CN102399838A - 一种具有抗氧化活性的南极海冰菌胞外多糖及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种具有抗氧化活性的南极海冰菌胞外多糖是指NJ-B3胞外多糖，由甘露糖和葡萄糖按4∶1成分组成，其分子量为2112Da。具有清除氧自由基的活性，方法简单、活性独特、性能稳定、药用价值大，抗氧化性强、可调节和提高机体免疫力等特点。首创性的从海冰中获得微生物抗氧化活性菌胞外多糖及其提炼方法，开创了海冰微生物综合利用的新方法和途径，开发了海冰微生物的药用价值和用途，获得了海冰微生物提炼具有抗氧化活性菌胞外多糖的方法，海冰微生物多糖的获得是医药生物技术的重大突破，为开发研究抗肿瘤、抗衰老、抗感染、抗辐射等其他活性的作用机理，改善和提高机体免疫力的药品和食品奠定了基础，是抗氧化活性的南极海冰菌胞外多糖的专用制备方法。
Description
技术领域
本发明涉及的是医药生物技术，更详细地讲是关于海冰微藻和细菌等微生物提炼的一种具有抗氧化活性的南极海冰菌胞外多糖及其制备方法。
背景技术
大量的研究发现：临床上许多疾病与机体的自由基损伤、氧化损害有关。抗氧化多糖的发现，无疑为氧化损伤相关疾病的治疗带来了新的希望，与其他外源性抗氧剂相比，抗氧化多糖具有低毒、安全、来源广等特点。在研究抗氧化多糖的过程中发现，多糖的抗氧化性可能是多糖抗肿瘤、抗衰老、抗感染、抗辐射等其他活性的作用机理之一。微生物来源的抗氧化多糖，尤其是细菌和真菌的胞外多糖，具有易于分离纯化、产量高等优势颇受青睐。
南极海洋环境寒冷，一些区域终年覆盖冰雪，空间的特殊性和海冰形成活动季节的大幅浮动，使微生物栖息环境具有高度的多样性，形成了不同的微生物群落。生存于南极生态系统中的微生物的多样性是开发具有特殊应用价值的活性物质(包括EPSs)的资源库。南极海冰中发现了大量的微生物(海冰微藻和细菌)及其产生的胞外多糖，这些物质聚集在冰藻和细菌生存的海冰通道中，提供了海冰和冰水界面的有机碳，是能源传输的主要物质；并可保护细胞在结冰时免受冰晶的伤害，缓冲pH以及盐浓度的变化，可以降低其它化学物质的伤害。与常规环境的细菌相比，极地细菌胞外多糖的结构组成具有特异性，其复杂的糖链缠结与分子内的缔合增加，形成了独特多聚体三级结构和物理特性。极地细菌胞外多糖富含糖醛酸羧基基团，氨基糖氨基化合物，硫酸盐和羟基基团；且有高比例的羟基基团，尤其硫酸化程度，这些功能基团均与抗氧化活性相关。因此从南极微生物中发现结构新颖、活性独特的胞外多糖，阐明其结构与功能的关系，对于南极微生物资源的开发利用具有重要的意义。然而，具有抗氧化活性的南极微生物胞外多糖的研究尚未见报道。因此，从海冰微藻和细菌中获取和提炼胞外多糖是医药生物技术的重大突破，也是开辟和利用南极海冰自然资源的迫切需要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能消除上述缺点，具有方法简单、结构新颖、活性独特、性能稳定、功能奇特、成本低廉、药用价值大，抗氧化性强、可调节和提高机体免疫力等特点的一种具有抗氧化活性的南极海冰菌胞外多糖及其制备方法。尤其是采用液体深层发酵、分离纯化的制备方法，以及科学的试验手段，首创性的从海冰中获得微生物抗氧化活性菌胞外多糖及其提炼方法，开创了南极海冰微生物综合利用的新方法和途径，开发了海冰微生物的药用价值和用途，获得了海冰微生物提炼具有抗氧化活性菌胞外多糖的方法，自然资源 得到有效地开发和利用，降低了生产和使用成本，提高了社会和经济效益，海冰微生物多糖的获得是医药生物技术的重大突破，为开发研究抗肿瘤、抗衰老、抗感染、抗辐射等其他活性的作用机理，改善和提高机体免疫力的药品和食品奠定了基础，是抗氧化活性的南极海冰菌胞外多糖的专用制备方法。
本发明的一种具有抗氧化活性的南极海冰菌胞外多糖是指NJ-B3多糖，它是一株多糖产率高的南极菌Pseudoalteromonas sp.NJ-B3，通过工艺，得到分离纯化的多糖，初步分析其结构组成；并提供了该多糖清除氧自由基的活性，为其在生物技术领域的应用奠定基础。多糖NJ-B3由甘露糖和葡萄糖组成，其组成比为4∶1，多糖NJ-B3分子量为2112Da。其制备方法为：种子制备→深层发酵→制备发酵液→去除蛋白→分离纯化→冷冻干燥→多糖纯品。
