술하는 공정도중에 pH를 이 범위 내로 유지하는 것이 바람직하며, 별도 지시가 없는한 pH를 6.5근처로 유지한다.

본 발명은 또한 구조식(Ⅰ)의 클라블란산 또는 그염을 수용성 이온성 리튬 화합물과 반응시켜서 리튬 클라블라네이트를 함유하는 수융액을 얻고 이것을 침전시키고 이 침전을 상기 수용액에서 분리하여 혼입된 불순물을 제거하는 방법을 제공한다.

일반적으로 이온성 리튬 화합물은 염이다. 염화리튬이 바람직하나, 브롬화리튬, 요드화리튬 또는 리튬설페이트나, 아세테이트, 프로피오네이트, 포르메이트, 벤조에이트 또는 락테이트와 같은 리튬 카복실 레이트로 적절하다. 염의 선택은 존재하는 다른 물질에 의하여 영향을 받으며, 예를들어, 기존 클라블란산 염이 바륨 염이라면, 리튬 설페이트를 사용하여 리튬 클라블라네이트가 침전되기전에 바륨 설페이트를 침전시켜 제거하는 것이 바람직하다.

일반적으로, 침전되기전의 리튬 클라블라네이트의 농도는, 중량으로 최소 0.1% 유리하게는 최소한 2%가 바람직하며, 12%까지 또는 20%까지의 고농도에서는 회수율 %가 증가한다.

정제를 필요로하는 기존 클라블란산염의 형태는 알카리금속염(나트륨 또는 칼륨염 또는 클라블란산 물질의 미량 성분으로 존재하는 경우의 리튬염) 알카리토금속염(예를들면 칼슘, 바륨 또는 마그네슘염) 또는 상술한 바와 같은 유기 염기염 또는 이온교환수지와 형성된 염등이다.

리튬 클라블라네이트가 고순도로 쉽게 침전되는 것은 여러 가지로 이용할 수 있다.

[리튬 클라블라네이트의 염석]

본 발명의 방법으로 리튬 클라블라네이트를 함유하는 수용액은 또한 충분한 양의 이온성 리튬화합물, 보통은 리튬 클라블라네이트를 형성하는데 사용한 리튬염을 함유할 수 있으며, 리튬 클라블라네이트를 염석시키기 위하여는 리튬 이온의 농도를 높여서, 그 온도에서의 리튬 클라블라네이트의 용해적을 크게 초과하도록 한다. 클라블라네이트는 낮은 온도에서 용해도가 감소하므로 침전을 최대로 하기 위해 온도를 약 0 내지 5℃로 낮추는 것이 편리하다.

염석을 위한 리튬 클라블라네이트를 함유하는 수용액에서의 이온성 리튬 화합물의 농도는 포화농도까지의 농도가 일반적이나 4내지 10몰이 바람직하며 5내지 8몰이 특히 바람직하다.

리튬 클라블라네이트 침전을 1차 수득한 후에 모액을 더 농축시켜서 침전을 2차로 수득하면 유리하다.

[기타 클라블라네이트의 리튬 클라블라네이트로의 전환]

리튬 클라블라네이트를 함유하는 용액은 리튬 염외의 클라블란산염, 예를 들면 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 바륨, 칼슘 또는 암모늄염을 물에 용해하고 여기에 염화리튬 같은 수용성 리튬 염을 가하여 쉽게 생성된다. 바륨염인 경우에는, 염화리튬의 농도를 높게 하면 염화바륨과 리튬 클라블라네이트의 공침이 일어난다. 그러나 염화바륨은 이 혼합물을 물에 재용해하고 리튬 설페이트를 가하여 바륨 설페이트로 침전시키고, 여과등으로 제거하고 염화리튬을 가하여 순수한 리튬 클라블라 네이트를 침전시킨다.

[이온교환수지상의 리튬 클라블라네이트의 생성]

본 발명의 특히 유용한 응용에 따라 처음 사용된 클라블란산 염은 염기성 이온교환 수지와의 염이며 이것을 리튬 염의 수용액과 접촉시켜서 리튬 클라블라 네이트 수용액을 생성한다. 수지는 보통 칼럼 형태로 사용하여, 여기에 불순한 클라블란산 또는 그염을 충진하고 염화리튬과 같은 수용성 리튬염의 수용액을 사용하여 리튬 클라블라네이트 수용액을 용출시킨다. 수지는 보통 용출시키기 전에 물 등으로 세척한다.

일반적으로 수지는 아미노기 또는 3급 아미노기(약 염기성) 또는 4급 암모늄기(강 염기성)을 가지고 있다. 수지로는 폴리스티렌, 폴리아크릴, 에폭시-폴리아민, 페놀릭폴리아민 또는 교차 결합된 덱스트란 수지등이며, 거대망상형 또는 미세망상형이다.

수지란 편의상 셀루로스 유도체 및 천연에 존재하는 중합체로부터 유도된 상술한 덱스트란 유도체도 포함한다. 대표적인 약염기성 이온교환 수지에는 앰버라이트 IRA 68(미세망상체 : 디비닐벤젠과 교차결합된 폴리아크릴레이트 : 3급아미노기), 앰버라이트 IRA 93(거대망상체 : 디비닐벤젠과 교차결합된 폴리스티렌 : 3급 아미노기)가 포함되며, 모두 영국 롬앤드 하스사 제품이다. 대표적 강염기성 이온 교환수지에는 제로리트 FF 및 제로리트 FF(ip)(제로리트사 제품)등이 포함된다.

염기성 이온교환수지는 불순한 클라블란산 또는 그염과 접촉할 때 염형태이어야 유리하며: 음 이온은 용출제로 사용한 리튬 염의 음이온과 동일하면, 편리하게는 염소이온, 바람직하나 다른 음이온도 큰 역효과 없이 사용할 수 있다.

용출제로 사용한 수용성 리튬 염의 농도는 0.02몰 내지 8몰의 범위가 바람직하나, 저농도를 사용하면, 리튬 클라블라네이트 용액의 농도가 너무 낮아서 침전시키기가 힘들다. 일반적으로 0.5 내지 2.5몰이 바람직하다.

흡착/용출법에서는 통상 원하는 생성물을 크로마토그래피로 다른 흡착물질로부터 분리하지만, 침전공정은, 불필요한 불순물에서 리튬 클라블라네이트를 분리하는데 대단히 효과적이므로 용출액에 비교적 고 농도의 리튬염을 사용하여 칼럼을 용출시키는 것이 바람직하다는 것을 알았다. 이렇게하면 칼럼상에 좋은 클라블라네이트 대가 형성되는데 비교적 소량의 용출액으로 용출되어 침전시키기가 쉽다.

용출액은 보통 염화리튬등의 리튬염을 0.5 내지 2.5몰 농도로 함유하는데, 상기한 바와 같이 염석 효과는 5내지 10몰 범위의 농도에서 가장 효과적이다. 따라서 용출액을 진공 증발시켜서 약 5배 인자로 농축시키는 것이 바람직하다. 다음표는 약 20℃에서 염화리튬 수용액의 여러 농도에서의 리튬 클라블라네이트의 용해도를 나타낸 것이다.

[표 1]

상기의 농축공정은 리튬염의 추가보다 바람직한데 리튬 클라블라네이트도 농축되어 모액의 손실을 최소로 하기 때문이다.

수지로부터 흡착된 불순물이 용출되는 것을 최소화하기 위하여는 용출제에 수혼화성의 유기용매를 고농도로 포함시키는 것이 유리하다. 또는 이러한 용매의 부재하에 용출시킨후 용매를 용출액에 가하여 용출된 불순물을 침전시키고, 이 침전을 분리할 수도 있다. 용매의 예로는 아세톤과 같은 케톤, 메탄올, 에탄올, 이소프로필 알콜 또는 에틸렌 글리콜과 같은 알콜, 디옥산 또는 테트라하이드로푸란과 같은 환상에테르, 디메틸포름 아마이드 또는 디메틸설폭사이드와 같은 치환된 아마이드, 이미드 또는 설폭사이드 등을 들 수 있다. 일반적으로, 그런 용매로는 에탄올 또는 이소프로필 알콜 같은 알콜류가 바람직하다.

