CN112980760B

CN112980760B - 一种用于生产麦角硫因的基因工程菌株及其构建方法以及应用

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Publication number: CN112980760B
Application number: CN202110251782.6A
Authority: CN
Inventors: 王风清; 谢智勇; 魏东芝; 克洁; 陶欣艺; 赵明; 熊亮斌
Original assignee: Baikaisheng Shanghai Biotechnology Co ltd
Current assignee: Baikaisheng Shanghai Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-03-08
Filing date: 2021-03-08
Publication date: 2023-09-29
Anticipated expiration: 2041-03-08
Also published as: CN112980760A

Abstract

本发明公开一种用于生产麦角硫因的基因工程菌株及其构建方法以及应用。所述基因工程菌株的构建包括以下步骤：A：将自杀质粒p19‑Mn_hal电转化导入Mn‑egtABCDE‑hisG菌株感受态，利用同源臂引物进行PCR扩增筛选，获得MnΔhal‑egtABCDE‑hisG菌株；B：将整合型质粒pMV306‑Mn_hisC‑Mn_allB1电转化导入MnΔhal‑egtABCDE‑hisG感受态，平板筛选，验证，即得。本发明通过对自身可产生麦角硫因的新金色分枝杆菌进行代谢工程改造，构建的基因工程菌株生产麦角硫因的能力相对野生型菌株提高18倍，相对出发菌株提高4.1倍，具有良好的应用前景。

Description

一种用于生产麦角硫因的基因工程菌株及其构建方法以及应用

技术领域

本发明涉及生物合成应用领域，具体涉及一种用于生产麦角硫因的基因工程菌株及其构建方法以及应用。

技术背景

麦角硫因(Ergothioneine，EGT)，又名巯基组氨酸甜菜碱(Thiolhistidine-betaine)，学名2-巯基组氨酸三甲基内盐，是已知唯一的天然2-硫代咪唑氨基酸。EGT可由蕈类真菌、粗糙脉孢菌及蓝细菌等生物合成，但尚未发现任何动物或植物具有合成EGT的能力。EGT具有细胞氧化还原，信号转导及生物能量稳态的功能，被认为是延长健康、延缓衰老的重要因素，适当补充可显著降低罹患中老年慢性疾病和早衰的风险。异养型的人体主要依赖从日饮食中摄取麦角硫因，由转运蛋白基因SLC22A4编码合成的OCTN1蛋白介导了人体细胞对EGT的摄取。

EGT主要可经化学合成、食用真菌或菌丝体深层发酵提取法获取。然而，化学合成法收率低、污染重、成本高，食用真菌的发酵产量低，生产成本也较高，这在一定程度上限制了EGT的推广应用。在众多食用菌中，美味牛肝菌(Boletus edulis)的产量相对较高，每克干重含量约为7.27mg(Kalaras MD,Richie JP,Calcagnotto A,et al.Mushrooms:A richsource of the antioxidants ergothioneine and glutathione.Food Chemistry,2017,233,429–433.)。由于粗糙脉孢菌(Hu W,Song H,Her AS,et al.Bioinformatic andbiochemical characterizations of C-S bond formation and cleavage enzymes inthe fungus Neurospora crassa ergothioneine biosynthetic pathway.OrganicLetters,2014,16(20):5382-5385.)、蓝细菌(Pfeiffer C,Bauer T,Surek B,etal.Cyanobacteria produce high levels of ergothioneine.Food Chemistry,2011,129(4):1766–1769.)、耻垢分枝杆菌(Seebeck FP.In vitro reconstitution ofMycobacterial ergothioneine biosynthesis.Journal of the American ChemicalSociety,2010,132(19):6632-6633.)等微生物均具有合成EGT的能力，因此，利用遗传改造来开发高产EGT的基因工程菌株，是一个具有良好应用前景的技术方向。

EGT的天然合成途径大致可分为两类，一种由EgtABCDE基因簇编码的EgtD，EgtB，EgtA，EgtC和EgtE等5个酶催化的合成途径；另一种是仅需Egt1，Egt2两个酶催化的连续合成途径。通过基因强化参与EGT合成的关键基因表达，可获得生产能力显著提升的EGT工程菌株。利用模式微生物高密度发酵，异源表达EGT合成所需的关键酶基因，可获得具有异源生产EGT能力的基因工程菌株。通过在米曲霉(Aspergillus oryzae)中强化表达粗糙脉孢菌来源的egt1和egt2基因，米曲霉宿主的EGT产量被提升至231mg/L的水平(Takusagawa S,Satoh Y,Ohtsu I,et al.Ergothioneine production with Aspergillusoryzae.Bioence,Biotechnology,and Biochemistry,2018,83(1):1-4.)。利用酿酒酵母，通过异源表达麦角菌(Claviceps purpurea)、耻垢分枝杆菌等多个来源的EGT合成酶基因，在1L生物反应器流加分批发酵的条件下，经84h培养获得了0.598g/L的麦角硫因产量(HoekSAVD,Darbani B,Zugaj KE,et al.Engineering the yeast Saccharomyces cerevisiaefor the production of L-(+)-ergothioneine.Frontiers in Bioengineering andBiotechnology,2019,7:262.)。截止目前，文献报道的EGT最高产量是利用耻垢分枝杆菌来源的egtABCDE基因簇，在大肠杆菌中异源表达，同时，通过流加EGT合成的三种氨基酸前体(L-半胱氨酸，L-组氨酸，L-甲硫氨酸)，优化发酵条件，经过216h的发酵，在3L的发酵罐培养条件下获得1.31g/L的麦角硫因产量(Tanaka N,Kawano Y,Satoh Y,et al.Gram-scalefermentative production of ergothioneine driven by overproduction of cysteinein Escherichia coli.Scientific Reports,2019,9(1):1895.)。最近，上述研究组利用甲基杆菌属来源的egtB基因，替换导入大肠杆菌工程菌株，虽然在摇瓶水平获得了0.657g/L的EGT产量，但遗憾的是，该研究却遭遇了重大挫折，在上罐放大测试中，工程菌出现了明显的生长抑制和提前死亡现象，产量并没有出现明显提升(Kamide T,Takusagawa S,TanakaN,et al.High production of ergothioneine in Escherichia coli using thesulfoxide synthase from Methylobacterium strains.Journal of Agricultural andFood Chemistry,2020,68(23):6390–16394.)。上述工作提示利用异源宿主合成EGT，由于菌株本身并不生产EGT，以及过多外源基因的引入等原因，工程菌株难以承受高浓度的产物浓度而出现生长抑制和裂解死亡，从而使得发酵放大难以实现。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于生产麦角硫因的基因工程菌株及其构建方法以及应用，从而解决现有技术缺乏高产麦角硫因的基因工程菌的问题。