本发明的一种具有抗氧化活性的南极海冰菌胞外多糖的制备方法，即：菌胞外多糖-NJ-B3多糖提取纯化方法如下：
1、种子制备：
培养基：蔗糖25g，豆粉12.5g，K2HPO40.2g，Na2SO40.1g，FeSO4·7H2O0.01g，CaCO32g，陈海水1000mL，pH值7.2，121℃灭菌20min；按5％的比例接入NJ-B3的菌悬液，10℃、120rpm，培养48h备用。
2、深层发酵制备胞外多糖发酵液：
培养基：蔗糖50g，豆粉25g，K2HPO40.2g，Na2SO40.1g，FeSO4·7H2O 0.01g，CaCO33g，陈海水1000mL，pH值7.2，121℃灭菌20min。100L发酵罐的加料量为70L，按5～7％的比例接入NJ-B3种子液，发酵温度利用外接低温循环水控制，发酵温度利用循环冷冻机控制，罐内温度保持在10±1℃；通过空气压缩机向罐内通入压缩空气，以提供发酵过程中需要的氧气；不断搅拌，搅拌速度为250r/min，用灭菌的豆油作为消泡剂来消除在搅拌过程中产生的气泡。培养120小时，胞外多糖产量可达3.8g/L。
3、胞外多糖发酵液的后处理：
将发酵液以10000r/min转速离心10min去菌体。将去菌体发酵液加入三倍体积的95％乙醇沉淀过夜后，以5000r/min离心收集沉淀。采用TCA法脱蛋白，南极菌NJ-B3胞外多糖溶液中加入1.5倍体积的10％TCA溶液，混合均匀，于冰箱中静置4～6h，再以5000r/min的转速离心15min，除去沉淀，保留上清液，如此反复处理数次，得多糖粗品。多糖粗品复溶，经过凝胶过滤层析，层析柱：100cm×1.2cm，凝胶类型：Sephadex G-50；离子交换层析，层析柱：25cm×1.6cm，凝胶类型：DEAE-Sepharose Fast Flow的方法进行纯化，冷冻干燥，得到多糖纯品。
结合胞外多糖的组成分析，对本发明做进一步说明。
本发明方法制备的NJ-B3多糖的分子量及单糖组成分析方法及结果如下：
1、采用高效凝胶渗透色谱法(HP-GPC)测定南极菌NJ-B3胞外多糖分子 量。分析条件：TSK-GEL G2000PW，300×7.5mmID色谱柱；流动相0.1mol/L Na2SO4溶液，流速10ml/min；柱温60℃，进样量2μl，示差折光检测器检测。以标准Dextran T系列葡聚糖作标准曲线，计算分子量。分析结果表明NJ-B3多糖的分子量为2112Da。
2、单糖组成分析：
10mg纯化多糖中加入2mol/L三氟乙酸2ml置于100℃水浴中水解18h，减压浓缩至干，加入10mg盐酸羟胺和0.5ml吡啶，放入90℃水浴中加热反应30min分钟并振荡。取出后冷至室温，加入0.5ml醋酸酐，90℃下继续反应30min分钟进行乙酰化。反应产物减压浓缩至干，加入0.5ml氯仿萃取。同时将D-阿拉伯糖，D-木糖、D-半乳搪、D-葡萄糖和D-甘露糖按上述步骤转化成糖氰乙酸酯衍生物作为标准对照，接着进行气相(GC)色谱分析。气相色谱分析条件：OV-225柱，载气N2，90ml/min；柱温240℃，检测器温度250℃，气化室温度280℃，氢火焰离子检测器。分析结果表明NJ-B3多糖由甘露糖和葡萄糖组成，其组成比为4∶1。
本发明制备的NJ-B3胞外多糖为能够有效清除体外的O2·和·OH，显示出良好的抗氧化活性。该多糖在医药、生物技术领域、食品、化妆品等领域具有广泛的应用前景。
本发明的特点在于：
1.首次以南极海冰菌Pseudoalteromonas sp.NJ-B3为菌株发酵生产胞外多糖，建立该菌株合成分泌的胞外多糖的优化发酵生产工艺；
2.提供了一种南极菌胞外多糖的潜在用途：体外抗氧化试验表明，NJ-B3多糖能够显著的清除多种活性氧自由基，并能有效抑制连苯三酚的自氧化速率。具有抗氧化活性的南极海冰菌胞外多糖的研究还未见报道，本发明制备的多糖纯品为生物技术产品，在医药、生物技术领域、食品、化妆品等领域具有广泛的应用前景。
具体实施方式
结合实施例进一步对本发明做详细的说明：
