CN102399296A

CN102399296A - 一种具有免疫活性的南极海冰菌胞外多糖及其制备方法

Info

Publication number: CN102399296A
Application number: CN2010102819688A
Authority: CN
Inventors: 李江; 沈继红; 林学政; 黄晓航; 何培青
Original assignee: First Institute of Oceanography SOA
Current assignee: First Institute of Oceanography SOA
Priority date: 2010-09-15
Filing date: 2010-09-15
Publication date: 2012-04-04

Abstract

一种具有免疫活性的南极微生物胞外多糖是指胞外多糖EPS-I，其中：阿拉伯糖∶甘露糖∶葡萄糖＝26∶40∶21。方法为：种子制备→深层发酵→制备发酵液→去除蛋白→分离纯化→冷冻干燥→多糖纯品。具有方法简单、活性独特、性能稳定、药用价值大，可调节和提高机体免疫力等特点。采用液体深层发酵、分离纯化的制备方法，首创性的从海冰中获得微生物胞外多糖及其提炼方法，开创了南极海冰微生物综合利用的新方法和途径，开发了海冰微生物的药用价值和用途，海冰微生物多糖的获得是医药生物技术的重大突破，为研制改善和提高机体免疫力的药品和食品奠定了基础，是理想的南极及海冰免疫活性微生物胞外多糖的专用制备方法。

Description

一种具有免疫活性的南极海冰菌胞外多糖及其制备方法

技术领域

本发明涉及的是医药生物技术，更详细地讲是关于海冰微藻和细菌等微生物提炼一种具有免疫活性的南极微生物胞外多糖及其制备方法。

背景技术

目前普遍认为，多糖是一种无细胞毒的免疫促进剂，多种多糖能够分别或同时刺激巨噬细胞、B细胞、T细胞、自然杀伤细胞(NK)，增强这些细胞的活性；促进巨噬细胞分泌白细胞介素1(IL-1)、肿瘤坏死因子(TNF)；促进T淋巴细胞产生白细胞介素2(IL-2)；激活白细胞产生干扰素；调节抗体和补体生成等。多糖能够对免疫系统发挥诸多的调节作用，可以改善机体的免疫功能。微生物来源的多糖，尤其是细菌和真菌的胞外多糖，具有易于分离纯化、产量高等优势颇受青睐。

南极海冰中发现了大量的微生物(海冰微藻和细菌)及其产生的胞外多糖，这些物质聚集在冰藻和细菌生存的海冰通道中，提供了海冰和冰水界面的有机碳，是能源传输的主要物质；并且还可以保护细胞在结冰时免受冰晶的伤害，缓冲pH以及盐浓度的变化，可以降低其它化学物质的伤害。与常规环境的细菌相比，极地细菌胞外多糖的结构组成具有特异性，其复杂的糖链缠结与分子内的缔合增加，形成了独特多聚体三级结构和物理特性。极地细菌胞外多糖富含糖醛酸羧基基团，氨基糖氨基化合物，硫酸盐和羟基基团；且有高比例的羟基基团，尤其硫酸化程度，这些功能基团均与其生物活性相关。因此从南极微生物中发现结构新颖、活性独特的胞外多糖，阐明其结构与功能的关系，对于南极微生物资源的开发利用具有重要的意义。然而，具有免疫活性的南极微生物胞外多糖的研究尚未见报道。因此，从海冰中获取和提炼胞外多糖是医药生物技术的重大突破，也是研发和利用南极海冰资源的迫切需要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能消除上述缺点，具有方法简单、结构新颖、活性独特、性能稳定、功能奇特、成本低廉、药用价值大，可调节和提高机体免疫力等特点的一种具有免疫活性的南极微生物胞外多糖及其制备方法。尤其是采用液体深层发酵、分离纯化的制备方法，以及科学的试验手段，首创性的从海冰中获得微生物胞外多糖及其提炼方法，开创了南极海冰微生物综合利用的新方法和途径，开发了海冰微生物的药用价值和用途，获得了海冰微生物提炼多糖的方法，自然资源得到有效地开发和利用，降低了生产和使用成本，提高了社会和经济效益，海冰微生物多糖的获得是医药生物技术的重大突破，为开发研究改善和提高机体免疫力的药品和食品奠定了基础，是理想的南极及海冰免疫活性微生物胞外多糖的专用制备方法。

