CN102827913B

CN102827913B - 微生物混菌发酵制备11α-OH-ADD的方法

Info

Publication number: CN102827913B
Application number: CN201210316179.2A
Authority: CN
Inventors: 刘喜荣; 孟浩
Original assignee: Hunan Chengda Biotechnology Co Ltd
Current assignee: HUNAN LONGTENG BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd.
Priority date: 2012-08-31
Filing date: 2012-08-31
Publication date: 2014-01-15
Anticipated expiration: 2032-08-31
Also published as: CN102827913A

Abstract

本发明涉及甾体类药物的生产方法，具体来说是同时利用两种微生物混菌发酵转化4-AD生产11α-OH-ADD的方法，以4-AD为原料，经赭曲霉AspergillusochraceusATCC18500和节杆菌ArthrobactersimplexATCC6946混合发酵，相对于单独使用上述的两种菌进行上羟基以及脱氢反应，本发明通过混菌发酵4-AD得到11α-OH-ADD，两种菌体在发酵转化上存在有协同效应，有如下优点：总收率较高，转化更完全，减少了一步后处理，能耗减少，本发明的混菌发酵使得其生产成本大幅度降低，不仅提高了转化率，而且降低了转化时间，相应的减少了后处理，减少了能耗。

Description

微生物混菌发酵制备11α-OH-ADD的方法

技术领域

本发明涉及甾体类药物的生产方法，具体来说是利用微生物混菌发酵4-AD制备11α-OH-ADD的方法。

背景技术

甾体类药物具有抗炎、避孕、利尿、抗毒、抗过敏、抗休克作用，广泛用于湿疹、哮喘、风湿疾病。近年来，甾体药物在医疗领域的应用范围不断扩大，广泛应用于治疗风湿、心血管病、胶原性病症、淋巴白血病、人体器官移植、抗肿瘤、细菌性脑炎、皮肤病、内分泌失调、老年性疾病等，甾体类药物还对某些癌症，尤其是激素依赖性肿瘤具有一定的疗效。甾体类药物作用范围广、产量高，是医药行业中仅次于抗生素的第二大类药物。

甾体激素药物生产中，甾体母核的多个基团需要进行修饰，C₁₁α-羟基化反应是重要的甾体转化反应之一。甾体的C₁₁α-羟基化对于甾体药物的合成及结构改造具有重要意义，通过C₁₁α-羟基化反应可以引入高生理活性基团，从而大大增加疗效，减少副作用，并能改变作用的专属性。甾体的C₁₁α-羟基化反应可以由具有甾体C₁₁α-羟基化能力的微生物完成。

目前，用于甾体C₁₁α-羟基化反应的微生物主要有黑根霉(主要为葡枝根霉) Rhizopus nigricans、绿僵菌Metanrrhtzium、赭曲霉Aspergillus ochraceus、黄曲霉Aspergillus flavus、青霉、诺卡氏菌等。文献报道了一些具有较高C₁₁α-羟基化反应活性的微生物，曲霉、绿僵菌是近年国内研究较多的甾体C₁₁α-羟基化微生物。但是赭曲霉在转化后期产生与产物难以分离的砖红色色素，绿僵菌也存在活性不稳定、转化不专一的缺点，限制了其工业化应用。工业生产上，国内普遍使用黑根霉进行C₁₁α-羟基化反应，但是现有工艺转化率不高。

当抗炎甾体激素药物的母核C_1,2位置导入双键后，都能成倍的增加抗炎作用，如：醋酸可的松C_1,2位上导入双键后成醋酸脱氢可的松，抗炎作用提高3～4倍，但C_1,2位脱氢甾体激素化合物在动物体内不能被转化得到，采用化学方法进行脱氢一般是用二氧化硒法，常使产品中带有少量难以除尽对人体有害的硒，所以微生物脱氢成为甾体抗炎激素药物合成中不可缺少的一步。

应用于甾体母核A环脱氢的主要微生物有：简单节杆菌（Arthrobacter sp.）、棒状杆菌（Corymebacterium sp.）、分支杆菌（Mycobacterum sp.）、芽孢杆菌（Bacillus）、诺卡氏菌（Nocardia sp.）、耻垢杆菌（Mycobacterium smemagctis）。一般来说细菌的脱氢能力比真菌大，研究中发现对甾体母核有脱氢活力的微生物，较多伴生边链降解和C₂₆位羰基还原以及C₉羟基引起B环打开等作用。

