CN114107422A - 一种3β，7β（α）二羟基-5β-胆烷酸的合成方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种3β，7β二羟基‑5β‑胆烷酸和3β，7α二羟基‑5β‑胆烷酸的合成方法。该方法以鹅去氧胆酸为起始原料，经过7位羟基氧化，羧基保护，3位羟基光延反应结构翻转，水解脱保护，7位酮基还原，得到目标产物3β，7β二羟基‑5β‑胆烷酸(杂质H)或3β，7α二羟基‑5β‑胆烷酸(杂质K)。本发明通过上述合成路线制备得到杂质H和杂质K，原料来源广泛，供应充足；产率高，副反应少，后处理简单，适合大量制备，可为后续的相关研究提供标准品及数据支持。
Description
技术领域
本发明属于有机化学合成领域，具体涉及一种3β，7β二羟基-5β- 胆烷酸和3β，7α二羟基-5β-胆烷酸的合成方法。
背景技术
熊去氧胆酸UDCA是一种无毒性亲水胆酸，能竞争性地抑制毒性内源性胆酸在回肠的吸收，通过激活钙离子、蛋白激酶C组成的信号网络，并通过激活分裂活性蛋白基酶来增加胆汁淤积的作用。熊去氧胆酸还能竞争性地取代细胞磨合细胞器上的毒性胆酸分子，防止肝细胞和胆管细胞受到更多毒性胆酸的损害。在临床上，熊去氧胆酸主要用于溶解胆固醇型胆结石，原发性胆汁肝硬化PBC，慢性丙型肝炎，同时还用于酒精性肝病，非酒精性脂肪肝、良性复发性肝内胆汁淤积症、先天性内胆管囊性扩张症。
3β，7β二羟基-5β-胆烷酸(杂质H)、3β，7α二羟基-5β-胆烷酸(杂质K)是熊去氧胆酸(UDCA)的同分异构体，也是熊去氧胆酸生产过程中产生的两个杂质，其结构如下式所示。
目前国内外尚未有合成这两种物质的方法报导，导致市面上这两种物质的对照品价格非常昂贵。因此研究一种原料广泛、工艺简单、收率高、质量好的3β，7β二羟基-5β-胆烷酸和3β，7α二羟基-5β-胆烷酸的合成方法是非常有必要的。
发明内容
本发明的目的在于：提供一种3β，7β二羟基-5β-胆烷酸和3β， 7α二羟基-5β-胆烷酸的制备方法，该制备方法原料易得，且反应简单，副反应少，转化率高，适合大量生产。
为了实现上述目的，本发明采取以下技术方案：
一种3β，7β二羟基-5β-胆烷酸和3β，7α二羟基-5β-胆烷酸的制备方法，以鹅去氧胆酸为起始原料经以下步骤制备：
其中：
R1为C1～C4的直链烷基或支链烷基；
R2为C1～C4的直链烷基、支链烷基、甲基磺酸基或对硝基苯甲基。
本发明中，一种3β，7β二羟基-5β-胆烷酸和3β，7α二羟基-5 β-胆烷酸的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
a.化合物B(7-酮基石胆酸)的制备
将化合物A(3α,6α,7α三羟基-5β-胆烷酸)溶解于丙酮中，降温至10～20℃，加入氧化剂进行氧化反应，反应完全后，加入还原剂终止反应，蒸馏除去丙酮，过滤洗涤，得到化合物B(7-酮基石胆酸)的粗品湿品，将化合物B(7-酮基石胆酸)粗品湿品悬浮在2倍体积的甲醇中，升温回流2h，降温至常温，过滤洗涤干燥，得精品化合物B(7-酮基石胆酸)；
b.化合物C(7-酮基石胆酸酯)的制备
将化合物B(7-酮基石胆酸)的溶解于醇中，加入催化剂，回流反应 2h，反应完成后，加入1％的碳酸氢钠溶液终止反应，蒸馏除去溶剂，过滤干燥，得到化合物C(7-酮基石胆酸酯)；
c.化合物D的制备
