CN109154016B - 一种化学-酶法制备熊去氧胆酸的方法 - Google Patents

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Abstract

一种化学‑酶法制备熊去氧胆酸的方法，包括将猪去氧胆酸加入到第一有机溶剂中，并在氧化剂作用下氧化得到6‑氧代‑石胆酸得到6‑氧代‑石胆酸；将所述6‑氧代‑石胆酸和磺酰肼衍生物加入到第二有机溶剂中，使所述6‑氧代‑石胆酸和所述磺酰肼衍生物发生亲核加成‑消去反应，得到腙类化合物；在惰性气体环境下，采用还原剂将所述腙类化合物还原得到石胆酸；将所述石胆酸在羟化酶和辅酶的催化作用下进行羟基化反应，得到熊去氧胆酸。该方法以猪去氧胆酸为初始原料，经过三步化学法和一步生物酶法得到熊去氧胆酸，整个合成工艺步骤少，操作简单，产率高，成本低，可以广泛适用于工业化规模生产。

Description

一种化学-酶法制备熊去氧胆酸的方法
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，特别涉及一种化学-酶法制备熊去氧胆酸的方法。
背景技术
熊去氧胆酸(Ursodeoxycholic acid,UDCA)，分子式为C24H40O4，是中药熊胆的主要成份，其化学名称为(3α，7β)-二羟基-5β-胆烷酸，是鹅去氧胆酸(Chenodeoxycholic acid,CDCA)的7β-羟基差向异构体。UDCA曾主要用于治疗胆石病。近年来，国外报道了UDCA在治疗各种急性、慢性肝病中的应用。新的研究表明，UDCA不仅对于治疗原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎、慢性活动性肝炎具有良好的疗效，还可用于治疗慢性肝炎和肝移植后排斥反应。因此，随着研究的深入，UDCA的利用价值越来越被认识和受到人们的重视，对UDCA的需求量也在逐年升高。
由于中药熊胆为割取熊的胆囊而制成，来源有限，而且有违于动物保护。我国现在采取人工养殖，活熊提取UDCA，但步骤多、周期长、收得率低，不能满足医疗要求，因而人工合成UDCA具有重要意义。目前UDCA的生产工艺主要以鹅去氧胆酸(CDCA)为原料，经过酯化、氧化、还原的方法制备，该产品国内外市场需求量大，而CDCA资源有限，其市场价格逐年升高，造成以鹅去氧胆酸为原料的合成路线成本居高不下。相对而言，猪去氧胆酸(Hyodeoxycholic acid,HDCA)的来源较为广泛，成本较低，因此以HDCA为起始原料人工合成UDCA具有着重要的意义。然而，目前从HDCA合成UDCA都是化学方法，合成步骤均需要7步左右，并且收率低；此外，化学方法常使用到高污染的试剂，比如重铬酸吡啶盐。
因此，开发一条生产UDCA步骤少、转化率高且更环保的合成方法变得越来越迫切。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种化学-酶法制备熊去氧胆酸的方法，共涉及三步化学法和一步酶法，大大减少了传统方法制备过程中繁多的合成步骤，同时本发明所述化学-酶法制备熊去氧胆酸的方法具有低成本、高收率、低污染的特点。
本发明提供了一种化学-酶法制备熊去氧胆酸的方法，包括：
(1)将猪去氧胆酸加入到第一有机溶剂中，并在氧化剂作用下，使所述猪去氧胆酸氧化得到化学结构式如式(Ⅰ)所示的6-氧代-石胆酸，
Figure BDA0001862171010000021
(2)将所述6-氧代-石胆酸和磺酰肼衍生物加入到第二有机溶剂中，使所述6-氧代-石胆酸和所述磺酰肼衍生物发生亲核加成-消去反应，得到化学结构式如式(Ⅱ)所示的腙类化合物，
