CN110066846B - 一种制备倍他米松中间体的方法 - Google Patents

Abstract

本发明利用单一菌种简单节杆菌Arthrobacter simplex CPCC 140451或简单类诺卡氏菌Nocardioide simplex ACCC 10205中的一种，使化合物I的水解和脱氢过程在同一个体系中进行，实现了一步发酵转化得到倍他米松环氧水解物，工艺简便，适合工业化生产。

Description

一种制备倍他米松中间体的方法

技术领域

本发明属于甾体生物制药领域，具体涉及一种利用单一微生物发酵合成倍他米松环氧水解物即DB11的方法。

背景技术

倍他米松是一种临床应用广泛的糖皮质激素，具有抗炎、抗过敏和免疫等多种药理作用，可用于治疗风湿性关节炎、红斑狼疮等。倍他米松环氧水解物是合成倍他米松重要中间体，商品名为DB11，CAS：981-34-0，化学名为：9β，11β-环氧-16β-甲基孕甾-1，4-二烯-17α，21-二醇-3，20-二酮，为白色或几乎白色结晶性粉末，无臭，味苦。几乎不溶于水，略溶于甲醇或丙酮，其结构式如下所示：

现有报道合成DB11技术工艺路线，主要分为两类：一类是化学合成方法。专利文献CN 103724395 A报道了以倍他米松置换物为起始物，经还原剂硫化钠或亚硫酸钠水解成倍他米松环氧水解物的工艺，重量收率大于87％，液相含量97％以上，反应式如下：

专利文献CN 104945464 A报道了DB11的化学合成方法，反应过程复杂，以倍他米松消除物为原料，经溴羟化反应和环氧水解反应得到倍他米松环氧水解物成品，但该合成方法使用了二氧六环、高氯酸、N-溴代丁二酰亚胺等污染较重溶剂，收率70％-75％，HPLC含量96％-97％。

另一类是生物发酵合成方法。专利文献CN 107099498 A报道，利用重组分枝杆菌或者重组大肠杆菌细胞裂解液制备倍他米松环氧水解物的方法，但重组大肠杆菌或重组分枝杆菌质粒在培养和传代过程中容易丢失，且使用酶催化过程比较繁琐，需要先培养好菌体，然后使用PBS缓冲液洗涤菌体，超声波破碎重组菌后，投入反应起始物料，该方法中还使用了磷酸缓冲液，转化过程投料量仅1g/L，不适宜工业化生产。

虽然制备倍他米松环氧水解物研究取得了一定的研究成果，但现有技术中化学合成方法，存在环境污染大的问题；采用重组微生物转化制备倍他米松环氧水解物存在转化率和投料量低、副产物多等不足。经检索，利用非重组菌种进行一步发酵且投料量大、转化率高的制备倍他米松环氧水解物的技术未见报道。

发明内容

针对现有技术中合成DB11的缺陷，本发明旨在提供一种利用微生物发酵合成DB11的新方法，旨在解决化学合成过程中存在的污染问题和重组菌种投料量低、转化率低、副产物多等不足。

本发明提供的方案是：以化合物I(化学名称是：16β-甲基-17α，21-二羟基孕甾-4-烯-9，11-环氧-3，20-二酮-21-醋酸酯)为起始物，利用单一菌种一次性进行1，2位脱氢和21位酯水解，得到倍他米松环氧水解物DB11，这里所指单一菌种是：简单节杆菌Arthrobactersimplex CPCC 140451或简单类诺卡氏菌Nocardioide simplex ACCC 10205中的一种。转化如下式：

本发明人筛选菌种时，发现一些具有脱氢活性的节杆菌和诺卡氏菌对化合物I并没有水解作用，而简单节杆菌Arthrobacter simplex CPCC 140451和简单类诺卡氏菌Nocardioide simplex ACCC 10205，是能够对化合物I具有较强水解脱氢活性的单一菌种，其筛选结果如下：

使用的微生物：本发明使用的简单节杆菌是指Arthrobacter simplex CPCC140451，于2014年3月购自中国药学微生物菌种保藏管理中心，该菌株起始来源于1989年中国河南省安阳第二制药厂；本发明使用的简单类诺卡氏菌是指Nocardioide simplex ACCC10205，于2014年3月购自中国农业微生物菌种保藏管理中心。

