CN1560269A

CN1560269A - 假单胞菌429产酯酶水解蜂蜡制备芸苔素内酯的方法

Info

Publication number: CN1560269A
Application number: CNA2004100219528A
Authority: CN
Inventors: 何其明; 杨锡良
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2004-03-02
Filing date: 2004-03-02
Publication date: 2005-01-05

Abstract

本发明提供了一种假单胞菌429产酯酶水解蜂蜡制备芸苔素内酯的方法。该方法是用假单胞菌429产酯酶定向水解蜂蜡的分散乳化液，用树脂将水解后的蜂蜡分离，从而制得芸苔素内酯。水解温度低，水解时间少、能耗少，对设备腐蚀小，产品收率高，纯度高，质量好，工艺操作易控制，对环境无污染。

Description

假单胞菌429产酯酶水解蜂蜡制备芸苔素内酯的方法

技术领域：

本发明与制备芸苔素内酯的方法有关，特别与假单胞菌429产酯酶水解蜂蜡制备芸苔素内酯的方法有关。

背景技术：

芸苔素内酯是由植物内合成的一类内源性植物生长调节剂，对多种农作物生长代谢具有调节作用。目前，国内外生产芸苔素方法主要是化学合成法和天然资源提取法。

1、化学合成法(如国内云大120；美国、日本)生产工艺时间长，反应物不易提纯，对环境有污染，并且生产成本高等不足。这是由于芸苔素内酯是一个含有多种具有生理活性化合物的体系，而其中4个活性最高，都呈立体结构，而任何一种化学合成法，就是合成与其中的一种立体结构完全相同的组分也无法办到，更不要说4个分完成相同。因此，芸苔素内酯生产中不提倡化学合成法。

2、天然资源提取法：提取法中常采用的是碱皂法，但碱水解蜂蜡时间长，一般在8-10；水解温度高，95-100℃；水解率较低，70-75％；产品纯度较低，90％；生产成本较高，蜂蜡水解成本1800元/吨。

发明内容：

本发明的目的是为了克服以上不足，提供一种水解温度低，水解时间少、能耗少，对设备腐蚀小，产品收率高，纯度高，质量好，工艺操作易控制，对环境无污染的假单胞菌429产酯酶水解蜂蜡制备芸苔素内酯的方法。

本发明这样来实现的：

本发明假单胞菌429产酯酶水解蜂蜡制备芸苔素内酯的方法包括如下步骤：

1)，制取活性液体酯酶；

按重量百分比配料：

油脂 0.6～0.8％氢氧化钠 0.1～0.3％

酵母膏 0.4～0.6％磷酸二氢钾 0.1～0.3％

消泡剂 0.010～0.018％假单胞菌429 余量，

将油脂、氢氧化钠、酵母膏、磷酸二氢钾、假单胞菌429在温度至少为28℃的条件下，按至少60r/min的速度搅拌后发酵至少22小时，使其pH为7.1～7.6，加入消泡剂，通气便制得酯酶活力为900～1400U/L的发酵液，在发酵液中加入絮凝剂离心除去菌体，获得粗酶液，浓缩粗酶液，制得4500～600U/L的活性液体酯酶；

2)，制取蜂蜡的分散乳化液：在蜂蜡中加入乳化剂，使其乳化，获得蜂蜡的分散乳化液；

3)，酯酶对蜂蜡中酯键的定向水解：将活性液体酯酶加入到蜂蜡乳化液中，调pH7.1～7.3，搅拌，升温到35～50℃，定向水解至少3小时，水解接近终点时加入适量萃取剂，使蜂蜡水解；

