CN103013891A - 一株肠膜明串珠菌及其胞外多糖与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)菌株和该菌株的胞外多糖以及该胞外多糖的制备方法，还公开了一种增稠组合物及前述胞外多糖或前述增稠组合物在食品、制药和相关领域的应用。该肠膜明串珠菌菌株的保藏号为CGMCC NO.6432；该胞外多糖为葡聚糖，其平均重量分子量在974～5230kDa之间；所述增稠组合物包括前述肠膜明串珠菌的胞外多糖和生理学上可接受的载体。本发明所述的胞外多糖水溶性好，且在低浓度时具有很好的粘度、很好的表面活性、很好的蛋白质可混性及极好的稳定性/乳化性；本发明的制备方法获得的胞外多糖或粗品产量高，应用前景十分广阔。
Description
技术领域
本发明涉及一株新的肠膜明串珠菌菌株及其胞外多糖，以及该胞外多糖的制备方法和应用。
背景技术
微生物胞外多糖是指某些特定微生物（如乳酸菌、土壤杆菌、根瘤菌等）在生长代谢过程中分泌到细胞壁外的一类糖类化合物，其中，依附于微生物细胞壁外的多糖被称为荚膜多糖，而粘液多糖则以渗透于生长环境中的形式存在。
微生物胞外多糖不但可以赋予发酵乳制品特殊的风味，还具有一定的降血脂、免疫调节和抗肿瘤等保健功能。更重要的是，随着生活质量的不断提高，与我们每个人日常生活息息相关的一些食品添加剂（如增稠剂、乳化剂、稳定剂等）的食品安全问题越来越受到消费者的重视，因此，寻找来源明确、产量稳定、功能多样的新型食品添加剂越来越受到研究者的重视。
发明内容
本发明的目的是提供一株新的肠膜明串珠菌菌株和由该菌株所产生的胞外多糖，以及该胞外多糖的制备方法和应用。本发明的目的是通过以下技术方案来实现的。
本发明提供的技术方案之一是：一株肠膜明串珠菌菌株，其是保藏号为CGMCC NO.6432的肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)菌株。
该菌株经16S rRNA基因测序的结果如SEQ ID NO.1所示。
本发明提供的技术方案之二是：一种肠膜明串珠菌的胞外多糖，所述的胞外多糖为葡聚糖，该胞外多糖的平均重量分子量在974～5230kDa之间。
本发明中，所述的胞外多糖为一种纯白色的丝状物或粉末；5.0mg/mL的所述胞外多糖水溶液澄清透明、无色、无味，pH值为6.0～7.1。
本发明中，所述的胞外多糖可以由前述保藏号为CGMCC NO.6432的肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)菌株产生，也可以由其它的可以产胞外多糖的肠膜明串珠菌菌株产生。较佳地，所述的胞外多糖由前述保藏号为CGMCC NO.6432的肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)菌株所产生。
本发明提供的技术方案之三是：一种如前所述的肠膜明串珠菌的胞外多糖的制备方法。
本发明中，所述的制备方法可以是将所述的肠膜明串珠菌按照现有技术内常规的培养方法培养得到发酵液，然后将发酵液采用常规的多糖分离方法分离得到胞外多糖。
较佳地，所述的制备方法包括如下步骤：
（1）将肠膜明串珠菌的种子液以体积比0.5～4.0%(v/v)的接种量接种于无菌培养基，于25～34℃培养24～120h得发酵液；其中，所述的无菌培养基为含有质量比为6.0～12.0%(w/w)脱脂乳粉和质量体积比为2.5～10.0%(w/v)蔗糖的脱脂乳蔗糖溶液，并在95～135℃下灭菌20～30min制成；
（2）将步骤（1）所得的发酵液在95～100℃加热10～30min，冷却至15~25℃后，调节pH至4.4～4.8，静置3～5h，离心取上清，加入2～4倍体积的80～100%乙醇于离心后的上清液中，静置4～24h，离心收集沉淀物并将沉淀物溶于水，得沉淀物的水溶液；
（3）将步骤（2）所得的沉淀物水溶液干燥后即得胞外多糖粗品。
本发明中，所述的胞外多糖粗品包括85～95%的前述肠膜明串珠菌胞外多糖和5～15%的游离蛋白，所述的百分比为质量百分比。
本发明中，较佳地，步骤（1）所述的肠膜明串珠菌的种子液为前述保藏号为CGMCC NO.6432的肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)菌株的种子液。