具体来说，本发明人提供如下的技术方案：

利用简单节杆菌Arthrobacter simplex CPCC 140451制备倍他米松环氧水解物DB11，主要包括以下步骤：

(1)简单节杆菌培养：按照斜面培养基配方配置好培养基，经灭菌后在斜面培养基上划线接种菌种，32℃培养2天后，使用30mL无菌水洗下菌体，按照1％接种浓度(V/V)接入种子培养基中，在有氧条件下，于28℃～32℃的温度下，150～250rpm的转速下，培养24h后移入已经灭菌的发酵培养基中，经与种子培养同样的培养条件，培养15-24h后，得到培养好的菌体。

斜面培养基选用：葡萄糖13g/L，酵母膏16g/L，琼脂18g/L，pH7.0-8.0；

种子和发酵培养基选用：葡萄糖11.8g/L，玉米浆6g/L，蛋白胨8g/L，KH₂PO₄4g/L，pH7.0-8.0；

发酵培养基中添加1～2g/L化合物I作为诱导。

(2)菌体转化条件：调节步骤1)培养好的菌体pH值，称取一定量的起始化合物I加入其中，添加增溶剂后，于31℃～35℃的温度下，150～250rpm的转速下，转化反应24-72h。

上述调节发酵液pH值，需调至pH9-10，所用碱可以使用10％～20％的氨水或氢氧化钠溶液；

增溶剂选自Tween-80、甲醇、乙醇、丙酮、DMF、DMSO中的一种；

进一步地，增溶剂浓度为0.01～0.3％；

起始物化合物I的投料浓度为10g/L-60g/L。

(3)转化反应终止：转化结束后终止反应，优选采用将发酵液升温至50-80℃而使菌体灭活的方法，终止反应后优选采用溶剂浸泡方式提取发酵液中的转化产物。

溶剂倍量范围10-30V；所述溶剂选自甲醇、丙酮、乙腈。

(4)转化反应检测：采用HPLC法跟踪起始化合物I转化情况。

利用简单类诺卡氏菌Nocardioide simplex ACCC 10205制备DB11，主要包括以下步骤：

(1)菌种培养：按照斜面培养基配方配置好培养基，经灭菌后在斜面培养基上划线接种菌种，30℃培养2天后，使用50mL无菌水洗下菌体，按照1％接种浓度(V/V)接入种子培养基中，在有氧条件下，于28℃～34℃的温度下，150～250rpm的转速下，培养24h后移入已经灭菌的发酵培养基中，经与种子培养同样的培养条件，培养10-20h后，得到培养好的菌体。

斜面培养基：葡萄糖11g/L，酵母膏17g/L，琼脂20g/L，pH7.0-8.0；

种子与发酵培养基：葡萄糖13g/L，玉米浆5g/L，酵母膏1g/L，蛋白胨8g/L，KH₂PO₄3g/L，pH7.0-8.0；

发酵培养基中添加1～2g/L起始化合物I作为诱导。

(2)菌体转化条件：调节步骤1)培养好的菌体pH值，称取一定量的起始化合物I加入其中，添加增溶剂后，于30℃～35℃的温度下，150～250rpm的转速下，转化反应24-72h。

上述调节发酵液pH值，需调至pH9-10，所用碱选自10～20％的氨水或氢氧化钠溶液；

增溶剂选自Tween-80、甲醇、乙醇、丙酮、DMF、DMSO中的一种；

进一步地，增溶剂浓度为0.01～0.3％；

起始物化合物I的投料浓度为10g/L-60g/L。

(3)转化反应终止：转化结束后终止反应，采用将发酵液升温至50-80℃而使菌体灭活的方法，终止反应后优选采用溶剂浸泡方式提取发酵液中的转化产物，所述溶媒选自甲醇、丙酮、乙腈。倍量范围10-30V；

(4)转化反应检测：采用HPLC法跟踪起始物转化情况。

本专利中，涉及的化合物结构如下：

其中，各物质在HPLC图谱中的相对保留时间如下：

RRT	物质	物质名称
			0.935	杂质1	化合物I水解物
1.000	产物	DB11
			2.227	杂质2	化合物I
2.280	杂质3	化合物I脱氢物

发明人对转化所使用的微生物种类、投料浓度、菌种培养及转化条件等进行了细致的研究，获得了高效制备倍他米松环氧水解物生物转化工艺路线。

为了进一步解释本发明的方案，在实施例1-3中，采用简单节杆菌Arthrobactersimplex CPCC 140451作为转化单一菌种，添加起始物化合物I作诱导，直接投料方式，化合物I投料浓度分别为30g/L，60g/L，50g/L，转化率分别为95.631％，93.136％，94.632％；

