CN112662581A

CN112662581A - 一株产具有抗肿瘤和降糖降脂活性的胞外多糖的嗜酸乳杆菌及其应用

Info

Publication number: CN112662581A
Application number: CN202011436537.4A
Authority: CN
Inventors: 王楠; 张同存; 申敬; 杨在明; 赵崇杰; 盖塞伦; 齐威; 罗学刚
Original assignee: Tianjin University of Science and Technology
Current assignee: Tianjin University of Science and Technology
Priority date: 2020-12-10
Filing date: 2020-12-10
Publication date: 2021-04-16
Anticipated expiration: 2040-12-10
Also published as: CN112662581B

Abstract

本发明公开一种具有抗肿瘤和降糖降脂活性的嗜酸乳杆菌，名称为：YL01，分类名称为：嗜酸乳杆菌Lactobacillus acidophilus，保藏编号为：CGMCC No.20085，保藏日期：2020年6月15日，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院生物研究所。本发明嗜酸乳杆菌YL01具有较好的酸和胆盐耐受性，可以减轻饮食诱导的高血脂症，缓解高脂饮食诱导的小鼠体重增加、显著降低餐后血糖水平，增强机体对葡萄糖的耐受能力，减轻胰岛素抵抗。本发明嗜酸乳杆菌可以用于制备预防和/或治疗肥胖和/或糖尿病的发酵食品，具有非常广泛的应用前景。

Description

一株产具有抗肿瘤和降糖降脂活性的胞外多糖的嗜酸乳杆菌及其应用

技术领域

本发明属于微生物学中的多糖技术领域，涉及到一种微生物胞外多糖，尤其是一株产具有抗肿瘤和降糖降脂活性的胞外多糖的嗜酸乳杆菌及其应用。

背景技术

乳酸菌(Lactic acid bacteria,LAB)胞外多糖(Exopolysaccharides,EPS)是乳酸菌在生长、代谢过程中分泌到细胞壁外的次级代谢产物，根据其与细胞壁结合的能力强弱可分为两种，一种失去与细胞结合的能力而渗入培养基形成黏液，称黏液多糖；另一种粘附于细胞壁形成荚膜，称荚膜多糖。目前报道的大多数产生EPS的菌株产生黏液多糖，而一些LAB菌株可以同时产生荚膜多糖和黏液多糖。根据乳酸菌胞外多糖的化学组成和生物合成机制的不同还可分为均多糖(HoPS)和杂多糖(HePS)两大类。均多糖(HoPS)是由一种单糖的重复单元组成，例如分子量约为10⁵-10⁶Da的D-葡萄糖或D-果糖，根据糖苷键类型不同，HoPS可分为葡聚糖(Dextrans)、β-葡聚糖(β-glucans)、果聚糖(Fructans)、变聚糖(Mutans)四种；杂多糖(HePS)是以葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、甘露糖、果糖、阿拉伯糖、木糖为主的糖单元按不同比例或N-乙酰氨基半乳糖、N-乙酰氨基葡萄糖等糖衍生物组成的长链、高分子量水溶性天然高分子聚合物。

已有研究证实，乳酸菌产生的胞外多糖具有降血压、降胆固醇、抗氧化、调节免疫、抗肿瘤等多种生物活性。同时胞外多糖基本无细胞毒性，使其成为食品科学、天然药物等领域的研究热点之一，具有广阔的应用前景。还可以作为益生元调节肠道菌群平衡、促进肠道内其他有益菌的生长。研究发现，不同菌株产生的胞外多糖的生物活性差别很大，受到单糖组成、分子量、功能团、所带电荷等多方面因素的影响，同时由于乳酸菌具有菌株特异性，即使是同一种属但不同株来源的胞外多糖差异很大，不同的多糖具有各自特定的功能。因此，开展产胞外多糖的乳酸菌的研究，开发具有益生功能的乳酸菌胞外多糖，具有十分重要的研究意义和经济价值。然而整体来说，目前具有明确生物活性的乳酸菌胞外多糖研究较少。

在乳酸菌抗肿瘤方面，已有多篇研究证实乳杆菌菌株及其分泌成分通过激活caspases原、下调抗凋亡蛋白Bcl-2和上调促凋亡蛋白Bax对癌细胞发挥抗增殖和促凋亡作用。然而在乳酸菌胞外多糖抗肿瘤方面，目前研究并不多，同时已有报道多集中在结肠癌上，在宫颈癌中研究较少。其中CN105441357A公开了一株植物乳杆菌YW11，其胞外多糖可以抑制结肠癌细胞增殖；CN106754475A公开了一株乳酸菌Lactobacillus PantherisWXT002，其胞外多糖抑制卵巢癌细胞生长。对我国专利进行检索，尚未见到乳酸菌胞外多糖抑制宫颈癌的专利。