将化合物C(7-酮基石胆酸酯)溶解于四氢呋喃中，加入三苯基膦、酸、偶氮二甲酸二乙酯，室温下搅拌反应6h，反应完成后，加水终止反应，真空蒸馏除去四氢呋喃，得到油状物溶解于4倍体积的乙酸乙酯中，1％碳酸氢钠溶液洗涤除去未反应的酸，溶液浓缩后柱层析纯化，收集成分为化合物D的洗脱液，浓缩得到化合物D；
d.化合物E(3-β羟基7-酮基石胆酸)的制备
将化合物D悬浮在水中，加入强碱，升温至50～100℃水解2～8h，水解完全后，加酸结晶，过滤洗涤，得到化合物E(3-β羟基7-酮基石胆酸)；
e.化合物H(3β，7β二羟基-5β-胆烷酸)或化合物K(3β，7α二羟基-5β-胆烷酸)的制备
将化合物E(3-β羟基7-酮基石胆酸)溶解在氢氧化钠溶液中，加入磷酸二氢钾调节溶液pH为7.0～7.5之间，加入L-苹果酸钠、苹果酸脱氢酶、7-β类固醇脱氢酶或7-α类固醇脱氢酶，控制溶液温度在25～ 30℃之间，pH为7.0～7.5之间反应，直到化合物E残留低于0.1％，反应完成后，升温至70～75℃搅拌2h，过滤除去溶液中的固形物，滤液加入5M盐酸，调节溶液pH为3～4结晶，过滤、洗涤、干燥，得到目标产物，即化合物H或K；
所述上述步骤加入7-β类固醇脱氢酶时制取的目标产物为化合物H (3β，7β二羟基-5β-胆烷酸)；加入7-α类固醇脱氢酶时制取的目标产物为化合物K(3β，7α二羟基-5β-胆烷酸)。
本发明中，所述a步骤中的氧化剂为氯气、溴素、次氯酸钠、重铬酸盐、高锰酸盐、浓硫酸、硝酸中的一种或任意两种的组合；所述还原剂为活泼金属(如铁、铝、锌、镁等)，活泼金属氢化物(如硼氢化钠、氢化铝锂等)、非金属单质(如H2、C、S等)、处于低化合价时的氧化物(如CO,SO2等)、处于低化合价时的盐(如亚硫酸盐,亚铁盐等) 中的一种。
所述a步骤中：
丙酮体积与化合物A的体积重量比为5～10mL:1g；
氧化剂与化合物A的物质的量比为1.1～1.5:1；
还原剂与化合物A的物质的量比为0.1～0.5:1。
所述步骤b中：
醇为含有1～4个碳原子的直链醇或支链醇；醇的体积与化合物B的重量比为4～8:1；
催化剂为有机酸或无机酸，优选盐酸、硫酸、对甲苯磺酸；催化剂与化合物B的物质的量比为1～5:100；
碳酸氢钠溶液与化合物B重量比为1:1。
所述步骤c中：
酸为C1～C4的直链或支链酸，甲基磺酸、对硝基苯甲酸中的一种；优选甲酸、甲基磺酸、对硝基苯甲酸，进一步地优选为甲酸。
所述柱层析纯化为硅胶柱，所用硅胶粒径为300～400目；
所述洗脱剂为乙酸乙酯和石油醚按体积比1:2混合的溶剂。
所述四氢呋喃与化合物C的体积质量比为3～8mL:1g；
所述三苯基膦与化合物C的物质的量比为2.5～4:1；
所述酸与化合物C的物质的量比为2.5～5:1；
所述偶氮二甲酸二乙酯与化合物C物质的量比3～5:1。
所述d步骤中：
强碱为无机碱，优选氢氧化钠、氢氧化钾，进一步地优选氢氧化钠；
所述氢氧化钠与化合物D的质量比为30～50:100；
所述水解温度为50～100℃，优选60～80℃；
所述酸为无机酸或有机酸，优选无机酸，进一步地优选浓度为6M的盐酸。
所述e步骤中：
氢氧化钠溶液为1g氢氧化钠溶解于100mL水中配置而成；
氢氧化钠溶液与化合物E的重量比为10:1；
苹果酸钠与化合物E的重量比为0.4～0.7:1，优选0.4～0.5:1；
苹果酸脱氢酶与化合物E的重量比为0.01～0.03:1；