为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

根据本发明的第一方面，提供一种用于生产麦角硫因的基因工程菌株的构建方法，所述基因工程菌株通过对自身可产生麦角硫因的新金色分枝杆菌进行代谢工程改造而成，包括过表达egtABCDE基因簇，敲除菌株内源的Mn_hal基因，以及共表达Mn_hisC和Mn_allB1基因，所述基因工程菌株的构建方法包括以下步骤：A：将自杀质粒p19-Mn_hal电转化导入Mn-egtABCDE-hisG菌株感受态，涂布卡那霉素和潮霉素双抗性平板长出单克隆，利用同源臂引物D-Mn_hal-UF&D-Mn_hal-DR进行PCR扩增筛选，选择条带大小为1996bp的单克隆菌株，即为MnΔhal-egtABCDE-hisG菌株；以及B：将整合型质粒pMV306-Mn_hisC-Mn_allB1电转化导入MnΔhal-egtABCDE-hisG感受态，涂布卡那霉素和潮霉素双抗性平板长出单克隆，利用E-Mn_hisC-Mn_allB1-F&E-Mn_hisC-Mn_allB1-R进行PCR扩增验证，如能扩增出1000bp左右的阳性条带，所对应的菌株为MnΔhal-attB::(hisC-allB1)-egtABCDE-hisG菌株，即为一种可用于生产麦角硫因的基因工程菌株。

所述自杀质粒p19-Mn_hal的构建包括以下步骤：A1：以新金色分枝杆菌基因组为模板，利用同源臂引物D-Mn_hal-UF&D-Mn_hal-UR，D-Mn_hal-DF&D-Mn_hal-DR分别扩增上、下游同源臂序列，获得上、下游同源臂纯化产物；A2：p2NIL质粒提取物采用HindIII和BamHI进行酶切，上游同源臂纯化产物利用HindIII和EcoRI进行酶切，下游同源臂利用EcoRI和BamHI进行酶切，T4酶连接，获得重组质粒p2NIL-Mn_hal；A3：将pGOAL19质粒产物、重组质粒p2NIL-Mn_hal分别用PacI酶切，T4酶连接，转入大肠杆菌DH5α感受态，扩大培养、抽提获得自杀质粒p19-Mn_hal的纯化产物，电转，涂布蔗糖致死平板，筛选正确的双交换突变菌株，即可获得自杀质粒p19-Mn_hal。

Mn_hal基因的核苷酸序列如SEQ ID No:1所示。

所述同源臂引物D-Mn_hal-UF&D-Mn_hal-UR，D-Mn_hal-DF&D-Mn_hal-DR的核苷酸序列如SEQ ID No:2-5所示。

所述整合型质粒pMV306-Mn_hisC-Mn_allB1的构建包括以下步骤：B1：Mn_hisC基因拷贝数增加菌株的构建：1)以新金色分枝杆菌基因组为模板，利用引物E-Mn_hisC-F&E-Mn_hisC-R扩增获得Mn_hisC的基因序列；2)将pMV261质粒产物、Mn_hisC的基因序列，用BamHI&EcoRI酶切纯化回收，T4酶连接，转化大肠杆菌DH5α感受态，获得重组质粒pMV261-Mn_hisC；B2：Mn_hisC-Mn_allB1共强化菌株的构建：1)以新金色分枝杆菌基因组为模板，利用引物E-Mn_hisC-Mn_allB1-F&E-Mn_hisC-Mn_allB1-R扩增获得Mn_allB1的基因序列片段；2)重组质粒pMV261-Mn_hisC质粒采用HpaI酶切，纯化回收得到质粒骨架，与Mn_allB1的基因序列片段进行无缝克隆连接，获得重组质粒连接产物pMV261-hisC-allB1；3)将连接产物pMV261-hisC-allB1转化大肠杆菌DH5α，涂布卡那霉素抗性平板进行克隆筛选，经菌落PCR、质粒酶切和质粒测序验证，即可获得重组质粒pMV261-Mn_hisC-Mn_allB1；4)利用XbaI&HpaI酶切重组质粒pMV261-Mn_hisC-Mn_allB1，将pMV306的质粒产物，采用XbaI&HpaI进行酶切，T4连接酶连接，随后转化大肠杆菌DH5α感受态，使用潮霉素抗性平板筛选单克隆，获得所述整合型质粒pMV306-Mn_hisC-Mn_allB1。

Mn_hisC基因的核苷酸序列如SEQ ID No:6所示，Mn_allB1基因的核苷酸序列如SEQ ID No:7所示。

引物E-Mn_hisC-F&E-Mn_hisC-R的核苷酸序列分别如SEQ ID No:8和SEQ ID No:9所示，引物E-Mn_hisC-Mn_allB1-F&E-Mn_hisC-Mn_allB1-R的核苷酸序列分别如SEQ IDNo:10和SEQ ID No:11所示。

新金色分枝杆菌的保藏号为ATCC 25795。

根据本发明的第二方面，提供一种用于生产麦角硫因的基因工程菌株，由上述构建方法构建得到。

根据本发明的第三方面，还提供一种麦角硫因的制备方法，包括以下步骤：将根据上述构建方法构建得到的基因工程菌株，接种于培养基中培养，即得。

发明人通过研究发现，新金分枝杆菌在过量合成EGT的情况下，会进一步分解EGT，表明该菌株可自激活EGT分解途径，调控EGT在胞内的生理水平。由于该降解系统的存在，将导致EGT无法高水平积累，极度限制了工程菌的开发。通过对新金分枝杆菌基因组内疑似参与EGT降解的基因进行分析筛选，发现一个命名为Hal的基因，失活该基因可明显阻止EGT的分解，从而有效保障EGT的高水平积累。同时，通过转录组差异比对发现，在EGT产量较高的Mn-egtABCDE-hisG菌株中，组氨醇磷酸氨基转移酶HisC的转录水平相对出发菌株Mn提高了近2.2倍。由于HisC是合成EGT所需组氨酸前体供应途径的重要催化酶之一，可间接关联到目标产物EGT的合成，因此，通过增加hisC的拷贝数，很可能将提升EGT的产量。此外，我们发现allB1的转录水平相对提高了10.5倍。因此，本发明首次创造性地通过联合操作hal，hisC以及allB1基因，构建出了一株新金色分枝杆菌的基因工程菌株，该基因工程菌株可稳定几乎无降解的合成EGT，产量相对野生型菌株出现大幅度增加。