在改善肥胖方面，已有多篇研究报道乳酸菌作为益生菌，可以降低高脂血症所致的高血糖和高胆固醇血症，显著降低HFD诱导的肥胖小鼠肝脏甘油三酯水平，具有良好的减肥效果和抑制肝脏脂质沉积的作用。然而在乳酸菌胞外多糖改善肥胖、降糖降脂方面，目前整体研究相对较少。其中CN111154676A公开了一株鼠李糖乳杆菌ZFM231，其胞外多糖具有脂肪酶抑制活性、较强的降低胆固醇及甘油三酯的效果；CN107058422A公开了一株植物乳杆菌，其胞外多糖具有一定的胆固醇清除能力。

目前，我国已有一些关于嗜酸乳杆菌调节血糖和胆固醇的发明专利和专利申请，CN109182207 A公开了一株嗜酸乳杆菌La-SJLH001，具有显著的淀粉酶抑制活性和α-葡萄糖苷酶抑制活性，并能显著降低小鼠空腹血糖、餐后血糖水平；CN 101139558 B公开了一株嗜酸乳杆菌，其具有降低血清胆固醇含量及提高免疫调节的功能。

总之，目前已公开的专利或专利申请中，虽已有嗜酸乳杆菌改善血糖减肥降脂的报道，但尚未检索到关于嗜酸乳杆菌抗结肠癌和宫颈癌方面的专利，同时对于嗜酸乳杆菌的胞外多糖分离纯化，及抗肿瘤、降糖减肥方面的研究均并未见到相关专利。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一株产具有抗肿瘤和降糖降脂活性的胞外多糖的嗜酸乳杆菌及其应用。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种具有抗肿瘤和降糖降脂活性的嗜酸乳杆菌，名称为：YL01，分类名称为：嗜酸乳杆菌Lactobacillus acidophilus，保藏编号为：CGMCC No.20085，保藏日期：2020年6月15日，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院生物研究所。

而且，所述嗜酸乳杆菌在固体平板上菌落不规则、呈圆形、乳白色、光滑有光泽；

或者，所述嗜酸乳杆菌来源于河套地区自制酸奶；

或者，所述嗜酸乳杆菌的基因序列为SEQ ID No.1。

而且，所述嗜酸乳杆菌能够显著抑制结肠癌细胞增殖；

或者，所述嗜酸乳杆菌能够显著抑制宫颈癌细胞增殖；

或者，所述嗜酸乳杆菌够缓解饮食诱导的高血脂症；

或者，所述嗜酸乳杆菌能够缓解高脂饮食诱导的小鼠体重增加、显著降低餐后血糖水平，增强机体对葡萄糖的耐受能力，减轻胰岛素抵抗；

或者，所述嗜酸乳杆菌具有高产胞外多糖的特性。

而且，所述嗜酸乳杆菌产生的胞外多糖以酸性多糖为主；

或者，所述嗜酸乳杆菌产生的胞外多糖产量可达502mg/L；

或者，所述嗜酸乳杆菌产生的胞外多糖经DEAE阴离子交换柱进行不同浓度NaCl溶液分离后，所得多糖以0.1mol/LNaCl为洗脱剂时为主；

或者，所述嗜酸乳杆菌产生的胞外多糖纯化后在260nm处和280nm处无紫外吸收峰；

或者，所述嗜酸乳杆菌产生的胞外多糖含有葡萄糖、羧基和α-D-吡喃糖环；

或者，所述嗜酸乳杆菌产生的胞外多糖分子量为1700kDa；

或者，所述嗜酸乳杆菌产生的胞外多糖在3400cm^-1附近和2927cm^-1处有糖类物质的特征吸收峰，在1660cm^-1附近有羧基的吸收峰，在1050cm^-1有葡萄糖的特征吸收峰。

