CN117247924A - 一种Ame1-FgTad2-FgTad3编辑酶系统、编辑工具和编辑方法 - Google Patents
一种Ame1-FgTad2-FgTad3编辑酶系统、编辑工具和编辑方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于基因编辑技术领域，具体公开了一种Ame1‑FgTad2‑FgTad3编辑酶系统、编辑工具和编辑方法。本发明所述系统为AME1‑FgTAD2‑FgTAD3三个基因(蛋白)组成的三元复合体，可催化mRNA上的A‑to‑I编辑。本发明通过将AME1基因在禾谷镰孢无性阶段表达，可检测到大量A‑to‑I mRNA编辑。将Ame1‑FgTad2‑FgTad3编辑酶系统转入酿酒酵母、大肠杆菌和人源细胞中表达均能够产生A‑to‑I mRNA编辑，表明禾谷镰孢A‑to‑I mRNA编辑系统的活性具有广适性，具备在不同生物中开发为基因编辑工具的巨大潜力。
Description
技术领域
本发明属于基因编辑技术领域，具体涉及一种Ame1-FgTad2-FgTad3编辑酶系统、编辑工具和编辑方法。
背景技术
Ato-I mRNA编辑是一种重要的RNA修饰现象，该现象普遍存在于动物中，由ADAR家族的酶通过脱氨基作用将mRNA分子中的腺苷(A)转变为肌苷(I)，肌苷会被各种细胞过程识别为鸟苷(G)，因此A-to-I mRNA编辑相当于发生在mRNA上的A-to-G突变，可导致mRNA编码的蛋白发生改变。申请人团队前期在禾谷镰孢(Fusarium graminearum)、粗糙脉孢(Neurospora crassa)等真菌中发现了A-to-I mRNA编辑现象，并证明其特异发生在有性生殖阶段[1][2]。ADAR酶的一个共同特征是C-端具有脱氨酶结构域，N-端具有若干dsRNA结合结构域[3]。ADAR是动物中特异进化出来的基因家族，其它生物中不存在ADAR酶[4]。因此真菌中的A-to-ImRNA编辑催化系统尚不清楚。
参考文献：
[1]Liu H,Wang Q,He Y,Chen L,Hao C,Jiang C et al.2016.Genome-wideA-to-I RNAediting in fungiindependent ofADARenzymes.Genome Res,26(4),499-509.
[2]Liu H,Li Y,Chen D,Qi Z,Wang Q,Wang J,Jiang C,Xu JR.2017A-to-I RNAediting is developmentallyregulated andgenerally adaptive for sexualreproduction inNeurosporacrassa.ProcNatl Acad SciU SA,114(37),E7756-E7765.
[3]SavvaYA,RiederLE,ReenanRA.2012.TheADARprotein family.GenomeBiol13:252.
[4]Grice LF.,Degnan,BM.2015.The origin ofthe ADAR gene family andanimal RNA editing.BMC EvolBiol,15(1),4.