从4-AD制备11α-OH-ADD，现有技术是分两步进行的，即C_1,2位脱氢和C₁₁位羟基化反应，前一步反应完成后需要进行后处理，加大了产品后处理成本及发酵能耗，而且降低了产品收率。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种发酵能耗较小，节约成本并提高产品收率的微生物混菌发酵制备11α-OH-ADD的方法。

本发明的11α-OH-ADD的化学名称为：11α-羟基-雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮，4-AD的化学名称为雄烯二酮，本发明的反应路线如下：

。

本发明的赭曲霉Aspergillus ochraceus ATCC 18500和节杆菌Arthrobacter simplex ATCC 6946通过常规的斜面培养和种子培养，得到发酵用菌。

赭曲霉Aspergillus ochraceus ATCC 18500

斜面培养

斜面培养基：土豆培养基；培养条件：30℃，培养6～7天。

液体种子培养

液体种子培养基：

名称	用量（g/L）
		玉米浆粉末	10
磷酸氢二钾	3
		磷酸二氢钾	3

pH = 7.2 ± 0.2，孢子悬液：用无菌水将斜面孢子洗下，制成孢子悬液，镜检计数，孢子浓度2～3×10⁷ 个/ml；摇瓶种子培养：接种量10%，180 rpm，30℃，培养36～40h，生物量为5%～8%；10升种子罐：接种量10%，150 rpm，空气流量：0.2 Nm³/h，罐压：0.05MPa，培养30～32 h，种子湿重为5%～8%。种子湿重的计算方法为：4000 rpm离心10 min，弃上清，收集菌体，称重，菌体重量占培养基总重量的百分数。

节杆菌Arthrobacter simplex ATCC 6946

斜面培养

斜面培养基：土豆培养基；培养条件：30℃，培养6～7天

液体种子培养

液体种子培养基：

名称	用量（g/L）
		蛋白胨	10
牛肉粉	3
		氯化钠	5

pH = 7.2 ± 0.2；孢子悬液：用无菌水将斜面孢子洗下，制成孢子悬液，镜检计数，孢子浓度2～3×10⁷ 个/ml；摇瓶种子培养：接种量10%，180 rpm，30℃，培养40～48 h，生物量为5%～8%；10升种子罐：接种量10%，150 rpm，空气流量：0.2 Nm³/h，罐压：0.05MPa，培养36～40 h，生物量2%～3%。

把以上两种菌混合发酵，通过大量实验发现，以下培养基组分对于本发明发酵来说，是适合的。1L水中，发酵培养基的组分和重量为甲醇19-21g，TW80 1.9-2.1g，酵母膏或酵母粉9.5-10.5g，糖蜜9.5-10.5g，硝酸钠或硝酸钾4.75-5.25g，磷酸氢二钠或磷酸氢二钾1.9-2.1g，磷酸二氢钠或磷酸二氢钾1.9-2.1g；优选为1L水中，发酵培养基的组分和重量为甲醇20g，TW80 2g，酵母膏或酵母粉10g，糖蜜10g，硝酸钠或硝酸钾5g，磷酸氢二钠或磷酸氢二钾2g，磷酸二氢钠或磷酸二氢钾2g。糖蜜为：工业制糖过程中，蔗糖结晶后，剩余的不能结晶，但仍含有较多糖的液体残留物，可从市场上购买，如天津市叶兹化工技术有限公司。

培养基的pH= 7.0±0.2。优选的，赭曲霉Aspergillus ochraceus ATCC 18500的接种量为18-22%，最优选20%，节杆菌Arthrobacter simplex ATCC 6946的接种量为8-12%，最佳为10%。优选的，赭曲霉Aspergillus ochraceus ATCC 18500和节杆菌Arthrobacter simplex ATCC 6946的接种量的比例为1.8-2.2:1。50升罐转化：装样量70%（即35升培养基），罐压0.045-0.055MPa，最优0.05MPa，空气流量：0.45-0.55 VVM，最优选0.5VVM。

发酵转化完毕，90℃灭活，冷却到25℃，抽滤，滤饼层用二氯甲烷萃取剂萃取，浓缩，得11α-OH-ADD晶体，11α-OH-ADD晶体用1体积的甲苯60℃打浆1小时，冷却到25℃，抽滤，得白色晶体。