如上所述的具有抗肿瘤和降糖降脂活性的嗜酸乳杆菌在制备预防和/或治疗肿瘤和/或肥胖的药物方面中的应用。

而且，所述药物为益生菌制剂；或者，所述药物为包含嗜酸乳杆菌及药学上通常使用的矫味剂、润滑剂、填充剂、崩解剂的载体组成的复合物；

或者，所述肿瘤为结肠癌或宫颈癌。

利用如上所述的具有抗肿瘤和降糖降脂活性的嗜酸乳杆菌发酵生产制得的发酵食品。

而且，所述发酵食品包括乳制品、豆制品、果蔬制品。

如上所述的具有抗肿瘤和降糖降脂活性的嗜酸乳杆菌生产的胞外多糖。

如上所述的胞外多糖在制备预防和/或治疗肿瘤(结肠癌、宫颈癌)和/或肥胖的药物方面中的应用。

而且，所述药物为包含嗜酸乳杆菌胞外多糖及药学上通常使用的矫味剂、润滑剂、填充剂、崩解剂的载体组成的复合物。

利用如上所述的胞外多糖生产制得的益生食品。

而且，所述益生食品包括益生菌压片糖果、益生菌饮料。

本发明的优点和积极效果如下：

1、本发明嗜酸乳杆菌YL01具有较好的酸和胆盐耐受性，可以减轻饮食诱导的高血脂症，缓解高脂饮食诱导的小鼠体重增加、显著降低餐后血糖水平，增强机体对葡萄糖的耐受能力，减轻胰岛素抵抗。本发明嗜酸乳杆菌可以用于制备预防和/或治疗肥胖和/或糖尿病的发酵食品，具有非常广泛的应用前景。

2、本发明嗜酸乳杆菌YL01具有高产胞外多糖的特性，产生的胞外多糖为酸性多糖，纯化后不存在或存在非常少量的核酸和蛋白质，该胞外多糖可以较好的抑制结肠癌和宫颈癌细胞增殖。本发明嗜酸乳杆菌产生的胞外多糖可以用于制备预防和/或治疗肿瘤(结肠癌、宫颈癌)的食品、药品和保健品。

3、本发明嗜酸乳杆菌及其胞外多糖具有抗肿瘤活性和降糖降脂活性，具有良好的胃肠道环境耐受能力，能够显著抑制结肠癌和宫颈癌细胞的增殖，并显著降低餐后血糖水平，能够缓解高脂饮食诱导的小鼠体重增加，增强机体对葡萄糖的耐受能力，减轻胰岛素抵抗，该菌能够高产胞外多糖且产生的胞外多糖含有葡萄糖、羧基和α-D-吡喃糖环，该菌及其胞外多糖的抗肿瘤、降糖降脂活性使其在多种形式的益生食品(如益生菌压片糖果、益生菌饮料等)和药品中具有广泛的应用价值。

附图说明

图1为本发明中嗜酸乳杆菌YL01的生长曲线图；

图2为本发明中嗜酸乳杆菌YL01的耐酸能力图；

图3为本发明中嗜酸乳杆菌YL01的耐胆盐能力图；

图4为本发明中嗜酸乳杆菌YL01影响HT-29细胞增殖图；

图5为本发明中嗜酸乳杆菌YL01影响Hela细胞增殖图；

图6为本发明中嗜酸乳杆菌YL01对高脂饮食诱导的肥胖小鼠体重的影响图；

图7为本发明中嗜酸乳杆菌YL01口服葡萄糖耐受测定图；其中，A为口服葡萄糖耐受测定图；B为曲线下面积图(AUC)；

图8为本发明中嗜酸乳杆菌YL01胰岛素耐受能力图；其中，A为胰岛素耐受能力图；B为曲线下面积图(AUC)；

图9为本发明中嗜酸乳杆菌YL01粗多糖DEAE阴离子交换柱洗脱曲线图；

图10为本发明中嗜酸乳杆菌YL01胞外多糖纯化后冻干粉图。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明进一步说明，下属实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。

本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规市售产品，本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法，本发明所用各物质质量均为常规使用质量。

一株具有抗肿瘤和降糖降脂活性的嗜酸乳杆菌，名称为YL01，分类名称为Lactobacillus acidophilus，保藏编号为：CGMCC No.20085，保藏日期：2020年6月15日，北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院生物研究所，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