实施例1、菌悬液的制备：
南极菌NJ-B3源自中国第24次南极科学考察乌拉圭站(S62°11’50.52”，W58°55.’50.4”)采集的海冰样品，采用佐贝尔2216E培养基筛选、分离获得，经16S rDNA鉴定为Pseudoalteromonas属。NJ-B3采用Zobell2216E固体培养基划线保存于4℃冰箱中，NJ-B3接入装有2216E液体培养基的三角瓶，10℃、150rpm振荡培养48h，做菌悬液用。
Zobell2216E固体培养基：蛋白胨5g，酵母粉1g，琼脂粉15g，陈海水1000ml；
Zobell2216E液体培养基：蛋白胨5g，酵母粉1g，陈海水1000ml；
实施例2、南极菌NJ-B3胞外多糖的制备：
1、种子培养基为：蔗糖25g，豆粉12.5g，K2HPO40.2g，Na2SO40.1g，FeSO4·7H2O 0.01g，CaCO32g，陈海水1000mL，pH值7.2，121℃灭菌20min； 按5％的比例接入NJ-B3的菌悬液，10℃、120rpm，培养48h备用。
2、深层发酵制备胞外多糖发酵液：
培养基：蔗糖50g，豆粉25g，K2HPO40.2g，Na2SO40.1g，FeSO4·7H2O 0.01g，CaCO33g，陈海水1000mL，pH值7.2，121℃灭菌20min。100L发酵罐的加料量为70L，按5～7％的比例接入NJ-B3种子液，发酵温度利用循环冷冻机控制，罐内温度保持在10±1℃；通过空气压缩机向罐内通入压缩空气，以提供发酵过程中需要的氧气；搅拌速度为250r/min，用灭菌的豆油作为消泡剂来消除在搅拌过程中产生的气泡。发酵120h，胞外多糖产量可达3.8g/L。
3、胞外多糖的后处理：
将发酵液以10000r/min转速离心10min去菌体。将去菌体发酵液加入三倍体积的95％乙醇沉淀过夜后，以5000r/min离心收集沉淀。采用TCA法脱蛋白，南极菌NJ-B3胞外多糖溶液中加入1.5倍体积的10％TCA溶液，混合均匀，于冰箱中静置4～6h，再以5000r/min的转速离心15min，除去沉淀，保留上清液，如此反复处理数次，得多糖粗品。多糖粗品复溶，经过凝胶过滤层析和离子交换层析的方法进行纯化，冷冻干燥，得到多糖纯品。凝胶过滤层析和离子交换层析优选：凝胶过滤层析柱：100cm×1.2cm，凝胶类型：Sephadex G-50；离子交换层析柱：25cm×1.6cm，凝胶类型：DEAE-Sepharose Fast Flow。
实施例3、NJ-B3胞外多糖的抗氧化测试：
(1)NJ-B3多糖对O·-的清除作用：
向干燥比色皿内依次加入pH7.8，0.05mol/L磷酸盐缓冲液、0.13mol/L蛋氨酸、2×10-5mol/L核黄素、不同浓度的样品多糖溶液或1.3×10-3mol/L抗坏血酸、7×10-4mol/L氯化硝基四氮唑蓝(NBT)各0.4mL。(空白不加蛋氨酸，空白与对照均不加清除剂)，以双蒸水稀释至4.0mL。混合液在35℃恒温，4000lx下光照20min进行还原，以黑暗中止反应。用721分光光度计在560nm处测量各管溶液的光吸收值。计算平均清除率d：
d＝(A对照-A样品)×100％/A对照
B3多糖对O 2·-的清除效率见表1。
表1NJ-B3多糖对O2·-的清除作用
(2)NJ-B3多糖对·OH的清除作用：
取5×10-3mol/L邻二氮菲溶液1.5ml，加pH 7.4磷酸缓冲液(PBS)2.0ml充分混匀后，加7.5×10-3mol/L FeSO4溶液1.0ml，每加1管立即混匀，加0.1％H2O21.0ml，最后以H2O补充体积至总体积为10ml。反应液37℃保温1h，以0.5cm比色皿测536nm吸光度A536(损伤)。B-3多糖清除羟自由基作用，依上法试验，加B3后加H2O2，37℃保温1h，测A536(多糖)。未损伤管不加H2O2及多糖。表观羟自由基清除率(简称羟自由基清除率)d计算法：
B3多糖对·OH的清除效率见表2
表2NJ-B3多糖对·OH的清除作用
(3)NJ-B3胞外多糖对连苯三酚自氧化的抑制作用