实施例4-6中，采用简单类诺卡氏菌Nocardioide simplex ACCC 10205为单一转化菌种，添加化合物I作诱导，化合物I投料浓度分别为10g/L，20g/L，30g/L，直接投料方式，转化率分别为95.901％，92.312％，90.256％；

实施例7中，采用简单类诺卡氏菌Nocardioide simplex ACCC 10205于50L发酵罐中进行转化，转化率为95.041％。

与现有报道技术相比，本发明的有益效果有以下几点：

(1)本发明利用单一菌种简单节杆菌Arthrobacter simplex CPCC 140451或简单类诺卡氏菌Nocardioide simplex ACCC 10205中的一种，使化合物I的水解和脱氢过程在同一个体系中进行，实现了一步发酵转化得到倍他米松环氧水解物，工艺简便，不需要中间出料，降低了生产成本和环保压力，适合工业化生产。

(2)利用本发明提供的制备倍他米松环氧水解物的方法，发酵投料浓度为10g/L-60g/L，脱氢水解转化率达90％以上，比专利文献CN107099498A报道的利用重组分枝杆菌或者重组大肠杆菌细胞裂解液制备倍他米松环氧水解物的方法，投料浓度为1g/L，转化率为50％-90％，更具有工业应用的价值。

(3)现有技术中专利文献CN 107099498 A报道，利用重组分枝杆菌或者重组大肠杆菌细胞裂解液制备倍他米松环氧水解物的方法，未提及杂质情况，且转化过程需要添加0.1％氢化可的松来诱导，有增加杂质的风险，给后续分离纯化工艺增加难度；而利用本发明提供的制备倍他米松环氧水解物的方法，仅有酮基还原杂质产生，且HPLC含量均小于0.5％，所用原辅料为发酵常用原辅料，来源丰富，价格便宜，适合工业放大。

注：文中所述W表示重量，V表示体积。当W单位为g时，V的单位mL；当W单位为kg时，V的单位L。

附图说明

图1为实施例1的HPLC转化图谱；

图2为实施例4的HPLC转化图谱；

图3为实施例7的HPLC转化图谱；

具体实施方式

下面结合实施例，更具体地说明本发明的内容。

在本发明中，所有的设备和原料等均可从市场购得或是本行业常用的。下述实施例中方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。各种培养基的组分配比均为含量百分比，除特别说明之外，均为重量百分比。

本发明中化合物I为：16β-甲基-17α，21-二羟基孕甾-4-烯-9，11-环氧-3，20-二酮-21-醋酸酯。

实施例1-3中使用的简单节杆菌Arthrobacter simplex CPCC 140451，购买于中国药学微生物菌种保藏管理中心；

实施例4-7中使用的简单类诺卡氏菌Nocardioide simplex ACCC 10205，购买于中国农业微生物菌种保藏管理中心。

注：文中所述W表示重量，V表示体积。当W单位为g时，V的单位mL；当W单位为kg时，V的单位L。

实施例1

以简单节杆菌Arthrobacter simplex CPCC 140451为转化菌种。

(1)菌种斜面培养过程：使用500mL茄形瓶，按照如下配比：葡萄糖13g/L，酵母膏16g/L，琼脂18g/L，pH7.0-8.0配制斜面培养基，每个茄形瓶装液100mL，经121℃，灭菌30min后，摆好斜面，待斜面凝固成形后放置32℃培养箱中培养2天，未发现杂菌后，于斜面培养基上接种简单节杆菌CPCC 140451，经32℃培养2天后，收集茄形瓶，放置4℃冰箱中，待用。

(2)菌种摇瓶培养过程：使用500mL摇瓶，按照如下配比：葡萄糖11.8g/L，玉米浆6g/L，蛋白胨8g/L，KH₂PO₄4g/L，pH7.0-8.0来配制摇瓶种子培养基及发酵转化培养基，每个摇瓶装液100mL，其中发酵转化培养基灭菌前添加1.0g/L化合物I作为诱导，经121℃，灭菌30min冷却后，在无菌条件下，使用30mL无菌水洗下一个茄形瓶菌体，按照1％接种浓度(V/V)接入种子培养基中，放置摇床后，经220rpm，32℃培养1天后以5％的移种量(V/V)移入发酵转化培养基中，于220rpm，32℃条件下，培养15-24h后用于投料。