根据本发明所提供的构建方法中，涉及一种用于敲除Mn_hal基因的重组自杀质粒p19-Mn_hal，其包含pGOAL19的质粒骨架，以及Mn_hal基因上下游同源臂序列。该自杀质粒的构建方法及pGOAL19质粒骨架的获取，在文献(Xiong LB,Liu HH,Xu LQ,etal.Improving the production of 22-hydroxy-23,24-bisnorchol-4-ene-3-one fromsterols in Mycobacterium neoaurum by increasing cell permeability andmodifying multiple genes.Microbial Cell Factories,2017,16(1):89.)中有详细描述。

根据本发明所提供的构建方法中，还涉及一种用于构建Mn_hisC、Mn_allB1基因组整合表达的重组质粒pMV306-Mn_hisC-Mn_allB1，其主要由热休克蛋白启动子hsp60，Mn_hisC，Mn_allB1基因编码区，以及潮霉素抗性基因等组成。该重组质粒的骨架来源于pMV261和pMV306质粒，获取方式及重组质粒的构建方法在上段所述文献中也有详细描述。

本发明通过对自身可产生麦角硫因(EGT)的新金色分枝杆菌(Mycobacteriumneoaurum)进行代谢工程改造，构建EGT生产能力得到显著增强的基因工程菌。

根据本发明提供的一种用于生产麦角硫因的基因工程菌株，该菌株内源具有egtABCDE组成的麦角硫因合成基因簇，通过基因敲除可降解麦角硫因前体的基因Mn_hal，以及共表达菌株内源的Mn_hisC和Mn_allB1基因，使麦角硫因菌株的生产能力相对野生型菌株提高18倍，相对出发菌株提高4.1倍，工程菌株在发酵罐放大过程中生长良好，显示出进一步的改造和开发应用前景。

综上所述，本发明通过基因工程和代谢工程技术，通过挖掘菌株自身与麦角硫因合成相关的内源基因，对一株天然可产EGT的新金色分枝杆菌进行遗传改造，以增强其生产EGT的能力，经发酵罐放大测试，其麦角硫因总产量可达580mg/L，具有良好的进一步改造和应用前景。

附图说明

图1是Mn_hal基因敲除上下游同源臂的扩增结果；

图2是Mn_hal基因缺失菌株MnΔhal的PCR验证结果；

图3是构建成功的pMV261-Mn_hisC质粒的PCR验证结果；

图4是构建成功的MnΔhal-attB::(hisC-allB1)-egtABCDE-hisG菌株PCR验证结果。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步的描述，但本发明的实施方式不限于此。

下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均为从商业途径得到的试剂和材料。

本文中涉及的溶液制备方法如下：

LB培养基：5g/L酵母提取物，10g/L胰蛋白胨，10g/L氯化钠(LB固体培养基，需额外添加20g/L琼脂粉)。

发酵培养基：20.0g/L甘油，2.0g/L柠檬酸，2.0g/L硝酸铵，0.5g/L七水硫酸镁，0.5g/L磷酸氢二钾，0.05g/L柠檬酸铁胺，pH 7.5。

麦角硫因的检测方法：

麦角硫因的标准品，购自上海麦克林生化科技有限公司。

麦角硫因标准品溶液配制：称取10mg麦角硫因标准品，溶于70％乙腈-水溶液，定容于10mL容量瓶，标准品母液浓度为1mg/mL。

胞外产物检测：取发酵液样品，12000rpm离心10min，取上清，用0.22μm聚丙烯离心管过滤，滤液用于薄层色谱或高效液相色谱分析。

胞内产物检测：取发酵液样品，12000rpm离心2min收集菌体，将细胞在等体积的1×PBS缓冲液洗涤两次，重悬于70％乙腈-水溶液，加入0.1mm硅胶珠，7000rpm，破碎细胞5min，随后在-20℃静置2min(重复2次)，12000rpm离心10min；取上清，用0.22μm聚丙烯离心管过滤，滤液用于薄层色谱或高效液相色谱分析。

薄层色谱法：取20μL提取物点样于薄层层析硅胶板，以甲醇：水＝3:1(v/v)为展开剂。层析完成后，风干表面液体，喷洒0.2％的Gibb’s试剂，对比观察标准品及产物提取液的显色情况。

高效液相色谱法：如需准确测定麦角硫因的含量，则需借助HPLC法。检测条件：Agilent1100型色谱仪，色谱柱采用ZORBAX Eclipse×DB C18柱(250mm×4.6mm,5μm)；柱温30℃，流动相为乙腈：水＝3:97(v/v)；流速0.6mL/min；检测波长254nm；进样量10μL。每个样品运行10min以确保全部样品全部通过检测器。

新金色分枝杆菌的原始菌株Mycobacterium neoaurum购买于美国模式培养物集存库(American type culture collection，ATCC)，保藏号：ATCC 25795。对新金色分枝杆菌的基因工程改造，包括过表达Mn_egtABCDE基因簇和组氨酸合成的限速酶基因Mn_hisG，所获得的Mn-egtABCDE-hisG菌株，摇瓶发酵产量约为79.3mg/L，该菌株的制备方法记载于文献(王丽.麦角硫因高产微生物细胞工厂的创建.华东理工大学硕士论文，2019.)。以此菌株为下述实施例中进行麦角硫因生产能力强化构建的出发菌株，利用遗传操作工具，分别删除可能参与麦角硫因降解的Mn_hal基因，强化Mn_hisC和Mn_allB1基因的表达，所构建的基因工程菌株，其麦角硫因生产能力得到明显增强。