Figure BDA0001862171010000022
式(Ⅱ)中，R为氢、甲基、乙基、丙基和丁基；
(3)在惰性气体环境下，采用还原剂将所述腙类化合物还原得到石胆酸(Lithocholic acid，LCH)；
(4)将所述石胆酸在羟化酶和辅酶的催化作用下进行羟基化反应，得到熊去氧胆酸。
本发明中，所述化学-酶法制备熊去氧胆酸的方法的具体工艺路线如下所示：
Figure BDA0001862171010000031
其中，所述工艺中前三步反应为化学法，第四步反应为生物酶法；所述猪去氧胆酸的化学结构式如式(Ⅲ)所示，所述石胆酸(或称为3α-羟基-5β-胆甾烷-24-酸，或称为3α-羟基-5β-胆烷酸)的化学结构式如式(Ⅳ)所示，所述熊去氧胆酸的化学结构式如式(Ⅴ)所示。
可选地，所述步骤(1)中，所述氧化剂包括高价碘氧化剂或铬类氧化剂。可选地，所述高价碘氧化剂包括2-碘酰基苯甲酸(2-Iodoxybenzoic acid,IBX)，所述铬类氧化剂包括重铬酸吡啶盐(PDC)。例如，所述氧化剂为2-碘酰基苯甲酸，或为重铬酸吡啶盐。
进一步地，本发明步骤(1)，当所述氧化剂为2-碘酰基苯甲酸，可以避免污染，实现绿色安全环保。所述IBX是一款便宜的且温和的氧化剂，同样是一款环境友好型氧化剂，在空气中稳定，可以长期保存，进行反应时不需要惰性气体保护，甚至可以在有水条件下进行反应，操作简便，产率高、选择性好，在反应过程中很多官能团都不受影响；相比于常用的铬类氧化剂，例如重铬酸吡啶盐(PDC)等，可以大大降低成本，极大的减少污染。
可选地，所述氧化剂与所述猪去氧胆酸的摩尔比为1：(0.5-5)。进一步可选地，所述氧化剂与所述猪去氧胆酸的摩尔比为1：(0.5-3)。优选的，所述氧化剂与所述猪去氧胆酸的摩尔比为1：(1-3)。例如，所述氧化剂与所述猪去氧胆酸的摩尔为1：1，或为1：1.5，或为1：2。在本发明中，优选的摩尔含量的氧化剂可以有效的将所述HDCA的6位的羟基氧化成羰基。
可选地，所述步骤(1)中，所述第一有机溶剂为非醇类有机试剂。进一步可选地，所述第一有机溶剂包括二氯甲烷(CH2Cl2)、四氢呋喃(THF)、丙酮(CH3COCH3)和二甲基亚砜(DMSO)中的一种或多种。例如，所述第一有机溶剂为二氯甲烷，或为二氯甲烷和二甲基亚砜的混合溶液，或为二氯甲烷、四氢呋喃和二甲基亚砜的混合溶液。本发明所述第一有机溶剂对所述猪去氧胆酸和所述氧化剂都具有较好的溶解性。
进一步可选地，所述步骤(1)中，当所述氧化剂为2-碘酰基苯甲酸时，所述第一有机溶剂包括二甲基亚砜。可选地，所述第一有机溶剂为二氯甲烷、四氢呋喃和丙酮中的一种或多种与二甲基亚砜的混合溶液。本发明所述二甲基亚砜对2-碘酰基苯甲酸具有很好的溶解性，可以提高该氧化剂的氧化效果。
可选地，所述步骤(1)中还包括对所述6-氧代-石胆酸(Ⅰ)进行重结晶。所述重结晶过程是对所述6-氧代-石胆酸(Ⅰ)的进一步纯化，有利于后续反应进行，间接提高UDCA的产量。
可选地，所述步骤(2)中，所述磺酰肼衍生物包括苯磺酰肼、对甲苯磺酰肼、对乙基苯磺酰肼、对丙基苯磺酰肼和对丁基苯磺酰肼中的一种或多种，所述磺酰肼衍生物与所述6-氧代-石胆酸(Ⅰ)的摩尔比为(1-5):1。进一步的，所述磺酰肼衍生物与所述6-氧代-石胆酸的摩尔比为(1-3.5):1。优选的，所述磺酰肼衍生物与所述6-氧代-石胆酸的摩尔比为(1-2.5):1。例如所述磺酰肼衍生物与所述6-氧代-石胆酸的摩尔比为1:1，或为2:1。所述磺酰肼衍生物的化学结构式如式(Ⅵ)所示：
Figure BDA0001862171010000041
其中R为氢、甲基、乙基、丙基和丁基。