本发明步骤（1）所述的无菌培养基打破了常规纯化学培养基发酵明串 珠菌的局限性，创新性地运用脱脂乳蔗糖溶液作为明串珠菌的发酵基料，在降低物料成本的同时，令发酵条件更简单可行。与传统的纯化学培养基相比，天然来源的培养基料经明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)发酵而获得的胞外多糖更具食品安全保障性，而且，使用脱脂乳蔗糖溶液培养明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)获得的发酵液中胞外多糖的产量显著提高。
本发明中，步骤（2）较佳地为：将步骤（1）所得的发酵液在95～100℃加热10～30min，冷却至室温后，用盐酸或食品级的乳酸调节pH至4.6，静置4h，9000rpm离心10min，取上清，加入2～4倍(v/v)的80～100%乙醇于上述离心后的上清液中，静置过夜，9000rpm离心10min，收集沉淀物并溶于蒸馏水，得沉淀物的水溶液。
本发明中，步骤（3）所述干燥的方式为本领域常规，可以直接进行冷冻干燥或者在温度不超过115℃下干燥或者真空冷冻干燥。
本发明中，较佳地，在步骤（3）之后还包括步骤（4）：将制得的胞外多糖粗品进行进一步的纯化，以去除蛋白和杂质。
本发明中，步骤（4）所述进一步的纯化可以是现有技术中的任何常规的分离纯化的步骤。
较佳地，步骤（4）所述进一步的纯化是采用三氯乙酸法去除蛋白和采用透析法去除其它杂质。
所述的三氯乙酸法为将胞外多糖粗品用50～80℃蒸馏水溶解，使胞外多糖粗品的终浓度为0.5～1.0%，待溶液冷却至20～25℃时加入三氯乙酸，使三氯乙酸的最终质量浓度为2～4%(w/v)，再将溶液于2～8℃静置8～16h，离心或过滤去除沉淀物。
所述的透析法为将去除沉淀后的胞外多糖溶液用截留分子量为10000道尔顿的透析膜在2～8℃透析48～60h；在透析过程中较佳地还可以进行多次换水。
更佳地，步骤（4）还包括，经过透析后的多糖溶液还可以采用凝胶排 阻层析的方法进行更进一步的纯化。
本发明中，较佳地，步骤（4）所述进一步的纯化后的多糖溶液可进行干燥以获得粉末状的肠膜明串珠菌胞外多糖，干燥方法可以为本领域常规，较佳地选自热风干燥、低温干燥、冷风干燥、冷冻干燥、真空干燥和真空冷冻干燥中的任一种，更佳的干燥方法选自冷风干燥、冷冻干燥、真空干燥和真空冷冻干燥中的任一种。
本发明提供的技术方案之四是：一种增稠组合物，其包括前述胞外多糖和生理学上可接受的载体。
本发明中，所述的生理学上可接受的载体为常规，可以是食品领域常规的增稠剂辅料，如食品胶、淀粉等，也可以是其他领域符合国家相应标准的增稠剂辅料。
本发明提供的技术方案之五是：前述胞外多糖或增稠组合物在食品、制药和相关领域的应用。
本发明中，由于肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)胞外多糖或多糖粗品能很好的溶于水形成胶态水溶性聚合物，能在低浓度时具有很高的粘度、很好的表面活性、很好的蛋白质可混性以及极好的稳定性/乳化性。基于这些性质，本发明所述胞外多糖或胞外多糖粗品可以被用作增稠剂、稳定剂、悬浮剂、乳化剂或润滑剂及其相关用途。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
本发明所述肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)菌株的胞外多糖水溶性好，且在低浓度时具有很好的粘度、很好的表面活性、很好的蛋白质可混性以及极好的稳定性/乳化性。本发明的制备方法获得的肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)胞外多糖或多糖粗品产量高，食品安全性强，其 可以作为添加剂应用于食品、制药和相关领域中，应用前景十分广阔。
生物材料保藏信息
本发明提供的肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)菌株，已于2012年8月13日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101。该菌株的保藏编号为：CGMCC No.6432。
附图说明
以下结合附图说明本发明的特征和有益效果。