发明内容
本发明的目的在于提供一种来源于禾谷镰孢中的Ame1-FgTad2-FgTad3编辑酶系统、编辑工具和编辑方法，可在各个物种的mRNA上进行特异的A到G的突变。
本发明提供了一种Ame1-FgTad2-FgTad3编辑酶系统，所述Ame1的氨基酸序列如SEQ IDNo.1所示，所述FgTad2的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，所述FgTad3的氨基酸序列如SEQ IDNo.3所示。
优选的，编码所述Ame1的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，编码所述FgTad2的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，编码所述FgTad3的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。
本发明还提供了上述编辑酶系统在作为A-to-I mRNA编辑工具中的应用。
本发明还提供了一种A-to-I mRNA编辑工具，包括上述编辑酶系统。
本发明还提供了一种包含上述编辑酶系统的编码基因的重组载体。
优选的，当所述编辑酶系统在酵母中表达时，以pYES2载体为基础载体；
当所述编辑酶系统在大肠杆菌中表达时，以pRSFDuet1为基础载体；
当所述编辑酶系统在人源细胞中表达时，以pCMV-Blank为基础载体。
本发明还提供了上述重组载体的构建方法，在基础载体上插入AME1基因表达框、FgTAD2基因表达框和FgTAD3基因表达框。
本发明还提供了一种利用上述A-to-I mRNA编辑工具进行A-to-I mRNA编辑的方法，包括以下步骤，将上述编辑酶系统或上述A-to-I mRNA编辑工具或上述重组载体转入需要A-to-I mRNA编辑的物种中。
优选的，所述物种包括原核生物和真核生物。
优选的，所述物种包括酿酒酵母、大肠杆菌和人源细胞。
有益效果：本发明提供了一种Ame1-FgTad2-FgTad3编辑酶系统，所述系统为AME1-FgTAD2-FgTAD3三个基因(蛋白)组成的三元复合体，其中FgTad3与FgTad2互作形成的异源二聚体催化tRNA反密码子环第34位A-to-I编辑，Ame1与FgTad3的N端互作，形成的Ame1-FgTad2-FgTad3三元复合体催化mRNA上的A-to-I编辑。在本发明中，FgTAD2和FgTAD3基因为组成型表达，而AME1基因为有性阶段特异表达，自然条件下A-to-I mRNA编辑只出现在有性阶段。本发明通过将AME1基因在禾谷镰孢无性阶段表达，可检测到大量A-to-I mRNA编辑。将Ame1-FgTad2-FgTad3编辑酶系统转入酿酒酵母、大肠杆菌和人源细胞表达均能够产生A-to-I mRNA编辑，表明禾谷镰孢A-to-I mRNA编辑系统的活性具有广适性，具备在不同生物中开发为基因编辑工具的巨大潜力。
附图说明
图1为本发明所示mRNA编辑激活因子AME1在粪壳菌纲中的进化关系图；AME1是粪壳菌纲中特异进化出来的一个分支，参与mRNA编辑，起到了激活mRNA编辑的作用；
图2为本发明的一个实施方式中Ame1-FgTad2-FgTad3编辑酶系统的pYES2-Ame1酵母表达载体构建示意图；
图3为本发明的一个实施方式中Ame1-FgTad2-FgTad3编辑酶系统的pYES2-Leu-4M-FgTad2酵母表达载体构建示意图；
图4为本发明的一个实施方式中Ame1-FgTad2-FgTad3编辑酶系统的pYES2-Trp-FgTad3酵母表达载体构建示意图；
图5为本发明的一个实施方式中Ame1-FgTad2-FgTad3编辑酶系统转入酵母原生质体中，底物mRNA上发生编辑的位点峰图；
图6为本发明实施方式中Ame1-FgTad2-FgTad3编辑酶系统分别转入大肠杆菌和酵母原生质体中，转录组测序后，大肠杆菌和酵母出现的mRNA编辑事件及其编辑水平；其中，从左到右依次为酵母和大肠杆菌；
图7为本发明实施方式中Ame1-FgTad2-FgTad3编辑酶系统转入大肠杆菌和酵母原生质体中，转录组测序后，发生mRNA编辑的序列偏好性与禾谷镰孢中mRNA编辑序列偏好性比较结果图；其中，从上到下依次为禾谷镰孢、大肠杆菌和酵母；
图8为本发明的一个实施方式中Ame1-FgTad2-FgTad3编辑酶系统的大肠杆菌表达载体构建示意图；