4)，用树脂将水解后的蜂蜡分离，便制得芸苔素内酯产品。

上述的1、1)步骤在制取活性液体酯酶时按重量百分比配料：

油脂 0.7％氢氧化钠 0.2％酵母膏 0.5％

磷酸二氢钾 0.2％消泡剂 0.014％假单胞菌429余量，

在温度为28℃条件下，按60r/min的速度搅拌发酵22小时，使其pH为7.5，选用中空纤维超过滤系统浓缩粗酶液，

在1、3)步骤时将活性液体酯酶加入到蜂蜡乳化液中，调pH为7.2，升温至40～45℃，定向水解3小时。

上述的1、2)步骤时，加入的乳化剂为非离子型乳化剂。

假单胞菌429(Pseudomons SP 429)产酯酶活性最高，专一水解蜂蜡的活性最强，500罐(装200L较高酶发酵液)连续发酵观察20个批次，发酵液中酯酶活力能保持在900～1400U/L这一水平。假单胞菌429产酯酶是一种胞外菌，在发酵液中加入絮凝剂再离心除去菌体，便获粗酶液。选用DC-30型中空纤维柱超过滤系统浓缩粗酶液，在滤掉无机盐及部分水分子物质的同时，可使粗酶液浓缩五倍左右，得到4500～600U/L的高活性液体酯酶。采用中空纤维超过滤浓缩技术解决了生物酶在工业化浓缩中易失活、回收率低的难题，该技术使液体酯酶的回收率比膜式长管蒸发器浓缩技术提高20个百分点。蜂蜡是由高级一元醇和高级酯肪酸形成的酯，油溶性极强而非水溶性，要实现假单胞菌429产生的酯酶，蜂蜡的乳化是关键。采用高活性乳化剂可使蜂蜡以直径为0.5微米左右的微粒均匀分散在水中，获得蜂蜡的高分散乳化剂。在酯酶对蜂蜡中酯键的定向水解中当水解接近终点时，加入适量的萃取剂(有机溶剂，如乙醇、甲醇、溶剂油等)，打破酯酶催化的平衡点，可使蜂酯水解率达90％以上，“酯法”水解比“皂化法”(旧工艺用NaOH)水解，水解率70～75％)温度低、能耗少，对设备的腐蚀性小，水解率高(高15～20个百分点)。蜂蜡酶解液经萃取物浓缩后，经高效液相色谱检测表明：蜂蜡中除含有芸苔素外，还含有多种芸苔素类似物。这些类似物混杂在产品中，对农作物的生长效应没有叠加作用。粗混合物活性很低，即使加大施用浓度也不会提高生物活性，而分离纯化的芸苔素内酯在极低浓度下也表现出极高生物活性，因此，芸苔素内酯的分离纯化及纯度是保障芸苔素内酯产品质量的又一关键问题。本发明采用强吸附型树脂柱分离纯化技术取代二次硅胶柱分离纯化，获得99％的高纯度芸苔内酯产品。

本发明制取芸苔素内酯的方法比皂化法水解温度低，能耗少，水解时间短，对设备腐蚀小，产品收率高，纯度高，质量好，工艺操作易控制，对环境无污染、生产成本也显著降低(吨蜂蜡水解成本由原来1800元降到1300元，降低20％，每吨蜂蜡制品的产值提高2.64万元，经济效益增加20％以上，特别是酶解法提取芸苔素内酯后的“蜡渣”，有利于后续加工，生产三十烷醇、二十八烷醇及低烷醇等化工原料及医药中间体产品，提高原料的综合利用。采用本方法制备的天然芸苔素内酯产品经测试和在二十多个省市不同的农作应用试验表明：产品具有多种独特的调节植物生长的生理活性功能，生物活性强，便用量低，增产效效明显，改善作物品质，无毒副作用，安全性高。本发明方法生产的产品是目前国内唯一获得的绿色生资认证的植物生长调节素。本发明方法对发展高效、优质、无公害农业和绿色食品工业具有重大意义，具有广阔的发展和应用前景。

具体实施方式：

本实施例方法步骤如下：

1)，制取活性液体酯酶；

采用平板培养技术，从土壤中分离到3种产酯酶活性的菌株，选取高酯活性最高，专一水解蜂蜡的假单胞菌429。

按重量百分比配料：

油脂 0.7％氢氧化钠 0.2％

酵母膏 0.5％磷酸二氢钾 0.2％

消泡剂 0.014％假单胞菌429 余量，

消泡剂采用甘油聚醚。

将油脂(可采用动物油脂也可采用植物油脂，如植物油、花生油)、氢氧化钠、酵母膏、磷酸二氢钾、假单胞菌429在温度为28℃的条件下，按60r/min的速度搅拌后发酵22小时，使其pH为7.5，加入消泡剂，通气便制得酯酶活力为900～1400U/L的发酵液，在发酵液中加入絮凝剂(可采用高分子化合物，如聚丙烯酰铵)离心除去菌体，获得粗酶液，选用DC-30型中空纤维超过滤系统浓缩粗酶液，制得4500～600U/L的高活性液体酯酶；

2)，制取蜂蜡的分散乳化液：在蜂蜡中加入乳化剂平平加，使其乳化，获得蜂蜡的分散乳化液；

3)，酯酶对蜂蜡中酯键的定向水解：将活性液体酯酶加入到蜂蜡乳化液中，调pH7.2，搅拌，升温到40℃～45℃，定向水解3小时，水解接近终点时加入适量萃取剂(如乙醇)，使蜂蜡水解，

4)，用CD-180树脂将水解后的蜂蜡分离，使制得芸苔素内酯产品。

Claims

1、假单胞菌429产酯酶水解蜂蜡制备芸苔素内酯的方法，其特征在于包括如下步骤：

1)，制取活性液体酯酶；

按重量百分比配料：

油脂 0.6～0.8％氢氧化钠 0.1～0.3％

酵母膏 0.4～0.6％磷酸二氢钾 0.1～0.3％

消泡剂 0.010～0.018％假单胞菌429 余量，

4)，用树脂将水解后的蜂蜡分离，便制得芸苔素内酯产品。

2、如权利要求1所述的假单胞菌429产酯酶水解蜂蜡制备芸苔素内酯的方法，其特征在于1、1)步骤在制取活性液体酯酶时按重量百分比配料：

油脂 0.7％氢氧化钠 0.2％酵母膏 0.5％

磷酸二氢钾 0.2％消泡剂 0.014％假单胞菌 429余量，

在温度为28℃条件下，按60r/min的速度搅拌发酵22小时，使其pH为7.5，选用中空纤维超过滤系统浓缩粗酶液；

3、如权利要求1或2所述的假单胞菌429酯酶水解蜂蜡制备芸苔素内酯的方法，其特征在于1、2)步骤时，加入的乳化剂为非离子型乳化剂。