可选地，所述步骤(2)中，所述第二有机溶剂为不带羰基的有机溶剂。进一步可选地，所述第二有机溶剂为不带羰基的醇类有机试剂。进一步可选地，所述第二有机溶剂包括甲醇和乙醇中的一种或多种。本发明所述第二有机溶剂对所述6-氧代-石胆酸(Ⅰ)和所述磺酰肼衍生物均具有良好的溶解性。
可选地，所述步骤(2)中，所述第二有机溶剂中还包括体积分数为0.1-5％的酸性有机试剂。进一步可选地，所述酸性有机试剂包括乙酸、草酸和丙酸中的一种或多种。例如所述酸性有机试剂为乙酸，或为草酸，或为丙酸，或为乙酸和丙酸的混合溶液，或为乙酸和草酸的混合溶液。本发明所述步骤(2)的亲核加成-消去反应在弱酸性条件下进行时，反应体系中的质子与羰基氧原子结合，可以提高羰基的活性，有利于促进反应正向进行，提高产品转化率。
可选地，在所述步骤(2)中，在所述亲核加成-消去反应后还包括，在反应体系中添加无机盐溶液，过滤，对滤饼进行干燥；所述无机盐溶液包括质量分数为50％-80％的碳酸盐溶液、碳酸氢盐溶液或硫酸氢盐。可选地，所述无机盐包括钠盐和钾盐中的一种或多种。例如所述无机盐溶液为碳酸氢钠溶液、或为碳酸氢钾溶液，或为硫酸氢钠溶液，或为碳酸钠溶液，或为碳酸钾溶液。本发明中，所述无机盐溶液的体积量根据实际反应情况而定，所述无机盐溶液可以使所述腙类化合物(Ⅱ)从反应体系中析出。本发明中，所述无机盐溶液能够有效终止所述亲核加成-消去反应，并且所述亲核加成-消去反应的生成的所述腙类化合物(Ⅱ)在该无机盐溶液体系中的溶解度很低，因此所述无机盐溶液可以起到促进产品析出的作用。
可选地，所述步骤(3)中，所述还原剂包括儿茶酚硼烷或硼氢化钠；所述还原剂与所述腙类化合物的摩尔比为(0.5-5)：1。可选地，所述还原剂与所述腙类化合物的摩尔比为(0.5-3)：1。进一步可选地，所述还原剂与所述腙类化合物的摩尔比为(0.5-2.5)：1。例如，所述所述还原剂与所述腙类化合物的摩尔比为为2：1，或为1.5：1，或为1：1。优选地，所述还原剂为儿茶酚硼烷。所述儿茶酚硼烷的分子式为C6H5BO2，也称为邻苯二氧硼烷，常用于有机合成中的氢化反应，是具有高活性的还原试剂，在本发明步骤(3)中，所述腙类化合物(Ⅱ)在所述儿茶酚硼烷的还原作用下可以高效还原得到石胆酸(Ⅳ)，提高所述石胆酸(Ⅳ)的产率。
可选地，所述步骤(3)中，所述采用还原剂将所述腙类化合物(Ⅱ)还原得到石胆酸(Ⅳ)的过程包括：将所述腙类化合物和所述还原剂溶解于第三有机溶剂中，然后搅拌0.5-2小时，搅拌完成后加入碱性溶液，于常温下搅拌1-5小时后过滤，重结晶收集得到所述石胆酸(Ⅳ)。
可选地，所述腙类化合物和所述还原剂按摩尔比1：(1-5)溶解于所述第三有机溶剂中。
可选地，所述第三有机溶剂为非氧化性的有机溶剂。进一步可选地，所述第三有机溶剂包括二氯甲烷和四氢呋喃中的一种或多种。例如，所述第三有机溶剂为二氯甲烷，或为四氢呋喃，或为二氯甲烷和四氢呋喃的混合溶液。
可选地，所述碱性溶液包括氢氧化钠溶液和氢氧化钾溶液中的一种或多种，所述碱性溶液的浓度为0.5-4mol/L。例如，所述碱性溶液为氢氧化钠溶液，或为氢氧化钾溶液，或为氢氧化钠和氢氧化钾的混合溶液。进一步可选地，所述碱性溶液的浓度为1-3mol/L。例如，所述碱性溶液的浓度为2mol/L，或所述碱性溶液的浓度为4mol/L。可选地，所述碱性溶液的体积占步骤(3)中总反应体体系的体积分数为20％-60％。本发明中，所述腙类化合物和所述还原剂先在无水的第三有机溶剂中进行初步反应并形成中间络合物，当加入占反应体体系的体积分数为20％-60％量的碱性溶液后，所述中间络合物进一步反应得到所述石胆酸。
其中，本发明所述步骤(3)中还可以不对反应生成的石胆酸进行重结晶过程，直接将过滤得到的滤饼进行干燥后进行下一步反应；所述重结晶后得到的石胆酸进行步骤(4)反应时可以有效提升最终产品——熊去氧胆酸(Ⅴ)的纯度和产量。