图1显示28℃、180rpm的好氧条件下，不同接种量对肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)Leuco4胞外多糖粗品产量的影响；
图2显示28℃、180rpm的好氧条件下，不同脱脂乳浓度对(Leuconostoc mesenteroides)Leuco4胞外多糖粗品产量的影响；
图3显示28℃、180rpm的好氧条件下，不同蔗糖浓度对(Leuconostoc mesenteroides)Leuco4胞外多糖粗品产量的影响；
图4显示180rpm的好氧条件下，不同发酵温度对(Leuconostoc mesenteroides)Leuco4胞外多糖粗品产量的影响；
图5显示最适条件下肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)Leuco4在脱脂乳蔗糖培养基和纯化学培养基中的产胞外多糖能力的比较；
图6显示肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)Leuco4胞外多糖（纯品）糖基组成的色谱分析结果。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常 规方法和条件，或按照商品说明书选择。本发明中所述的室温是指进行试验的操作间的温度，一般为25℃。
实施例1菌株的获得
本发明中的肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)菌株通过如下途径获得：以无菌药勺取云南来源的泡菜1克，并用无菌生理盐水系列稀释，通过涂布的方式将稀释液均匀涂布于无菌的M17蔗糖琼脂培养基（以5%(w/v)蔗糖取代M17培养基中0.5%(w/v)的乳糖，OXOID LTD.，英国）上，28℃培养24小时，选取拉丝性好，菌落光滑有明显突起的菌落，转接到蔗糖M17蔗糖液体培养基中，于28℃、180rpm摇床培养48h，将发酵液在100℃加热20min，冷却至20℃后，用食品级的乳酸或盐酸调节pH至4.60，静置4h，9000rpm离心10min，取上清，加入3倍(v/v)的95%乙醇于上述离心后的上清液中，静置过夜，9000rpm离心10min，收集沉淀物并溶于蒸馏水，将该沉淀物水溶液直接冷冻干燥即得胞外多糖粗品，通过苯酚硫酸法对不同菌株的胞外多糖粗品中多糖的含量进行测定，筛选出一株高产胞外多糖的菌株BD01710。
该菌株经16S rRNA基因测序的结果如SEQ ID NO.1所示。根据其生理生化特性及16S rRNA序列分析的结果，经中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）鉴定为(Leuconostoc mesenteroides)菌种，并将其命名为(Leuconostoc mesenteroides)Leuco4。该菌株已于2012年08月13日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101。该菌株的保藏编号为：CGMCC NO.6432。
该菌株的微生物学特性如表1所示：
表1(Leuconostoc mesenteroides)Leuco4菌株理化试验结果
实施例2
肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)Leuco4发酵条件的优化
种子液（发酵菌种）的制备：将肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)Leuco4(CGMCC No.6432)的冻干粉以少量无菌蒸馏水溶解，用接种环挑取一环划线于M17蔗糖琼脂培养基上，28℃好氧培养24h取出，用接种环挑取单菌落放入1mL M17蔗糖液体培养基中，运用涡旋震荡器将菌落均匀分散于该液体培养基内，28℃、180rpm摇床培养48h取出，以2%(v/v)接种量接种于50mL上述M17蔗糖液体培养基中，再次于28℃、180rpm摇床培养48h，将培养物9000rpm离心10min，弃去上清，沉淀部分以无菌蒸馏水洗涤2次后，用原培养体积的无菌蒸馏水悬浮，得到发酵用的种子液(即工作发酵剂)。