每次吸1.0×10-3ml连苯三酚溶液(45×10-3mol/L)加入比色皿(1.0cm)，分别加入0％、0.1％、0.2％、0.4％的B-3多糖溶液0.5ml后，用蒸馏水补齐至5.0ml。25℃下，测定325nm处吸光度对时间的变化曲线，曲线的斜率即为连苯三酚的自氧化速率。观察不同浓度多糖对连苯三酚自氧化速率的抑制效果。
B3多糖对连苯三酚自氧化的抑制率见表3
表3NJ-B3多糖对连苯三酚自氧化的抑制率。
Claims (7)
1.一种具有抗氧化活性的南极海冰菌胞外多糖，其特征在于是指NJ-B3胞外多糖，它是一株多糖产率高的南极菌Pseudoaleromonas sp.NJ-B3，通过工艺，得到分离纯化的多糖，该多糖具有清除氧自由基的活性。
2.用于权利要求1所述的一种具有抗氧化活性的南极海冰菌胞外多糖的制备方法，其特征在于该制备方法为：种子制备→深层发酵→制备发酵液→去除蛋白→分离纯化→冷冻干燥→多糖纯品。
3.如权利要求1或2所述的一种具有抗氧化活性的南极海冰菌胞外多糖的制备方法，其特征在于是NJ-B3胞外多糖的制备方法，
从南极菌NJ-S2发酵液中分离提取的胞外多糖EPS-Ⅰ的步骤如下：
a、种子制备：
培养基：蔗糖25g，豆粉12.5g，K2HPO40.2g，Na2SO40.1g，FeSO4·7H2O0.01g，CaCO32g，陈海水1000mL，pH值7.2，121℃灭菌20min；按5％的比例接入NJ-B3的菌悬液，10℃、120rpm，培养48h备用；
b、深层发酵制备胞外多糖发酵液：
培养基：蔗糖50g，豆粉25g，K2HPO40.2g，Na2SO40.1g，FeSO4·7H2O 0.01g，CaCO33g，陈海水1000mL，pH值7.2，121℃灭菌20min，100L发酵罐的加料量为70L，按5％的比例接入NJ-B3种子液，发酵温度利用外接低温循环水控制，发酵温度利用外接低温循环水控制，罐内温度保持在12±1℃；通过空气压缩机向罐内通入压缩空气，以提供发酵过程中需要的氧气；不断搅拌，搅拌速度为250r/min，用灭菌的豆油作为消泡剂来消除在搅拌过程中产生的气泡，培养120小时，胞外多糖产量可达3.8g/L；
c、胞外多糖发酵液的后处理；
将发酵液以10000r/min转速离心10min去菌体，将去菌体发酵液加入三倍体积的95％乙醇沉淀过夜后，以5000r/min离心收集沉淀，采用TCA法脱蛋白，南极菌NJ-B3胞外多糖溶液中加入1.5倍体积的10％TCA溶液，混合均匀，于冰箱中静置4～6h，再以5000r/min的转速离心15min，除去沉淀，保留上清液，如此反复处理数次，得多糖粗品，多糖粗品复溶，经过凝胶过滤层析和离子交换层析的方法进行纯化，冷冻干燥，得到多糖纯品。
4.如权利要求1所述的一种具有抗氧化活性的南极海冰菌胞外多糖，其特征在于所述的多糖NJ-B3是由甘露糖和葡萄糖组成，其组成比为4∶1，多糖NJ-B3分子量为2112Da。
5.如权利要求1或2所述的一种具有抗氧化活性的南极海冰菌胞外多糖的制备方法，其特征在于凝胶过滤层析柱：100cm×1.2cm，凝胶类型：Sephadex G-50。
6.如权利要求1或2所述的一种具有抗氧化活性的南极海冰菌胞外多糖的制备方法，其特征在于离子交换层析柱：25cm×1.6cm，凝胶类型：DEAE-SepharoseFast Flow。
7.如权利要求1或2所述的一种具有抗氧化活性的南极海冰菌胞外多糖的制备方法，其特征在于所述的南极菌胞外多糖NJ-B3的应用，可有效清除体外的O2·和·OH，具有良好的抗氧化活性。
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| CN103320482A (zh) * | 2013-06-26 | 2013-09-25 | 国家海洋局第一海洋研究所 | 极地Pseudoalteromonas elyakovii胞外多糖及在水产养殖中的应用 |
| CN103439281A (zh) * | 2013-09-11 | 2013-12-11 | 厦门大学 | 白蔹提取物抗衰老美容功效的检测方法 |
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