图9为本发明的一个实施方式中Ame1-FgTad2-FgTad3编辑酶系统转入大肠杆菌中，底物mRNA上发生编辑的位点峰图；
图10为本发明的一个实施方式中Ame1-FgTad2-FgTad3编辑酶系统的人源细胞表达载体构建示意图；
图11为本发明的一个实施方式中Ame1-FgTad2-FgTad3编辑酶系统转入人胰腺癌细胞中，AME1基因自身发生编辑的位点峰图。
具体实施方式
本发明提供了一种Ame1-FgTad2-FgTad3编辑酶系统，所述Ame1的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，所述FgTad2的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，所述FgTad3的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。
本发明只是以禾谷镰孢中的Ame1-FgTad2-FgTad3编辑系统为例，但根据本发明，其它粪壳菌纲真菌中的该系统也应具有mRNA编辑的功能，因此也应属于本发明保护范围。
本发明所述Ame1优选来源于禾谷镰孢(Fusarium graminerum)，氨基酸序列如SEQID No.1所示，共计652个氨基酸。对应的AME1基因的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，序列长1959bp。
本发明所述FgTad2(实施例中记为FgTad2-4M)优选来源于禾谷镰孢(Fusariumgraminerum)，氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，全长377个氨基酸；对应的FgTAD2基因的核苷酸序列优选如SEQ ID No.5所示，序列长1134bp。
本发明所述FgTad3的氨基酸序列优选来源于禾谷镰孢(Fusarium graminerum)，其序列长428个氨基酸，如SEQ ID No.3所示；对应的FgTAD3基因的核苷酸序列全长1287bp，如SEQ ID No.6所示。
所述AME1基因在大肠杆菌中优化密码子后的核苷酸序列全长1959bp，如SEQ IDNo.7所示。
所述FgTAD2基因编码的短蛋白在大肠杆菌中优化密码子后的核苷酸序列全长1134bp，如SEQ ID No.8所示。
所述FgTAD3基因在大肠杆菌中优化密码子后的核苷酸序列全长1287bp，如SEQ IDNo.9所示。
本发明还提供了上述编辑酶系统在作为A-to-I mRNA编辑工具中的应用。
本发明实施例中发现禾谷镰孢中的A-to-I mRNA编辑催化系统为Ame1-FgTad2-FgTad3三元复合体。通过基因敲除、过表达、RIP-seq等实验证明负责tRNA反密码子环上A34位A-to-I修饰的FgTad2-FgTad3酶也是催化A-to-I mRNA编辑的酶，但FgTad2-FgTad3编辑mRNA的能力依赖Ame1蛋白。AME1特异在禾谷镰孢有性生殖阶段被诱导表达，所以自然情况下，A-to-I mRNA编辑只发生在有性生殖阶段。通过将AME1基因在禾谷镰孢无性阶段表达，可检测到大量A-to-I mRNA编辑。实验证明，FgTad2和FgTad3的C-端互作，而Ame1与FgTad3的N-端互作，三者形成的Ame1-FgTad2-FgTad3三元复合体，执行A-to-I mRNA编辑功能。将Ame1-FgTad2-FgTad3编辑酶系统转入酿酒酵母、大肠杆菌和人源细胞中表达均能够产生A-to-I mRNA编辑，表明禾谷镰孢A-to-I mRNA编辑系统的活性具有广适性，具备在不同生物中开发为基因编辑工具的巨大潜力。同时，本发明还发现Ame1在mRNA编辑中的功能在粪壳菌纲真菌中保守。研究发现AME1的直系同源基因主要存在于丝状子囊真菌中，在粪壳菌纲(Sordariomycetes)和其最近的锤舌菌纲(Leotiomycetes)真菌中还存在另外一个祖先复制形成的AME1旁系同源基因。相较于锤舌菌纲，粪壳菌纲真菌中的AME1基因进化速率加快。锤舌菌纲真菌核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)的AME1直系同源基因不能替换禾谷镰孢中AME1基因的功能。上述结果表明AME1基因在mRNA编辑中的功能是在粪壳菌纲真菌中特异进化出来的。研究发现A-to-I mRNA编辑在粪壳菌纲真菌中普遍存在，因此粪壳菌纲真菌的AME1基因应该普遍具有mRNA编辑的功能。因此本发明证实了禾谷镰孢中的A-to-I mRNA编辑催化系统具有作为广谱基因编辑工具的前景。