脱脂乳蔗糖培养基的制备：将6.0～12.0%(w/w)脱脂乳粉与2.5～10.0%(w/v)蔗糖按一定配比与蒸馏水混匀，充分溶解后，在95～135℃下灭菌20～30min即得所需浓度的无菌脱脂乳蔗糖培养基。
纯化学培养基的制备：将蛋白胨10g、酵母抽提物5g、蔗糖50g、K2HPO420g、MgSO4·7H200.2g、MnSO40.01g、NaCl0.01g、CaCl20.02g、FeSO40.01g与1L蒸馏水混匀，充分溶解后，在95～135℃下灭菌20～30min即得所需的无菌纯化学培养基。
发酵液中胞外多糖纯品的制备：将发酵液在95～100℃加热10～30min，冷却至室温后，用食品级的乳酸或盐酸调节pH至4.4~4.8，静置3~5h，9000rpm离心10min，取上清，加入2～4倍(v/v)的80～100%乙醇于上述离心后的上清液中，静置过夜，9000rpm离心10min，收集沉淀物并溶于蒸馏水，再向沉淀物水溶液中加入三氯乙酸，使其终浓度达到2～4％(v/v)，8～16h静置，然后离心获得发酵上清液，该上清液用截留量为10000D的透析袋在蒸馏水中透析48～60h，每6~10h换水一次，袋内透析液经冷冻干燥或者在温度不超过115℃下干燥或者真空冷冻干燥即得胞外多糖纯品。
发酵液中胞外多糖粗品（胞外多糖粗品）的制备：将发酵液在95～100℃加热10～30min，冷却至15~25℃后，用食品级的乳酸或盐酸调节pH至4.60，静置4h，9000rpm离心10min，取上清，加入2～4倍(v/v)的80～100%乙醇于上述离心后的上清液中，静置过夜，9000rpm离心10min，收集沉淀物并溶于蒸馏水，将该沉淀物水溶液直接冷冻干燥或者在温度不超过115℃下干燥或者真空冷冻干燥即得胞外多糖粗品(胞外多糖粗品)。
（2）不同接种量对肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)Leuco4胞外多糖产量的影响
分别将肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)Leuco4种子液（按上述方法制备的工作发酵剂）按0.5%、1.0%、2.0%、4.0%(v/v)的接种量接入上述方法制备的脱脂乳蔗糖培养基中，该脱脂乳蔗糖培养基中含脱脂乳10%(w/w)、蔗糖5%(w/v)，28℃、180rpm摇床培养，并于不同的培养时间，取发酵液按上述方法制备胞外多糖粗品并称重。
所获得的发酵液中胞外多糖粗品的含量为0.056~11.743g/L，结果见图1。接种量为0.5%(v/v)的发酵液中胞外多糖粗品含量为0.056～10.589g/L， 接种量为1.0%(v/v)的发酵液中胞外多糖粗品含量为0.072～10.786g/L，接种量为2.0%(v/v)的发酵液中胞外多糖粗品含量为0.125～11.300g/L，接种量为4.0%(v/v)的发酵液中胞外多糖粗品含量为0.136～11.743g/L。由此可见，较佳的接种量为2.0～4.0%(v/v)，最佳的是2.0%(v/v)，发酵时间较佳地为80～90h。
（3）不同脱脂乳浓度对肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)Leuco4多糖产量的影响
分别将肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)Leuco4种子液（按上述方法制备的工作发酵剂）以2%的接种量接入脱脂乳含量为6%、8%、10%、12%(w/w)，蔗糖含量为5%(w/v)的脱脂乳蔗糖培养基中，28℃、180rpm摇床培养48h，发酵结束后将发酵液按上述方法制备多糖粗品并称重。
所获得的发酵液中胞外多糖粗品的含量为6.523～6.812g/L，结果见图2。脱脂乳含量为6%(w/w)的发酵液中胞外多糖粗品含量为6.714g/L，脱脂乳含量为8%(w/w)的发酵液中胞外多糖粗品含量为6.523g/L，脱脂乳含量为10%(w/w)的发酵液中胞外多糖粗品含量为6.812g/L，脱脂乳含量为12%(w/w)的发酵液中胞外多糖粗品含量为6.668g/L。由此可见，脱脂乳浓度对肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)Leuco4胞外多糖粗品产量无显著影响，最佳的脱脂乳浓度为10%(w/w)。