7-β类固醇脱氢酶或7-α类固醇脱氢酶与化合物E的重量比为 0.01～0.03:1。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1.本发明以鹅去氧胆酸(3α，6α，7α三羟基-5β-胆烷酸)为起始原料合成3β，7α二羟基-5β-胆烷酸或3β，7β二羟基-5β-胆烷酸，原料来源广泛，价格低廉；
2.本发明的合成路线，工艺路线简单，副反应少，转化率高，适合大量生产；
3.本发明得到的3β，7α二羟基-5β-胆烷酸或3β，7β二羟基-5 β-胆烷酸，杂质少，可为后续研究提供数据及标样。
附图说明
图1为一种3β，7β二羟基-5β-胆烷酸或3β，7α二羟基-5β-胆烷酸制备的流程图；
图2为一种3β，7β二羟基-5β-胆烷酸(杂质H)制备的流程图之一；
图3为一种3β，7α二羟基-5β-胆烷酸(杂质K)制备的流程图之一；
图4为一种3β，7β二羟基-5β-胆烷酸(杂质H)制备的流程图之一；
图5为一种3β，7β二羟基-5β-胆烷酸(杂质H)对照品色谱图；
图6为一种3β，7β二羟基-5β-胆烷酸(杂质H)供试品色谱图；
图7为一种3β，7α二羟基-5β-胆烷酸(杂质K)对照品色谱图；
图8为一种3β，7α二羟基-5β-胆烷酸(杂质K)供试品色谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
如图1所示，一种3β，7β二羟基-5β-胆烷酸和3β，7α二羟基- 5β-胆烷酸的合成方法，所用起始原料为鹅去氧胆酸，具体步骤如下：
a、制备化合物B(7-酮基石胆酸)
将化合物A(鹅去氧胆酸)溶解于丙酮中，降温，加入氧化剂进行氧化反应，反应完全后，加入还原剂终止反应。蒸馏除去丙酮，过滤洗涤，得到化合物B粗品湿品。将化合物B悬浮在2倍体积甲醇中，升温回流2h，降温至常温，过滤洗涤干燥，得到精品化合物B。
b、制备化合物C(7-酮基石胆酸酯)
将化合物B溶解于醇中，加入催化剂，回流反应2h，反应完成后，加入碳酸氢钠溶液终止反应，蒸馏除去溶剂，过滤干燥，得到化合物C。
c、制备化合物D(3-β*酯-7-酮基石胆酸酯)
将上步的化合物C(7-酮基石胆酸酯)溶解于四氢呋喃中，加入三苯基膦、酸、偶氮二甲酸二乙酯，室温下搅拌反应6h。反应完成后，加水终止反应，真空蒸馏除去四氢呋喃，得到油状物溶解于4倍体积乙酸乙酯中，1％碳酸氢钠溶液洗涤除去未反应的酸，溶液浓缩后柱层析纯化。收集成分为化合物D的洗脱液，浓缩得到化合物D。
d、制备化合物E(3-β羟基7-酮基石胆酸)
将上步的化合物D(3-β*酯-7-酮基石胆酸酯)悬浮在水中，加入强碱，升温水解，水解完全后，加入酸调节溶液pH至4～5结晶，过滤洗涤，得到化合物E。
e、制备化合物H(3β，7β二羟基-5β-胆烷酸)或化合物K(3 β，7α二羟基-5β-胆烷酸)
将上步制得的化合物E(3-β羟基7-酮基石胆酸)溶解在氢氧化钠溶液中，加入磷酸二氢钾调节溶液pH为7.0～7.5之间，加入L-苹果酸钠、苹果酸脱氢酶(MDH)、7-β类固醇脱氢酶控制溶液温度在25～ 30℃，pH为7.0～7.5之间反应，直到化合物E残留低于0.1％，反应完成后，升温至70～75℃搅拌2h，过滤除去溶液中的固形物，滤液加入5M 盐酸，调节溶液pH为3～4结晶，过滤、洗涤、干燥，得到化合物H。或在上述步骤中将7-β类固醇脱氢酶换为7-α类固醇脱氢酶，其他条件不变即可制得化合物K。