较优地，所述嗜酸乳杆菌是从河套地区酸奶中分离获得的；

或者，所述嗜酸乳杆菌的基因序列为SEQ ID No.1。

较优地，所述嗜酸乳杆菌在固体平板上菌落较小、微微隆起、不规则、呈圆形、乳白色、光滑有光泽。

较优地，所述嗜酸乳杆菌具有较强的耐酸能力和胆盐耐受能力；

较优地，所述嗜酸乳杆菌能够缓解饮食诱导的高血脂症；

或者，所述嗜酸乳杆菌能够缓解高脂饮食诱导的小鼠体重增加、显著降低餐后血糖水平，增强机体对葡萄糖的耐受能力，减轻胰岛素抵抗。

较优地，所述嗜酸乳杆菌具有高产胞外多糖的特性；

或者，所述嗜酸乳杆菌胞外多糖产量可达502mg/L。

较优地，所述嗜酸乳杆菌胞外多糖以酸性多糖为主；

或者，所述嗜酸乳杆菌胞外多糖经DEAE阴离子交换柱进行不同浓度NaCl溶液分离后，所得多糖以0.1mol/L NaCl为洗脱剂时为主。

较优地，所述嗜酸乳杆菌胞外多糖纯化后不存在或存在非常少量的核酸和蛋白质；

或者，所述嗜酸乳杆菌胞外多糖纯化后在260nm处和280nm处无紫外吸收峰。

较优地，所述嗜酸乳杆菌胞外多糖含有葡萄糖、羧基和α-D-吡喃糖环，存在分子间和分子内氢键；

或者，所述嗜酸乳杆菌胞外多糖在3400cm^-1附近和2927cm^-1处有糖类物质的特征吸收峰，在1660cm^-1附近有羧基的吸收峰，在1050cm^-1有葡萄糖的特征吸收峰。

如上所述的具有抗肿瘤活性的嗜酸乳杆菌在制备预防和/或治疗结肠癌的药物中的应用。

较优地，所述药物为益生菌制剂；或者，所述药物为包含嗜酸乳杆菌及药学上通常使用的矫味剂、润滑剂、填充剂、崩解剂的载体组成的复合物。

较优地，所述药物为微生态制剂；或者，所述药物为包含嗜酸乳杆菌及药学上通常使用的矫味剂、润滑剂、填充剂、崩解剂的载体组成的复合物。

如上所述的具有抗肿瘤活性的嗜酸乳杆菌在制备预防和/或治疗宫颈癌的药物中的应用。

如上所述的具有降糖降脂活性的嗜酸乳杆菌在制备预防和/或治疗肥胖和/或糖尿病的药物中的应用。

如上所述的具有降糖降脂活性的嗜酸乳杆菌胞外多糖在制备预防和/或治疗肥胖和糖尿病的药物中的应用。

利用如上所述的具有降糖降脂活性的嗜酸乳杆菌发酵生产制得的发酵食品。

较优地，所述发酵食品包括乳制品、豆制品、果蔬制品。

具体地，相关制备及检测实施例如下：

实施例1：菌株的分离、纯化与鉴定

(1)菌株的分离纯化

以来源于河套地区的酸奶为样本，用无菌生理盐水10倍梯度稀释至10^-6，取10^-4、10^-5、10^-6三个梯度的稀释液100μl分别涂布于MRS固体平板上，37℃培养48h，挑选不同形态的菌落进行划线分离，直至得到菌落形态一致的纯的单菌落，挑取单菌落接种于5mlMRS液体培养基中，培养过夜，取800μl菌液加入200μl 60％甘油于-80℃保存。

(2)菌株的鉴定

将分离得到的菌株进行PCR扩增16S rDNA，PCR产物送到金唯智进行测序，将测序结果在EzBioCloud中进行核酸序列比对，相似度为91.29％，得到嗜酸乳杆菌1株，命名为嗜酸乳杆菌YL01。

(3)培养

将嗜酸乳杆菌接入MRS固体培养基上于37℃厌氧培养48h后，观察菌落形态较小，微微隆起，不规则，呈圆形，乳白色，光滑，有光泽。

实施例2：菌株的生长曲线

将实施例1中的嗜酸乳杆菌接入MRS固体培养基上于37℃厌氧培养48h。挑取生长状态良好的单菌落接种至MRS液体培养基中进行活化，再以1％的接种量接种于MRS液体培养基中，静置培养24h，每小时取菌悬液测定OD600，并绘制嗜酸乳杆菌的生长曲线。如图1所示。