本发明的一种具有免疫活性的南极微生物胞外多糖是指胞外多糖EPS-I，它是从南极菌NJ-S2发酵液中分离提取的胞外多糖EPS-I，其特征为白色絮状物，易溶于水和二甲基亚砜，相对分子量为60kDa，主要由阿拉伯糖、甘露糖和葡萄糖组成，其组成比为：阿拉伯糖∶甘露糖∶葡萄糖＝26∶40∶21。

本发明的一种具有免疫活性的南极微生物胞外多糖的制备方法，即：胞外多糖EPS-I的提取纯化方法如下：

1、种子制备：

培养基：蔗糖22.5g，豆粉10.5g，K₂HPO₄0.2g，Na₂SO₄0.1g，FeSO₄7H₂O0.01g，CaCO₃2g，陈海水1000mL，pH值7.2，121℃灭菌20min；按5％的比例接入NJ-S2的菌悬液，10℃、120rpm，培养48h备用。

2、深层发酵制备胞外多糖发酵液：

培养基：蔗糖45g，豆粉21g，K₂HPO₄0.2g，Na₂SO₄0.1g，FeSO₄7H₂O 0.01g，CaCO₃3g，陈海水1000mL，pH值7.2，121℃灭菌20min。100L发酵罐的加料量为70L，按5％的比例接入NJ-S2种子液，发酵温度利用外接低温循环水控制，发酵温度利用循环冷冻机控制，罐内温度保持在101℃；通过空气压缩机向罐内通入压缩空气，以提供发酵过程中需要的氧气；不断搅拌，搅拌速度为250r/min，用灭菌的豆油作为消泡剂来消除在搅拌过程中产生的气泡。培养144小时，胞外多糖产量可达3.5g/L。

3、胞外多糖发酵液的后处理：

将发酵液以10000r/min转速离心10min去菌体。将去菌体发酵液加入三倍体积的95％乙醇沉淀过夜后，以5000r/min离心收集沉淀。采用TCA法脱蛋白，南极菌NJ-S2胞外多糖溶液中加入1.5倍体积的10％TCA溶液，混合均匀，于冰箱中静置4～6h，再以5000r/min的转速离心15min，除去沉淀，保留上清液，如此反复处理数次，得多糖粗品。多糖粗品复溶，经过凝胶过滤层析和离子交换层析的方法进行纯化，冷冻干燥，得到多糖纯品。

结合胞外多糖的组成分析，对本发明做进一步说明：

本发明方法制备的多糖EPS-I的分子量及单糖组成分析方法及结果如下：

1、采用高效凝胶渗透色谱法(HP-GPC)测定多糖EPS-I分子量。

分析条件：TSK-GEL G2000PW，300×7.5mmID色谱柱；流动相0.1mol/L Na₂SO₄溶液，流速10ml/min；柱温60℃，进样量21，示差折光检测器检测。以标准Dextran T系列葡聚糖作标准曲线，计算分子量。分析结果表明EPS-I多糖的分子量为60k Da。

2、单糖组成分析：

10mg纯化多糖中加入2mol/L三氟乙酸2ml置于100℃水浴中水解18h，减压浓缩至干，加入10mg盐酸羟胺和0.5ml吡啶，放入90℃水浴中加热反应30min分钟并振荡。取出后冷至室温，加入0.5ml醋酸酐，90℃下继续反应30min分钟进行乙酰化。反应产物减压浓缩至干，加入0.5ml氯仿萃取。同时将D-阿拉伯糖，D-木糖、D-半乳搪、D-葡萄糖和D-甘露糖按上述步骤转化成糖氰乙酸酯衍生物作为标准对照，接着进行气相(GC)色谱分析。气相色谱分析条件：OV-225柱，载气N₂，90ml/min；柱温240℃，检测器温度250℃，气化室温度280℃，氢火焰离子检测器。分析结果表明EPS-I多糖由阿拉伯糖、甘露糖和葡萄糖组成，其组成比为26∶40∶21。

本发明制备的胞外多糖EPS-I能够显著提高小鼠脾淋巴细胞的增殖和促进小鼠白介素2的分泌，显示出良好的免疫活性。该多糖在医药、食品、化妆品、美容、生物技术等领域具有广泛的应用前景。

本发明的特点在于：

1、首次以南极海冰菌Moritella sp.NJ-S2为菌株发酵生产胞外多糖，建立该菌株合成分泌的胞外多糖的优化发酵生产工艺；

2、提供了一种南极菌胞外多糖EPS-I的潜在用途：细胞免疫试验表明，EPS-I多糖能够显著的提高小鼠脾淋巴细胞的增殖和促进小鼠白介素的分泌，显示出良好的免疫活性。本发明制备的多糖纯品为生物技术产品，在医药、食品、美容、生物技术等领域具有潜在的应用前景。

