CN112578032A - 倍他米松前体环氧物的含量及有关物质的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种倍他米松前体环氧物的含量及有关物质的检测方法，涉及分析化学技术领域。倍他米松前体环氧物的含量及有关物质的检测方法，采用高效液相色谱法，色谱条件包括：采用十八烷基硅烷键合硅胶填充剂的色谱柱，紫外检测器检测，检测波长为250‑260nm，流动相由流动相A和流动相B组成，流动相A：甲醇，流动相B：pH＝2.5‑3.5的水溶液。本发明通过对流动相、洗脱梯度及pH值的优化设计，使极性化合物保留时间明显延后，达到主峰及各杂质有效分离，使各成分峰保留时间及分离度显著改善。在前体阶段采用该检测方法进行检测控制，能够有效控制地塞米松的含量，可减少倍他米松的精制次数以提高收率。

Description

倍他米松前体环氧物的含量及有关物质的检测方法
技术领域
本发明涉及分析化学技术领域，尤其是涉及一种倍他米松前体环氧物的含量及有关物质的检测方法。
背景技术
倍他米松，作用与用途同醋酸地塞米松，其钠、水潴留作用及剂量都比后者小。糖代谢及抗炎作用较氢化可的松强，为氢化可的松的15倍，在原发性肾上腺皮质功能减退症中，可与糖皮质类固醇一起用于替代治疗。也适用于低肾素低醛固酮综合征和植物神经病变所致体位性低血压等。制剂有片剂、膏剂、注射剂，应用广泛。
倍他米松和地塞米松为同分异构体，它们的前体也为同分异构体，经文献调研，未查到任何文献及药典对倍他米松和地塞米松前体的测定方法进行报道和收载。倍他米松的前体为环氧物，环氧物所包含的有关物质杂质均为类似物，其极性较强，且互为异构体。倍他米松前体环氧物为16β-甲基-17ɑ,21-二羟基-Δ9,11-环氧-1,4-孕甾二烯-3,20-二酮，结构式如下：
Figure BDA0002223136530000011
有关物质包括以下三种，分别为：
杂质1：溴代甲酸酯，分子式：C23H29BrO6，分子量：481.38，化学名：9α-溴-11β-甲酸酯-16β-甲基-17α,21-羟基-1,4-孕甾二烯-3,20-二酮，结构式如下：
Figure BDA0002223136530000021
杂质2：16α-甲基环氧物，分子式：C22H28O5，分子量：372.45，化学名：16ɑ-甲基-17ɑ,21-二羟基-Δ9,11-环氧-1,4-孕甾二烯-3,20-二酮，结构式如下：
Figure BDA0002223136530000022
杂质3：11β-羟基溴羟物，分子式：C22H29BrO5，分子量：453.37，化学名：16β-甲基-9ɑ-溴-11β,17ɑ,21-三羟基-1,4-孕甾二烯-3,20-二酮，结构式如下：
Figure BDA0002223136530000023
环氧物及有关物质采用常规的缓冲盐体系及含酸、碱的流动相均无法达到有效分离，不能有效控制倍他米松中有关物质的含量，增加了倍他米松的精制次数，对倍他米松的质量控制增加了难题。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种倍他米松前体环氧物的有关物质的检测方法，以期至少部分地解决上述技术问题中的至少之一。
本发明提供了一种倍他米松前体环氧物的含量及有关物质的检测方法，采用高效液相色谱法，色谱条件包括：采用十八烷基硅烷键合硅胶填充剂的色谱柱，紫外检测器检测，检测波长为250-260nm，流动相由流动相A和流动相B组成，流动相A：甲醇，流动相B：pH＝2.5-3.5的水溶液，按照下表进行梯度洗脱：
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 A1 B1
44-46 A1 B1
其中，A1＝45-50％；B1＝50-55％。
进一步的，采用高效液相色谱法，色谱条件包括：采用十八烷基硅烷键合硅胶填充剂的色谱柱，紫外检测器检测，检测波长为250-260nm，流动相由流动相A和流动相B组成，流动相A：甲醇，流动相B：pH＝2.5-3.5的水溶液，按照下表进行梯度洗脱：
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 A1 B1
44-46 A1 B1
59-61 A2 B2