实施例1：构建Mn_hal基因缺失的菌株

我们研究发现，新金分枝杆菌在过量合成EGT的情况下，会进一步分解EGT，表明该菌存在EGT分解途径，以调控EGT在细胞内的生理水平，该降解系统的存在使EGT无法高水平积累，限制了工程菌的开发。因此，我们对新金分枝杆菌内疑似基因进行了分析筛选，发现一个命名为Hal的基因，使其失活，可明显阻止EGT的分解代谢，可有效保障EGT的高水平积累。Hal是一种组氨酸氨裂解酶，也称组氨酸酶和组氨酸脱氨酶可以催化组氨酸脱氨生成尿刊酸，今人惊讶的是Hal的一些同功酶，并不具有Hal的功能，其同功酶失活后，并不能阻止EGT的降解，说明Hal在分枝杆菌中是一种特殊的EGT分解酶。

新金色分枝杆菌中的Hal基因，命名为Mn_hal，其基因序列已上传NCBI数据库，GeneBankaccession number:NZ_JMDW01000003.1；Region:300862…302385，具体序列如下(SEQ ID No.1)：

ATGACAGAAACTCGTAGTATCTCGCTGGACTTCTATCGCCTCGACGATATCGCCGATATCGTCGACAACGCACAGGAACTCACTCTCGACGGCGAGGTGCAGGAGTGCATCGGCCGCGGTGCGGATTACATTGCCAGCATCGCGGGCGAGGACCGCCACATCTACGGGATCAACACCGGATTCGGCTCGCTGTGCGTGCGGCGCATCGAGGAACACGAGCAGTCCGAACTGCAGCACCGCCACCTGCTGTCGCATGCCTGCGGGGTGGGAGAGCCGATGCCCGCGCGGATCAGCCGGATCACCACGGTCATCAAGCTGCTCACCTTCCGCAGCGGCTACTGCGGTATCACGCCGAACACCGTCAACCGCATGCTCGACTTCTGGGGCCGCGGCATCGTGCCGGCCATCCCCAAGAAGGGAACCGTCGGTGCCAGTGGCGATCTCGCGCCGTTGGCGCATCTGGCCCTGCCGCTGATCGGCGAAGGGAAGGTCTACTACCGGGGCGAACTCGTCGACGCCGCCACGATGCTAGCGGGCGAGGGCTTCGAGCCGCTGCGGCTGCGCCCCAAGGAGGGGCTGGCGCTGACCAATGGCGTGCAGTACATCAACGCGATCGCCGTCGACTGCCTGCTGCGTGCCCGCACCCTGATCCGGTTCGCAGATCTTGTGACGGCGTTGAGCATTCAGGGCTTCAGCACCGCCAAGAGCTTCTACCAACCGCTGCTGGAGAAGACCTGGCGGCACCCCGAGCGCGTCACGGTCGCCAAGAACCTCGAGACATTGCTGGAGGGCAGCAACCACCACGAGCTGCCACAGTGCAATATCGCCCACGAAGATCCGTACTCGTATCGCTGTGTGCCGCAGGTGCATGCCGCGGCGCGTCAGGCGATCAACTTCGCCACCCAGATCATCGAGCAGGAATGCAACACCGTCTCGGACAATCCGGTCTTCTTCTACGAGGAGGGCACCGAACTGTGCGCGGGTAACCTGCACGGCGCCTCGTCGGCGATGGTGATGGACCTGCTGGCGATCGCGTTGACGGATCTGTCGAGCATCTCCGAACGCCGCACCTACCAACTGCTCTCCGGCCAGCACGGCCTGCCGGACTATCTGGTGGCCAAGCCCGGCCTGGATTCCGGGCTGATGATCCCGCAGTACACCTCGGCCGCCCTGGTCAACGAGAACAAGGTGCTCTCGGCCCCGGCCAGTGTCGACACCATCGCCACCTGCCAGCTGCAGGAGGACCATGTGAGCATGGGCGGGACGTCGGCCTACAAGCTGATGCAGGTCATCGACAACCTGACCTACATTCTGGGTATCGAGTTGCTGACCGCCGCGCAGGCCATCGACCTGAACGAGGGGCTGCGGCTCTCACCGGAGACGGCGAAGCTGTTCAACGAGTTCCGCTCCGAGGTGAGCCATCTGGACCAGGACCGCTACCAGCACCCCGATATCGAGAAGGCGCGGCAGTTCGTCGAGCAGCGCGCGCGGCGGTGGTGTGACGAGCTGGCGGTGCAGTGA

设计基因敲除同源臂引物序列如下(SEQ ID No:2-5)：

D-Mn_hal-UF：CCCAAGCTTGTCGATGATCGACAACCTGTCCGGC

D-Mn_hal-UR：GGAATTCGGTGTTGATCCCGTAGATGTGGCGG

D-Mn_hal-DF：GGAATTCGCCATCGACCTGAACGAGGGGCTGC

D-Mn_hal-DR：CGGGATCCAAGAGTCGAAGTAGGTCTTATCCCAGAAGGGGAC

引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，以无菌水溶解稀释至10μM使用，PCR扩增所用的高保真酶为Takara PrimerSTAR Max DNA。

上下游同源臂扩增：以新金色分枝杆菌基因组为模板，利用同源臂引物D-Mn_hal-UF&D-Mn_hal-UR，D-Mn_hal-DF&D-Mn_hal-DR分别扩增上下游同源臂序列，PCR扩增体系为：

PCR扩增条件：98℃预变性5min；98℃变性10s，(Tm-5)℃退火8s，72℃延伸1kb/min，反应30个循坏；72℃延伸5min。同源臂上游片段长度为1000bp，同源臂下游片段长度为996bp。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测条带单一，采用产物纯化试剂盒纯化回收，4℃保存备用。

p2NIL质粒及上下游同源臂酶切

取备用的p2NIL质粒(购自Addgene公司(www.addgene.org/20188/)编号：#20188)提取物和Mn_hal基因上下游同源臂纯化产物，p2NIL质粒提取物采用HindIII和BamHI进行酶切，上游同源臂利用HindIII和EcoRI进行酶切，下游同源臂利用EcoRI和BamHI进行酶切。内切酶均购自ThermoFisher Scientific公司，酶切体系及反应条件为：