可选地，所述步骤(4)中，所述辅酶包括氧化性辅酶和还原性辅酶中的一种或多种，当所述辅酶包括所述氧化性辅酶时，所述羟基化反应的反应体系中还包括醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶(Glucose dehydrogenase，GDH)中的一种或多种。
可选地，所述醇脱氢酶包括甲醇脱氢酶(methanoldehydrogenase，MDH)和乙醇脱氢酶(Alcohol dehydrogenase，ADH)中的一种或多种。
可选地，所述氧化性辅酶包括NAD+和NADP+中的一种或多种，所述还原性辅酶包括NADH和NADPH中的一种或多种。可选地，所述醇脱氢酶、葡萄糖脱氢酶，或醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶的混合酶与所述氧化性辅酶的摩尔比为1:(5-15)。
可选地，所述步骤(4)中，所述羟基化反应在温度为30-45℃、pH＝6-8的缓冲溶液中进行，所述缓冲溶液的浓度为50-150mmol/L。可选地，所述缓冲溶液包括磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液或其他缓冲试剂。可选地，所述缓冲溶液的浓度为50-120mmol/L。进一步可选地，所述缓冲溶液的浓度为60-100mmol/L。优选的，所述缓冲溶液的浓度为80-120mmol/L。例如，所述缓冲溶液的浓度为60mmol/L，或为80mmol/L，或为90mmol/L，或为100mmol/L，或为110mmol/L。
可选地，所述步骤(4)中，当所述羟基化反应的反应体系中包括所述醇脱氢酶时，所述羟基化反应的反应体系中还包括异丙醇。可选地，所述异丙醇是溶解在所述缓冲溶液中的，所述异丙醇在所述缓冲溶液中的浓度为0.5-5mol/L。可选地，所述异丙醇在所述缓冲溶液中的浓度为0.5-3mol/L。进一步可选地，所述异丙醇在所述缓冲溶液中的浓度为0.8-2.5mol/L。例如，所述异丙醇在所述缓冲溶液中的浓度为1mol/L，或为1.5mol/L，或为2.5mol/L。
可选地，所述步骤(4)中，当所述羟基化反应的反应体系中包括所述葡萄糖脱氢酶时，所述羟基化反应的反应体系中还包括葡萄糖(Glucose)。可选地，所述葡萄糖是溶解在所述缓冲溶液中的，所述葡萄糖在所述缓冲溶液中的浓度为0.5-5mol/L。可选地，所述葡萄糖在所述缓冲溶液中的浓度为0.5-3mol/L。进一步可选地，所述葡萄糖在所述缓冲溶液中的浓度为0.8-2.5mol/L。例如，所述葡萄糖在所述缓冲溶液中的浓度为1mol/L，或为1.5mol/L，或为2.5mol/L。
可选地，所述步骤(4)中，所述羟化酶可以促进所述石胆酸的7位上形成β构型羟基。可选地，所述羟化酶来源于木贼镰刀菌或玉米赤霉菌；所述羟化酶包括7β-羟化酶(7β-LAH)。
可选地，所述步骤(4)中，所述醇脱氢酶和羟化酶的摩尔比为1:(0.5-1.5)，所述醇脱氢酶的浓度为(0.3-1)g/L。进一步可选地，所述醇脱氢酶和羟化酶的摩尔比为1:(0.5-1.0)。例如，所述醇脱氢酶和羟化酶的摩尔比为1:1，或为1:1.2，或为1:1.5。进一步可选地，所述醇脱氢酶的浓度为(0.5-1)g/L。例如，所述醇脱氢酶的浓度为0.5g/L，或为0.8g/L，或为1g/L。