64-66 A2 B2
其中，A1＝45-50％，A2＝60-65％；B1＝50-55％，B2＝35-40％。
进一步的，采用高效液相色谱法，色谱条件包括：采用十八烷基硅烷键合硅胶填充剂的色谱柱，紫外检测器检测，检测波长为250-260nm，流动相由流动相A和流动相B组成，流动相A：甲醇，流动相B：pH＝2.5-3.5的水溶液，按照下表进行梯度洗脱：
Figure BDA0002223136530000031
Figure BDA0002223136530000041
其中，A1＝45-50％，A2＝60-65％；B1＝50-55％，B2＝35-40％。
进一步的，采用高效液相色谱法，色谱条件包括：采用十八烷基硅烷键合硅胶填充剂的色谱柱，紫外检测器检测，检测波长为250-260nm，流动相由流动相A和流动相B组成，流动相A：甲醇，流动相B：pH＝2.5-3.5的水溶液，按照下表进行梯度洗脱：
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 48 52
45 48 52
进一步的，采用高效液相色谱法，色谱条件包括：采用十八烷基硅烷键合硅胶填充剂的色谱柱，紫外检测器检测，检测波长为250-260nm，流动相由流动相A和流动相B组成，流动相A：甲醇，流动相B：pH＝2.5-3.5的水溶液，按照下表进行梯度洗脱：
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 48 52
45 48 52
60 63 37
65 63 37
进一步的，采用高效液相色谱法，色谱条件包括：采用十八烷基硅烷键合硅胶填充剂的色谱柱，紫外检测器检测，检测波长为250-260nm，流动相由流动相A和流动相B组成，流动相A：甲醇，流动相B：pH＝2.5-3.5的水溶液，按照下表进行梯度洗脱：
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 48 52
45 48 52
60 63 37
65 63 37
70 48 52
75 48 52
进一步的，所述流动相B选自冰醋酸水溶液、磷酸水溶液或醋酸铵-冰醋酸水溶液。
进一步的，所述流动相B选自冰醋酸水溶液。
进一步的，所述醋酸铵-冰醋酸水溶液中醋酸铵的浓度为18-22mmol/L。
进一步的，所述醋酸铵-冰醋酸水溶液中醋酸铵的浓度为20mmol/L。
进一步的，所述流动相B的pH＝3.0。
进一步的，所述检测波长为254nm。
进一步的，所用流速为1.0-1.5mL/min。
进一步的，所用流速为1.2mL/min。
进一步的，所用柱温为25-35℃。
进一步的，所用柱温为30℃。
进一步的，所述进样量为18-22μL。
进一步的，所述进样量为20μL。
进一步的，采用高效液相色谱法，色谱条件包括：采用十八烷基硅烷键合硅胶填充剂的色谱柱，紫外检测器检测，检测波长为254nm，流动相由流动相A和流动相B组成，流动相A：甲醇，流动相B：pH＝3.0的冰醋酸水溶液，流速为1.2mL/min，柱温为30℃，进样量为20μL，按照下表进行梯度洗脱：
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 48 52
45 48 52
60 63 37
65 63 37
70 48 52
75 48 52
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供的倍他米松前体环氧物的含量及有关物质的检测方法，基于倍他米松与地塞米松为同分异构体，环氧物为倍他米松前体，并根据环氧物的理化性质，开发了一套液相色谱体系对环氧物及有关物质进行分离测定，通过对流动相、洗脱梯度及pH值的优化设计，使极性化合物保留时间明显延后，达到主峰及各杂质有效分离，使各成分峰保留时间及分离度显著改善。在前体阶段采用该检测方法进行检测控制，能够有效控制地塞米松的含量，可减少倍他米松的精制次数以提高收率。本方法可用于准确控制地塞米松在倍他米松中的含量，提高倍他米松的收率。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为环氧物的HPLC谱图；
图2为溴代甲酸酯的HPLC谱图；