酶切反应条件：37℃，金属浴或水浴孵育1小时。酶切产物经纯化回收，-20℃保存备用。

T4酶连接：使用购买自ThermoFisher Scientific公司的T4连接酶体系，即连接酶，1μL；10×buffer，2μL；质粒载体和基因片段1：5比例，添加到T4连接酶体系，22℃孵育连接2h。随后，将连接产物转化大肠杆菌DH5α，使用卡那霉素(50μg/mL)抗性平板筛选，经菌落PCR扩增、测序验证后，获得重组质粒p2NIL-Mn_hal。

p19-Mn_hal质粒的构建及电转化感受态：将pGOAL19质粒(购自Addgene公司(www.addgene.org/20190/)编号：#20190)产物、重组质粒p2NIL-Mn_hal分别用PacI酶切。pGOAL19质粒酶切产物回收长度为9000bp的片段，重组质粒p2NIL-Mn_hal酶切后直接纯化。将上述两个片段利用T4连接酶连接，转入大肠杆菌DH5α感受态，经菌落PCR扩增、测序验证，获得携带重组质粒p19-Mn_hal的大肠杆菌DH5α转化菌株，扩大培养、抽提获得自杀质粒p19-Mn_hal的纯化产物，经碱处理后，转移至分枝杆菌感受态细胞进行电转化(2.5kV，200欧姆，25μF，0.2cm电转化杯，电击时间5-6ms，电击两次)，孵育后的菌液，5000×g离心2min，弃上清保留100μL涂布抗性筛选平板。

待培养基长出蓝色菌落，挑菌转接LB培养基扩增，涂布蔗糖致死平板(2％蔗糖，200μL X-Gal(20mg/mL)及20μL IPTG(50mg/mL))，筛选正确的双交换突变菌株：

1)将蓝色菌落转接含50μg/mL卡那霉素、50μg/mL潮霉素的5mL液体LB试管，30℃振荡培养24-48h。

2)准备筛选平板：LB固体培养基，2％蔗糖，200μL X-Gal(20mg/mL)及20μL IPTG(50mg/mL)。

3)当菌液培养至OD＝1.5左右时，取50-100μL，涂布至上述平板。37℃倒置培养3-5d。

4)完成双交换基因删除的菌种不含筛选标记。待菌株长好后，挑取黄色单克隆，进行菌落PCR验证。

5)双交换验证引物为D-Mn_hal-UF和D-Mn_hal-DR，如能扩增出2000bp左右的单条带，此即为删除目标基因Mn_hal的正确转化子。

6)验证正确的单克隆，转接到5mL液体LB试管，30℃，220rpm振荡培养2天，保菌备用。

实施例2：Mn_hisC基因拷贝数增加菌株的构建

我们通过对比Mn-egtABCDE-hisG与Mn菌株的转录组差异发现，在EGT产量较高的Mn-egtABCDE-hisG菌株中，组氨醇磷酸氨基转移酶的编码基因hisC转录水平相对出发菌株Mn提高了近2.2倍。由于HisC是合成EGT所需的组氨酸前体合成途径的催化酶之一，因此，我们认为通过增加hisC的拷贝数，很可能将明显提升EGT的产量。

新金色分枝杆菌Mn_hisC基因序列，已上传NCBI数据库，GeneBankaccessionnumber:NZ_JMDW01000010.1；Region:275183…274053，具体序列如下(SEQ ID No:6)：

GTGAGTGCGGCCAAGATCACCCTCGACGACCTGCCGTTGCGCGACAGCCTGCGCGGCAAATCCCCCTACGGCGCACCACAACTGGCGGTGCCGGTGCGGCTGAACACCAACGAGAACCCGCATCCGCCGACCCAGGCGCTCGTCGACGATGTCGCCGAGTCCGTGCGTGATGCGGCTGCCGAACTGCACCGCTACCCCGATCGCGACGCGGTGGCCCTGCGCACCGATCTGGCGGAGTACCTGCGCACCCAGACCGGCGTCGAGGTCGGCGTCGACAACGTCTGGGCGGCAAATGGTTCGAATGAGATCCTGCAGCAGTTGCTGCAGGCGTTCGGCGGTCCTGGCCGGCGCGCCATCGGTTTCGTGCCGTCCTATTCCATGCACCCCATCATCTCCGACGGCACGCAGACCCAGTGGCTGGAGGCGGCCCGCGCCGAGGACTTCGGCCTGGACACCGACCGTGCCGTCGCGGCGATCACCGAGCACCGGCCCGATGTGGTGTTCTTGGCCAGCCCGAACAATCCCTCGGGTCAGAGCGTCACACCGGACGAGCTGCGCCGGGTGCTCGACGCCGCGCCGGGTGTGGTCATAGTCGACGAGGCATATGGCGAATTCTCTTCCCAGCCCAGCGCCGTCGGGCTGATCGCGGACCATCCGGCCAAGCTCATCGTCACCCGCACCATGAGCAAGGCGTTCGCCTTCGCCGGCGGCCGGCTGGGTTACCTGATCGCCGATCCCGCTGTGATCGACGCGATCCTGTTGGTCCGGCTGCCGTATCACCTGTCCGCGCTGACGCAGGCCGGAGCGCGCGCGGCGCTGCGTCATGCCGACGAAACCCTGGGCAGTGTGCAGACACTGATCGCCGAGCGCGGCCGGATCGCGTCGGCGTTGACGGACATGGGGTATCGCGTCATCCCCAGTGACGCCAACTTCGTGCTCTTCGGCGGCTTCGCCGATGCCCCGGCCGTCTGGCAGCGCTATCTCGATGCCGGCGTGCTGATCCGCGATGTCGGCGTGCCCGGCCACCTGCGGACCACCGTCGGCCTCGCCGAAGAGAACGATGTCTTCCTCGATGTGAGTGCCACGATCGCCGAATCCGGCGTCCTAACGCAGAACCAAGGAGTCTCATGA