实施例3：嗜酸乳杆菌YL01耐酸能力测定

将乳酸菌进行3次活化，放置37℃厌氧培养箱，过夜培养；将其菌体的浓度稀释到5×10⁸CFU/mL，换置不同pH值的MRS培养基中，pH分别为2.0、3.0、4.0；将不同pH的菌液放置96孔板里，每一个实验组设置6个平行孔，需要设置阴性对照，其阴性对照为pH值为7的MRS，置于37℃厌氧培养箱中，培养时间为4h。将加入20μL的MTT(5mg/mL)，放置厌氧培养箱4h。在酶联免疫检测仪测量490nm处各孔的吸光值(A实验组)，并与阴性对照组吸光值(A对照组)对比，测定存活率。存活率计算公式如下：

存活率(％)＝(A实验组)/(A对照组)×100 式(1)

结果如图2所示，嗜酸乳杆菌YL01在pH4条件下存活率为53.7±4.37％，具有较好的耐酸性。

实施例4：嗜酸乳杆菌YL01耐胆盐能力测定

将乳酸菌进行3次活化，放置37℃厌氧培养箱，过夜培养；将其菌体的浓度稀释到5×10⁸CFU/mL，换置不同胆盐浓度的MRS培养基中，胆盐的浓度为0.1％(w/v)、0.2％(w/v)、0.3％(w/v)；采用实施例1中的方法测定存活率。

结果如图所示，结果如图3所示，嗜酸乳杆菌YL01在0.3％胆盐条件下存活率为79.4％±4.16，具有较好的胆盐耐受能力。

实施例5：嗜酸乳杆菌YL01对结肠癌细胞增殖的影响

结肠癌细胞HT-29生长于含有10％胎牛血清DMEM高糖培养基中，在条件为37℃，5％CO²和完全饱和湿度的细胞培养箱中进行培养，隔一天换液以维持良好生长状态。把对数生长期细胞以1×10⁴个细胞/孔接种于96孔板中，每孔接种100μl细胞悬液，每个实验设置6个复孔，放置含5％二氧化碳培养箱中过夜至细胞完全贴壁。将多糖样品加入96孔板中，设置对照组和空白组。分别培养24h、48h、72h后，将培养基换成低血清的100μl培养基，每孔加入5mg/ml的MTT 10μl，放置5％二氧化碳培养箱4h后，弃去培养基，每孔加入100μl DMSO，用酶标仪在490nm处测各孔吸收值，计算细胞存活率。实验结果如图4所示，YL01胞外多糖为500μg/mL时，对结肠癌细胞有良好的抑制作用，且随着作用时间延长作用效果增加。

实施例6：嗜酸乳杆菌YL01对宫颈癌细胞增殖的影响

宫颈癌细胞Hela生长于含有10％胎牛血清DMEM高糖培养基中，在条件为37℃，5％CO²和完全饱和湿度的细胞培养箱中进行培养，隔一天换液以维持良好生长状态。把对数生长期细胞以1×10⁴个细胞/孔接种于96孔板中，每孔接种100μl细胞悬液，每个实验设置6个复孔，放置含5％二氧化碳培养箱中过夜至细胞完全贴壁。将多糖样品加入96孔板中，设置对照组和空白组。分别培养24h、48h、72h后，将培养基换成低血清的100μl培养基，每孔加入5mg/ml的MTT 10μl，放置5％二氧化碳培养箱4h后，弃去培养基，每孔加入100μl DMSO，用酶标仪在490nm处测各孔吸收值，计算细胞存活率。实验结果如图5所示，YL01胞外多糖为500μg/mL时，对宫颈癌细胞有良好的抑制作用，且随着作用时间延长作用效果增加。

实施例7：嗜酸乳杆菌YL01对高脂饮食诱导肥胖小鼠脂代谢的影响

(1)动物饲养

将购自中国食品药品监督管理实验动物资源研究所的18只雄性C57BL/6小鼠，置于25℃、55％湿度、12h光照/黑暗周期的对照条件下，饲喂标准实验室食品。

(2)实验流程

一周适应期，给与无限制食物和饮用水。适应期后，对实验组灌胃嗜酸乳杆菌YL01(10⁸CFU/mL)，200μL/鼠/天，空白组和模型组灌胃同等体积的生理盐水。实验期间所有小鼠饮用纯净水，模型组和实验组均喂食高脂饲料，连续饲养6周。实验过程中每天记录体重。实验结束，眼球法取血后将其脱臼处死。

(3)体重记录

小鼠每天口服嗜酸乳杆菌YL011×10⁸CFU，连续喂养7周。结果如图6所示，从第24天开始，灌胃YL01组小鼠体重明显下降，逐渐趋于正常组，而高脂饮食组小鼠体重明显增加。综上所述，嗜酸乳杆菌YL01明显缓解了高脂饮食诱导的小鼠体重增加。

