CN103695379B - 重组酮还原酶及使用其制备奥拉西坦中间体的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种重组酮还原酶，编码所述重组酮还原酶的核苷酸及氨基酸序列，以及使用所述重组酮还原酶催化还原生产奥拉西坦中间体的用途。本发明还具体提供了一种采用上述重组酮还原酶生物催化法制备4-氯-3-羟基丁酸乙酯的方法，该方法反应条件温和，溶剂用量少，污染和能耗减少，成本大大降低，更加绿色环保，更加适合工业化生产。

Description

重组酮还原酶及使用其制备奥拉西坦中间体的方法
技术领域
本发明属于药物制备技术领域，具体涉及一种奥拉西坦中间体的制备方法，更具体涉及一种重组酮还原酶及其在4-氯-3-羟基丁酸乙酯生产中的应用。
背景技术
奥拉西坦是一种合成的羟基氨基丁酸环状衍生物，可以改善老年痴呆和记忆障碍症患者的记忆和学习功能，临床上用于治疗中度血管性痴呆，老年性痴呆以及脑外伤等症引起的记忆与智能障碍，因其疗效确切、安全性好近年来在国内痴呆药物市场一直处于领先地位，成为临床应用中最重要的痴呆治疗药物。目前奥拉西坦合成过程大多是以双烯酮作为起始原料，经中间体4-氯-3-羟基丁酸乙酯，最终与甘氨酰胺盐酸盐经环合制备。因此4-氯-3-羟基丁酸乙酯成为奥拉西坦的一种重要中间体，开发其新的生产工艺具有重要意义。
目前公开的有关4-氯-3-羟基丁酸乙酯的制备方法主要采用化学还原方法，反应条件往往需要低温或高温，存在危险性高、环境污染大、成本高的问题。如专利CN101693684报道利用NaBH4或KBH4催化还原羰基，反应过程中需要消耗大量的醇类溶剂，催化剂的用量也较大，且无法回收利用，反应还需要低温进行，不仅造成能耗很高，成本无优势还会产生大量废水。专利CN102633705报道采用金属铑、钌、钯作为催化剂，在高温高压条件下进行催化还原，不仅耗费大量昂贵的催化剂，而且废弃的重金属催化剂还会对环境造成严重污染，另外该反应条件苛刻，同样造成能耗高和生产成本高的问题。因此研究开发一种污染小、能耗低、成本低、可规模化生产4-氯-3-羟基丁酸乙酯的技术以替代目前的化学还原工艺成为迫切需要。
生物催化法的反应条件温和，具有高效率、低污染、低能耗，更加绿色环保的特点，越来越受到化学和制药工业界的关注，成为当前世界上解决化学法诸多弊端的最佳途径。但目前未见有关生物法制备4-氯-3-羟基丁酸乙酯的文献报道。
本专利公开了一种改进的利用重组酮还原酶生产4-氯-3-羟基丁酸乙酯的方法，不仅避免了化学法中存在的种种问题，而且反应条件温和，有机溶剂使用量少，大大减低了成本，具有重要的工业应用价值。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种重组酮还原酶，编码所述重组酮还原酶的核苷酸及氨基酸序列。
本发明第二个目的提供所述重组酮还原酶的制备方法。
本发明再一个目的提供所述重组酮还原酶的用途。
本发明的最后一个目的是提供一种奥拉西坦中间体4-氯-3-羟基丁酸乙酯的生物制备方法。
本发明为实现上述目的，采用如下技术方案：
重组酮还原酶，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。
上述重组酮还原酶，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。
一种制备上述重组酮还原酶的方法，包括如下步骤：