实施例1
如图2所示，本实施例3β，7β二羟基-5β-胆烷酸的制备方法，包括如下步骤：
a、制备7-酮基石胆酸
在500mL反应瓶中，加入50g鹅去氧胆酸(CDCA)，250mL丙酮，搅拌下降温0℃以下，缓慢加入22.3g溴素，溴素加完后继续反应3h，取样测得CDCA残留量为2.379％，加入1.3g亚硫酸氢钠终止反应。真空蒸馏除去丙酮，加入100mL水，搅拌30min，过滤洗涤，得到7-酮基石胆酸粗品湿品84.7g。将7-酮基石胆酸粗品湿品全部倒入反应瓶中，加入 170mL甲醇，升温回流2h，降温至常温，过滤洗涤干燥，得到7-酮基石胆酸40.8g，HPLC纯度为99.347％。
b、制备7-酮基石胆酸甲酯
在500mL反应瓶中，加入7-酮基石胆酸40.8g，甲醇165mL，浓盐酸 0.5mL，回流反应2h，取样测得7-酮基石胆酸残留为0.558％，加入1％的碳酸氢钠溶液64.7mL，真空蒸馏除去甲醇，过滤洗涤干燥，得到7-酮基石胆酸甲酯40.3g，HPLC纯度为99.356％。
c、制备3-β甲酸酯-7-酮基石胆酸甲酯
在500mL三口烧瓶中，加入7-酮基石胆酸甲酯40.3g，四氢呋喃搅拌溶解160mL，加入三苯基膦60g、无水甲酸12mL、偶氮二甲酸二乙酯 52mL，室温下搅拌反应6h,取样测得7-酮基石胆酸甲酯残留为0.047％。加入50mL水，真空蒸馏除去四氢呋喃，得到油状物。加入160mL乙酸乙酯搅拌溶解，静置分层，用2*160mL浓度为1％碳酸氢钠溶液洗涤乙酸乙酯溶液，除去未反应的甲酸，溶液真空蒸馏收集馏出液约120mL,浓缩液倒入硅胶柱中柱层析，用乙酸乙酯与石油醚体积比1:2的混合溶剂洗脱。收集成分为3-β甲酸酯-7-酮基石胆酸甲酯的洗脱液约350mL，洗脱液真空蒸馏收集馏出液约300mL，此时蒸馏瓶中析出大量晶体，过滤，得到3-β甲酸酯-7-酮基石胆酸甲酯40.2g,取样HPLC检测纯度99.017％。
d、制备3-β羟基-7-酮基石胆酸
在1000mL三口烧瓶中，加入3-β甲酸酯-7-酮基石胆酸甲酯 40.2g，水402mL，氢氧化钠8g，升温至60℃，维持60℃搅拌6h，取样检测3-β甲酸酯-7-酮基石胆酸甲酯残留为0.273％，降温至室温，加入浓盐酸20mL,调节溶液酸性结晶，过滤洗涤，得到3-β羟基7-酮基石胆酸54.3g，HPLC纯度98.521％。
e、3β，7β二羟基-5β-胆烷酸制备
在1000mL反应瓶中，加入3-β羟基7-酮基石胆酸54.3g，1％氢氧化钠溶液543mL，搅拌溶解，加入磷酸二氢钾2.1g调节溶液pH为 7.36，反应液中加入L-苹果酸钠21.8g、MDH1g、7-βHSDH 100mg，控制溶液温度在25～30℃，pH为7.0～7.5之间反应3h，取样测3-β羟基7-酮基石胆酸残留为0.047％。升温至73℃并搅拌2h，然后降温至 30℃，过滤除去溶液中的固形物，滤液中加入5M盐酸，调节溶液pH至 3.74，过滤洗涤干燥，得到3β，7β二羟基-5β-胆烷酸39.6g，HPLC纯度91.022％。
实施例2
如图3所示，本实施例3β，7α二羟基-5β-胆烷酸的制备方法，包括如下步骤：
a、7-酮基石胆酸制备