本发明还提供了一种A-to-I mRNA编辑工具，包括上述编辑酶系统。
本发明还提供了一种包含上述编辑酶系统的编码基因的重组载体。
本发明优选以pYES2、pRSFDuet1、pCMV-Blank载体为基础载体，分别用于酵母、大肠杆菌和人源细胞中表达编辑酶系统，并在原始载体加入相应的启动子和终止子后，将该载体改造成为一个多元表达载体，且构建的重组载体的质粒图谱优选如图2、图3、图4、图8、图10所示。
本发明还提供了上述重组载体的构建方法，在基础载体上插入AME1基因表达框、FgTAD2基因表达框和FgTAD3基因表达框。
本发明所述基因表达框优选包括启动子、基因和终止子，且为了高效表达，在不同物种中利用的启动子和终止子有所差异。如在酵母中表达时，所述AME1、FgTAD2、FgTAD3基因表达利用pYES2载体上的基因表达启动子GAL1及CYC1终止子。如在大肠杆菌中表达时，所述pRSFDuet1载体上插入AME1、FgTAD2、FgTAD3基因的表达框，分别为各自密码子优化后的编码区序列，并包含T7启动子和T7终止子。如在人源细胞中表达时，所述pCMV-Blank载体上插入，AME1、FgTAD2、FgTAD3基因的表达框，分别为各自编码区序列，并包含CMV启动子和SV40多聚腺苷酸信号。
本发明对重组载体的方法没有特殊限制，采用常规构建方法即可，构建得到的所述重组载体的核苷酸序列图谱优选如图2、图3、图4、图8、图10所示。
本发明还提供了一种利用上述A-to-I mRNA编辑工具进行A-to-I mRNA编辑的方法，包括以下步骤，将上述编辑酶系统或上述A-to-I mRNA编辑工具或上述重组载体转入需要A-to-I mRNA编辑的物种中。
本发明所述物种优选包括原核生物和真核生物，实施例中以酿酒酵母、大肠杆菌和人源细胞为例进行说明，但是不能仅将其认定为本发明的全部保护范围。
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种Ame1-FgTad2-FgTad3编辑酶系统、编辑工具和编辑方法进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
本发明实施例中所用的操作均为本领域中的常规实验操作：
其中PCR扩增的扩增体系为200μL：10×Taq Reaction Buffer 20μL、dNTP(2.5mM)16μL、Forward Primer(2mM)4μL、Reverse Primer(2mM)4μL(表1-3)、模板(基因组DNA或cDNA)4μL、ExTaqpolymerase(5U/μL)2μL和余量的ddH2O。
表1pYES2上重组载体构建所用引物和序列
表2pRSFDuet1上重组载体构建所用引物及序列
表3pCMV-Blank载体上重组载体构建所用引物及序列
扩增程序：94℃预变性3min；94℃变性40sec，56～58℃退火30sec，72℃延伸2min，34个循环；72℃延伸10min；16℃，forever。
DNA片段的回收，连接及克隆：将扩增后电泳分离得到的片段利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(美基生物科技有限公司，广州)进行回收，详细步骤见说明书。
回收产物与相应载体连接：连接体系及反应条件：PCR回收产物1μg、载体100ng；50℃反应15min。然后将连接产物转化大肠杆菌DH5α。经过抗性筛选，选取单克隆，送上海生工生物公司进行测序。
酵母转化：将测序正确的载体转入酵母INVSc1菌株中。采用热激转化法将构建好的酵母编辑载体与编辑报告载体共转入INVSc1酵母感受态细胞中，使用缺素培养基进行筛选，并对筛选后菌株进行菌落PCR检测确保载体共转成功。
RNA提取：RNA提取采用Promega RNA提取试剂盒(普洛麦格生物技术有限公司，北京)，详细步骤见说明书。
RNA反转录：RNA反转录采用天根一步法逆转录PCR试剂盒(天根生化科技有限公司，北京)，详细步骤见说明书。
RNA-seq测序：将转入载体后的酵母样品收集后，送至诺禾致源公司(诺禾致源科技股份有限公司，北京)进行转录组测序。
实施例1
