CN112608970B - 一种甲基泼尼松龙脱氢物的生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种甲基泼尼松龙脱氢物的生产方法。本发明的甲基泼尼松龙脱氢物的生产方法，包括：A)将甲基泼尼龙格氏物加水打浆，制得浆液；B)利用简单节杆菌将浆液中的甲基泼尼龙格氏物生物转化为甲基泼尼松龙脱氢物。本发明的生产方法不使用有机溶剂，在生物转化时对微生物的毒害作用小；该方法通过将甲基泼尼龙格氏物加水打浆制成浆液，大大提高了甲基泼尼龙格氏物的投料浓度和底物转化率，甲基泼尼松龙脱氢物产品的产率高，特别有利于甲基泼尼松龙脱氢物的工业化生产。

Description

一种甲基泼尼松龙脱氢物的生产方法

技术领域

本发明涉及制药技术领域，尤其是涉及一种甲基泼尼松龙脱氢物的生产方法。

背景技术

甲基泼尼松龙(简称甲泼尼龙)是一种重要的糖皮质激素药物，具有抗炎、抗内毒素、抑制免疫等药理作用，在临床上具有非常重要的作用，可用于危重疾病的急救，还可用于内分泌失调、风湿性疾病、胶原性病、皮肤疾病、过敏反应、眼科疾病、胃肠道疾病、血液疾病、白血病、休克、脑水肿、多发性神经炎、脊髓炎及防止癌症化疗引起的呕吐等。

甲泼尼龙在C_1,2位置脱氢导入双键能够显著提高其抗炎等活性；与化学方法相比，采用微生物法脱氢具有反应条件温和、专一性强、转化率高等优势。研究发现，利用简单节杆菌可以对甲泼尼龙格氏物进行生物转化，从而制备得到甲基泼尼松龙脱氢物；然而，甲泼尼龙格氏物在水中的溶解度很低，在发酵液中分散与微生物形成有效接触十分困难，从而严重影响了转化反应的速率以及产品的产率，这也成为利用简单节杆菌制备甲基泼尼松龙脱氢物工艺中的难题。

目前，解决上述问题的方法主要包括粉碎处理和溶剂处理；其中，粉碎处理是将甲泼尼龙格氏物磨成细粉进行微粒化以增加其在发酵液中的溶解度，该方式虽能在一定程度上提高产物的转化率，然而提高幅度有限，且投料浓度较低(4％以下)，在高投料浓度下易结晶析出，不利于实际生产；溶剂处理是利用溶剂来溶解甲泼尼龙格氏物，该方式虽然提高了甲泼尼龙格氏物的溶解性，然而在生物转化时会对微生物造成毒害作用，从而在很大程度上制约了底物的投加量及转化率，此外有机溶剂还可能会对产品的质量造成不利影响。

例如，公开号为CN101760495A的中国专利公开了一种6α-甲基泼尼松龙中间体的生物脱氢制备方法，其在将甲泼尼龙格氏物进行粉碎或以溶剂溶解后，利用简单节杆菌AS1.754、AS 1.94*进行1,2位生物脱氢，然而该方法投料浓度在4％以下，且底物转化率仅为70.1-82.1％，其简单节杆菌转化甲基泼尼龙格氏物的水平仍然较低。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种甲基泼尼松龙脱氢物的生产方法，该生产方法能够显著提高简单节杆菌转化甲基泼尼龙格氏物的水平，甲基泼尼龙格氏物的投料浓度和转化率高。

本发明提供的一种甲基泼尼松龙脱氢物的生产方法，包括：

A)将甲基泼尼龙格氏物加水打浆，制得浆液；

B)利用简单节杆菌将浆液中的甲基泼尼龙格氏物生物转化为甲基泼尼松龙脱氢物。

本发明人经研究发现，采用将甲基泼尼龙格氏物加水打浆制成浆液的方式加入到简单节杆菌的发酵培养液中进行生物转化，能够明显提高甲基泼尼龙格氏物在发酵培养液中的溶解和分散性能，从而实现了甲基泼尼龙格氏物与简单节杆菌的有效接触，大大提高了甲基泼尼龙格氏物的投料浓度和转化率；此外，由于打浆时所采用的溶剂为水(例如饮用水等)，不含有任何其它有机溶剂，对生物转化时的发酵体系没有毒害作用，更加有利于简单节杆菌对底物的发酵转化。