在500mL反应瓶中，加入50g鹅去氧胆酸(CDCA)，350mL丙酮，搅拌下降温0℃以下，加入浓硫酸0.5mL，缓慢加入10％的次氯酸钠溶液 125g，次氯酸钠溶液加完后继续反应0.5h，取样测得CDCA残留量为 3.446％，加入1g保险粉终止反应。真空蒸馏除去丙酮，加入100mL水，搅拌30min，过滤洗涤，得到7-酮基石胆酸粗品湿品82.3g。将上述7- 酮基石胆酸粗品湿品倒入反应瓶中，加入165mL甲醇，升温回流2h，降温至常温，过滤洗涤干燥，得到7-酮基石胆酸40.3g，HPLC纯度 99.258％。
b、7-酮基石胆酸乙酯制备
在500mL反应瓶中，加入7-酮基石胆酸40.3g，乙醇240mL，浓硫酸 0.3mL，回流反应2h，取样测得7-酮基石胆酸残留为0.421％，加入浓度为1％的碳酸氢钠溶液60.3mL，真空蒸馏除去乙醇，过滤洗涤干燥，得到 7-酮基石胆酸乙酯39.8g，HPLC纯度为99.523％。
c、3-β甲基磺酸酯-7-酮基石胆酸乙酯制备
在500mL三口烧瓶中，加入7-酮基石胆酸乙酯39.8g，四氢呋喃 160mL搅拌溶解，加入三苯基膦65g、甲基磺酸15mL、偶氮二甲酸二乙酯 56mL，室温下搅拌反应6h,取样测得7-酮基石胆酸乙酯残留为0.025％。加入50mL水，真空蒸馏除去四氢呋喃，得到油状物。加入160mL乙酸乙酯搅拌溶解，静置分层，用2*160mL的浓度为1％的碳酸氢钠溶液洗涤乙酸乙酯溶液，除去未反应的甲基磺酸，溶液真空蒸馏收集馏出液约120mL, 浓缩液倒入硅胶柱中柱层析，用乙酸乙酯与石油醚体积比1:2的混合溶剂洗脱。收集成分为3-β甲基磺酸酯-7-酮基石胆酸乙酯的洗脱液约350mL，洗脱液真空蒸馏收集馏出液约300mL，此时蒸馏瓶中析出大量晶体，过滤，得到3-β甲基磺酸酯-7-酮基石胆酸乙酯41.5g,取样HPLC检测纯度为99.945％。
d、3-β羟基-7-酮基石胆酸制备
在1000mL三口烧瓶中，加入3-β甲基磺酸酯-7-酮基石胆酸乙酯 41.5g，415mL水，10g氢氧化钠，升温至60度，维持70度搅拌4小时，取样检测3-β甲基磺酸酯-7-酮基石胆酸乙酯残留为0.273％，降温至室温，加入浓盐酸20mL,调节溶液酸性结晶，过滤洗涤，得到3-β羟基7-酮基石胆酸52.6g，HPLC纯度98.438％。
e、3β，7α二羟基-5β-胆烷酸制备
在1000mL反应瓶中，加入3-β羟基7-酮基石胆酸52.6g，1％氢氧化钠溶液526mL，搅拌溶解，加入磷酸二氢钾1.9g调节溶液pH＝7.42，反应液中加入L-苹果酸钠26.3g、MDH0.6g、7-αHSDH 150mg，控制溶液温度在25～30℃，pH为7.0～7.5之间反应3h，取样测3-β羟基7-酮基石胆酸残留为0.052％。升温至75℃并搅拌2h，过滤除去溶液中的固形物，滤液中加入5M盐酸，调节溶液pH＝3.62，过滤洗涤干燥，得到3 β，7α二羟基-5β-胆烷酸38.7g，HPLC纯度为99.106％。
实施例3
如图4所示，本实施例3β，7β二羟基-5β-胆烷酸的制备方法，包括如下步骤：
a、7-酮基石胆酸制备
在1000mL反应瓶中，加入50g鹅去氧胆酸(CDCA)，500mL丙酮，搅拌下降温0℃以下，缓慢加入浓度为10％的高锰酸钾溶液(12g高锰酸钾溶解于108g水中)120g，高锰酸钾溶液加完后继续反应0.5h，取样测得CDCA残留量为1.557％，加入0.5g锌粉终止反应，过滤除去溶液中的固体。滤液真空蒸馏除去丙酮，加入100mL水，搅拌30min，过滤洗涤，得到7-酮基石胆酸粗品湿品77.8g。将上述7-酮基石胆酸粗品湿品倒入反应瓶中，加入155mL甲醇，升温回流2h，降温至常温，过滤洗涤，得到7-酮基石胆酸40.6g，HPLC纯度为99.574％。