本发明的有益效果是，相对于单独使用上述的两种菌进行上羟基以及脱氢反应，本发明通过混菌发酵4-AD得到11α-OH-ADD，两菌株在发酵转化上存在有协同效应，有如下优点：总收率较高，转化更完全，减少了一步后处理，能耗减少。本发明的混菌发酵使得其生产成本大幅度降低，不仅提高了转化率，而且降低了转化时间，相应的减少了后处理，减少了能耗。

具体实施方式

实施例1

斜面、种子培养方法如发明内容部分所述，在1L水中，发酵底物4-AD 20g，发酵培养基的组分和重量为甲醇20g，TW80（吐温80） 2g，酵母膏10g，糖蜜10g，硝酸钠5g，磷酸氢二钠2g，磷酸二氢钠2g，pH值为7.0。赭曲霉Aspergillus ochraceus ATCC 18500的接种量为20%，节杆菌Arthrobacter simplex ATCC 6946的接种量为10%。使用50升罐进行转化，装样量70%，罐压0.05 MPa，空气流量：0.5 VVM，温度：30℃，搅拌：150 rpm，转化50小时，取样TLC分析，转化基本完全，样品用乙酸乙酯（EA）萃取，将EA层送HPLC，11α-OH-ADD含量96.1%，4-AD含量0.5%，ADD含量0.7%，11α-OH-4-AD含量1.2%。

转化完毕，90 ℃灭活，冷却到25℃，抽滤，滤饼层用二氯甲烷萃取，浓缩，得淡黄色晶体，晶体用1体积的甲苯60℃打浆1小时，冷却到25℃，抽滤，得白色晶体，收率91.5%，11α-OH-ADD含量98.2%(HPLC面积归一法)。

实施例2

斜面、种子培养方法如发明内容部分所述，在1L水中，发酵底物4-AD 19g，发酵培养基的组分和重量为甲醇21g，TW80 2.1g，酵母粉10.5g，糖蜜9.5g，硝酸钾4.75g，磷酸氢二钾1.9g，磷酸二氢钾1.9g；pH值为6.8。赭曲霉Aspergillus ochraceus ATCC 18500的接种量为19.5%，节杆菌Arthrobacter simplex ATCC 6946的接种量为10.5%。使用50升罐进行转化，装样量70%，罐压0.055MPa，空气流量：0.45 VVM，温度：30℃，搅拌：150 rpm，转化48小时，取样TLC分析，转化基本完全，样品用EA萃取，将EA层送HPLC，11α-OH-ADD含量95.6%，4-AD含量0.6%，ADD含量1.0%，11α-OH-4-AD含量0.9%。

转化完毕，90 ℃灭活，冷却到25℃，抽滤，滤饼层用二氯甲烷萃取，浓缩，得淡黄色晶体，晶体用1体积的甲苯60℃打浆1小时，冷却到25℃，抽滤，得白色晶体，收率89.1%，11α-OH-ADD含量97.6%(HPLC面积归一法)。

实施例3

斜面、种子培养方法如发明内容部分所述，在1L水中，发酵底物4-AD 21g，发酵培养基的组分和重量为甲醇19g，TW80 1.9g，酵母粉9.5g，糖蜜10.5g，硝酸钾5.25g，磷酸氢二钾2.1g，磷酸二氢钾2.1g；pH值为7.2。赭曲霉Aspergillus ochraceus ATCC 18500的接种量为19%，节杆菌Arthrobacter simplex ATCC 6946的接种量为10%。使用50升罐进行转化，装样量70%，罐压0.045 MPa，空气流量：0.55VVM，温度：30℃，搅拌：150 rpm，转化48小时，取样TLC分析，转化基本完全，样品用EA萃取，将EA层送HPLC，11α-OH-ADD含量97.11%，4-AD含量0.23%，ADD含量0.33%，11α-OH-4-AD含量1.52%。

转化完毕，90℃灭活，冷却到25℃，抽滤，滤饼层用二氯甲烷萃取，浓缩，得11α-OH-ADD晶体，11α-OH-ADD晶体用1体积的甲苯60℃打浆1小时，冷却到25℃，抽滤，得白色晶体，重量收率91%，11α-OH-ADD含量98.1%(HPLC归一法)。