将含有酮还原酶基因的重组大肠杆菌单菌落接种到含卡那霉素抗性的液体LB培养基中，于35～40℃下摇床活化8～12小时，将活化后得到的培养物接种到含卡那霉素抗性的液体LB培养基中，于35～40℃下摇床扩大培养，培养至OD600值达到0.6～0.8时，加入诱导剂，于25～33℃下继续培养8～12小时，离心，收集沉淀物，加入三乙醇胺缓冲液悬浮，将悬浮液置于冰水浴中超声破碎8～12分钟，再离心，上清液即为重组酮还原酶。
上述制备重组酮还原酶的方法，所述诱导剂为异丙基-β-D-硫代半乳糖苷或乳糖。
上述重组酮还原酶的用途，将重组酮还原酶用于生物催化还原4-氯乙酰乙酸乙酯制备奥拉西坦中间体4-氯-3-羟基丁酸乙酯。
一种使用上述重组酮还原酶生物催化制备奥拉西坦中间体4-氯-3-羟基丁酸乙酯的方法，以4-氯乙酰乙酸乙酯为底物，以重组酮还原酶为生物催化剂、以NAD/NADH或NADP/NADPH为辅因子，以葡萄糖为氢供体，以葡萄糖脱氢酶为辅因子再生体系，在25～30℃条件下，在pH6.5～7.0的水相缓冲液或水相缓冲液-乙酸正丁酯两相体系中进行还原反应生成4-氯-3-羟基丁酸乙酯。
上述制备奥拉西坦中间体4-氯-3-羟基丁酸乙酯的方法，所述还原反应在反应起始时的反应体系中，底物浓度以g/ml计为14～18%,重组酮还原酶用量为底物4-氯乙酰乙酸乙酯质量的1～5%，辅因子用量为底物质量的0.01～0.03%，葡萄糖脱氢酶用量为底物质量的0.2～0.3%，葡萄糖用量与底物的物质的量的比为1.2～1.5：1。
上述制备奥拉西坦中间体4-氯-3-羟基丁酸乙酯的方法，其特征在于，所述的水相缓冲液为磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲溶液或三乙醇胺-盐酸缓冲溶液，所述的水相缓冲液-乙酸正丁酯两相体系中水相缓冲液与乙酸正丁酯的体积比为1：0.4～0.7。
上述制备奥拉西坦中间体4-氯-3-羟基丁酸乙酯的方法，其特征在于，所述的辅因子为NADP/NADPH。
上述制备奥拉西坦中间体4-氯-3-羟基丁酸乙酯的方法，其特征在于，所述的还原反应在pH为7.0的水相缓冲液体系中进行。
所述的制备方法的实施过程如下：在反应容器中依次加入底物4-氯乙酰乙酸乙酯，水相缓冲液或水相缓冲液-乙酸正丁酯，葡萄糖，搅拌均匀，继续加入重组酮还原酶，葡萄糖脱氢酶和辅因子，在25～30℃下，搅拌反应，用NaOH或KOH或Na2CO3溶液滴定保持恒定pH6.5～7.0，利用GC检测反应进程，待转化率达99%以上时，过滤，滤液加入乙酸正丁酯多次萃取或将滤液静置分层取水相加入乙酸正丁酯萃取，合并有机相并蒸发脱去溶剂，即得4-氯-3-羟基丁酸乙酯产品。
本发明技术方案中所用到的材料、试剂等，除重组酮还原酶外均可由商业途径购买获得。
本发明的有益结果在于：
本发明的重组的酮还原酶，能在水相缓冲液或水相缓冲液-乙酸正丁酯两相体系中保持较高的活性，可以高效率、快速催化还原4-氯乙酰乙酸乙酯制备奥拉西坦的重要中间体4-氯-3-羟基丁酸乙酯，能在较短时间内达到99%以上的转化率；并且本发明采用改进的工艺，使得反应条件温和，有机溶剂用量少，减少了能耗和污染、大大降低了生产成本，更加绿色环保，更加适合工业化生产。
附图说明
本发明的重组酮还原酶催化还原4-氯乙酰乙酸乙酯生成4-氯-3-羟基丁酸乙酯气相色谱图。
图1.为实施例五反应0时样品峰图。
保留时间为7.672min的峰是底物4-氯乙酰乙酸乙酯。
图2为实施例五反应中间时的样品峰图。
保留时间为7.675min的峰是底物4-氯乙酰乙酸乙酯；
保留时间为8.050min的峰是产物4-氯-3-羟基丁酸乙酯。
图3为实施例五反应结束时样品峰图。
保留时间为8.036min的峰是产物4-氯-3-羟基丁酸乙酯。
序列说明