pYES2上重组载体构建
将Ame1编码序列(见SEQ ID No.4)，FgTad2-4M编码区序列(见SEQ ID No.5)，FgTad3编码序列(见SEQ ID No.6)，Leu2(扩增自pGADT7质粒)，Trp1(扩增自pGBKT7质粒)五个片段的PCR扩增引物上加上相应载体上下游的同源序列进行引物设计(表1)。
采用常规方法，利用上述引物进行PCR扩增后，回收DNA片段。利用NcoI和ClaI酶切位点对pYES2载体进行双酶切，通过一步克隆的方式，将Leu2及Trp1扩增分别后替换Ura3基因，创建pYES2-Leu、pYES2-Trp载体。利用BamHI和NotI酶切位点，分别将Ame1、FgTad2-4M以及FgTad3，通过一步克隆的方式分别构建到pYES2、pYES2-Leu和pYES2-Trp载体。一步克隆体系如下：载体：100ng；DNA：1μg；10×反应缓冲液：2μL；/>重组酶：1μL；无菌水补足至20μL；50℃反应15min。
取10μL连接产物加入到100μL的DH5α中进行热激转化，反应步骤如下：冰浴30min；42℃热激90sec；冰浴5min；加入500μL无菌LB在37℃培养箱中进行摇培1h；离心弃上清加入无菌水将菌液重悬；重悬后的菌液涂布于90mm加入含Amp抗性的10mL LB固体平板上；37℃培养10～12h；长出的单菌落进行PCR检测并送上海生工进行测序，最终成功构建载体如图2、3、4。
将上述采用同源重组方式构建于pYES2-Ame1、pYES2-Leu-4M-FgTad2和pYES2-Trp-FgTad3载体质粒作为酵母编辑载体。采用热激转化法将构建好的酵母编辑载体转入INVSc1酵母感受态细胞中。挑取转化成功的单菌落于10mL 2％葡萄糖SD-Ura-Leu-Trp液体培养基30℃摇培24h，离心弃上清培养基，加入10mL 2％半乳糖SD-Ura-Leu-Trp液体培养基30℃摇培12h，离心收集菌体作为样品，提取其gDNA和RNA，对RNA进行反转录获得cDNA，由于AME1及FgTAD3上本身具有编辑位点，以cDNA和gDNA为模板扩增编辑底物，通过桑格测序以gDNA测序结果为对照确定编辑底物在RNA水平上发生编辑(图5)。对桑格测序鉴定存在编辑的酵母菌株，进行RNA-seq和DNA-seq高通量测序，通过生物信息学分析鉴定在酵母转录组中发生的RNA编辑事件(图6中左图)，在酵母中鉴定到1144个编辑位点，且分析发现编辑底物序列偏好性与禾谷镰孢中一致(图7)，说明禾谷镰孢中mRNA编辑复合体发挥了mRNA编辑的功能。
实施例2
pRSFDuet1上重组载体构建
将Ame1易于在大肠杆菌中表达的优化后编码序列(见SEQ ID No.7)，FgTad2-4M优化后编码区序列(见SEQ ID No.8)，FgTad3优化后编码序列见(SEQ ID No.9)3个片段的PCR扩增引物上加其上游或下游片段的同源序列进行引物设计(表2)；
采用常规方法，利用上述引物进行PCR扩增后，回收DNA片段，分别使用BamHI及EcoRI双酶切pRSFDuet1质粒载体使其线性化，通过一步克隆的方式，将扩增后Ame1片段与酶切后载体进行连接，通过KpnI及XhoI将连接Ame1编码序列后的载体进行双酶切，通过一步克隆的方式将FgTad3编码序列片段与酶切载体连接，同理，通过BglII及EcoRV将连接好的载体进行双酶切，并与进行FgTad2-4M编码区序列连接。连接体系及反应步骤见实施例1。其中pRSFDuet1质粒包括T7启动子(核苷酸序列见SEQ ID No.40)、lac操纵子(核苷酸序列见SEQ ID No.41)和T7终止子(核苷酸序列见SEQ ID No.42)；
取10μL连接产物加入到100μL的DH5α中进行热激转化，反应步骤见实施例1，长出的单菌落进行PCR检测并送上海生工进行测序，最终成功构建载体如图8。
将上述采用同源重组方式将AME1、FgTAD2及FgTAD3的CDS区回收的片段共同构建于pRSFDuet1质粒作为大肠杆菌编辑载体。采用热激转化法将构建好的大肠杆菌编辑载体转入BL21酵母感受态细胞中。摇培转化成功的大肠杆菌菌落，提取其gDNA和RNA，对RNA进行反转录获得cDNA，由于FgTAD3上本身具有编辑位点，以cDNA和gDNA为模板扩增编辑底物，通过桑格测序以gDNA测序结果为对照确定编辑底物在RNA水平上发生编辑(图9)。对桑格测序鉴定存在编辑的大肠杆菌，进行RNA-seq和DNA-seq高通量测序，通过生物信息学分析鉴定在大肠杆菌中发生的RNA编辑事件(图6中右图)，在大肠杆菌中鉴定到1241个编辑位点，且分析发现编辑底物序列偏好性与禾谷镰孢中一致(图7)，说明禾谷镰孢中mRNA编辑复合体发挥了mRNA编辑的功能。