本发明对加水打浆的方式不作严格限制；具体地，加水打浆时，可以控制水与甲基泼尼龙格氏物的质量比为(3-4)：1；同时，可以控制打浆时的搅拌速度为120-200r/min，打浆时间为20-60min。

在本发明中，对甲基泼尼龙格氏物不作严格限制，例如可以选自如下化合物中的至少一种：

11β，17α-二羟基-孕甾-4-烯-3，20-二酮；

17α，21-二羟基-孕甾-4-烯3，11，20-三酮-21-醋酸酯；

11β，17α，21-三羟基-孕甾-4-烯-3，20-二酮-21-醋酸酯；

17α-羟基-孕甾-4-烯-3，11，20-三酮；

6α-甲基-11α，17α，21-三羟基-孕甾-4-烯-3，20-二酮-21-醋酸酯；

11α，17α-二羟基-孕甾-4-烯-3，20-二酮；

11α，17α，21-三羟基-孕甾-4-烯-3，20-二酮-21-醋酸酯；

6α-甲基-11α-羟基-孕甾-4，16-二烯-3，20-二酮；

11α-羟基-16α，17α-环氧-孕甾-4-烯-3，20-二酮；

11α-羟基-孕甾-4，16-二烯-3，20-二酮；

6α-甲基-11α-羟基-16α，17α-环氧-孕甾-4-烯-3，20-二酮；

6α-甲基-11α，21-二羟基-16α，17α-环氧-孕甾-4-烯-3，20-二酮-21-醋酸酯。

优选地，甲基泼尼龙格氏物为11β，17α-二羟基-孕甾-4-烯-3，20-二酮、6α-甲基-11α-羟基-孕甾-4，16-二烯-3，20-二酮、11α-羟基-16α，17α-环氧-孕甾-4-烯-3，20-二酮。

此外，本发明对所采用的简单节杆菌不作严格限制，可以是本领域常规用于C_1,2位置脱氢的简单节杆菌，例如简单节杆菌AS 1.754等。

进一步地，本发明的步骤A)还可以包括：向加水打浆后的浆料中加入分散剂并混匀。研究发现，分散剂的添加能够进一步提高甲基泼尼龙格氏物的投料浓度和转化率，相对于现有技术的粉碎或以溶剂溶解的预处理方式，本发明的上述投料前处理更加科学，不仅处理工艺简单，并且不使用有毒有害的溶剂，甲基泼尼龙格氏物1,2位脱氢的效率大大提高。

本发明对上述分散剂的种类以及添加量不作严格限制；具体地，可以控制分散剂与浆料的质量比为(0.01-0.05)：1；此外，分散剂可以选自甲醇、乙醇、聚醚消泡剂和DMF中的至少一种。

进一步地，本发明的步骤A)还可以包括：对浆液进行高温灭菌，随后冷却；其中，高温灭菌的温度可以为121-125℃，高温灭菌的时间可以为20-35分钟。对浆液进行高温灭菌能够避免杂菌影响，进而保证简单节杆菌对甲基泼尼龙格氏物的生物转化效果。

在一实施方式中，甲基泼尼龙格氏物浆液的制备方法可以包括：

采用饮用水对甲基泼尼龙格氏物进行搅拌打浆，得到浆料；

向所述浆料中加入分散剂，混匀，随后进行高温灭菌，得到甲基泼尼龙格氏物浆液。

在本发明中，步骤B)可以包括：将浆液投加到简单节杆菌的发酵培养液中进行生物转化。可以理解，发酵培养液是对简单节杆菌进行培养后形成的发酵液；在本发明中，可以采用本领域的常规方法对简单节杆菌进行培养，并且可以根据实际需求对简单节杆菌进行逐级扩大培养，从而获得上述发酵培养液。经发酵培养后，发酵培养液中的简单节杆菌的活性高，在投加含有甲基泼尼龙格氏物的浆液后，能够快速地与甲基泼尼龙格氏物接触并进行生物转化。

进一步地，在生物转化时，可以将所述浆液分次投加到所述发酵培养液中；采用分次投加的方式能够避免一次投料后底物对菌种的毒害作用，更加有利于甲基泼尼龙格氏物的转化。

本发明对上述分次投加的次数不作严格限制，具体可以为2-5次，例如4次；进一步地，可以控制相邻两次投加之间的时间间隔为9-15h。

在本发明中，生物转化时，甲基泼尼龙格氏物的投加浓度可以为5-8％；即，每100mL发酵培养液中投加甲基泼尼龙格氏物5-8g；优选地，甲基泼尼龙格氏物的投加浓度可以为7-8％。研究发现：通过上述底物预处理方式，能够极大地提高甲基泼尼龙格氏物的底物浓度，其减少了发酵转化的批次，降低了产品的损失率，提高了收率，特别有利于甲基泼尼松龙脱氢物的工业化生产。