图3为16α-甲基环氧物的HPLC谱图；
图4为11β-羟基溴羟物的HPLC谱图；
图5为混合样品的HPLC谱图；
图6为环氧物的定量限的HPLC谱图；
图7为环氧物的检出限的HPLC谱图；
图8为溴代甲酸酯+16α-甲基环氧物的定量限的HPLC谱图；
图9为溴代甲酸酯+16α-甲基环氧物的检出限的HPLC谱图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
倍他米松前体环氧物、溴代甲酸酯对照品、16α-甲基环氧物对照品、11β-羟基溴羟物对照品，天津药业研究院有限公司自制。
倍他米松前体环氧物的含量及有关物质的检测方法
实施例1专属性试验
供试品溶液：取环氧物，加稀释剂乙腈-甲醇(50：50)溶解并稀释制成每1mL中约含2.5mg的溶液，作为供试品溶液。
对照品溶液：精密称取环氧物对照品适量，加稀释剂乙腈-甲醇(50：50)溶解并稀释制成每1mL中约含0.025mg的溶液，作为环氧物定位溶液。
精密称取溴代甲酸酯对照品适量，加稀释剂乙腈-甲醇(50：50)溶解并稀释制成每1mL中约含0.025mg的溶液，作为溴代甲酸酯定位溶液。
精密称取16α-甲基环氧物对照品适量，加稀释剂乙腈-甲醇(50：50)溶解并稀释制成每1mL中约含0.025mg的溶液，作为16α-甲基环氧物定位溶液。
精密称取11β-羟基溴羟物对照品适量，加稀释剂乙腈-甲醇(50：50)溶解并稀释制成每1mL中约含0.025mg的溶液，作为11β-羟基溴羟物定位溶液。
混合样品：分别量取环氧物对照品溶液、溴代甲酸酯对照品溶液、16α-甲基环氧物对照品溶液和11β-羟基溴羟物对照品溶液适量加入供试品溶液中，作为混合样品。
空白溶剂：乙腈-甲醇(50：50)。
实施例1-1
色谱条件：
色谱柱：DIKMA Spursil C18250×4.6mm，5μm；
流动相：流动相：A：甲醇，流动相B：pH＝2.8的磷酸水溶液；
检测波长：252nm；
流速：1.2mL/min；
柱温：28℃；
进样量：20μL；
按照下表进行梯度洗脱：
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 46 54
45 46 54
混合样品的检测数据如表1所示。
表1混合样品的检测结果
Figure BDA0002223136530000081
由表1可知，相邻杂质峰与主峰之间的分离度均符合要求，在本发明的色谱条件下的检测方法能够将环氧物与杂质完全分离，且相邻峰之间无干扰。
实施例1-2
色谱条件：
色谱柱：DIKMA Spursil C18250×4.6mm，5μm；
流动相：流动相：A：甲醇，流动相B：20mmol/L的醋酸铵水溶液，用冰醋酸调节pH＝3.2；
检测波长：258nm；
流速：1.3mL/min；
柱温：32℃；
进样量：20μL；
按照下表进行梯度洗脱：
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 47 53
45 47 53
60 62 38
65 62 38
混合样品的检测数据如表2所示。
表2混合样品的检测结果
Figure BDA0002223136530000091
Figure BDA0002223136530000101
由表2可知，相邻杂质峰与主峰之间的分离度均符合要求，在本发明的色谱条件下的检测方法能够将环氧物与杂质完全分离，且相邻峰之间无干扰。
实施例1-3
色谱条件：
色谱柱：DIKMA Spursil C18250×4.6mm，5μm；
流动相：流动相：A：甲醇，流动相B：pH＝3.0的冰醋酸水溶液；
检测波长：254nm；
流速：1.2mL/min；
柱温：30℃；
进样量：20μL；
按照下表进行梯度洗脱：
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 48 52
45 48 52
60 63 37
65 63 37
70 48 52
75 48 52
环氧物的HPLC谱图如图1所示。
由图1可知，环氧物的保留时间为38.909min。
溴代甲酸酯的HPLC谱图如图2所示。
由图2可知，溴代甲酸酯的保留时间为25.921min。
16α-甲基环氧物的HPLC谱图如图3所示。