(3)投料转化过程：向培养好的100mL发酵液中添加10％氢氧化钠溶液，调节pH值至9.0，称取3g化合物I，投入摇瓶中后，加入0.3％的乙醇(V/V)，于32℃转化温度下，200rpm转速条件下转化48h，转化完成后升温至60℃终止反应，取1mL转化液，加入20mL乙腈超声30min，离心后进行HPLC分析，转化率为95.631％。

实施例2：以简单节杆菌Arthrobacter simplex CPCC 140451为转化菌种

(1)菌种斜面培养与摇瓶培养过程：同实施例1，区别在于发酵转化培养基灭菌前添加1.5g/L化合物I作为诱导。

(2)投料转化过程：向培养好的100mL发酵液中添加10％氨水，调节pH值至9.5，称取6g化合物I，投入摇瓶中，加入0.1％的DMF(V/V)，摇匀后于34℃转化温度下，220rpm转速条件下转化70h，转化完成后升温至70℃终止反应，取1mL转化液，加入20mL丙酮超声30min，离心后进行HPLC分析，转化率为93.136％。

实施例3：以简单节杆菌Arthrobacter simplex CPCC 140451为转化菌种

(1)菌种斜面培养与摇瓶培养过程：同实施例1，区别在于发酵转化培养基灭菌前添加2.0g/L化合物I作为诱导。

(2)投料转化过程：向培养好的100mL发酵液中添加15％氢氧化钠水溶液，调节pH值至10.0，称取5g化合物I，投入摇瓶中，加入0.1％的DMSO(V/V)摇匀后，于32℃转化温度下，220rpm转速条件下转化65h，转化完成后升温至80℃终止反应，取1mL转化液，加入20mL丙酮超声30min，离心后进行HPLC分析，转化率为94.632％。

实施例4：以简单类诺卡氏菌Nocardioide simplex ACCC 10205为转化菌种

(1)菌种斜面培养过程：使用500mL茄形瓶，按照如下配比：葡萄糖11g/L，酵母膏17g/L，琼脂20g/L，pH7.0-8.0配制斜面培养基，每个茄形瓶装液100mL，经121℃，灭菌30min后，摆好斜面，待斜面凝固成形后放置30℃培养箱中培养2天，未发现杂菌后，于斜面培养基上接种简单类诺卡氏菌ACCC 10205，经30℃培养2天后，收集茄形瓶，放置4℃冰箱中，待用。

(2)菌种摇瓶培养过程：使用500mL摇瓶，按照如下配比：葡萄糖13g/L，玉米浆5g/L，酵母膏1g/L，蛋白胨8g/L，KH₂PO₄3g/L，pH7.0-8.0来配制摇瓶种子培养基及发酵转化培养基，每个摇瓶装液100mL，其中发酵转化培养基灭菌前添加1.0g/L化合物I作为诱导，经121℃，灭菌30min冷却后，在无菌条件下，使用50mL无菌水洗下一个茄形瓶菌体，按照1％接种浓度(V/V)接入种子培养基中，放置摇床后，于200rpm，32℃培养条件下，培养1天后以5％的移种量(V/V)移入发酵转化培养基中，于220rpm，32℃条件下，培养10-20h后用于投料。

(3)投料转化过程：向培养好的100mL发酵液中添加15％氨水溶液，调节pH值至9.0，称取1g化合物I，投入摇瓶中，加入0.1％的甲醇(V/V)后，于30℃转化温度下，220rpm转速条件下转化48h，转化完成后升温至50℃终止反应，取1mL转化液，加入20mL乙腈超声30min，离心后进行HPLC分析，转化率为95.901％。

实施例5：以简单类诺卡氏菌Nocardioide simplex ACCC 10205为转化菌种

(1)菌种斜面培养与摇瓶培养过程：同实施例4，区别在于发酵转化培养基灭菌前添加1.5g/L化合物I作为诱导。

(2)投料转化过程：向培养好的100mL发酵液中添加10％氢氧化钠溶液，调节pH值至9.5，称取2g化合物I，投入摇瓶中后，加入0.2％的乙醇(V/V)，摇匀后于32℃温度下，220rpm转速条件下转化70h，转化完成后升温至70℃终止反应，取1mL转化液，加入20mL丙酮超声30min，离心后进行HPLC分析，转化率为92.312％。

