CN104388515A - 一种植物甾醇混菌发酵生产11ɑ-OH-ADD的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种植物甾醇混菌发酵生产11ɑ-OH-ADD的方法，以植物甾醇为原料，经分枝杆菌和赫曲霉混合发酵生产11ɑ-OH-ADD；与现在技术相比，本发明具有如下有益效果：通过混菌发酵的协同作用，原料转化更完全，产品总收率更高，减少一步后处理，溶剂消耗、三废排放、能源消耗更少，降低生产成本的同时更加环保。
Description
技术领域
本发明涉及一种甾体激素重要中间体的制备方法，具体涉及一种植物甾醇混菌发酵生产11ɑ-OH-ADD的方法。
背景技术
11ɑ-OH-ADD(即11ɑ-羟基-1,4-二烯雄甾-3,17-二酮)是甾体激素类药物重要中间体，甾体药物生产中，甾体母核中C1,2位导入双键及C11位ɑ羟基化都是重要的甾体转化反应，母核中C1,2位置导入双键后，能成倍的增加抗炎作用，而通过C11位ɑ羟基化可以引入高生理活性基团，从而大大增加疗效，减少副作用。11ɑ-OH-ADD可用于合成倍他米松，地塞米松，泼尼松龙等多种甾体药物，市场需求量巨大。
从植物甾醇制备11ɑ-OH-ADD，现有技术大都分两步进行。申请公开号为CN102477404的中国专利公开了一种植物甾醇经微生物转化为ADD的方法及所用培养基，具体是以植物甾醇为原料先生产ADD，经提取分离精制后，再以ADD为原料生产11ɑ-OH-ADD；申请公开号为CN102827913的中国专利公开了一种微生物混菌发酵制备11ɑ-OH-ADD的方法，具体是以植物甾醇为原料先生产4AD，经提取分离精制后，再以4AD为原料生产11ɑ-OH-ADD；上述两种方案都会存在先提取后再发酵，导致收率低且能耗高，且生产周期较长。
发明内容
为解决现在技术所存在的问题，本发明提供一种以植物甾醇为原料经混菌发酵生产11ɑ-OH-ADD的方法，以植物甾醇为原料，成本更低，生产周期更短，一次收率更高，是目前生产11ɑ-OH-ADD中最经济、快捷的方法。
本发明的反应式如下：
本发明采用如下技术方案实现：一种植物甾醇混菌发酵生产11ɑ-OH-ADD的方法，以植物甾醇为原料，经分枝杆菌和赫曲霉混合发酵生产11ɑ-OH-ADD。
优选地，上述方法所使用的发酵培养基配方为：酵母膏15～20g/L，硝酸钠80～100g/L，磷酸二氢钾1.2～1.5g/L，磷酸氢二钠2.4～2.6g/L，葡萄糖6～8g/L，氯化钾1～2g/L，七水硫酸镁8～10g/L，大豆油20～30g/L，吐温-800.8～1.5g/L，植物甾醇20～40g/L；所述发酵培养基的PH为6.0～8.0。
优选地，将配置好的发酵培养基升温至80～85℃，保温搅拌1.0～1.2h。
优选地，采用两级或多级发酵方式，预先分别培养好分枝杆菌菌种和赫曲霉菌种。
优选地，分枝杆菌菌种的接种量为15～20％，赫曲霉菌种的接种量为10～15％。
优选地，接入分枝杆菌菌种40～48h后再接入赫曲霉菌种。
优选地，发酵转化完毕后，85～95℃灭活，冷却至15～25℃抽滤，滤饼用二氯甲烷萃取。
具体步骤如下：
一、菌种培养
分枝杆菌菌种培养：将分枝杆菌接种至液体种子培养基中，180rpm，30℃，培养42～48h。
赫曲霉菌种培养：将赫曲霉接种至液体种子培养基中，180rpm，29℃，培养42～48h。
二、发酵转化