由图3可知，16α-甲基环氧物的保留时间为34.527min。
11β-羟基溴羟物的HPLC谱图如图4所示。
由图4可知，11β-羟基溴羟物的保留时间为41.158min。
混合样品的HPLC谱图如图5所示，检测数据如表3所示。
表3混合样品的检测结果
Figure BDA0002223136530000111
由图5和表3可知，相邻杂质峰与主峰之间的分离度均符合要求，在本发明的色谱条件下的检测方法能够将环氧物与杂质完全分离，且相邻峰之间无干扰。
实施例1-4
色谱条件：
色谱柱：DIKMA Spursil C18250×4.6mm，5μm；
流动相：流动相：A：甲醇，流动相B：pH＝2.5的冰醋酸水溶液；
检测波长：260nm；
流速：1.5mL/min；
柱温：25℃；
进样量：20μL；
按照下表进行梯度洗脱：
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 45 55
44 45 55
59 65 35
64 65 35
69 45 55
74 45 55
混合样品的检测数据如表4所示。
表4混合样品的检测结果
Figure BDA0002223136530000121
由表4可知，相邻杂质峰与主峰之间的分离度均符合要求，在本发明的色谱条件下的检测方法能够将环氧物与杂质完全分离，且相邻峰之间无干扰。
实施例1-5
色谱条件：
色谱柱：DIKMA Spursil C18250×4.6mm，5μm；
流动相：流动相：A：甲醇，流动相B：pH＝3.5的冰醋酸水溶液；
检测波长：250nm；
流速：1.0mL/min；
柱温：35℃；
进样量：20μL；
按照下表进行梯度洗脱：
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 50 50
46 50 50
61 60 40
66 60 40
71 50 50
76 50 50
混合样品的检测数据如表5所示。
表5混合样品的检测结果
Figure BDA0002223136530000131
由表5可知，相邻杂质峰与主峰之间的分离度均符合要求，在本发明的色谱条件下的检测方法能够将环氧物与杂质完全分离，且相邻峰之间无干扰。
实施例2灵敏度试验
环氧物定量限溶液：取环氧物对照品，精密称定，置10mL量瓶中，加乙腈：水(1：1)溶解并定量稀释制成每1mL约含2.5mg的溶液，作为环氧物对照储备液；精密量取环氧物对照储备液，加乙腈：水(1：1)稀释成每1mL约含0.25μg的溶液，为定量限溶液。
环氧物检出限溶液：精密量取环氧物定量限溶液3mL置10mL量瓶中，为检出限溶液。
溴代甲酸酯+16α-甲基环氧物定量限溶液：取溴代甲酸酯对照品，精密称定，置10mL量瓶中，加乙腈：水(1：1)溶解并定量稀释制成每1mL约含2.5mg的溶液，作为溴代甲酸酯对照储备液；取6α-甲基环氧物对照品，精密称定，置10mL量瓶中，加乙腈：水(1：1)溶解并定量稀释制成每1mL约含2.5mg的溶液，作为16-α甲基环氧物对照储备液；分别精密量取溴代甲酸酯对照储备液和16α-甲基环氧物对照储备液，加乙腈：水(1：1)稀释成每1mL约含0.25μg溴代甲酸酯和约0.25μg 16α-甲基环氧物的溶液，为定量限溶液。
溴代甲酸酯+16α-甲基环氧物检出限溶液：精密量取溴代甲酸酯定量限溶液3.5mL和16α-甲基环氧物3.5mL置10mL量瓶中，为检出限溶液。
色谱条件：
色谱柱：DIKMA Spursil C18250×4.6mm，5μm；
流动相：流动相：A：甲醇，流动相B：pH＝3.0的冰醋酸水溶液；
检测波长：254nm；
流速：1.2mL/min；
柱温：30℃；
进样量：20μL；
按照下表进行梯度洗脱：
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 48 52
45 48 52
60 63 37
65 63 37
70 48 52
75 48 52
环氧物的定量限的HPLC谱图如图6所示，检测数据如表6所示。
表6环氧物的定量限检测结果
Figure BDA0002223136530000151
由图6和表6可知，环氧物在定量限下，信噪比大于9，说明本发明的色谱条件下的检测方法灵敏度高。