(4)口服糖耐量实验(OGTT)

在实验结束前最后一周进行。小鼠过夜禁食12-14h，不禁水，用PBS配置200mg/ml浓度的D-葡萄糖溶液，于第二天上午九点按2g/kg(10ul/g)的剂量腹腔注射葡萄糖溶液，分别在0min，30min，60min，120min检测小鼠的血糖值变化。实验结果如图7所示，所有动物的葡萄糖浓度在口服葡萄糖负荷后30分钟达到峰值。在OGTT期间，HFD组的血糖浓度最高，而YL01组逆转了这一变化，YL01组的曲线下面积(AUC)也明显低于HFD组，表明嗜酸乳杆菌YL01具有较好的降糖效果。

(5)胰岛素耐受实验(ITT)

在实验结束前最后一周进行。禁食4小时，用PBS配成0.075U/ml胰岛素，按0.75U/kg(10ul/g)的剂量腹腔注射胰岛素溶液，分别在0min，15min，30min，60min，120min检测小鼠的血糖值变化。结果如图8所示，所有动物的胰岛素浓度在30分钟达到最低值，与HFD组相比，YL01组显著降低了胰岛素浓度，表明嗜酸乳杆菌YL01可以减轻胰岛素抵抗。

(6)血清指标的测定

将从小鼠眼球取的血在4℃下放置30分钟后，12000r离心30分钟后得到血清，检测血清中TC、TG、HDL-C、LDL-C的含量，结果如表1所示。

表1

	正常组	模型组	YL01组
				TC(mmol/L)	3.52±0.45	5.79±0.25<sup>##</sup>	4.88±0.28*
TG(mmol/L)	0.65±0.12	1.00±0.14<sup>#</sup>	0.72±0.05*
				LDL-C(mmol/L)	0.29±0.03	0.39±0.03<sup>#</sup>	0.30±0.02*
HDL-C(mmol/L)	1.53±0.29	2.30±0.25<sup>#</sup>	2.13±0.11*

#与对照组相比P<0.05；##与对照组相比P<0.01；*与模型组相比P<0.05

结果表明，高脂饮食摄入7周后，TC、TG、HDL-C、LDL-C水平显著增高，补充嗜酸乳杆菌YL01可以显著抑制TC、TG、HDL-C、LDL-C的升高，表明嗜酸乳杆菌YL01对饮食诱导的高脂血症有一定的抑制作用。

实施例8：嗜酸乳杆菌YL01胞外多糖的提取

将活化好的嗜酸乳杆菌YL01按3％-5％接种量接种到MRS液体培养基中，于37℃静置培养过夜。将发酵液于8000r/min，4℃离心20min，收集上清液，蒸发浓缩；向上清液中加入80％的三氯乙酸溶液至终浓度为4％，4℃静置24h，调pH至中性，8000r/min，4℃离心20min，收集上清；向上清液中加入3倍体积的预冷乙醇，4℃静置24h，8000r/min，4℃离心20min收集沉淀；将沉淀以少量蒸馏水溶解，再以预处理的透析袋(截留分子量8000～14000Da)于4℃透析48h，每8h换一次水，透析液真空冷冻干燥后获得干燥后的淡黄色粉末状粗多糖。

实施例9：嗜酸乳杆菌YL01胞外多糖的纯化

(1)DEAE阴离子交换层析

将规格为2.6cm×50cm色谱层析柱中装入DEAE Sepharose FF阴离子交换柱中，用蒸馏水平衡过夜。粗多糖用蒸馏水溶解，上样(质量浓度为10mg/mL，上样量80mg)，分别用蒸馏水及0～0.5mol/L NaCl进行线性梯度洗脱，3mL/管分部收集，洗脱速率为1mL/min，逐管使用苯酚-硫酸法及紫外A 280nm波长处检测多糖含量。图9为粗多糖的DEAE SepharoseFF洗脱曲线。由图可知，经DEAE Sepharose FF离子交换层析柱进行不同浓度NaCl溶液分离后，得到三个洗脱峰，分别是以0.1mol/L NaCl为洗脱剂时得到的峰和以水和0.2mol/LNaCl溶液为洗脱剂时得到的两个小峰。其中，0.1mol/L NaCl洗脱得到的峰远大于以水和0.2mol/L NaCl溶液为洗脱剂时得到的峰，说明嗜酸乳杆菌粗多糖中以酸性多糖为主。