（4）不同蔗糖浓度对肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)Leuco4多糖产量的影响
分别将肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)Leuco4种子液（按上述方法制备的工作发酵剂）以2%的接种量接入脱脂乳含量为10%(w/w)，蔗糖含量为2.5%、5.0%、7.5%、10%(w/v)的脱脂乳蔗糖培养基中，28℃、180rpm摇床培养48h，发酵结束后将发酵液按上述方法制备多糖粗品并称重。
所获得的发酵液中胞外多糖粗品的含量为4.982~7.142g/L，结果见图3。含有2.5%(w/v)蔗糖的发酵液中胞外多糖粗品含量为4.982g/L，含有5.0%(w/v)蔗糖的发酵液中胞外多糖粗品含量为7.142g/L，含有7.5%(w/v) 蔗糖的发酵液中胞外多糖粗品含量为6.594g/L，含有10.0%(w/v)蔗糖的发酵液中胞外多糖粗品含量为6.426g/L。由此可见，较佳的蔗糖浓度为5.0-10.0%(w/v)，最佳的是5.0%(w/v)。
（5）不同发酵温度对肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)Leuco4多糖产量的影响
将肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)Leuco4种子液(上述方法制备的工作发酵剂)以2%(v/v)接种量接入上述方法制备的脱脂乳蔗糖培养基中，该脱脂乳蔗糖培养基中含脱脂乳10%(w/w)，蔗糖5%(w/v)，分别置于25℃、28℃、31℃、34℃、转速为180rpm的摇床培养48h发酵结束后将发酵液按上述方法制备胞外多糖粗品并称重。
所获得的发酵液中胞外多糖粗品的含量为0.476~7.142g/L，结果见图4。25℃条件下获得的发酵液中胞外多糖粗品含量为6.74g/L，28℃条件下获得的发酵液中胞外多糖粗品含量为7.142g/L，31℃条件下获得的发酵液中胞外多糖粗品含量为6.294g/L，34℃条件下获得的发酵液中胞外多糖粗品含量为0.476g/L。由此可见，较佳的发酵温度为25~31℃，最佳的是28℃。
（6）最适条件下肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)Leuco4在脱脂乳蔗糖培养基和纯化学培养基中的产糖能力比较
将肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)Leuco4种子液(按上述方法制备的工作发酵剂)以2%(v/v)接种量接入上述方法制备的脱脂乳蔗糖培养基和纯化学培养基中，该脱脂乳蔗糖培养基中含脱脂乳10%(w/w)，蔗糖5%(w/v)，28℃、180rpm摇床培养120h，取不同培养时间的发酵液按上述方法制备胞外多糖粗品并称重。
相同发酵条件下，肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)Leuco4发酵脱脂乳蔗糖培养基所获得的发酵液中胞外多糖粗品含量为0.358～12.364g/L，发酵纯化学培养基所获得的发酵液中胞外多糖粗品含量为0.72～6.51g/L，结果见图5。
肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)Leuco4于脱脂乳蔗糖培养基 发酵时，16h的发酵液中胞外多糖粗品含量为0.358g/L，24h的发酵液中胞外多糖粗品含量为1.13g/L，40h的发酵液中胞外多糖粗品含量为5.064g/L，48h的发酵液中胞外多糖粗品含量为6.436g/L，56h的发酵液中胞外多糖粗品含量为9.510g/L，72h的发酵液中胞外多糖粗品含量为9.612g/L，80h的发酵液中胞外多糖粗品含量为12.364g/L，104h的发酵液中胞外多糖粗品含量为11.300g/L。
肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)Leuco4于纯化学培养基发酵时，16h的发酵液中胞外多糖粗品的含量为0.720g/L，24h的发酵液中胞外多糖粗品含量为1.775g/L，40h的发酵液中胞外多糖粗品含量为5.885g/L，48h的发酵液中胞外多糖粗品含量为6.025g/L，64h的发酵液中胞外多糖粗品含量为6.105g/L，72h的发酵液中胞外多糖粗品含量为6.160g/L，88h的发酵液中胞外多糖粗品含量为6.400g/L，96h的发酵液中胞外多糖粗品含量为6.510g/L，112h的发酵液中胞外多糖粗品含量为5.750g/L。
比较肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)Leuco4在上述两种培养基中的产糖特性后发现，脱脂乳蔗糖培养基是肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)Leuco4发酵产糖的优选培养基，在该优选培养基中，其优选的发酵时间为80～100h，最佳的发酵时间为90h。
实施例3肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)Leuco4胞外多糖的单糖组成测定
取上述方法制备的胞外多糖纯品，以高效阴离子色谱法测定多糖的单糖组成。
（1）多糖水解
吸取100μL浓度为4~5mg/mL的多糖样品溶液于5mL的具塞刻度试管中，加入100μL的4moL/L TFA，充N2封管，110℃烘箱中水解2h；冷却后打开盖，加200μL甲醇后用N2吹干，如此重复加甲醇并用N2吹3次，去除TFA，将其残渣用水溶解定容至5mL，用0.45μm微孔膜过滤后供进样分析。
（2）色谱条件
色谱柱：CarboPac PA203mm i.d.×150mm；
流动相：A，H2O；B，250mmol/L NaOH；C，1mol/L NaAc；
三元梯度洗脱：流速：0.5mL/min；积分脉冲安培检测器；
Au工作电极：Ag/AgCl参比电极，
进样体积：20μL；柱温：30℃。
肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)Leuco4胞外多糖样品糖基组成的色谱分析结果见图6，该多糖在10.450min有单一吸收峰，且该吸收峰的保留时间与葡萄糖标品保留时间一致。
结论：肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)Leuco4胞外多糖是由葡萄糖单一糖基组成。
实施例4肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)Leuco4胞外多糖分子量的测定
将肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)Leuco4种子液（按上述方法制备的工作发酵剂）按2.0%(v/v)的接种量接入实施例1中所述方法制备的脱脂乳蔗糖培养基中，该脱脂乳蔗糖培养基中含脱脂乳10%(w/w)、蔗糖5%(w/v)，25℃、180rpm摇床培养104h，所得发酵液以实施例1中所述方法制备胞外多糖（纯品），并用重蒸水配制成5mg/mL的溶液，进行高效液相（HPLC）分析：将不同分子量的标准Dextran相继进样，记录保留时间TR，以TR为横坐标，LgM为纵坐标绘制标准曲线，得出分子量与保留时间TR的回归方程。待测样品按以下步骤进样，根据所得TR，推算胞外多糖的分子量分布。
高效液相色谱条件：
色谱仪：Waters2690；
检测器：Waters2410示差折光检测器和紫外检测器；
色谱柱：Waters UltrahydrogelTM Linear(Ф7.8mm×300mm ID)两柱串连；
流动相：0.1mol/L NaNO3；
柱温：40℃；
流速：0.9mL/min；
进样量：20μL；
结论：经回归方程推算，该肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)Leuco4多糖纯品的平均重量分子量为5,230k Da。
实施例5肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)Leuco4胞外多糖分子量的测定
将肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)Leuco4种子（上述方法制备的工作发酵剂）按2.0%(v/v)的接种量接入实施例1中所述方法制备的脱脂乳蔗糖培养基中，该脱脂乳蔗糖培养基中含脱脂乳10%(w/w)、蔗糖5%(w/v)，28℃、180rpm摇床培养90h，所得发酵液以实施例1中所述方法制备胞外多糖纯品，并用重蒸水配制成5mg/mL的溶液，进行高效液相（HPLC）分析：将不同分子量的标准Dextran相继进样，记录保留时间TR，以TR为横坐标，LgM为纵坐标绘制标准曲线，得出分子量与保留时间TR的回归方程。待测样品按以下步骤进样，根据所得TR，推算胞外多糖的分子量分布。
高效液相色谱条件：
色谱仪：Waters2690
检测器：Waters2410示差折光检测器和紫外检测器
色谱柱：Waters UltrahydrogelTM Linear(Ф7.8mm×300mm ID)两柱串连
流动相：0.1mol/L NaNO3
柱温：40℃
流速：0.9mL/min
进样量：20μL
结论：经回归方程推算，该肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)Leuco4多糖纯品的平均重量分子量为2,940k Da。
实施例6肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)Leuco4胞外多糖分子 量的测定
将肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)Leuco4种子（上述方法制备的工作发酵剂）按2.0%、(v/v)的接种量接入实施例1中所述方法制备的脱脂乳蔗糖培养基中，该脱脂乳蔗糖培养基中含脱脂乳10%(w/w)、蔗糖5%(w/v)，34℃、180rpm摇床培养24h，所得发酵液以实施例1中所述方法制备胞外多糖纯品，并用重蒸水配制成5mg/mL的溶液，进行高效液相（HPLC）分析：将不同分子量的标准Dextran相继进样，记录保留时间TR，以TR为横坐标，LgM为纵坐标绘制标准曲线，得出分子量与保留时间TR的回归方程。待测样品按以下步骤进样，根据所得TR，推算胞外多糖的分子量分布。
高效液相色谱条件：
色谱仪：Waters2690
检测器：Waters2410示差折光检测器和紫外检测器
色谱柱：Waters UltrahydrogelTM Linear(Ф7.8mm×300mm ID)两柱串连
流动相：0.1mol/L NaNO3
柱温：40℃
流速：0.9mL/min
进样量：20μL
结论：经回归方程推算，该肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)Leuco4胞外多糖的平均重量分子量为在974～5230kDa之间。
实施例7肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)Leuco4胞外多糖粗品组分的测定
将肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)Leuco4种子液(按上述方法制备的工作发酵剂)以2%(v/v)接种量接入上述方法制备的脱脂乳蔗糖培养基中，该脱脂乳蔗糖培养基中含脱脂乳10%(w/w)，蔗糖5%(w/v)，28℃、180rpm摇床培养90h，发酵结束后取发酵液按上述方法制备胞外多糖粗品并称重。上述实验作三个平行样，所得的胞外多糖粗品分别标注为胞外多糖粗品 A、B、C。
将胞外多糖粗品样品A、B、C用80℃蒸馏水配制而成10mg/mL的混悬液，经过4℃、10,000rpm离心20min后，分别收集沉淀和上清液。然后采用凯氏定氮法和苯酚-硫酸法分别测定沉淀部分游离蛋白质含量和上清液中胞外多糖的含量，结果见表2。
表2胞外多糖粗品组分的测定
结论：本发明的胞外多糖粗品中，多糖（纯品）的含量在90～95%(w/w)之间，游离蛋白的含量在5～10%(w/w)之间。
实施例8肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)Leuco4胞外多糖粗品的产量测定
将实施例6中获得的胞外多糖粗品A、B、C称重后，其产量见表3。
表3胞外多糖粗品产量的测定
结论：采用本发明的制备方法从每升发酵液中得到的胞外多糖粗品产量在10.574～12.641g之间。