b、7-酮基石胆酸异丙酯制备
在500mL反应瓶中，加入7-酮基石胆酸40.6g，异丙醇320mL，对甲苯磺酸0.5g，回流反应2h，取样测得7-酮基石胆酸残留为0.317％，加入浓度为1％的碳酸氢钠溶液59.8mL，真空蒸馏除去异丙醇，过滤洗涤干燥，得到7-酮基石胆酸异丙酯41.3g，HPLC纯度为99.628％。
c、3-β对硝基苯甲酸酯-7-酮基石胆酸异丙酯制备
在500mL三口烧瓶中，加入7-酮基石胆酸异丙酯39.8g，四氢呋喃 180mL搅拌溶解，加入三苯基膦70g、对硝基苯甲酸25g、偶氮二甲酸二乙酯60mL，室温下搅拌反应6h,取样测得7-酮基石胆酸异丙酯残留为 0.033％。加入50mL水，真空蒸馏除去四氢呋喃，得到油状物。加入 160mL乙酸乙酯搅拌溶解，静置分层，用2*160mL浓度为1％的碳酸氢钠溶液洗涤乙酸乙酯溶液，除去未反应的对硝基苯甲酸，溶液真空蒸馏收集馏出液约120mL，浓缩液倒入硅胶柱中柱层析，用乙酸乙酯与石油醚体积比1:2的混合溶剂洗脱。收集成分为3-β对硝基苯甲酸酯-7-酮基石胆酸异丙酯的洗脱液约350mL，洗脱液真空蒸馏收集馏出液约300mL，此时蒸馏瓶中析出大量晶体，过滤，得到3-β对硝基苯甲酸酯-7-酮基石胆酸异丙酯43.7g,取样HPLC检测纯度为99.224％。
d、3-β羟基-7-酮基石胆酸制备
在1000mL三口烧瓶中，加入3-β对硝基苯甲酸酯-7-酮基石胆酸异丙酯43.7g，水437mL，氢氧化钠13g，升温至80℃，维持60℃搅拌 3h，取样检测3-β对硝基苯甲酸酯-7-酮基石胆酸异丙酯残留为 0.076％，降温至室温，加入浓盐酸20mL,调节溶液酸性结晶，过滤洗涤，得到3-β羟基7-酮基石胆酸51.4g，HPLC纯度为99.155％。
e、3β，7β二羟基-5β-胆烷酸制备
在1000mL反应瓶中，加入3-β羟基7-酮基石胆酸51.4g，1％的氢氧化钠溶液514mL，搅拌溶解，加入1.8g磷酸二氢钾调节溶液pH＝7.47，反应液中加入L-苹果酸钠30.3g、MDH1.5g、7-βHSDH 150mg，控制溶液温度在25～30℃，pH为7.0～7.5之间反应3h，取样测3-β羟基7-酮基石胆酸残留为0.014％。升温至74℃并搅拌2h，过滤除去溶液中的固形物，滤液中加入5M盐酸，调节溶液pH＝3.57，过滤洗涤干燥，得到3 β，7β二羟基-5β-胆烷酸39.7g，HPLC纯度为90.221％。
目标产物验证性实验
本实验主要是对本发明的中实施例1及实施例2所述的合成方法得到的最终产物进行验证，与市购的产品作为对比进行色谱分析，从而验证本发明合成工艺的可行性以及合成的目标产物的准确性，其详细操作步骤和条件如下所示：
1.色谱系统条件的选择：
色谱柱：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱长4.7×250mm×5μ m；
流动相：30mL乙腈+37mL浓度为0.78g/l磷酸二氢钠(用磷酸调节至pH＝3)+40ml甲醇；
稀释剂：甲醇和流动相按体积比1:9的混合溶液；
流速：0.8mL/min；