设计引物序列如下(SEQ ID No:8-9)：

E-Mn_hisC-F：cgggatccGTGAGTGCGGCCAAGATCACC

E-Mn_hisC-R：cccaagcttTCATGAGACTCCTTGGTTCTGCGTT

基因表达框扩增：以新金色分枝杆菌基因组为模板，利用引物E-Mn_hisC-F&E-Mn_hisC-R扩增序列Mn_hisC的基因序列，PCR扩增体系配制、扩增条件、PCR产物纯化条件同实施例1。

pMV261-Mn_hisC质粒的构建：

将pMV261质粒产物，基因表达框扩增产物，用BamHI&EcoRI酶切纯化回收，将两个片段通过连接酶连接转化大肠杆菌DH5α感受态，涂布、菌落PCR扩增、测序验证，获得携带重组质粒的转化菌株。

实施例3：Mn_hisC-Mn_allB1共表达菌株的构建

我们在对比Mn-egtABCDE-hisG与Mn菌株的转录组差异时，发现在EGT产量较高的Mn-egtABCDE-hisG菌株中，allB1的转录水平相对提高了10.5倍。由此，我们通过增加allB1的拷贝数，尝试提升EGT的产量。

新金色分枝杆菌Mn_allB1基因的序列如下(SEQ ID No:7)：

GTGTTGCTGCATCAGGGAATCGGACTGGACGTGTTCAACGCGTTGCCCGAACGCAAGGCCGTACACGCGCTCTACGAGTGCTGCAACAGCTATGCGCTGGCCCGCGAACTCGTCCGTGGCCGCCCTTATCCCGATCACGACGCACTGTTCCGCCGCGCCGATGCCGCGCTGTTCGAGCTGCCCGAATCCGCCGTGGATCAGATCCTGGACGCGTGCCCCGATATCGGCAGGCGACCGCGCAGCGCGAAGTCGCAGGCCGAACCCTGTGCGGTCTGGGATGACGATGCCGAATTGATGGCAGCGCTGAGCGCCGCCTCCCGGCAGTACGCGCAACGCTACGGGTTCACCTTCGTGATGTTCGTCGACGGGCACTGCGCACGCGATGTCCTTGCCGCCGTCACCGACCGGATGCACCATGACACCGAGACCGAACGCAAGATCCTGCGAAACGAACTGGCCAAGATCGGTCGCAGCAGGTTGGAACGGATGCTCGGCCCCGAGGGCGGTTACCAGAACTGGTAG

设计共表达引物序列如下(SEQ ID No:10-11)：

E-Mn_hisC-Mn_allB1-F：TTATCGATGTCGACGTAGTTgagaaggagatatactgcatcagggaatcg

E-Mn_hisC-Mn_allB1-R：CAGTCGATCGTACGCTAGTTaacctaccagttctggtaaccgc

将实施例2获得的pMV261-Mn_hisC质粒，扩大培养、提取质粒产物。纯化产物采用HpaI酶切，纯化回收得质粒骨架。利用E-Mn_hisC-Mn_allB1-F&E-Mn_hisC-Mn_allB1-R为引物，以分枝杆菌基因组为模板进行PCR扩增，所得条带经纯化回收，4℃保存备用。将PCR扩增的纯化产物，以及酶切后的质粒骨架进行无缝克隆连接，无缝克隆试剂盒购自上海翊圣生物科技有限公司，按说明书流程操作。加入的质粒载体骨架和PCR扩增片段的摩尔比为1：3，50℃反应20分钟，获得重组质粒连接产物pMV261-hisC-allB1。将连接产物转化大肠杆菌DH5α，涂布卡那霉素抗性平板(50μg/mL)进行克隆筛选，经菌落PCR、质粒酶切和质粒测序验证，即可获得重组质粒pMV261-Mn_hisC-Mn_allB1。经扩大培养，提取获得pMV261-Mn_hisC-Mn_allB1的质粒产物。利用XbaI&HpaI酶切上述质粒产物，纯化回收大小为2091bp的片段。同时，将pMV306的质粒产物，采用XbaI&HpaI进行酶切，与上述2091bp片段的纯化产物，利用T4连接酶连接，随后转化大肠杆菌DH5α感受态，使用潮霉素抗性平板筛选单克隆，经菌落PCR及测序验证，获得pMV306-Mn_hisC-Mn_allB1。

取MnΔhal-egtABCDE-hisG菌株制备感受态，随后将上述pMV306-Mn_hisC-Mn_allB1质粒产物电转化导入MnΔhal-egtABCDE-hisG菌株，获得基因型为MnΔhal::hisC::allB1-egtABCDE-hisG的工程菌株，制备步骤如下：

1)向MnΔhal-egtABCDE-hisG感受态(100μL)加入重组质粒pMV306-Mn_hisC-Mn_allB1质粒产物，混匀，冰水浴20min。

2)将上述混悬菌液，转移至4℃预冷的电极杯，用Gene Pulser Xcell电穿孔仪电击两次(2.5kV，200欧姆，25μF，0.2cm电转化杯，电击时间5-6ms)，并迅速转入冰水浴，静置3min。

3)加入700μL的LB液体培养基，充分混悬，转移1.5mL无菌离心管，30℃摇床振荡培养3-4小时，取100μL涂布于抗性(卡那霉素50μg/mL，潮霉素50μg/mL)固体平板，在30℃培养箱倒置培养3天左右。

4)挑取单菌落，溶于10μL的LB培养基，利用E-Mn_hisC-Mn_allB1-F&E-Mn_hisC-Mn_allB1-R进行PCR验证，即可获得基因型为MnΔhal-attB::(hisC-allB1)-egtABCDE-hisG的增强菌株(图4)。

实施例4：工程菌株的麦角硫因生产能力评估

取已构建完成的MnΔhal-attB::(hisC-allB1)-egtABCDE-hisG菌株，划线至LB固体平板(卡那霉素50μg/mL)，挑取单菌落转接5mL LB试管，30℃，220rpm培养3天，按10％(v/v)接种至50mL种子培养基，30℃，220rpm振荡培养2天，可得种子培养液。将种子培养液按10％(v/v)比例，转接发酵培养基。

发酵罐搅拌转速为300～800rpm，溶氧偶联，溶氧控制在40％，温度为30℃，补加氨水和前体物质，发酵168h。发酵结束后，新金色分枝杆菌的麦角硫因产量出现显著增加，与出发菌株产量对比如下表所示。