具体实施方式

结合实施例进一步对本发明做详细的说明：

实施例1、菌悬液的制备：

南极菌Moritella sp.NJ-S2源自中国第24次南极科学考察乌拉圭站(S6211□50.52□，W5855.□50.4□)采集的海冰样品，采用佐贝尔2216E培养基筛选、分离获得，经16S rDNA鉴定为Pseudoalteromonas属。NJ-B3采用Zobell2216E固体培养基划线保存于4℃冰箱中，NJ-B3接入装有2216E液体培养基的三角瓶，10℃、150rpm振荡培养48h，做菌悬液用。

Zobell2216E固体培养基：蛋白胨5g，酵母粉1g，琼脂粉15g，陈海水1000ml；

Zobell2216E液体培养基：蛋白胨5g，酵母粉1g，陈海水1000ml；

实施例2、南极菌Moritella sp.NJ-S2胞外多糖的制备：

1、种子培养基为：蔗糖22.5g，豆粉10.5g，K₂HPO₄ 0.2g，Na₂SO₄ 0.1g，FeSO₄7H₂O 0.01g，CaCO₃2g，陈海水1000mL，pH值7.2，121℃灭菌20min；按5％的比例接入NJ-B3的菌悬液，10℃、120rpm，培养48h备用。

2、深层发酵制备胞外多糖发酵液：

培养基：蔗糖45g，豆粉21g，K₂HPO₄ 0.2g，Na₂SO₄ 0.1g，FeSO₄7H₂O 0.01g，CaCO₃ 3g，陈海水1000mL，pH值7.2，121℃灭菌20min。100L发酵罐的加料量为70L，按5％的比例接入Moritella sp.NJ-S2种子液，发酵温度利用外接低温循环水控制，罐内温度保持在101℃；通过空气压缩机向罐内通入压缩空气，以提供发酵过程中需要的氧气；搅拌速度为250r/min，用灭菌的豆油作为消泡剂来消除在搅拌过程中产生的气泡。发酵144h，胞外多糖产量可达3.5g/L。

3、胞外多糖的后处理：

将发酵液以10000r/min转速离心10min去菌体。将去菌体发酵液加入三倍体积的95％乙醇沉淀过夜后，以5000r/min离心收集沉淀。采用TCA法脱蛋白，南极菌NJ-B3胞外多糖溶液中加入1.5倍体积的10％TCA溶液，混合均匀，于冰箱中静置4～6h，再以5000r/min的转速离心15min，除去沉淀，保留上清液，如此反复处理数次，得多糖粗品。多糖粗品复溶，经过凝胶过滤层析和离子交换层析的方法进行纯化，冷冻干燥，得到多糖纯品。凝胶过滤层析和离子交换层析优选：凝胶过滤层析柱：100cm1.2cm，凝胶类型：Sephadex G-100；离子交换层析柱：25cm1.6cm，凝胶类型：DEAE-Sepharose Fast Flow。

实施例3、EPS-I多糖的免疫活性：

1、EPS-I多糖对脾淋巴细胞的增殖作用：

采用MTS-PMS比色法。BALB/c小鼠断颈椎处死，无菌取脾，制备脾淋巴细胞，用RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为4×10⁹/L cell/ml。

将BALB/c小鼠4×10⁹/L cell/ml的脾细胞悬液加入96孔细胞培养板内，每孔100μl，多糖组每孔加入用RPMI1640完全培养液稀释成浓度为：6.25、12.5、25、50、100mg/L的HT-II各10μl，每个浓度5个重复，空白对照组以等体积的RPMI 1640代替。置37℃，5％CO₂饱和湿度培养箱中培养72h。取出，加入20μl MTS-PMS继续培养4～6h，用酶标仪测定A_492nm值。

将BALB/c小鼠4×10⁹cell/ml的脾细胞悬液加入96孔细胞培养板内，随后每孔加入ConA10μl，终浓度为5mg/L，多糖组每孔加入用RPMI 1640完全培养液稀释成浓度为6.25、12.5、25、50、100mg/L的HT-II各10μl，每个浓度3个重复，空白对照组以等体积的RPMI1640代替，置37℃，5％CO₂饱和湿度培养箱中培养72h。取出，加入20μl MTS-PMS继续培养4～6h，用酶标仪测定A_492nm值，测定结果见表1。