实施例4

斜面、种子培养方法如发明内容部分所述，在1L水中，发酵底物4-AD 20g，发酵培养基的组分和重量为甲醇20g，TW80 2g，酵母粉10g，糖蜜10g，硝酸钾5g，磷酸氢二钾2g，磷酸二氢钾2g；pH值为7.0。赭曲霉Aspergillus ochraceus ATCC 18500的接种量为20%，节杆菌Arthrobacter simplex ATCC 6946的接种量为10%。使用50升罐进行转化，装样量70%，罐压0.05 MPa，空气流量：0.5 VVM，温度：30℃，搅拌：150 rpm，转化52小时，取样TLC分析，转化基本完全，样品用乙酸乙酯萃取，将乙酸乙酯层送HPLC，11α-OH-ADD含量97.51%，4-AD含量0.17%，ADD含量0.30%，11α-OH-4-AD含量1.2%(HPLC面积归一法)。

转化完毕，90 ℃灭活，冷却到25℃，抽滤，滤饼层用二氯甲烷萃取，浓缩，得11α-OH-ADD晶体，11α-OH-ADD晶体用1体积的甲苯60℃打浆1小时，冷却到25℃，抽滤，得白色晶体，收率90%，11α-OH-ADD含量98.6%(HPLC面积归一法)。

对比实施例1

斜面、种子培养方法如发明内容部分所述，转化培养基如实施例1所述，底物为4-AD 20g/l，接种节杆菌Arthrobacter simplex ATCC 6946，接种量为10%，进行脱氢转化，30℃，180 rpm，转化期间取样TLC监测，转化96小时，其他条件不变，转化停滞, 取样送液相，ADD含量81.2%，4-AD含量16.2%。

转化完毕，90 ℃灭活，冷却到25℃，抽滤，滤饼层用二氯甲烷萃取，浓缩，得淡黄色晶体，产物用1体积的石油醚60℃打浆1小时，冷却到25℃，抽滤，得白色晶体，收率70.1%，ADD含量82.2% (HPLC面积归一法)。

对比实施例2

斜面、种子培养方法如发明内容部分所述，转化培养基如实施例1所述，转化培养基底物由4-AD替换为11α-OH-4-AD，含量为20g/l，接种节杆菌Arthrobacter simplex ATCC 6946，接种量为10%，进行脱氢转化，30℃，180 rpm，期间用TLC检测监控转化情况，转化96小时，其他条件不变，转化停滞，取样送液相，转化11α-OH-ADD含量75.1%，11α-OH-4-AD含量20.1%。

转化完毕，90 ℃灭活，冷却到25℃，抽滤，滤饼层用二氯甲烷萃取，浓缩，得11α-OH-ADD晶体，11α-OH-ADD晶体用1体积的甲苯60℃打浆1小时，冷却到25℃，抽滤，得白色晶体，收率88.2%，11α-OH-ADD含量74.2% (HPLC面积归一法)。

对比实施例3

斜面、种子培养方法如发明内容部分所述，转化培养基如实施例1所述，转化培养基底物由4-AD替换为ADD，含量为20g/l，接种赭曲霉Aspergillus ochraceus ATCC 18500，进行11位羟化，30℃，180 rpm，转化72小时，其他条件不变，取样TLC检测，脱氢转化完全，取样送液相，11α-OH-ADD含量97.8%。

转化完毕，90℃灭活，冷却到25℃，抽滤，滤饼层用二氯甲烷萃取，浓缩，得11α-OH-ADD晶体，11α-OH-ADD晶体用1体积的甲苯60℃打浆1小时，冷却到25℃，抽滤，得白色晶体，重量收率89%，11α-OH-ADD含量98.5%(HPLC归一法)。

对比实施例4

斜面、种子培养方法如发明内容部分所述，转化培养基如实施例1所述，底物为4-AD 20g/l，先接种节杆菌Arthrobacter simplex ATCC 6946，接种量为10%，进行脱氢转化，转化48小时，取样TLC检测，脱氢转化完全，接入赭曲霉Aspergillus ochraceus ATCC 18500，接种量为20%，转化96小时，其他条件不变，转化停滞，取样TLC检测，未转化完全，送样HPLC，转化75.2%。