SEQIDNO.1
含有酮还原酶基因的重组大肠杆菌
重组酮还原酶的核苷酸序列
ATGTTAAGTCTTGGTTTGGAAGATAAAGTAATCGTGGTCACCGGCGGCAATCGGGGCATCGGCGCGGCGATCGTGAAATTACTCCAGGAAATGGGGGTCAAAGTAGCTTTTACCGATTTAGCTACGGACGGGGGTAATACTGAAGCCCTGGGGGTGGTGGCCAACGTCACCGATTTGGAATCCATGTCGGCGGCGGCAGCGGAAATCACCGATAAGCTGGGCCCCGTTTACGGTGTGGTGGCCAATGCCGGTATCACCAAAGACAACTTTTTCCCAAAATTAACCCCCGCCGATTGGGAAGCAGTGTTGAACGTTAACTTGAAAGGGGTAGCCTACAGCATTAAGCCTTTCATCGAAGGCATGTATGAACGGAAAGCCGGCTCCATTGTGGCCATTAGTTCCATCTCCGGGGAGCGGGGTAACGTCGGTCAAACTAACTATTCCGCCACTAAAGCTGGGGTAATTGGCATGATGAAATCCCTGGCTCGGGAAGGGGCCCGGTATGGAGTGCGGGCCAATGCAGTAGCCCCTGGTTTCATTGACACCGATATGACTTTGGCGATCCGGGAAGATATTCGGGAAAAAATTACCAAGGAAATCCCCTTCCGCCGTTTTGGTAAACCGGAGGAAATTGCCTGGGCGGTGGCCTTTTTACTTTCCCCCGTAGCCAGTAGCTATGTCACCGGCGAAGTATTACGGGTAAATGGGGCCCACCACACCTAA
SEQIDNO.2
含有酮还原酶基因的重组大肠杆菌
重组酮还原酶的氨基酸序列
MLSLGLEDKVIVVTGGNRGIGAAIVKLLQEMGVKVAFTDLATDGGNTEALGVVANVTDLESMSAAAAEITDKLGPVYGVVANAGITKDNFFPKLTPADWEAVLNVNLKGVAYSIKPFIEGMYERKAGSIVAISSISGERGNVGQTNYSATKAGVIGMMKSLAREGARYGVRANAVAPGFIDTDMTLAIREDIREKITKEIPFRRFGKPEEIAWAVAFLLSPVASSYVTGEVLRVNGAHHT
具体实施方式
本发明的反应式如下：
下面的实施例可以使本专业的技术人员更全面的理解本发明，但不以任何方法限制本发明。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
实施例一：重组酮还原酶的制备
将含有酮还原酶基因的重组大肠杆菌单菌落从甘油管或转化平板接种到4ml含卡那霉素抗性的液体LB培养基活化过夜(37℃，200rpm)。从过夜培养物以1/100接种量转接100ml含卡那霉素抗性的液体LB培养基，37℃、200rpm振荡培养至OD600值达到0.6～0.8，加入0.1mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）于30℃继续培养过夜。离心收集细胞，用10ml三乙醇胺缓冲液(2mM，pH7.0)悬浮细胞，将细胞悬浮液置于冰水浴中超声破碎10分钟；再离心，得到重组酮还原酶上清液，冷冻干燥后即得重组酮还原酶干粉。
实施例二：重组酮还原酶的制备