实施例6：以简单类诺卡氏菌Nocardioide simplex ACCC 10205为转化菌种

(1)菌种斜面培养与摇瓶培养过程：同实施例4，区别在于发酵转化培养基灭菌前添加2.0g/L化合物I作为诱导。

(2)投料转化过程：向培养好的100mL发酵液中添加20％氢氧化钠溶液，调节pH值至10.0，称取3g化合物I，投入摇瓶中，加入0.1％的DMSO(V/V)，摇匀后于33℃温度下，250rpm转速条件下转化65h，转化完成后升温至80℃终止反应，取1mL转化液，加入20mL丙酮超声30min，离心后进行HPLC分析，转化率为90.256％。

实施例7：以简单类诺卡氏菌Nocardioide simplex ACCC 10205为转化菌种进行50L发酵罐转化。

(1)菌种斜面培养与种子培养过程：同实施例4；

(2)菌种培养过程：使用50L发酵罐，装液30L，按照如下配比：葡萄糖13g/L，玉米浆5g/L，酵母膏1g/L，蛋白胨8g/L，KH₂PO₄3g/L，pH7.0-8.0来配制发酵转化培养基，并添加1g/L化合物I作诱导，配制完成后通蒸汽，于121℃，灭菌30min，待发酵罐冷却至32℃，以5％的移种量，火焰接种方式接种至发酵罐中，通气量调至0.6m³/h，搅拌转速为250rpm，32℃培养10-20h后用于投料。

(3)菌种转化过程：向培养好的发酵液中添加20％氢氧化钠溶液，调节pH值至9.0；称取600g化合物I放入3L摇瓶中，加入1800mL无菌水，经100灭菌15分钟冷却后，投入至发酵罐中，加入0.1％的Tween-80(V/V)后，于30℃温度下，250rpm转速条件下转化48h，转化完成后升温至50℃终止反应，取1mL转化液，加入20mL乙腈超声30min，离心后进行HPLC分析，转化率为95.041％。

Claims (8)

1.一种制备倍他米松环氧水解物即DB11的方法，其特征在于，其合成步骤包括：以化合物I为起始物，利用单一菌种一次性转化得到倍他米松环氧水解物，所述单一菌种是指简单节杆菌Arthrobacter simplex保藏编号CPCC 140451，或简单类诺卡氏菌Nocardioidesimplex保藏编号ACCC 10205中的一种，转化如下式：

2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于发酵培养基中添加1～2g/L起始化合物I作为诱导。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述化合物I投料浓度为10g/L-60g/L。

4.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于投料所用增溶剂浓度为0.01％～0.3％，增溶剂选自：Tween-80、甲醇、乙醇、丙酮、DMF和DMSO中的一种。

5.根据权利要求4所述制备方法，其特征在于投料前需用碱调节发酵液pH至pH 9-10，调节pH所用碱是10％～20％的氨水或氢氧化钠水溶液。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于采用Arthrobacter simplexCPCC140451菌种时，斜面培养所采用的培养基是：葡萄糖13g/L，酵母膏16g/L，琼脂18g/L，pH 7.0-8.0，余量的自来水；一级种子和发酵转化用培养基是：葡萄糖11.8g/L，玉米浆6g/L，蛋白胨8g/L，KH₂PO₄ 4g/L，pH 7.0-8.0；菌体培养温度为28-32℃，投料后转化温度为31-35℃，菌体培养和转化过程转速为150rpm～250rpm。

7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于采用Nocardioide simplex ACCC10205菌种时，斜面培养采用的培养基是：葡萄糖11g/L，酵母膏17g/L，琼脂20g/L，pH 7.0-8.0，余量的自来水；一级种子和发酵转化用培养基是：葡萄糖13g/L，玉米浆5g/L，酵母膏1g/L，蛋白胨8g/L，KH₂PO₄ 3g/L，pH 7.0-8.0；菌体培养温度为28-34℃，投料后转化温度为30-35℃，菌体培养和转化过程转速为150rpm～250rpm。

8.根据权利要求5所述制备方法，转化结束后灭活方式为50～80℃，灭活15～30min，制样方式为取少量发酵液，加入溶媒后超声离心进行HPLC分析，所述溶媒选自甲醇、乙腈、丙酮中的一种。

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