불필요한 불순물을 분리하기 위하여 알콜을 가할 때 용출제 또는 용출액의 바람직한 알콜 농도는 용량으로 70내지 97%이다.

[수혼화성 용매를 사용한 리튬 클라블라네이트의 침전]

상기 공정에서 수혼화성 유기용매 및 리튬염의 농도가 너무 높으면, 리튬 클라블라네이트가 미리 침전되므로 주의하여야 한다. 실제로 이러한 용매를 매우 고농도로 사용하여 수용액에서 리튬 클라블라네이트를 침전시키는 것이 가능하며, 이렇게 하면 앞에서 약술한 바와 같이 리튬 클라블라네이트를 선택적으로 침전시킬 수 있는 이점이 있다. 클라블란산 또는 그염을 칼럼으로부터 용출시키든가 단일용액에 그염을 용해시켜서 비교적 저농도의 리튬염과 접촉시키고, 수-혼화성 용매를 가하여 농축시키지 않고도 침전시킬 수 있다. 예를들면, 용량으로 최소한 90%, 바람직하게는 최소한 95%의 알콜이 리튬 클라블라네이트를 침전시키는데 효과적이다. 리튬 클라블라네이트를 1차 수득하고 진공중에서 약 4분의 1등으로 농축시켜 2차로 수득한다.

[이온 교환수지에 의한 클라블란산 염의 제조]

전술한 염기성 이온교환수지에 여과 또는 원심분리 등에 의해 미리 고형물질을 제거한 발효액을 직접 적용시켜서 클라블란산 또는 그염을 충진한다. 이것은 뒤이은 리튬침전공정의 현저한 정제효과로 인해 가능하다. 고형물질을 제거한 후에 발효액을 흡착 목탄으로 처리하여 클라블란산 또는 그염을 흡착시키는 것이 바람직하며; 이렇게 하면 클라블라네이트로부터 다른 염을 분리하기 쉽고, 염기성 이온교환수지에 불필요한 이온성 물질이 결합하는 것을 피할 수 있다.

일반적으로, 정화한 발효액을 칼럼등에서 목탄베드를 통과시킬 수 있는데, 목적하는 클라블란산 또는 그염을 모두 흡착시키는데 충분한 량의 목탄을 사용하는 것이 바람직하며 보통 정화한 발효액 3내지 10부(용량)에 대하여 목탄 약 1부의 비율로 사용한다. 통상의 목탄이 적절하며, 고도로 활성화된 물질을 사용할 필요는 없다.

목탄을 메틸에틸케톤, 메틸이소부틸케톤 또는 바람직하게는 아세톤과 같은 케톤등의 수혼화성 용매로 처리할 수 있으며, 농도는 30 내지 95%가 유리하며, 50 내지 70%가 바람직하다. 용매로 처리하기전에, 물 등으로 목탄을 세척하여 잔류하는 발효액 성분을 제거하는 것이 바람직하다.

상기공정의 다른 변형은, 상술한 바와 같이 클라블란산의 수지염을 제조하여, 리툼염외의 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘염, 예를들어 클로라이드, 아세테이트, 또는 암모늄 포르메이트 또는 아세테이트 또는 피리딘 하이드로클로라이드 등의 암모늄 또는 피리디늄염으로 용출시켜 상응하는 클라블라네이트 수용액을 생성하고; 과량의 수용성 리튬염을 용출액에 가하고, 전술한 바와 같이 리튬 클라블라네이트를 침전시킨다.

[스트레토마이세스 클라블리게루스의 발효]

스트렙토마이세스 클라블리게루스에서 클라블란산을 제조하는 과정은 탄소, 질소 및 무기염류와 같은 영양원의 존재하에 스트렙토마이세스 클라블리게루스를 배양하는 통상의 방법으로 행한다. 배양은 호기성 조건하의 심층배양이 바람직하다.

탄소, 질소 및 무기질 원은 단일 또는 복합영양원으로 제공된다. 탄소원으로는 일반적으로 글루코스, 전분, 글리세롤, 당밀, 서당, 덱스트린 또는 락토스가 포함된다.

질소원으로는 소야빈밀, 옥수수침지액, 알콜 박즙(distiller’s solubles), 효모 추출물, 면실박, 펩톤, 카제인 또는 아미노산 혼합물이 있다. 요소 및 다른 아마이드를 사용할 수도 있다.

배양배지에 넣을 수 있는 무기염류 영양원으로는 일반적으로 나트륨, 칼륨, 암모늄, 철, 마그네슘, 아연, 닉켈, 코발트, 망간, 칼슘, 포스페이트, 설페이트, 클로라이드, 카보네이트 이온을 생성할 수 있는 염류가 포함된다.

자나친 기포생성을 조절하기 위하여 소포제를 간격을 두고 필요에 따라 가할 수 있다.

스트렙토마이세스 클라블리게루스의 배양은 일반적으로 20내지 37℃, 바람직하게는 25내지 30℃에서 행하며 진탕, 교반하고 통기시키며 행하는 것이 좋다. 생장 배지는 처음에 미생물의 포자현탁액 소량으로 접종시키기도하나, 생장정지기를 피하기 위하여, 미생물의 포자형태로 소량의 배양배지를 접종하여 미생물의 증식성 접종물을 제조한 다음, 얻어진 증식성 접종물을 발효 배지에 옮기거나, 또는 주 발효배지에 옮기기 전에 종자기(seed stage)로 옮겨 더 증식시킨다.

미생물은 스트렙토 마이세스 클라블리게루스 균주이다. 균주 NRRL 3585 및 그 변이주가 클라블란산 제조에 특히 만족할만한 균주임이 밝혀졌다.

선택할만한 발효법으로서는, 스트렙토 마이세스 클라블리게루스 NRRL 3585 또는 그 변이주의 사면배지를 동화성의 탄소원인 서당 글리세린 및 동화성의 질소원인 트립톤 또는 동화성의 탄소 및 질소의 복합물인 알콜박즙 및 효모추출물 및 영양무기질을 함유하는 배지에 접종한다. 이 배지는 25내지 30℃에서 진탕하며 3일까지 배양시킨다.

이렇게 증식된 접종물을 유사한 동화성의 탄소, 질소 및 무기질원을 함유하는 영양배지에 접종(약 10% 까지의 양)한다. 발효는 pH 6.0 내지 7.5의 범위에서 통기하며, 진탕하면서 2내지 10일간 25°내지 30℃에서 행하는 것이 바람직하다.

[클라블란산의 페놀성 용액의 추출에 의한 리튬 클라블라네이트 및 기타 클라블라네이트의 제조]

클라블란산의 페놀성 용액을 수산화리튬 수용액으로 추출하고 이 수용액을 수혼화성용매 즉 에테르, 클로로포름 또는 카본-테트라클로라이드로 추출하여 잔류 페놀성 용매를 제거한 후 리튬 클라블라네이트를 상술한 바와 같이 침전시켜 리튬 클라블라네이트를 함유하는 수용액을 수득한다.

상기 방법은 또한 페놀성 용액을 적절한 염기 예를 들면 알칼리토금속 수산화물 즉 수산화칼슘 또는 수산화바륨으로 추출하여 리튬염 이외의 클라블란산염을 제조하는데에 사용할 수도 있다. 생성되는 모든 침전 예를 들면 바륨설페이트 등을 반드시 제거하여야하며 그염을 동결 건조등으로 분리할 수 있다. 리튬염으로 전환시켜 상술한 바와 같이 정제한다.