本发明对生物转化的条件不作严格限制；具体地，可以控制所述生物转化时的温度为30-34℃，时间为30-48h。经上述生物转化后，甲基泼尼松龙脱氢物的转化率高达94-96％。

在本发明中，可以理解，所述生产方法还可以包括：对所述生物转化后的发酵培养液进行分离、纯化，得到甲基泼尼松龙脱氢物。对发酵培养液的分离、纯化方式不作严格限制，可以采用本领域的常规方法。

本发明的实施，至少具有以下优势：

1、本发明的生产方法不使用有机溶剂，在生物转化时不会对微生物造成毒害作用，同时对甲基泼尼松龙脱氢物产品的质量造成不利影响；

2、本发明的生产方法能够明显提高甲基泼尼龙格氏物在发酵培养液中的溶解和分散性能，甲基泼尼龙格氏物与简单节杆菌能够形成良好且有效的接触，从而大大提高了甲基泼尼龙格氏物的投料浓度和转化率；

3、在本发明的生产方法中，底物投加浓度可高达7-8％，该较高的底物投加浓度有利于减少发酵转化的批次，进而降低产品的损失率，提高产品的收率，特别有利于甲基泼尼松龙脱氢物的工业化生产；

4、在本发明的生产方法中，甲基泼尼松龙脱氢物的转化率高达94-96％，该较高的转化率不仅有利于降低原料损失并提高产品收率，同时有利于产品的后续精制，经济效益显著。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

一、甲基泼尼龙格氏物的预处理

本实施例采用的甲基泼尼龙格氏物具体为11β，17α-二羟基-孕甾-4-烯-3，20-二酮，分散剂具体为乙醇。

将饮用水与上述甲基泼尼龙格氏物以质量比4：1进行混合，随后在搅拌速度为150r/min下进行搅拌打浆，搅拌打浆时间为20min，得到浆料。

向上述浆料中加入分散剂，分散剂与浆料的质量比为0.03：1，搅拌混匀后，升温至121℃左右灭菌25分钟，随后降温至常温，得到甲基泼尼龙格氏物浆液。

二、菌种培养

本实施例采用的发酵培养基为：葡萄糖2.5％，酵母膏0.3％，磷酸二氢钾0.4％，pH值为7.0-7.2。

一级培养：对简单节杆菌进行活化，随后接入装有30mL上述发酵培养基的250mL三角瓶中，于32℃、150r/min的条件下振荡培养15小时左右，得到一级培养液。

二级培养：将上述一级培养液按2％的接种量接入装有150mL上述发酵培养基的1000mL三角瓶中，于32℃、150r/min的条件下振荡培养15小时左右，得到二级培养液。

发酵培养：在5L发酵罐中接入二级培养液，于32℃、150r/min的条件下发酵培养12小时左右，得到发酵培养液。

三、甲基泼尼龙格氏物的生物转化

将处理好的甲基泼尼龙格氏物浆液按照总投加浓度为6％，分四次投加到上述发酵培养液中进行生物转化，每次投加量为总投加量的1/4；控制生物转化时的温度为32℃左右，各次投加后的生物转化时间为10h，总生物转化时间为40h。