90℃灭活，冷却到25℃，抽滤，滤饼层用二氯甲烷萃取，浓缩，得淡黄色晶体，晶体用1体积的甲苯60℃打浆1小时，冷却到25℃，抽滤，得白色晶体，重量收率80%，11α-OH-ADD含量79.2%(HPLC归一法)。

对比实施例5

斜面、种子培养方法如发明内容部分所述，转化培养基如实施例1所述，底物为4-AD 20g/l，先接种赭曲霉Aspergillus ochraceus ATCC 18500，接种量为20%，进行脱氢转化，转化72小时，取样TLC检测，11位羟化完全，接入节杆菌Arthrobacter simplex ATCC 6946，接种量为10%，转化120小时，其他条件不变，转化停滞，取样TLC检测，未转化完全，送样HPLC，转化85.4%。

90℃灭活，冷却到25℃，抽滤，滤饼层用二氯甲烷萃取，浓缩，得淡黄色晶体，晶体用1体积的甲苯60℃打浆1小时，冷却到25℃，抽滤，得白色晶体，重量收率78.7%，11α-OH-ADD含量87.2%(HPLC归一法)。

从对比实施例4、5来看，先后顺序发酵，先后进行C_1,2位脱氢和C₁₁位羟基化，其最后的产品的收率分别是80%和78.7%，相比于实施例1的91.5%相差甚远。

考虑到一种菌发酵后，发酵液的组分和含量会发生变化，对后一种菌不再是合适的发酵液，因此考虑到让每种菌都在最合适的条件下发酵。结合对比实施例1和3，11α-OH-ADD的收率为70.1%*89%=62.4%。

从实施例和上述分析中，可以惊讶的得出这样的结论：本发明的两种菌，即赭曲霉Aspergillus ochraceus ATCC 18500和节杆菌Arthrobacter simplex ATCC 6946存在协同作用，两种菌对发酵底物4-AD生成11α-OH-ADD有明显的相互促进作用，这是以前的研究中未发现的。

Claims

1.一种微生物混菌发酵制备11α-OH-ADD的方法，以4-AD为原料，其特征是，经赭曲霉Aspergillus ochraceus ATCC18500和节杆菌Arthrobacter simplex ATCC6946混合一步发酵制备11α-OH-ADD。

2.根据权利要求1所述的微生物混菌发酵制备11α-OH-ADD的方法，其特征是，赭曲霉Aspergillus ochraceus ATCC18500的接种量为18-22%，节杆菌Arthrobacter simplexATCC6946的接种量为8-12%。

3.根据权利要求2所述的微生物混菌发酵制备11α-OH-ADD的方法，其特征是，赭曲霉Aspergillus ochraceus ATCC18500和节杆菌Arthrobacter simplex ATCC6946的接种量的比例为1.8-2.2:1。

4.根据权利要求1所述的微生物混菌发酵制备11α-OH-ADD的方法，其特征是，赭曲霉Aspergillus ochraceus ATCC18500的接种量为20%，节杆菌Arthrobacter simplex ATCC6946的接种量为10%。

5.根据权利要求1-4任一项所述的微生物混菌发酵制备11α-OH-ADD的方法，其特征是，1L水中，发酵培养基的组分和重量为甲醇19-21g，TW801.9-2.1g，酵母膏或酵母粉9.5-10.5g，糖蜜9.5-10.5g，硝酸钠或硝酸钾4.75-5.25g，磷酸氢二钠或磷酸氢二钾1.9-2.1g，磷酸二氢钠或磷酸二氢钾1.9-2.1g。

6.根据权利要求5所述的微生物混菌发酵制备11α-OH-ADD的方法，其特征是，1L水中，发酵培养基的组分和重量为甲醇20g，TW802g，酵母膏或酵母粉10g，糖蜜10g，硝酸钠或硝酸钾5g，磷酸氢二钠或磷酸氢二钾2g，磷酸二氢钠或磷酸二氢钾2g。

7.根据权利要求1-4任一项所述的微生物混菌发酵制备11α-OH-ADD的方法，其特征是，罐压为0.045-0.055MPa。

8.根据权利要求1-4任一项所述的微生物混菌发酵制备11α-OH-ADD的方法，其特征是，空气流量为0.45-0.55VVM。

9.根据权利要求1所述的微生物混菌发酵制备11α-OH-ADD的方法，其特征是，发酵培养基的pH值为6.8-7.2。