일반적으로 페놀성 용매의 추출은 pH 약 6.5에서 수상이 얻어지도록 수행해야 한다.

용출물을 농축시키고 필요하면 불필요한 유기불순물을 하나이상의 수혼화성 유기용매를 가해서 침전시키거나 수혼화성 용매로 추출하여 불순물을 제거한후 활성탄 또는 상술한 종류의 수지 흡착제로부터 수성용출물을 추출하여 페놀성 추출물을 수득한다.

따라서 활성탄 또는 수지로부터의 용출물을 감압하에 증발 농축시키는 것이 바람직하다. 일반적으로 분해를 최소화하기 위해, 정제과정의 pH는 6.0내지 7.0, 예를들어 6.5가 바람직하다. 불필요한 물질을 아세톤 같은 수혼화성케톤 50내지 90용량%, 유리하게는 약 85%로 침전시켜, 용출물을 정제한다. 이때의 pH는 6.5가 바람직하며 수용액에 이미 수혼화성 케톤이 함유되어 있으면 pH측정을 위해 제거하는 것이 바람직하다. 염기 예를들면 수산화나트륨같은 알칼리 금속 수산화물을 가하여 pH를 조절할 수 있다.

케톤 침전물의 여액을 농축하고, 황산 또는 염산과 같은 무기산을 가하여 pH를 4로 조절하고, n-부탄올 또는 고분자량알콜로 추출하는 등의, 용매추출과정에 의해, 불필요한 성분을 제거하여 정제할 수 있다. 1내지 8배량의 용매를 사용하면 편리하다.

추출공정이후 수층을 약 pH5.6에서 농축하고 무기산으로 pH를 약 4로 낮춘후 목적하는 항생물질을 페놀성 용매 예를 들어 페놀이나 크레졸중으로 추출하여 정제한다. 페놀성 용매는 N,N-디메틸아닐린과 같은 염기 및 클로로포름 또는 카본 테트라클로라이드 같은 수혼화성용매를 함유하는 것이 유리하다. 매회 추출시, 2/3배량의 용매를 사용하여 수회에 걸쳐 추출한다. 이 추출물을 합하고 용매량의 약 1/15의 물을 가하여 분리상을 생성한다.

염기의 수층에 수산화리튬등의 알칼리금속-수산화물 또는 수산화바륨 또는 수산화칼슘등의 알칼리토금속 수산화물을 pH6.5까지 가해 항생물질을 역추출한다. 수층을 페놀층으로부터 분리하고 역추출을 반복하는 것이 유리하며, 수성추출물을 합한다. 바륨설페이트등의 침전을 분리한 후 잔류 페놀성 용매를 수혼화성 용매 예를 들어 에테르, 클로로포름 또는 카본테트라 클로라이드로 추출하여 수용액으로부터 제거하고, 항생물질의 염을 회수하기 위하여 수상을 동결 건조하거나 pH6.5에서 분무 건조한다.

특히 세파덱스(파마시아사제품)같은 물질을 사용하는 크로마토그래피등의 통상적 기술로 정제할 수 있다. 따라서 보통 바륨염등의 염형태인 항생물질을 세파덱스 G15등의 세파덱스 컬럼에 적용하여, 물로 용출하고, 높은 항생물질 활성을 갖는 분획을 합해, 동결건조등에 의해 염을 회수할 수 있다.

[리튬클라블라네이트의 클라블란산 및 기타의 염으로의 전환]

상기 방법으로 제조한 정제된 리튬 클라블라네이트를 이온교환 수지를 사용하여 기타의 염으로 전환할 수 있다. 따라서, 수성리튬염을 양이온 교환수지, 예를들어 바이오래드 AG 50×8(캔리포니아, 리치몬드 바이오래드 래보라토리스제품)에 적용하여 물등으로 용출할 수 있는데, 양이온은 나트륨 또는 칼륨등의 목적하는 클라블란산염의 양이온이다.

클라블란산에 대한 수혼화성 용매 예를들면 에틸아세테이트같은 에스테르용매 존재하에 염화나트륨 또느 암모늄 설페이트로 포화시킨 높은 이온강도의 리튬염의 수용액을 pH 약 2.6으로 산성화시켜 유리 클라블란산을 제조할 수 있다. 필요하면 수상을 용매로 더 추출하고 추출물을 합한다. 일반적으로 pH를 충분히 낮추는 산 예를 들어 염산같은 무기산이 산성화 반응에 적절하다. 용매를 제거하여 유상의 유리산을 수득한다. 수불혼화성 용매중의 유리산의 용액을 적당한 염기의 수용액으로 추출하고 염을 분리하여 광범위한 염의 제조에 사용할 수 있다. 염을 분리하기 전에 수상으로부터 고체물질을 여과할 필요가 있다.

유리산은 불안정하므로 생성 즉시 염 또는 기타 유도체의 제조에 사용하는 것이 바람직하다.

다음의 제조예 및 실시예는 본 발명을 상세히 설명한다.

고체 및 액체중의 클라블란산의 함량은 다음과 같이 측정한다.

[1. UV 스펙트로스코피]

클라블란산 및 그염의 수용액은 230㎚ 이상에서 대단히 낮은 UV 흡광도를 나타내며 280㎚에서의 분자흡광계수 ε는 약 60이다. 그러나, 알칼리용액에서는 λmax 259±1에서 UV흡광도가 크게 증가하여 클라블란산 또는 그염을 분석하는데 이용할 수 있다. 분석에 있어서, 고체를 정확히 평량하여 묽은 수산화나트륨(0.1M)에 용해하여 0.01㎎/㎖의 클라블란산에 해당하는 용액을 제조한다. 259㎚ 또는 그 근처에서의 용액의 흡광도를 적절한 분광광도계로 측정하고, 클라블란산의 ε를 16,700로 가정하여 고체물질 순도를 계산한다. 분자흡광계수를 E₁치로부터 계산하며 이는 1㎝ 셀(cell)중의 1% 용액에 대한 흡광계수이다. 필요하면 유기용매를 제거한 후 유사한 방법으로 반응액을 묽은 수산화나트륨으로 정확히 희석하면 알칼리 및 클라블란산의 농도가 유사하게 되며, 원액중의 클라블란산 농도를 상술한 바와같이 측정한다. 조(粗)고체 및 반응액의 값을 동일한 농도의 수용액을 사용하여 불순물에 의한 흡수에 대해 보정한다.

[2. 생물학적 활성]

리스 및 투틸법(Lees, K.A ＆ Tootill, J.P.R., Analyst, 1955, 80(947), 95-110 : 동 110-123 : 80(952), 531-535)에 따라 아시네토박터(Acinetobacter)에 대하여 한천 컵플레이트 분석법으로 기지농도의 클라블란산 고체의 용액과 비교하여 측정한다. 모든 배지는 발효전에 증기 멸균한다.

[제조예 1]

[바륨염의 제조]

a) 접종

멸균증류수(10ml)를 스트렙토마이세스 클라블리게루스 NRRL 3585의 14일 경과한 맥아/효모추출물 사면한천에 가하여 현탁액을 생성한다.

이 현탁액의 이루(1.5ml)를 사용하여 다음 조성을 갖는 2ℓ플로렌스 플라스크중의 배지 150ml에 접종한다.

물을 가하여 100%로 한다.

이 플라스크를 회전반경 2인치의 회전진탕기에서 220rev/min로 48시간동안 26℃에서 배양한다. 접종물 150ml을 다음 조성을 갖는 5ℓ발효기중의 배지 4ℓ에 접종한다.

공기를 통해주며(0.75v/v/min) 물을 가해 100%로 하고, 교반하며(750rev/min, 20시간) 28℃로 유지한다.

b) 발효

(a)의 20시간 교반 접종물 7.5ℓ를, 다음 조성을 갖는 220ℓ 용기중의 배지 150ℓ에 접종한다.