其中，本发明所述步骤(4)为生物酶法，其中，所述羟化酶、醇脱氢酶或葡萄糖脱氢酶可以是商业化的蛋白酶粉，也可以是通过破碎能够表达所述羟化酶或醇脱氢酶的细胞或菌体获得。其中，所述NAD+为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide adeninedinucleotide，NAD+)，也称为氧化型辅酶Ⅰ；所述NADH为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的还原态，也称为还原型辅酶Ⅰ；所述NADP+为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(Nicotinamide adeninedinucleotide phosphate，NADP+)，也称为氧化型辅酶Ⅱ；所述NADPH为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的还原态，也称为还原型辅酶Ⅱ。在存在氧气(O2)的条件下，所述辅酶，醇脱氢酶以及异丙醇之间形成一个电子循环体系，在羟化酶作用下，可以有效实现石胆酸(Ⅳ)的羟基化反应，在所述石胆酸(Ⅳ)的7位上形成β构型的羟基，生成熊去氧胆酸(Ⅴ)。在存在氧气(O2)的条件下，所述辅酶，葡萄糖脱氢酶以及葡萄糖之间形成一个电子循环体系，在羟化酶作用下，可以有效实现石胆酸(Ⅳ)的羟基化反应，在所述石胆酸(Ⅳ)的7位上形成β构型的羟基，生成熊去氧胆酸(Ⅴ)。
可选地，所述步骤(4)中，所述羟基化反应结束后进行加热处理使酶失活，然后过滤，收集滤液，调节所述滤液的pH为2-3之间，经萃取，干燥，蒸馏后，得到所述熊去氧胆酸。可选地，所述步骤(4)中，所述萃取的步骤包括采用萃取溶液进行萃取，萃取次数2-5次，所述萃取溶液包括乙酸乙酯。
本发明的有益效果包括以下几个方面：
1、本发明所述的化学-酶法制备熊去氧胆酸的方法，由三步化学法和一步生物酶法组成，以猪去氧胆酸为初始原料，生产成本低廉，工艺步骤少，反应条件温和，大大提高了产品的收率；
2、本发明采用化学-酶法制备熊去氧胆酸，反应过程中可以不使用和不生成会对环境和人体造成伤害的化合物，从根源上避免了环境污染问题，进一步降低成本，可以广泛适用于工业化规模生产；
3、由本发明所述的方法制备的熊去氧胆酸，纯度高，活性好，可在生物医学领域中有广泛的应用。
附图说明
图1为本发明一实施例提供的熊去氧胆酸的核磁共振氢谱图；
图2为本发明一实施例提供的熊去氧胆酸的核磁共振碳谱图。
具体实施方式
以下所述是本发明实施例的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明实施例原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明实施例的保护范围。若无特别说明，本发明实施例所采用的原料及其它化学试剂皆为市售商品。
实施例一一种化学-酶法制备熊去氧胆酸的方法，包括：
(1)取10g猪去氧胆酸溶解于200mL的二氯甲烷中，继续加入60mLDMSO，搅拌至溶解，加入7.50g 2-碘酰基苯甲酸常温搅拌4h后过滤，将滤液减压浓缩至约40mL，缓慢滴入200mL去离子水，析出得到6-氧代-石胆酸，烘干。将上述产品进一步重结晶，包括将上述过程得到的6-氧代-石胆酸溶解于50mL甲醇中并经过滤操作，在滤液中缓慢滴入100mL去离子水，过滤，干燥，得产品9.18g重结晶后的6-氧代-石胆酸。
(2)将上述9.18g 6-氧代-石胆酸和8.50g对甲苯磺酰肼溶解在200mL甲醇和2mL乙酸的混合溶液中，常温搅拌，然后加入100mL 70％的碳酸氢钠，过滤得滤饼，烘干，得13.68g白色固体状的3α-羟基-6-对甲苯磺酰腙-5β-胆烷酸。