柱温：40℃；
RID检测器温度：35℃；
进样量：90μL。
2.溶液的配制
(1)取外购的3β，7β二羟基-5β-胆烷酸(杂质H)对照品1和3 β，7α二羟基-5β-胆烷酸(杂质K)对照品2，各精密称重25mg，置于两个25mL的容量瓶中，加稀释剂(甲醇和流动相按体积比1:9的混合溶液)溶解成浓度为1.0mg/mL对照品溶液，分别标记为a1、a2；
(2)取本实施例1制取的化合物H作为供试品1，本实施例2制取的化合物K作为供试品2，各精密称重25mg，置于两个25mL的容量瓶中，加稀释剂(甲醇和流动相按体积比1:9的混合溶液)溶解成浓度为 1.0mg/mL供试品溶液，分别标记为b1、b2；
3.进行色谱分析
分别将配置好的对照品溶液a1、a2和供试品溶液b1、b2注入高效液相色谱仪中，获得图谱，如图5～图8所示。
由图5和图6可知，对照品溶液a1和供试品溶液b1的峰值曲线和保留时间基本一致，在保留时间为19±0.1min时均可以检测到同一种物质，且HPLC纯度均大于90％，根据对照品溶液a1的成分可知，此物质为 3β，7β二羟基-5β-胆烷酸(杂质H)。由此可见，本实施例1制取的目标产物化合物H同为3β，7β二羟基-5β-胆烷酸，说明本发明的合成方法准确可行。
由图7和图8可知，对照品溶液a2和供试品溶液b2的峰值曲线和保留时间基本一致，在保留时间为31±0.1min时均可以检测到同一种物质，且HPLC纯度均大于99％，根据对照品溶液a2的成分可知，此物质为 3β，7α二羟基-5β-胆烷酸(杂质K)。由此可见，本实施例2制取的目标产物化合物K同为3β，7α二羟基-5β-胆烷酸，说明本发明的合成方法准确可行。
Claims (10)
1.一种3β，7β二羟基-5β-胆烷酸和3β，7α二羟基-5β-胆烷酸的制备方法，其特征在于，以鹅去氧胆酸为起始原料经以下步骤制备：
其中：
R1为C1～C4的直链烷基或支链烷基；
R2为C1～C4的直链烷基、支链烷基、甲基磺酸基或对硝基苯甲基。
2.根据权利要求1所述的3β，7β二羟基-5β-胆烷酸和3β，7α二羟基-5β-胆烷酸的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
a.化合物B的制备
将化合物A溶解于丙酮中，降温至10～20℃，加入氧化剂进行氧化反应，反应完全后，加入还原剂终止反应，蒸馏除去丙酮，过滤洗涤，得到化合物B的粗品湿品，将化合物B粗品湿品悬浮在2倍体积的甲醇中，升温回流2h，降温至常温，过滤洗涤干燥，得精品化合物B；
b.化合物C的制备
将化合物B的溶解于醇中，加入催化剂，回流反应2h，反应完成后，加入1％的碳酸氢钠溶液终止反应，蒸馏除去溶剂，过滤干燥，得到化合物C；
c.化合物D的制备
将化合物C溶解于四氢呋喃中，加入三苯基膦、酸、偶氮二甲酸二乙酯，室温下搅拌反应6h，反应完成后，加水终止反应，真空蒸馏除去四氢呋喃，得到油状物溶解于4倍体积的乙酸乙酯中，1％碳酸氢钠溶液洗涤除去未反应的酸，溶液浓缩后柱层析纯化，收集成分为化合物D的洗脱液，浓缩得到化合物D；
d.化合物E的制备
将化合物D悬浮在水中，加入强碱，升温至50～100℃水解2～8h，水解完全后，加酸结晶，过滤洗涤，得到化合物E；
e.化合物H或化合物K的制备