表1各菌株生产麦角硫因的产量结果对比

新金色分枝杆菌	EGT总产量mg/L
		Mycobacterium neoaurum ATCC25795(Mn)	32
Mn-egtABCDE-hisG	141
		MnΔhal-attB::(hisC-allB1)-egtABCDE-hisG	580

SEQUENCE LISTING

<110> 华东理工大学

<120> 一种用于生产麦角硫因的基因工程菌株及其构建方法以及应用

<160> 11

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1521

<212> DNA

<213> 新金色分枝杆菌

<400> 1

atgacagaaa ctcgtagtat ctcgctggac ttctatcgcc tcgacgatat cgccgatatc 60

gtcgacaacg cacaggaact cactctcgac ggcgaggtgc aggagtgcat cggccgcggt 120

gcggattaca ttgccagcat cgcgggcgag gaccgccaca tctacgggat caacaccgga 180

ttcggctcgc tgtgcgtgcg gcgcatcgag gaacacgagc agtccgaact gcagcaccgc 240

cacctgctgt cgcatgcctg cggggtggga gagccgatgc ccgcgcggat cagccggatc 300

accacggtca tcaagctgct caccttccgc agcggctact gcggtatcac gccgaacacc 360

gtcaaccgca tgctcgactt ctggggccgc ggcatcgtgc cggccatccc caagaaggga 420

accgtcggtg ccagtggcga tctcgcgccg ttggcgcatc tggccctgcc gctgatcggc 480

gaagggaagg tctactaccg gggcgaactc gtcgacgccg ccacgatgct agcgggcgag 540

ggcttcgagc cgctgcggct gcgccccaag gaggggctgg cgctgaccaa tggcgtgcag 600

tacatcaacg cgatcgccgt cgactgcctg ctgcgtgccc gcaccctgat ccggttcgca 660

gatcttgtga cggcgttgag cattcagggc ttcagcaccg ccaagagctt ctaccaaccg 720

ctgctggaga agacctggcg gcaccccgag cgcgtcacgg tcgccaagaa cctcgagaca 780

ttgctggagg gcagcaacca ccacgagctg ccacagtgca atatcgccca cgaagatccg 840

tactcgtatc gctgtgtgcc gcaggtgcat gccgcggcgc gtcaggcgat caacttcgcc 900

acccagatca tcgagcagga atgcaacacc gtctcggaca atccggtctt cttctacgag 960

gagggcaccg aactgtgcgc gggtaacctg cacggcgcct cgtcggcgat ggtgatggac 1020

ctgctggcga tcgcgttgac ggatctgtcg agcatctccg aacgccgcac ctaccaactg 1080

ctctccggcc agcacggcct gccggactat ctggtggcca agcccggcct ggattccggg 1140

ctgatgatcc cgcagtacac ctcggccgcc ctggtcaacg agaacaaggt gctctcggcc 1200

ccggccagtg tcgacaccat cgccacctgc cagctgcagg aggaccatgt gagcatgggc 1260

gggacgtcgg cctacaagct gatgcaggtc atcgacaacc tgacctacat tctgggtatc 1320

gagttgctga ccgccgcgca ggccatcgac ctgaacgagg ggctgcggct ctcaccggag 1380

acggcgaagc tgttcaacga gttccgctcc gaggtgagcc atctggacca ggaccgctac 1440

cagcaccccg atatcgagaa ggcgcggcag ttcgtcgagc agcgcgcgcg gcggtggtgt 1500

gacgagctgg cggtgcagtg a 1521

<210> 2

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

cccaagcttg tcgatgatcg acaacctgtc cggc 34

<210> 3

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

ggaattcggt gttgatcccg tagatgtggc gg 32

<210> 4

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

ggaattcgcc atcgacctga acgaggggct gc 32

<210> 5

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

cgggatccaa gagtcgaagt aggtcttatc ccagaagggg ac 42

<210> 6

<211> 1131

<212> DNA

<213> 新金色分枝杆菌

<400> 6

gtgagtgcgg ccaagatcac cctcgacgac ctgccgttgc gcgacagcct gcgcggcaaa 60

tccccctacg gcgcaccaca actggcggtg ccggtgcggc tgaacaccaa cgagaacccg 120

catccgccga cccaggcgct cgtcgacgat gtcgccgagt ccgtgcgtga tgcggctgcc 180

gaactgcacc gctaccccga tcgcgacgcg gtggccctgc gcaccgatct ggcggagtac 240

ctgcgcaccc agaccggcgt cgaggtcggc gtcgacaacg tctgggcggc aaatggttcg 300

aatgagatcc tgcagcagtt gctgcaggcg ttcggcggtc ctggccggcg cgccatcggt 360

ttcgtgccgt cctattccat gcaccccatc atctccgacg gcacgcagac ccagtggctg 420

gaggcggccc gcgccgagga cttcggcctg gacaccgacc gtgccgtcgc ggcgatcacc 480

gagcaccggc ccgatgtggt gttcttggcc agcccgaaca atccctcggg tcagagcgtc 540

acaccggacg agctgcgccg ggtgctcgac gccgcgccgg gtgtggtcat agtcgacgag 600

gcatatggcg aattctcttc ccagcccagc gccgtcgggc tgatcgcgga ccatccggcc 660

aagctcatcg tcacccgcac catgagcaag gcgttcgcct tcgccggcgg ccggctgggt 720

tacctgatcg ccgatcccgc tgtgatcgac gcgatcctgt tggtccggct gccgtatcac 780