물을 가해 100%로 하고 공기를 통해주고(2v/v/min) 진탕(350rev/min)하며 28℃로 90시간동안 발효시킨다.

c) 분리

(b)단계로부터의 전발효액을 pH 6.3으로 조절하고 원심분리하여 정제한다. 맑은 상등액(89ℓ)을 피츠버그 CAL 목탄(20ℓ)을 함유하는 컬럼에 적용한다.

목탄을 증류수(40ℓ)로 세척하고 배수 건조시킨다. 목탄을 아세톤(10ℓ) 및 90% 아세톤 수용액(40ℓ)으로 용출한다. 용출분획(5×10ℓ)을 모아 각 분획을 감압하여 증발시켜 아세톤을 제거한다.

분획 1(5ℓ 수용액)을 냉동 건조시켜 2.2ℓ로 농축하고 아세톤을 가하여 최종농도를 약 84%로 한다. 분획 2(0.5ℓ 수용액)에 아세톤을 가하여 최종농도를 84%로 한다. 분획 1 및 2를 필터-에이드(셀라이트 535)로 여과하고 여액을 감압하에 증발시켜 아세톤을 제거한 후 생성 수용액을 합한다.

분획 3내지 5의 수용액을 합해 냉동 건조시켜 고체물질을 얻는다. 합한 분획 1 및 2의 수용액을 합한 분획 3내지 5의 고체물질에 가하여 용액을 생성하고 냉동건조에 의해 0.76ℓ로 농축시킨다. 이 용액(pH4)을 곧 부탄-1-올(1×1, 52ℓ 5×380ml)로 추출한다.

감압하에 증발시켜 부탄올을 제거한후 황산으로 수상의 pH를 5.6에서 4.2로 낮추고 72%의 수성페놀/N, N-디메틸아닐린/카본테트라클로라이드(53 : 5 : 15 용량비) 동량으로 추출한다. 용매층을 수성수산화바륨(500ml로 추출하여 pH6.5의 수용액을 얻는다. 현탁된 바륨설페이트를 여과하여 제거하고 여액을 디에틸에테르로 세척하고 냉동 건조시켜 11.1g의 바륨염 고체를 수득한다. E₁: 220

[제조예 2]

[바륨염의 제조]

제조예 1(a) 및 (b)와 유사한 방법으로 수득한 발효액을 다음과 같이 정제한다 :

pH6.25의 발료액(135ℓ)을 원심분리하여 pH6.3의 상등액(112ℓ)을 얻는다. 이를 피츠버그 CAL 목탄(25ℓ) 컬럼을 통과시키고 컬럼을 물(50ℓ)로 세척한다. 아세톤(10ℓ)을 베드에 조용히 부어 용출을 시작한다. 이어서 90% 수성 아세톤(60ℓ)을 붓는다. 용출물을 분획으로(1×10ℓ, 2×25ℓ) 받는다.

각 분획을 감압 증류하여 아세톤을 제거한다. 잔류 수용액을 1M 수산화나트륨으로 pH6.0으로 조절한다. 분획을 합해 2.9ℓ로 다시 증류하고 적절한 용기에 옮기고 증류기 세척액을 합해 3.3ℓ로 만든다. 아세톤(17ℓ) 및 셀라이트 535(500g)를 격렬하게 교반하면서 농축물에 가한다. 생성된 현탁액을 여과하고 그 케이크를 85% 아세톤4(ℓ)으로 세척한다.

여액 및 세척액을 합해 감압증류하여 4.0ℓ로 한다. pH를 1M수산화나트륨으로 5.65에서 6.0으로 하고 1.0ℓ로 될 때까지 증류한다. 생성된 농축물을 20% 황산으로 pH 4.0으로 산성화하고 부탄-1-올(4×750ml, 1×50ml)로 세척한다. 용해된 부탄-1-올을 진공에서 수층으로부터 증류해낸다.

20% 황산으로 pH를 4.2로 조절한 후 농축물을 액화페놀 B. P. (265ml), 카본 테트라 클로라이드(75m) 및 N, N-디메틸아닐린(25ml)이 혼합물로 3회 추출한다. 각 추출액의 pH를 4.2로 조절한다. 합한 용매 추출물을 물(250ml)과 교반하고 포화수산화바륨(70ml)으로 pH 6.5로 조절한다. 상을 분리한후 용매를 물(200ml)과 포화수산화바륨(7ml)로 재추출한다.

합한 수상을 디에틸에테르(3×20ml)로 세척하고 진공에서 200ml로 농축하고 냉동 건조시켜 담갈색고체 29.4g을 수득한다. Ei=152

[제조예 3]

[클라블란산을 함유하는 목탄용출물의 제조]

a) 접종

멸균증류수(10ml)를 스트렙토마이세스 클라블리게루스 NRRL 3585의 14일 경과한 맥아/효모추출물 사면한천에 가하여 현탁액을 생성한다. 이 현탁액의 일부(2.0ml)를 다음 조성을 갖는, 2ℓ플로렌스플라스크중의 배지 150ml에 접종한다.

물을 가하여 100%로 한다.

플라스크를 회전 진탕기(회전방경 5㎝, 220rev/min)상에서 48시간동안 26℃에서 배양한다.

이러한 플라스크 6개(총 900ml)를 사용하여 다음의 조성을 갖는 배지 4.5ℓ를 각각 함유하는 5ℓ 발효기 6개를 접종한다.

물을 가하여 100%로 한다.

발효기에 공기를 통해주고(0.67v/v/min) 28℃에서 20시간 진탕한다(750rev/min 쌍날개 직경 7.5㎝)

b) 발효

5ℓ 발효기로부터의 접종물(25ℓ)을 사용하여 다음 조성을 갖는 배지 475ℓ에 접종한다.

물을 가하여 100%로 한다.

700ℓ 스테인레스강철 발효기에 넣어 350rev/min(직경 25㎝의 날개 및 7.5㎝의 바플 4)로 진탕하고 0.56v/v/min로 공기를 통해준다. 2시간동안 28.C 및 pH 6.5에서 발효시키고 필요하면 소포제를 더 가한다.

c) 분리

(b)단계의 전발효액을 농황산으로 pH 5.45로 조절하고 셀루로스로 도금한 회전드럼 여과기로 여과한다. 항생물질을 함유하는 여액(430ℓ)을 컬럼중의 목탄(피츠버그 CAL 135ℓ)에 흡착시킨다. 목탄을 물(90ℓ)로 세척하여 여과된 발효액을 치환한다. 항생물질을 수성아세톤(60% v/v : 180ℓ)으로 용출한다.

[실시예 1]

i) 칼슘염의 제조

a) 제조예 2에서의 조바륨염(8.83g)을 (NH₄)₂SO₄의 포화수용액 50ml에 가한다. 에틸아세테이트(50ml)를 가하고 이 혼합물을 교반한다. pH 전극을 혼합물에 넣고 1M 황산 15ml로 pH를 6.8에서 2.6으로 조절한다. 수용액을 에틸아세테이트로부터 분리하고 새로운 에틸아세테이트(50ml)와 다시 교반한다. 2회의 에틸아세테이트 추출물을 합하고 증류수(100ml)를 가하고 혼합물을 pH 전극을 넣은채로 교반한다. 약 40ml의 포화수산화칼슘 용액을 혼합물의 pH가 6.6.이 되도록 가한다. 수용액을 에틸아세테이트로부터 분리하고 필터에이드로 여과하고 동결 건조하며 칼슘염 고체 1.44g을 수득한다.