将化合物E溶解在氢氧化钠溶液中，加入磷酸二氢钾调节溶液pH为7.0～7.5之间，加入L-苹果酸钠、苹果酸脱氢酶、7-β类固醇脱氢酶或7-α类固醇脱氢酶，控制溶液温度在25～30℃之间，pH为7.0～7.5之间反应，直到化合物E残留低于0.1％，反应完成后，升温至70～75℃搅拌2h，过滤除去溶液中的固形物，滤液加入5M盐酸，调节溶液pH为3～4结晶，过滤、洗涤、干燥，得到目标产物，即化合物H或K；所述加入7-β类固醇脱氢酶时制取的目标产物为化合物H；加入7-α类固醇脱氢酶时制取的目标产物为化合物K。
3.根据权利要求1或2所述的3β，7β二羟基-5β-胆烷酸和3β，7α二羟基-5β-胆烷酸的制备方法，其特征在于：所述a步骤中的氧化剂为氯气、溴素、次氯酸钠、重铬酸盐、高锰酸盐、浓硫酸、硝酸中的一种或任意两种的组合；所述还原剂为活泼金属，活泼金属氢化物、非金属单质、处于低化合价时的氧化物、处于低化合价时的盐中的一种。
4.根据权利要求3所述的3β，7β二羟基-5β-胆烷酸和3β，7α二羟基-5β-胆烷酸的制备方法，其特征在于，所述a步骤中：
丙酮体积与化合物A的体积重量比为5～10ml:1g；
氧化剂与化合物A的物质的量比为1.1～1.5:1；
还原剂与化合物A的物质的量比为0.1～0.5:1。
5.根据权利要求1或2所述的3β，7β二羟基-5β-胆烷酸和3β，7α二羟基-5β-胆烷酸的制备方法，其特征在于，所述步骤b中：
醇为含有1～4个碳原子的直链醇或支链醇；
催化剂为有机酸或无机酸。
6.根据权利要求5所述的3β，7β二羟基-5β-胆烷酸和3β，7α二羟基-5β-胆烷酸的制备方法，其特征在于，所述步骤b中：
醇的体积与化合物B的重量比为4～8:1；
催化剂与化合物B的物质的量比为1～5:100；
碳酸氢钠溶液与化合物B重量比为1:1。
7.根据权利要求1或2所述的3β，7β二羟基-5β-胆烷酸和3β，7α二羟基-5β-胆烷酸的制备方法，其特征在于，所述步骤c中：
酸为C1～C4的直链或支链酸，甲基磺酸、对硝基苯甲酸中的一种；
所述柱层析纯化为硅胶柱，所用硅胶粒径为300～400目；
所述洗脱剂为乙酸乙酯和石油醚按体积比1:2混合的溶剂。
8.根据权利要求7所述的3β，7β二羟基-5β-胆烷酸和3β，7α二羟基-5β-胆烷酸的制备方法，其特征在于：
所述四氢呋喃与化合物C的体积质量比为3～8ml:1g；
所述三苯基膦与化合物C的物质的量比为2.5～4:1；
所述酸与化合物C的物质的量比为2.5～5:1；
所述偶氮二甲酸二乙酯与化合物C物质的量比3～5:1。
9.根据权利要求1或2所述的3β，7β二羟基-5β-胆烷酸和3β，7α二羟基-5β-胆烷酸的制备方法，其特征在于，所述d步骤中：
强碱为氢氧化钠，所述氢氧化钠与化合物D的质量比为30～50:100；
所述水解温度为60～80℃；
所述酸为浓度为6M的盐酸。
10.根据权利要求9所述的3β，7β二羟基-5β-胆烷酸和3β，7α二羟基-5β-胆烷酸的制备方法，其特征在于，所述e步骤中：
氢氧化钠溶液为1g氢氧化钠溶解于100ml水中配置而成；
氢氧化钠溶液与化合物E的重量比为10:1；
苹果酸钠与化合物E的重量比为0.4～0.7:1；
苹果酸脱氢酶与化合物E的重量比为0.01～0.03:1；
7-β类固醇脱氢酶或7-α类固醇脱氢酶与化合物E的重量比为0.01～0.03:1。
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