CN101684483B - 天然芸苔素内酯的生物酶解制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种生物酶的制备方法，具体为天然芸苔素内酯的生物酶制备方法。本方法包括：接种发酵，压滤，超滤，乳化，酶解，萃取，压滤，浓缩，树脂吸附，浓缩结晶，真空吸滤，干燥包装步骤。本发明工艺方法操作简便，生产过程能耗低，产品纯度高，环保节约。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术分离处理方法，尤其涉及天然芸苔素内酯的生物酶解制备方法，用于处理从蜂蜡中获得甾体类植物生长调节剂--芸苔素内酯类物质。
背景技术
芸苔素内酯类物质(Brassinolide，简称BR)又名油菜素内酯，是美国Mirchell博士等人，于1970年首次从油菜花粉中分离发现。经深入研究证明，芸苔素内酯有多种独特的调节植物生长的生理活性，与已知的生长素、细胞分裂素、赤霉素(920)、脱落酸、乙烯等植物生长调节剂相比，生物活性更强，使用量更低，安全性更高，在农业上增产增收的效果更好。1982年第八届国际植物生长物质大会上，被一致公认为新一代农业生产资料即世界第六大植物生长调节剂。
Grand和Mandeve等各国科学家在600多种植物花粉中分离出这种具有生理活性的芸苔素内酯化合物，并进一步证明具以下基本结构加上不同的侧链基团，构成的4种同系物生理活性最强。芸苔素内酯的化学结构：
芸苔素内酯为特殊的立体化学结构，已经证实任何一种化学合成方法，只能得到一种与之相近而不是完全相同的化合物，化学合成无法在立体结构上做到与天然物质的立体化学结构完全相同，这就大大降低了其效果。而且化学合成法的生产工艺时间长，反应物不易提纯，对环境有污染，生产成本高。
从生物源中提取芸苔素内酯，如从蜂蜡、榨油后的饼渣中提取，专利85102899以蜂蜡采用NaOH皂化，盐酸中和，硅胶柱层析分离的方法。但此方法使用大量的四氯化碳、氯仿作萃取溶剂，消耗大量的酸碱，环保压力巨大，严重危害工人健康，污染环境，而且生产消耗大，生产成本相对较高，副产物作为废物不能综合利用，不能适应市场的需求。
发明内容
针对上述现有合成技术的不足，本发明的目的是提供一种原料易得，工艺操作简便，生产过程能耗低，产品纯度高，环保节约的芸苔素内酯制备方法。
本发明的目的通过以下技术方案来实现的：
芸苔素内酯的生物酶制备方法，经过下列步骤：
A、在培养基中接种假单胞菌液，调节液温至25～30℃，搅拌40～50r/min；
B、通气培养，发酵时间15～25h；
C、发酵规模从2L放大至100L、500L罐，加入发酵液体积从0.8L、40L扩大到200L，酶活力达到900～1400U/L；
D、反应发酵液加入絮凝剂再离心除去菌体，获得粗酶液；
E、粗酶液经中空纤维系统超滤浓缩，同时去掉无机盐及部分小分子物质，得到2000～2500U/L的浓缩酶液；
F、将浓缩酶液加到分散的蜂蜡乳化液中，调pH7.0～8.5，搅拌，升温到30～40℃，定向水解不少于3h，水解接近终点时，加入适量的生成物萃取剂；
G、酶解液经乙醇萃取，板框压滤机过滤，浓缩罐浓缩后，采用吸附树脂柱分离纯化，真空浓缩，结晶，得到99％芸苔素内酯产品。
所述的步骤A中的培养基组成为，油脂0.75％，NaNO40.2％，酵母膏0.5％，K2HPO40.2％，消泡剂0.010～0.018％，pH7.5。
所述的步骤A中所用菌株为荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)，购买自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.1.867。