(b) (a)에서 수득한 고체를 증류수 15ml에 용해하고 밀리포오 필터로 여과한후 세파덱스 G15를 물 중에 충진해 직경이 1인치, 높이 60인치인 베드를 생성한 컬럼에 적용한다. 증류수로 용출하고 20ml의 분획을 모은다. 분획은 TLC(셀루로스, 이스트만 코닥 6065플레이트 ; 용매, 아세토니트릴-물, 7 : 3(용량))한 후 스타필로코커스 아우레우스를 함유하는 영양한천을 덧씌워 정량한다. 분획 33내지 37을 합해서 동결 건조시켜 490mg을 수득한다. 고체는 진공에서 오산화인상에서 60시간 방치한다. (b)에서 수득한 칼슘염은 다음의 특성을 갖는다.

[PKa]

상응하는 산의 PKa 값은 염의 전위차적정에 의해 약 2.4임이 밝혀졌다.

[광회전]

22℃에서 [α]_D는 +44.9°이다. (농도는 0.287g/100ml 물)

[UV 스펙트럼]

0.1M NaOH 100ml에 용해한 샘플(0.00148g)은 258㎛에서 흡수극대가(Ei 값 550) 나타난다.

[IR 스펙트럼]

샘플의 뉴졸 멀의 IR스펙트럼은 다음의 파수(cm^-1)에서 흡수극대가 나타난다.

(s, m, br 및 w=강도의 강, 중, 광, 약을 각각 나타낸다)

[NMR 스펙트럼]

샘플의 중수용액의 수소 n m r 스펙트럼은 4.31, 5.10, 5.85, 6.46, 6.91(τ)에 중심을 둔 피크군을 나타낸다.

[박층크로마토그라피]

물에 용해한 샘플 일부를 이스트만-코닥 셀룰로스 TL플레이트(plastic backed, EK 6065) 또는 이스트만-코닥 실리카 TL플레이트(plastic backed, EK 6060)원점에 적용한다. 플레이트는 실온에서 용매로 전개하고 풍건하고 스타필로코커스 아우레우스를 함유하는 영양한천을 덧씌운다. 원점과 용매전선 사이의 거리로 나눈 원점과 박테리아 생장억제대 중심까지의 거리로 계산되는 Rf 값을 다음 다섯계에 대해 구한다.

[종이이온영동]

샘플의 일부를 와트만 541 지 20㎝를 사용해서 400V로 1시간동안 이온영동시킨다. 스타필로코커스 아우레우스를 함유하는 영양한천을 풍건한 종이에 입혀 측정하는 활성도는 pH4.8(0.01M 아세테이트), pH6.9(0.01M 포스테이트) 및 pH9.5(0.01M 피로포스페이트)에서 시아노코발라민에 관해 음극쪽으로 4.5㎝ 이동한다.

(ii) 리튬염의 제조

상기 (i)(b)에서와 같이 제조된 칼슘염(1g : Ei 590, uv정량에 의하면 약 78%의 순도)을 물 10ml에 용해하고 염화리튬 포화수용액 10ml를 가한다. 긁거나 결정핵을 가하지 않아도 결정화된다. 0℃까지 냉각한 후 결정을 여과하고 에탄올 5ml, 아세톤 5ml 및 디에틸 에테르 2×5ml로 세척한다. 결정을 실리카 겔상에서 감압하(0.1mmHg)에서 2시간 건조하면 고형 리튬염 495.5㎎을 수득한다. 이 염은 다음의 특성을 갖는다.

[원소분석]

[측정치(괄호안은 평균치)]

C, 45.5, 45.8(45.65); H, 3.8, 3.8(3.8); N, 7.0, 7.2(7.1); Li, 3.2%

뉴요오크 크로웰, 반미량정성분석 93페이지의 엔. 디. 체로니스 및 제이. 비. 엔트리킨(1947) 방법으로 황은 검출되지 않는다.

C₈H₈NO Li 4/1 H₂O의 이론치는 C, 45.84 : H, 4.05 : N, 6.68 : Li, 3.31%이다.

상기의 리튬 분석치(3.2%)는 원자 흡수 분광 광도법으로 측정한다. 황산염화된 회분은 26.8%로 Li₂SO₄로 계산되는데 이는 3.38% 리튬에 상당한다.

[PKa]

상응하는 산의 PKa 값은 염의 전위차 적정에 의하면 2.3이다.

[광회전]

24℃에서 0.145% w/v 수용액의 [α]_D값은 +66.0°이다.

[자외부 스펙트럼]

0.1M NaOH 중의 0.00091% 용액의 UV 흡수 스펙트럼은 258㎜에서 최대 흡광도를 나타내는데 Ei은 788이다.

[적외선 스펙트럼]

뉴졸 멀의 i. r. 스펙트럼은 다음에서 흡수피크(cm^-1)를 나타낸다.

첨부된 도면 제1도는 전체 스펙트럼을 나타낸다.

[N.M.R. 스펙트럼]

리튬염의 중수용액의 100 MHZ 수소 n.m.r. 스펙트럼은 다음에 중심을 둔 피크를 나타낸다[단위는 τ로 괄호안은 다중성 및 결합상수(Hz)를 나타낸다].

4.26(d, 3), 5.05(t, 8), 5.06(s), 5.81(d, 8), 6.43(dd, 3 및 17) 및 6.89(d, 17).

(s, d, dd, t 및 m은 단일선, 이중선, 이중ㆍ이중선, 삼중선, 다중선을 각각 나타낸다)

[실시예 2]

[리튬염의 재결정]

실시예 1(ii)에서 제조한 리튬염(0.1g)을 물(1.0ml)에 용해하고 주의하여 이소프로판올(19ml)로 희석한다. 생성물은 0℃에서 서서히 결정화하며 감압하에서 5ml까지 비등시켜서 2회에 걸쳐 수득한다. 리튬염의 결정은 진공에서 실리카겔 상에서 3일간 건조한다.

[일차수득물]

20.0㎎, λmax 259㎚, 0.1M 수산화나트륨 용액중의 10㎍/ml일 때, Ei=814이다.

[원소분석측정치]

C=46.2, 46.0; H=4.10, 3.85; N=6.8, 6.7% C₈H₈NO₅Li 1/4 H₂O의 이론치는 C=45.84 ; H, 4.06; N=6.68%이다.

[이차수득물]

67.0㎎, λmax 259㎜, 0.1N 수산화나트륨중의 10㎍/ml에서, Ei=800이다.

[원소분석측정치]

C=46.15, 46.5 ; H=3.9, 4.0 ; N=6.65, 6.5리튬 3.4%(황산염화회분)

C₈H₈NO₅Li 4/1 H₂O의 이론치는 C=45.84 ; H, 4.06; N=6.68 ; Li=3.31%이다.

[실시예 3]

제조예 2에서 제조한 바륨염(30g :

=274)을 물(40ml)에 용해하고 포화 암모늄설페이트용액(300ml)을 가한다. 이 용액의 pH를 황산(20%, 23.0ml)으로 2.3으로 조절하고 에틸아세테이트(2×300ml)로 추출한다. 물(200ml)을 합한 추출물에 가한다. 혼합물을 격렬하게 교반하고 수산화나트륨용액(1M,89.3ml)을 가하여 pH가 6.8이 되도록 한다. 수상을 분리하고 감압하에 33ml로 증류한다. 부탄-1-올(770ml)을 수성 농축액에 가하고 혼합한 후 40℃까지 가온하고 격렬하게 진탕한다. 불용성물질을 여과하고 완전히 용해할때까지 물 : 부탄-1-올(1 : 23v/v)로 재추출한다. 용액을 합해서 4℃로 철야 냉각한다. 생성된 결정을 여과하여 모으고 부탄-1-올 및 아세톤으로 세척하고 풍건하면 나트륨염 3.34g을 수득한다(

648).