四、底物转化率测定

底物转化率采用反应过程中转化为产物的底物质量占初始底物总质量的百分比来表示。测定方法如下：

采用HPLC测定，分离柱为C18柱，检测波长为240nm，流动相是乙腈∶水(体积比)＝60∶40，流速为1.5mL/min。采用面积归一法计算底物转化率。

测定结果表明：本实施例底物甲基泼尼龙格氏物的转化率为95.5％。

实施例2

一、甲基泼尼龙格氏物的预处理

本实施例采用的甲基泼尼龙格氏物具体为11α，17α，21-三羟基-孕甾-4-烯-3，20-二酮-21-醋酸酯，分散剂具体为甲醇。

将饮用水与上述甲基泼尼龙格氏物以质量比3：1进行混合，随后在200r/min的搅拌速度下进行搅拌打浆，搅拌打浆时间为40min，得到浆料。

向上述浆料中加入分散剂，分散剂与浆料的质量比为0.01：1，搅拌混匀后，升温至121℃左右灭菌35分钟，随后降温至常温，得到甲基泼尼龙格氏物浆液。

二、菌种培养

本实施例的菌种一级培养、二级培养方式与实施例1相同；在5L发酵罐中接入二级培养液，于30℃、180r/min的条件下发酵培养15小时左右，得到发酵培养液。

三、甲基泼尼龙格氏物的生物转化

将处理好的甲基泼尼龙格氏物浆液按照总投加浓度为8％，分四次投加到上述发酵培养液中进行生物转化，每次投加量为总投加量的1/4；其中，生物转化时的温度为30℃左右，各次投加后的生物转化时间为12h，总生物转化时间为48h。

四、底物转化率测定

采用实施例1的测定方法对底物转化率进行测定；结果表明：本实施例底物甲基泼尼龙格氏物的转化率为94.5％。

实施例3

一、甲基泼尼龙格氏物的预处理

本实施例采用的甲基泼尼龙格氏物具体为6α-甲基-11α-羟基-16α，17α-环氧-孕甾-4-烯-3，20-二酮，分散剂具体为二甲基甲酰胺(DMF)。

将饮用水与上述甲基泼尼龙格氏物以质量比4：1进行混合，随后在130r/min的搅拌速度下进行搅拌打浆，搅拌打浆时间为50min，得到浆料。

向上述浆料中加入分散剂，分散剂与浆料的质量比为0.05：1，搅拌混匀后，升温至125℃左右灭菌20分钟，随后降温至常温，得到甲基泼尼龙格氏物浆液。

二、菌种培养

本实施例的菌种一级培养、二级培养方式与实施例1相同；在5L发酵罐中接入二级培养液，于32℃、165r/min的条件下发酵培养10小时左右，得到发酵培养液。

三、甲基泼尼龙格氏物的生物转化

将处理好的甲基泼尼龙格氏物浆液按照总投加浓度为7％，分五次投加到上述发酵培养液中进行生物转化，每次投加量为总投加量的1/5；其中，生物转化时的温度为34℃左右，各次投加后的生物转化时间为9h，总生物转化时间为45h。

四、底物转化率测定

采用实施例1的测定方法对底物转化率进行测定；结果表明：本实施例底物甲基泼尼龙格氏物的转化率为94.9％。

实施例4

一、甲基泼尼龙格氏物的预处理

本实施例采用的甲基泼尼龙格氏物具体为11β，17α-二羟基-孕甾-4-烯-3，20-二酮，分散剂具体为甲醇。

将饮用水与上述甲基泼尼龙格氏物以质量比3：1进行混合，随后在200r/min的搅拌速度下进行搅拌打浆，搅拌打浆时间为30min，得到浆料。

向上述浆料中加入分散剂，分散剂与浆料的质量比为0.02：1，搅拌混匀后，升温至121℃左右灭菌30分钟，随后降温至常温，得到甲基泼尼龙格氏物浆液。

二、菌种培养

本实施例的菌种一级培养、二级培养方式与实施例1相同；在5L发酵罐中接入二级培养液，于30℃、180r/min的条件下发酵培养15小时左右，得到发酵培养液。

三、甲基泼尼龙格氏物的生物转化

将处理好的甲基泼尼龙格氏物浆液按照总投加浓度为6％，分四次投加到上述发酵培养液中进行生物转化，每次投加量为总投加量的1/4；其中，生物转化时的温度为30℃左右，各次投加后的生物转化时间为10h，总生物转化时间为40h。

四、底物转化率测定

采用实施例1的测定方法对底物转化率进行测定；结果表明：本实施例底物甲基泼尼龙格氏物的转化率为94.3％。

实施例5

一、甲基泼尼龙格氏物的预处理

本实施例采用的甲基泼尼龙格氏物具体为11β，17α-二羟基-孕甾-4-烯-3，20-二酮，分散剂具体为乙醇。

将饮用水与上述甲基泼尼龙格氏物以质量比4：1进行混合，随后在搅拌速度为120r/min下进行搅拌打浆，搅拌打浆时间为20min，得到浆料。

将上述浆料中升温至121℃左右灭菌25分钟，随后降温至常温，得到甲基泼尼龙格氏物浆液。

二、菌种培养

本实施例的菌种一级培养、二级培养方式与实施例1相同；在5L发酵罐中接入二级培养液，于30℃、180r/min的条件下发酵培养15小时左右，得到发酵培养液。

三、甲基泼尼龙格氏物的生物转化

将处理好的甲基泼尼龙格氏物浆液按照总投加浓度为6％，分四次投加到上述发酵培养液中进行生物转化，每次投加量为总投加量的1/4；其中，生物转化时的温度为30℃左右，各次投加后的生物转化时间为10h，总生物转化时间为40h。