按如下配方配置发酵培养基：酵母膏15～20g/L，硝酸钠80～100g/L，磷酸二氢钾1.2～1.5g/L，磷酸氢二钠2.4～2.6g/L，葡萄糖6～8g/L，氯化钾1～2g/L，七水硫酸镁8～10g/L，大豆油20～30g/L，吐温-800.8～1.5g/L，植物甾醇20～40g/L；所述发酵培养基的PH为6.0～8.0；将培养基升温至80～85℃后，保温搅拌1～1.2h，待甾醇充分分散后蒸汽灭菌。
先接入分枝杆菌菌种，接种量为15～20％，转化温度为30～32℃，转化培养40～48h后，再接入赫曲霉菌种，接种量为10～15％，转温度为29～31℃。
三、提取分离
发酵转化完毕后，85～95℃灭活，冷却至15～25℃抽滤，滤饼用二氯甲烷萃取，浓缩至干，得11ɑ-OH-ADD粗品，将11ɑ-OH-ADD粗品用甲苯打浆，冷却析晶，抽滤得11ɑ-OH-ADD精品。
与现在技术相比，本发明具有如下有益效果：通过混菌发酵的协同作用，原料转化更完全，产品总收率更高，减少一步后处理，溶剂消耗、三废排放、能源消耗更少，降低生产成本的同时更加环保。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明一种植物甾醇混菌发酵生产11ɑ-OH-ADD的方法作进一步的详细说明。
实施例1
一、菌种培养
分枝杆菌菌种培养：将分枝杆菌接种至液体种子培养基中，180rpm，30℃，培养48h。
赫曲霉菌种培养：将赫曲霉接种至液体种子培养基中，180rpm，29℃，培养48h。
二、发酵转化
配置100ml发酵培养基，所述发酵培养基包含有溶解或分散在水中的下列物质：酵母膏1.5g，硝酸钠8g，磷酸二氢钾0.12g，磷酸氢二钠0.24g，葡萄糖0.6g，氯化钾0.1g，七水硫酸镁0.8g，大豆油2g，吐温-800.08g，植物甾醇2g；所述发酵培养基的PH为6.0；将培养基升温至80℃后，保温搅拌1h，待甾醇充分分散后蒸汽灭菌。
接入分枝杆菌菌种，接种量为15ml，转化温度为32℃，搅拌180rpm，转化培养40h后，接入赫曲霉菌种，接种量为10ml，转温度为31℃，搅拌180rpm，转化63h，取样TLC分析，转化基本完全，无植物甾醇斑点，样品用二氯甲烷萃取，并送HPLC检测，11ɑ-OH-ADD含量93.3％，ADD含量0.8％。
三、提取分离
发酵转化完毕后，90℃灭活，冷却至20℃抽滤，滤饼用二氯甲烷萃取，浓缩至干，得淡黄色粗品，加少许甲苯打浆，冷却析晶，抽滤得白色晶体，称重0.97g，HPLC检测纯度为98.3％(检测波长为245nm，面积归一法得纯度)，重量收率为38.8％。
实施例2
一、菌种培养
分枝杆菌菌种培养：将分枝杆菌接种至液体种子培养基中，180rpm，30℃，培养42h。
赫曲霉菌种培养：将赫曲霉接种至液体种子培养基中，180rpm，29℃，培养43h。
二、发酵转化
配置100ml发酵培养基，所述发酵培养基包含有溶解或分散在水中的下列物质：酵母膏2g，硝酸钠10g，磷酸二氢钾0.15g，磷酸氢二钠0.26g，葡萄糖0.8g，氯化钾0.2g，七水硫酸镁1g，大豆油2.2g，吐温-800.15g，植物甾醇4g；所述发酵培养基的PH为7.2；将培养基升温至80℃后，保温搅拌1h，待甾醇充分分散后蒸汽灭菌。
接入分枝杆菌菌种，接种量为18ml，转化温度为31℃，搅拌180rpm，转化培养45h后，接入赫曲霉菌种，接种量为12ml，转温度为30℃，搅拌180rpm，转化71h，取样TLC分析，转化基本完全，无植物甾醇斑点，样品用二氯甲烷萃取，并送HPLC检测，11ɑ-OH-ADD含量91.4％，ADD含量1.1％。
三、提取分离