나트륨염 2.92g을 물에(20ml)용해하고 여과한다. 염화리튬용액(20ml, 20℃에서 포화)을 5분에 걸쳐 가하면서 여액을 0℃에서 교반한다. 교반과 냉각을 1시간 계속한 후 여과하여 결정을 수득한다. 에탄올(20ml) 아세톤(2×20ml) 디에틸 에테르(2×25ml)로 세척하고 풍건하면 리튬염(2.275g)을 백색의 신장된 평판 프리즘으로 수득한다.

=770이다.

[실시예 4]

제조예 2에서 제조한 조 바륨염(7.99g;

288)을 물(60ml)에 용해하고 여과한다. 여액을 주위온도에서 교반하면서 나트륨 로디조네이트에 의한 외부 점적판상이 바륨 테스트가 음성일때까지 리튬 설페이트(4.0g)를 소량씩 가하여 처리한다. 현탁액을 원심분리하고 상등액을 경사하고 감압하에서 약 35ml까지 비등시킨다. 교반과 냉각을 계속하며 염화리튬(9.0g)을 소량씩 가한다; 0℃에서 1시간후 리튬염을 여과에 의해 수득하며 에탄올(10ml), 아세톤(2×25ml), 디에틸에테르로 세척하고 여두에서 풍건하면 백색프리즘 1.590g을 수득한다(

790).

[실시예 5]

[나트륨염의 제조]

실시예 1(ii)에서 제조한 리튬염(3.5g)을 증류수 20ml에 용해하고 AG 50×8양이온 교환수지(바이오-래드, Na⁺200-400메쉬)를 함유한 컬럼에 적용한다. 물로 용출하고 분획 8ml를 모은다. 분획일부를 종이에 적용하고 스타필로코커스 아우레우스를 함유하는 영양한천을 분석한다. 활성분획(4 내지 13)을 합하여 동결 건조시킨다.

동결 건조시킨 고체를 증류수에 용해하여 19ml용액을 생성하고 부탄-1-올(450ml)과 함께 진탕하고 용액이 거의 투명해질때까지 가온한다(수욕). 온 용액을 신터를 통해 여과하여 황색고체를 제거하고, 여액을 4℃에서 60시간 유지한다. 생성된 결정은 여과하고 부탄-1-올(2×10ml)로 세척하고 아세톤(2×10ml)으로 다시 세척한 후 감압하 40℃에서 1시간 건조하면 고체 2.18g을 수득한다. 이 고체를 상술한 물-부탄-1-올(1 : 23.3, 용량)으로부터 재결정한다. 결정을 실리카겔상에서 감압하 44℃에서 1.5시간 건조하면 나트륨염 1.8g을 수득한다.

이 고체는 흡습성이다. 모르타르에서 갈아 18℃에서 대기중의 수분을 흡습하도록 방치한다. 약 22%(w/w)의 물을 흡습한 후 평형에 도달한다.

이 염은 다음의 특성을 갖고 있다.

[원소분석(평형을 이룬 습한 고체)]

측정치(괄호 안은 평균치이다) :

C, 33.3, 33.2(33.25); H, 4.6, 4.6(4.6); N, 4.6, 4.7(4.65); Na, 7.3(흡수분광광도법) 7.9(황산염화된 회분으로부터 계산); 물, 21.95%

C₈H₈O₅NNaㆍ4H₂O의 이론치 C, 32.76; H, 5.46; N, 4.78; Na, 7.8; 물 24.57%이다.

[금속분석]

(1) 원자흡수분광 광도법에 의한 측정치 :

나트륨 7.3±0.2%(이 값은 원소분석에서 인용된다.)

(2) 황산염화 회분이 Na₂SO₄라고 가정하면 나트륨함량은 7.9%로 계산된다.

[광회전]

24℃에서 0.134%(w/v) 수용액의 [α]_D는 +47°이다.

[자외부 스펙트럼]

0.1M NaOH중의 0.00098%용액의 UV흡수 스펙트럼은 258㎚에서 최대흡광도(λmax)를 나타내며

값은 555이다.

[적외부 스펙트럼]

뉴졸 멀(Nujol mull)의 IR스펙트럼은 다음에서 흡수피크(cm^-1)를 나타낸다.

첨부된 도면 제2도는 전체 스펙트럼을 나타낸다.

[N.M.R. 스펙트럼]

중수용액의 n.m.r. 스펙트럼은 4.25, 5.07, 5.82, 6.44 및 6.88에서 중심을 둔 피크군(τ치)을 나타낸다.

[실시예 6]

[칼륨염의 제조]

실시예 1(ii)에서 제조한 리튬염(3.0g)을 물(199ml)에 용해하고 도웩스 50W×2컬럼(450ml 칼륨싸이클)을 통과시킨다. 선용출액(150ml)을 버린다. 다음의 400ml의 용출물을 모아 감압하에 15ml로 농축한다. 부탄-1-올(340ml)을 가하고 이 혼합물을 가온하여 잘 진탕한다. 불용성고체를 여과해낸다. 여액을 감압하에 200ml로 증류하여 4℃에서 철야 저장한다. 결정성 침적물을 여과하여 부탄-1-올(2×10ml), 아세톤(2×50ml) 및 디에틸 에테르(2×50ml)로 세척하고 최종적으로 주위온도에서 진공 데시케이터중에서 건조한다. 칼륨염 2.34g을 수득한다(

=704).

는 칼륨염 7.1㎎을 물 100ml에 용해하여 측정한다. 이 용액 1ml를 0.1M 수산화나트륨으로 10ml로 희석하여 7.1㎍/ml의 최종용액을 수득한다.

[원소분석]

측정치 : (평균치를 괄호 안에 표시)

C, 40.0, 40.14(40.07)

H, 3.5, 3.55(3.53)

N, 6.0, 5.82(5.91)

K(흡수 분광광도법으로 측정) 16.0(황산염화된 회분으로) 15.9, 물 1.75, 1.95(1.85)%

C₈H₈NO₅K 1/4H₂O의 이론치는 C 39.7 : H 3.5 : N 5.8 : K 16.2 : 물 1.96%이다.

[광회전]

0.27% w/v 수용액의

는 +58.4°이다. 유사한 방법으로 리튬 클라블라네이트로부터 칼슘, 바륨 및 마그네슘염을 제조한며

은 각각 530, 576 및 713이다.

[실시예 7]

[유리클라블란산의 제조]

실시예 1(ii)에서 제조한 리튬염(500mg)을 에틸아세테이트(10ml) 및 포화염화나트륨(10ml)가운데 분배한다. 2N염산(1ml)을 가하고 이 혼합물을 잠시 진탕한다. 수상을 분리하고 에틸아세테이트(10ml)로 세척하고 합한 유기추출물을 포화염화나트륨(15ml)으로 세척한다. 생성되는 유기용액을 나트륨설페이트상에서 건조하고 거의 증발 건고하여 에틸아세테이트 약 0.5몰을 함유하는 기름상(352mg)으로 유리산을 수득한다.

본 화합물은 다음과 같은 성질을 갖는다.