(3)称取13.68g 3α-羟基-6-对甲苯磺酰腙-5β-胆烷酸溶解在200mL无水二氯甲烷中，通入N2，常温搅拌溶解，缓慢滴入75mL 1mol/L儿茶酚硼烷，搅拌1h后加入200mL 2mol/L的NaOH溶液，继续搅拌4h后过滤并收集滤饼，得到石胆酸。将所述石胆酸进一步重结晶，包括将所述石胆酸溶解在100mL甲醇中，然后缓慢滴加150mL去离子水，过滤，烘干，得7.85g白色固体状的重结晶后的石胆酸。
(4)在100mM的磷酸钾缓冲液(100mL，pH＝7.0)中，加入7.85g石胆酸、5g 7β-羟化酶、5g葡萄糖醇脱氢酶、50mg NAD+、18g葡萄糖，于35℃温度下，敞口搅拌反应24小时。反应结束后加热70℃使其中的蛋白质变性，过滤去除蛋白质，用HCl调节pH＝2之间，并采用乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，干燥，减压蒸馏获得7.21g固体产物。将制备的固体产物进行核磁共振检测得到如图1和图2所示的核磁图谱，证实该最终产物为熊去氧胆酸。本实施例中，熊去氧胆酸的收率为72.1％，经HPLC检测，熊去氧胆酸的纯度为99.2％。其中，7β-羟化酶源自木贼镰刀菌，经过超声破碎及离心预处理得到。本实施例的反应过程具体如下所示：
Figure BDA0001862171010000101
实施例二一种化学-酶法制备熊去氧胆酸的方法，包括：
(1)取10g猪去氧胆酸溶解于200mL的二氯甲烷中，继续加入40mLDMSO，搅拌至溶解，加入8.2g 2-碘酰基苯甲酸常温搅拌3h后过滤，将滤液减压浓缩至约40mL，缓慢滴入200mL去离子水，析出得到6-氧代-石胆酸，烘干。将上述产品进一步重结晶，包括将上述过程得到的6-氧代-石胆酸溶解于50mL甲醇中并经过滤操作，在滤液中缓慢滴入100mL去离子水，过滤，干燥，得产品9.05g重结晶后的6-氧代-石胆酸。
(2)将上述9.05g 6-氧代-石胆酸和8.2g对甲苯磺酰肼溶解在200mL乙醇和2mL乙酸溶液中，常温搅拌，然后加入100mL 80％的碳酸钠，过滤得滤饼，烘干，得13.35g白色固体状的3α-羟基-6-对甲苯磺酰腙-5β-胆烷酸。
(3)称取13.35g 3α-羟基-6-对甲苯磺酰腙-5β-胆烷酸溶解在200mL无水二氯甲烷中，通入N2，常温搅拌溶解，缓慢滴入100mL 1mol/L儿茶酚硼烷，搅拌2h后加入200mL 3mol/L的NaOH溶液，继续搅拌5h后过滤并收集滤饼，得到石胆酸。将所述石胆酸进一步重结晶，包括将所述石胆酸溶解在100mL甲醇中，然后缓慢滴加150mL去离子水，过滤，烘干，得7.54g白色固体状的重结晶后的石胆酸。
(4)在100mM的磷酸钾缓冲液(100mL，pH＝7.0)中，加入7.54g石胆酸、7g 7β-羟化酶、7g乙醇脱氢酶、50mg NADP+、15mL异丙醇，于40℃温度下，敞口搅拌反应24小时。反应结束后加热70℃使其中的蛋白质变性，过滤去除蛋白质，用HCl调节pH＝3之间，并采用乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，干燥，减压蒸馏获得6.75g熊去氧胆酸。本实施例中，熊去氧胆酸的收率为67.5％，经HPLC检测，产品熊去氧胆酸的纯度为99.3％。其中，7β-羟化酶源自木贼镰刀菌经过超声破碎及离心预处理得到。本实施例的反应过程具体如下所示：
Figure BDA0001862171010000111
实施例三一种化学-酶法制备熊去氧胆酸的方法，包括：