所述的步骤F中蜂蜡乳化液制作工艺为每100L水中，加入蜂蜡20～30kg，乳化剂0.6～0.9kg，在70～80℃搅拌50～60r/min，乳化2～3h。
本发明所用原料蜂蜡是由高级一元醇和高级脂肪酸形成的酯，极具油溶性而非水溶性，选用乳化性极强而又不干扰酯酶定向水解活性的乳化剂，将蜂蜡制成高分散乳化液体。在酯酶的发酵过程中，采用低温延时发酵技术，酯酶在发酵液中获得最佳积累，以中空纤维超过滤系统浓缩发酵酯酶液，中空纤维超滤系统由若干空心纤维丝成束地装配组成，每根纤维丝即成为一个微细管型膜(相当于一个超滤单位)。纤维丝膜切面内壁的表层细密，向外逐渐疏松，形成各向异性微孔膜管结构，在除去发酵液中无机盐及部分小分子杂质的同时，获得高活性、高浓度的液体酯酶。假单胞菌产生的酯酶为一种专一水解蜂蜡中酯键的酶，对蜂蜡中的酯键产生高亲和性，加到高度分散的蜂蜡乳化液中，实现定向水解，在水解接近终点时，加入适量的生成物萃取剂，打破酯酶催化的平衡点，使酯酶定向水解更彻底，水解率达到86％以上。
蜂蜡中含有多种芸苔素类似物，这些混合的类似物对农作物的效应没有加和作用。粗混合物活性很低，即使加大施用浓度也不会提高生物活性，而分离纯化的芸苔素在极低浓度下也表现出极高生物活性。因此，芸苔素的分离纯化及纯度是保障芸苔素产品质量的又一关键。本发明采用树酯吸附柱分离纯化技术取代硅胶柱分离纯化，获得高纯度的芸苔素产品。
产品经质谱检测分析，GC-EI-MS质图谱显示样品中属于芸苔素内酯的有3个峰：
对21.89峰言其碎片峰为：479(M-1)、412、398、383、380(C22-C23断裂，H转移)、379、365、314(M-1，C20-C22断裂，2、3位羟基断裂，基峰)、299、285、271、173。
对24.97峰言起碎片峰为：479(M-1)、451、412、397、380(C20-C22断裂、H转移)、379、314(M-1，C20-C22断裂，2、3位羟基断裂，基峰)、299、285、271、173。
对28.63峰言其碎片峰为：479(M-1)、416、401、440、380(C20-C22断裂、H转移)、379、355、337、314(M-1，C20-C22断裂，2、3位羟基断裂，基峰)、299、285、271、173。
即21.89，24.91，28.64，为芸苔素内酯的三个异构体。
本发明与现有技术相比有如下优点：
1.原料易于获得，成本低廉。本发明以十字花科植物(油菜等)蜂蜡为原料生产芸苔素。蜜蜂采食花粉分泌蜂蜡的过程是对芸苔素的富集过程，以蜂蜡为原料比用油菜花粉生产成本更低廉。作为四川的优势资源，油菜源蜂蜡年产5000吨。因此用蜂蜡作原料生产芸苔素，资源有保障。
2.工艺先进。本发明以自主开发的生物酶解技术生产芸苔素内酯。采用专一水解蜂蜡中酯键的酯酶定向水解经高分散乳化处理的蜂蜡，并加入生成物萃取剂打破酯酶催化平衡点，提高酯酶水解率，最后采用强吸附型树脂柱取代硅胶柱，分离纯化制备得到芸苔素内酯。生物酶水解蜂蜡生产芸苔素内酯属于国内首创，是应用发酵工程、酶工程、化学工程技术的综合技术，达到国内领先和国际先进水平。
3.产品纯度高质量好。酶解法制得的芸苔素内酯纯度≥99％，产品至少可获得三个以上最具生理活性的结构与天然产物完全一致的组分，与化学合成相比，具有特别突出的生理活性，最强的调控能力。其使用效果(按增产、增收的标准计)超过目前国内所有化学合成的同类产品，也优于包括脱落酸等其他植物生长调节剂。经广泛的试验检测证明，产品具有多种独特调节植物生长的生理活性功能，生物活性强，使用量低，增产效果明显，且能改善作物品质，没有化学合成植物调节剂的毒副作用。