(C 1.0 : DMSO) +54.5°, 0.1N NaOH중 0.0009%용액의 λmax는 258nm(

590), 뉴멀졸의 IR피크는 3350, 1790 및 1722cm^-1. n.m.r. 피크(DMSO-d₆)는 τ 4.31(d, 3Hz), 4.99(s), 5.23(t, 7Hz), 5.97(d, 7Hz), 6.37 및 6.93(dd, 3 및 17Hz : d, 17Hz) : τ 8.82, 8.00 및 5.95에 중심을 둔 피이크는, 샘플에 클라블란산 1몰당 0.5몰의 에틸아세테이트가 함유되어 있는 것을 나타낸다. 이러한 숫치들은 샘플에 최소

[실시예 8]

[암모늄 염의 제조]

드웩스 50W컬럼(240ml)을 암모늄 설페이트로 처리하여 암모늄싸이클로 전환시키고 물로 세척하여 설페이트를 제거한다. 리튬염(1.0g)을 물(15ml)에 용해하여 컬럼에 적용하고 그 컬럼을 물로 전개한다. 분획을 취하여 (25ml) 0.1N수산화나트륨에서 UV흡수를 테스트한다. 활성분획(4 내지 7)을 합해 감압하에 거의 증류 건고하고 n-부탄올(85ml)을 가한다. 이 혼합물을, 결정성물질이 침전될 때까지 0.1mm압력 및 25℃에서 증류한다. 여과하여 암모늄염을 수득하고 극소량의 에탄올과 아세톤으로 세척한후 디에틸 에테르로 세척하고 0.1mm 압력에서 6시간 건조하여 백색결정(0.54g)을 얻는다.

(C 0.39%수용액) +60.1° ; λmax(0.1N수산화나트륨 : 8.8㎍/ml) 258nm(

745) : 뉴졸에서 i.r. 피크는 3,360, 1,780, 1,700 및 1,580cm^-1: τ(5% D₂O)는 4.27(d, 3Hz), 5.08, 5.09(t, 7Hz), 5.84(d, 7Hz), 6.43(dd, 17Hz, 3Hz) 및 6.89(d, 17Hz). 측정치 : C 44.4 : H 5.6 : N 13.3% C₈H₈NO₅NH₄의 이론치는 C 44.4 : H 5.6 : N 13.09%이다.

미량의 수분(0.6%)이 칼 피셔 분석법으로 측정된다.

[실시예 9]

[메틸아민염의 제조]

앰버라이트 IR 120H⁺컬럼(200ml)을 0.5M 메틸 아민 수용액으로 처리하여 메틸암모늄 형태로 전환시킨다. 이를 물로 세척하여 중화하고 물(10ml)중의 염화메틸암모늄(3.0g)을 도입한다. 컬럼을 물로 세척하여 염소이온을 제거한다.

리튬염(1.50g)을 물(15ml)에 용해하여 컬럼상부에 도입한다. 컬럼을 물로 전개하여 분획(25ml)을 취한다.

분획 3내지 7을 합해(세척액을 포함, 161ml) 35°/1.0mm에서 약 2ml로 증류하여 n-부탄올(200ml)를 가한다. 결정화되기 시작할 때 투명한 용액을 유사한 조건하에서 20ml로 증류한다. 2℃에서 1시간후 결정을 여과하여 수득하고 디에틸에테르(2×15ml)로 세척하고 1mm에서 3시간 건조하여 백색의 신장된 프리즘군으로 메틸아민염(1.2g)을 수득한다.

(C 0.23%수용액)+56.1° λmax(0.1N 수산화나트륨, 9.5㎍/ml) 260nm(

584) : 뉴졸중의 i.r. 피크는 25,000, 1,790, 1,692, 1,632 1,576cm^-1; τ(8% D₂O)는 6.40 및 6.86(dd, 17Hz, 3Hz : d, 17Hz), 4.24(d, 3Hz), 5.06(t, 7Hz), 5.78(d, 7Hz), 5.08(s), 7.42(s); 측정치 C 46.7 : H 6.1 : N 12.5% C₉H₁₄N₂O₅의 이론치는 C 47.0 : H 6.1 : N 12.2%이다.

[실시예 10]

[피페리딘염의 제조]

이론교환수지 컬럼(200ml바이오-래드 래보라토리스, AG^(R)50W×2,100-200메쉬 H⁺형)을 물(1,500ml)중의 피페리딘(75ml)의 용액으로 피페리디늄형태로 전환시킨다. 수지를 물로 중화하고 물(10ml)중의 염화피페리디늄(3g)으로 처리한다. 컬럼을 물로 세척하여 염소이온을 제거한다.

리튬염(1.50g)을 물(15ml)중의 컬럼상부에 도입하고 25ml의 분획을 취하면서 물로 전개한다. 분획 3내지 6을 세척액과 합한다(172ml).

용액을 35°/1.0mm에서 거의 증발 건조시키고 순수한 톨루엔을 가한다. 유상 현탁액을 감입하에 상기와 같이 증발건조시키고 수득된 결정성고체를 에틸 아세테이트(90ml)와 함께 분쇄한다. 결정성 피페리디늄염을 여과하여 수득하고 에틸아세테이트(3×30ml)로 세척하여 잔류용매를 3시간동안 0.1mm에서 제거하여 연회 백색프리즘 1.775g을 수득한다.

(C 0.35%수용액)+42.2°;

λmax(0.1N 수산화나트륨, 10㎍/ml) 259.5nm (

474) : 뉴졸중의 i.r. 피크는 3,380, 2,540, 1,782, 1,682 및 1,608cm^-1: τ(8% D₂O)는 6.90(d, 17Hz), 6.44(dd, 17Hz), 4.28(d, 3Hz), 5.08(s), 5.84(d, 8Hz), 5.08(t, 7Hz), 6.84(복합다중선), 8.0-8.5(복합다중선), 측정치 C 52.8 : H 7.2 : N 9.3% C₁₃H₂₀N₂O₅ㆍ0.6H₂O의 이론치는 C 52.9 : H 7.4 : N 9.5%이다.

[실시예 11]

[트리에틸아민염의 제조]

이온교환수지 컬럼(바이오-래드 AG^(R)50W)을 실시예 10에서와 같이 트리에틸아민 수용액(0.5N, 1.5ℓ)으로 트리에틸암모늄 형태로 전환시키고 물로 세척하여 중화한다. 물(15ml)중의 염화트리에틸암모늄(3g)의 용액을 컬럼에 도입하고 컬럼을 물로 세척하여 염수이온을 제거한다. 리튬염(1.5g)과 물(15ml)중의 컬럼상부에 도입하고 분획 25ml를 취하면서 물로 전개한다. 분획 4 내지 9를 합한다(세척액과 합제 175ml).

이 용액을 감압(35°/1.0mm)하에 비등시켜 기름을 생성하고 이를 동일조건하에 3회, 톨루엔과 함께 비등시킨다. 생성되는 결정을 에틸아세테이트(50ml)로 분쇄하고, 여과 수득하고 디에틸에테르(2×20ml)로 2회 세척하고 0.1mm에서 3시간동안 데시케이터중에서 잔류 용매를 제거하여 연회백색프리즘으로 트리에틸 암모늄염(1.588g)을 수득한다.

(C 0.22%수용액)+44.3° ;

λmax(0.1N 수산화나트륨, 9.7㎍/ml) 258nm(

485) : 뉴졸중의 i.r. 피크는 3,250, 2,080, 1,784, 1,700 및 1,640cm^-1: τ(10% D₂O)는 6.41 및 6.87(dd, 17Hz, 3Hz : d, 17Hz), 4.26(d, 3Hz), 5.07(t, 7Hz), 5.78(d, 7Hz), 5.07(S), 8.74(t, 7Hz) 및 6.78(a, 7Hz), 측정치 C 55.2 : H 7.9 : N 9.2% C₁₄H₂₄N₂O₅4/1H₂O의 이론치는 C 55.2 : H 8.0 : N 9.2%이다.

[실시예 12]

제조예 3에서와 같이 제조한 목탄용출물 샘플을 감압하에 농축하여 아세톤을 제거한다. 생성되는 농축물(1ℓ : 클라블란산 1.28g함유)을 IRA 68수지 컬럼(염소 이온 싸이클 100ml)에 적용한다. 컬럼을 물(300ml)로 세척하고 5%(w/v) 염화리튬 수용액으로 용출하여 용출물을 100ml의 분획으로 모은다.