将含有酮还原酶基因的重组大肠杆菌单菌落从甘油管或转化平板接种到4ml含卡那霉素抗性的液体LB培养基中，于35℃摇床活化(200rpm)12小时。然后以1/100接种量转接100ml含卡那霉素抗性的液体LB培养基，35℃、200rpm振荡培养至OD600值达到0.6～0.8，加入0.1mM乳糖，于25℃继续培养12小时。离心收集细胞，用10ml三乙醇胺缓冲液(2mM，pH7.0)悬浮细胞，将细胞悬浮液置于冰水浴中超声破碎8分钟；再离心，得到重组酮还原酶上清液，冷冻干燥后即得重组酮还原酶干粉。
实施例三：重组酮还原酶的制备
将含有酮还原酶基因的重组大肠杆菌单菌落从甘油管或转化平板接种到4ml含卡那霉素抗性的液体LB培养基中，于40℃摇床活化(200rpm)8小时。然后以1/100接种量转接100ml含卡那霉素抗性的液体LB培养基，40℃、200rpm振荡培养至OD600值达到0.6～0.8，加入0.1mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）于33℃继续培养8小时。离心收集细胞，用10ml三乙醇胺缓冲液(2mM，pH7.0)悬浮细胞，将细胞悬浮液置于冰水浴中超声破碎12分钟；再离心，得到重组酮还原酶上清液，冷冻干燥后即得重组酮还原酶干粉。
实施例四：生物催化还原反应监测方法
采用GC监测方法测定4-氯乙酰乙酸乙酯到4氯-3-羟基丁酸乙酯的转化。
样品处理：取不同时间点反应液100ul，加入乙酸乙酯900ul，混匀后用0.45um微孔滤膜过滤，然后进样检测(进样量1ul)。
色谱条件为：色谱柱AgilentHP-5（30m×320μm，0.25μm），流速1.0ml/min，柱温：初始温度70℃保持1分钟，10℃/min升至185℃共12.5min；进样口温度：250℃；隔垫吹扫：3ml/min；分流比：10:1。
4-氯乙酰乙酸乙酯保留时间为7.6min，4-氯-3-羟基丁酸乙酯保留时间为8.1min。
实施例五：4氯-3-羟基丁酸乙酯的制备
在反应容器中依次加入30g4-氯乙酰乙酸乙酯，150ml三乙醇胺-盐酸缓冲溶液（pH7.0，0.1M），葡萄糖41.25g，搅拌均匀，之后加入0.375g重组酮还原酶，0.075g葡萄糖脱氢酶，3mgNADP+，30℃下机械搅拌开始计时反应，4M的NaOH水溶液滴定，保持pH7.0恒定。取样GC分析监控反应进程，反应24h后转化率>99%，过滤，滤液加入乙酸正丁酯萃取两次，合并有机相并蒸发脱去溶剂，得4-氯-3-羟基丁酸乙酯产品27.64g，收率91.03%，GC纯度>98.92%。实施例六：4氯-3-羟基丁酸乙酯的制备
在反应容器中依次加入30g4-氯乙酰乙酸乙酯，150mlTris-HCl缓冲溶液（pH6.8，0.1M），葡萄糖32.96g，搅拌均匀，之后加入0.595g重组酮还原酶，0.06g葡萄糖脱氢酶，6mgNAD+，25℃下机械搅拌开始计时反应，4M的KOH水溶液滴定，保持pH6.8恒定。取样GC分析监控反应进程，反应24h后转化率>99%，过滤，滤液加入乙酸正丁酯萃取两次，合并有机相并蒸发脱去溶剂，得4-氯-3-羟基丁酸乙酯产品27.40g，收率90.23%，GC纯度>98.15%。
实施例七：4氯-3-羟基丁酸乙酯的制备
在反应容器中依次加入50g4-氯乙酰乙酸乙酯，250ml磷酸盐缓冲液（pH6.5，0.1M），葡萄糖55.08g，搅拌均匀，之后加入2.5g重组酮还原酶，0.15g葡萄糖脱氢酶，15mgNADP+，28℃下机械搅拌开始计时反应，4M的Na2CO3水溶液滴定，保持pH6.5恒定。取样GC分析监控反应进程，反应24h后转化率>99%，过滤，滤液加入乙酸正丁酯萃取两次，合并有机相并蒸发脱去溶剂，得4-氯-3-羟基丁酸乙酯产品45.70g，收率90.30%，GC纯度>98.56%。