4.生产过程节能环保。生产过程中水解温度低(40℃)，时间短(3h)，水解率达到86％以上，能耗少，对设备腐蚀小，产品收率高(99％)。用酒精取代了皂化法中使用的有害溶剂，酒精的回收率达到93％，同时加强了密封及冷却等设施的构建。生产设备均考虑了通风除尘、节约能源、降低耗能、循环利用水资源的问题，并予以实施，符合国家“三同时”制度的规定，不但减轻了环境污染，也降低了成本。废渣可提取三十烷醇和二十八烷醇，综合利用可进一步降低成本，基本实现废渣的零排放。
附图说明
图1是本发明的生产工艺流程图。
具体实施方式
具体实施例：
1.高选择性酯酶的发酵及纯化；
发酵产酶培养基(油脂0.75％，NaNO40.2％，酵母膏0.5％，K2HPO40.2％，pH7.5)120℃灭菌30min，冷却至28℃接入种子，28～30℃搅拌45r/min。通气培养，发酵时间为76h。
发酵液加入絮凝剂再离心除去菌体获得粗酶液，通过板框压滤机过滤后进入中空纤维浓缩柱进行超滤浓缩，得到2000～2500U/L的浓缩酶液。
2.蜂蜡的高分散乳化处理：
每100L水中，加入蜂蜡30kg，乳化剂(食品用)0.8kg，80℃搅拌(60r/min)乳化2h。
3.酯酶对蜂蜡中酯键的定向水解：
向蜂蜡乳化液中加入0.4倍量浓缩酶液(2500u/L)，搅拌(45r/min)，调pH7.2(此酶的最适pH)，温度40℃(此酶的最适温度)，定向水解3h，加入生成物萃取剂乙醇，蜂蜡酯键的水解率达到86％以上。
4.对芸苔素内酯的分离纯化(树脂分离纯化技术)：
(1)芸苔素的萃取：
向酶解液中加入5.0倍(W/W)95％乙醇，升温至65℃，回流20min，萃取时间2h，冷却至室温。
(2)萃取液的压滤：
经板框压滤机过滤蜂蜡渣，过滤压力0.3Mpa。
(3)萃取液的浓缩：
将滤液在75℃条件下真空浓缩，浓缩真空为0.085Mpa，蒸去溶剂和水后得到胶状物。将胶状物溶于10倍(W/W)异丙醇中，加热至60℃搅拌，冷却后过滤。滤液真空浓缩(75℃)至0.5倍体积得浓缩液。
(4)树脂分离纯化：
选用山东鲁能集团树脂分厂生产的CD-180树脂作为分离纯化树脂，柱床体积Φ0.5×8m，洗脱液为：乙酸乙酯：甲醇：乙酸＝3：16：8混合液，用分光光度计进行检测，收集紫外线吸收部分，真空浓缩，结晶，制得99％的高纯度芸苔素内酯。
Claims (3)
1.天然芸苔素内酯的生物酶解制备方法，其特征在于经过下列步骤：
A、发酵产酶培养基120℃灭菌30min，冷却至28℃接入假单胞菌种子，28～30℃搅拌45r/min，通气培养，发酵时间为76h，其中培养基组成为：油脂0.75％，硝酸钠0.2％，酵母膏0.5％，磷酸氢二钾0.2％，pH7.5；
B、反应发酵液加入絮凝剂再离心除去菌体，获得粗酶液；
C、粗酶液经中空纤维系统超滤浓缩，同时去掉无机盐及部分小分子物质，得到2000～2500U/L的浓缩酶液；
D、将浓缩酶液加到分散的蜂蜡乳化液中，调pH7.0～8.5，搅拌，升温到30～40℃，定向水解不少于3h，水解接近终点时，加入适量的乙醇；
E、酶解液经乙醇萃取，板框压滤机过滤，浓缩罐浓缩后，采用树脂吸附柱分离纯化，真空浓缩，结晶，得到99％芸苔素内酯产品。
2.根据权利要求1所述的天然芸苔素内酯的生物酶解制备方法，其特征在于：
所述的假单胞菌是保藏号为CGMCC No.1.867的荧光假单胞菌。
3.根据权利要求1所述的天然芸苔素内酯的生物酶解制备方法，其特征在于：
所述的步骤D中蜂蜡乳化液制作工艺为，每100L水中，加入蜂蜡20～30kg，乳化剂0.6～0.9kg，在70～80℃搅拌50～60r/min，乳化2～3h。
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