四、底物转化率测定

采用实施例1的测定方法对底物转化率进行测定；结果表明：本实施例底物甲基泼尼龙格氏物的转化率为91.3％。

对照例1

采用实施例1的菌种培养方式对简单节杆菌(与实施例1相同)进行培养，得到发酵培养液。

将甲泼尼龙格氏物磨成细粉后，按照总投加浓度为4％(高于4％易结晶析出)分四次投加到上述发酵培养液中进行生物转化，每次投加量为总投加量的1/4；控制生物转化时的温度为32℃左右，各次投加后的生物转化时间为10h，总生物转化时间为40h。

采用实施例1的测定方法对底物转化率进行测定；结果表明：本实施例底物甲基泼尼龙格氏物的转化率仅为80％左右。

对照例2

以11α，17α，21-三羟基-孕甾-4-烯-3，20-二酮-21-醋酸酯为底物；将简单节杆菌AS 1.754依次进行斜面培养、一级培养和二级培养，培养温度为30℃，将溶于DMF的底物投入5L发酵罐中，投料浓度为2％，反应温度为30℃，反应时间为68小时。

采用实施例1的测定方法对底物转化率进行测定；结果表明：本对照例底物甲基泼尼龙格氏物的转化率为70.1％。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (6)

1.一种甲基泼尼松龙脱氢物的生产方法，其特征在于，包括：

A)将甲基泼尼龙格氏物加水打浆，制得浆液；

B)利用简单节杆菌AS 1.754将浆液中的甲基泼尼龙格氏物生物转化为甲基泼尼松龙脱氢物；

步骤A)中，加水打浆时，控制水与甲基泼尼龙格氏物的质量比为(3-4)：1；控制打浆时的搅拌速度为120-200r/min，打浆时间为20-60min；

步骤A)还包括：向加水打浆后的浆料中加入分散剂并混匀，控制分散剂与浆料的质量比为(0.01-0.05)：1，分散剂选自甲醇、乙醇、聚醚消泡剂和DMF中的至少一种；

步骤B)中，生物转化时，甲基泼尼龙格氏物的投加浓度为5-8％；

步骤B)包括：将浆液分次投加到简单节杆菌的发酵培养液中进行生物转化，控制所述分次投加的次数为2-5次，控制相邻两次投加之间的时间间隔为9-15h。

2.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，步骤A)中，甲基泼尼龙格氏物选自11β，17α-二羟基-孕甾-4-烯-3，20-二酮、17α，21-二羟基-孕甾-4-烯3，11，20-三酮-21-醋酸酯、11β，17α，21-三羟基-孕甾-4-烯-3，20-二酮-21-醋酸酯、17α-羟基-孕甾-4-烯-3，11，20-三酮、6α-甲基-11α，17α，21-三羟基-孕甾-4-烯-3，20-二酮-21-醋酸酯、11α，17α-二羟基-孕甾-4-烯-3，20-二酮、11α，17α，21-三羟基-孕甾-4-烯-3，20-二酮-21-醋酸酯、6α-甲基-11α-羟基-孕甾-4，16-二烯-3，20-二酮、11α-羟基-16α，17α-环氧-孕甾-4-烯-3，20-二酮、11α-羟基-孕甾-4，16-二烯-3，20-二酮、6α-甲基-11α-羟基-16α，17α-环氧-孕甾-4-烯-3，20-二酮、6α-甲基-11α，21-二羟基-16α，17α-环氧-孕甾-4-烯-3，20-二酮-21-醋酸酯中的至少一种。

3.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，步骤A)还包括：对浆液进行高温灭菌，随后冷却。

4.根据权利要求3所述的生产方法，其特征在于，高温灭菌的温度为121-125℃，高温灭菌的时间为20-35分钟。

5.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，步骤B)中，生物转化时，甲基泼尼龙格氏物的投加浓度为7-8％。

6.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，步骤B)中，控制生物转化时的温度为30-34℃，时间为30-48h。