(1)取10g猪去氧胆酸溶解于150mL丙酮，50mL DMSO搅拌至溶解，加入7.50g 2-碘酰基苯甲酸常温搅拌3h后过滤，将滤液减压浓缩至约40mL，缓慢滴入150mL去离子水，析出得到6-氧代-石胆酸，烘干。将上述产品进一步重结晶，包括将上述过程得到的6-氧代-石胆酸溶解于50mL甲醇中并经过滤操作，在滤液中缓慢滴入100mL去离子水，过滤，干燥，得产品9.25g重结晶后的6-氧代-石胆酸。
(2)将上述9.25g 6-氧代-石胆酸和10.0g对甲苯磺酰肼溶解在200mL乙醇和4mL乙酸的混合溶液中，常温搅拌，然后加入100mL 80％的碳酸钠，过滤得滤饼，烘干，得13.93g白色固体状的3α-羟基-6-对甲苯磺酰腙-5β-胆烷酸。
(3)称取13.93g 6-对甲苯磺酰肼-石胆酸溶解在200mL无水四氢呋喃中，通入N2，常温搅拌溶解，缓慢滴入100mL 1mol/L儿茶酚硼烷，搅拌2h后加入200mL 1mol/L的NaOH溶液，继续搅拌3h后过滤并收集滤饼，得到7.98g石胆酸。
(4)在100mM的Tris-HCl缓冲液(100mL，pH＝7.0)中，加入7.98g石胆酸、6g 7β-羟化酶、100mg NADPH，于45℃温度下，敞口搅拌反应20小时。反应结束后加热70℃使其中的蛋白质变性，过滤去除蛋白质，用HCl调节pH＝2.5之间，并采用乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，干燥，减压蒸馏获得7.32g熊去氧胆酸。本实施例中，熊去氧胆酸的收率为73.2％，经HPLC检测，产品熊去氧胆酸的纯度为99.2％。其中，7β-羟化酶源自玉米赤霉菌，均经过超声破碎及离心预处理得到。本实施例的反应过程具体如下所示：
Figure BDA0001862171010000121
实施例四一种化学-酶法制备熊去氧胆酸的方法，包括：
(1)取10g猪去氧胆酸溶解于200mL的四氢呋喃中，继续加入30mL DMSO，搅拌至溶解，加入8g 2-碘酰基苯甲酸常温搅拌3.5h后过滤，将滤液减压浓缩至约50mL，缓慢滴入200mL去离子水，析出，烘干，得产品9.35g 6-氧代-石胆酸。
(2)将上述9.35g 6-氧代-石胆酸和7.5g苯磺酰肼溶解在200mL乙醇和8mL乙酸溶液中，常温搅拌，然后加入100mL 80％的碳酸氢钠，过滤得滤饼，烘干，得13.15g白色固体状的3α-羟基-6-苯磺酰腙-5β-胆烷酸。
(3)称取13.19g 3α-羟基-6-苯磺酰腙-5β-胆烷酸溶解在200mL无水二氯甲烷中，通入N2，常温搅拌溶解，缓慢滴入130mL 1mol/L儿茶酚硼烷，搅拌2.5h后加入200mL 3mol/L的NaOH溶液，继续搅拌4h后过滤并收集滤饼，烘干，得7.23g白色固体状的石胆酸。
(4)在100mM的磷酸钾缓冲液(100mL，pH＝7.0)中，加入7.23g石胆酸、5g 7β-羟化酶、6g乙醇脱氢酶、20mg NADP+、15mg NAD+、20mL异丙醇，于40℃温度下，敞口搅拌反应24小时。反应结束后加热70℃使其中的蛋白质变性，过滤去除蛋白质，用HCl调节pH＝2.5之间，并采用乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，干燥，减压蒸馏获得6.55g熊去氧胆酸。本实施例中，熊去氧胆酸的收率为65.5％，经HPLC检测，产品熊去氧胆酸的纯度为99.0％。其中，7β-羟化酶源自玉米赤霉菌，均经过超声破碎及离心预处理得到。本实施例的反应过程具体如下所示。
Figure BDA0001862171010000131
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (8)

1.一种化学-酶法制备熊去氧胆酸的方法，其特征在于，包括：