ctgtccgcgc tgacgcaggc cggagcgcgc gcggcgctgc gtcatgccga cgaaaccctg 840

ggcagtgtgc agacactgat cgccgagcgc ggccggatcg cgtcggcgtt gacggacatg 900

gggtatcgcg tcatccccag tgacgccaac ttcgtgctct tcggcggctt cgccgatgcc 960

ccggccgtct ggcagcgcta tctcgatgcc ggcgtgctga tccgcgatgt cggcgtgccc 1020

ggccacctgc ggaccaccgt cggcctcgcc gaagagaacg atgtcttcct cgatgtgagt 1080

gccacgatcg ccgaatccgg cgtcctaacg cagaaccaag gagtctcatg a 1131

<210> 7

<211> 522

<212> DNA

<213> 新金色分枝杆菌

<400> 7

gtgttgctgc atcagggaat cggactggac gtgttcaacg cgttgcccga acgcaaggcc 60

gtacacgcgc tctacgagtg ctgcaacagc tatgcgctgg cccgcgaact cgtccgtggc 120

cgcccttatc ccgatcacga cgcactgttc cgccgcgccg atgccgcgct gttcgagctg 180

cccgaatccg ccgtggatca gatcctggac gcgtgccccg atatcggcag gcgaccgcgc 240

agcgcgaagt cgcaggccga accctgtgcg gtctgggatg acgatgccga attgatggca 300

gcgctgagcg ccgcctcccg gcagtacgcg caacgctacg ggttcacctt cgtgatgttc 360

gtcgacgggc actgcgcacg cgatgtcctt gccgccgtca ccgaccggat gcaccatgac 420

accgagaccg aacgcaagat cctgcgaaac gaactggcca agatcggtcg cagcaggttg 480

gaacggatgc tcggccccga gggcggttac cagaactggt ag 522

<210> 8

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

cgggatccgt gagtgcggcc aagatcacc 29

<210> 9

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

cccaagcttt catgagactc cttggttctg cgtt 34

<210> 10

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 10

ttatcgatgt cgacgtagtt gagaaggaga tatactgcat cagggaatcg 50

<210> 11

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 11

cagtcgatcg tacgctagtt aacctaccag ttctggtaac cgc 43

Claims

1.一种用于生产麦角硫因的基因工程菌株的构建方法，其特征在于，所述基因工程菌株通过对自身可产生麦角硫因的新金色分枝杆菌进行代谢工程改造而成，包括过表达egtABCDE基因簇，敲除菌株内源的Mn_hal基因，以及共表达Mn_hisC和Mn_allB1基因，所述新金色分枝杆菌的保藏号为ATCC 25795，所述基因工程菌株的构建方法包括以下步骤：

A：将自杀质粒p19-Mn_hal电转化导入Mn-egtABCDE-hisG菌株感受态，涂布卡那霉素和潮霉素双抗性平板长出单克隆，利用同源臂引物D-Mn_hal-UF&D-Mn_hal-DR进行PCR扩增筛选，选择条带大小为1996bp的单克隆菌株，即为MnΔhal-egtABCDE-hisG菌株；以及

B：将整合型质粒pMV306-Mn_hisC-Mn_allB1电转化导入MnΔhal-egtABCDE-hisG感受态，涂布卡那霉素和潮霉素双抗性平板长出单克隆，利用E-Mn_hisC-Mn_allB1-F&E-Mn_hisC-Mn_allB1-R进行PCR扩增验证，如能扩增出1000bp左右的阳性条带，所对应的菌株为MnΔhal-attB::(hisC-allB1)-egtABCDE-hisG菌株，即为一种可用于生产麦角硫因的基因工程菌株；

所述自杀质粒p19-Mn_hal的构建包括以下步骤：

A1：以新金色分枝杆菌基因组为模板，利用同源臂引物D-Mn_hal-UF&D-Mn_hal-UR，D-Mn_hal-DF&D-Mn_hal-DR分别扩增上、下游同源臂序列，获得上、下游同源臂纯化产物；

A2：p2NIL质粒提取物采用HindIII和BamHI进行酶切，上游同源臂纯化产物利用HindIII和EcoRI进行酶切，下游同源臂纯化产物利用EcoRI和BamHI进行酶切，T4酶连接，获得重组质粒p2NIL-Mn_hal；

A3：将pGOAL19质粒产物、重组质粒p2NIL-Mn_hal分别用PacI酶切，T4酶连接，转入大肠杆菌DH5α感受态，扩大培养、抽提获得自杀质粒p19-Mn_hal的纯化产物，电转，涂布蔗糖致死平板，筛选正确的双交换突变菌株，即可获得自杀质粒p19-Mn_hal；

Mn_hal基因的核苷酸序列如SEQ ID No:1所示；

所述同源臂引物D-Mn_hal-UF&D-Mn_hal-UR，D-Mn_hal-DF&D-Mn_hal-DR的核苷酸序列如SEQ ID No:2-5所示；

所述整合型质粒pMV306-Mn_hisC-Mn_allB1的构建包括以下步骤：

B1：Mn_hisC基因拷贝数增加菌株的构建：

1)以新金色分枝杆菌基因组为模板，利用引物E-Mn_hisC-F&E-Mn_hisC-R扩增获得Mn_hisC的基因序列；

2)将pMV261质粒产物、Mn_hisC的基因序列，用BamHI&EcoRI酶切纯化回收，T4酶连接，转化大肠杆菌DH5α感受态，获得重组质粒pMV261-Mn_hisC；

B2：Mn_hisC-Mn_allB1共强化菌株的构建：

1)以新金色分枝杆菌基因组为模板，利用引物E-Mn_hisC-Mn_allB1-F&E-Mn_hisC-Mn_allB1-R扩增获得Mn_allB1的基因序列片段；

2)重组质粒pMV261-Mn_hisC质粒采用HpaI酶切，纯化回收得到质粒骨架，与Mn_allB1的基因序列片段进行无缝克隆连接，获得重组质粒连接产物pMV261-hisC-allB1；

3)将连接产物pMV261-hisC-allB1转化大肠杆菌DH5α，涂布卡那霉素抗性平板进行克隆筛选，经菌落PCR、质粒酶切和质粒测序验证，即可获得重组质粒pMV261-Mn_hisC-Mn_allB1；

4)利用XbaI&HpaI酶切重组质粒pMV261-Mn_hisC-Mn_allB1，将pMV306的质粒产物，采用XbaI&HpaI进行酶切，T4连接酶连接，随后转化大肠杆菌DH5α感受态，使用潮霉素抗性平板筛选单克隆，获得pMV306-Mn_hisC-Mn_allB1；

Mn_hisC基因的核苷酸序列如SEQ ID No:6所示，Mn_allB1基因的核苷酸序列如SEQ IDNo:7所示；

2.一种用于生产麦角硫因的基因工程菌株，其特征在于，由根据权利要求1所述的基因工程菌株的构建方法构建得到。

3.一种麦角硫因的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

将根据权利要求1所述的构建方法构建得到的基因工程菌株，接种于培养基中培养，即得。