表1EPS-I多糖对脾淋巴细胞增殖的影响

从表1中看出，EPS-I在6.25～100mg/L的浓度范围内可显著刺激小鼠脾淋巴细胞增殖，随着多糖浓度增加，刺激效应呈增强趋势。EPS-I在6.25～100mg/L的浓度范围内与ConA刺激的淋巴细胞增殖无明显协同作用，也无抑制作用。

2、EPS-I多糖对细胞白介素II的诱导作用：

制备脾单细胞悬液同上，加入48孔板，每孔1000μl，每样3个复孔，加ConA与多糖浓度同上，培养48h取上清用ELISA法测定IL-2含量，测定结果见表2。

表2 EPS-I多糖对IL-2分泌的影响

从表2中看出，EPS-I在6.25～100mg/L的浓度范围内，IL-2分泌随多糖浓度增加而增加，但EPS-I对ConA刺激的IL-2分泌不仅没有协同作用，反而具有一定的抑制作用。

本发明的菌株NJ-S2分离自南极海冰样品，经鉴定为Moritella sp.属菌，通过液体深层发酵、分离纯化获得该菌胞外多糖活性成分EPS-I。体外细胞实验表明，EPS-I能够显著促进小鼠脾淋巴细胞增殖，同时提高细胞白介素II(IL-2)的分泌，提高机体免疫功能，可作为有效活性组分用于制备增强免疫剂食品和药物。

Claims

1.一种具有免疫活性的南极微生物胞外多糖，其特征在于是指胞外多糖EPS-I，为白色絮状物，易溶于水和二甲基亚砜，相对分子量为60kDa，主要由阿拉伯糖、甘露糖和葡萄糖组成，其组成比为：阿拉伯糖∶甘露糖∶葡萄糖＝26∶40∶21。

2.用于权利要求1所述的一种具有免疫活性的南极微生物胞外多糖的制备方法，其特征在于该制备方法为：种子制备→深层发酵→制备发酵液→去除蛋白→分离纯化→冷冻干燥→多糖纯品。

3.如权利要求1或2所述的一种具有免疫活性的南极微生物胞外多糖的制备方法，其特征在于是多糖EPS-I的制备方法，从南极菌NJ-S2发酵液中分离提取的胞外多糖EPS-I的步骤如下：

a、种子制备：

培养基：蔗糖25g，豆粉12.5g，K₂HPO₄ 0.2g，Na₂SO₄ 0.1g，FeSO₄7H₂O 0.01g，CaCO₃2g，陈海水1000mL，pH值7.2，121℃灭菌20min；按5％的比例接入NJ-S2的菌悬液，10℃、120rpm，培养48h备用。

b、深层发酵制备胞外多糖发酵液：

培养基：蔗糖50g，豆粉25g，K₂HPO₄ 0.2g，Na₂SO₄ 0.1g，FeSO₄7H₂O 0.01g，CaCO₃3g，陈海水1000mL，pH值7.2，121℃灭菌20min。100L发酵罐的加料量为70L，按5％的比例接入NJ-B3种子液，发酵温度利用外接低温循环水控制，发酵温度利用外接低温循环水控制，罐内温度保持在10±1℃；向罐内通入压缩空气，以提供发酵过程中需要的氧气；不断搅拌，搅拌速度为250r/min，用灭菌的豆油作为消泡剂来消除在搅拌过程中产生的气泡。培养120小时，胞外多糖产量可达3.5g/L。

c、胞外多糖发酵液的后处理：将发酵液以10000r/min转速离心10min去菌体。将去菌体发酵液加入三倍体积的95％乙醇沉淀过夜后，以5000r/min离心收集沉淀。采用TCA法脱蛋白，南极菌NJ-S2胞外多糖溶液中加入1.5倍体积的10％TCA溶液，混合均匀，于冰箱中静置4～6h，再以5000r/min的转速离心15min，除去沉淀，保留上清液，如此反复处理数次，得多糖粗品。多糖粗品复溶，经过凝胶过滤层析和离子交换层析的方法进行纯化，冷冻干燥，得到多糖纯品。

4.如权利要求1或2或3所述的一种具有免疫活性的南极微生物胞外多糖及其制备方法，其特征在于所述的南极菌胞外多糖EPS-I单独使用，能够有效促进小鼠脾淋巴细胞增殖，提高小鼠细胞白介素II的分泌。