实施例八：4氯-3-羟基丁酸乙酯的制备
在反应容器中中依次加入100g4-氯乙酰乙酸乙酯，142.8ml乙酸正丁酯和357.2ml磷酸盐缓冲液（pH7.0，0.1M），葡萄糖119.15g，搅拌均匀，之后加入1.105g重组酮还原酶，0.25g葡萄糖脱氢酶，10mgNADP+，30℃下机械搅拌开始计时反应，4M的NaOH水溶液滴定，保持pH7.0恒定。取样GC分析监控反应进程，反应24h后转化率>99%，过滤，滤液静置分层后分开水相和有机相，水相中加入乙酸正丁酯萃取，合并两次得到的有机相并蒸发脱去溶剂，得4-氯-3-羟基丁酸乙酯产品90.88g，收率89.78%，GC纯度>98.21%。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.重组酮还原酶，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。
2.一种制备权利要求1所述的重组酮还原酶的方法，其特征在于，包括如下步骤：
将含有酮还原酶基因的重组大肠杆菌单菌落接种到含卡那霉素抗性的液体LB培养基中，于35～40℃下摇床活化8～12小时，将活化后得到的培养物接种到含卡那霉素抗性的液体LB培养基中，于35～40℃下摇床扩大培养，培养至OD600值达到0.6～0.8时，加入诱导剂，于25～33℃下继续培养8～12小时，离心，收集沉淀物，加入三乙醇胺缓冲液悬浮，将悬浮液置于冰水浴中超声破碎8～12分钟，再离心，上清液即为重组酮还原酶。
3.根据权利要求2所述的制备重组酮还原酶的方法，其特征在于，所述诱导剂为异丙基-β-D-硫代半乳糖苷或乳糖。
4.权利要求1所述的重组酮还原酶的用途，其特征在于，将重组酮还原酶用于生物催化还原4-氯乙酰乙酸乙酯制备奥拉西坦中间体4-氯-3-羟基丁酸乙酯。
5.一种使用权利要求1所述的重组酮还原酶生物催化制备奥拉西坦中间体4-氯-3-羟基丁酸乙酯的方法，其特征在于，以4-氯乙酰乙酸乙酯为底物，以重组酮还原酶为生物催化剂、以NAD/NADH或NADP/NADPH为辅因子，以葡萄糖为氢供体，以葡萄糖脱氢酶为辅因子再生体系，在25～30度条件下，在pH6.5～7.0的水相缓冲液或水相缓冲液-乙酸正丁酯两相体系中进行还原反应生成4-氯-3-羟基丁酸乙酯。
6.根据权利要求5所述的制备奥拉西坦中间体4-氯-3-羟基丁酸乙酯的方法，其特征在于，所述还原反应在反应起始时的反应体系中，底物的浓度以g/ml计为14～18％,重组酮还原酶用量为底物4-氯乙酰乙酸乙酯质量的1～5％，辅因子用量为底物质量的0.01～0.03％，葡萄糖脱氢酶用量为底物质量的0.2～0.3％，葡萄糖用量与底物的物质的量的比为1.2～1.5：1。
7.根据权利要求6所述的制备奥拉西坦中间体4-氯-3-羟基丁酸乙酯的方法，其特征在于，所述的水相缓冲液为磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲溶液或三乙醇胺-盐酸缓冲溶液，所述的水相缓冲液-乙酸正丁酯两相体系中水相缓冲液与乙酸正丁酯的体积比为1：0.4～0.7。
8.根据权利要求7所述的制备奥拉西坦中间体4-氯-3-羟基丁酸乙酯的方法，其特征在于，所述的辅因子为NADP/NADPH。
9.根据权利要求8所述的制备奥拉西坦中间体4-氯-3-羟基丁酸乙酯的方法，其特征在于，所述的还原反应在pH为7.0的水相缓冲液体系中进行。
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