분획 1 및 2를 합하여 (200ml)감압하에 40ml로 증발시켜 4℃에 철야 방치한다. 생성된 결정을 여과하고 계속하여 에탄올(10ml), 아세톤(50ml) 및 디에틸에테르(50ml)로 세척하고 진공에서 건조하여 백색고체 530mg(

802)을 수득한다. 목탄용출물로부터의 수율은 40.8%이다. 동량의 포화수성염화리튬을 모액에 가하고 4℃에 저장하여 상기와 같이 반응시켜 2차 수득물 178mg(

740)을 수득하는데 추가수율은 12.7%이다.

염화리튬 용출제의 농도, 이온교환수지 : 용출제 양이온 및 음이온의 성질 등을 변화시킨 일련의 실험결과는 다음 표와 같다.

^*가한 목탄 용출물을 기준한 수율

ø 본 실험에서 리튬염온 용출물의 농도를 6배로 하고 동량의 50%(w/v)염화리튬 용액을 가하여 제조한다. 생성되는 리튬염은 상기와 같이 완성한다.

[실시예 13]

제조예 3에서 제조한 목탄용출물 샘플(4ℓ)을 IRA 68 컬럼(염소이온 싸이클 : 250ml)에 통과시키고 물(250ml)로 세척하여 5%(w/v) 염화리튬용액으로 용출한다. 73%생물학적 활성을 갖는 용출물 200ml를 수득한다. 용출물 샘플(70ml)을 5용량의 프로판-2올로 교반하며 처리하여, 타르성의 침전물을 수득한다. 상등액을 경사하여 감압하에 7ml로 농축한다. 4℃에서 철야방치한 후 결정성 생성물을 여과하고 에탄올, 아세톤 및 디에텔 에테르로 계속 세척하여 진공에서 건조한다. 건조된 고형물(870mg)은 생물학적 분석에 의하면 순수하며 수지컬럼용출물로 부터의 수율은 94%이다.

[실시예 14]

IRA 68수지 컬럼(염소이온 싸이클 50ml)에 제조예 3에서 제조한 목탄용출물(840ml)을 충진하고 물(100ml)로 세척하고 푸로판-2-올 : 물(5 : 1)중의 5%(w/v)염화리튬으로 용출한다. 초기의 5베드용량을 감압하에 농축하고 항생물질을 실시예 13에서와 같이 결정화한다. 고체 292mg을 수득하며(생물학적 분석 : 970mg 리튬 클라블라네이트/mg고체)목탄용출물로부터의 수율은 45%이다.

[실시예 15]

브로스를 제조에 3에서와 같이 발효시켜 여과하고 클라블란산 0.43g을 함유하는 여과한 브로스(1ℓ)의 샘플을 IRA 93수지 컬럼(염소이온 싸이클 100ml)에 통과시킨다. 컬럼을 희초산(0.25M : 200ml) 및 물(750ml)로 세척하고 염화리튬 수용액(1M)으로 용출한다. 클라블란산 0.28g을 함유하는 용출물 150ml을 감압하에 농축하여 15ml로 하고 4℃에서 철야방치한다. 생성물을 여과하고 에탄올, 아세톤 및 디에틸에테르로 계속 세척하여 대기중에서 건조하여 고형물 668mg(

: 245)을 수득하며, 여과한 브로스로부터의 수율은 47%이다.

[실시예 16]

브로스를 제조예 3에서와 같이 발효시키고 여과하여 클라블란산 1.23g을 함유하는 여과한 브로스(2ℓ) 샘플을 IRA 93수지컬럼(염소이온 사이클 240ml)에 통과시킨다. 이 컬럼을 물(500ml), 프로판-2-올 : 물(5 : 1, 400ml)로 세척하고, 프로판-2-올 : 물(5 : 1)중의 5% 염화리튬으로 용출한다. 970ml의 용출물을 감압하에 농축하여 100ml로 하고 4℃에서 2일간 저장한다. 생성물은 여과하고 실시예 15에서와 같이 세척하여 고형물 286mg(

662)을 수득하며, 여과한 브로스로부터의 수율은 19%이다.

[실시예 17]

브로스를 제조예 3에서와 같이 발효시키고 여과하여 여액 500ml를 IRA 93(염소이온 싸이클 : 50ml)에 통과시킨다. 컬럼을 물(50ml) 및 95% 수성에탄올(100ml)로 세척하고 염화리튬(95%에탄올중 1% w/v; 50ml분획)으로 용출한다. 분획 2 및 3을 합하여 고체물질이 결정화될 때까지 감압하에 증발시킨다. 농축물을 4℃에서 45분간 냉각하고 고형물을 신터필터에 모은다. 고형물을 에탄올, 아세톤 및 디에틸에테르로 세척하고 진공오븐으로 실온에서 30분간 건조하여 리튬 클라블라네이트 89mg(

770)을 수득하며, 여과한 브로스로부터의 수율을 32%이다.

[실시예 18]

제조예 3에서 제조한 목탄 용출물(5ℓ)를 IRA 68컬럼(500ml베드 컬럼)에 통과시킨다(염소이온 싸이클 1ℓ/h). 이 컬럼을 물(1ℓ)로 세척하고 0.5M염화나트륨 용액으로 용출한다. 초기 용출물 1ℓ를 회전 증발시켜 90ml로 농축한다. 농축물 일부(10ml)를 교반하면서 프로판-2-올(50ml)로 처리한다. 상등액을 타르성 침전물에서 경사하고 회전증발시켜 3ml로 농축하고 30% w/v 염화리튬용액 3ml로 처리한다. 4℃에서 철야 정치한 후 생성물을 여과하고 에탄올, 아세톤 및 디에틸에테르로 계속 세척하고 건조시켜 백색분말 280mg(

770)을 수득한다.

[실시예 19]

실시예 15에서와 같이, 이소프로필알콜과 반응시켜 제조한 리튬 클라블라네이트 2.0g(

667)을 물(16ml)에 용해하여 여과하고; 에탄올(64ml)을 주의해서 가하고 주위온도에서 1시간 교반한다. 처음 생성된 침전물에는 UV스펙트로스코피에 의하면 리튬클라블라네이트가 함유되지 않으므로 버린다. 상등액을 포화 염화리튬 용액(16ml)으로 희석하고 2시간 30분간 방치하여 결정화한다. 결정을 여과 수득하고 흡인건조하고 아세톤(2×15ml) 및 디에틸에테르(2×20ml)로 세척하고 진공에서 항량(1.350g)(

735)이 될때까지 건조한다.

[제제실시예 1]

리튬 클라블라네이트(100mg)를 생리식염수(10ml)에 용해하여 세팔로리딘(100mg)을 생리식염수(10ml)에 용해한 용액과 균질하게 합하여 주사제로 사용하기 적당한 용액을 제조한다.

[제제실시예 2]

제제실시예 1과 같은 조성으로 제조하나, 리튬 클라블라네이트 대신에 나트륨 클라블라네이트(100mg)를 사용한다.

[제제실시예 3]

리튬 클라블라네이트(100mg)를 생리식염수(10ml)에 용해하고, 생리식염수(10ml)에 용해하여 제조한 앰피실린(100mg)의 용액과 균질하게 혼합하여 주사제로 사용하기 적당한 용액을 제조한다.

Claims (1)

1. 다음 구조식(Ⅰ)의 클라블란산 또는 그염을 리튬클로라이드, 리튬브로마이드, 리튬 요다이드, 리튬 설페이트, 리튬 아세테이트, 리튬 프로피오네이트, 리튬포메이트, 리튬벤조에이트, 리튬 락테이트, 리튬 하이드록사이드 가운데 선택한 수성의 이온성 리튬 화합물과 반응시켜 리튬 클라블라네이트를 함유한 수용액을 생성하고, 이를 침전시켜 수용액으로부터 분리하는 것을 특징으로 하는 클라블란산 또는 그염으로부터 불순물을 제거하는 방법.

   

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