（1）将猪去氧胆酸加入到第一有机溶剂中，并在氧化剂作用下，使所述猪去氧胆酸氧化得到化学结构式如式（Ⅰ）所示的6-氧代-石胆酸，所述氧化剂与所述猪去氧胆酸的摩尔比为1:(1.5-3)；所述氧化剂为2-碘酰基苯甲酸；
Figure 108436DEST_PATH_IMAGE001
（Ⅰ）；
（2）将所述6-氧代-石胆酸和磺酰肼衍生物加入到第二有机溶剂中，所述磺酰肼衍生物选自苯磺酰肼、对甲苯磺酰肼；所述第二有机溶剂选自甲醇和乙醇中的一种或多种；所述第二有机溶剂中还包括体积分数为0.1-5%的酸性有机试剂；使所述6-氧代-石胆酸和所述磺酰肼衍生物发生亲核加成-消去反应，得到化学结构式如式（Ⅱ）所示的腙类化合物，
Figure 419332DEST_PATH_IMAGE002
（Ⅱ），式（Ⅱ）中，R为氢和甲基；
（3）在惰性气体环境下，采用还原剂将所述腙类化合物还原得到石胆酸；其中包括：将所述腙类化合物和所述还原剂溶解于第三有机溶剂中，然后搅拌0.5-2小时，搅拌完成后加入碱性溶液，于常温下搅拌1-5小时后过滤，重结晶收集得到所述石胆酸；所述还原剂选自儿茶酚硼烷；所述碱性溶液选自氢氧化钠溶液和氢氧化钾中的一种或多种，所述碱性溶液的浓度为1-3mol/L，所述碱性溶液的体积占总反应体系的体积分数为20％-60％；所述第三有机溶剂选自无水二氯甲烷、无水四氢呋喃中的一种或多种；
（4）将所述石胆酸在羟化酶和辅酶的催化作用下进行羟基化反应，得到熊去氧胆酸。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（4）中，所述辅酶包括氧化性辅酶和还原性辅酶中的一种或多种，当所述辅酶包括所述氧化性辅酶时，所述羟基化反应的反应体系中还包括醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶中的一种或多种。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤（4）中，所述氧化性辅酶包括NAD+和NADP+中的一种或多种，所述还原性辅酶包括NADH和NADPH中的一种或多种。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，当所述羟基化反应的反应体系中包括醇脱氢酶时，所述羟基化反应的反应体系中还包括异丙醇；当所述羟基化反应的反应体系中包括葡萄糖脱氢酶时，所述羟基化反应的反应体系中还包括葡萄糖。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（4）中，所述羟基化反应在温度为30-45℃、pH=6-8的缓冲溶液中进行，所述缓冲溶液的浓度为50-150mmol/L。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（4）中，所述羟基化反应结束后进行加热处理使酶失活，然后过滤，收集滤液，调节所述滤液的pH为2-3之间，经萃取，干燥，蒸馏后，得到所述熊去氧胆酸。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中，所述第一有机溶剂包括二氯甲烷、四氢呋喃、丙酮和二甲基亚砜中的一种或多种。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述步骤（2）中，在所述亲核加成-消去反应后还包括，在反应体系中添加无机盐溶液，过滤，对滤饼进行干燥；所述无机盐溶液包括质量分数为50%-80%的碳酸盐溶液、碳酸氢盐溶液或硫酸氢盐。
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