(2)透析冻干

按上述多糖含量值收集并合并单一峰组分，以预处理的透析袋(截留分子量8000～14000Da)于4℃透析48h，每8h换一次水，至无Cl^-检出，冷冻干燥得纯多糖。图10为冻干纯多糖。

实施例10：嗜酸乳杆菌YL01胞外多糖总含量测定

采用苯酚-硫酸法测定多糖的含量。称取葡萄糖50mg于100mL容量瓶中，加水溶解；在新的100mL容量瓶中分别吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mL溶解的葡萄糖溶液，加蒸馏水至2mL，加入6％苯酚1mL和浓硫酸5mL，振荡摇匀，沸水浴中加热15min显色，冷却后用紫外分光光度计测OD 490nm处的吸光值，用水作为空白对照，制得标准曲线，横坐标为多糖微克数，纵坐标为OD 490nm处的吸光值。测定样品的OD 490nm值，根据标准曲线获得多糖的含量。

实施例11：嗜酸乳杆菌YL01胞外多糖生产曲线

将活化好的嗜酸乳杆菌YL01按3％-5％接种量接种到MRS液体培养基中，于37℃静置培养。分别于4h、8h、12h、18h、24h取发酵液上清测定多糖的含量。

表2

结果如表2所示，嗜酸乳杆菌YL01发酵液多糖含量在12h达到最大值，菌体生长进入平稳期后，多糖含量逐渐下降。

实施例12：嗜酸乳杆菌YL01胞外多糖结构分析

(1)分子量测定

高效液相色谱(HPLC)：将不同分子质量的标准Dextran T系列标品(40kD、70kD、500kD、1000kD、2000kD)/葡聚糖标准品相继进样，同时记录保留时间tR，以tR为横坐标，lgM为纵坐标绘制标准曲线,得出分子量与保留时间的回归方程。样品按上述步骤进样，根据所得的保留时间，通过回归方程即可得到样品的分子质量。高效液相色谱条件：色谱柱为Shodex SB-804HQ；流动相为三蒸水；柱温箱为30℃；流速为0.8mL/min；进样量为20μL。

(2)紫外光谱分析

多糖用双蒸水配制成0.5mg/mL的溶液，用0.22μl滤膜过滤后进行紫外光谱扫描(波长230～400nm)，样品流速为0.5ml/min。纯化后的多糖在230nm-400nm波长范围内，没有出现核酸(260nm)和蛋白质(280nm)的明显特征吸收峰，说明不存在或存在非常少量的核酸和蛋白质。

(3)红外光谱分析

取EPS纯品干粉1mg，KBr压片，400～4000cm^-1区间进行红外扫描。在3400cm^-1附近具有强且宽的吸收峰，它是由糖类-OH官能团的伸缩振动引起的，表明多糖存在分子间和分子内氢键；在2927cm^-1处的吸收峰是由C-H伸缩振动引起的，在这个区域的吸收峰是糖类物质的特征吸收峰，表明多糖存在C-H伸缩振动；1660cm^-1附近的吸收峰是羧基C＝O的非对称伸缩振动；1050cm^-1是葡萄糖的特征吸收峰，说明多糖含有葡萄糖；在835cm^-1附近的特征吸收峰，是由α-D-吡喃糖C-H的变角振动所引起的，说明含有α-D-吡喃糖环。

Lactobacillus acidophilus YL01

尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。

序列表

<110> 天津科技大学

<120> 一株产具有抗肿瘤和降糖降脂活性的胞外多糖的嗜酸乳杆菌及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1369

<212> DNA

<213> 嗜酸乳杆菌YL01(Unknown)

<400> 1

cttcggtgat gacgttggga acgcgagcgg cggatgggtg agtaacacgt ggggaacctg 60

ccccatagtc tgggatacca cttggaaaca ggtgctaata ccggataaga aagcagatcg 120

catgatcagc ttataaaagg cggcgtaagc tgtcgctatg ggatggcccc gcggtgcatt 180

agctagttgg tagggtaacg gcctaccaag gcaatgatgc atagccgagt tgagagactg 240

atcggccaca ttgggactga gacacggccc aaactcctac gggaggcagc agtagggaat 300

cttccacaat ggacgaaagt ctgatggagc aacgccgcgt gagtgaagaa ggttttcgga 360

tcgtaaagct ctgttgttgg tgaagaagga tagaggtagt aactggcctt tatttgacgg 420

taatcaacca gaaagtcacg gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata cgtaggtggc 480