实施例3
pCMV-Blank载体上重组载体构建
将Ame1编码序列，CMV增强子及启动子序列(SEQ ID No.43)，SV40 ployA signal序列(SEQ ID No.44)，FgTad2-4M编码区序列(见SEQ ID No.5)，FgTad3编码序列5个片段的PCR扩增引物加其上游或下游片段的同源序列进行引物设计(表3)；
回收DNA片段后，按上述顺序将片段通过PCR扩增的方式在体外进行片段重叠。
将PCR重叠扩增后的DNA产物进行回收，并用HindIII酶切pCMV-Blank质粒载体使其线性化，通过一步克隆的方式，将重叠后的片段与酶切后载体进行连接，连接产物加入DH5α中进行转化，连接、转化方法及反应体系见实施例1，长出的单菌落进行PCR检测并送上海生工进行测序，最终成功构建载体如图10。
将7×105个胰腺癌细胞株PACN1铺板于60mm细胞培养皿，37℃培养24h后，使用上述构建成功的pCMV-Blank质粒对细胞进行转染，轻轻摇匀转染试剂(擎科生物TSnanofect转染试剂)，取5μL转染试剂与120μL RNase-free水混合至125μL(此过程在冰上操作)，另取125μL水稀释5μg构建成功的pCMV-Blank质粒，轻轻混匀。再将稀释后的125μL质粒与125μL转染试剂稀释溶液混合，总体积为250μL，轻轻混匀，室温孵育15min后将250μL转染液加入细胞培养皿，轻轻混匀，37℃培养48h后提取其RNA，对RNA进行反转录获得cDNA，由于AME1和FgTAD3本身具有编辑位点，以cDNA为模板扩增编辑底物，并以单转AME1或FgTAD2和FgTAD3的cDNA模板为阴性对照，通过桑格测序结果确定编辑底物在RNA水平上发生编辑(图11)。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (10)
1.一种Ame1-FgTad2-FgTad3编辑酶系统，其特征在于，所述Ame1的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示，所述FgTad2的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，所述FgTad3的氨基酸序列如SEQ IDNo.3所示。
2.根据权利要求1所述编辑酶系统，其特征在于，编码所述Ame1的核苷酸序列如SEQIDNo.4所示，编码所述FgTad2的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，编码所述FgTad3的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。
3.权利要求1或2所述编辑酶系统在作为A-to-I mRNA编辑工具中的应用。
4.一种A-to-I mRNA编辑工具，其特征在于，包括权利要求1或2所述编辑酶系统。
5.一种包含权利要求1或2所述编辑酶系统的编码基因的重组载体。
6.根据权利要求5所述重组载体，其特征在于，当所述编辑酶系统在酵母中表达时，以pYES2载体为基础载体；
当所述编辑酶系统在大肠杆菌中表达时，以pRSFDuet1为基础载体；
当所述编辑酶系统在人源细胞中表达时，以pCMV-Blank为基础载体。
7.权利要求5或6所述重组载体的构建方法，其特征在于，在基础载体上插入AME1基因表达框、FgTAD2基因表达框和FgTAD3基因表达框。
8.一种利用权利要求4所述A-to-I mRNA编辑工具进行A-to-I mRNA编辑的方法，其特征在于，包括以下步骤，将权利要求1或2所述编辑酶系统或权利要求4所述A-to-I mRNA编辑工具或权利要求6所述重组载体转入需要A-to-I mRNA编辑的物种中。
9.根据权利要求8所述方法，其特征在于，所述物种包括原核生物和真核生物。
10.根据权利要求8或9所述方法，其特征在于，所述物种包括酿酒酵母、大肠杆菌和人源细胞。
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