环氧物的检出限的HPLC谱图如图7所示，检测数据如表7所示。
表7环氧物的检出限检测结果
Figure BDA0002223136530000152
由图7和表7可知，环氧物在检出限下，信噪比大于3，说明本发明的色谱条件下的检测方法灵敏度高。
溴代甲酸酯+16α-甲基环氧物的定量限的HPLC谱图如图8所示，检测数据如表8所示。
表8溴代甲酸酯+16α-甲基环氧物的定量限检测结果
Figure BDA0002223136530000153
Figure BDA0002223136530000161
由图8和表8可知，溴代甲酸酯+16α-甲基环氧物在定量限下，信噪比大于9，说明本发明的色谱条件下的检测方法灵敏度高。
溴代甲酸酯+16α-甲基环氧物的检出限的HPLC谱图如图9所示，检测数据如表9所示。
表9溴代甲酸酯+16α-甲基环氧物的检出限检测结果
Figure BDA0002223136530000162
由图9和表9可知，溴代甲酸酯+16α-甲基环氧物在检出限下，信噪比大于3，说明本发明的色谱条件下的检测方法灵敏度高。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种倍他米松前体环氧物的含量及有关物质的检测方法，其特征在于，采用高效液相色谱法，色谱条件包括：采用十八烷基硅烷键合硅胶填充剂的色谱柱，紫外检测器检测，检测波长为250-260nm，流动相由流动相A和流动相B组成，流动相A：甲醇，流动相B：pH＝2.5-3.5的水溶液，按照下表进行梯度洗脱：
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％) 0 A1 B1 44-46 A1 B1
其中，A1＝45-50％；B1＝50-55％。
2.根据权利要求1所述的倍他米松前体环氧物的含量及有关物质的检测方法，其特征在于，采用高效液相色谱法，色谱条件包括：采用十八烷基硅烷键合硅胶填充剂的色谱柱，紫外检测器检测，检测波长为250-260nm，流动相由流动相A和流动相B组成，流动相A：甲醇，流动相B：pH＝2.5-3.5的水溶液，按照下表进行梯度洗脱：
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％) 0 A1 B1 44-46 A1 B1 59-61 A2 B2 64-66 A2 B2
其中，A1＝45-50％，A2＝60-65％；B1＝50-55％，B2＝35-40％。
3.根据权利要求1所述的倍他米松前体环氧物的含量及有关物质的检测方法，其特征在于，采用高效液相色谱法，色谱条件包括：采用十八烷基硅烷键合硅胶填充剂的色谱柱，紫外检测器检测，检测波长为250-260nm，流动相由流动相A和流动相B组成，流动相A：甲醇，流动相B：pH＝2.5-3.5的水溶液，按照下表进行梯度洗脱：
Figure FDA0002223136520000011
Figure FDA0002223136520000021
其中，A1＝45-50％，A2＝60-65％；B1＝50-55％，B2＝35-40％。
4.根据权利要求1-3任一项所述的倍他米松前体环氧物的含量及有关物质的检测方法，其特征在于，所述流动相B选自冰醋酸水溶液、磷酸水溶液或醋酸铵-冰醋酸水溶液。
5.根据权利要求4所述的倍他米松前体环氧物的含量及有关物质的检测方法，其特征在于，所述流动相B选自冰醋酸水溶液。
6.根据权利要求1-3任一项所述的倍他米松前体环氧物的含量及有关物质的检测方法，其特征在于，所述流动相B的pH＝3.0。
7.根据权利要求1-3任一项所述的倍他米松前体环氧物的含量及有关物质的检测方法，其特征在于，所述检测波长为254nm。
8.根据权利要求1-3任一项所述的倍他米松前体环氧物的含量及有关物质的检测方法，其特征在于，所用流速为1.0-1.5mL/min。
9.根据权利要求1-3任一项所述的倍他米松前体环氧物的含量及有关物质的检测方法，其特征在于，所用柱温为25-35℃。
10.根据权利要求1-3任一项所述的倍他米松前体环氧物的含量及有关物质的检测方法，其特征在于，所述进样量为18-22μL。
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