实施例9肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)Leuco4胞外多糖粗品作为增稠剂在发酵乳制作中的应用及感官测定
表4发酵乳配方表
按表4配制发酵乳基料，溶解完全后95℃灭菌5min，按0.05%（w/w）接种量接入市售酸乳菌种(活菌总数为10101011cfu/mL)，40℃恒温发酵6h后取出冷藏过夜，各样品的pH值、组织状态及根据表5标准测定的感官评分结果如表6所示：
表5感官评分标准
表6发酵乳pH值、组织状态及感官评分结果
其中，n为评价员的数量。
从表6的结果可以看出，添加(Leuconostoc mesenteroides)Leuco4胞外多糖粗品1.0‰的发酵乳C，其乳清析出量与质地状况均优于空白对照组（发酵乳A），并与添加常规食品增稠剂果胶的阳性对照组（发酵乳B）相当， 其次，发酵乳C的感官评分结果与发酵乳B相当且均在80分以上，上述组织状态与感官评分的结果说明(Leuconostoc mesenteroides)Leuco4胞外多糖粗品可以作为一种果胶的替代品应用于酸奶制作工艺中，并被大部分消费者接受。
以上所有原料和试剂均市售可得。
应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一株肠膜明串珠菌菌株，其特征在于，其是保藏号为CGMCC NO.6432的肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)菌株。
2.一种肠膜明串珠菌的胞外多糖，其特征在于，所述的胞外多糖为葡聚糖，其为一种纯白色的丝状物或粉末；该胞外多糖的平均重量分子量在974～5230kDa之间。
3.如权利要求2所述的胞外多糖，其特征在于，5.0mg/mL的所述胞外多糖水溶液澄清透明、无色、无味，pH值为6.0～7.1。
4.如权利要求2所述的胞外多糖，其特征在于，所述的胞外多糖由保藏号为CGMCC NO.6432的肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)菌株产生。
5.一种如权利要求2~4任一项所述的肠膜明串珠菌的胞外多糖的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括如下步骤：
（1）将肠膜明串珠菌的种子液以体积比0.5～4.0%的接种量接种于无菌培养基，于25～34℃培养24～120h得发酵液；其中，所述的无菌培养基为含有质量比为6.0～12.0%脱脂乳粉和质量体积比为2.5～10.0%蔗糖的脱脂乳蔗糖溶液，并在95～135℃下灭菌20～30min制成；
（2）将步骤（1）所得的发酵液在95～100℃加热10～30min，冷却至15~25℃后，调节pH至4.4～4.8，静置3～5h，离心取上清，加入2～4倍体积的80～100%乙醇于离心后的上清液中，静置4～24h，离心收集沉淀物并将沉淀物溶于水，得沉淀物的水溶液；
（3）将步骤（2）所得的沉淀物水溶液干燥后即得胞外多糖粗品。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述的胞外多糖粗品包括85～95%如权利要求2所述的肠膜明串珠菌的胞外多糖和5～15%的游离蛋白，所述的百分比为质量百分比。
7.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）所述的肠膜明串珠菌的种子液是保藏号为CGMCC NO.6432的肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)的种子液；步骤（2）所述离心的条件为9000rpm、10min。
8.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，在步骤（3）之后还包括步骤（4）：将制得的胞外多糖粗品进行进一步的纯化，以去除蛋白和杂质。
9.一种增稠组合物，其特征在于，所述增稠组合物包括如权利要求2所述的肠膜明串珠菌的胞外多糖和生理学上可接受的载体。
10.如权利要求2所述的肠膜明串珠菌的胞外多糖或如权利要求9所述的增稠组合物在食品、制药和相关领域的应用。
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