发酵转化完毕后，85℃灭活，冷却至15℃抽滤，滤饼用二氯甲烷萃取，浓缩至干，得淡黄色粗品，加少许甲苯打浆，冷却析晶，抽滤得白色晶体，称重1.13g，HPLC检测纯度为98.1％(检测波长为245nm，面积归一法得纯度)，重量收率为37.6％。
实施例3
一、菌种培养
分枝杆菌菌种培养：将分枝杆菌接种至液体种子培养基中，180rpm，30℃，培养46h。
赫曲霉菌种培养：将赫曲霉接种至液体种子培养基中，180rpm，29℃，培养42h。
二、发酵转化
配置100ml发酵培养基，所述发酵培养基包含有溶解或分散在水中的下列物质：酵母膏1.8g，硝酸钠9g，磷酸二氢钾0.14g，磷酸氢二钠0.25g，葡萄糖0.7g，氯化钾0.15g，七水硫酸镁0.9g，大豆油3g，吐温-800.12g，植物甾醇3g；所述发酵培养基的PH为8.0；将培养基升温至85℃后，保温搅拌1.2h，待甾醇充分分散后蒸汽灭菌。
接入分枝杆菌菌种，接种量为20ml，转化温度为30℃，搅拌180rpm，转化培养48h后，接入赫曲霉菌种，接种量为15ml，转温度为29℃，搅拌180rpm，转化83h，取样TLC分析，转化基本完全，无植物甾醇斑点，样品用二氯甲烷萃取，并送HPLC检测，11ɑ-OH-ADD含量90.7％，ADD含量1.92％。
三、提取分离
发酵转化完毕后，95℃灭活，冷却至25℃抽滤，滤饼用二氯甲烷萃取，浓缩至干，得淡黄色粗品，加少许甲苯打浆，冷却析晶，抽滤得白色晶体，称重1.45g，HPLC检测纯度为98.2％(检测波长为245nm，面积归一法得纯度)，重量收率为36.25％。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围的内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求所界定的保护范围为准。
Claims (7)
1.一种植物甾醇混菌发酵生产11ɑ-OH-ADD的方法，其特征在于，以植物甾醇为原料，经分枝杆菌和赫曲霉混合发酵生产11ɑ-OH-ADD。
2.根据权利要求1所述的植物甾醇混菌发酵生产11ɑ-OH-ADD的方法，其特征在于，使用的发酵培养基配方为：酵母膏15～20g/L，硝酸钠80～100g/L，磷酸二氢钾1.2～1.5g/L，磷酸氢二钠2.4～2.6g/L，葡萄糖6～8g/L，氯化钾1～2g/L，七水硫酸镁8～10g/L，大豆油20～30g/L，吐温-80 0.8～1.5g/L，植物甾醇20～40g/L；所述发酵培养基的PH为6.0～8.0。
3.根据权利要求2所述的植物甾醇混菌发酵生产11ɑ-OH-ADD的方法，其特征在于，将配置好的发酵培养基升温至80～85℃，保温搅拌1.0～1.2h。
4.根据权利要求1所述的植物甾醇混菌发酵生产11ɑ-OH-ADD的方法，其特征在于，采用两级或多级发酵方式，预先分别培养好分枝杆菌菌种和赫曲霉菌种。
5.根据权利要求1所述的植物甾醇混菌发酵生产11ɑ-OH-ADD的方法，其特征在于，分枝杆菌菌种的接种量为15～20％，赫曲霉菌种的接种量为10～15％。
6.根据权利要求1所述的植物甾醇混菌发酵生产11ɑ-OH-ADD的方法，其特征在于，接入分枝杆菌菌种40～48h后再接入赫曲霉菌种。
7.根据权利要求1所述的植物甾醇混菌发酵生产11ɑ-OH-ADD的方法，其特征在于，发酵转化完毕后，85～95℃灭活，冷却至15～25℃抽滤，滤饼用二氯甲烷萃取。
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