aagcgttgtc cggatttatt gggcgtaaag cgagcgcagg cggaagaata agtctgatgt 540

gaaagccctc ggcttaaccg aggaactgca tcggaaactg tttttcttga gtgcagaaga 600

ggagagtgga actccatgtg tagcggtgga atgcgtagat atatggaaga acaccagtgg 660

cgaaggcggc tctctggtct gcaactgacg ctgaggctcg aaagcatggg tagcgaacag 720

gattagatac cctggtagtc catgccgtaa acgatgagtg ctaagtgttg ggaggtttcc 780

gcctctcagt gctgcagcta acgcattaag cactccgcct ggggagtacg accgcaaggt 840

tgaaactcaa aggaattgac gggggcccgc acaagcggtg gagcatgtgg tttaattcga 900

agcaacgcga agaaccttac caggtcttga catctagtgc aatccgtaga gatacggagt 960

tcccttcggg gacactaaga caggtggtgc atggctgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg 1020

ttgggttaag tcccgcaacg agcgcaaccc ttgtcattag ttgccagcat taagttgggc 1080

actctaatga gactgccggt gacaaaccgg aggaaggtgg ggatgacgtc aagtcatcat 1140

gccccttatg acctgggcta cacacgtgct acaatggaca gtacaacgag gagcaagcct 1200

gcgaaggcaa gcgaatctct taaagctgtt ctcagttcgg actgcagtct gcaactcgac 1260

tgcacgaagc tggaatcgct agtaatcgcg gatcagcacg ccgcggtgaa tacgttcccg 1320

ggccttgtac acaccgcccg tcacaccatg ggagtctgca atgcccaaa 1369

Claims

1.一种具有抗肿瘤和降糖降脂活性的嗜酸乳杆菌，其特征在于：名称为：YL01，分类名称为：嗜酸乳杆菌Lactobacillus acidophilus，保藏编号为：CGMCC No.20085，保藏日期：2020年6月15日，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院生物研究所。

2.根据权利要求1所述的具有抗肿瘤和降糖降脂活性的嗜酸乳杆菌，其特征在于：所述嗜酸乳杆菌在固体平板上菌落不规则、呈圆形、乳白色、光滑有光泽；

或者，所述嗜酸乳杆菌来源于河套地区自制酸奶；

或者，所述嗜酸乳杆菌的基因序列为SEQ ID No.1。

3.根据权利要求1所述的具有抗肿瘤和降糖降脂活性的嗜酸乳杆菌，其特征在于：

所述嗜酸乳杆菌能够显著抑制结肠癌细胞增殖；

或者，所述嗜酸乳杆菌能够显著抑制宫颈癌细胞增殖；

或者，所述嗜酸乳杆菌够缓解饮食诱导的高血脂症；

或者，所述嗜酸乳杆菌具有高产胞外多糖的特性。

4.根据权利要求3所述的具有抗肿瘤和降糖降脂活性的嗜酸乳杆菌，其特征在于：所述嗜酸乳杆菌产生的胞外多糖以酸性多糖为主；

或者，所述嗜酸乳杆菌产生的胞外多糖产量可达502mg/L；

或者，所述嗜酸乳杆菌产生的胞外多糖经DEAE阴离子交换柱进行不同浓度NaCl溶液分离后，所得多糖以0.1mol/L NaCl为洗脱剂时为主；

或者，所述嗜酸乳杆菌产生的胞外多糖分子量为1700kDa；

5.如权利要求1至4任一项所述的具有抗肿瘤和降糖降脂活性的嗜酸乳杆菌在制备预防和/或治疗肿瘤和/或肥胖的药物方面中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述药物为益生菌制剂；或者，所述药物为包含嗜酸乳杆菌及药学上通常使用的矫味剂、润滑剂、填充剂、崩解剂的载体组成的复合物；

或者，所述肿瘤为结肠癌或宫颈癌。

7.利用如权利要求1至3任一项所述的具有抗肿瘤和降糖降脂活性的嗜酸乳杆菌发酵生产制得的发酵食品。

8.如权利要求1至4任一项所述的具有抗肿瘤和降糖降脂活性的嗜酸乳杆菌生产的胞外多糖。

9.如权利要求8所述的胞外多糖在制备预防和/或治疗肿瘤和/或肥胖的药物方面中的应用。

10.利用如权利要求8所述的胞外多糖生产制得的益生食品。